KR20170113714A - 미생물의 검사 방법 - Google Patents

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도요세이칸 그룹 홀딩스 가부시키가이샤
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Abstract

미생물의 검사 방법에서 샘플링을 포함한 검사 전체의 기간을 더욱 단축할 수 있다. 환경 속에서의 여러 종류의 미생물의 존재 여부를 동시에 판정하는 미생물의 검사 방법이며, 공기 중에 부유하는 미생물을 액체 중에 회수하는 채취 공정과, 액체 중에서의 미생물에서 핵산을 추출하는 핵산 추출 공정과, 추출된 핵산의 일부를 증폭하는 핵산 증폭 공정과, 증폭된 핵산을 포함한 용액을 미리 여러 종류의 미생물의 핵산을 고정화한 담체에 떨어뜨려서, 증폭된 핵산과 상보적으로 결합하는 핵산이 담체에 고정화되어 있는 경우에 미생물의 종류를 특정하는 검출 공정을 갖추고 채취 공정 후에, 또한 핵산 추출 공정 전에 있어서 미생물 배양을 하지 않는다.

Description

미생물의 검사 방법 {METHOD FOR TESTING FOR MICROORGANISMS}
본 발명은 미생물의 검사 방법에 관한 것이며 특히 여러 종류의 미생물을 동시에 신속하게 검출하기 위한 검사 방법에 관한 것이다.
종래, 식품 제조 현장이나 임상 현장, 또는 문화재 등의 보호 환경 등에서 곰팡이 등의 미생물의 존재 여부를 검사하여, 안전성을 확인하는 동시에 그 번식을 방지하는 것이 중요하다.
이와 같은 미생물, 특히 곰팡이를 대상으로 한 검사 방법으로서 이하에 제시하는 3가지 방법을 들 수 있다.
먼저 제1의 방법으로서 환경 중에서 시료를 샘플링하여 전 배양(채취된 균의 동시 배양)하고 이어서 균 종류별로 최적인 배지에서 20일 정도의 배양을 한 후에 형태적 특징을 관찰함으로써 미생물을 특정하고 그 존재 여부 확인을 하는 방법을 들 수 있다(특허 문헌 1참조).
또한, 제2의 방법으로서 환경 중에서 시료를 샘플링하여 전 배양한 후에 각 균을 개별적으로 배양하고, 배양 세포에서 DNA을 추출하여 PCR(중합 효소 연쇄 반응)법에 의해서 표적 영역을 증폭하여 그 영역의 염기 서열을 해석함으로써 미생물의 특정 및 존재 확인을 하는 방법을 들 수 있다.
또한 제3의 방법으로서 목표 영역과 상보적으로 결합하는 염기 서열로 구성된 프로브를 제작하여 DNA칩의 기판상에 고정화하고 PCR법으로 증폭 산물을 DNA칩에 떨어뜨려서 표적 영역과 프로브를 혼성화(hybridization)하여 시료에 포함되는 미생물의 특정 및 존재 확인을 하는 방법을 들 수 있다(특허 문헌 2참조).
형태에 따라, 미생물의 특정을 하는 제1의 방법은 전 배양하여 생육한 후에 개별적으로 배양할 필요가 있다. 그 때 미생물의 형태적 특징을 발현시키기 위해서 균 종류별로 최적인 배지를 준비하여 장기간 배양할 필요가 있기 때문에 미생물 종류에 따라서는 50일 정도의 긴 검사 기간을 필요로 하였다. 또한 미생물의 특정에 숙련이 필요하므로 신속한 검사와 간이적인 검사에 적절한 것은 아니었다.
서열 해석에 의한 제2의 방법에서도 전 배양한 후에 균 종류마다 개별적으로 배양할 필요가 있다. 이를 위해, 검사 기간으로 14일 정도를 요하였다. 또한 균 종류마다 개별적으로 해석하는 방법이므로, 다수의 검체를 동시에 검사할 필요가 있는 경우에 적절한 것은 아니었다.
한편 DNA칩을 사용하는 제3의 방법으로는 균 종류마다 개별적으로 배양하지 않고 미생물을 검출할 수 있고 검사 기간을 9일 정도로 단축할 수 있다.
그러나 검사 현장에서는 환경 중에서 시료를 샘플링한 당일 중에 그 결과를 알고 싶어 하는 검사의 새로운 신속화의 요망이 있다.
그런데 DNA칩을 사용하는 제3의 방법에서도 전 배양이 필요하며, 이 전 배양에 7일 정도가 소요되므로 제3의 방법으로는 그 요망에 부응할 수 없었다.
여기서 DNA칩을 사용한 미생물 검사를 전 배양하지 않고 실시 가능하게 하는 미소 유기체의 신속한 검출을 위한 방법이 제안되어 있다(특허 문헌 3참조).
[특허 문헌 1]
일본특허 공개공보 2007-195454호 공보
[특허 문헌 2]
일본특허 공개공보 2008-35773호 공보
[특허 문헌 3]
일본특허 공개공보 2007-508811호 공보
그러나 이 미소 유기체의 신속한 검출을 위한 방법은 미생물에서 RNA를 추출하는 것인데, 미생물이 포자 형태인 경우는 RNA을 얻을 수 없다. 한편, 비 포자 형태의 미생물을 선택적으로 포집할 수 없기 때문에, 포자를 발아시키기 위한 회복 공정이 필수가 된다는 문제가 있었다.
또한 RNA, 또는 이에 상보적인 DNA의 증폭하지 않고 미생물 검출이 가능하게 하고 있어서, 매우 많은 미생물의 세포를 포집할 필요가 있고(실시예에서는 백만개의 세포를 사용. 비교적 오염된 환경 하에서 샘플링에 며칠을 요한다.)샘플링을 포함한 검사 전체 기간을 단축하기 어렵다는 문제가 있었다.
본 발명은 상기 사정을 감안하여 이뤄진 것이며 샘플링을 포함한 검사 전체의 기간을 더욱 단축할 수 있는 미생물의 검사 방법의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명의 미생물 검사 방법은 환경 중에서의 여러 종류의 미생물의 존재 여부를 동시에 판정하는 미생물의 검사 방법이며, 공기 중에 부유하는 미생물을 액체 중에 회수하는 채취 공정과, 액체 중에서의 미생물에서 핵산을 추출하는 핵산 추출 공정과, 추출된 핵산의 일부를 증폭하는 핵산 증폭 공정과, 증폭된 핵산을 포함한 용액을 미리 여러 종류의 미생물의 핵산을 고정화된 담체에 떨어뜨려서, 증폭된 핵산과 상보적으로 결합하는 핵산이 담체에 고정되어 있는 경우에 미생물의 종류를 특정하는 검출 공정을 갖추어 채취 공정 후에, 핵산 추출 공정 전에 미생물 배양을 하지 않는 방법으로 되어 있다.
본 발명에 따르면 샘플링을 포함한 검사 전체의 기간을 더욱 단축할 수 있는 미생물의 검사 방법을 제공할 수 있게 된다.
도 1은 실시예에서의 에어 샘플러에서 회수한 공기 양과 곰팡이 수와의 관계를 나타내는 도표이다.
도 2는 실시 예에서 사용한 프라이머의 염기 서열을 나타내는 도표이다.
도 3은 실시 예에서 사용한 프로브의 염기 서열을 나타내는 도표이다.
도 4는 실시 예에서의 DNA칩에 의한 검출 결과(S/N 비)를 나타내는 도표이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대하여 자세히 설명한다.
본 발명의 실시형태의 미생물 검사 방법은 환경 중에서의 여러 종류의 미생물의 존재 여부를 동시에 판정하는 미생물의 검사 방법이며, 공기 중에 부유하는 미생물을 액체 중에 회수하는 채취 공정과, 액체 중에서의 미생물에서 핵산을 추출하는 핵산 추출 공정과, 추출된 핵산의 일부를 증폭하는 핵산 증폭 공정과, 증폭된 핵산을 포함한 용액을 미리 여러 종류의 미생물의 핵산을 고정화된 담체에 떨어뜨려서, 증폭된 핵산과 상보적으로 결합하는 핵산이 담체에 고정되어 있는 경우에 미생물의 종류를 특정하는 검출 공정을 갖추어 채취 공정 후, 또한 핵산 추출 공정 전에 미생물 배양을 하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 실시형태의 미생물 검사 방법은 이하의 공정을 포함하는 것으로 할 수 있다.
(1)채취 공정
채취 공정에서는 공기 중에 부유하는 미생물을 액체 중에 회수한다. 이 때, 미생물을 회수하기 위한 샘플링 장치로는 사이클론식 에어 샘플러를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 액체로서는 미생물의 회수 효율을 높이기 위해 계면 활성제를 함유하는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
사이클론식 에어 샘플러를 사용함으로써 샘플링 용기에서의 액체 중에 공기가 고속으로 나선 모양으로 거둬들여진 뒤 배출되고, 그 과정에서 공기 중의 미립자가 원심력으로 샘플링 용기의 내벽에 부착한다. 이로 인해서, 공기 중의 미생물을 샘플링 용기에서의 액체 중에 회수할 수도 있다.
사이클론식 에어 샘플러로서는, 예를 들면 코리오리스 μ(액상 원심 분리 방식:액체 사이클론, Bertin사제)를 알맞게 사용할 수 있다.
사이클론식 에어 샘플러를 사용하는 경우, 유속 300L/분에서 1~10분간 공기를 흡입하는 것이 바람직하다.
이와 같이 채취 공정에서 사이클론식 에어 샘플러를 사용함으로써, 단시간에 대량의 공기 중에서 비교적 많은 미생물을 액체 중에 회수할 수 있다. 이를 위해 핵산 추출 공정에 앞서서 미생물 배양(전 배양)을 하지 않아도, 핵산 증폭 공정에서 미생물의 핵산을 충분히 증폭할 수 있고, 검출 공정에서 그 미생물을 검출할 수 있다.
또한 미생물의 전 배양을 행할 필요가 없기 때문에 배지의 조건이 원인이 되어 미생물이 적절하게 생육하지 못하기 때문에 그 미생물이 검출되지 않는다는 위험을 줄일 수도 있다.
본 실시형태의 미생물 검사 방법에서 "미생물"에는 곰팡이와 효모 등의 진균, 식중독 균 등의 세균, 그 외 현미경을 사용하지 않으면 보이지 않는 미소한 생물이 포함된다.
특히 본 실시형태의 미생물 검사 방법에 따르면 식품 검사, 역학적 환경 검사, 환경 검사, 임상 시험 및 가축 위생 등에서 중요해지는 공기 중에 부유하는 포자 또는 균사 형태의 곰팡이를 적절하게 검출할 수 있다.
또한 미생물 배양을 행할 필요가 없기 때문에 살아있는 미생물뿐만 아니라 죽은 균 등의 미생물의 시체에서 그 미생물의 종류를 특정할 수도 있다.
(2)핵산 추출 공정
핵산 추출 공정에서는 채취 공정에서 얻어진 액체 중에서의 미생물에서 핵산을 추출한다. 이로써 미생물에서 게놈 DNA를 얻을 수 있다. 핵산의 추출은 통상적인 방법으로 할 수 있으며, 특히 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 시판하는 핵산 추출 키트(Water RNA/DNA Purification Kit-0.22μm, Norgen Biotek Corporation제)를 사용하여 액체를 필터로 여과하여 미생물을 농축하고 그 세포를 파쇄, 용균하여, 핵산을 정제함으로써 핵산의 추출을 알맞게 할 수 있다. 또한 CTAB법(Cetyl trimethyl ammonium bromide)이나 DNA추출 장치 등으로 핵산을 추출하여도 좋다.
(3)핵산 증폭 공정
핵산 증폭 공정에서는 핵산 추출 공정에서 추출된 핵산의 일부를 증폭한다. 이로써 시료가 되는 게놈 DNA에서의 증폭 대상 영역을, 검출에 필요한 수량으로 증폭할 수 있다.
이와 같이 본 실시형태의 미생물 검사 방법에 따르면 채취 공정에서 사이클론식 에어 샘플러를 사용하여 공기 중에 부유하는 미생물을 액체 중에 회수하고, 핵산 증폭 공정에서 미생물의 핵산을 증폭할 수 있다.
이를 위해 작업 공정에서 미생물의 회수를 장시간 실시하지 않아도, 그 핵산 증폭 공정에서 미생물의 핵산을 충분히 증폭할 수 있으므로 검출 공정에서 그 미생물을 적절히 검출할 수 있다.
핵산의 증폭 방법으로는 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 PCR법을 적절히 사용할 수 있다.
PCR법에서 사용하는 PCR용 반응액은 예를 들면 다음 조성으로 구성된 것이 바람직하다. 즉, 핵산 합성 기질, 프라이머 세트, 핵산 합성 효소, 표지 성분, 시료의 게놈 DNA, 완충액 및 나머지 용량 분으로서 물을 포함한 PCR용 반응 액을 알맞게 사용할 수 있다.
PCR법에서 시료의 게놈 DNA에서의 증폭 대상 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 사용하여 해당 증폭 대상 영역을 증폭시켜서 증폭 산물을 얻을 수 있다. 또한 후의 검출 공정에서 증폭 대상 영역의 일부에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브에 증폭 산물을 혼성화시킨다. 그리고 혼성화된 증폭 산물에 포함되는 표지 성분을 검출함으로써 해당 게놈 DNA를 가진 미생물을 특정할 수 있다.
완충액으로는 예를 들면 Ampdirect(R)(주식 회사 시마즈 제작소)를 사용할 수 있다.
PCR장치로는 일반적인 서멀 사이클러 등을 사용할 수 있다.
PCR의 반응 조건으로서는, 예를 들면 다음과 같이 하는 것이 바람직하다.
(a)95℃ 10분, (b)95℃(DNA변성 공정) 30초, (c)56℃(어닐링 공정) 30초, (d)72℃(DNA합성 공정) 60초((b)~(d)를 40사이클), (e)72℃ 10분.
(4)검출 공정
검출 공정에서는 PCR법에 의해서 얻은 증폭 산물을 포함한 용액을 미리 여러 종류의 미생물의 프로브를 고정화한 담체에 적하한다. 이 담체에 증폭 산물과 상보적으로 결합하는 프로브가 고정화되어 있는 경우, 증폭 산물과 프로브가 혼성화한다. 그리고 혼성화된 증폭 산물에 포함되는 표지 성분을 검출함으로써 여러가지 종류의 미생물의 종류를 각각 특이적으로 동시에 특정할 수 있다.
이러한 담체로서는 DNA칩을 알맞게 사용할 수 있다. DNA칩은, 검출 대상 미생물의 게놈 DNA에서의 PCR법으로 증폭 대상 영역에서 선택된 프로브를 미리 합성하여, 기판상에 고정화한 것이라면 좋고, 또 다른 점에서는 특히 한정되지 않는다. 예를 들면 스폿형 DNA칩, 합성형 DNA칩 등을 사용할 수 있다.
증폭 산물의 표지 성분 검출은 구체적으로는 예를 들면 다음과 같이 할 수 있다.
먼저, 증폭 산물에 소정의 완충액을 혼합하여 DNA칩에 적하하고 DNA칩을 45℃에서 1시간 정치한다. 그 후 소정의 완충액을 사용하여 혼성화하지 않은 PCR산물을 DNA칩에서 씻어 없앤다.
다음에 DNA칩을 표지 검출 장치로 표지 성분 검출을 실시하여, 검출 대상인 미생물의 존재 여부를 판정한다. 표지 검출 장치로는 예를 들면 형광 스캐닝 장치 등 일반적인 것을 사용할 수 있다. 표지 및 그 검출 방법은 형광에 의한 것에 한정되지 않고 기타의 방법을 사용해도 된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 실시형태의 미생물 검사 방법에 따르면 채취 공정에서 사이클론식 에어 샘플러를 사용하여 공기 중에 부유하는 미생물을 액체 중에 회수하고 또한 핵산 증폭 공정에서 미생물의 핵산을 증폭할 수 있다. 그래서, 종래는 핵산 추출 공정 전에 필수였던 미생물의 전 배양을 하지 않아도 검출에 충분한 양의 핵산을 얻게 되고, 검출 공정에서 여러 종류의 미생물을 동시에 특이적으로 검출할 수 있다.
또한 채취 공정에서 미생물의 회수를 장시간 실시하지 않아도, 핵산 증폭 공정에서 미생물의 핵산을 충분히 증폭할 수 있어서 검출 공정에서 미생물을 적절히 검출할 수 있다.
그러므로 본 실시형태의 미생물 검사 방법에 따르면 샘플링을 포함한 검사 전체의 기간을 더욱 단축할 수 있다.
또한 본 실시형태의 미생물 검사 방법에 따르면 미생물의 전 배양을 하지 않고, 해당 미생물의 검출을 할 수 있으므로 공기 중에 부유하는 미생물의 시체에서 그 미생물을 특정할 수도 있다. 미생물의 시체라도 사람이 흡입하면 건강 피해가 발생할 경우가 있으며 이를 더욱 신속하게 검출 가능하게 하는 것은 유익하다.
[실시예]
이하, 본 발명의 미생물 검사 방법의 실시예에 대해서 구체적으로 설명한다.
채취 공정에서 공기 중에 부유하는 미생물을 액체 중에 회수하기 위해서, 사이클론식 에어 샘플러(코리오리스 μ, Bertin사제)를 사용하여 2지점에서의 공기를 흡인하여 다음과 같이, 합계 4개의 샘플을 얻었다. 에어 샘플러의 유속은 300L/분으로 고정하였다.
먼저, 지점 A(화장실 내)에서 공기의 흡입을 3번하고 회수 시간을 각각 1분, 3분, 5분으로 하여 샘플 (1)-(3)을 얻었다. 샘플 (1)-(3)의 회수 공기량은 각각 300L, 900L, 1500L이다.
또한 지점 B(응접실 내)에서 공기의 흡입을 1회하고 회수 시간을 10분으로 하여 샘플 (4)을 얻었다. 샘플 (4)의 회수 공기량은 3000L이다.
미생물을 회수하기 위한 액체의 양은 모든 샘플에 대하여 공기 회수의 개시 시점에서는 10mL이었다. 공기 회수 후에는 회수 중에서의 샘플의 증발에 의해서 액량이 감소하기 때문에 잔존 액량은 회수 시간이 길수록 적고, 모든 샘플에 대하여 잔존 액량은 5.1mL이상 존재하고 있었다.
샘플 (1)-(4)의 액체에서 각각 0.1mL를 꺼내어 지름 90mm의 샬레에 멸균한 M40Y배지에 도포하였다. 이것을 샘플마다 2개의 배지에 대해서 실시하고 25℃, 7일간 배양하였다. 이 M40Y배지는 호건성 곰팡이, 내건성 곰팡이, 호습성 곰팡이를 모두 알맞게 배양할 수 있는 배지이며, 증류수 1L에 Malt extract 20g, Yeast extract 5g, Sucrose 400g, Agar 20g을 첨가하여 얻어진 것이다.
그리고 각각의 배지에서 4일째 7일째에 샘플을 꺼내어 눈으로 보아서 생육한 콜로니 수를 카운트하여 샘플마다 평균을 산출하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이 샘플 (1)-(4)의 0.1mL중에서의 곰팡이 수의 평균은 각각 2, 9, 15, 3개였다. 그러므로 액체 5mL에서의 곰팡이 수는 각각 100, 450, 750, 150개로 환산된다. 회수 공기량을 고려하면 지점 A의 샘플 (1)-(3)에서의 곰팡이 수는, 지점 B 샘플 4에서의 곰팡이 수보다 많은 결과가 되어 있다. 그 이유는, 지점 A의 공기가, 지점 B의 공기보다 오염되어 있기 때문으로 풀이된다.
다음에, 핵산 추출 공정에서 시판의 핵산 추출 키트(Water RNA/DNA Purification Kit-0.22μm, Norgen Biotek Corporation제)를 사용하여 설명서에 준하여 조작을 하고 샘플 (1)-(4)의 각 액체 중의 곰팡이에서 핵산을 추출하였다.
이때 샘플 (1)-(4)의 액체 중 5mL를 각각 필터로 여과하고, 이어서 필터를 분리해서 유리 구슬을 포함한 파쇄 튜브에 회수 후, 용균 버퍼를 가하여 4800rpm에서 5분간 파쇄하였다. 이 공정에 의해서 액체에 회수된 곰팡이를 필터별 유리 구슬에 의해서 파쇄하여, 소정의 용균 처리를 하였다. 이로써 얻은 용액에서 공기에서 액체에 회수된 곰팡이 포자 및 균사의 세포 벽은 모두 파쇄되어 용균되어 있다.
그리고, 샘플 (1)-(4)마다 얻은 용액을 정제하여, DNA용액을 얻었다.
다음에, 핵산 증폭 공정에서 샘플 (1)-(4)마다의 DNA용액에서의 DNA의 일부를 PCR법에 의해서 증폭하였다.
이 때, 검출 대상의 곰팡이로서 아스퍼질러스 페니시리오이데스 종균(Aspergillus penicillioides), 클라도스포륨속 균(Cladosporium sp.)및 왈레미아 세비 종균(Wallemia sebi)을 선택하였다.
그리고 도 2와 같이, 이들 3종류의 곰팡이의 게놈 DNA에서의 ITS영역을 증폭하기 위한 프라이머 셋트로서 서열 번호 1에 나타낸 포워드 프라이머 및 서열 번호 2에 나타낸 리버스 프라이머를 사용하였다. 또한 아스퍼질러 페니시리오이데스 종균의 게놈 DNA에서의 β-튜불린 영역을 증폭하기 위한 프라이머 셋트로서 서열 번호 3에 나타낸 포워드 프라이머 및 서열 번호 4에 나타낸 리버스 프라이머를 사용하였다.
PCR반응액으로는 Ampdirect(R)(주식 회사 시마즈 제작소 제품)을 사용하고 다음의 조성의 것을 샘플마다 20㎕작성하였다.
1.Ampdirect addition(G/C rich) 4.0㎕
2.Ampdirect(addition-4) 4.0㎕
3.dNTP mixture 1.0㎕
4.1.0mM Cy5-dCTP 0.2㎕
5.ITS1영역 증폭용 포워드 프라이머(2.5㎛, 서열 번호 1, 시그마-알드리치사에 의해서 합성) 1.0㎕
6.ITS1영역 증폭용 리버스 프라이머(2.5㎛, 서열 번호 2, 시그마-알드리치사에 의해서 합성) 1.0㎕
7. β-튜불린 영역 증폭용 포워드 프라이머(10㎛, 서열 번호 3, 시그마-알드리치사에 의해서 합성) 1.0㎕
8. β-튜불린 영역 증폭용 리버스 프라이머(10㎛, 서열 번호 4, 시그마-올드리치사에 의해서 합성) 1.0㎕
9.Nova Taq Hot Start DNA polymerase 0.2㎕
10. 시료의 게놈 DNA 1.0㎕
11. 물(전체가 20.0㎕이 될 때까지 물 첨가)
이 PCR반응 액을 사용하여 핵산 증폭 장치(TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(R) Gradient 다카라 바이오 주식 회사제)로 샘플마다 다음 조건으로 DNA의 증폭을 하였다.
1.95℃ 10분
2.95℃ 30초
3.56℃ 30초
4.72℃ 60초(2~4를 40사이클)
*5.72℃ 10분
다음에 검출 공정에서 아스퍼질러스 페니시리오이데스 종균 검출용 프로브, 클라도스포륨속 균 검출용 프로브 및 왈레미아 세비 종균 검출용 프로브를 고착화한 DNA칩을 샘플마다 사용하였다. DNA칩에는 진 실리콘(R)(동양철강판주식회사 제)를 사용하였다.
또한 도 3과 같이 아스퍼질러스 페니시리오이데스 종균 검출용 프로브로서 서열 번호 5, 서열 번호 6으로 표시된 염기 서열로 구성된 프로브를 사용하고, 클라도스포륨속 균 검출용 프로브로서 서열 번호 7로 표시된 염기 서열로 구성된 프로브를 사용하고, 왈레미아 세비 종균 검출용 프로브로서 서열 번호 8로 표시되는 염기 서열로 구성된 프로브를 사용하였다.
서열 번호 5, 서열 번호 7 및 서열 번호 8로 표시된 염기 서열로 구성된 프로브는 상기 ITS영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트의 증폭 대상 영역의 일부와 혼성화하는 것이다. 또한 서열 번호 6으로 표시된 염기 서열로 구성된 프로브는 상기 β-튜불린 영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트의 증폭 대상 영역의 일부와 혼성화하는 것이다.
PCR법으로 증폭 산물에 완충액(3×+ 0.3% SDS)을 혼합하여, 상기 DNA칩에 적하하였다.
이 DNA칩을 45℃에서 1시간 정치하고, 상기 완충액을 사용하여 하이 브리다이즈하지 않은 PCR산물을 DNA칩에서 씻어 냈다.
다음에 DNA칩을 표지 검출 장치(진 실리콘 전용 스캐너 BIOSHOT 동양철강 판주식회사 제)에 걸어서 각 프로브의 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.
이 도에서 각 수치는 S/N비(형광 강도치-백그라운드치)/백그라운드치)를 나타내고, 3 이상이면 대응하는 곰팡이가 존재한다고 판단할 수 있다. 또한 아스퍼질러스 페니시리오이데스 종균에 대해서는 ITS영역 및 β-튜불린 영역의 양측에 대해서, S/N 비가 3 이상인 경우 그 곰팡이가 존재한다고 판단할 수 있으며, 이로써 위양성 반응이 생길 것을 정확하게 방지하고 보다 정밀도 높은 검사를 실시하는 것을 가능하게 하고 있다.
도 4와 같이, 지점 A에 대해서는 샘플 (1)에 의해서 아스퍼질러스 페니시리오이데스 종균의 존재를 확인할 수 있게 되어 있다. 또한 샘플 (1)-(3)에 의해서 클라도스포륨속 균의 존재를 확인할 수 있게 되어 있고, 샘플 (3)에 의해서 왈레미아 세비 종균의 존재를 확인할 수 있다.
또한 지점 B에 대해서는 샘플 (4)에의 아스퍼질러스 페니시리오이데스 종균 및 클라도스포륨속 균의 존재를 확인할 수 있다.
이와 같이 본 실시형태의 미생물 검사 방법에 따르면 미생물의 전 배양을 하지 않고, 해당 미생물 검출이 가능하다는 것을 알았다. 또한 샘플링에 소요되는 시간도 불과 10분 정도면 되고, 미생물의 채취 공정에서 검출 공정까지의 검사 전체에 필요한 기간을 크게 저감할 수 있었다.
이 결과, 본 실시형태의 미생물 검사 방법에 따르면 환경 중에서 시료를 샘플링한 당일 중에 검사 결과를 얻을 수 있고, 종래는 샘플링을 포함하여 며칠을 필요로 한 미생물 검사를 크게 신속화하는 것이 밝혀졌다. 또한 상기 결과에서 환산 곰팡이 수로 750이하, 이어 450이하, 150이하, 100이하의 수에서도 검사할 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명은 이상의 실시형태와 실시 예에 한정되는 것은 아니고 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능하다는 것을 말할 필요도 없다.
예를 들면, 상기 실시예에서는 3종류의 곰팡이만을 대상으로 사용하고 있지만, 본 발명은 그 특징상 미생물의 종류에 관계 없이 적용할 수 있다는 것은 물론이며 같은 방법을 기타 종류의 곰팡이나 기타 미생물 검출에 사용하는 등 적절히 변경할 수 있다.
본 발명은 식품 검사, 역학적 환경 검사, 환경 검사, 임상 시험 및 가축 위생 등의 여러 종류의 곰팡이를 동시에 검사하는 경우에 알맞게 이용할 수 있다.
<110> TOYO SEIKAN GROUP HOLDINGS, LTD. <120> METHOD FOR TESTING FOR MICROORGANISMS <130> IP17-0025 <150> JP 2013-218854 <151> 2013-10-22 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 ttggtcattt agaggaagta aaagtc 26 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 ctgcgttctt catcgatgc 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 3 ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 4 accctcagtg tagtgaccct tggc 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus penicillioides <400> 5 gagacctcaa ccatgaacac t 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus penicillioides <400> 6 catcgtcagc atgtcacacc gc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cladosporium sp. <400> 7 actcttgcgt aactttgcag tct 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wallemia sebi <400> 8 ccaagcagtt aagctgttga aat 23

Claims (3)

  1. 환경 속에서의 여러 종류의 미생물의 존재 여부를 동시에 판정하는 미생물의 검사 방법이며,
    상기 미생물이 포자 또는 균사 형태의 곰팡이이며,
    공기 중에 부유하는 상기 미생물을 액체 중에 회수하는 채취 공정과
    상기 액체 중에서 제1의 액체 샘플과 제2의 액체 샘플을 수득하는 공정과
    파쇄 전에 미생물의 배양을 하지 않고, 상기 제1의 액체 샘플의 적어도 일부에 있어서 상기 미생물의 세포를 파쇄하는 파쇄공정과
    상기 미생물의 파쇄한 세포로부터 핵산을 추출하는 핵산 추출 공정과
    상기 추출된 핵산의 적어도 일부를 증폭하는 핵산 증폭 공정과
    상기 증폭된 핵산을 포함한 용액을 미리 여러 종류의 미생물의 핵산을 고정화한 담체에 떨어뜨려서, 상기 증폭된 핵산과 상보적으로 결합하는 핵산이 상기 담체에 고정화되어 있는 경우에, 상기 미생물의 종류를 특정하는 검출 공정과
    상기 제2의 액체 샘플의 적어도 일부의 미생물을 계수하고, 상기 제1의 액체 샘플 중에 회수된 상기 미생물의 수를 산출하는 공정과
    상기 산출된 미생물의 수가 100이상인 경우, 상기 미생물의 종류를 특정하는 것이 가능하다고 판정하는 공정
    을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물의 검사 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산출된 미생물의 수가 750이상인 것을 특징으로 하는 미생물 검사 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 채취 공정에서 에어 샘플러를 사용하여 공기를 300~3000L 회수해서, 회수된 공기 중에 부유하는 미생물을 액체 중에 회수하는 것을 특징으로 하는 미생물 검사 방법.
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