KR20170109037A - 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 및 그것의 생산 및 사용 방법 - Google Patents

활성화된 포르밀글리신-생성 효소 및 그것의 생산 및 사용 방법 Download PDF

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패트릭 홀더
진 베이커
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Abstract

본 개시물은 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE), 활성화된 FGE를 생산하는 방법, 및 포르밀글리신 (FGly) 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법에서 그것들의 사용을 제공한다. 활성화된 FGE의 생산 방법, 뿐만 아니라 FGly-함유 단백질의 생산에서 활성화된 FGE의 사용 방법은 세포-기반 및 무세포 방법 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 본 개시물의 방법을 실시하는데 사용되는 조성물 및 키트가 또한 제공된다.

Description

활성화된 포르밀글리신-생성 효소 및 그것의 생산 및 사용 방법
관련 출원에 대한 교차 -참조
본 출원은 2015년 2월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/112,422, 및 2015년 3월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/134,461의 이익을 주장하며, 이것들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
치료 단백질의 성질은 부위-특이적 단백질 컨쥬게이션(conjugation)에 의해 향상될 수 있다. 포유류 세포에서 발현된 재조합 단백질은 하나 이상의 유전적으로 암호화된 알데하이드 기를 통해 부위-특이적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 5개의 잔기만큼 짧을 수도 있는, 소포체 (ER)-잔류 포르밀글리신 생성 효소 (FGE)에 의해 인식되는 펩타이드 서열은 포유류 세포에서 발현된 이종 기원 단백질로 유전적으로 암호화될 수도 있다. FGE는 동시-번역에 의해 FGE 인식 부위의 시스테인 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시켜서, 독특한 알데하이드 기를 가지고 있는 단백질을 생산한다. 이 알데하이드 기는 단백질로의 관심 작용제 (예를 들어, 치료제, 영상화제, 등)의 부위-특이적 컨쥬게이션에 이용될 수도 있다.
본 개시물은 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE), 활성화된 FGE를 생산하는 방법, 및 포르밀글리신 (FGly) 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법에서의 그것들의 사용을 제공한다. 활성화된 FGE를 생산하는 방법뿐만 아니라, FGly-함유 단백질의 생산에서 활성화된 FGE의 사용 방법은 세포-기반 및 무세포 방법 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 본 개시물의 방법을 실시하는데 사용되는 조성물 및 키트 또한 제공된다.
본 개시물의 양태는 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 방법은 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하기 위해 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 활성화된 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 조건 하에서 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질과 조합하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 조합하는 단계는 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 세포 배양 조건 하에서 Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지에서 포르밀글리신-생성 효소 (FGE), 및 FGE 인식 부위를 가지는 단백질을 포함한 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 nM 내지 10 mM의 농도로 존재한다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 μM 내지 1 mM의 농도로 존재한다.
포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법이 세포를 포함하는 일부 구체예에서, FGE는 세포에 대하여 내인성이고 및/또는 세포는 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형되며, FGE 인식 부위를 함유하는 단백질은 세포에 대하여 내인성이고 및/또는 세포는 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된다. FGE 및 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질 중 하나 또는 둘 다는 세포에 대하여 내인성일 수도 있거나, 세포는 FGE 및 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질 중 하나 또는 둘 다를 발현하도록 유전적으로 변형될 수도 있다. 세포가 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형된 경우, 세포는 또한 세포에 대하여 내인성인 FGE를 발현할 수도 있다.
일부 구체예에서, 세포는 진핵 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다.
일부 구체예에서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마(hybridoma) 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 효모 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 곤충 세포이다.
일부 구체예에서, 조합하는 단계는 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 조건 하에서 Cu2 +를 포함하는 무세포 반응 혼합물에서 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 발현하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질은 환원제를 포함한 반응 혼합물에서 조합된다. 일부 구체예에서, 환원제는 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기의 포르밀글리신 잔기로의 전환을 촉진한다. 일부 구체예에서, 환원제는 2-메르캅토에탄올이다.
일부 구체예에서, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질은 무세포 반응 혼합물에서 조합된다.
일부 구체예에서, 방법은, 활성화된 FGE를 FGE 인식 부위를 가진 단백질과 조합하기 전에, FGE를 Cu2 +로 활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 원소상 산소는 말단 산화제로서 존재한다.
일부 구체예에서, 원소상 산소는 산소, 산소 및 황화수소의 혼합물, 또는 염기성 조건 하에서의 산소에 의해 제공된다.
일부 구체예에서, 원소상 산소는 Cu2 +에 의해 촉매화된 반응에서 말단 산화제이다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 황산구리, 시트르산구리, 타르타르산구리, 펠링 시약(Fehling's reagent), 및 베네딕트 시약(Benedict's reagent)으로부터 선택된 Cu2+의 공급원에 의해 제공된다.
일부 구체예에서, Cu2 +의 공급원은 황산구리이다.
일부 구체예에서, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질이 무세포 반응 혼합물에서 조합될 때, 활성화된 FGE는 N-말단 절단된 FGE이다. N-말단 절단된 FGE는 N-말단 절단된 인간 FGE일 수도 있다.
일부 구체예에서, 단백질은 항체 또는 항체 단편이다.
일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 IgG 또는 이것의 단편, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, ScFv, 이중 특이적 항체 또는 이것의 단편, 디아바디 또는 이것의 단편, 키메라 항체 또는 이것의 단편, 단클론성 항체 또는 이것의 단편, 인간화된 항체 또는 이것의 단편, 및 완전한 인간 항체 또는 이것의 단편으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항체는 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 종양 관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 HER2, CD19, CD22, CD30, CD33, CD56, CD66/CEACAM5, CD70, CD74, CD79b, CD138, 넥틴-4, 메소텔린, 막관통 당단백질 NMB (GPNMB), 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), SLC44A4, CA6, 및 CA-IX로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 단백질은 리간드이다.
일부 구체예에서, 리간드는 성장 인자이다.
일부 구체예에서, 리간드는 호르몬이다.
일부 구체예에서, 방법은 포르밀글리신 잔기의 알데하이드 모이어티를 통해 포르밀글리신 잔기를 가진 단백질에 작용제를 컨쥬게이션하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 작용제는 치료제이다.
일부 구체예에서, 치료제는 세포독성제, 항증식제, 항신생물제, 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 작용제는 영상화제이다.
일부 구체예에서, 영상화제는 형광 염료, 근적외선 (NIR) 영상화제, 및 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)/CT 영상화제, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화제, 자기 공명 영상 (MRI) 제, 양전자-방출 단층촬영 (PET) 제, X선 영상화제, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 영상화제, K-엣지(K-edge) 영상화제, 초음파 영상화제, 광음향 영상화제, 음향 광학 영상화제, 마이크로파 영상화제, 핵 영상화제, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다.
본 개시물의 양태는 Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지, 및 세포 배양 배지에 존재하는 세포를 포함하는 조성물을 포함하며, 세포는 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 발현한다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 0.1 μM 내지 10 mM의 농도로 존재한다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 μM 내지 1 mM의 농도로 존재한다.
조성물이 세포를 포함하는 일부 구체예에서, FGE는 세포에 대하여 내인성이고 및/또는 세포는 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형되며, FGE는 인식 부위를 함유하는 단백질 세포에 대하여 내인성이고 및/또는 세포는 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된다. FGE 및 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질 중 하나 또는 둘 다는 세포에 대하여 내인성일 수도 있거나, 세포는 FGE 및 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질 중 하나 또는 둘 다를 발현하도록 유전적으로 변형될 수도 있다. 세포가 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형되는 경우, 세포는 또한 세포에 대하여 내인성인 FGE를 발현할 수도 있다.
일부 구체예에서, 세포는 진핵 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다.
일부 구체예에서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 효모 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 곤충 세포이다.
일부 구체예에서, 세포는 원핵 세포이다.
본 개시물의 양태는 Cu2 +를 가진 세포 배양 배지에서 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 포함하며, 배양하는 단계는 FGE가 세포에서 발현되는 조건 하에서 이루어진다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 0.1 μM 내지 10 mM의 농도로 존재한다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 μM 내지 1 mM의 농도로 존재한다.
일부 구체예에서, 세포는 진핵 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다.
일부 구체예에서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 효모 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 곤충 세포이다.
일부 구체예에서, 세포는 원핵 세포이다.
본 개시물의 양태는 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 생산하는 방법을 포함하며, 방법은 활성화된 FGE를 생산하기 위해 FGE를 Cu2 +로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, FGE를 Cu2 +로 처리하는 단계는 Cu2 +를 가진 세포 배양 배지에서 FGE를 암호화하는 핵산을 가진 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 배양하는 단계는 FGE가 세포에서 발현되는 조건 하에서 이루어진다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 0.1 μM 내지 10 mM의 농도로 존재한다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 μM 내지 1 mM의 농도로 존재한다.
일부 구체예에서, 세포는 진핵 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다.
일부 구체예에서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 효모 세포이다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 곤충 세포이다.
일부 구체예에서, 세포는 원핵 세포이다.
일부 구체예에서, 방법은 세포로부터 FGE를 정제하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, FGE를 처리하는 단계는 Cu2 +를 포함한 무세포 반응 혼합물에서 FGE를 발현시키는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, FGE는 무세포 반응 혼합물에서 Cu2 +로 처리된다.
일부 구체예에서, 원소상 산소는 말단 산화제로서 존재한다.
일부 구체예에서, 원소상 산소는 산소, 산소 및 황화수소의 혼합물, 또는 염기성 조건 하에서의 산소에 의해 제공된다.
일부 구체예에서, 원소상 산소는 Cu2 +에 의해 촉매화된 반응에서 말단 산화제이다.
일부 구체예에서, Cu2 +는 황산구리, 시트르산구리, 타르타르산구리, 펠링 시약, 및 베네딕트 시약으로부터 선택된 Cu2 +의 공급원에 의해 제공된다.
일부 구체예에서, 방법은 Cu2 +로부터 FGE를 정제하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, FGE가 무세포 반응 혼합물에서 Cu2 +로 처리될 때, FGE는 N-말단 절단된 FGE이다. 일부 구체예에서, FGE는 N-말단 절단된 인간 FGE이다.
본 개시물의 양태는 본원에서 개시된 방법에 의해 생산된, 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 포함한다.
본 개시물의 양태는 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE), 및 버퍼를 포함하는 무세포 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 무세포 조성물에 포함된, 활성화된 FGE는 N-말단 절단된 FGE (예를 들어, N-말단 절단된 인간 FGE)이다.
일부 구체예에서, 조성물은 FGE 인식 부위를 가진 단백질을 포함한다.
본 개시물의 양태는 키트를 포함한다. 키트는 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE), 및 단백질의 FGE 인식 부위에 존재하는 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키기 위해 활성화된 FGE를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트에 포함된, 활성화된 FGE는 N-말단 절단된 FGE (예를 들어, N-말단 절단된 인간 FGE)이다.
본 개시물의 양태는 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 암호화하는 핵산, 및 Cu2+ 또는 Cu2 +의 공급원을 포함하는 키트를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 또한 핵산에 의해 암호화된 FGE를 발현하는데 적합한 세포를 포함한다. 이러한 세포는 내인성 FGE를 발현하고 및/또는 FGE 인식 부위를 함유하는 내인성 단백질을 발현할 수도 있다.
도 1, 패널 A-B는 본 개시물의 특정 구체예에 따라 Cu2 +-처리된 세포에서 생체 내 FGE 활성화/증가된 전환을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 2는 본 개시물의 특정 구체예에 따라 Cu2 +-처리된 세포에서 생체 내 FGE 활성화/증가된 전환을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 3, 패널 A는 Cu2 +-처리된 세포 및 미처리 세포의 생균 밀도를 비교하는 데이터를 나타낸다. 도 3, 패널 B는 Cu2 +-처리된 세포 및 미처리 세포의 단백질 역가를 비교하는 데이터를 나타낸다. 도 3, 패널 C는 본 개시물의 특정 구체예에 따라 Cu2 +-처리된 세포에서 생체 내 FGE 활성화/증가된 전환을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 4는 본 개시물의 특정 구체예에 따라 Cu2 +-처리된 세포에서 생체 내 FGE 활성화/증가된 전환을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 5는 Cu2 +-처리된 대장균(E. coli) 세포 및 미처리 대장균 세포로부터 단리된 FGE를 비교하는 액체 크로마토그래피-질량 분석 데이터를 제공한다.
도 6은 본 개시물의 특정 구체예에 따라, CuSO4를 사용하여 Sc FGE의 시험관 내 활성화를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 7, 패널 A는 본 개시물의 특정 구체예에 따라 Cu2 +의 존재 또는 Cu2 +의 부재 하에서의 % 전환의 그래프를 나타낸다. 도 7, 패널 B는 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서의 락테이트 소모의 그래프를 나타낸다. 도 7, 패널 C는 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서의 글루코스 소모의 그래프를 나타낸다.
도 8은 본 개시물의 특정 구체예에 따라 Cu2 +-처리된 세포에서 생체 내 FGE 활성화에 대한 전환 효율의 감소된 변동성을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 9, 패널 A, 및 도 9, 패널 B는 본 개시물의 특정 구체예에 따라 세포 배양 배지에서 Cu2 +의 공급은 유사한 수준의 FGE를 발생시키지만 구리 배양물에서의 FGE의 활성은 훨씬 더 크다는 것을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 10은 SDS-PAGE 전기영동에 의해 특성화된, 정제된 FGE의 이미지를 나타낸다. Sc-FGE 및 Hs-cFGE 조제물은 양호한 양 및 순도로 효소를 수득하였다. 도 10, 패널 a, 레인들은 다음과 같이 Sc-FGE 정제의 중간 스테이지를 나타낸다: 1 - 세포 용해 이후 전체 가용성 단백질; 2 - 1 부피% 스트렙토마이신 설페이트로 DNA 침전 이후 전체 가용성 단백질; 3 - Ni-NTA 레진 상에 용해물의 로딩으로부터 회수된 통과액 중 가용성 단백질; 4 - Ni-NTA 크로마토그래피의 세척 분획 중 가용성 단백질; 및 5 - Ni-NTA 크로마토그래피의 용출 분획 중 가용성 단백질. 도 10, 패널 b는 Hi5 세포에서 발현된 Hs-cFGE의 10개의 생산 배치(batch)의 최종 순도를 나타낸다.
도 11은 시작 재료 및 생산 펩타이드의 LC/MS 특성화를 나타낸다. 도 14, 패널 a로부터 체류 t = 2.1 min (도 11, 패널 a), 및 t = 3.3 min (도 11, 패널 b)을 갖는 피크의 스펙트럼이 도시된다.
도 12는 기질 다이머화의 함수로서 반응 억제의 그래프를 나타낸다. 도 12, 패널 a는 Csub-Csub 다이머의 동일성이 FGE로의 시험관 내 전환 중에 형성된 부산물 피크의 LC-MS에 의해 확인되었음을 나타내는 그래프를 나타낸다. 도 12, 패널 b는 FGE 반응 혼합물에 과산화수소의 첨가가 기질 다이머를 신속하게 형성하여 생성물 형성을 억제하였음을 나타내는 그래프를 나타낸다. 도 12, 패널 c는 생성물 형성이 또한 반응 혼합물 중 Cu2 +의 존재에 의해 억제되었음을 나타내는 그래프를 나타낸다. 이 억제는 DTT의 소모 (도 12, 패널 d) 및 다이머화에 의한 기질의 트랩핑(trapping) (도 12, 패널 e)의 결과였다.
도 13은 FGE에 의해 형성된 기질 이황화물의 식별 및 모니터링에 관한 데이터를 나타낸다. 도 13, 패널 a는 Csub-BME의 LC/MS 식별을 나타낸다. 도 13, 패널 b는 화학량론적 환원제로서 BME를 함유한 FGE 반응 혼합물의 확장된 HPLC 트레이스(trace)를 나타낸다. 생성물 형성은 FGE에 의해, 환원제의 부재 하에서 (도 13, 패널 c), 2.5 mol 당량의 환원제 (도 13, 패널 d) 및, 100 mol 당량의 환원제 (도 13, 패널 e)로 촉매화되었다.
도 14는 FGE의 특이적 활성이 불연속 활성 검정을 사용하여 측정되었음을 나타내는 데이터를 제공한다. 도 14, 패널 a는 FGE 촉매 작용의 동역학을 측정하기 위해 14개의 아미노산 펩타이드 기질이 사용된 데이터를 나타낸다. Cys- 및 fGly-함유 펩타이드는 RP-HPLC에 의해 분리되고, 그것들의 양은 215 nm에서 피크 면적을 통합하여 결정되었다. 별표는 펩타이드 합성 중에 형성된 불순물을 나타낸다. 도 14, 패널 b는 초기 반응 속도 (v 0)가 시간 (t)에 대한 즉각적인 반응 속도 (p/t)의 플롯을 y축 (t = 0)에 외삽(extrapolate)하여 결정되었음을 나타내는 데이터를 나타낸다. 도 14, 패널 c는 야생형 Hs-FGE가 세 개의 주요 도메인을 함유한다는 것을 나타내는 개략도를 나타낸다: ER-지향성 신호 서열, ER 체류를 위해 ERp44와 상호작용하는 N-말단 연장부, 및 촉매 코어. 도 14, 패널 d는 세포 배양물로부터 정제된 진핵생물 및 원핵생물 FGE의 특이적 활성을 나타내는 그래프를 나타낸다. 전장 (Hs-FGE) 및 NTE가 없는 코어 (Hs-cFGE)는 유사한 특이적 활성을 갖고 있었다. Hs-FGE와의 높은 서열 및 구조 상동성에도 불구하고, 대장균에서 생산된 원핵생물 Sc-FGE는 Hs-cFGE보다 덜 활성이었다.
도 15는 FGE의 특이적 활성이 구리(II)의 화학량론적 양의 처리시 크게 증가하였음을 나타내는 데이터를 나타낸다. 도 15, 패널 a는 대장균에서 생산된 바와 같이, Sc-FGE는 낮은 특이적 활성을 가진다는 것을 나타내는 그래프를 나타낸다. 이전자 산화제 또는 환원제 (각각 DHAA 또는 DTT)로 Sc-FGE의 처리는 효소의 활성을 변화시키지 않았다. 그에 반해, CuSO4의 초과량의 처리 후 이어서 Cu2 +를 제거하기 위한 겔 여과는 FGE 활성을 크게 증가시켰다. 도 15, 패널 b는 화학량론적 양 미만의 Cu2 +가 Sc-FGE를 충분히 활성화시키지 않았음을 나타내는 그래프를 나타낸다. 1 몰 이상의 당량의 Cu2 +의 첨가는 효소를 충분히 활성화시켰다. 도 15, 패널 c는 정제된 바와 같이, Sc-FGE가 ~0.01 Cu/FGE를 함유하고, Hs-cFGE가 0.34 Cu/FGE를 함유함을 나타내는 그래프를 나타낸다. 시험관 내에서 활성화 후, Sc-FGE 및 Hs-FGE는 각각 1.1 및 1.4 Cu/FGE를 함유하였다. 모든 경우에서, 정제된 효소의 조제물에 함유된 구리의 양은 효소의 특이적 활성과 연관성이 있었다. 도 15, 패널 d는 구리-촉매화된 이황화물 형성의 결과로서 산화된 형태의 DTT, 뿐만 아니라 Csub-Csub의 형성을 나타낸다.
도 16은 Hs-cFGE의 특이적 활성이 활성 부위 잔기 C341의 산화 환원 상태와 연관성이 없었음을 나타내는 데이터를 나타낸다. 도 16, 패널 a는 두 개의 구조적 이황화물 및 두 개의 활성 부위 시스테인을 함유하고, 아포효소(apoenzyme)에서 이황화물을 형성할 수 있는 Hs-cFGE의 개략도를 나타낸다. 도 16, 패널 b는 C341의 산화 환원 상태가 LC-MS/MS에 의해 측정될 수 있음을 나타내는 그래프를 나타낸다. Cu2 +로 활성화 후, 용액에 접근 가능한 C341의 양은 ~28%였다. 환원제 (DTT)의 처리시 접근 가능한 C341의 양은 93%로 증가하였다. 하지만, 효소의 특이적 활성은 감소하지 않았다. DTT의 처리는 C235-함유 구조적 이황화물에 영향을 미치지 않았다.
도 17은 FGE 촉매 작용이 시안화물에 의해 억제되었음을 나타내는 데이터를 나타낸다. 도 17, 패널 a는 EDTA 또는 KCN으로 활성화된 FGE의 전처리가 특이적 활성의 변화를 거의 또는 전혀 초래하지 않았음을 나타내는 그래프를 나타낸다. KCN 처리 후 단지 Hs-cFGE 활성만이 적당히 감소하였다. 도 17, 패널 b는 Sc-FGE 및 c, Hs-cFGE 둘 다가 전환 중에 구리에 대하여 강력한 리간드인 CN-에 의해 농도-의존적 방식으로 억제되었음을 나타내는 그래프를 나타낸다. 도 17, 패널 d는 환원제 (DTT, TCEP) 또는 금속 킬레이터 (EDTA)로 활성화된 Sc-FGE (n = 6)의 전처리가 효소의 특이적 활성을 변화시키지 않았음을 나타낸다. 환원제 및 킬레이터가 조합될 때 (각각 15 mM, 1 h, 37 ℃), FGE 활성은 거의 없어진다.
도 18은 비선형 회귀에 의해 결정된 Sc-FGE 및 Hs-cFGE의 동역학 파라미터의 데이터를 나타낸다. 도 18, 패널 a는 기질 농도를 Sc-FGE 및 Hs-cFGE에 대한 v 0과 연관시키는 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 플롯을 나타낸다 (도 18, 패널 b). 데이터는 동역학 파라미터를 결정하기 위해 비선형 회귀에 의해 미카엘리스-멘텐 방정식에 맞춰 조정되었다 (도 18, 패널 c).
도 19는, 생성물 수율에 대한 억제일 수 있는, FGE가 기질/환원제 이황화물 형성을 촉매화할 수 있음을 나타내는 데이터를 나타내고, 기질이 이황화물로서 활성 부위에 결합됨을 확인한다. 도 19, 패널 a는 FGE 반응 혼합물에서 0-10 mM βME의 범위에 걸쳐 생성물 형성의 그래프를 나타낸다. βME 없이, fGly 및 Csub-Csub는 비슷한 속도로 형성되었다. [βME]가 증가함에 따라, Csub-Csub는 Csub- βME로 대체되었고 생성물은 더 높은 속도로 형성되었다. 도 19, 패널 b는 βME로의 FGE 촉매 작용의 초기 속도가 DTT로의 초기 속도보다 더 빠르다는 것을 나타내는 그래프를 나타낸다. 도 19, 패널 c는 이 데이터가 [E·S]의 형성이 i, E 및 S 사이에서 이황화물을 발생시켰음을 확인한다는 것을 나타내는 개략도를 나타낸다. 촉매 작용 ii는 기질을 생성물로 전환시켰으며, 이것은 그 이후 방출되었다 iii. 티올 환원제의 존재 하에, k cat로 정의되는 촉매 작용 속도는 속도 상수 k DS로 티올-이황화물 교환 iv과 경쟁하였으며, 이것은 E·S 복합체를 해리시키고 Csub-R을 방출하였다. 그 이후 이 종은 또 다른 당량의 환원제 v와 반응하여 유리 기질을 생성할 수 있다. 첨가된 시약이 강력한 비-티올 환원제 (예를 들어, TCEP) 또는 환화될 수 있는 티올 (DTT)일 때, iv 및 v는 단일 단계로 축소되었다. 환원제가 모노티올일 때, Csub-R은 속도 상수 k - DS로 [E·S]를 재형성할 정도로 충분히 오래 지속될 수 있다.
도 20은 FGE가 알데하이드 태그된 mAb를 높은 수율로 생산하는데 사용될 수 있음을 나타내는 데이터를 나타낸다. 도 20, 패널 a는 알데하이드 태그가 IgG1 중쇄의 중쇄의 세 군데 영역 (힌지, CH2, 및 CH3)에 설치되었음을 나타내는 개략도를 나타낸다. 시험관 내에서 FGE와의 반응 이후, Cys 및 fGly의 양이 결정되었다. 최적화된 조건 하에서, Cys에서 fGly로의 전환 수율은 일관적으로 85-95%였다. 도 20, 패널 b는 두 개의 개개의 mAb에서 0.8, 8.0 및 80.0 mg 테스트 사례에서 측정된 바와 같이 생체 촉매 fGly 생산 수율이 반응 규모에 독립적임을 나타내는 그래프를 나타낸다. 도 20, 패널 c는 더 큰 규모의 반응의 대표적인 예의 그래프를 나타낸다. FGE로의 전환 후, fGly 함량은 98.1%였으며, 97.8%의 전환 수율에 해당한다.
도 21은 Cys- 및 fGly-함유 단백질의 LC-MRM/MS 특성화와 관련된 데이터를 나타낸다. 도 21, 패널 a는 단클론성 항체가 해체 및 분해되고, Cys 및 fGly 작용기가 특성화를 위해 다음 단계를 통해 각각 카르복시아미도메틸 (CAM) 및 메틸 옥심 (MeOx) 종으로서 트랩핑되었음을 나타내는 개략도를 나타낸다: i) DTT, 37 ℃, 15 min; ii) HCl, 이어서 NH4HCO3; iii) 트립신, 아이오도아세트아미드, pH 8, 37 ℃, 1 h; iv) 메톡실아민, pH 5.5, 16 h. 도 21, 패널 b는 각각의 알데하이드 태그 위치가 설치된 태그 서열을 함유하는 독특한 트립신의 펩타이드에 의해 특성화되었음을 나타내는 그래프를 나타낸다. 본원에서는, 9-mer 펩타이드가 트립신에 의해 생성되었다. 표적화된 MRM-MS는 CAM 또는 MeOx로서 변형된 펩타이드를 정량화하는데 사용되었다. 피크 면적 통합을 위해 다섯 개의 가장 강력한 전구체/생성물 이온 전이가 선택되었다. 도 21, 패널 c는 CAM- 및 MeOx-함유 펩타이드의 이온 크로마토그램을 나타낸다. MeOx-함유 펩타이드는 옥심 형성의 결과로서 존재하는 부분입체이성질체로 분리되었다.
도 22는 시험관 내 전환 반응 조건의 대상이 되는 mAb의 생물물리학적 속성에 관한 데이터를 나타낸다. 도 22, 패널 a, 및 도 22, 패널 b는 두 개의 IgG1 mAb에 대한 항체/항원 친화도의 ELISA 측정값의 그래프를 나타낸다. 도 22, 패널 c는 IgG1 스캐폴드(scaffold)의 CH3 도메인의 위치 252에서 산화된 메티오닌의 비율의 측정값이 반응 과정에 걸쳐 변화되지 않았음을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 23은 구리 보조 인자를 설명하는 FGE에 대하여 제안된 촉매 메커니즘의 개략도를 나타낸다. 단계 a에서 나타난 바와 같이, 기질 S는 효소 E에 결합하여 C341를 통해 공유 결합으로 부착된다. 이 공유 결합 형성은 Cu2 +에 의해 촉매화될 수도 있거나, 또는 기존의 C341 이황화물 및 기질 간의 티올-이황화물 교환으로부터 초래될 수 있다. 단계 b에서 나타난 바와 같이, Cu1 +로의 Cu2 +의 환원은 Cu2 + 슈퍼옥소 중간물로서, 분자상 산소의 결합을 가능하게 할 것이다 (단계 c). 단계 d에서 나타난 바와 같이, 양자-커플링된 전자 이동 (수소 원자 이동과 유사함)을 통해 Cu(II)-O2 -에 의한 기질의 산화는 이황화물 라디칼을 생성할 것이며, 이것은 티오알데하이드 및 티일 라디칼로 신속하게 축소될 것이다 (단계 e). 두 번째 1 H+/1 e- 환원 및 가수분해는 C341을 발생시킬 것이다. 이 환원이 발생하는 방식은, 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함하는, 많은 경로를 통해 진행될 수 있다: 직접적인 티일 라디칼 환원 및 H2O2를 방출하기 위한 구리-과산화물의 가수분해; 또는 술펜산을 생성하기 위한 Cu(II)-OOH에서 라디칼로의 옥소 이동, 이어서 구리-옥실 환원 및 술펜산 가수분해.
본 개시물은 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE), 활성화된 FGE를 생산하는 방법, 및 포르밀글리신 (FGly) 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법에서 그것들의 사용을 제공한다. 활성화된 FGE를 생산하는 방법뿐만 아니라 활성화된 FGE를 생산하는 방법뿐만 아니라, FGly-함유 단백질의 생산에서 활성화된 FGE의 사용 방법은 세포-기반 및 무세포 방법 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 본 개시물의 방법을 실시하는데 사용되는 조성물 및 키트 또한 제공된다.
본 개시물의 방법 및 조성물이 더 상세히 기술되기 전에, 방법 및 조성물은 기술된 특정 구체예에 제한되는 것이 아니며, 물론, 달라질 수도 있음을 이해해야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적을 위한 것이며, 방법 및 조성물의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에, 제한하려는 의도는 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 및 하한 사이에서, 달리 분명하게 지시되지 않는 한, 하한의 단위의 10분의 1까지의, 각각의 개재된 값 및 상기 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 값 또는 개재된 값이 방법 및 조성물 내에 포함됨을 이해해야 한다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수도 있고 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계를 조건으로 하여 방법 및 조성물에 또한 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위는 또한 방법 및 조성물에 포함된다.
달리 한정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 방법이 속한 업계의 당업자들에 의해 흔히 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. 본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 조성물이 또한 방법 및 조성물의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 대표적인 예시의 방법 및 조성물이 지금 기술된다.
이 명세서에서 인용된 임의의 간행물 및 특허는 각각의 간행물 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타난 것처럼 본원에 참조로 포함되고 간행물이 인용된 재료 및/또는 방법 및 조성물을 개시하고 기술하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전에 그것의 개시를 위한 것이며, 제공된 공개일이 실제 공개일과 다를 수도 있으며 이것은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수도 있기 때문에 본 방법 및 조성물이 이러한 간행물에 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥상 달리 분명하게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 또한 청구범위는 임의의 선택적인 요소들을 배제하도록 작성될 수도 있다. 이와 같이, 이러한 진술은 청구 요소의 열거, 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "전적으로", "단지" 등과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 근거로서 역할을 하도록 의도된다.
명확성을 위해서, 별도의 구체예의 맥락에서 기술되는 방법 및 조성물의 어떤 특징들은 또한 단일 구체예에서 조합하여 제공될 수도 있다. 반대로, 간결함을 위해서는, 단일 구체예의 맥락에서 기술되는 방법 및 조성물의 다양한 특징들은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 부분조합으로 제공될 수도 있다. 구체예들의 모든 조합은 본 개시물에 구체적으로 포함되고 모든 조합이 개별적으로 및 명확하게 개시되는 것처럼, 이러한 조합들이 작동 가능한 공정 및/또는 디바이스를 포함하는 정도로 본원에서 개시된다. 이에 더하여, 이러한 변수들을 기술하는 구체예에서 나열된 모든 부분조합들은 또한 본 방법 및 조성물에 구체적으로 포함되고 모든 이러한 부분조합이 본원에서 개별적으로 및 명확하게 개시된 것처럼 본원에서 개시된다.
본 개시물을 읽으면 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에서 기술되고 예시된 개개의 구체예들은 본 방법의 범위 또는 사상에서 벗어나지 않으면서 다른 구체예들 중 어느 것의 특징들로부터 쉽게 분리되거나 그것들과 조합될 수도 있는 별개의 구성요소 및 특징을 가진다. 임의의 열거된 방법들은 열거된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
포르밀글리신 -생성 효소, FGE 인식 서열, 및 표적 단백질
본 개시물의 양태는 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)의 제조 방법, 및 관심 단백질의 FGE 인식 서열에서 아미노산의 전환에 의해 포르밀글리신-함유 단백질을 생산하기 위한 활성화된 FGE의 사용 방법을 포함한다. 활성화된 FGE 및 하나 이상의 FGE 인식 서열 및/또는 하나 이상의 포르밀글리신 잔기를 포함하는, 관심 단백질을 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
본 개시물의 방법 및 조성물에서 사용을 위해 활성화될 수도 있는 FGE의 예, 관심 단백질에서 제공될 수도 있는 FGE 인식 서열의 예, 및, 예를 들어, 관심 단백질에 작용제 (예를 들어, 치료제, 영상화제, 등)를 컨쥬게이션하는데 유용한 포르밀글리신 잔기를 포함하도록 FGE에 의해 전환될 수도 있는 관심 단백질의 예가 하기 기술된다.
포르밀글리신 -생성 효소
본원에서 사용된 바와 같이, "포르밀글리신-생성 효소" (또는 "FGE")는 설파타제 모티프 (또는 "FGE 인식 부위")의 시스테인 또는 세린을 2-포르밀글리신 (FGly) 잔기 (본원에서는 포르밀글리신 잔기로도 불림)로 산화시키는 효소이다. 따라서, "FGE"는 본원에서 FGE 인식 부위의 시스테인 ("Cys" 또는 "C")의 FGly로의 전환을 중재하도록 FGly-생성 효소의 역할을 할 수 있거나 또는 FGE 인식 부위의 세린 ("Ser" 또는 "S")의 FGly로의 전환을 중재할 수 있는 임의의 효소를 언급하는데 사용된다. "전환"은 FGE 인식 부위에서 FGE의 작용의 맥락에서 사용된 바와 같이 포르밀글리신 (FGly) 잔기로의 FGE 인식 부위의 시스테인 또는 세린 잔기의 생화학적 변형을 말한다 (예를 들어, Cys에서 FGly로, 또는 Ser에서 FGly로). FGE에 의해 FGly를 함유하도록 변형된 FGE 인식 부위는 본원에서 "전환된 FGE 인식 부위"로 불릴 수도 있다.
일반적으로, 문헌에서는 FGE 인식 부위에서 Cys를 FGly로 전환하는 FGly-생성 효소를 FGE라고 언급하고, FGE 인식 부위에서 Ser을 FGly로 전환하는 효소를 Ats-B-유사라고 언급한다. 하지만, 본 개시물의 목적을 위해서 "FGE"는 일반적으로 적절한 FGE가 FGE 인식 부위 (즉, Cys-함유 또는 Ser-함유) 및/또는 FGE 인식 부위를 함유한 표적 단백질에 따라 선택될 수도 있는 조건 하에서 FGE 인식 부위에서 FGly-생성 효소 활성을 나타내는 임의의 효소를 언급하는데 사용된다.
활성 부위에서 FGly를 가진 설파타제의 편재하는 존재로 입증된 바와 같이, FGE는 진핵생물 및 원핵생물 둘 다를 포함한 다양한 세포 유형에서 발견된다. 적어도 두 가지 형태의 FGE가 존재한다. 진핵생물 설파타제는 일반적으로 그것의 설파타제 모티프에 시스테인을 함유하고, SUMF1 유전자에 의해 암호화될 수도 있는 "SUMF1형" FGE에 의해 변형된다 (예를 들어, Cosma et al. Cell 2003, 113, (4), 445-56; Dierks et al. Cell 2003, 113, (4), 435-44 참조). 원핵생물 설파타제는 그것의 설파타제 모티프에서 시스테인 또는 세린을 함유할 수 있고 각각 "SUMF1형" FGE 또는 "AtsB형" FGE에 의해 변형된다 (예를 들어, Szameit et al. J Biol Chem 1999, 274, (22), 15375-81 참조). 원핵생물 FGE의 예는 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; Mtb) FGE 및 스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) FGE를 포함한다. FGE는 또한 척추동물 및 극피동물을 포함한 후구동물에서 발견된다 (예를 들어, Pepe et al. (2003) Cell 113, 445-456, Dierks et al. (2003) Cell 113, 435-444; Cosma et al. (2004) Hum. Mutat. 23, 576-581 참조).
진핵생물에서, FGE 인식 서열을 함유하는 단백질 상에서 FGE 활성은 소포체 (ER)에서 단백질의 번역 중에 또는 직후에 발생할 수도 있다 (Dierks et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94(22):11963-8). 어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, 원핵생물에서 SUMF1형 FGE는 세포 기질에서 기능하고 AtsB형 FGE는 세포막에서 또는 그 근처에서 기능할 것으로 생각된다. SUMF2 FGE는 또한 척추동물 및 극피동물을 포함한 후구동물에서 기술되었다 (예를 들어, Pepe et al. (2003) Cell 113, 445-456, Dierks et al. (2003) Cell 113, 435-444; Cosma et al. (2004) Hum. Mutat. 23, 576-581 참조).
본원에서 개시된 방법 및 조성물에서 사용되는 FGE는 자연 발생 공급원으로부터 얻어지거나 합성에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 적절한 FGE는 자연적으로 FGE를 생산하거나 또는 FGE를 암호화하는 재조합 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 생물학적 공급원으로부터 유도될 수 있다. 본원에서 기술된 방법이 숙주 세포의 사용을 포함할 때, FGE는 숙주 세포에 고유한 것일 수도 있거나, 또는 숙주 세포는 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 개시물은 또한 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형된 재조합 숙주 세포를 제공하며, 이러한 FGE는 선택된 FGE 인식 부위를 가지는 표적 단백질의 전환에서의 사용에 적합하도록 선택될 수도 있다. 일부 구체예에서, 인간 FGE와 호환 가능한 설파타제 모티프 (예를 들어, SUMF1형 FGE, 예를 들어, Cosma et al. Cell 113, 445-56 (2003); Dierks et al. Cell 113, 435-44 (2003) 참조)를 사용하여, 인간 FGE를 발현하는 인간 세포에서, 또는 인간 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포, 일반적으로 포유류 세포에서 FGE 인식 부위를 가진 단백질을 발현시키는 것이 바람직할 수도 있다.
특정 구체예에서, FGE는 진핵생물 FGE, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 포유류 FGE이다. 어떤 경우에는, 포유류 FGE는 인간 FGE이다. 특정 구체예에서, FGE는 원핵세포 FGE, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 박테리아 FGE이다. 어떤 경우에는, 박테리아 FGE는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis; Mtb) FGE 또는 스트렙토미세스 코엘리컬러(S. coelicolor) FGE이다.
FGE, 뿐만 아니라 많은 FGE를 암호화하는 핵산이 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Preusser et al. 2005 J. Biol. Chem. 280(15):14900-10 (Epub 2005 Jan 18) (인간 FGE 및 이것을 암호화하는 핵산을 기술함); Fang et al. 2004 J Biol Chem. 279(15):14570-8 (Epub 2004 Jan 28) (클렙시알레 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)의 박테리아 포르밀글리신-생성 설파타제-변형 효소 AtsB 및 이것을 암호화하는 핵산을 기술함); Landgrebe et al. Gene 2003 Oct 16;316:47-56 (인간 FGE를 암호화하는 유전자 (SUMF1)의 식별 및 FGE를 암호화하는 원핵생물 유전자로의 보존을 기술함); Dierks et al. 1998 FEBS Lett. 423(1):61-5; Dierks et al. Cell. 2003 May 16;113(4):435-44 (인간 FGE를 암호화하는 유전자 및 다발성 설파타제 결손증 (Multiple Sulfatase Deficiency; MSD)을 유발하는 그것의 돌연변이를 기술함); Cosma et al. (2003 May 16) Cell 113(4):445-56 (인간 FGE를 암호화하는 유전자 및 다발성 설파타제 결손증 (MSD)을 유발하는 그것의 돌연변이를 기술함); Baenziger (2003 May 16) Cell 113(4):421-2 (review); Dierks et al. Cell. 2005 May 20;121(4):541-52; Roeser et al. (2006 Jan 3) Proc Natl Acad Sci USA 103(1):81-6; WO 2004/072275 (인간 FGE를 암호화하는 핵산 및 이것의 변이체를 기술함); GenBank 등록 번호 NM_182760 (인간 FGE의 단일 뉴클레오타이드 변이체); 및 Carlson et al. J Biol Chem. 2008 283:20117-20125 (마이코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis; Mtb) FGE 및 스트렙토미세스 코엘리컬러(S. coelicolor) FGE를 암호화하는 핵산을 기술함) 참조.
특정 구체예에 따르면, FGE는 전장 FGE이다. "전장"은 FGE가 해당 야생형 FGE의 임의의 야생형 아이소폼(isoform) (예를 들어, 대체 스플라이싱(splicing)의 결과로서)을 포함하는, 야생형 FGE의 완전하고, 성숙한 아미노산 서열을 가진다는 것을 의미한다. 전장 FGE의 한 예로서, FGE는 전장 인간 FGE, 예컨대 아미노산 서열 MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD (서열 번호:1; 하기 표 4에서 제공됨)에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과 (예를 들어, 100%)의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 전장 인간 FGE일 수도 있다.
다른 구체예에서, FGE는 포르밀글리신-생성 활성을 보유한 N-말단 절단된 FGE이다. "N-말단 절단된"은 FGE가 해당 야생형 FGE의 임의의 야생형 아이소폼 (예를 들어, 대체 스플라이싱의 결과로서)을 포함하는, 해당 야생형 FGE의 N-말단에 존재하는 아미노산의 수보다 더 적은 수를 포함한다는 것을 의미한다. N-말단 절단된 FGE가 포르밀글리신-생성 활성을 보유하는지는 시험관 내에서 절단된 FGE를 포르밀글리신-생성 활성을 가진 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 (또는 세린) 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 조건 하에서 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질과 조합하는 단계, 및 FGE 인식 부위의 시스테인 (또는 세린) 잔기가 포르밀글리신 잔기로 전환되었는지를 결정하는 단계를 포함하는, 임의의 편리한 접근법을 사용하여 결정될 수도 있다. 포르밀글리신 잔기로의 전환을 검출하기 위한 시험관 내 반응 조건 및 방법의 예는 본원의 다른 곳에서 기술된다.
특정 양태에서, N-말단 절단된 FGE (예를 들어, N-말단에서 절단된 인간 FGE)는 1-72개의 아미노산 N-말단 절단을 가지고, 해당 전장 FGE에 관하여 N-말단에서 1-5개의 아미노산, 1-10개의 아미노산, 1-15개의 아미노산, 1-20개의 아미노산, 1-25개의 아미노산, 1-30개의 아미노산, 1-35개의 아미노산, 1-40개의 아미노산, 1-45개의 아미노산, 1-50개의 아미노산, 1-55개의 아미노산, 1-60개의 아미노산, 또는 1-70개의 아미노산이 없을 수도 있다.
특정 양태에서, 절단된 FGE는 N-말단에서 절단된 인간 FGE이며, N-말단 절단된 인간 FGE은 길이가 300 내지 373개의 아미노산 (예를 들어, 길이가 302 내지 373개의 아미노산), 예컨대 길이가 302 내지 370개, 302 내지 360개, 302 내지 350개, 302 내지 340개, 302 내지 330개, 302 내지 320개, 또는 302 내지 310개의 아미노산이다.
특정 구체예에 따르면, N-말단 절단된 FGE는 길이가 자연 발생 FGE 프로테아제 분열 생성물에 해당한다. 예를 들어, N-말단 절단된 FGE는 길이가 인간 FGE의 퓨린 분열 생성물에 해당할 수도 있다. 퓨린 효소는 인간 FGE의 위치 72의 아르기닌과 위치 73의 글루탐산 사이를 분열시키며, 퓨린 효소에 의해 분열되지 않은 인간 FGE에 관하여 72-아미노산 N-말단 절단을 가진 분열 생성물을 발생시킨다. 한 구체예에 따르면, N-말단 절단된 인간 FGE는 표 4 (서열 번호: 1)에서 나타난 바와 같이 전장 인간 FGE에 관하여 72개 아미노산의 N-말단 절단을 초래하는 인간 FGE의 퓨린 분열 생성물에 해당한다.
전장 인간 FGE의 예 (밑줄이 없는 아미노산과 밑줄이 있는 아미노산) 및 절단된 인간 FGE의 예 (밑줄)
전장 인간 FGE (밑줄이 없는 아미노산 및 밑줄이 있는 아미노산) (서열 번호: 1)

N-말단 절단된 인간 FGE (밑줄이 있는 아미노산만) (서열 번호: 2)		 MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD
전장 FGE 또는 절단된 FGE를 암호화하는 핵산, 뿐만 아니라 이것을 포함하는 발현 벡터는 재조합 DNA-기반 접근법을 포함한, 임의의 적합한 접근법을 사용하여 제조될 수도 있다. 예로서, 절단된 FGE를 암호화하는 핵산은 전장 FGE를 암호화하는 핵산의 제한 효소 분해, 또는 주형으로서 전장 FGE를 암호화하는 핵산을 사용하여 절단된 FGE를 암호화하는 영역의 PCR 증폭에 의해 제조될 수도 있다. 이러한 제한 효소 분해 또는 증폭 생성물은 관심 숙주 세포에서 전장 또는 절단된 FGE의 발현에 적합한 발현 벡터로 클로닝될 수도 있다. 그 이후 관심 숙주 세포는 숙주 세포에서 후속적인 FGE 생산을 위해 발현 벡터로 형질전환/트랜스펙션될 수도 있다. 전장 및 절단된 FGE를 생산하는데 사용되는 발현 벡터 및 숙주 세포는 하기 기술되어 있다.
FGE (예를 들어, 전장 FGE 또는 N-말단 절단된 FGE)는 FGE가 FGE에 대하여 이종 기원인 아미노산 서열 (예를 들어, 정제 태그, 프로테아제 인식 서열, 분비 신호 서열, 소포체 (ER)-지향성 신호 서열, ER 체류 서열 (예를 들어, KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)), 등)에 융합된 융합 단백질로서 제공될 수 있다. 본원에서 개시된 FGE (예를 들어, 전장 FGE, N-말단 절단된 FGE, 및/또는 이것들의 융합 단백질)는 본원에서 개시된 바와 같이 활성화된 FGE를 제공하기 위한 방법에서 사용될 수 있다.
FGE 인식 부위
단백질의 FGE 인식 부위 (본원에서는 "설파타제 모티프"로도 불림)는 다를 수도 있다. 최소 인식 부위는 일반적으로는 길이가 5 또는 6개의 아미노산 잔기, 일반적으로는 길이가 6개 이하의 아미노산 잔기이다. 단백질에서 제공되는 전체 인식 부위는 길이가 적어도 5 또는 6개의 아미노산 잔기이고, 예를 들어, 길이가 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6개 미만의 아미노산 잔기의 FGE 인식 부위를 한정하기 위해서, 5 내지 16개, 6-16개, 5-15개, 6-15개, 5-14개, 6-14개, 5-13개, 6-13개, 5-12개, 6-12개, 5-11개, 6-11개, 5-10개, 6-10개, 5-9개, 6-9개, 5-8개, 또는 6-8개의 아미노산 잔기일 수 있다. 특정 구체예에서, 단백질의 FGE 인식 부위는 다음 식에 의해 기술된다:
X1Z1X2Z2X3Z3 (I)
상기 식에서
Z1은 시스테인 또는 세린이고 (이것은 (C/S)로도 표시될 수 있음);
Z2는 프롤린 또는 알라닌 잔기이고 (이것은 (P/A)로도 표시될 수 있음);
Z3은 염기성 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R)이고, 리신 (K) 또는 히스티딘 (H)일 수도 있으며, 일반적으로는 리신이다), 또는 지방족 아미노산 (알라닌 (A), 글리신 (G), 류신 (L), 발린 (V), 아이소류신 (I), 또는 프롤린 (P), 일반적으로는 A, G, L, V, 또는 I)이고;
X1은 존재하거나 부재하고, 존재할 때는, 임의의 아미노산일 수 있지만, 일반적으로는 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성, 비대전 아미노산, (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 이외의 것), 일반적으로는 L, M, V, S 또는 T, 더 일반적으로는 L, M, S 또는 V이며, 단 FGE 인식 부위가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고;
X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있지만, 일반적으로는 지방족 아미노산, 극성, 비대전 아미노산, 또는 황 함유 아미노산 (즉, 방향족 아미노산 또는 대전된 아미노산 이외의 것), 예를 들어, S, T, A, V, G 또는 C; 예를 들어, S, T, A, V 또는 G이다. 한 예에서, 단백질의 FGE 인식 부위는 식 L(C/S)TPSR (서열 번호: 3), 예를 들어, LCTPSR (서열 번호: 4) 또는 LSTPSR (서열 번호: 5)이다.
FGE 인식 부위의 예는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,985,783 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2011/0117621에서 기술되며, 이 개시물들은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
FGE 인식 부위를 포함하는 단백질
FGE 인식 부위를 함유하는 단백질은 임의의 관심 단백질일 수도 있으며 관심 작용제, 예를 들어, 치료제, 영상화제, 등을 컨쥬게이션하는 것이 바람직한 단백질을 포함한다. 관심 단백질은 자연 발생 아미노산 서열, N-말단 메티오닌을 가진 고유한 아미노산 서열, 자연 발생 단백질의 단편, 및 비-자연 발생 단백질 및 이것의 단편을 가진 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 단백질은 설파타제 또는 이것의 단편 이외의 단백질, 리포터 단백질 이외의 단백질, 또는 프리프로락틴 또는 프로락틴 이외의 단백질이다.
FGE 인식 서열을 함유하는 단백질은 FGE와 같거나 다른 기원의 것일 수 있다. 본 개시물의 방법이 세포-기반 방법을 포함하는 경우, FGE 인식 부위를 함유하는 단백질 (예를 들어, 설파타제)은 숙주 세포에 대하여 내인성일 수도 있고 및/또는 숙주 세포는 FGE 인식 서열을 함유하는 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형될 수도 있다. 이 구체예에서, FGE는 숙주 세포에 대하여 내인성일 수도 있고 및/또는 숙주 세포는 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형될 수도 있다.
특정 양태에서, 단백질은 치료적 또는 다른 임상적 이점을 제공할 수도 있는 단백질이며, 모이어티로의 부착이, 예를 들어, 표적 세포 (예를 들어, 암세포)에 단백질의 결합시 증가된 세포독성, 단백질이 결합하는 세포의 이미지화 (예를 들어, 생체 내 이미지화), 혈청 반감기의 증가, 부정적인 면역 반응의 감소, 추가의 또는 대안의 생물학적 활성 또는 기능성, 또는 다른 이점 또는 해로운 부작용의 감소 중 하나 이상을 제공할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료 단백질이 백신에 대한 항원인 경우, 변형은 단백질의 향상된 면역원성을 제공할 수 있다.
단백질은 치료 단백질과 같은 단백질의 부류의 구성원일 수도 있으며, 사이토카인, 케모킨, 리간드, 성장 인자, 호르몬, 성장 호르몬, 효소 (예를 들어, 설파타제, 예를 들어, 인간 설파타제 또는 이것의 기능적 단편), 항체 및 항체 단편 (항원-결합 항체 단편 포함), 및 항원을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가의 예는 에리트로포이에틴 (EPO, 예를 들어, 고유한 EPO, 합성 EPO (예를 들어, US 2003/0191291 참조)), 인간 성장 호르몬 (hGH), 소 성장 호르몬 (bGH), 여포 자극 호르몬 (FSH), 인터페론 (예를 들어, IFN-감마, IFN-베타, IFN-알파, IFN-오메가, 공통 인터페론, 등), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (예를 들어, IGF-I, IGF-II), 혈액 인자 (예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 (TPA), 등), 콜로니 자극 인자 (예를 들어, 과립구-CSF (G-CSF), 대식세포-CSF (M-CSF), 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF), 등), 형질전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-베타, TGF-알파), 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, 등), 표피 성장 인자 (EGF), 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF, 예를 들어, aFGF, bFGF), 신경아교세포주-유도된 성장 인자 (GDNF), 신경 성장 인자 (NGF), RANTES, 등을 포함한다.
일부 구체예에서, 단백질은 약물 및/또는 영상화제와 같은 관심 모이어티의 부착을 위한 스캐폴드를 제공할 수도 있다. 이러한 단백질의 예는 혈청 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민), Fc 폴리펩타이드 (예를 들어, IgG Fc 단편 (예를 들어, IgG1 Fc 단편, IgG2 Fc 단편, IgG3 Fc 단편, 또는 IgG4 Fc 단편)), 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 단백질은 Fc 폴리펩타이드이고, Fc 폴리펩타이드는 포유류 Fc 폴리펩타이드 (예를 들어, 인간 Fc 폴리펩타이드)일 수도 있다.
특정 구체예에 따르면, 단백질은 항체 또는 항체 단편이다. 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 임의의 아이소타입의 항체 또는 면역글로불린, 전체 항체 (예를 들어, 차례로 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 두 개의 헤테로다이머로 구성된 테트라머로 구성된 항체, 전체 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 항체를 포함함); 절반 항체 (예를 들어, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 단일 다이머를 포함하는 항체); 제한되는 것은 아니지만, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv, 이중 특이적 항체 및 디아바디를 포함하는, 관심 항원에 대한 특이적 결합을 보유한 항체 단편 (예를 들어, 전체 항체의 단편, 예컨대 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 항체의 단편); 키메라 항체; 단클론성 항체; 인간화된 항체 (예를 들어, 인간화된 단클론성 항체, 또는 인간화된 항체 단편); 또는 완전한 인간 항체 (인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체)를 포함한다. 또한 V-D-J 재배열의 결과로서 N- 또는 P-뉴클레오타이드 추가 및 결실 및/또는 체세포 돌연변이를 가지고 있는 인간 단클론성 항체가 포함된다. 또한 합성 서열이 상보성 결정 영역 (CDR)으로 삽입된 인간 항체가 포함된다 (예를 들어, Miersch S & Sidhu SS (2012) Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods 57(4):486-98; 및 Knappik et al. (2000) Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus 프레임워크s and CDRs randomized with trinucleotides. J. Mol . Biol . 296(1):57-86 참조). 특정 양태에서, 본 개시물의 항체는 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체), Fab, F(ab')2, 및 Fab'로부터 선택된다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편이라고 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 가지는, 두 개의 동일한 항원-결합 단편, 및 잔류 "Fc" 단편을 생산하는데, 명칭을 쉽게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 두 개의 항원 조합 부위를 가지며 여전히 항원을 교차-연결할 수 있는 F(ab')2 단편을 수득한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편을 포함한다. 이 영역은 단단하게 비-공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 구성된다. 이 구성에서는 VH-VL 다이머의 표면 상에 항원-결합 부위를 한정하기 위해 각각의 가변 도메인의 세 개의 CDR이 상호작용한다. 종합해보면, 여섯 개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 하지만, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 세 개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하여 그것에 결합하는 능력을 갖지만 친화도는 전체 결합 부위보다 더 낮다.
"Fab" 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기의 추가에 의해 Fab' 단편과는 다르다. Fab'-SH는 본원에서는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 함유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편의 쌍들 사이에서 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"단일 사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 더 포함하며, 이것은 sFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성할 수 있게 한다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 가진 작은 항체 단편을 말하며, 이 단편은 같은 폴리펩타이드 사슬에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함한다. 같은 사슬 상의 두 개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들은 강제로 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 두 개의 항원-결합 부위를 생성한다.
용어 "재조합" 항체는 본원에서 사용된 바와 같이 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 모든 항체, 예컨대 (i) 숙주 세포로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체; (ii) 재조합형 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; (iii) 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체; 또는 (iv) 예를 들어, 시험관 내 번역 기술을 포함하여, 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다 (예를 들어, Yin et al. (2012) A glycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable in vitro transcription-translation system, Landes Bioscience, Volume 4, Issue 2 참조). 이러한 재조합 항체는 인간화, CDR 이식, 키메라, 탈면역화, 시험관 내 생성된 항체를 포함하고; 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 불변 영역을 포함할 수 있다.
"인간화된 항체"는 면역글로불린, 절반 항체, 면역글로불린 사슬 (예를 들어, 경쇄 폴리펩타이드) 또는 인간 및 비-인간 면역글로불린 둘 다로부터 유도된 서열을 함유하는 이것들의 단편 (예컨대 Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 부분서열)을 의미한다. 인간화된 항체는 수령체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 요구되는 특이성, 친화도 및 수용력을 가진 비-인간 종 (공여체 항체), 예컨대 마우스, 래트, 라마, 낙타 또는 토끼의 CDR의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)일 수도 있다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 해당 비-인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화된 항체는 수령체 항체 및 외래의 CDR 또는 프레임워크 서열 둘 다에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수도 있다.
인간 경쇄 폴리펩타이드는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 게다가, 인간 중쇄 폴리펩타이드는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다.
특정 양태에서, FGE 인식 부위를 포함하는 단백질은 IgG 또는 이것의 단편, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, ScFv, 이중 특이적 항체 또는 이것의 단편, 디아바디 또는 이것의 단편, 키메라 항체 또는 이것의 단편, 단클론성 항체 또는 이것의 단편, 인간화된 항체 또는 이것의 단편, 및 완전한 인간 항체 또는 이것의 단편이다.
항체가 특이적으로 결합하는 관심 항원은 종양-특이적 항원, 예를 들어, 악성 세포의 표면에 존재하지만 비-악성 세포에는 존재하지 않는 항원을 포함한다. 다른 양태에서, 항체에 의해 결합된 항원은 종양-관련 항원이다. "종양-관련 항원"은 악성 세포에서 발현되며 정상 조직의 세포에서 발현이 제한된 항원, 정상 세포에 비해 악성 세포에서 훨씬 더 높은 밀도로 발현되는 항원, 또는 점진적으로 발현되는 항원을 의미한다.
임의의 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 본 개시물의 항체에 의해 표적화될 수도 있다. 특정 양태에서, 본 개시물의 방법이 암의 치료를 위한 것일 때, 본 개시물의 컨쥬게이트의 항체 또는 항체 구성요소에 의해 특이적으로 결합되는 항원은 HER2, CD19, CD22, CD30, CD33, CD56, CD66/CEACAM5, CD70, CD74, CD79b, CD138, 넥틴-4, 메소텔린, 막관통 당단백질 NMB (GPNMB), 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), SLC44A4, CA6, CA-IX, 또는 임의의 다른 종양-관련 또는 종양-특이적 관심 항원을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체의 특성의 맥락에서 항체가 상이한 항원들의 균질 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하는 능력을 말한다. 특정 구체예에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플 또는 유기체 (예를 들어, 인간)에서 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원 (또는 "표적" 및 "비-표적" 항원)을, 일부 구체예에서는, 약 10 내지 100배 이상 (예를 들어, 약 1000 또는 10,000배 이상)으로 구별할 것이다. 특정 구체예에서, 항체와 항원 간의 친화도는 그것들이 항체-항원 복합체에서 특이적으로 결합할 때 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 또는 약 10-12 M 미만 또는 그 미만의 KD (해리 상수)를 특징으로 한다.
활성화된 FGE의 생산 방법
본 개시물은 활성화된 FGE를 생산하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "활성화된 포르밀글리신-생성 효소" 또는 "활성화된 FGE"는 FGE를 발현하는 세포에 산화제(oxidation reagent)의 첨가 및/또는 단리된 FGE에 산화제의 첨가에 의해 산화제가 처리된 FGE를 말한다. 따라서, 특정 양태에서, 본 개시물은 활성화된 FGE를 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 활성화된 FGE를 생산하기 위해 FGE를 산화제로 처리하는 단계를 포함한다. "산화제"는 FGE를 산화시킬 수 있는 시약 (이것은 "산화제(oxidizing agent)"라고 불릴 수도 있음), FGE의 산화를 촉매화할 수 있는 시약, 또는 이것들의 조합을 의미한다. FGE의 산화를 촉매화할 수 있는 시약의 한 예는 Cu2 +이다. FGE를 산화시킬 수 있는 시약 및 FGE의 산화를 촉진하는 시약을 포함하는 산화제의 한 예는 말단 산화제로서 원소상 산소 및 전이 금속, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 Cu2 +를 포함하는 시약이다. 이들 및 다른 적합한 산화제들은 하기 기술되어 있다.
활성화된 FGE는 숙주 세포 내에서 FGE가 발현되고 활성화되는 생체 내 단백질 합성 방법의 일부로서 생산될 수도 있으며, 이 방법은 숙주 세포에서 FGE 인식 부위를 함유하는 관심 단백질의 동시-발현을 선택적으로 포함할 수도 있다. 즉, FGE는 숙주 세포에 존재할 수도 있으며, FGE는 숙주 세포가 배양되고 있는 세포 배양 배지에 산화제 (예를 들어, Cu2 +)를 제공하여 활성화된 FGE를 생산하도록 처리된다. 예를 들어, 본 발명자들은 처리된 세포에서 동시-발현된 표적 단백질의 FGE 인식 부위 내 시스테인 잔기가 Cu2 +가 처리되지 않았지만 그렇지 않으면 동일한 조건 하에서의 전환과 비교하여 증가된 수율로 포르밀글리신 잔기로 전환되도록 산화제, 예컨대 Cu2 +로 FGE-발현 세포의 처리 (세포 배양 배지에 Cu2 +를 제공함으로써)가 FGE 활성화를 제공한다는 것을 발견하였다 (하기 실시예 섹션 참조). 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 산화제로 FGE-발현 세포의 처리는 FGE-발현 세포에 의해 생산된, 활성화된 FGE의 집단을 증가시킬 수도 있다. 유사하게, 본원에서 기술된 바와 같이 산화제로 FGE-발현 세포의 처리는 FGE-발현 세포에 의해 생산된, 활성화된 FGE가 아닌 FGE의 집단을 감소시킬 수도 있다.
따라서, 특정 구체예에서, 산화제는 Cu2 +이고, FGE를 처리하는 단계는 Cu2 +를 포함한 세포 배양 배지에서 FGE를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 배양하는 단계는 FGE가 세포에서 발현되는 조건 하에서 이루어진다. 특정 양태에서, 본 개시물은 Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지에서 FGE를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 배양하는 단계는 FGE가 세포에서 발현되는 조건 하에서 이루어진다.
세포 배양 배지에서 Cu2 +의 공급원 (예를 들어, 구리염 또는 다른 적합한 Cu2+ 공급원) 및 Cu2 + 농도는, 예를 들어, 세포 생존률, 단백질 발현 수준, 등에 영향을 주거나 실질적으로 영향을 주지 않으면서 세포 배양물이 호환 가능하도록 선택될 수도 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포일 때, Cu2 + 공급원 및 농도는 원핵 세포 배양물과 호환 가능하도록 선택될 수도 있다. 유사하게, 숙주 세포가, 예를 들어, 포유류 세포일 때, Cu2 + 공급원 및 농도는 포유류 세포 배양물과 호환 가능하도록 선택될 수도 있다. 원핵 세포 및 포유류 세포에서 생체 내 FGE 활성화에 적합한 배양 조건의 예는 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
특정 양태에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에 구리염의 첨가에 의해 제공된다. 적합한 구리염은 황산구리 (즉, 구리(II) 설페이트, CuSO4), 시트르산구리, 타르타르산구리, 구리 나이트레이트, 및 이것들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cu2 +는 세포 배양 배지에서 FGE 활성화에 적합한 농도로 존재한다. 특정 양태에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 nM 내지 100 mM, 예컨대 0.1 μM 내지 10 mM, 0.5 μM 내지 5 mM, 1 μM 내지 1 mM, 2 μM 내지 500 μM, 3 μM 내지 250 μM, 4 μM 내지 150 μM, 또는 5 μM 내지 100 μM (예를 들어, 5 μM 내지 50 μM)의 농도로 존재한다.
특정 구체예에 따르면, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 nM 이상, 10 nM 이상, 100 nM 이상, 1 μM 이상, 5 μM 이상, 10 μM 이상, 20 μM 이상, 30 μM 이상, 40 μM 이상, 50 μM 이상, 100 μM 이상, 200 μM 이상, 300 μM 이상, 400 μM 이상, 500 μM 이상, 1 mM 이상, 10 mM 이상, 또는 100 mM 이상의 농도로 존재한다. 특정 양태에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 100 mM 이하, 10 mM 이하, 1 mM 이하, 500 μM 이하, 400 μM 이하, 300 μM 이하, 200 μM 이하, 100 μM 이하, 50 μM 이하, 40 μM 이하, 30 μM 이하, 20 μM 이하, 10 μM 이하, 5 μM 이하, 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 농도로 존재한다.
생체 내 FGE 활성화에 적합한 숙주 세포는, 예를 들어, 원핵 세포 (예를 들어, 대장균 세포) 및 진핵 세포 (예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 등)를 포함한다. 세포는 관심 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형될 수도 있고 및/또는 FGE는 세포에 대하여 내인성일 수도 있다.
대장균(Escherichia coli)은 활성화된 FGE를 생산하는 방법을 실시하는데 사용될 수도 있는 원핵 숙주 세포의 예이다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내 세균, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이 원핵생물 숙주들에서, 전형적으로 숙주 세포와 호환 가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제의 기원)을 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이에 더하여, 많은 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께, 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 시작하고 끝마치기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
다른 미생물, 예컨대 효모는 또한 활성화된 FGE를 생산하는 방법을 실시하는데 유용하다. 사카로미세스(Saccharomyces) (예를 들어, 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae)) 및 피치아(Pichia)는, 필요한 만큼 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제의 기원, 종결 서열 등을 가진 적합한 벡터를 가지는, 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는, 다른 것들 중에서, 알콜 데하이드로게나제, 아이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 활용의 원인이 되는 효소의 프로모터를 포함한다.
미생물 외에도, 포유류 세포가 활성화된 FGE를 생산하는 방법을 실시하는데 이용될 수도 있다. 포유류 세포는 설치류 세포, 인간 세포, 또는 임의의 관심 있는 다른 포유류 세포일 수도 있으며, 제한되는 것은 아니지만, CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로부터 선택된 세포를 포함한다. 이 세포들에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제의 기원, 프로모터, 및 인핸서 (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 정보 처리 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열의 예는 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유도된 프로모터이다. Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992) 참조.
숙주 세포에서 FGE를 발현시키는데 적합한 배양 조건은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,985,783 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2011/0117621에서 기술되며, 이 개시물들은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. FGE는 숙주 세포에 대하여 내인성일 수도 있거나, 숙주 세포는 숙주 세포에 이종 기원인 적합한 FGE에 대하여 재조합될 수도 있다. FGE 발현은 FGE 유전자에 대하여 내인성인 발현 시스템에 의해 제공될 수 있거나 (예를 들어, 발현은 프로모터 및 숙주 세포의 고유한 FGE 유전자에 존재하는 다른 제어 요소에 의해 제공됨), 또는 구성성 또는 유도성 발현을 제공하기 위해 FGE 암호화 서열이 이종 기원 프로모터에 작동 가능하게 결합된 재조합 발현 시스템으로부터 제공될 수 있다. 높은 수준의 FGE 발현을 제공하기 위한 강력한 프로모터의 사용은 특정 구체예에서 특히 관심을 받을 수도 있다. 세포 배양 배지 및 그 안에 있는 구성요소들의 유형은 FGE가 발현되는 특정 세포 유형과 호환 가능하도록 선택될 수도 있다.
방법은 또한 세포 및/또는 산화제로부터 활성화된 FGE를 정제하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 임의의 편리한 단백질 정제 절차는 활성화된 FGE를 단리시키는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, Guide to Protein Purification, 2nd Edition (Burgess & Deutscher ed.) (Academic Press, 2009) (ISBN: 9780123745361) 참조. 예를 들어, 용해물은 활성화된 FGE를 생산하는 세포로부터 제조되고, HPLC, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 등을 사용하여 정제될 수도 있다.
활성화된 FGE는 또한 시험관 내, 무세포 단백질 합성 방법의 일부로서 생산될 수도 있는데, 이 방법은 반응 혼합물에서 FGE 인식 서열을 함유하는 표적 폴리펩타이드의 동시-발현을 선택적으로 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, 본 개시물의 방법은 산화제가 들어있는 무세포 반응 혼합물에서 FGE를 발현시키는 단계를 포함하며, 산화제는 Cu2 +일 수 있다. 이 양태들에 따르면, 무세포 반응 혼합물은 FGE가 세포에서 발현되는 것이 아니라, 시험관 내 단백질 합성에 적합한 반응 혼합물에서 발현되는 것이다. 예시의 무세포 반응 혼합물은, FGE 및 임의의 다른 요구되는 단백질 (예를 들어, 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 FGE 인식 부위를 가지는 단백질)의 합성을 위한 핵산 주형(들)과 함께, 무세포 추출물, 세포 용해물, 및 재구성된 번역 시스템을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
무세포 반응 혼합물은 거대분자가 합성되는 모노머, 예를 들어, 아미노산, 뉴클레오타이드, 등, 및 이러한 보조 인자, 효소 및 임의의 다른 필요한 시약, 예를 들어, 리보솜, tRNA, 폴리머라제, 전사 인자, 등을 포함할 수도 있다. 상기 구성요소, 예컨대 무세포 추출물, 핵산 주형, 및 아미노산 외에도, 단백질 합성에 구체적으로 필요한 재료들이 반응에 첨가될 수도 있다. 재료들은 염, 폴린산, 환형 AMP, 단백질 또는 핵산 분해 효소에 대한 억제자, 단백질 합성의 억제자 또는 조절자, 산화/환원 가능성의 조정자, 비-변성 계면활성제, 버퍼 구성요소, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신, 등을 포함할 수도 있다. 다양한 무세포 합성 반응 시스템은, 예를 들어, Kim, D.M. and Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 66: 180-8 (1999); Kim, D.M. and Swartz, J.R. Biotechnol. Prog. 16:385-90 (2000); Kim, D.M. and Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 74:309-16 (2001); Swartz et al, Methods MoL Biol. 267: 169-82 (2004); Kim, D.M. and Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 85: 122-29 (2004); Jewett, M.C. and Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 86: 19-26 (2004); Yin, G. and Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 86: 188-95 (2004); Jewett, M.C. and Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 87:465-72 (2004); Voloshin, A.M. and Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 91:516-21 (2005)에 기술되어 있다. 관심 단백질의 무세포 합성을 위한 추가적인 조건들은 국제 공개 번호 WO2010/081110에 기술되어 있으며, 이 개시물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 구체예에서, 무세포 단백질 합성은 통상적인 생체 내 단백질 발현 방법에 비해 특정 이점을 제공한다. 무세포 시스템은 전부는 아니지만, 대부분의 세포의 물질대사 자원을 하나의 단백질의 배타적 생산으로 향하게 할 수 있다. 더욱이, 시험관 내에서 세포벽 및 세포막 구성요소의 결핍은 합성 환경의 제어를 허용하기 때문에 이로울 수도 있다. 예를 들어, tRNA 수준은 발현되고 있는 유전자의 코돈 사용을 반영하도록 바뀔 수 있다. 산화제의 유형 또는 농도, 산화 환원 가능성, pH, 또는 이온 강도 또한 세포 성장 또는 변동성의 문제가 없기 때문에 생체 내 단백질 합성보다 더 큰 유연성으로 변화될 수 있다. 게다가, 정제된, 적절하게 폴딩된 단백질 생성물의 직접적인 회수가 쉽게 달성될 수 있다.
활성화된 FGE는 또한 시험관 내 활성화 방법의 일부로서 생산될 수도 있다. 이러한 구체예에 따르면, FGE는 산화제의 존재 하에서 발현되지 않는다. 이러한 방법은 시험관 내에서 FGE를 발현시키고 (예를 들어, 세포 또는 무세포 번역 시스템에서), FGE를 정제한 다음, FGE를 산화제로 처리하는 것이 FGE의 활성화를 초래한다는 본 발명자들의 발견을 기반으로 한다. 이러한 시험관 내에서 활성화된 FGE는 표적 단백질의 FGE 인식 부위 내에서 동일한 조건 하에서 비-활성화된 FGE에 의한 전환과 비교하여 증가된 효율로 시스테인 또는 세린 잔기를 전환시킨다 (하기 실시예 섹션 참조).
FGE의 활성화에 사용되는 산화제는 바람직한 반응 조건과 호환 가능한 임의의 편리한 산화제로부터 선택될 수도 있다. 예를 들어, 산화제는 원소상 산소, 예컨대 말단 산화제로서 원소상 산소일 수도 있다. 어떤 경우에는, 말단 산화제로서 원소상 산소는 산소, 산소 및 황화수소의 혼합물, 염기성 조건 하에서의 산소, 등으로서 제공될 수도 있다.
특정 구체예에서, 산화제는 원소상 산소, 예컨대 말단 산화제로서 원소상 산소이며, 반응은 전이 금속에 의해 촉매화된다. 이러한 경우에, 산화제는 제한되는 것이 아니라, 구리(II) (즉, Cu2 +) 또는 구리(II)의 공급원 (예를 들어, 황산구리 (CuSO4), 시트르산구리, 타르타르산구리, 구리 나이트레이트, 펠링 시약, 베네딕트 시약, 등)을 포함할 수도 있으며, 이것들은 산소 활성화를 촉매화할 수 있다. 어떤 경우에는, 산소 활성화를 촉매화할 수 있는 산화제 (예를 들어, Cu2+)는 산소의 존재 하에서 제공된다. 예를 들어, 산화제는 산소 및 Cu2 +, Cu2 +의 공급원, 또는 이것들의 조합을 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 산화제는 구리(II) (즉, Cu2 +) 또는 구리(II)의 공급원 (즉, Cu2 +의 공급원)이다. 어떤 경우에는, 구리(II) 또는 구리(II)의 공급원은 산소의 존재 하에서 제공된다. 어떤 경우에는, 산화제는 구리(II), 예컨대 구리(II) 및 산소이다. 어떤 경우에는, 산화제는 구리(II)의 공급원, 예컨대 구리(II)의 공급원 및 산소이다. 어떤 경우에는, 구리(II)의 공급원은 제한되는 것이 아니라, 황산구리, 시트르산구리, 타르타르산구리, 펠링 시약, 베네딕트 시약, 이것들의 조합, 등이다. 어떤 경우에는, 구리(II)의 공급원은 황산구리 (CuSO4)이다.
단백질의 시험관 내 산화를 위한 반응 조건은 이용된 특이적 산화제에 따라 달라질 수도 있다. 산화제의 예를 사용한, FGE의 시험관 내 활성화를 위한 반응 조건의 예는 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
FGE의 활성화는, FGE 활성화 반응 혼합물에서, FGE 및 산화제를 조합하는 것을 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, FGE 활성화 반응 혼합물은 수용액이다. 어떤 경우에는, FGE 활성화 반응 혼합물은 완충된 수용액, 예를 들어, 버퍼, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대, 트리에탄올아민을 포함하는 수용액이다. 어떤 경우에는, 완충된 수용액은 FGE와 호환 가능한 pH 범위, 예컨대 5 내지 10, 또는 5 내지 9, 또는 6 내지 8의 pH 범위, 예를 들어, 약 7의 pH, 예컨대 7.4의 pH를 가진다.
특정 구체예에서, FGE의 활성화는 FGE 활성화 반응 혼합물에서 FGE 및 산화제를 조합하는 것을 포함할 수도 있는데, FGE가 활성화 반응 혼합물에 존재하고 그 이후 산화제가 FGE 활성화 반응 혼합물에 첨가된다. 다른 구체예에서, FGE의 활성화는, FGE 활성화 반응 혼합물에서, FGE 및 산화제를 조합하는 것을 포함할 수도 있는데, 산화제가 FGE 활성화 반응 혼합물에 존재하고 그 이후 FGE가 FGE 활성화 반응 혼합물에 첨가된다.
특정 구체예에서, FGE 활성화 반응 혼합물에서 FGE 대 산화제의 mol 비는 5:1, 또는 4:1, 또는 3:1, 또는 2:1, 또는 1:1, 또는 1:2, 또는 1:3, 또는 1:4, 또는 1:5이다. 어떤 경우에는, FGE 활성화 반응 혼합물에서 FGE 대 산화제의 mol 비는 1:2이다.
어떤 경우에는, FGE 및 산화제가 FGE 활성화 반응 혼합물에서 조합된 후, FGE 활성화 반응 혼합물이 혼합된다. FGE 활성화 반응 혼합물을 혼합하기 위한 임의의 편리한 방법, 예컨대 교반, 보텍싱(vortexing), 등이 사용될 수도 있다. FGE 활성화 반응 혼합물은 활성화된 FGE로의 FGE의 충분한 활성화를 허용하는 기간, 예컨대 15 min 이상, 또는 30 min 이상, 또는 45 min 이상, 또는 1 시간 이상, 또는 2 시간 이상, 또는 3 시간 이상, 또는 4 시간 이상, 또는 5 시간 이상 동안 혼합될 수도 있다. 어떤 경우에는, FGE 활성화 반응 혼합물은 1 시간 동안 혼합된다. FGE 활성화 반응 혼합물의 혼합은 대략 실온, 예를 들어, 20 ℃ 내지 30 ℃의 범위, 예컨대 25 ℃의 온도에서 수행될 수도 있다. 활성화에 적합한 온도는 이용된 특정 산화제에 따라 달라질 수도 있다.
활성화된 FGE로의 FGE의 충분한 활성화는 본원에서 기술된 바와 같이 FGE 활성 검정을 사용하여 측정될 수도 있다. 활성화된 FGE로의 FGE의 충분한 활성화 후, 활성화된 FGE는 FGE 활성화 반응 혼합물로부터 분리될 수도 있다. FGE 활성화 반응 혼합물로부터 활성화된 FGE를 분리하기 위해 단백질 분리를 위한 임의의 편리한 방법, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대, 투석, 버퍼 교환, 정용 여과(diafiltration), 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 전기영동, 등이 사용될 수도 있다. 어떤 경우에는, 활성화된 FGE는 버퍼 교환에 의해 FGE 활성화 반응 혼합물로부터 분리될 수도 있다.
또한 활성화된 FGE를 생산하기 위한, 본원에서 기술된 방법 중 어느 것에 의해 생산된, 활성화된 FGE가 본 개시물에 의해 제공된다. 특정 구체예에 따르면, 활성화된 FGE는 산화제로부터 정제되지 않는다. 예를 들어, FGE는 FGE가 산화제로 처리되는 세포 또는 반응 혼합물에 존재할 수도 있다. 다른 양태에서, 활성화된 FGE는 본원의 다른 곳에서 기술된 임의의 이러한 분리 절차를 포함한 적합한 단백질 분리 절차를 사용하여 FGE 활성화 반응 혼합물로부터 분리된다.
활성화된 FGE의 사용 방법
본 개시물의 활성화된 FGE는, 예를 들어, 관심 단백질 (또는 "표적 단백질")에서 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 것이 바람직한 다양한 생체 내 및 시험관 내 용도로 사용된다. 포르밀글리신 잔기의 알데하이드 기는, 예를 들어, 표적 단백질에 관심 작용제 (예를 들어, 치료제, 영상화제, 등)를 부위-특이적으로 컨쥬게이션하는데 유용하다. 따라서, 본 개시물은 활성화된 FGE의 사용 방법을 제공한다.
특정 양태에서, 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 방법은 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하기 위해, 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 활성화된 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 조건 하에서 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질과 조합하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질은 환원제를 포함하는 반응 혼합물에서 조합된다. 일부 구체예에서, 환원제는 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기의 포르밀글리신 잔기로의 전환을 촉진한다. 일부 구체예에서, 환원제는 2-메르캅토에탄올이다. 본원에서 사용된 바와 같이, FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기의 포르밀글리신 잔기로의 전환을 촉진하는 것은 환원제의 부재 하에서의 전환 반응과 비교하여 활성화된 FGE에 의해 생산된 fGly의 양 (예를 들어, 농도)의 증가를 말한다. 어떤 경우에는, 환원제는 환원제의 부재 하에서의 전환 반응과 비교하여 활성화된 FGE에 의해 생산된 fGly의 양을 5% 이상, 또는 10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 25% 이상, 또는 30% 이상, 또는 35% 이상, 또는 40% 이상, 또는 45% 이상, 또는 50% 이상, 또는 55% 이상, 또는 60% 이상, 또는 65% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95 % 이상, 또는 100% 이상만큼 증가시킨다. 특정 구체예에서, 환원제는 환원제의 부재 하에서의 전환 반응과 비교하여 활성화된 FGE에 의해 생산된 fGly의 양을 50% 이상만큼 증가시킨다.
생체 내 전환
포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질은 생체 내 단백질 합성 및 전환 방법의 일부로서 숙주 세포 내에서 생산될 수도 있다. 특정 구체예에 따르면, 활성화된 FGE를 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질과 조합하는 것은 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함한다. 배양은 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 세포 배양 조건 하에, 산화제로서 Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지에서 이루어진다. 특정 양태에서, 세포는 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질이 세포에서 동시-발현되도록 FGE를 암호화하는 핵산 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 포함한다.
세포 배양 배지에서 Cu2 +의 공급원 (예를 들어, 구리염 또는 다른 적합한 Cu2+ 공급원) 및 Cu2 + 농도는, 예를 들어, 세포 생존률, 단백질 발현 수준, 등에 영향을 주거나 실질적으로 영향을 주지 않으면서 세포 배양물이 호환 가능하도록 선택될 수도 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포일 때, Cu2 + 공급원 및 농도는 원핵 세포 배양물과 호환 가능하도록 선택될 수도 있다. 유사하게, 숙주 세포가, 예를 들어, 포유류 세포일 때, Cu2 + 공급원 및 농도는 포유류 세포 배양물과 호환 가능하도록 선택될 수도 있다. 원핵 세포 및 포유류 세포에서 생체 내 FGE 활성화에 적합한 배양 조건의 예는 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
특정 양태에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에 구리염의 첨가에 의해 제공된다. 적합한 구리염은 황산구리 (즉, 구리(II) 설페이트, CuSO4), 시트르산구리, 타르타르산구리, 구리 나이트레이트, 및 이것들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cu2 +는 세포 배양 배지에서 FGE 활성화에 적합한 농도로 존재한다. 특정 양태에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 nM 내지 100 mM, 예컨대 0.1 μM 내지 10 mM, 0.5 μM 내지 5 mM, 1 μM 내지 1 mM, 2 μM 내지 500 μM, 3 μM 내지 250 μM, 4 μM 내지 150 μM, 또는 5 μM 내지 100 μM (예를 들어, 5 μM 내지 50 μM)의 농도로 존재한다.
특정 구체예에 따르면, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 nM 이상, 10 nM 이상, 100 nM 이상, 1 μM 이상, 5 μM 이상, 10 μM 이상, 20 μM 이상, 30 μM 이상, 40 μM 이상, 50 μM 이상, 100 μM 이상, 200 μM 이상, 300 μM 이상, 400 μM 이상, 500 μM 이상, 1 mM 이상, 10 mM 이상, 또는 100 mM 이상의 농도로 존재한다. 특정 양태에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 100 mM 이하, 10 mM 이하, 1 mM 이하, 500 μM 이하, 400 μM 이하, 300 μM 이하, 200 μM 이하, 100 μM 이하, 50 μM 이하, 40 μM 이하, 30 μM 이하, 20 μM 이하, 10 μM 이하, 5 μM 이하, 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 농도로 존재한다.
FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질의 동시-발현에 적합한 숙주 세포는, 예를 들어, 원핵 세포 (예를 들어, 대장균 세포) 및 진핵 세포 (예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 등)를 포함한다.
대장균은 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법을 실시하는데 사용될 수도 있는 원핵 숙주 세포의 예이다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스, 및 다른 장내 세균, 예컨대 살모넬라, 세라티아, 및 다양한 슈도모나스 종을 포함한다. 이 원핵 세포 숙주들에서, 전형적으로 숙주 세포와 호환 가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제의 기원)을 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이에 더하여, 많은 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께, 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 시작하고 끝마치기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
다른 미생물, 예컨대 효모는 또한 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법을 실시하는데 유용하다. 사카로미세스 (예를 들어, 사카로미세스 세레비시애) 및 피치아는, 필요한 만큼 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제의 기원, 종결 서열 등을 가진 적합한 벡터를 가지는, 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는, 다른 것들 중에서, 알콜 데하이드로게나제, 아이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 활용의 원인이 되는 효소의 프로모터를 포함한다.
미생물 외에도, 포유류 세포가 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법을 실시하는데 이용될 수도 있다. 포유류 세포는 설치류 세포, 인간 세포, 또는 관심 있는 임의의 다른 포유류 세포일 수도 있으며, 제한되는 것은 아니지만, CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로부터 선택된 세포를 포함한다. 이 세포들에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제의 기원, 프로모터, 및 인핸서 (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 정보 처리 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열의 예는 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유도된 프로모터이다. Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992) 참조.
시험관 내 전사 방법의 맥락에서 무세포 전환
포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질은 시험관 내, 무세포 단백질 합성 및 전환 방법의 일부로서 생산될 수도 있다. 특정 양태에서, 방법은 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 조건 하에서 산화제 (예를 들어, Cu2 +)를 포함하는 무세포 반응 혼합물에서 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 이 양태들에 따르면, 무세포 반응 혼합물은 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질이 세포에서 발현되는 것이 아니라, 시험관 내 단백질 합성에 적합한 반응 혼합물에서 발현되는 것이다. 예시의 무세포 반응 혼합물은 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질의 합성을 위한 핵산 주형과 함께, 무세포 추출물, 세포 용해물, 및 재구성된 번역 시스템을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 무세포 반응 혼합물의 구성요소는 활성화된 FGE를 생산하기 위한 시험관 내, 무세포 단백질 합성 방법에 관하여 상기 기술된 바와 같을 수도 있다.
활성화된 FGE를 사용한 시험관 내 전환
포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질은 시험관 내 전환 방법의 일부로서 생산될 수도 있으며, 이 방법에서 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질은 무세포 반응 혼합물에서 조합된다. 이 구체예들에 따르면, FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질은 무세포 반응 혼합물에서 발현되지 않는다. 이러한 방법들은 FGE의 활성화를 생산하기 위해 시험관 내에서 FGE를 발현시키고 (예를 들어, 세포 또는 무세포 번역 시스템에서), FGE를 정제한 다음, FGE를 산화제로 처리하는 단계를 기반으로 한다. 이러한 시험관 내 활성화된 FGE는 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질의 FGE 인식 부위 내에서 동일한 조건 하에서 비-활성화된 FGE에 의한 전환과 비교하여 증가된 효율로 시스테인 또는 세린 잔기를 전환시킨다 (하기 실시예 섹션 참조).
일부 구체예에서, 반응 혼합물은 구리(II) 이온 (즉, Cu2 +), 또는 구리(II) 이온의 공급원, 예를 들어, 황산구리 (CuSO4), 시트르산구리, 타르타르산구리, 등을 포함한다. Cu2 +를 함유하는 무세포 반응 혼합물에서 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질을 발현시키는 것은, 본원에서 기술된 바와 같이, FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 (Fgly) 잔기로 전환시키는 조건 하에서 발생할 수도 있다.
특정 구체예에서, FGly 잔기를 가진 단백질을 생산하는 시험관 내 방법은 무세포 반응 혼합물에서 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질을 조합하는 단계를 포함한다. 이 구체예들에서, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질을 조합하기 전에 활성화된 FGE를 형성하도록 FGE가 활성화될 수도 있다. "활성화된"은 활성화된 FGE가 활성화되지 않은 FGE와 비교하여 더 큰 활성, 예를 들어, FGE 인식 부위에서 시스테인 또는 세린 잔기의 FGly로의 전환을 위한 더 큰 활성을 가진다는 것을 의미한다. 예를 들어, 활성화된 FGE는 활성화되지 않은 FGE보다 1.5배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상 활성, 예컨대 200배 이상, 300배 이상, 또는 400배 이상, 또는 500배 이상, 또는 600배 이상, 또는 700배 이상, 또는 800배 이상, 또는 900배 이상, 또는 1000배 이상, 또는 1500배 이상, 또는 2000배 이상, 또는 2500배 이상, 또는 3000배 이상, 또는 3500배 이상, 또는 4000배 이상, 또는 4500배 이상, 또는 5000배 이상, 또는 5500배 이상, 또는 6000배 이상, 또는 6500배 이상, 또는 7000배 이상, 또는 7500배 이상, 또는 8000배 이상, 또는 8500배 이상, 또는 9000배 이상, 또는 9500배 이상, 또는 10,000배 이상 활성인 활성 (본원에서 기술된 바와 같이 FGE 활성 검정을 사용하여 측정됨)을 가질 수도 있다. 어떤 경우에는, 활성화된 FGE는 활성화되지 않은 FGE보다 3000배 이상 활성인 활성 (본원에서 기술된 바와 같이 FGE 활성 검정을 사용하여 측정됨)을 가진다. 어떤 경우에는, 활성화된 FGE는 활성화되지 않은 FGE보다 1.5 내지 10,000배 이상, 2 내지 10,000배 이상, 5 내지 10,000배 이상, 10 내지 10,000배 이상, 20 내지 10,000배 이상, 30 내지 10,000배 이상, 40 내지 10,000배 이상, 50 내지 10,000배 이상, 60 내지 10,000배 이상, 70 내지 10,000배 이상, 80 내지 10,000배 이상, 90 내지 10,000배 이상, 100 내지 10,000배 이상 활성, 예컨대 500 내지 9000배 이상, 1000 내지 8000배 이상, 또는 1000 내지 7000배 이상, 또는 1000 내지 6000배 이상, 또는 1000 내지 5000배 이상, 또는 1000 내지 4000배, 또는 2000 내지 4000배 이상 활성인 활성 (본원에서 기술된 바와 같이 FGE 활성 검정을 사용하여 측정됨)을 가진다. 어떤 경우에는, 활성화된 FGE는 활성화되지 않은 FGE보다 2000 내지 4000배 이상인 활성 (본원에서 기술된 바와 같이 FGE 활성 검정을 사용하여 측정됨)을 가진다.
특정 구체예에서, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질을 조합하기 전에 활성화된 FGE를 형성하도록 FGE가 활성화될 수도 있다. 이와 같이, 어떤 경우에는, 방법은 활성화된 FGE를 FGE 인식 부위를 가진 단백질과 조합하기 전에 산화제로 FGE를 활성화시키는 단계를 포함한다.
FGE의 활성화에 사용되는 산화제는 요구되는 반응 조건과 호환 가능한 임의의 편리한 산화제로부터 선택될 수도 있다. 예를 들어, 산화제는 원소상 산소, 예컨대 말단 산화제로서 원소상 산소일 수도 있다. 어떤 경우에는, 말단 산화제로서 원소상 산소는 산소, 산소 및 황화수소의 혼합물, 염기성 조건 하에서의 산소, 등으로서 제공될 수도 있다.
특정 구체예에서, 산화제는 원소상 산소, 예컨대 말단 산화제로서 원소상 산소이며, 반응은 전이 금속에 의해 촉매화된다. 이 경우에서, 산화제는, 제한되는 것이 아니라, 구리(II), 구리(II)의 공급원 (예를 들어, 황산구리, 시트르산구리, 타르타르산구리, 펠링 시약, 베네딕트 시약, 등)을 포함할 수도 있으며, 이것들은 산소 활성화를 촉매화할 수 있다. 어떤 경우에는, 산소 활성화를 촉매화할 수 있는 산화제 (예를 들어, Cu2 +)는 산소의 존재 하에서 제공된다. 예를 들어, 산화제는 산소 및 Cu2 +, Cu2 +의 공급원, 또는 이것들의 조합을 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 산화제는 구리(II) 또는 구리(II)의 공급원이다. 어떤 경우에는, 구리(II) 또는 구리(II)의 공급원은 산소의 존재 하에서 제공된다. 어떤 경우에는, 산화제는 구리(II), 예컨대 구리(II) 및 산소이다. 어떤 경우에는, 산화제는 구리(II)의 공급원, 예컨대 구리(II)의 공급원 및 산소이다. 어떤 경우에는, 구리(II)의 공급원은, 제한되는 것이 아니라, 황산구리, 시트르산구리, 타르타르산구리, 펠링 시약, 베네딕트 시약, 이것들의 조합, 등이다. 어떤 경우에는, 구리(II)의 공급원은 황산구리이다.
상기 기술된 바와 같이, 특정 구체예에서, FGE 대 산화제의 mol 비는 5:1, 또는 4:1, 또는 3:1, 또는 2:1, 또는 1:1, 또는 1:2, 또는 1:3, 또는 1:4, 또는 1:5이다. 어떤 경우에는, FGE 활성화 반응 혼합물에서 FGE 대 산화제의 mol 비는 1:2이다.
상기 기술된 바와 같이, 특정 구체예에서, 시험관 내에서 FGly 잔기를 가진 단백질을 생산하는 방법은 무세포 반응 혼합물에서 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질을 조합하는 단계를 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 가진 단백질을 조합하기 전에 활성화된 FGE를 형성하도록 FGE가 활성화될 수도 있다. 활성화된 FGE를 생산하기 위한 접근법은 상기 활성화된 FGE를 생산하는 방법의 설명에서 더 상세히 기술되어 있다.
특정 구체예에서, FGE 인식 부위를 가진 단백질에 대한 활성화된 FGE의 비율 (즉, 전환 반응에서 단백질에 대한 활성화된 FGE의 비율)은 200 mol % 이하, 예컨대 150 mol % 이하, 또는 100 mol % 이하, 또는 75 mol % 이하, 또는 50 mol % 이하, 또는 25 mol % 이하, 또는 10 mol % 이하, 또는 5 mol % 이하, 또는 3 mol % 이하, 또는 1 mol % 이하, 또는 0.7 mol % 이하, 또는 0.5 mol % 이하, 또는 0.4 mol % 이하, 또는 0.3 mol % 이하, 또는 0.2 mol % 이하, 또는 0.1 mol % 이하, 또는 0.07 mol % 이하, 또는 0.05 mol % 이하, 또는 0.03 mol % 이하, 또는 0.01 mol % 이하, 또는 0.005 mol % 이하이다. 특정 구체예에서, FGE 인식 부위를 가진 단백질에 대한 활성화된 FGE의 비율은 0.1 mol % 이하, 예컨대 0.1 mol %이다.
특정 구체예에 따르면, 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법은 포르밀글리신 잔기의 알데하이드 모이어티를 통해 생산된 단백질에 작용제를 컨쥬게이션하는 단계를 더 포함한다. 특정 양태에서, 작용제는 치료제, 영상화제, 대상체에게 투여시 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 작용제, 대상체에게 투여시 단백질의 면역원성을 감소시키는 작용제, 대상체에게 투여시 (예를 들어, 단백질이 백신일 때) 단백질의 면역원성을 증가시키는 작용제, 또는 생산된 단백질로의 컨쥬게이션에 바람직한 임의의 다른 바람직한 작용제이다.
특정 구체예에 따르면, 방법은 단백질에 치료제를 컨쥬게이션하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 치료제는 세포독성제, 항증식제, 항신생물제, 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제로부터 선택된다.
특정 구체예에 따르면, 관심 작용제는 영상화제이다. 영상화제는, 예를 들어, 형광 염료, 근적외선 (NIR) 영상화제, 및 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)/CT 영상화제, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화제, 자기 공명 영상 (MRI) 제, 양전자-방출 단층촬영 (PET) 제, X선 영상화제, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 영상화제, K-엣지 영상화제, 초음파 영상화제, 광음향 영상화제, 음향 광학 영상화제, 마이크로파 영상화제, 핵 영상화제, 및 이것들의 조합일 수도 있다.
관심 작용제는 생산된 단백질의 포르밀글리신 잔기의 알데하이드와의 반응에 대한 반응 파트너의 구성요소로서 제공된다. 광범위한 상업적으로 이용 가능한 시약들은 관심 작용제를 단백질의 포르밀글리신 잔기에 부착시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 많은 관심 작용제의 아미노옥시, 하이드라자이드, 또는 티오세미카바자이드 유도체는 적합한 반응 파트너이고, 쉽게 이용 가능하거나 또는 표준 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
조성물
본 개시물은, 특정 양태에서, 본 개시물의 방법을 실시하는데 유용한 조성물을 제공한다.
제1 양태에서, 세포 배양물과 호환 가능한 산화제, 예컨대 Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지 및 세포 배양 배지에 존재하는 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 세포는 FGE를 발현한다.
Cu2 +는 세포 배양 배지에서 FGE 활성화에 적합한 농도를 포함한, 임의의 요구되는 농도로 존재할 수도 있다. 특정 양태에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 nM 내지 100 mM, 예컨대 0.1 μM 내지 10 mM, 0.5 μM 내지 5 mM, 1 μM 내지 1 mM, 2 μM 내지 500 μM, 3 μM 내지 250 μM, 4 μM 내지 150 μM, 또는 5 μM 내지 100 μM (예를 들어, 5 μM 내지 50 μM)의 농도로 존재한다.
특정 구체예에 따르면, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 nM 이상, 10 nM 이상, 100 nM 이상, 1 μM 이상, 5 μM 이상, 10 μM 이상, 20 μM 이상, 30 μM 이상, 40 μM 이상, 50 μM 이상, 100 μM 이상, 200 μM 이상, 300 μM 이상, 400 μM 이상, 500 μM 이상, 1 mM 이상, 10 mM 이상, 또는 100 mM 이상의 농도로 존재한다. 특정 양태에서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 100 mM 이하, 10 mM 이하, 1 mM 이하, 500 μM 이하, 400 μM 이하, 300 μM 이하, 200 μM 이하, 100 μM 이하, 50 μM 이하, 40 μM 이하, 30 μM 이하, 20 μM 이하, 10 μM 이하, 5 μM 이하, 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 농도로 존재한다.
세포 배양 배지에 존재하는 세포는 원핵 세포 (예를 들어, 대장균 세포), 진핵 세포 (예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 등)일 수도 있다. 세포 배양 배지에 존재하는 세포는 FGE가 발현되는 핵산 주형, 및 선택적으로, FGE 인식 부위를 포함하는 단백질의 발현을 위한 핵산 주형을 포함할 수도 있다.
특정 양태에서, 세포 배양 배지에 존재하는 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로부터 선택된 포유류 세포이다.
또한 무세포 조성물이 제공된다. 특정 양태에서, 무세포 조성물은 활성화된 FGE 및 버퍼를 포함한다. 예를 들어, 활성화된 FGE는 버퍼에 존재할 수도 있다. 활성화된 FGE를 생산하기 위해 본원에서 기술된 방법 중 어느 것에 의해 생산된, 활성화된 FGE를 포함하는, 관심 있는 임의의 활성화된 FGE가 무세포 조성물에 포함될 수도 있다. 특정 구체예에 따르면, 활성화된 FGE는, 예를 들어, 투석, 버퍼 교환, 정용 여과, 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 전기영동, 등에 의해 반응 혼합물 (예를 들어, 생체 내 또는 무세포 단백질 합성 반응 혼합물, 및 FGE 활성화 반응 혼합물, 등)로부터 분리된, 정제된 활성화 FGE이다.
활성화된 FGE를 활성화된 형태로 유지하는데 적합한 버퍼가 이용될 수도 있다. 특정 양태에서, 버퍼는 활성화된 FGE와 호환 가능한 pH 범위, 예컨대 5 내지 9, 또는 6 내지 8의 pH 범위, 예를 들어, 약 7의 pH, 예컨대 7.4의 pH를 가지는 완충된 수용액을 제공하는데 적합하다.
본 개시물의 무세포 조성물은 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 더 포함할 수도 있다. 본원에서 상기 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질, 예를 들어, FGE 인식 부위를 가지는 관심 항체 또는 항체 단편, 등에 관한 섹션에서 기술된 단백질 중 어느 것을 포함한, FGE 인식 부위를 가진 임의의 관심 단백질이 무세포 조성물에 존재할 수도 있다.
키트
본 개시물의 양태는 키트를 더 포함한다. 본 개시물의 특정 구체예에 따르는 키트는 본 개시물의 방법을 실시하는데 사용된다.
한 구체에에 따르면, 활성화된 FGE, 및 단백질의 FGE 인식 부위에 존재하는 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키기 위해 활성화된 FGE를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공된다. 이러한 키트는 활성화된 FGE가 단백질의 FGE 인식 부위에 존재하는 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는데 사용될 수도 있는 반응 혼합물을 제조하는데 사용되는 버퍼를 더 포함할 수도 있다. FGE 및 버퍼는 같거나 다른 용기 (예를 들어, 튜브)에서 제공될 수도 있다. 활성화된 FGE에 대한 인식 부위를 포함하는 단백질 (예를 들어, 관심 항체 또는 임의의 다른 단백질)이 또한 키트에 포함될 수도 있다.
또한 FGE를 암호화하는 핵산, 및 산화제를 포함하는 키트가 제공된다. 특정 양태에서, FGE를 암호화하는 핵산은 세포로 벡터의 형질전환 또는 트랜스펙션시 원핵생물 또는 진핵생물 (예를 들어, 포유류) 세포에서 FGE를 발현시키는데 적합한 발현 벡터이다. 산화제는 상기 본 개시물의 방법에 관한 섹션에서 기술된 산화제 중 어느 것을 포함한, FGE를 활성화시키는데 적합한 임의의 산화제일 수도 있다. 특정 양태에서, 산화제는 Cu2 +이다. 키트는 핵산에 의해 암호화된 FGE를 발현시키는데 적합한 세포 (예를 들어, 본원에서 기술된 원핵 또는 진핵 세포 중 어느 것)를 더 포함할 수도 있다. 예를 들어, 산화제로 FGE를 활성화시키고 및/또는 핵산으로 관심 세포 유형을 형질전환하거나 트랜스펙션하기 위한 설명서가 키트에 포함될 수도 있다.
본 개시물의 키트의 구성요소는 별도의 용기에 존재할 수도 있거나, 또는 다수의 구성요소가 단일 용기에 존재할 수도 있다.
상기 언급된 구성요소 외에도, 본 개시물의 키트는, 예를 들어, 본 개시물의 방법을 실시하는데 키트의 구성요소를 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수도 있다. 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 기질, 예컨대 종이 또는 플라스틱, 등에 인쇄될 수도 있다. 이와 같이, 설명서는 포장 삽입물로서 키트 내에, 키트 또는 이것의 구성요소의 용기의 라벨에 (즉, 포장 또는 부분포장(subpackaging)과 관련됨), 등으로 존재할 수도 있다. 다른 구체예에서, 설명서는 적합한 컴퓨터로 판독 가능한 저장 매체, 예를 들어, CD-ROM, Blu-Ray, 하드 디스크 드라이브 (HDD), 컴퓨터로 판독 가능한 메모리 (예를 들어, 플래시 드라이브), 등에 존재하는 전자적 저장 데이터 파일로서 존재한다. 다른 구체예에서, 사실상의 설명서가 키트에 존재하지는 않지만, 예를 들어, 인터넷을 통해 원격 출처로부터 설명서를 얻는 수단이 제공된다. 이 구체예의 예는 설명서를 볼 수 있고 및/또는 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻기 위한 이 수단들이 적합한 기질에 기록된다.
다음 예들은 당업자에게 본 개시물의 구체예의 제조 및 사용 방법의 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위해서 제시되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 의도가 아니며 하기 실험들이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만 일부 실험적 오차 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 일부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 정도이다. "평균"은 산술 평균을 의미한다. 표준 약어, 예를 들어, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 시간, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오타이드(들); i.m., 근육 내(로); i.p., 복강 내(로); s.c., 피하(로); 등이 사용될 수도 있다.
실시예
장치
마이크로피펫 (연 1회 보정됨): ResearchPlus 2.5, 10, 20, 100, 200, 1000 (Eppendorf); 혈청용 피펫: Pipettor Plus (Omega); 저울 (월 1회 보정됨): XS4001S, NewClassic MF (ML204), AT200 (Mettler Toledo); pH 측정 (월 1회 보정됨): SevenCompact (Mettler Toledo), InLab Expert Pro electrode (Mettler Toledo), Orion Standards (Thermo Scientific); SDS-PAGE: PowerPac Basic (Bio-Rad), Mini-PROTEAN® Tetra System (Bio-Rad); PAGE 겔 이미지화: Image Quant LAS 4000 (GE Healthcare); 웰 플레이트 세척기: ELx405 (BioTek); 웰 플레이트 판독기: SpectraMax M5 (Molecular Devices); 원심분리기: Sorvall RC 6 Plus (Thermo Scientific), 5415 R & 5810 R (Eppendorf); 반응 혼합기: Thermomixer R (Eppendorf), 보텍싱 장치: vortex genie 2 (Scientific Industries); 진탕기: Lab Companion SI-600R (JEIO Tech Co. Ltd.), Shaking Incubator (Shel Labs); PCR 순환기: Mastercycler Pro (Eppendorf); 멸균: Hiclave (Hirayama).
흡수 분광법
UV 및 가시광선 흡수 스펙트럼을 제조사에서 공급된 소프트웨어를 구비한 NanoDrop™ 2000 (Thermo Scientific) 분광 광도계, 또는 VISIONlite™ 소프트웨어로 제어되는 GENESYS™ 10S 분광 광도계 (Thermo Scientific)에서 기록하였다. 분광계를 광도 측정의 정확도를 위해 NIST-추적 가능 칼륨 다이크로메이트 표준 (Starna Scientific 및 Thermo Scientific)로 보정하였다.
역상 HPLC
역상 고성능 액체 크로마토그래피를 Agilent OpenLAB CDS Chemstation Edition으로 제어되는 1100/1200 시리즈 기기 (Agilent Technologies)에서 수행하였다. 기기는 인라인 용매 탈기 장치, 분석용 4중 펌프, 바이알 자동 샘플링 장치, 온도 조절 컬럼 구획, 및 다이오드 어레이 검출기를 포함하였다. 크로마토그래피를 Aeris™ core-shell 250x2.1 mm XB-C18 Widepore 컬럼 (Phenomenex, Inc.)에서 달성하였다. 곡선 아래 면적 (AUC)을 Chemstation (Agilent)으로 계산하였다.
LC/MS
질량 분석 데이터를 인라인 용매 탈기 장치, 분석용 2중 펌프, 및 온도 조절 바이알/웰플레이트 자동 샘플링 장치를 포함한 1100 시리즈 HPLC (Agilent Technologies)가 구비된 4000 QTRAP® 질량 분석계 (AB Sciex)에서 수집하였다. 크로마토그래피를 PST-CHC 제어기 (Phoenix S&T)로 65 ℃로 설정된 버터플라이 컬럼 히터에 들어있는 Jupiter™ 150x1.0 mm C18 컬럼 (Phenomenex, Inc.)에서 수행하였다. LC-MRM (다중 반응 모니터링)/MS 전이 질량의 계산 및 결과로 얻은 데이터의 통합을 Skyline 2.6으로 수행하였다.
FPLC
빠른 성능 액체 크로마토그래피를 UPC-900, P-900 및 Frac-950 모듈로 구성된 GE Healthcare kta Protein Purification System에서 수행하였다. 니켈 친화도 크로마토그래피를 HisTrap® Excel 5 mL 컬럼 (GE Healthcare)으로 수행하였다. 겔 여과를 일회용 Sephadex® G-25 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 수동으로 수행하였다.
ICP-MS
고주파-커플링 플라스몬 질량 분석 (ICP-MS)을 Catalent Center for Excellence in Analytical Services (Morrisville, NC)에 의해 분석하였다. 구리 및 칼슘의 비를 효소 스톡(stock) 용액의 280 nm 흡광 강도로부터 측정된 단백질 농도를 기반으로 mol 비로서 계산하였다 (표 3).
FGE 조제물은 ICP-MS에 의해 측정된 바와 같이 구리 및 칼슘 둘 다를 함유한다.
조제물 [단백질] (μM)* Ca (μg/L) Ca (μM) Ca (비율) Cu (μg/L) Cu (uM) Cu (비율)
Sc-FGE 131.4 375 373.75 2.84 111 1.74 0.01
Hs-cFGE 204.3 98 97.4 0.48 4368 68.73 0.34
Sc-FGE +Cu 64.5 55 54.99 0.85 4768 75.03 1.16
Hs-FGE +Cu 69.7 106 105.59 1.51 6112 96.18 1.38
*단백질 농도를 280nm에서 스톡 단백질 용액의 흡광도를 사용하여 측정하였다. 단백질에 대한 흡광 계수를 ExPASy 생물정보학 서버 상의 분석 도구를 사용하여 효소의 1차 서열로부터 계산하였다. Hs-cFGE에 대하여, ε=85,745 M-1cm-1이고 MW=33,286 Da이며; Sc-FGE에 대해서는, ε=88,000 M-1cm-1이고 MW=37,432 Da이다.
항체 친화도의 경쟁적 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 평가
ELISA 플레이트 (Maxisorp)를 PBS 중 1 μg/mL으로 4 ℃에서 16 h 동안 1 μg/mL의 His-태그된 CD22 (Sino Biological 11958-H08H)로 코팅하였다. 그 이후 플레이트를 PBS 0.1% Tween-20 (PBS-T)으로 네 번 세척한 다음, 200 μL ELISA 블로커 (Thermo)로 차단하였다. 제2 플레이트에서, ELISA 블로커로 20 μg /mL에서 경쟁자 항체의 스톡 용액의 3배 단계 희석액 (50 μL + 100 μL)으로부터 11점 표준 곡선을 제조하였다. 그 다음에, 비오틴-태그된 CD22 (10 ng/mL의 100 μL)를 모든 웰이 첨가하였다. 마지막으로, 경쟁자 및 비오틴-태그된 CD22의 혼합물을 코팅된 ELISA 플레이트로 옮겼으며 (100 μL/웰), 이것을 RT에서 1-2 h 동안 흔들면서 인큐베이션하였다. 비오틴-태그된 CD22의 최종 농도는 5 ng/mL였고 경쟁자의 가장 높은 농도는 10 μg/mL였다. 플레이트를 PBS-T로 네 번 세척하였고; 그 이후, 스트렙타비딘-HRP (Thermo 21130)의 1:10,000 희석액 (차단 버퍼로)의 100 μL를 첨가하였고 플레이트를 RT에서 1-2 h 동안 흔들면서 인큐베이션하였다. 그 다음에, 플레이트를 PBS-T로 네 번 세척하였고, 1-Step Ultra TMB (100 μL/웰, Pierce #34038)로 현상하였다. 반응을 50 μl 2 M 황산으로 퀸칭(quenching)하였고, 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. EC50 값을 비선형 회귀로 결정하였다.
불확실성의 추정
막대 그래프 상에 나타낼 때, 불확실성의 측정값은 다음 방정식을 사용하여 셋 이상의 샘플 크기 (n)에 대한 평균의 표준 오차로부터 계산된 95% 신뢰 구간을 나타낸다:
Figure pct00001
상기 식에서 s는 n개의 샘플에 대하여 측정된 표준 편차이다. 효소 동역학 파라미터에 대해 보고된 오차는 미카엘리스-멘텐 방정식에 대한 활성 데이터의 비선형 회귀 중에 발견된 최소화된 제곱합으로부터 계산된 오차의 추정치를 나타낸다:
Figure pct00002
상기 식에서 Et는 용액 내 전체 효소이고, k cat 및 K M은 STRENDA 위원회에 의해 명시된 표준 효소 파라미터이다. 효소 특이적 활성의 단위는 카탈(katal)이며, 1 kat = 1 mol·s- 1이다. 동역학 파라미터를 GraphPad prism을 사용하여 초기 속도에 대한 [기질]의 비선형 회귀로부터 결정하였다.
HPLC 실행에 대한 곡선 아래 면적 (AUC)을 "새로운 실험" 알고리즘을 사용하고 기울기 민감도를 1 mAU로 설정한 Chemstation 소프트웨어에 의해 계산하였다. 동역학 파라미터를 GraphPad Prism을 사용하여 초기 속도에 대한 [기질]의 비선형 회귀로부터 결정하였다.
소프트웨어
모든 기기 데이터 수집 단말기를 Microsoft Windows OS 및 제조사에 의해 제공된 기기 제어 소프트웨어를 실행하는 PC와 함께 작동시켰다. 데이터 분석을 MS windows를 실행하는 PC 또는 OS X 10.10을 사용하는 Apple iMac에서 수행하였다. 선형 및 비선형 회귀를 GraphPad Prism 6.0e를 사용하여 수행하였다. HPLC 크로마토그램의 통합을 OpenLAB CDS Chemstation Edition을 사용하여 수행하였다.
LC-MRM/MS 전이 질량의 계산 및 결과로 얻은 데이터의 통합을 Skyline 2.6 (MacCoss Lab, University of Washington)으로 수행하였다. 통계적 계산을 Microsoft Excel로 수행하였다. 그래프 및 도면을 Adobe Creative Suite로 제조하였다. 단백질 결정 구조의 렌더링(rendering)을 공개 출처 PyMOL 1.7로 수행하였다.
재료
시약, 재료, 화학물질, 및 약어
사용된 모든 물을 Milli-Q Integral 5 시스템 (EMD Millipore)으로부터 탈이온화하였다 (18 MΩ). 상업적으로 이용 가능한 화학물질은 시약 등급이었다 (또는 그 이상, 표시되어 있음). 화학물질 및 재료들의 출처는 다음과 같다: Sigma-Aldrich - β-메르캅토에탄올 (βME), 트리플루오로아세트산 (TFA), 메톡실아민 하이드레이트, 구리(II) 설페이트 펜타하이드레이트, 스트렙토마이신 설페이트, 아이오도아세트아미드 (IAA); Acros - 포름산, 트리에탄올아민 (TEAM), 디티오트레이톨 (DTT), 글리세롤, 글루코스, 제1 칼륨 포스페이트, 제2 칼륨 포스페이트; Fisher Scientific - 이미다졸, 트립톤, 효모 추출물, 나트륨 클로라이드; Honeywell Burdick & Jackson - 아세토니트릴 + 0.1% TFA (HPLC 등급), 아세토니트릴 + 0.1% 포름산 (HPLC 등급); Thermo Scientific - 트리스(카르복시에틸) 포스핀, (TCEP), PageRuler Plus Protein Standard; Bio-Rad Laboratories - 10X 단백질 검정; IBI scientific - 아이소프로필티오갈락토시드 (IPTG); Amresco - 앰피실린 나트륨 염 (USP); Roche diagnostics - cOmplete-mini EDTA-없는 프로테아제 억제자 칵테일; EMD Millipore - BugBuster® Master Mix; Invitrogen - 울트라컴피턴트(ultracompetent) 대장균 BL21(DE3) 세포.
항체 생산
항체 생산을 위해서, GPEx 기술을 사용하여 항체-발현 세포의 대량의 안정한 풀을 생성하였다. 항체를 단백질 A 크로마토그래피 (MabSelect, GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 조정 배지로부터 정제하였다.
펩타이드 합성
모든 펩타이드 합성을 고체상에서 수행하였고 ≥95%로 정제하였다.
생물학적 재료의 확인
Sc-FGE-UniProt 등록 번호: Q9F3C7; PDB 2Q17.
Hs-FGE-UniProt 등록 번호: Q8NBK3; PDB 1Y1E.
실시예 1: Cu 2 + 는 포유류 세포에서 생체 내 FGE의 전환 효율을 증가시킨다 .
FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 발현하는 포유류 세포의 세포 배양 배지에서 Cu2 + (황산구리)의 존재 하에서 전환의 효과를 조사하였다. 재조합 인간 FGE 및 FGE 인식 서열 LCTPSR을 함유하는 재조합 αHER2 mAb (같은 세포의 중쇄 및 경쇄)를 발현하는 CHO 세포를 CellBoost4 feed, Efficient Feed C, 및 글루코스 및/또는 갈락토스가 보충된 Efficient Feed C가 들어있는 FortiCHO 배지에서 배양하였다. FortiCHO 배지 (Life Technologies), CellBoost4 (Thermo Scientific) 사료 및 Efficient Feed C (Life Technologies).
다양한 조건을 테스트하였고, 그 결과를 하기 요약한다.
도 1 (패널 A)에서 나타난 바와 같이, Cu2 + (50 μM 제0 일)는 CellBoost4 사료, Efficient Feed C, 및 Efficient Feed C + 글루코스가 들어있는 FortiCHO 배지에서 전환을 증가시켰다. 도 1 (패널 B)에서 나타난 바와 같이, Cu2 + (50 μM 제0 일)는 글루코스 또는 갈락토스의 첨가를 포함하여, Efficient Feed C가 들어있는 PF-CHO 배지에서 전환을 개선하였다.
제0 일에서 5 μM 또는 20 μM Cu2 +의 첨가는 도 2에서 나타난 바와 같이 전환에 대하여 50 μM과 같은 효과를 나타냈다. 제3 일 또는 제5 일에 50 μM Cu2 +의 첨가는 전환에 대하여 제0 일에 첨가와 같은 효과를 나타냈다. Cu2 + (50 μM D0)는 PF-CHO, 아미노산, AGT CD 5x 배지, CellBoost4, 글루코스 공급, 및 온도 변화를 포함한 배양 조건 하에서 전환을 개선하였다.
상기 기술된 실험은 Cu2 +의 존재 하에서 세포를 배양하는 것이 FGE 활성화를 초래하고, 결국 FGly를 포함하도록 표적 단백질에서 FGE 인식 부위의 전환을 증가시킨다는 것을 입증하였다.
다양한 농도의 다른 이온 공급원, 예컨대 철(II) 설페이트, MnCl2, 및 ZnCl2의 존재 하에서 전환에 대한 효과를 테스트 하기 위한 실험을 또한 수행하였다. 실험 조건은 상기 Cu2 + 실험에서 사용된 것들과 같다. 결과는 철 설페이트 (0.1 mM 또는 0.5 mM 제3 일), MnCl2 (50 uM 또는 10 uM 제0 일), 및 ZnCl2 (50 uM 제0 일)는 표적 폴리펩타이드의 전환의 검출 가능한 또는 유의한 증가에 영향을 주지 않았다는 것을 나타냈다.
도 3, 패널 A는 Cu2 +-처리된 세포 및 미처리 세포의 생균 밀도를 비교하는 데이터를 나타낸다. 도 3, 패널 B는 Cu2 +-처리된 세포 및 미처리 세포의 단백질 역가를 비교하는 데이터를 나타낸다. 도 3, 패널 C는 Cu2 +-처리된 세포에서 생체 내 FGE 활성화/증가된 전환을 나타내는 데이터를 나타낸다. 도 3에서 나타난 데이터는 역가 및 세포 생존률이 Cu2 +가 첨가되지 않은 실험과 비교하여 Cu2 +의 존재 하에서 크게 변하지 않았음을 나타낸다.
실시예 2: 생체 내 전환 효율에 대한 락테이트 소모의 잠재적 자극물질의 효과
구리가 락테이트 소모의 잠재적 자극물질인 것처럼, 락테이트 소모의 다른 잠재적 자극물질이 FGly를 포함하도록 표적 단백질에서 FGE 인식 부위의 전환 효율을 증가시키기 위해 FGE를 활성화시키는 능력을 을 조사하였다.
실험 조건은 상기 실시예 1에서 기술된 것들과 같다. 세포 배양 배지에 락테이트 (Sigma) 또는 피루베이트 (Sigma) (사료와 함께 1.5g/L)의 첨가는 FGE의 전환 효율을 증가시키지 않았다. 락테이트 소모를 자극하는 것으로 보고된 PowerFeedA (Lonza)는 전환 효율을 증가시키지 않았다. 락테이트 수준의 분석은 Cu2+의 존재 또는 부재 하에서 전환 효율의 차이에도 불구하고 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서 락테이트 소모의 차이를 나타내지 않았다.
도 7, 패널 A는 Cu2 +의 존재 또는 Cu2 +의 부재 하에서 % 전환의 그래프를 나타내며, 이것은 Cu2 +의 존재 하에서 더 높은 % 전환을 나타냈다. 도 7, 패널 B는 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서 락테이트 소모의 그래프를 나타내며, 이것은 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서 락테이트 소모의 유의한 차이를 나타내지 않았다. 도 7, 패널 C는 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서 글루코스 소모의 그래프를 나타내며, 이것은 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서 글루코스 소모의 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 3: Cu 2 + 는 293 Expi 시스템에서 전환 효율의 변동성을 감소시킨다.
선택된 부위에서 포르밀글리신 잔기를 가진 항체를 생산하기 위해 293 Expi 일시적 동시-트랜스펙션 시스템 (Life Technologies)을 사용하였다. 시스템은 가변적인 (10-95%) 전환으로 높은 항체 역가 (100-500 mg/L)를 생산하였다. 배양 배지에서 Cu2 +의 첨가가 이 시스템의 변동성을 감소시킬 수 있는지를 결정하기 위해서, CT-1.1 태그된 Her2의 트랜스펙션 직전에 또는 트랜스펙션 다음 날에 50 μM 황산구리를 첨가하였다. 트랜스펙션 전에 50 μM 황산구리가 처리되거나 처리되지 않은 Expi 293F를 3:1의 항체:FGE DNA의 비로 N-말단 KDEL 아미노산 서열 (+KDEL)을 가진 전장 인간 FGE 및 CT 태그된 항체에 대한 발현 플라스미드를 이용한 세 번의 독립적인 실험에서 일시적 동시-트랜스펙션하였다. 배양물을 트랜스펙션 후 5-6일에 수확한 다음, 역가를 ELISA로 평가하였고 단백질을 정제하여 전환을 질량 분석법으로 측정하였다.
결과는 도 4 및 표 1에서 나타나고 Cu2 +는 역가의 유의한 감소 없이 293 세포의 전환을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
실험 FGE 형태 황산구리 (μM) 항체 역가 (mg/L) 수확 일 전환 (%)
Exp. 1 +KDEL 0 Her2 CT1.1 393 5 47
+KDEL 제0 일에 50 μM Her2 CT1.1 418 5 95
Exp. 2 +KDEL 0 Her2 CT1.1 540 5 78
+KDEL 제0 일에 50 μM Her2 CT1.1 426 5 93
Exp. 3 +KDEL 0 Her2 CT1.1 137 6 72
+KDEL 제0 일에 50 μM Her2 CT1.1 119 6 94
실시예 4: Cu 2 + 는 다양한 형태의 FGE의 전환 효율의 변동성을 감소시켰다.
인간 FGE의 +KDEL 형태의 가변적 전환 효율은 Cu2 +의 첨가에 의해 감소될 수도 있다. 상기 실시예 3에서 기술된 바와 같은 실험 조건을 사용하여, Cu2 +가 비-KDEL 형태의 인간 FGE의 전환 효율의 변동성을 감소시키는 능력을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 트랜스펙션 전에 50 μM 황산구리가 처리되거나 처리되지 않은 Expi 293F 세포를 3:1의 항체:FGE DNA의 비로 다양한 형태의 인간 FGE (+KDEL, WT, myc-His) 및 CT 태그된 항체에 대한 발현 플라스미드를 이용하여 일시적 동시-트랜스펙션하였다. 배양물을 트랜스펙션 후 5일에 수확한 다음, 역가를 ELISA로 평가하였고 단백질을 정제하여 전환을 질량 분석법으로 측정하였다.
결과는 도 8 및 표 2에서 나타나고 Cu2 +가 비-KDEL 형태의 인간 FGE가 태그된 항체, 구체적으로 WT FGE 및 myc-His로 C-말단에 태그된 FGE로 동시-트랜스펙션될 때, Expi 시스템에서 전환 효율의 변동성을 감소시켰다는 것을 나타낸다.
실험 FGE 형태 황산구리 (μM) 항체 역가 (mg/L) 수확 일 전환 (%)
Exp. 1 +KDEL 0 Her2 CT1.1 351 5 62
+KDEL 제0 일에 50 μM Her2 CT1.1 232 5 88
WT 0 Her2 CT1.1 106 5 77
WT 제0 일에 50 μM Her2 CT1.1 101 5 86
myc His 0 Her2 CT1.1 180 5 24
myc His 제0 일에 50 μM Her2 CT1.1 124 5 78
Exp. 2 myc His 0 Her2 CT1.1 75 5 71
myc His 제0 일에 50 μM Her2 CT1.1 64 5 94
실시예 5: 전환에 대한 산화적 인산화의 자극물질 및 억제자의 효과
Cu2 +와 비교하여 인간 FGE의 전환 효율에 대한 산화적 인산화의 자극물질 및 억제자의 효과를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.
다이클로로아세테이트 (DCA)는 미토콘드리아 호흡을 자극하는 피루베이트 데하이드로게나제 키나제 억제자이다. 로테논은 미토콘드리아 복합체 1 억제자이고 산화적 인산화를 억제한다. 두 작용제 (4 시간 처리)를 이용한 ATP 생산에 대한 용량 반응을 수행하였고 예상된 바와 같이 각각의 약물이 ATP 생산에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 세포를 여러 농도의 DCA (DCA: 0 μM; 16 μM; 80 μM; 400 μM; 2000 μM; 10,000 μM; 및 50,000 μM)로 처리하고 세포를 Cu2 + (황산구리) 및 여러 농도의 로테논 (로테논: 0 nM; 5 nM; 24 nM; 120 nM; 600 nM; 3000 nM; 및 15,000 nM)으로 처리한 여러 실험들을 실행하였다. 세포를 평판배양하였고 4 시간 처리 동안 DCA 또는 로테논 10 μL를 첨가하였다. 세포를 실온으로 평형화하였고 100 μL/웰의 Cell titerglo 시약 (Promega)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2 min 동안 진탕하였고, 실온에서 10 min 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트 판독기에서 판독하였다.
결과는 DCA 또는 로테논으로는 전환에 대한 효과가 없음을 나타낸다. DCA 처리된 세포는 미처리 세포보다 약간 더 낮은 전환을 나타냈고, 로테논 및 Cu2 + 처리된 세포는 Cu2 + 단독으로 처리된 세포와 유사한 전환 효율을 나타냈다. 이 결과들은 산화적 인산화가 Cu2 + 처리로 관찰된 향상된 전환에 포함되지 않았을 가능성이 있음을 나타낸다.
실시예 6: 전환에 대한 황화물 퀴논 리덕타제 ( SQR )의 효과
황화수소 (H2S)은 FGE 촉매 주기의 추정의 부산물이다. 황화물 퀴논 리덕타제 (SQR)는 H2S를 산화시키고 해독하는 미토콘드리아 효소이다. 실험을 수행하였다. 유가 배양(fed batch)의 과정에 걸친 H2S 축적이 인간 FGE 활성을 억제하는지, 및 Cu2 +가 이 효과에 대응하는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.
세포를 평판배양하였다. DNA를 Optipro 무혈청 배지 (Life Technologies)와 혼합하였다. FreeStyle Max 트랜스펙션 시약 (Life Technologies) 및 Optipro 무혈청 배지를 혼합하였다. DNA 및 시약을 10-20 min 동안 실온에서 조합하였다. 결과로 생긴 복합체를 세포에 첨가하였다.
Cu2 +가 SQR의 수준을 증가시키는지를 결정하기 위해서 Cu2 +가 처리되거나 또는 Cu2 +가 처리되지 않은 세포의 용해물에서 SQR에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. SQR의 수준의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. Expi 세포에서 전환을 증가시키는데 있어서 SQR의 과발현이 Cu2 +를 대체할 수 있는지를 테스트하기 위한 실험을 또한 수행하였다. 결과는 대조군과 비교하여 SQR 과발현 세포에서 전환의 유의한 차이가 없음을 나타냈다. SQR 과발현을 CHO 일시적 트랜스펙션에서 확인하였다. 따라서, SQR은 정지기에서 높은 전환을 유지하는데 포함되지 않았을 가능성이 있다.
실시예 7: Cu 2 + -처리된 세포로부터 분리된 FGE는 특이적 활성을 증가시켰다.
Cu2 + 처리된 세포에서 관찰된 향상된 전환이 FGE 효소의 증가된 특이적 활성 때문인지를 결정하기 위해서, Expi 세포를 Cu2 +로 처리하거나 처리하지 않았고 인간 FGE-mycHis (pRW529)로 트랜스펙션하였다. FGE를 니켈 크로마토그래피를 통해 정제하였고 특이적 활성에 대하여 테스트하였으며, Cu2 + 처리된 세포로부터 단리된 FGE는 지속적으로 훨씬 더 높은 활성을 나타낸다. 실험 조건은 상기 실시예 3에서와 같은 것이다. 특이적 활성을 하기 실시예 9에서 기술된 바와 같이 측정하였다.
세포 배양 배지에서 Cu2 +를 제공하는 것은 FGE의 활성화를 초래하였으며, 구리가 없지만 그렇지 않으면 동일한 조건 하에서 배양된 세포와 비교하여 처리된 세포로부터 단리된 FGE의 더 높은 특이적 활성으로 나타난 바와 같다. 도 9, 패널 A, 및 도 9, 패널 B에서 나타난 바와 같이, FGE의 수준은 같지만 (또는 구리가 들어있으면 더 낮음; 도 9, 패널 A 참조) 구리 배양물의 FGE의 활성은 훨씬 더 높았다 (도 9, 패널 B 참조).
실시예 8: 원핵 세포에서 FGE 활성화 및 향상된 전환
원핵 세포에서 Cu2 +가 FGE를 활성화시키고 전환을 향상시키는 능력을 조사하였다. 스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) ("Sc") FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 동시-발현하는 대장균 세포를 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 도 4에서 나타난 바와 같이, Cu2 +의 부재 하에서 배양된 세포와 비교하여 Cu2 +가 처리된 세포에서 전환이 향상되었다.
Cu2 +에 의한 FGE 활성화의 잠재적 메커니즘을 조사하기 위해서, 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LCMS)을 Cu2 +의 존재 또는 부재 하에서 배양된 대장균 세포로부터 단리된 Sc-FGE에서 수행하였다. 도 5에서 나타난 바와 같이, Cu2 + 처리는 Sc-FGE의 두 개의 활성 부위 티올 기의 산화를 초래하였으며, FGE 활성화가 두 개의 활성 부위 시스테인 잔기를 포함하는 이황화물 형성을 포함할 수도 있음을 나타낸다.
실시예 9: 시험관 내 FGE 활성화
본 실시예는 FGE가 CuSO4의 처리에 의해 시험관 내에서 활성화될 수도 있으며, 그 결과 미처리/비-활성화된 FGE와 비교하여 처리/활성화된 FGE가 더 큰 특이적 활성을 가진다는 것을 입증한다.
대장균 세포로부터 Sc FGE의 재조합 발현 및 정제
스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) (Sc) FGE의 향상된 재조합 발현 및 정제를 수행하였다. N-말단 헥사히스티딘 태그 및 TEV 프로테아제 분열 부위를 가지고 있는 야생형 Sc-FGE를 암호화하는 pET151-D/TOPO 벡터를 LB 배지에서 42℃로의 열 충격에 의해 50 μL 울트라컴피턴트 대장균 BL21(DE3) 세포로 형질전환하였다. 앰피실린 선택 하에서 LB/아가로스에서 37℃로 평판배양 및 밤새도록 성장시킨 후, 개개의 콜로니를 테리픽 브로스 (terrific broth; TB)에서 125 mL로 증폭시켰다. OD 0.4-0.5에서, IPTG를 1 mM에 도달하도록 첨가하였다. 배양 플라스크를 18℃로 냉각시키고 200 RPM으로 16 h 동안 진탕하였다. 세포를 6,000 rcf로 20 min 동안 수거하였다. 세포를 용해 버퍼 (25 mM 트리에탄올아민, 50 mM NaCl, 프로테아제 억제자, pH 8.0)에 재현탁시켰고 BugBuster® 용해제로 용해시켰다. 용액을 25,000 rcf로 25 min 동안 원심분리하여 정화시켰다. 상층액을 스트렙토마이신 설페이트의 용액에 희석시킴으로써 잔류 DNA를 침전시켜서, 1 부피%의 최종 농도에 도달하였다. 용액을 15 min 동안 4 ℃에서 교반한 다음, 25,000 RPM으로 25 min 동안 원심분리하였다. 상층액을 Ni-NTA 세파로스 FF 컬럼으로 로딩하였고 중력류(gravity flow) 하에서 용출하였다. 비특이적으로 결합된 단백질을 5 CV의 세척 버퍼 (25 mM 트리에탄올아민, 250 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8)로 세척하여 제거하였다. 정제된 단백질을 용출 버퍼 (25 mM 트리에탄올아민, 250 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, pH 8)로 단리시켰다. 단백질을 함유한 분획 (브래드포드(Bradford) 검정으로 판단됨)을 모아서 저장 버퍼 (25 mM 트리에탄올아민, 50 mM NaCl, 8 부피% 글리세롤, pH 7.4)로 평형화된 Sephadex® G-25 컬럼 (PD-10, GE Healthcare)에 로딩하였다. 그 이후 단백질을 저장 버퍼로 용출시키고, 10 kD Amicon® 한외여과 막 (Millipore, Inc.)으로 농축하고, 77 K에서 급속냉동시켰다. 단리된 효소의 전형적인 수율: 50-75 mg/L 배지. 정제된 효소는 온전한 구상 단백질의 SDS-PAGE 전기영동 (10% 겔, Bio-Rad, Inc.), 역상 HPLC, LCMS, 효소의 트립신에 의한 분해의 LCMS, UV-Vis 흡수 분광법, 특이적 활성에 의해 특징지어 진다 (하기 기술됨).
FGE 활성 검정
FGE의 특이적 활성을 불연속 효소 활성 검정을 사용하여 측정하였다. FGE에 대한 기질은 공통 서열을 함유한 14개의 아미노산 펩타이드였다 (H2N-ALCTPSRGSLFTGR-COOH). 역상 HPLC에서 펩타이드를 함유한 시작 물질 (Cys) 및 생성물 (fGly)의 215 nm에서의 피크 면적을 통합함으로써 반응 속도를 결정하였다. 생성물 (및 부산물) 피크의 동일성을 RP-HPLC MS/MS로 결정하였다. 각각의 반응 수용액 (60 μL)은 기질 펩타이드 (100 μM), FGE (1 μM), DTT (1 mM), 및 버퍼 (25 mM 트리에탄올아민, pH 9)를 함유하였다. 단일 시간 과정은 2분마다 수집된 5개의 데이터 포인트로 구성된다. FGE 스톡 용액의 첨가 및 3 s 동안 보텍싱할 때 반응을 개시하였다. 수동으로 마이크로피펫을 사용하여 반응 혼합물 10 μL를 1 M HCl 1 μL에 희석함으로써 시점을 퀸칭하였다. 반응의 완료 이후, 각 시점을 RP-HPLC로 분석하였다.
HPLC에 의한 FGE 기질 및 생성물 펩타이드의 정량
FGE 기질 펩타이드 ALCTPSRGSLFTGR의 기질, 생성물, 및 부산물을 RP-HPLC에서 7 min 동안 0.1% TFA를 함유하는 물 중 등용매 18% MeCN으로 분리하였다. fGly (2.1 min), Cys (3.3 min), βME-DS (3.6 min), 및 Cys-DS (6.2 min) 형태의 기질의 통합된 면적을 총 면적 및 이것의 각 분획을 계산하는데 사용하였다.
FGE의 활성화
완충된 수용액 (25 mM 트리에탄올아민, pH 7.4, 50 mM NaCl) 중 포르밀글리신-생성 효소 (스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 50 μM)의 용액에 구리(II) 설페이트 (100 μM)를 첨가하였다. 혼합물을 1500 RPM으로 1 h 동안 25 ℃에서 보텍싱하였다. 그 이후 Sephadex® G-25 레진 (제조사의 지시에 따라 GE healthcare PD-10 컬럼)을 사용한 25 mM 트리에탄올아민, pH 7.4, 50 mM NaCl로의 버퍼 교환에 의해 단백질을 반응 혼합물로부터 제거하였다. 교환 후, FGE의 특이적 활성을 본원에서 기술된 표준 활성 검정을 사용하여 측정하였다.
결과
시험관 내 활성화 실험의 결과는 도 6에서 나타나며, Cu2 +의 공급원으로서 CuSO4가 처리된 FGE, 및 미처리 FGE의 특이적 활성의 그래프를 나타낸다. Cu2 +의 처리는 FGE 활성화를 초래하며, 이 실시예에서 처리된 FGE의 증가된 특이적 활성으로 나타난 바와 같다.
실시예 10: 인간 FGE의 코어를 암호화하는 재조합 바큘로바이러 스(baculovirus)의 생산
호모 사피엔스(H. sapiens) FGE의 촉매 "코어"에 이어서 정제를 위한 C-말단 His6 태그 (Hs-cFGE)를 암호화하는 DNA를 PCR에 의해 사전 구조체로부터 증폭시켰다 (Rabuka, et al., Nat. Protocols., (2012), 7, 1052-1067 참조). Hs -cFGE 서열 및 프라이머는 하기 나열된다. Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 Hs-cFGE-암호화 바큘로바이러스의 제조를 수행하였다.
Bac -to- Bac 발현 시스템을 위한 Hs - cFGE의 클로닝에 사용된 프라이머
정방향: GAGGCTAACGCTCCGGGCCC
역방향: GTCCATAGTGGGCAGGCGGTC
Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템은 아미노산 서열 DRSL의 신호 서열 (서열 번호:6)을 제공하기 위해 N-말단 단부에서 추가적인 네 개의 잔기를 발생새킨다. 이 발현 벡터로부터 발현된 Hs-cFGE의 1차 서열이 하기 제공된다.
TEV 프로테아제 부위 및 His 6 태그를 가진 Hs - cFGE의 1차 서열
10 20 30 40 50 60
DRSLEANAPG PVPGERQLAH SKMVPIPAGV FTMGTDDPQI KQDGEAPARR VTIDAFYMDA
70 80 90 100 110 120
YEVSNTEFEK FVNSTGYLTE VAAAPWWLPV KGANWRHPEG PDSTILHRPD HPVLHVSWND
130 140 150 160 170 180
AVAYCTWAGK RLPTEAEWEY SCRGGLHNRL FPWGNKLQPK GQHYANIWQG EFPVTNTGED
190 200 210 220 230 240
GFQGTAPVDA FPPNGYGLYN IVGNAWEWTS DWWTVHHSVE ETLNPKGPPS GKDRVKKGGS
250 260 270 280 290
YMCHRSYCYR YRCAARSQNT PDSSASNLGF RCAADRLPTM DKGENLYFQG HHHHHH
실시예 11: Hi5 세포로부터 Hs - cFGE의 발현 및 정제
Hs-cFGE 바큘로바이러스를 0.1의 MOI로 Hi5 곤충 세포 (Invitrogen)에 트랜스펙션하였다. 배양 72 h 후, 조정 배지를 원심분리 및 여과 (0.45 μm PES)로 정화시켰고, FPLC로 HisTrap® Excel 레진에 5 mL/min으로 로딩하였다. 레진을 10 컬럼 부피 (CV)의 세척 버퍼 (25 mM TEAM, 250 mM NaCl, 5 mM 칼슘 아세테이트, 10 mM 이미다졸, pH 8)로 세척하였다. 그 이후 효소를 용출 버퍼 (25 mM 트리에탄올아민 (TEAM), 5 mM 칼슘 아세테이트, 300 mM 이미다졸, pH 8)를 이용하여 컬럼으로부터 제거하였다. 단백질을 함유하는 분획 (FPLC 용출의 UV 검출에 의해 결정됨)을 모아서 저장 버퍼 (25 mM TEAM, 8 부피% 글리세롤, pH 7.4)로 평형화된 Sephadex® G-25 컬럼에 로딩하였다. 그 이후, 단백질을 저장 버퍼로 용출시키고, 10 kD Amicon® 한외여과 막 (Millipore)으로 농축하고, 액체 질소에서 급속냉각시켰다. 단리된 효소의 전형적인 수율은 10-20 mg/L 배지였다. 정제된 효소는 온전한 단백질의 SDS-PAGE 전기영동 (도 10), 역상 HPLC, LC/MS, 트립신 분해에 이어서 LC-MS/MS, 흡수 분광법, 및 특이적 활성에 의해 특징지어 진다 (하기 실시예에서 기술됨).
실시예 12: FGE 촉매 활성의 검정
FGE의 특이적 활성을 불연속 효소 활성 검정을 사용하여 측정하였다. FGE에 대한 기질은 CXPXR 공통 서열을 함유한 14개의 아미노산 펩타이드 였다 (ALCTPSRGSLFTGR). 역상 HPLC에서 기질 시스테인 (Csub) 및 생성물 (fGly) 펩타이드의 215 nm에서의 피크 면적을 통합함으로써 반응 속도를 결정하였다. 생성물 (및 부산물) 피크의 동일성을 RP-HPLC MS/MS로 결정하였다 (하기 참조). 각각의 반응 수용액 (120 μL)은 Csub (100 μM), FGE (0.1-1 μM), DTT (1 mM), 및 버퍼 (25 mM TEAM, pH 9)를 함유하였다. 단일 시간 과정은 알정한 간격으로 수집된 5개의 데이터 포인트를 포함하였다. FGE 스톡 용액의 첨가 및 3 s 동안 보텍싱할 때 반응을 개시하였다. 반응 바이알을 thermomixer R (Eppendorf)에서 1,500 RPM 및 25 ℃에서 보텍싱하였다. 마이크로피펫을 사용하여 반응 혼합물 20 μL를 1 M HCl 2 μL에 첨가함으로써 시점을 수동 퀸칭하였다. 반응의 완료 이후, 각 시점을 RP-HPLC로 분석하였다 (하기 참조).
실시예 13: LC-MS/MS 및 RP- HPLC에 의한 FGE 펩타이드 중간물의 확인
Csub에서 FGE에 의한 시험관 내 전환의 중간물 및 생성물을 확인하기 위해서, FGE 활성 검정의 반응 혼합물을 퀸칭하였고 LC/MS로 분석하였다. 반응 혼합물은 총 부피 200 μL 중 0.5 mM 펩타이드, 0.5 μM 인간 FGE, 5 mM 2-메르캅토에탄올 (βME), 및 25 mM TEAM, pH 9를 포함하였다. 반응 혼합물 20 μL를 1 M HCl 2 μL에 첨가함으로써 시점을 준비하였다. 구배는 10 min에 걸쳐 0.1% 포름산이 들어있는 물 중 5-25% MeCN이었다. RP-HPLC 상에서 215 nm에서 검출된 네 개의 펩타이드 피크의 상대적인 강도 및 체류 시간을 LC-MS/MS 데이터에서 복제하여, 질량에 의한 각 피크의 할당을 허용한다. 계산 및 관찰된 m/z 이온, 및 각 펩타이드 종류에 대한 할당은 도 11, 도 12, 및 도 13에서 나타난다.
실시예 14: HPLC에 의한 FGE 기질 및 생성물 펩타이드의 정량
FGE 기질 펩타이드 ALCTPSRGSLFTGR의 기질, 생성물, 및 부산물을 RP-HPLC 상에서 7 min에 걸쳐 0.1% TFA를 함유한 물 중 등용매 18% MeCN으로 분리하였다. fGly (2.1 min), Csub (3.3 min), Csub/βME 이황화물 (Csub-βME, 3.6 min), 및 기질/기질 이황화물 (Csub-Csub, 6.1 min) 형태의 기질의 통합된 면적을 총 면적 및 이것의 각 분획을 계산하는데 사용하였다.
실시예 15: FGE의 티올 및 이황화물 맵핑 (mapping)
Sc-FGE 또는 Hs-FGE에서 티올 잔기의 산화 상태를 결정하기 위해서, 순차적 라벨링, 분해, 및 직교 라벨링을 사용하여 LC/MS에 의해 티올 및 이황화물을 맵핑하기 위한 절차를 개발하였다. 단계 1, 초기 라벨링 및 트립신 분해: 반응 혼합물은 총 부피 30 μL 중 FGE (7.5 μg), NH4HCO3 (50 mM), 아이오도아세트아미드 (20 mM), 및 트립신 (0.75 μg)으로 구성되어 있다. 샘플을 함유한 튜브를 37 ℃에서 16 h 동안 인큐베이션하였다. 단계 2, 퀸칭: 물 (6 μL) 및 DTT (0.5 M 4.8 μL, 50 mM 최종 농도)를 단계 1의 반응 혼합물에 첨가하였다. 샘플을 함유한 튜브를 37 ℃ 및 1500 RPM에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 단계 3, 2차 라벨링: N-에틸말레이미드 (0.5 M 7.2 μL, 150 mM 최종 농도)를 단계 2의 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 이후 샘플을 함유한 튜브를 37 ℃ 및 1500 RPM에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 단계 3 이후, 반응 혼합물을 HCl (1 M 4.8 μL, 100 mM 최종 농도)로 퀸칭하였다. 분해된 펩타이드를 0.1% 포름산이 들어있는 물 중 0-50% MeCN의 구배로 15 min에 걸쳐 분리하였다. 시스테인-함유 펩타이드를 아이오도아세트아미드, N-에틸말레이미드, 및 Cys 잔기의 산화적 변형을 모니터링하는 MRM/MS로 검출하였다.
실시예 16: 구리(II) 설페이트로 FGE의 활성화
황산구리 (50 μM, 5 몰 당량)를 완충된 수용액 (25 mM TEAM, pH 7.4, 50 mM NaCl) 중 Sc-FGE (10 μM)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1500 RPM에서 1 h 동안 25 ℃에서 보텍싱하였다. 단백질을 반응 혼합물로부터 Sephadex® G-25 레진을 사용하여 25 mM TEAM, pH 7.4, 50 mM NaCl로의 버퍼 교환에 의해 정제하였다. 그 이후, FGE의 특이적 활성을 상기 기술된 활성 검정을 사용하여 측정하였다.
실시예 17: 온전한 mAb에서 fGly 함량의 정량
DTT (20 mM)를 20 μL의 최종 부피로 완충된 수용액 (25 mM NH4HCO3) 중 mAb (20 μg)의 용액에 첨가하였다. 샘플을 함유한 튜브를 37 ℃에서 15min 동안 1500 RPM으로 인큐베이션하였다. 그 이후, HCl (50 mM)을 용액에 첨가하고 튜브를 혼합될 때까지 보텍싱하였다. 그 다음에, 암모늄 바이카보네이트 (100 mM)를 용액에 첨가하고 튜브를 혼합될 때까지 보텍싱하였다. 트립신 (1 μg) 및 아이오도아세트아미드 (50 mM)를 첨가하고, 튜브를 37 ℃ 및 1500 RPM에서 60 min 동안 어둠 속에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 나트륨 시트레이트 (150 mM, pH 5.5) 및 메톡실아민 (100 mM)을 용액에 첨가하고, 튜브를 37 ℃에서 16 h 동안 인큐베이션하였다. 그 이후 가공된 샘플을 LC-MRM/MS로 분석하였다. MRM 전환은 시스테인, 아이오도아세트아미드로 변형된 시스테인, 포르밀글리신, 포르밀글리신 하이드레이트 (충돌 세포에서 물의 손실을 포함함), 및 포르밀글리신 메틸 옥심을 포함한, Cys-함유 펩타이드의 변형을 포함하였다. 각 종류들의 풍부함을 5개의 가장 강력한 전구물질/생성물 이온 쌍에 의해 한정하였으며, 이것을 각 구성요소의 총 신호 및 상대적 분획을 제공하도록 통합하였다. 상기 기술된 최적화된 분해 및 캡핑(capping) 절차에서, 배경보다 높은 미반응 Cys, fGly, 또는 fGly-하이드레이트는 검출되지 않았으며, 단지 카르복시아세트아미도메틸 Cys (CAM) 및 fGly의 메틸 옥심 (MeOx)을 관찰하였다. 카르복시아세트아미도메틸 Cys (CAM) 및 fGly의 메틸 옥심 (MeOx)이 검출될 수 있다.
실시예 18: FGE로 온전한 mAb의 시험관 내 전환
Hs-cFGE를 50 mM NaCl 및 1 mM βME가 들어있는 25 mM TEAM pH 9.0에서 알데하이드 태그를 함유하는 IgG (여기에서 C-말단 K가 SLCTPSRGS으로 치환됨)의 용액에 첨가하였다. 효소를 항체 중쇄의 알데하이드 태그 내에 Csub의 농도에 관하여 10 mol %로 첨가하였다. 용액을 1,000 RPM으로 16 h 동안 18 ℃에서 보텍싱한 다음, mAb Select 단백질 A 레진으로의 결합을 위해 용액의 pH가 ~7로 감소하도록 용액을 0.25 vol 당량의 0.5 M 나트륨 시트레이트, pH 5.5 (최종 농도 100 mM 시트레이트로)로 퀸칭하였다. IgG를 표준 방법을 사용하여 정제하였다. 전형적인 반응은 95-100%의 항체에서 최종 fGly 함량을 수득하였으며, 90-100%의 반응 전환 수율에 해당한다. 지금까지, 20 μg에서 0.6 g까지의 규모 범위에 걸쳐 반응을 수행하였다.
실시예 19: FGE 아포효소의 생성
에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA, 15 mM) 및 트리스(카르복시에틸)포스핀 (TCEP, 15 mM)을 완충된 수용액 (25 mM TEAM, pH 7.4, 50 mM NaCl) 중 Sc-FGE 전효소(holoenzyme) (5 μM)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 750 RPM으로 1 h 동안 37 ℃에서 보텍싱하였다. 단백질을 Sephadex® G-25 레진을 사용하여 25 mM TEAM, pH 7.4, 50 mM NaCl로의 버퍼 교환에 의해 반응 혼합물로부터 정제하였다. 그 이후, FGE의 특이적 활성을 상기 기술된 활성 검정을 사용하여 측정하였다.
결과
실시예 10-19의 결과를 다음 섹션에서 논의한다.
Sc-FGE 및 Hs-cFGE는 세포 배양물로부터 단리된 바와 같이 보통의 촉매 활성을 가진다. FGE의 재조합 발현 방법을 개발하였다. 두 종-스트렙토미세스 코엘리컬러(S. coelicolor) 및 호모 사피엔스(H. sapiens)-의 FGE를 그것들이 효소의 원핵생물 및 진핵생물 형태 둘 다를 나타내기 때문에 연구용으로 선택하였다. Sc-FGE를 대장균의 트랜스펙션 및 정화된 세포 용해물로부터 정제에 의해 제조하였다. Hs-cFGE를 곤충 세포의 바이러스 형질 도입에 의해 높은 순도 및 양호한 수율로 제조하였다. 인간 형태를 군총 세포에서 생산하였다.
인간 효소에 관하여, 침전을 촉진하는 것으로 보이는 효소의 비촉매 부분을 제거하였다 (하기 더 상세히 기술됨). 가용성 효소를 이용하여, 세포 배양물로부터 생산된 FGE의 활성, 및 촉매 작용에 필요한 반응 조건을 평가하였다.
FGE의 특이적 활성을 측정하기 위해서, MALDI-MS를 사용하여 퀸칭된 반응 혼합물의 시작 물질 및 생성물을 정량하는 불연속 검정을 수행하였다. 검정에서, 역상 HPLC를 사용하여 FGE 공통 서열을 함유하는 펩타이드의 Cys 및 fGly 형태를 분리하고 정량하였다. 변형되지 않은 14-아미노산 펩타이드 ALCTPSRGSLFTGR을 효소의 Sc- 및 Hs- 형태 둘 다에 대한 기질로서 사용하였다.
Cys의 fGly로의 전환은 기질 Cys 티올의 2 H+/2 e- 산화, 뿐만 아니라 산소에 대한 황의 교환을 사용하였다. 현재의 데이터는 분자상 산소가 말단 전자 수용체인 메커니즘을 지지한다. 하지만, O2는 4 H+/4 e- 수용체이기 때문에, 2 H+ 및 2 e-의 제2 당량을 제공하도록 환원제를 사용하여, O2로부터 2 mol H2O로의 환원을 완료하였다. 2 H+/2 e- 산화제를 시험관 내 반응에 직접 첨가함으로써 환원제의 사용을 건너뛸 수 있는지를 테스트하기 위해서, 산화제 H2O2를 첨가하였지만, 이황화물 (Csub-Csub)을 생성함으로써 기질의 다이머화를 초래하였으며, 이것은 반응을 중단시켰다 (도 12, 패널 a 및 도 12, 패널 b). 환원제 (DTT) 및 O2의 혼합물을 일상적인 활성 측정에 사용하였다.
Csub 및 환원제의 사전 혼합된 완충 용액에 FGE를 신속하게 혼합함으로써 개개의 FGE 반응을 시작하였다. 모든 완충 용액이 25 ℃에서 ~270 μM로 산소를 함유한 것으로 가정하였다 (헨리의 법칙(Henry's law)에 기초함). 시점들을 HCl을 이용하여 수동으로 화학적으로 퀸칭하였다. 하기 기술된 바와 같이, FGE의 특이적 활성은 그것의 활성 부위의 화학적 상태의 함수에 따라 달라질 수 있으며, 이 검정에서 이러한 효소 농도는 0.1-10 μM (0.1-10 mol %) 효소의 범위에 걸쳐 있다. Cys- 및 fGly-함유 펩타이드 둘 다의 식별자를 LC-MS/MS로 확인하였다 (도 11). 이 할당은 HPLC 체류 시간과 연관성이 있다 (도 14, 패널 a). 기질 및 생성물의 통합된 피크 면적을 Boeker에 의해 기술된 방법 (Biochem . J., (1984), 223, 15; 및 Biochem . J., (1985), 226, 29)을 사용하여 FGE의 초기 속도를 계산하는데 사용하였다 (도 14, 패널 b).
Hs-FGE는 세 개의 주요 도메인을 함유한다: 신호 펩타이드, N-말단 연장부 (NTE), 기질에 결합하여 턴오버(turnover)를 수행하는 코어 (도 14, 패널 c). 신호 펩타이드의 ER로의 수송 및 단백질 가수분해에 의한 제거 후, "전장" 야생형 효소 (Hs-FGE)는 NTE 및 코어를 둘 다 함유한다. NTE는 C50 및/또는 C52 사이에서 ERp44와의 이황화물 결합 형성을 통해 ER 체류를 촉진할 수도 있다. NTE와 코어 사이의 경계는 프로단백질(proprotein) 컨버타제, 예컨대 퓨린 및 PACE에 대한 단백질 가수분해 분열 부위이다. FGE가 분비 경로에서 이 효소들과 직면할 때, NTE가 제거되고 절단된 코어가 분비될 수 있다. 시험관 내에서, 전장 FGE는 높은 농도에서 응집하는 경향이 있었고, 이와 같이 절단된 코어 (cFGE)가 제조되었다. Hs-cFGE의 특이적 활성 (1,143 pkat·mg-1, 33.3 kD)은 NTE를 함유한 Hs-FGE (850 pkat·mg-1, 36.9 kD)와 유사하였다. 이에 더하여, 대장균에서 발현된 Sc-FGE는 곤충 세포에서 발현된 인간 효소 (도 14, 패널 d)에 비해 훨씬 더 낮은 특이적 활성 (214 pkat·mg- 1)을 가지고 있었다. 따라서, 실험은 두 종 모두에서 양호한 수율 및 높은 순도의 활성 FGE의 생산을 나타냈다. FGE가 촉매 작용을 수행하는 메커니즘을 조사하고 FGE의 활성을 향상시키기 위한 추가의 실험을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
어떤 경우에는, FGE의 활성은 구리 보조 인자의 존재에 의존적이지만, 활성 부위 시스테인 잔기의 산화 환원 상태에 의존하는 것은 아니다. FGE가 활성 부위 이황화물 잔기의 존재를 필요로 하는지를 테스트하기 위한 실험을 수행하였다. 환원 및 산화된 형태의 FGE를 제조하여 그것들의 특이적 활성을 측정하였다.
환원된 활성 부위 Cys 잔기의 형성을 1 h 동안 25 ℃에서 강력한 환원제 (DTT)의 초과량 (100 몰 당량)으로 Sc-FGE의 전처리에 의해 달성하였으며, 그 이후 겔 여과에 의해 시약을 제거하였다. 산화된 활성 부위의 형성을 1 h 동안 25 ℃에서 (L)-데하이드로아스코르브산 (DHAA) 또는 CuSO4의 초과량 (100 몰 당량)으로 효소의 전처리에 의해 달성한 후 이어서, 겔 여과에 의해 시약을 제거하였다. DHAA는 화학량론적으로 이황화물을 형성할 수 있고, Cu2 +는 신속하게, 및 깨끗하게 용존 산소로 이황화물 형성에 촉매 작용할 수 있다. 이러한 처리 후에, 각 효소의 특이적 활성을 표준 동역학 검정을 사용하여 측정하였다. 단지 CuSO4로의 전처리만이 활성의 임의의 유의한 변화를 초래하였다 (도 15, 패널 a).
구리의 전처리 및 제거가 더 활성인 FGE를 유도하였기 때문에, Sc-FGE를 활성화시킬 수 있는 구리의 양을 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 1, 10, 또는 100 mol % CuSO4로 FGE의 처리는 구리의 화학량론적 양이 매우 활성인 효소를 생성한다는 것을 입증하였다 (도 15, 패널 b). 1 몰 당량 미만의 양은 비례적으로 더 낮은 활성을 초래하였으며, 활성 부위 티올의 촉매 활성화와 일치하지 않음을 관찰하였다.
반응 혼합물에 직접 구리를 첨가함으로써 FGE 반응 속도를 향상시키는 것이 가능한지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 데이터는 반응물에 구리의 포함에 의해 생성물 형성이 크게 억제된다는 것을 확인하였다 (도 12, 패널 c). 구리-촉매화된 이황화물 형성의 결과로서 산화된 형태의 DTT (도 12, 패널 d) 뿐만 아니라 Csub-Csub (도 12, 패널 e)의 신속한 형성을 관찰하였다.
Sc-FGE 및 Hs-cFGE 둘 다를 1 h 동안 25 ℃에서 CuSO4의 5 몰 당량으로 효율적으로 활성화시킨 후 이어서 초과량의 구리를 제거하였다. Sc-FGE의 특이적 활성은 크기가 10배 초과만큼-214 ± 34 pkat·mg- 1에서 3579 ± 215 pkat·mg-1로- 증가하였다; Hs-cFGE 특이적 활성은 1,143 ± 84 pkat·mg-1에서 3,050 ± 115 pkat·mg-1로 3배만큼 증가하였다 (도 15, 패널 c). 구리가 처리된 FGE가 정제 이후 금속을 함유하는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 비활성화 및 활성화 FGE 샘플 둘 다에서 구리의 양을 ICP-MS를 사용하여 측정하였다. 대장균에서 생산된 Sc-FGE는 측정의 노이즈(noise)의 수준보다 높은 수준의 구리를 거의 함유하지 않았다. 그에 반해, Hs-cFGE-곤충 세포로부터 단리됨-는 mol FGE 당 0.35 mol Cu를 함유하였다. 구리가 처리된 "활성화된" 형태의 FGE 둘 다는 단지 1 mol Cu/FGE보다 더 많이 함유한다. 게다가, 이 효소 조제물 각각의 특이적 활성은 Cu/FGE의 비율과 연관성이 있으며, 구리가 FGE의 활성 형태의 필수 구성요소임을 나타낸다 (도 15, 패널 c).
이어서 반응 혼합물에 직접 구리를 첨가함으로써 FGE 반응 속도를 향상시키는 것이 가능한지를 고려하였다. 데이터는 반응물에 구리의 포함에 의해 생성물 형성이 크게 억제되었다는 것을 나타냈다. 구체적으로, 구리-촉매화된 이황화물 형성의 결과로서 산화된 형태의 DTT, 뿐만 아니라 Csub-Csub의 매우 신속한 형성을 관찰하였다 (도 15, 패널 d). 왼쪽에서 오른쪽으로 fGly, Csub-Csub 및 DTTOX 각각에 대한 수직 막대는 0 μM, 5 μM 및 50 μM의 Cu2 + 농도에 해당한다.
활성화된 형태의 FGE에서 촉매화 활성이 활성 부위 이황화물에 의존하지 않음을 확인하기 위해서, 활성화된 효소에 강력한 환원제의 첨가가 결과로 얻은 물질의 특이적 활성을 감소시키는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 활성 부위 이황화물의 온전함이 턴오버에 중요한 경우, 강력한 환원제는 FGE 턴오버 속도를 감소시켜야 한다.
Hs-cFGE는 단백질의 다른 곳에서도 활성 부위 이황화물 (C336-C341), 뿐만 아니라 두 개의 구조적 이황화물 (C346-C235 및 C365-C218)을 형성할 수도 있다 (도 16, 패널 a). 20 mM DTT (또는 20 mM TCEP, 미도시)로 Hs-cFGE의 처리는 변함없는 특이적 활성을 가진 FGE를 생산하였다 (도 16, 패널 b). 관련 Cys 잔기가 이 처리의 결과로서 산화 환원 상태를 변화시켰음을 확인하기 위해서, LC-MRM/MS 검정을 사용하여 활성 부위에서 용액에 접근 가능한 Cys 잔기를 검출하였다. 이 방법으로, C341- 및 C235-함유 펩타이드 둘 다를 모니터링하였다. DTT로의 처리는 접근 가능한 활성 부위 C341의 비율을 28%에서 93%로 증가시켰다. 매립형 구조적 이황화물에 관여한 C235는 접근 불가능하며 (따라서, 이황화물에서는) DTT 처리에 독립적이다. 종합해보면, 이 데이터들은 환원성 처리가 거의 양적으로 감소된 활성 부위 티올을 생성하였고, 다른 구조적 이황화물을 교란시키지 않았지만, FGE의 촉매 활성에 아무런 효과가 없음을 확인하였다.
FGE가 효소 당 ~1 구리 원자를 함유한다는 것을 관찰한 후, 금속이 촉매 활성에 필요한 것인지를 결정하기 위해 금속을 제거하기 위한 실험을 수행하였다. 5 몰 당량 EDTA의 첨가를 통해 구리를 제거하려는 시도는 구리-처리된 Sc-FGE 또는 Hs-cFGE의 촉매 활성을 변화시키지 않았다 (도 17, 패널 a). 하지만, KCN은 보통의 양에 의해서도 Hs-cFGE의 활성을 감소시켰으며, 그것이 결합된 구리에 접근할 수 있다는 것을 제안한다. KCN의 전처리가 Hs-cFGE의 활성을 약간 감소시켰기 때문에, FGE 턴오버가 반응 혼합물에 KCN의 포함에 의해 억제될 수 있는지를 테스트하기 위한 실험을 수행하였다. 도 17, 패널 b에서 나타난 바와 같이, Sc-FGE (IC50 = 480 μM) 및 Hs-cFGE (88 μM) 둘 다에서 활성의 농도-의존적 억제를 관찰하였다. 구리 아민 옥시다제의 경우에, 나트륨 다이티오네이트로 사전-환원된 효소로부터 KCN을 이용하여 구리를 추출함으로써 아포효소를 생성하였다. 유사한 방식으로, 이 접근법은 FGE에도 성공적이었다. 활성은 환원제 및 킬레이터 (15 mM TCEP 및 EDTA) 둘 다의 처리시 (1 h, 37 ℃) 크게 감소하였지만, 개별적으로 각각의 구성요소의 처리시에는 그렇지 않았다 (도 17, 패널 d).
Sc-FGE 및 Hs-cFGE 둘 다의 표준 효소 파라미터를 결정하기 위한 실험을 수행하였다 (도 18). 그것들은 두 종 사이에서 상당히 달랐다. Sc-FGE는 기질과 매우 강력하게 상호작용하지 않았고 (KM = 96 μM) 매우 신속한 kcat (17.3 min- 1)를 나타냈으며, 이것들은 함께 kcat/KM = 3.0x104 M-1·s-1로 보통의 효소 효율을 나타냈다 (도 18, 패널 1). 그에 비해, Hs-cFGE는 더 느린 촉매 속도 상수 (kcat = 6.06 min-1)로 기질을 턴오버시켰지만, 기질 펩타이드와의 강력한 상호작용을 입증하였다 (KM = 0.34 μM). 종합해보면, Hs-cFGE (kcat/KM = 3.0x106 M-1·s- 1)는 그것의 박테리아 대응부보다 대략 10배 더 효율적이었다 (도 18, 패널 b).
데이터는 세포 배양물로부터 단리된 FGE의 보통으로 활성인 형태가 구리 보조 인자가 없는 아포효소, 및 펩타이드 기질 상에서 매우 활성이고 Cys를 fGly로 효율적으로 전환시키는 전효소의 혼합물임을 입증하였다. 폴딩된 단백질 기질 상에서 생체 촉매 반응에 FGE 전효소의 사용을 위한 조건을 개발하기 위한 실험을 수행하였다.
FGE는 폴딩된 단백질 상에서 Cys의 fGly로의 시험관 내 전환을 위한 효율적인 생체촉매였다. 알데하이드-태그된 mAb의 생산을 위해 시험관 내 전환을 사용하기 위해서, 다음 반응 조건을 테스트하였다. 대부분의 기질에 대하여, 5-10 몰 당량의 DTT가 완전한 전환을 달성하기에 충분하였다. 트리스(카르복시에틸) 포스핀 (TCEP), 리포산, 및 비스(2-메르캅토에틸)설폰 (BMS)으로도 턴오버가 가능했다. 하지만, 1 몰 당량의 강력한 환원제 (예를 들어, DTT, TCEP, 리포산, 또는 BMS)의 존재는 mAb 기질에 존재하는 이황화물을 분열시킬 수 있다. 기질 이황화물 분열을 막기 위해서, 대체 환원제를 반응에 사용하였다. 더 약한 환원제-예를 들어, βME 또는 GSH-는 항체 기질에 의해 내성을 가지며, 또한 FGE 촉매 작용을 가능하게 했다. 하지만, 환화 환원제 (DTT)에서 비-환화 환원제 (βME)로의 변화는 앞서 관찰되지 않은 부산물을 발생시켰다 (하기 논의됨). 부산물 형성을 감소시키고 생성물 수율을 증가시키기 위해서, 효소에 의한 턴오버에서 환원제의 역할(들)을 결정하기 위한 실험을 수행하였다.
기질 펩타이드에 결합된 FGE (아포효소)의 X선 결정학은 활성 부위에서 이황화물에 공유 결합된 C341 및 Csub를 나타냈다. 기질이 턴오버 중에 이 C341-Csub 이황화물에 의해 고정된 경우, 외인성 티올은 티올-이황화물 교환에 의해 효소-기질 복합체 (E·S)와 반응하여 티올-Csub 이황화물의 형태로 기질을 방출할 수도 있다. 두 개의 이상 경로 생성물이 턴오버 중에 FGE에 의해 형성되었다. 먼저, 환원제가 반응에 첨가되지 않았을 때, Csub-Csub 다이머 형성을 관찰하였다. 두 번째로, 모노티올이 환원제 (예를 들어, βME)로서 첨가되었을 때, Csub-βME 이황화물의 신속한 생성을 관찰하였다 (도 13, 패널 a). 효소가 없는 대조군 반응에서, Csub-Csub 및 Csub-βME는 둘 다 생성되지 않았다.
Csub-Csub 및 Csub-βME의 형성을 반응 조건의 함수로서 모니터링하였다. 먼저, 반응에서 환원제의 농도를 다양하게 하였고, 반응이 절반 완료되었을 때 반응을 퀸칭하였다. [Csub]에 대하여 낮은 [βME]에서는, Csub-Csub가 우세하였다 (도 19, 패널 a). 증가하는 [βME]는 Csub-Csub의 동시 감소, 및 Csub-βME의 증가를 초래하였다. 증가하는 [βME]는 또한 fGly의 더 높은 수율을 초래하였다.
시간이 흐름에 따라 진전된 반응으로서 [βME]의 효과를 결정하기 위한 실험을 수행하였다 (도 13, 패널 b). 상기 기술된 바와 같이, 외인성 환원제의 부재하에서 는 생성물이 형성되었지만, 상당한 비율의 Csub-Csub가 생성되었으며 (도 13, 패널 c), Csub가 턴오버 중에 환원제 대신에 작용할 수 있지만, 생성물 수율을 희생한다는 것을 나타낸다. 낮은 [βME] (0.25 mM, Csub에 대하여 2.5 몰 당량)에서, Csub-Csub는 처음에는 생성물 형성과 경쟁적인 속도로 성장하였지만 (도 13, 패널 d), 반응이 진행됨에 따라, 최대에 도달한 다음, 천천히 감퇴하였다. 이 [βME]에서, Csub-Csub가 소모되었고, Csub-βME는, 남아있는 경우, 신속하게 총 펩타이드의 13%의 플래토(plateau)에 도달하였다. 더 높은 [βME] (10 mM)를 이용한 후속 실험에서, Csub-Csub의 소모는 더욱 신속했다 (도 13, 패널 e). 이에 더하여, Csub-βME는 총 기질의 10%까지 빠르게 오르는 한편, 더 낮은 [βME]와 대조적으로, 신속하게 감퇴하였다. 모든 경우에, Csub-Csub 및 Csub-βME 둘 다의 소모는 생성물 형성으 더 높은 수율과 연관성이 있었다. 턴오버 중에 이황화물의 생산은 생성물 형성과 경쟁적이고, 효소의 부재 하에서 는 일어나지 않기 때문에, 이 데이터들은 FGE 및 기질 사이에서 이황화물 형성이 FGE 촉매 주기의 일부라는 것을 확인하였다.
βME와 대조적으로, DTT가 화학량론적 환원제로 사용되었을 때 중간물 Csub-Csub 및 Csub-DTT 이황화물은 관찰되지 않았다. 이것은 DTT가 환화하여 분자 내 이황화물을 형성하고 기질을 방출할 수 있기 때문일 것이다. 하지만, βME 또는 DTT를 사용한 반응에서 생성물 형성 속도는 같지 않았다 (도 19, 패널 b). 구체적으로는, 생성물 형성 속도는 βME 또는 DTT의 존재 하에서 각각 5.07 또는 3.27 min-1이었다. 환원제가 기질 및 효소 둘 다에 비해 초과량으로 존재하였기 때문에, 그것은 턴오버의 속도를 제한하는데 관여할 수도 있다.
환원제가 1 전자 메커니즘에 의해 작용하는 경우, 그것들의 상대적인 반응 속도는 그것들의 환원 가능성에 직접적으로 의존적이어야 한다:
E0'(βME) = -207 mV이고 E0'(DTT) = -323 mV이다. 대신에, 환원제가 티올-이황화물 교환에 의해 작용하는 경우, 그것들의 반응 속도는 티올-이황화물 교환 속도 상수와 연관성이 있어야 한다: kβME = 1이고 kDTT = 6x105이며, 글루타티온 이황화물에 대하여 측정된 바와 같다. 이 시나리오들 둘 다는 DTT의 존재 하에서 수행된 반응이 βME의 존재 하에서 수행된 반응보다 더 빠른 속도를 가져야 한다는 것을 예측한다. 그에 반해, DTT로 수행된 반응은 βME로 수행된 반응보다 더 느리고, 그래서 반응에서 티올의 역할은 티올 단독의 반응 속도에 의존하지 않을 수도 있다.
상기 실험에 의해 확인된 E·S에서 공유 결합된 이황화물은 상기 기술된 반응 속도의 차이의 원인일 수도 있다 (도 19, 패널 c). 이 상태로부터, E·S는 kcat의 속도 상수로 생성물로 진행될 수 있거나, 또는 그것은 kDS의 속도 상수로 티올-이황화물 교환에 의해 외인성 티올과 반응할 수 있다. 임의의 주어진 환원제에 대하여, kcat는 유사한 구리-의존성 옥시다제의 메커니즘을 기반으로 하는 같은 것일 것이며, 산화 환원 화학반응이 아니라 기질 방출이 속도를 제한한다. 하지만, kDS는 용액 중 환원제의 정체 및 그것의 티올-이황화물 반응 속도 상수에 직접적으로 의존할 수도 있다. 다른 말로 하면, E·S는 생성물 형성과 경쟁하여, 강력한 환원제의 존재 하에서 더 빠르게 해리되어야 한다. 이에 더하여, 기질이 빠르게 감퇴하지 않는 이황화물로서 방출되면 (βME-DS와 같이), 그것은 효소와 다시 반응하여 E·S를 재생시킬 수 있다. 그러므로, 더 강력한 환원제가 E·S 복합체를 해리시킴으로써 턴오버를 둔화시켜야 한다. 주기의 이 양태는 또한 pH 7에 비해 pH 9에서 관찰된 더 빠른 턴오버 속도를 설명할 수도 있다; 티올-이황화물 교환은 염기성 조건 하에서 더 빨랐다.
알데하이드 태그를 N- 또는 C-말단에 또는 임의의 용매 접근 가능한 내부 서열에 도입할 수 있다. 본원에서는, Cys는 mAb의 세 개의 독립적인 영역에서 (도 20, 패널 a) 및 세 개의 독립적인 mAb 상의 광범위한 반응 규모 (0.8-200 mg)에 걸쳐 (도 20, 패널 b, 및 도 20, 패널 c) Hs-cFGE에 의해 높은 수율로 fGly로 전환되었다. 각각의 경우에, 시험관 내 전환 수율은 >90%였으며, LC-MRM/MS에 의해 측정된 바와 같다 (도 21). 게다가, pH 9 반응 조건은 항원 결합 친화도 (도 22, 패널 a, 및 도 22, 패널 b) 또는 생체 내 FcRn 결합 및 mAb 순환에 중요한 잔기인 Met252에서의 산화 (도 22, 패널 c)에 영향을 미치지 않았다.
논의
양호한 수율로 Sc-FGE 및 Hs-cFGE 둘 다의 재조합 생산 방법이 본원에서 기술된다. 이에 더하여, 두 FGE의 동역학 파라미터를 측정하기 위한 불연속 HPLC 검정이 기술된다. 이 결과들은 Hs-FGE의 N-말단 연장부가 시험관 내 촉매 활성에 필요하지 않다는 것을 나타냈다. 곤충 세포 배양물로부터 단리된 인간 효소는 대장균에서 생산된 바와 같이 스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)의 FGE의 박테리아 형태보다 훨씬 더 활성이었다.
FGE 턴오버의 메커니즘을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 기존의 메커니즘에 대한 가설은 결정학에 의해 나타난 바와 같이 FGE 활성 부위 시스테인 잔기의 산화 환원 상태에 초점을 맞춘다. Hs-cFGE가 앞서 단리되었을 때, C336 (Sc-FGE에서는 C272) 및 C341 (C277)은 환원 및 산화된 형태의 혼합물로 효소에 존재하였다. C336 및 C341의 산화 상태는 C336 -C 341 이황화물을 형성하기 위해 용액 중 화학 시약을 사용하여, 또는 두 위치 모두에서 설폰산을 형성하기 위해 장기간에 걸쳐 H2 O 2로 조작될 수 있다. 이에 더하여, C336S 돌연변이는 C341로 분자 간 이황화물로서 Csub의 "트랩핑"을 가능하게 하였다. 이것은 FGE가 티올-이황화물 교환을 사용하여 Csub를 고정하고 C336을 활성화시킨다는 것을 나타냈다. 그 이후 이 잔기는 분자상 산소의 활성화를 수행하여 더 높은 산화 상태 Cys 잔기 (술펜산 또는 시스테인 과산화물)를 형성하고 그 후에 기질을 산화시킬 수도 있다.
FGE는 모노티올 환원제가 용액에 존재할 때 기질 Cys에서 이황화물의 형성을 촉매화할 수 있다. 이것은 FGE가 이황화물에서 Csub에 결합하고, k cat가 용액 중 환원제와의 반응 속도보다 더 느릴 때, Csub가 이황화물로서 방출될 수 있다는 것을 나타냈다. 디티올 시약, 예컨대 DTT가 사용되었을 때, 임의의 분자 간 이황화물은 DTT 환화에 의해 빠르게 폐지되었다.
FGE는 촉매 작용에 대한 보조 인자로서 구리를 포함한다. 결과는 FGE의 재조합 발현이 pH 7에서 구리(II) 설페이트의 첨가에 의해 전효소로 복원될 수 있는 아포효소를 가장 빈번하게 발생시킨다는 것을 나타냈다. 인간 및 박테리아 FGE 둘 다의 촉매화 속도는 Cu2 +의 화학량론적 양으로 활성화시 크게 증가하였고, 턴오버는 FGE 반응 혼합물에 시안화물의 첨가에 의해 억제되었다.
데이터는 FGE가 촉매 주기를 완료하기 위해 2 H+/2 e- 산화를 수행하고, 분자상 산소를 활성화시키고, 외인성 환원제를 필요로 하는 구리 옥시다제일 수도 있다는 것을 나타냈다.
상기 기술된 데이터로부터, 부산물의 형성은 [E·S] 복합체가 공유 결합에 의한 이황화물 브릿지를 포함한다는 것을 나타낸다 (도 23, 단계 a). 환원제는 활성 부위의 Cu(I) 상태를 생성하는 역할을 하며 (도 23, 단계 b), 이것은 기질 산화를 위해 준비된 구리 슈퍼옥소 Cu(II)-O2 -로서 분자상 산소의 결합에 대한 중간물이다. 그 이후 기질 시스테인 측쇄는 수소 원자 이동의 형태일 가능성이 높은 양자-커플링된 전자 이동에 의해 반응할 수 있다 (도 23, 단계 d). 산화 후에, 이황화물 라디칼은 티오알데하이드 및 티일 라디칼로 축소될 수도 있다 (도 23, 단계 e). 1 H+/1 e-의 제2 당량은 활성 부위 Cys를 재생시키고, 티오알데하이드는 신속하게 가수분해되어 fGly를 생산할 것이다 (도 23, 단계 f 및 단계 g). 형식적으로 산화 반응은 단순하게 반응 생성물로서 H2O2를 대체함으로써 완료되지만, 구리 과산화물 Cu(II)-OOH는 또한 추가의 환원을 거쳐 부산물로서 H2O만을 생성할 수도 있다. 이 시점에, 구리 상의 휴지 상태 리간드는 수산화물일 수도 있지만, 대체 메커니즘을 통해 C341의 직접적인 포함이 가능할 수도 있다.
상기 기술된 바와 같이, 기질 단백질에서 기존의 분자 간 이황화물을 붕괴시키지 않으면서 fGly의 효율적인 생산을 위한 반응 조건을 개발하였다. FGE를 양호한 수율로 생산하였고 시험관 내에서 알데하이드-태그된 단백질의 생산을 위한 생체 촉매로서 사용하였다. FGE와의 반응은 수율의 큰 감소 없이 질량의 적어도 3 자릿수에 걸쳐 조정되고, 기존의 이황화물을 교란시키지 않거나 생체 내에서 mAb 성능에 중요한 잔기를 변형시키지 않으면서 진행된다.
전술된 발명은 명확한 이해의 목적을 위해 삽도 및 예의 방식으로 일부 상세히 기술되었지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 특정 변화 및 변형이 이루어질 수도 있다는 본 발명의 교시내용에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 전술된 것들은 단지 본 발명의 원칙을 예시한다. 당업자들은 본원에서 명시적으로 기술되거나 도시된 것은 아니지만, 본 발명의 원칙을 구체화하고 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있음을 이해할 것이다. 게다가, 본원에서 나열된 모든 예 및 조건부 언어들은 주로 독자들이 본 발명의 원칙 및 발명자들에 의해 업계를 발전시키는데 기여한 개념들을 이해하는데 있어서 도움을 주기 위한 것이고, 이러한 구체적으로 나열된 예 및 조건에 대하여 제한하는 것이 아닌 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, 본 발명의 원칙, 양태, 및 구체예, 뿐만 아니라 구체적인 예들을 나열하는 모든 진술은 그것들의 구조적 및 기능적 등가물 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 추가적으로, 이러한 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발될 등가물, 즉, 구조에 관계없이, 같은 기능을 수행하도록 개발되는 임의의 요소를 포함하도록 의도된다. 그러므로 본 발명의 범위는 본원에서 도시되고 기술된 예시의 구체예들에 제한되도록 의도된 것은 아니다. 대신에, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구체화된다.

Claims (96)

  1. 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하기 위해, 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 활성화된 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 조건 하에서 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질과 조합하는 단계
    를 포함하는, 포르밀글리신 잔기를 포함하는 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 조합하는 단계는
    FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 세포 배양 조건 하에서 Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지에서
    포르밀글리신-생성 효소 (FGE); 및
    FGE 인식 부위를 포함하는 단백질
    을 포함하는 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2 항에 있어서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 nM 내지 10 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3 항에 있어서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, FGE는 세포에 대하여 내인성인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, FGE는 인식 부위를 함유하는 단백질은 세포에 대하여 내인성인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제2 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제2 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9 항에 있어서, 진핵 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10 항에 있어서, 포유류 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9 항에 있어서, 진핵 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제9 항에 있어서, 진핵 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1 항에 있어서, 조합하는 단계는 FGE가 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키는 조건 하에서 Cu2 +를 포함하는 무세포 반응 혼합물에서 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15 항에 있어서, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질은 환원제를 포함하는 반응 혼합물에서 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, 환원제는 FGE 인식 부위의 시스테인 잔기 또는 세린 잔기의 포르밀글리신 잔기로의 전환을 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17 항에 있어서, 환원제는 2-메르캅토에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1 항에 있어서, 활성화된 FGE 및 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질은 무세포 반응 혼합물에서 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19 항에 있어서, 활성화된 FGE를 FGE 인식 부위를 포함하는 단백질과 조합하는 단계 전에, Cu2 +로 FGE를 활성화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20 항에 있어서, 원소상 산소가 말단 산화제로서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21 항에 있어서, 원소상 산소는 산소, 산소 및 황화수소의 혼합물, 또는 염기성 조건 하에서의 산소에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21 항에 있어서, 원소상 산소는 Cu2 +에 의해 촉매화된 반응에서 말단 산화제인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제20 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, Cu2 +는 황산구리, 시트르산구리, 타르타르산구리, 펠링 시약, 및 베네딕트 시약으로부터 선택된 Cu2 +의 공급원에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제20 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, Cu2 +의 공급원은 황산구리인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제19 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, FGE는 N-말단 절단된 FGE인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26 항에 있어서, FGE는 N-말단 절단된 인간 FGE인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 항체, 항체 단편, 리간드, 효소, 또는 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 IgG 또는 이것의 단편, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, ScFv, 이중 특이적 항체 또는 이것의 단편, 디아바디 또는 이것의 단편, 키메라 항체 또는 이것의 단편, 단클론성 항체 또는 이것의 단편, 인간화된 항체 또는 이것의 단편, 및 완전한 인간 항체 또는 이것의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제29 항 또는 제30 항에 있어서, 항체는 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31 항에 있어서, 종양 관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 HER2, CD19, CD22, CD30, CD33, CD56, CD66/CEACAM5, CD70, CD74, CD79b, CD138, 넥틴-4, 메소텔린, 막관통 당단백질 NMB (GPNMB), 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), SLC44A4, CA6, 및 CA-IX로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33 항에 있어서, 리간드는 성장 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제33 항에 있어서, 리간드는 호르몬인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1 항 내지 제35 항 중 어느 한 항에 있어서, 포르밀글리신 잔기의 알데하이드 모이어티를 통해 포르밀글리신 잔기를 포함한 단백질에 작용제를 컨쥬게이션하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36 항에 있어서, 작용제는 치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37 항에 있어서, 치료제는 세포독성제, 항증식제, 항신생물제, 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제36 항에 있어서, 작용제는 영상화제인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39 항에 있어서, 영상화제는 형광 염료, 근적외선 (NIR) 영상화제, 및 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)/CT 영상화제, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화제, 자기 공명 영상 (MRI) 제, 양전자-방출 단층촬영 (PET) 제, X선 영상화제, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 영상화제, K-엣지 영상화제, 초음파 영상화제, 광음향 영상화제, 음향 광학 영상화제, 마이크로파 영상화제, 핵 영상화제, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지; 및
    세포 배양 배지에 존재하는 세포로서, 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 발현하는 세포
    를 포함하는 조성물.
  42. 제41 항에 있어서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 0.1 μM 내지 10 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제42 항에 있어서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제41 항 내지 제43 항 중 어느 한 항에 있어서, FGE는 세포에 대하여 내인성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제41 항 내지 제43 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제41 항 내지 제45 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제41 항 내지 제46 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 제47 항에 있어서, 진핵 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제48 항에 있어서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제47 항에 있어서, 진핵 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제47 항에 있어서, 진핵 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 제41 항 내지 제46 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지에서 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 배양하는 단계는 FGE가 세포에서 발현되는 조건 하에서 이루어지는 단계
    를 포함하는 방법.
  54. 제53 항에 있어서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 0.1 μM 내지 10 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제53 항에 있어서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제53 항 내지 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, FGE는 세포에 대하여 내인성인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제53 항 내지 제56 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제53 항 내지 제57 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 FGE 인식 부위를 함유하는 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제53 항 내지 제58 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제59 항에 있어서, 진핵 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제60 항에 있어서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제59 항에 있어서, 진핵 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제59 항에 있어서, 진핵 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제53 항 내지 제58 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 생산하는 방법으로서, 활성화된 FGE를 생산하기 위해 FGE를 Cu2+로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  66. 제65 항에 있어서, FGE를 Cu2 +로 처리하는 단계는 Cu2 +를 포함하는 세포 배양 배지에서 FGE를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 배양하는 단계는 FGE가 세포에서 발현되는 조건 하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제66 항에 있어서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 0.1 μM 내지 10 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제66 항에 있어서, Cu2 +는 세포 배양 배지에서 1 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제66 항 내지 제68 항 중 어느 한 항에 있어서, FGE는 세포에 대하여 내인성인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제66 항 내지 제69 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 FGE를 발현하도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제66 항 내지 제70 항 중 어느 한 항에서, 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제71 항에 있어서, 진핵 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제72 항에 있어서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, COS 세포, Vero 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, PC12 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, HLHepG2 세포, NSO 세포, C127 세포, 하이브리도마 세포, PerC6 세포, CAP 세포, 및 Sp-2/0 세포로 구성된 군으로부터 선태되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제71 항에 있어서, 진핵 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제71 항에 있어서, 진핵 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제66 항 내지 제70 항에 있어서, 세포는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제66 항 내지 제76 항에 있어서, 세포로부터 FGE를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제65 항에 있어서, FGE를 처리하는 단계는 Cu2 +를 포함하는 무세포 반응 혼합물에서 FGE를 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제65 항에 있어서, FGE는 무세포 반응 혼합물에서 Cu2 +로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제79 항에 있어서, 원소상 산소가 말단 산화제로서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제80 항에 있어서, 원소상 산소는 산소, 산소 및 황화수소의 혼합물, 또는 염기성 조건 하에서의 산소에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제80 항에 있어서, 원소상 산소는 Cu2 +에 의해 촉매화된 반응에서 말단 산화제인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제79 항 내지 제82 항 중 어느 한 항에 있어서, Cu2 +는 황산구리, 시트르산구리, 타르타르산구리, 펠링 시약, 및 베네딕트 시약으로 구성된 군으로부터 선택된 Cu2+의 공급원에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제79 항 내지 제83 항 중 어느 한 항에 있어서, FGE는 N-말단 절단된 FGE인 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제84 항에 있어서, FGE는 N-말단 절단된 인간 FGE인 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제65 항 내지 제85 항 중 어느 한 항에 있어서, Cu2 +로부터 FGE를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제65 항 내지 제86 항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 생산된, 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE).
  88. 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE); 및
    버퍼
    를 포함하는 무세포 조성물.
  89. 제84 항에 있어서, FGE 인식 부위를 포함하는 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  90. 제88 항 또는 제89 항에 있어서, FGE는 N-말단 절단된 FGE인 것을 특징으로 하는 조성물.
  91. 제90 항에 있어서, FGE는 N-말단 절단된 인간 FGE인 것을 특징으로 하는 조성물.
  92. 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE); 및
    단백질의 FGE 인식 부위에 존재하는 시스테인 잔기 또는 세린 잔기를 포르밀글리신 잔기로 전환시키기 위해 활성화된 FGE를 사용하기 위한 설명서
    를 포함하는 키트.
  93. 제92 항에 있어서, FGE는 N-말단 절단된 FGE인 것을 특징으로 하는 키트.
  94. 제93 항에 있어서, FGE는 N-말단 절단된 인간 FGE인 것을 특징으로 하는 키트.
  95. 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)를 암호화하는 핵산; 및
    Cu2 + 또는 Cu2 +의 공급원
    을 포함하는 키트.
  96. 제87 항에 있어서, 핵산에 의해 암호화된 FGE를 발현시키는데 적합한 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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