KR20010103471A - 공역화 리놀레산을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공역화 리놀레산을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 공역화 리놀레산이 융모요막의 혈관신생에 대한 억제작용, 염기성 섬유아세포 성장인자로 유도된 혈관신생에 대한 억제작용 및 혈관내피세포의 이상증식에 대한 억제작용을 가지는 바, 공역화 리놀레산을 유효성분으로 하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 억제제로 제조되어 혈관신생 억제뿐만 아니라, 혈관신생과 관련된 암의 성장 및 전이의 억제에도 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

Description

공역화 리놀레산을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제{Inhibitor for Angiogenesis Comprising Conjugated Linoleic Acid as an Active Ingredient}

본 발명은 공역화 리놀레산을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 공역화 리놀레산을 유효성분으로 하며, 혈관신생 억제뿐만 아니라 혈관신생과 관련된 암의 성장 및 전이 억제에 효과적으로 사용될 수 있는 혈관신생 억제제에 관한 것이다.

공역화 리놀레산(conjugated linoleic acid, C₁₈H₃₂O₂, 이하 'CLA'라 함)은 미량의 천연 지방산 성분이며, 흔히 되새김질 동물의 젖이나 근육에서 발견된다. 예를 들면, 소 및 산양과 같은 되새김질 동물의 되새김위내에서 식물성 기름의 주요 성분인 리놀레산 또는 리놀렌산(linolenic acid, C₁₈H₃₀O₂)과 혐기성 세균인 부티리비브리오 피브로이솔벤스(Butyrivibrio fibroisolvens)에 의한 수소첨가 반응산물에 의하여 CLA가 생성된다. 아울러, 공역화 리놀레산은 사람의 체내에서 리놀레산의 탄소중심 자유단-매개의 산화 또는 식이성의 섭취에 기인하여 생성되는 것으로 보고되었고, 최근에는 CLA가 체지방을 감소시켜 비만을 억제한다고 알려져 있다.

한편, 전이성 암은 침습성(invasion) 및 전이성(metastasis)을 나타내는 특징을 갖는데, 암의 발병부위에서 전이장소로 전이하는 과정에서는 암세포가 혈관 간질 및 실질속으로 유출된 후, 혈관신생(angiogenesis)을 유도하게 된다. 이때, 암세포가 분비하는 혈관신생 촉진인자들에 의한 혈관벽의 이완으로 인한 투과성이 증가하게 되면, 혈관내피세포들간의 결합이 파괴되어 세포가 수축하여, 다양한 단백질 분해효소가 활성되어 기저막(basement membrane)을 분해하게 된다. 이어, 혈관내피세포들이 혈관벽으로부터 자극이 있는 방향의 혈관주변 조직으로 이동하여, 혈관내피세포들이 증식하여 신생혈관이 형성되고 성장하여 최종적으로 전이성 암을 유발하게 된다. 따라서, 이러한 혈관신생을 억제하는 것은 항암치료에 있어서 필수적인 과정이다.

또한, 최근에 혈관신생이 비만의 과정에서도 발견됨이 보고되어, 혈관신생을 억제함으로써 상술한 암의 성장과 전이를 억제할 수 있을 뿐 아니라, 체지방을 감소시키는 기전과는 다른 접근 방법으로 비만을 치료할 수 있는 효과를 가질 수 있는 가능성이 제시되었으나, 이에 대한 구체적인 연구는 미미한 실정이다. 따라서, 암의 성장과 전이, 비만을 치료하기 위하여 천연에 다량 존재하는 단백질, 펩티드, 이들의 대사산물 또는 기타 단일물질을 이용한 혈관신생 억제제의 개발이 끊임없이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 CLA가 비만에 효과를 갖는 것에 착안하여, 혈관신생에 CLA가 관여하는지 밝히고자 예의 연구노력한 결과, CLA가 혈관신생을 강력하게 억제하는 작용이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 CLA를 유효성분으로 하는 혈관신생 억제제를 제공하는 것이다.

도 1은 마트리겔을 마우스에 피하주사한 후, 헤모글로빈의 양의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 공역화 리놀레산(CLA)의 혈관내피세포 이상증식 억제효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 CLA를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제에 대하여, 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 CLA가 혈관신생에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 수정란을 대상으로 하여 혈관의 형성 및 분화와 관련된 융모요막의 성장이 가장 왕성한 시기의 배를 선택하여, 융모요막에 CLA 또는 혈관신생에 대하여 억제작용을 한다고 알려진레틴산(retinoic acid, C₂₀H₂₈O₂)을 처리한 후, 이들을 배양하여 레틴산을 처리한 경우와 비교하여 혈관신생에 대한 CLA의 영향을 조사한 결과, CLA에 의하여 혈관신생이 현저히 감소되는 효과를 확인할 수 있었다.

이어, 혈관신생을 유도하는 bFGF(basic fibroblast growth factor, 이하, 'bFGF' 라 함)및 혈관신생 촉진인자인 헤파린에 의하여 유도된 혈관신생 과정에 대하여 CLA가 어떠한 작용을 하는지 확인하기 위하여, 마우스를 대상으로 마트리겔 플라그 실험을 수행한 결과, bFGF에 의하여 유도된 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있음을 헤모글로빈 감소율로 확인할 수 있었다.

아울러, CLA가 혈관내피세포의 이상증식에도 영향을 미치는지 알아보기 위하여,³H가 표지된 메틸 티미딘을 표식자로 하여 사람의 탯줄정맥의 내피세포를 대상으로 확인한 결과, CLA가 정상상태의 혈관내피세포의 증식에는 영향을 주지 않으면서, 이상증식하는 혈관내피세포에만 특이적으로 억제하는 것을 관찰하였다. 상술한 결과에 의하여, CLA는 혈관신생에 대하여 특이성 및 선택성을 갖는 억제작용이 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 혈관신생 억제작용을 하는 CLA는 암 뿐만 아니라, 과다한 혈관형성이 동반되는 비만, 류마티즘, 당뇨병성 망막증의 치료에 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: CLA의 혈관신생 억제작용

혈관신생에 CLA가 관여하는지 알아보기 위하여, 계배의 융모요막(chorioallantoic membrane, 이하 'CAM'이라 함)을 대상으로 CAM 시험방법을 하기와 같이 수행하였다: 즉, 수정란을 45시간 동안 18℃에서 방치한 다음, 90의 습도가 유지되는 37℃의 배양기에서 배양 첫날을 0일배로 하여 배양한 후, 3일배가 되면 계란의 끝부분에 구멍을 내어 주사기로 알부민을 2㎖ 뽑아내었다. 또한, 계란의 공기주머니가 있는 쪽을 요오드팅크로 소독한 후, 메스를 이용하여 지름 3㎝ 크기의 원형 창문을 만들고, 공기 주머니 아래에 있는 막을 핀셋으로 제거한 후 유리테이프로 구멍을 차단하였다. 이어, CAM의 성장이 가장 왕성한 시기인 4.5일배가 되면, 여러물질이 도포된 터마녹스 커버슬립(thermanox coverslip, Nunc Co., U.S.A.)에 시험하고자 하는 CLA(C₁₈H₃₂O₂, Sigma Chemical Co., U.S.A.)를 점적하여 도포하고 건조시켰다. 이와 동시에, 종래 공지된 혈관형성 억제제인 레틴산을 양성 대조군으로 사용하여 터마녹스 커버슬립에 도포하고, 음성대조군으로 물질이 도포되지 않은 빈 커버슬립을 사용하였다. 커버슬립이 완전히 건조되면 계배의 유리테이프를 떼어낸 후, 커버슬립을 발생 중의 태자(embryo) CAM 표면에 놓고, 다시 유리테이프로 창문을 차단시킨 후, 배양기에서 2일동안 배양시켰다. 그런 다음, 10지방 에멀젼(fat emulsion, Intralipid^R,녹십자)을 CAM 안쪽에 주입하여 해부 현미경(8배율)으로 혈관신생이 억제되었는지 관찰하고, CAM의 사진을 촬영하였다. 그 결과, 약물을 점적하지 않은 커버슬립만을 CAM 상에 올려 관찰하면 정상적인 혈관 형태를 관찰할 수 있었으나, 혈관신생 억제제로 공지된 레틴산을 처리하면 새로운 혈관의 발아(sprouting)가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, CLA를 도포한 커버슬립의 경우에 10㎍/계란의 농도에서 55.6의 놀라운 혈관신생 억제를 확인할 수 있었다. 이 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

CLA에 의한 혈관신생의 억제

시료	용량(㎍/계란)	처리된 CAM 총 수	양성율
음성대조군	-	7	14.3
양성대조군(레틴산)	1	12	83.3
CLA	10	9	55.6
	100	12	83.3

실시예 2: bFGF 유도 혈관신생에 대한 CLA의 억제작용

혈관형성을 촉진하는 물질에 의하여 유도된 혈관신생에 CLA가 관여하는지 알아보기 위하여 하기와 같은 마트리겔 플라그 실험을 수행하였다. 즉, 엔젤브레트-홈-스웜 마우스 육종(Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) mouse sarcoma)으로부터 분리되어, 라미닌(laminin), 콜라겐 IV(collagen IV), 헤파란 설페이트 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycans), 엔탁틴(entactin), 니도겐(nidogen), 변형 성장인자-베타(transforming growth factor-beta, TGF-beta), 섬유아세포 성장인자, 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator) 및 다른 성장인자를 포함하는 마트리겔(Matrigel, Collaborative Research, Inc., U.S.A.)에 염기성 섬유아세포성장인자(Upstate, U.S.A.) 100ng/㎖ 및 CLA 200㎍/㎖를 혼합하고 혈관형성 촉진을 증대시켜 주는 헤파린 500㎕(Sigma Chemical Co., U.S.A.)를 추가로 혼합하여 감염방지가 된(specific pathogen free) 6주 내지 7주령인 웅성 마우스 C57BL/6의 복부에 피하주사하였다. 이때, 대조군으로 헤파린만이 혼합된 마트리겔, bFGF와 헤파린이 혼합된 마트리겔을 다른 마우스에 투여하였다. 이어, 5일 후에 마우스의 복부로부터 조직을 수득하고, 마손의 삼색계(Masson's trichrome)에 의한 콜라겐 섬유의 염색법을 통하여 혈관형성을 관찰하였다. 즉, 마우스로부터 수득된 조직을 10포르말린에 고정시킨 다음, 슬라이드상에 도말하여 부인 용액(Bouin solution)에 담그고, 상온에서 하룻밤 동안 방치시키거나 56℃에서 1시간 동안 방치시켰다. 그런 다음, 흐르는 물에 색이 사라질 때 까지 수세하고, 증류수로 세척한 후, 바이게르트 철 헤마톡실린(Weighert iron hematoxylin) 용액에서 10분동안 핵염색을 수행하고 수세하였다. 이어, 1비브리치 스칼렛- 1산성 푹신(Biebrich Scarlet-acid fuchsin) 용액이 90㎖ 대 10㎖로 혼합되고 글라이시알 아세트산이 1㎖이 첨가된 용액에서 10분간 염색한 다음, 증류수로 여러번 수세하였다. 수세된 슬라이드를 5포스포텅스텐산(phosphotungstic acid)에서 10 분 동안 반응시키고 밝은 녹색(light green) 용액에서 5분 동안 염색한 후, 증류수로 수차례 수세하여 1아세트산 용액에서 3분 동안 반응시키고, 수차례 수세한 후 커버슬립을 덮었다. 전기 염색과정에 의하여, 현미경상에서 콜라겐 섬유는 녹색을 띄고, 근육 및 세포질은 붉은색을 띄며, 핵은 푸른빛을 띄는 흑색을 나타내므로, 혈관형성시 나타나는 변화를 관찰할 수 있었다. 이러한 염색을 통하여, 마우스 복부로 주입된 마트리겔은 체온에 의하여 겔을 형성하고 마트리겔 내부의 bFGF는 서서히 방출되면서 복강막으로 흡수되어 복강막 주위의 혈관으로부터 마트리겔 쪽으로 신생 혈관이 형성되면서 이동하는 반면, CLA가 혼합된 마트리겔은 bFGF가 유도하는 혈관 형성을 효과적으로 억제함을 관찰할 수 있었다.

또한, 마트리겔이 함유하고 있는 전체 헤모글로빈의 양을 드랍킨 시약 키트(Drabkin reagent kit 525, Sigma Chemical Co., U.S.A.)을 이용하여 정량화함으로써, 혈관신생 정도를 수치화하였다. 도 1은 마트리겔을 마우스에 피하주사한 후, 헤모글로빈의 양의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 1에서도 보듯이, bFGF를 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때, bFGF를 처리한 경우 헤모글로빈의 양은 약 9.91g/㎗로써 혈관신생이 증가하였다. 그러나, bFGF 및 CLA가 함께 투여된 경우, 헤모글로빈의 양은 1.39g/㎗로 bFGF만의 투여에 의하여 증가된 혈관신생과 비교하였을 때, 약 86의 현저한 헤모글로빈 감소율을 나타냄을 알 수 있었는 바, CLA는 bFGF가 유도하는 혈관신생을 강력하게 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 3: CLA의 혈관내피세포의 이상증식 억제

사람의 탯줄정맥의 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC, Dong-A University)를 20의 소의 태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco-BRL, U.S.A.), 스트렙토마이신, 페니실린을 포함하는 M199(media 199, Gibco-BRL, U.S.A.) 배지를 사용하여 배양하였다. 이어, 24웰-플레이트에 웰 당 1×10⁴세포/㎖를 분주하여 37℃, 5CO₂조건의 배양기에서 24시간동안 부착시킨 후, 대조군, 100μM의 CLA, 200μM의 CLA, bFGF(40ng/㎖), bFGF(40ng/㎖) 및 100μM의 CLA, 혹은 bFGF(40ng/㎖) 및 200μM의 CLA를 처리한 6개의 군을 각각 48시간 반응시키고, 세포의 이상증식을 나타내주는 표식자인³H가 표지된 메틸 티미딘(³H-methyl thymidine)을 가하여 세포에 침투시켰다. 이어, 4시간이 지나면, 배양액을 제거하고, 메탄올로 세포를 고정시켜 10트리클로로아세트산을 이용하여 표지되지 않은 메틸 티아민을 제거하였다. 그 후, 세포를 용해시켜 방사선동위원소량을 측정하여³H-메틸 티미딘의 침투율로서 혈관내피세포의 이상증식정도를 측정하였다.

도 2는 CLA에 의한 혈관내피세포 이상증식 억제효과를 나타낸 그래프이다: 이때, 각각의 막대는 대조군, 100μM의 CLA, 200μM의 CLA, bFGF(40ng/㎖), bFGF(40ng/㎖)와 100μM의 CLA 또는 bFGF(40ng/㎖)와 200μM의 CLA를 처리한 6개의 군을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 대조군 또는 CLA만을 단독 처리한 실험군에서는 혈관신생이 일어나지 않거나 거의 미미하였으나, bFGF만을 처리하였을 경우³H-메틸티미딘의 침투율은 840로서 bFGF에 의한 혈관신생이 활발히 일어남을 확인할 수 있었다. 한편, bFGF와 CLA를 함께 처리함에 따라서,³H-메틸 티미딘의 침투율은 CLA의 농도에 의존하여 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서, bFGF에 의하여 유도되는 혈관내피세포 이상증식은 CLA에 의하여 현저히 억제됨을 알 수 있었는 바, CLA를 혈관내피세포의 이상증식에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 CLA는 통상의 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제의 담체와 혼합하여 약학적 제제를 제조할 수 있다. 이하에서는 제제의 제조예를 실시예로서 예시하였다.

실시예 4: 정제의 제조

다음의 원료를 균질하게 혼합하여 약전 제제총칙 중 정제 제조방법에 따라서, 1정 400㎎ 당 CLA를 10㎎ 함유하도록 타정하였다.

CLA 10㎎

락토즈 285㎎

마그네슘 스테아레이트 5㎎

칼슘 카르복시셀룰로오스 25㎎

경질무수규산 75㎎

총량 400㎎

실시예 5: 연질캅셀제의 제조

다음의 조성물들을 약전 제제총칙 중 연질캅셀제 제조방법에 따라서, 1 캅셀 400㎎ 당 CLA를 10㎎ 함유하도록 충진하였다.

CLA 10㎎

젤라틴 140㎎

글리세린 60㎎

파라옥시메틸벤조에이트 0.3㎎

파라옥시프로필메틸벤조에이트 0.3㎎

대두유 적량

총량 400㎎

실시예 6: 연고제의 제조

다음의 원료를 약전 제제총칙 중 연고제 제조방법에 따라서 제조하고, 1g 당 CLA를 10㎎ 함유하도록 연질캅셀제를 제조하였다.

CLA 10㎎

경질유동파라핀 100㎎

스테아릴알콜 80㎎

세토스테아릴알콜 13㎎

프로필렌글리콜 50㎎

모노스테아레이트 폴리옥시에틸소르비탄 30㎎

부틸화 하이드록시톨루엔 0.4㎎

파라옥시벤조에이트 메틸 에스테르 0.9㎎

파라옥시벤조에이트 부틸 에스테르 0.9㎎

정제수 적량

총량 1g

실시예 7: 주사제의 제조

다음의 원료를 약전 제제총칙중 주사제 제조방법에 따라서 제조하고, 5㎖의 앰플 당 CLA를 2㎎ 함유하도록 밀봉하여 멸균하였다.

CLA 2㎎

소디움사이트레이트 500㎎

주사용증류수 적당량

총량 5㎖

CLA의 급성독성실험

6 내지 7주령 된 마우스를 대상으로 본 발명의 CLA를 경구투여하여 24시간내의 개체사망율을 조사하여, 그 결과, 200㎎/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않아, 본 발명의 CLA는 kg당 200㎎까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 혈관신생 억제제로서 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 혈관신생 억제제의 유효성분으로 함유되는 CLA는 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당, 콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바닐린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제, 경고제, 과립제, 로오숀제, 에어로솔제, 좌제, 카타플라스마제, 크림제, 트로키제, 파스타제, 환제 및 주사제 등의 약학적 제제로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 약제조성물 중 유효성분인 CLA의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라 투여될 수 있으며, 제제중의 유효성분인 CLA는 성인을 기준으로 1일 10㎍ 내지 100㎎을, 바람직하게는 20㎍ 내지 100㎎을 1회 또는 그 이상을 분복할 수 있다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 CLA를 유효성분으로 하며 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 억제제를 제공한다. 본 발명에 의하면, CLA가 혈관신생에 대한 작용을 융모요막의 혈관신생에 대한 억제작용, bFGF로 유도된 혈관신생에 억제작용 및 혈관내피세포의 이상증식에 억제작용을 가지므로, 혈관신생 억제뿐만 아니라, 혈관신생과 관련된 암의 성장 및 전이 억제에도 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

Claims (2)

1. 공역화 리놀레산을 유효성분으로 하며 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 억제제.
2. 제 1항에 있어서,

   정제, 연질캅셀제, 캅셀제, 액제, 연고제, 경고제, 과립제, 로오숀제,

   에어로솔제, 좌제, 카타플라스마제, 크림제, 트로키제, 파스타제, 환제,

   주사제로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

   혈관신생 억제제.