KR20170110520A - mTOR 억제제 및 N-아세틸시스테인을 포함하는 간섬유화 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간섬유화 억제용 조성물에 관한 것이며, 상세하게는 이식 후 사용되는 mTOR 억제제와 N-acetylcystein를 포함하는 간섬유화 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

mTOR 억제제 및 N-아세틸시스테인을 포함하는 간섬유화 억제용 조성물{Composition comprising mTOR inhibitor and N-acetylcysteine for inhibiting hepatic fibrosis}

본 발명은 간섬유화 억제용 조성물에 관한 것이며, 상세하게는 이식 후 사용되는 mTOR 억제제와 N-아세틸시스테인을 포함하는 간섬유화 억제용 조성물에 관한 것이다.

간은 다른 고형 장기이식에 비하여 이식 후 거부반응의 위험이 상대적으로 낮고 간 자체가 독특한 재생 능력을 가지고 있기 때문에 장기간 생존율이 높다. 그러나 대부분의 간이식 수혜자는 필수적으로 면역억제제를 복용한다. 면역 요법은 타인의 장기를 이식하면서 일어나는 자연스러운 면역 반응을 약물로 억제하는 방법이다. 면역력이 너무 억제되면 감염, 독성, 발암, 대사장애 등이 유발되고 적절하게 억제되지 못하면 거부반응이 일어난다.

간이식 후 사용되는 면역억제제에는 calcineurin inhibitor(CNI)인 cycloporine과 tacrolimus가 있다. CNI는 calcineurin의 기능을 억제해 T-cell의 면역 억제를 유도하는 signal 1 차단제로서, calcineurin inhibitor 계열의 면역억제제를 사용한 in vitro 실험에서 항섬유화 효과가 보고된 바 있다. 그러나 CNI계열의 면역억제제는 장기간 복용 시, 임상에서 당뇨나 고지혈증의 부작용을 일으켜 오히려 대사성 간질환을 가속화 시키는 경향이 있다.

또한, mTOR inhibitor 계열인 sirolimus는 최근 in vivo, in vitro 연구에 따라 섬유화의 진행을 억제할 수 있다는 이론적인 장점이 보고되었다. 따라서 다양한 면역억제제의 사용이나 면역억제의 정도는 간실질 섬유화에 영향을 미친다.

간섬유화는 간경변증의 전구병변으로, 만성 간질환을 일으키는 심각한 간손상의 결과, 콜라겐을 포함한 비정상적인 세포외기질이 축척되는 것이다. 간섬유화의 중요기전은 간성상세포가 활성화 되어, 콜라겐을 포함한 다양한 세포외기질 물질을 합성하고 분비하는 것이다. 이렇게 간 전체에 광범위하게 축적된 콜라겐은 간의 섬유화를 진행시키게 된다.

간이식 후 발생하는 간경변증은 대사성 간질환과 유사한 기작에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 대사성 간질환의 경우 섬유화 과정에서 축적되는 세포외기질(ECM) 대부분이 활성화된 간성상세포에서 생성되기 때문에 대사성 간질환에서 간섬유화는 바로 간성상세포의 활성화 과정이라 할 수 있다.

Anne-Christine PIGUET 등은 mTOR 억제제인 everolimus를 사용하여 LX-2 cell line에서 약물의 효과를 확인하였다. 이들은 everolimus가 collagen typeⅠ과 alpha-SMA의 발현량을 억제하며, primary human stellate cell이 myofibroblast-like cell로 변화하는 것을 억제한다고 보고하였다. 같은 mTOR 억제제인 rapamcin은 in vitro에서 간성상세포(hepatic stellate cell)의 분열을 억제하고 in vivo에서 fibrogenesis를 억제한다는 보고도 있다.

간이식 후 사용되는 면역억제제가 간섬유화(hepatic fibrosis)를 억제한다는 연구가 보고된 바 있다. 이들 연구에서는 간이식 후 사용되는 면역억제제가 in vivo에서 간성상세포를 억제하고 in vitro에서 간섬유화를 효과적으로 억제한다고 보고하고 있다.

또한, 간성상세포(hepatic stellate cell)나 쿠퍼세포(kupffer cell)에서 항산화제(antioxidant)가 미치는 영향에 대한 연구도 보고되었다. 이 약물들은 성상세포의 분열이나 alpha-SMA의 발현량을 억제한다고 보고되었다.

간이식의 경우 시간이 경과함에 따라 면역억제제의 부작용으로 각종 대사성 질환 유병율이 증가하는데 이 경우에도 간경변증을 동반하는 경우가 많다. 이러한 문제의 해결을 위해 간경변 발생의 병태생리적 기전 연구나 효과적인 치료법의 개발, 치료약물의 개발을 위한 연구가 필요하다.

본 발명의 목적은 간이식 환자에서 사용되는 면역억제제가 대사성 간질환의 진행 속도를 늦추는데 얼마나 영향을 미치는지, 또한 다른 약물 등과 병용 시 그 영향에 변화가 있는지를 알아보고, 간섬유화를 가장 효과적으로 억제할 수 있는 병용요법을 확립하여 대사성 간섬유화를 억제하고자 하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

일 실시예에 따르면, mTOR 억제제(mTOR inhibitor) 및 N-아세틸시스테인(NAC, N-acetylcysteine)을 포함하는, 간섬유화 억제용 조성물이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 mTOR 억제제는 라파마이신(rapamycin) 또는 에베롤리무스(everolimus)일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 mTOR 억제제의 농도는 10ng/㎖ 내지 20ng/㎖일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 N-아세틸시스테인의 농도는 1mM 내지 5mM일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 조성물은 간성상세포(HSC, hepatic stellate cell)의 활성을 억제할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 조성물은 Ⅰ형 콜라겐(Collagen type Ⅰ)의 발현을 억제할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 조성물은 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 간섬유화 억제용 조성물에 포함된 mTOR 억제제 및 N-아세틸시스테인은 상호 상승작용을 발생시키므로, 이들이 각각 단독으로 사용되는 경우에 비해 월등히 향상된 간섬유화 억제 효과를 구현할 수 있다.

또한, 상기 mTOR 억제제와 N-아세틸시스테인 각각의 농도를 일정 범위 내로 조절하는 경우 간섬유화 억제 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 배양된 간성상세포의 사진이다.
도 2는 간성상세포의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 간성상세포의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 mTOR 억제제인 everolimus, 또는 everolimus와 NAC의 조합으로 처리한 간성상세포의 사진이다.
도 5는 약물을 처리한 간성상세포의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 약물을 처리한 간성상세포의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 약물을 처리한 간성상세포의 lipid droplet을 나타낸 사진이다.
도 8은 약물을 처리한 간성상세포의 단백질 발현을 나타낸 그래프이다.
도 9는 mTOR 억제제 농도에 따른 간성상세포의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 NAC 농도에 따른 간성상세포의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 약물을 처리한 간성상세포의 섬유화(fibrosis) 정도를 나타낸 사진과 그래프이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, mTOR 억제제(mTOR inhibitor) 및 N-아세틸시스테인(NAC, N-acetylcysteine)을 포함하는, 간섬유화 억제용 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "mTOR(mammalian target of rapamycin)"는 포유류 등의 동물에서 세포 내 신호전달에 관여하는 단백질 인산화효소의 일종으로, 포유동물에 존재하는 분자량 약 290,000의 세린-트레오닌 인산화효소(serine-threonine kinase)이다.

상기 mTOR는 통상 단백질 복합체를 형성하며 세포증식인자, 세포환경 내 아미노산 농도균형(balance), 에너지 상태에 의해 제어되며, 리포좀 단백질인 S6 인산화효소 등을 인산화시킴으로써 단백질 합성을 제어함과 동시에 세포 크기를 조절한다. 이 뿐만 아니라, mTOR는 인슐린 또는 다른 성장인자, 영양, 에너지 상태, 산화환원 상태 등 세포 내외 환경정보를 통합하여 전사, 번역 등을 조절하고, 이에 따라 세포의 크기, 분열, 생존 등을 조절하는 데 중추적 역할을 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "mTOR 억제제(mTOR inhibitor)"는 상기 mTOR의 신호전달 경로를 억제하는 물질로, 종래 항암제나 면역억제제의 용도로 사용되었다. 상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호전달 경로를 억제함으로써 간섬유화의 진행을 억제할 수 있다. 또한, 상기 mTOR 억제제는 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 활성을 억제함으로써 간의 전이나 혈관신생을 방지할 수 있고, 기존의 면역억제제 사용에 따라 발생할 수 있는 치명적 부작용을 억제할 수 있다.

상기 mTOR 억제제로는 라파마이신(rapamycin) 또는 에베롤리무스(everolimus)를 사용할 수 있다. 라파마이신은 40번 탄소에 하이드록실기(hydroxyl group)가 결합되어 있는 반면, 에베롤리무스는 2-하이드록시에틸기(2-hydroxyethyl group)가 결합되어 있어 상대적으로 극성이 강하고 친수성이다. 이와 같은 구조적 차이로 에베롤리무스가 라파마이신에 비해 체내 흡수율이 높고, 안정기(steady state)에 도달하는 시간이 짧으며 효과적으로 혈중 농도를 조절할 수 있으므로, 상기 mTOR 억제제로는 에베롤리무스를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "N-아세틸시스테인(NAC, N-acetylcysteine)"은 아세트아미노펜(acetaminophen)으로 알려진 파라세타몰(paracetamol)의 과다복용을 치료하고, 낭포성 섬유증이나 만성 폐색성 질환 등을 치료하기 위한 약물로 알려져 있는 물질이다. 본 발명자들은 상기 NAC가 위와 같은 치료 효과 외에도 간섬유화를 억제할 수 있고, 상기 mTOR 억제제와 병용하는 경우 억제 효과를 더욱 향상시킬 수 있음을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 상기 mTOR 억제제와 NAC를 일정 농도 범위 내로 조절하는 경우 간섬유화 억제 효과를 월등히 향상시킬 수 있음을 실험을 통해 밝혀내었다.

구체적으로, 상기 mTOR 억제제의 농도는 10ng/㎖ 내지 20ng/㎖일 수 있다. 상기 mTOR 억제제의 농도가 10ng/㎖ 미만이면 간섬유화 억제 효능이 저하될 수 있고, 20 ng/㎖ 초과이면 농도 증가 대비 약물 효능 증가율이 저하되어 약물 생산 과정에서 경제적 손실이 발생할 수 있다.

한편, 상기 N-아세틸시스테인(NAC)의 농도는 1mM 내지 5mM일 수 있다. 상기 NAC의 농도가 1mM 미만이면 간섬유화 억제 효능을 충분히 구현할 수 없고, 5mM 초과이면 저산소증으로 인해 심장, 폐에 심각한 손상을 입히는 부작용이 발생할 수 있다.

상기 mTOR 억제제와 NAC를 포함하는 조성물은 간섬유화를 억제할 수 있고, 구체적으로 간성상세포(HSC, hepatic stellate cell)의 활성을 억제할 수 있다. 간성상세포(HSC)는 정상적인 간에서는 휴지상태로 존재하며 간 내 전체 세포 중 5~8%를 차지한다. 간성상세포는 외관상 다수의 돌출부를 나타내고 동양혈관을 감싸는 형태로 존재하며 세포 내부의 지방방울(lipid droplet)을 통하여 혈액으로부터 비타민 A를 저장한다.

자극으로부터 간 손상이 발생하면 상기 간성상세포의 활성화가 유도되어, 세포 크기가 감소하면서 증식하며 주화성(chemotaxis)을 나타낸다. 또한, 간성상세포의 활성화에 의해 내부에 저장되어 있던 비타민 A의 양이 감소하고 콜라겐 반흔조직(scar tissue)을 분비하여 간섬유화(liver fibrosis)를 거쳐 간경변(cirrhosis)을 유발한다. 따라서, 이러한 간성상세포의 활성 억제는 간섬유화를 억제하는 것을 의미한다.

구체적으로, 상기 조성물은 Ⅰ형 콜라겐(Collagen type Ⅰ)의 발현 억제와 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 발현 억제를 통해 간성상세포의 활성화를 억제할 수 있다.

상기 콜라겐(collagen)은 대부분의 동물에서 발견되는 단백질로, 특히 포유동물의 살과 결합조직을 구성하며, 체구성 단백질 중 25~35%를 차지할 정도로 풍부한 단백질이다. 신장 형태의 콜라겐은 주로 힘줄, 인대, 피부와 같은 섬유조직에 존재하며 각막, 연골조직, 뼈, 혈관 등에도 존재한다. 또한, 근육조직에서 상기 콜라겐은 근내막의 주요 구성분으로 작용한다.

콜라겐의 종류 중 Ⅰ형 콜라겐(Collagen type Ⅰ)은 피부, 힘줄이나 간과 같은 장기에서 그 기능을 주로 수행한다. 이 때, 간 내에서 상기 Ⅰ형 콜라겐이 발현되어 간세포를 대체하면서 간섬유화가 진행되기 때문에, 상기 Ⅰ형 콜라겐의 발현 억제는 간섬유화 억제를 의미할 수 있다. 즉, 상기 조성물은 Ⅰ형 콜라겐의 발현을 억제함으로써 간섬유화를 억제할 수 있다.

간 손상이 발생하면 상기 간성상세포는 Ⅰ형 콜라겐 뿐만 아니라, 세포골격 단백질인 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 발현을 증가시키므로, 이에 따라 간섬유화가 진행될 수도 있다. 상기 조성물은 α-SMA의 발현 억제를 통해서도 간섬유화를 억제할 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 이에 따라, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 대상 조성물 또는 성분을 하나의 기관, 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 부분으로의 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭하며, 상기의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산 마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 상기　약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 막 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 병원성 세균 및 내성균에 대한 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 조성물은 의약외품 조성물일 수도 있다. 상기 의약외품 조성물은 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위에 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 간성상세포(HSC)의 분리

전신 마취 후 개복한 실험용 쥐의 간을 2-step collagenase perfusion을 통해 채취한 뒤, 간막을 제거하고 간세포만을 L-15 buffer에 세척하였다. 수 차례 50g 에서 5분 동안 centrifuge 하여 튜브의 침전된 간세포를 제거한 뒤, 튜브 밑에 간 세포가 침전되지 않을 때 200g에서 10분 동안 centrifuge하여 HSC만을 분리하였다. 20시간 뒤에 HSC culture 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 교환해줌으로써 잔류물(debris)과 혈구(blood cell)를 제거하였다.

실시예 2: 약물 처리 유무 및 종류에 따른 간성상세포 형태 관찰

간성사에포의 형태가 처리 유무 및 종류에 따라 달라지는지 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 간성상세포에 everolimus 10ng/㎖, rapamycin 10ng/㎖, FK506 10ng/㎖, cyclosporine A 100ng/㎖, mycophenolate mofetil(MMF) 1uM 및 N-acetylcysteine(NAC) 1mM을 각각 처리한 뒤, 배양용기(incubator)에서 배양하면서 현미경을 이용하여 기간별 세포 형태를 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 대조군으로는 어떠한 약물도 처리하지 않은 간성상세포를 사용하였다.

도 1을 참고하면, 물질 처리 유무나 종류에 관계없이 배양 초기 3일까지는 간성상세포(HSC, hepatic stellate cell)의 형태(morphology)를 유지하고 있으나, 시간이 지날수록 세포의 크기가 증가하는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 약물 처리 유무 및 종류에 따른 간성상세포 활성화 수준 측정

상기 실시예 2의 결과로는 세포의 활성화 정도를 알 수 없으므로, RT-PCR을 수행하여 상기 간성상세포의 활성화 수준을 측정하였다.

구체적으로, 실시예 1의 간성상세포에 everolimus, rapamycin, FK506, cyclosporine A, MMF 및 NAC를 상기 실시예 2와 동일한 농도로 처리한 뒤, 각각의 실험군을 PBS로 세척하고 tryzol 1㎖를 첨가하여 피펫팅(pipetting)하였다. 1.5㎖ EP 튜브에 세포를 수집하고 0.3㎖의 클로로포름을 첨가하여 교반(vortexing)한 뒤 상온에서 5분 동안 인큐베이션 하였다. 각 세포를 4℃에서 15분 동안 13,000rpm 속도로 centrifuge한 후 투명한 상층액을 분리하여 EP 튜브에 옮기고, IPA를 RNA와 1:1의 부피비가 되도록 혼합한 뒤 3~4회 교반하였다. 이후, 20분 동안 인큐베이션하고 13,000rpm에서 10분간 centrifuge 수행 후 용액을 제거하여 남은 펠렛을 75% 에탄올로 세척하였고, 13,000rpm에서 10분 동안 centrifuge 수행 후 건조시킴으로써 각 세포의 RNA를 추출하였다.

추출한 각각의 RNA를 1㎕씩 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 11㎕과 혼합 및 교반하고 용액이 아래에 모이도록 centrifuge를 수행한 후, 5분 동안 RT-PCR을 수행하였다. 5x reaction buffer 4㎕, dNTP 2㎕ 및 RNase 1㎕을 각각의 실험군에 투입하고 5분 동안 RT-PCR을 수행하였다. 여기에 RTase를 1㎕씩 첨가하고 RT-PCR을 수행함으로써 각 세포의 cDNA를 합성하였다.

각각의 cDNA를 1/10으로 희석하여 2㎕씩 수득한 뒤, forward primer 1㎕, reverse primer 1㎕ 및 DEPC 16㎕과 혼합하여 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 30초씩 25cycle의 PCR을 수행함으로써 collagen typeⅠ과 α-SMA의 mRNA 발현 수준을 측정하였고, 그 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2 및 도 3을 참고하면, 배양 초반 1일에서 3일까지는 HSC의 활성화에 약물이 영향을 미치지 않는 것처럼 보였으나, 7일 이후에는 collagen typeⅠ과 α-SMA의 유전자 발현 양상이 감소하는 것을 확인하였다. 특히, mTOR 억제제인 라파마이신(Rapa)과 에베롤리무스(Ever)에서 통계적으로 유의하게 collagen typeⅠ과 α-SMA의 유전자 발현 양상이 감소한 것을 확인하였다.

이를 통해 mTOR 억제제 계열의 약물이 HSC의 활성화를 가장 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 이러한 연구결과를 바탕으로 mTOR 억제제 계열의 약물과의 조합을 통한 효과적인 HSC의 활성화 억제 요법을 모색하였다.

실시예 4 : 약물의 단독 또는 조합 처리에 따른 간성상세포 형태 관찰

상기 mTOR 억제제와 NAC의 조합 처리에 따른 효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 간성상세포의 형태를 관찰하되, FK506, NAC 및 everolimus 단독 처리군과 everolimus와 NAC의 조합 처리군으로 실험을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참고하면, HSC의 형태학적 특징을 통해서는 처리 약물의 종류에 따른 차이를 뚜렷하게 확인할 수 없었으나, 에베롤리무스 단독 처리군에 비해 에베롤리무스와 NAC 조합 처리군에서 세포의 크기가 일정 수준 이상으로 증가하지 않는 것을 확인하였다.

실시예 5: 약물의 단독 또는 조합 처리에 따른 간성상세포 활성화 수준 측정

상기 실시예 4의 형태학적 특징으로는 약물 단독 처리군과 조합 처리군의 간성상세포 활성화 억제 수준을 비교할 수 없으므로, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하여 collagen typeⅠ과 α-SMA의 발현 수준을 측정하였고, 각각의 측정 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 이 때, 약물 처리는 상기 실시예 4와 동일하게 수행하였다.

도 5 및 도 6을 참고하면, mTOR 억제제와 NAC를 동시에 처리한 군은 mTOR 억제제 단독 처리군에 비해 collagen type Ⅰ과 α-SMA의 유전자 발현량이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

실시예 6: 약물의 단독 또는 조합 처리에 따른 간성상세포 지방방울(lipid droplet) 관찰

상기 실시예 5의 방법과 별도로 간성상세포의 활성화 수준을 확인하기 위해, 간성상세포의 특징인 지방방울(lipid droplet) 형성 정도를 관찰하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4 및 5와 동일한 약물 처리 조건 하에서 2일마다 배지를 교환하며 간성상세포를 배양하였다. 배양 3, 7, 10 및 14일 경과 시점에 4% paraformaldehyde로 4℃에서 세포를 고정하고 PBS로 세척한 후, 1:1000으로 BODIPY 493/503을 PBS에 희석하여 배양된 세포와 혼합하였다. 15분 동안 상온에서 교반한 뒤 염색 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척하였다. PBS를 제거하고 건조시킨 후 커버글라스를 덮고 현광현미경으로 각각의 세포를 관찰하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7을 참고하면, 약물을 처리하지 않은 군에서는 시간 경과에 따라 lipid droplet이 감소하였다. 그러나 mTOR 억제제 계열의 약물을 처리한 군에서는 시간이 경과하여도 lipid droplet이 유지되는 것을 확인 할 수 있었다. 더욱이 mTOR 억제제와 NAC를 동시에 처리한 군의 경우 mTOR 억제제를 단독 처리한 군보다 더 많은 lipid droplet이 관찰되었다.

실시예 7: 약물의 단독 또는 조합 처리에 따른 간성상세포의 단백질 발현 양상 확인

TGF-β는 간섬유화 신호전달 경로에 관여하는 인자로, 해당 신호전달 경로에서 TGF-β가 p70S6k 단백질을 인산화시킴으로써 간섬유화가 진행된다.

상기 TGF-β에 대한 약물의 단독 처리군과 조합 처리군의 효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 간성상세포에 TGF-β를 처리하고 이와 함께 에베롤리무스 및/또는 NAC를 처리한 뒤 western blot을 수행하여 단백질 발현 양상을 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 참고하면, mTOR 억제제를 처리한 군에서 phospho-S6 kinase(p70S6k) 발현량이 대조군이나 NAC 처리군에 비해서 감소한 것을 확인하였다. mTOR 억제제인 에베롤리무스 내지 NAC와의 조합은 간성상세포의 활성 억제에 효과가 있는 것을 확인하였지만, NAC 단독으로는 phospho-S6kinas signal에 관여하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

실시예 8: mTOR 억제제 농도에 따른 간성상세포 활성 억제 수준 측정

앞선 실험 결과들에서, 약물 처리 시 mTOR 억제제와 NAC의 조합 처리가 간성상세포의 활성 억제에 효율적인 것을 확인하였다.

나아가, 이러한 조합 처리 시 mTOR 억제제의 최적 농도를 확인하기 위해, NAC의 농도는 1mM으로 유지하면서 상기 실시예 3 및 5와 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하여 mTOR 억제제(everolimus) 농도별 간성상세포 활성 수준을 측정하였다. 또한, ethidium bromide가 포함된 2% agarose 젤에 PCR 산물을 9㎕씩 로딩하여 15분 동안 전기영동을 수행하였다. 측정 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9를 참고하면, mTOR 억제제 농도가 증가할수록 collagen type Ⅰ과 α-SMA mRNA 발현 수준이 대체로 감소하며, 특히 α-SMA의 경우 10ng/㎖의 농도에서 급격하게 그 수준이 감소하여 20ng/㎖ 농도에서도 유지되는 것을 확인할 수 있다.

실시예 9: NAC 농도에 따른 간성상세포 활성 억제 수준 측정

상기 실시예 8과 마찬가지로, mTOR 억제제와 NAC의 조합 처리 시 가장 효과적인 NAC 농도를 확인하기 위해, mTOR 억제제의 농도는 10ng/㎖로 유지하면서 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 RT-PCR과 전기영동을 수행하여 NAC 농도별 간성상세포 활성 수준을 측정하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10을 참고하면, Collagen type Ⅰ의 발현량에서는 mTOR 억제제의 단독 처리군보다 NAC와의 조합 처리군에서 14일 째에 유의미하게 발현량이 줄어든 것을 확인할 수 있었지만, NAC의 농도에 따른 collagen type Ⅰ의 발현량에는 유의미한 차이가 없었다.

그러나, α-SMA의 경우 mTOR 억제제를 단독 처리한 군에 비하여 NAC를 조합 처리한 군에서 유의미하게 간성상세포의 활성화가 억제된 것을 확인할 수 있으며, NAC의 농도에 따른 간성상세포의 억제 정도를 비교해보아도 NAC 0.5mM에 비해 1mM의 이상의 농도에서 α-SMA의 억제가 효과적으로 이루어졌음을 알 수 있다(** p<0.05, *** p<0.05).

실시예 10: 동물모델에서의 간성상세포 활성 억제 수준 측정

본 발명자들은 앞선 in vitro의 실험 결과를 바탕으로 in vivo 연구를 수행하였다. 대사성 간질환 모델을 확립하기 위해 실험용 쥐에 thioacetamide를 100㎍/g으로 1주일에 2번씩 8주 동안 복강주사(IP injection)하였다. 대조군 쥐에는 동량의 normal saline을 주사하였다.

이와 동시에 everolimus(10ng/㎖), FK506(10ng/㎖), NAC(1mM) 및 everolimus(10ng/㎖)와 NAC(1mM)의 조합 약물을 normal saline에 희석하여 매일 복강주사하였다. 대조군에는 처리 약물과 동량의 생리식염수를 주사하였다.

8주 경과 후 쥐를 희생시킨 뒤, Fuji-Dry Chem을 이용하여 AST, ALT, Total bilirubin, TG, Albumin을 측정하였고, 쥐의 간 조직을 확보하여 Hemotoxylin& Eosin staining을 실시하였다. 간경변을 확인하기 위해 Masson's Trichrome staining을 실시하여 Collagen을 염색한 후 간경변의 진행 정도를 확인하였다. 아래 표 1의 조직학적 섬유증 단계(Historical fibrosis stage)를 기준으로 점수화하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 11에 나타내었다.

Score	Fibrosis stage
0	Absence of fibrosis
1	Portal/perisinusodial
2	Perisinusodial and portal/periportal
3	Septal or bridging fibrosis
4	Cirrhosis

Group	Fibrosis score (mean ± Er)
control	2.1 ± 0.74
FK506	1.55 ± 0.44
NAC	1.83 ± 0.82
Everolimus	0.8 ± 0.27
Everolimus + NAC	0.083 ± 0.2

상기 표 2 및 도 11을 참고하면, 대조군에 비해 mTOR 억제제 또는 mTOR 억제제와 NAC를 처리한 군에서 섬유화 정도가 감소하는 경향성을 확인할 수 있다. 더욱이, mTOR 억제제를 단독으로 처리한 군에 비해 NAC와 조합 처리한 군에서 섬유화가 유의미하게 감소하는 것을 알 수 있다.

구체적으로, 대조군과 비교 시 mTOR 억제제 단독 처리군에서는 약 38% 정도의 섬유화가 진행된 것을 확인할 수 있고, mTOR 억제제와 NAC를 함께 처리한 군에서는 약 3%의 섬유화만이 확인되었다. 따라서, mTOR 단독 처리 군에 비해 조합 처리군에서는 약 12.6% 정도 섬유화가 억제되는 것을 알 수 있다.

in vitro와 in vivo 연구를 통하여 mTOR 억제제와 NAC의 조합 처리가 in vitro 에서 HSC의 활성화를 효과적으로 억제하고, in vivo 에서 섬유화(fibrosis)를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims (7)

1. mTOR 억제제(mTOR inhibitor) 및 N-아세틸시스테인(NAC, N-acetylcysteine)을 포함하는, 간섬유화 억제용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 mTOR 억제제는 라파마이신(rapamycin) 또는 에베롤리무스(everolimus)인, 간섬유화 억제용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 mTOR 억제제의 농도는 10ng/㎖ 내지 20ng/㎖인, 간섬유화 억제용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 N-아세틸시스테인의 농도는 1mM 내지 5mM인, 간섬유화 억제용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   간성상세포(HSC, hepatic stellate cell)의 활성을 억제하는, 간섬유화 억제용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   Ⅰ형 콜라겐(Collagen type Ⅰ)의 발현을 억제하는, 간섬유화 억제용 조성물.
   
7. 제5항에 있어서,
   α-SMA(α-smooth muscle actin)의 발현을 억제하는, 간섬유화 억제용 조성물.

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