JP2018512043A - 活性化ホルミルグリシン生成酵素ならびにその生成方法及び使用方法 - Google Patents

活性化ホルミルグリシン生成酵素ならびにその生成方法及び使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）、活性化ＦＧＥの生成方法、及びホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基を含むタンパク質の生成方法におけるその使用を提供する。活性化ＦＧＥの生成方法、及びＦＧｌｙ含有タンパク質の生成における活性化ＦＧＥの使用方法は、細胞ベースの方法及び無細胞方法の両方を含む。例えば本開示の方法の実施において有用となる組成物及びキットも提供する。【選択図】図２０

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／１１２，４２２号、及び２０１５年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／１３４，４６１号の利益を主張し、これらの出願全体を参照により本明細書に援用する。
緒言
部位特異的タンパク質結合によって治療用タンパク質の特性を強化することができる。１つ以上の遺伝的にコードされるアルデヒド基を介して、哺乳類細胞内で発現される組換えタンパク質を部位特異的に修飾することができる。例えば、小胞体（ＥＲ）内在性ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によって認識されるペプチド配列は、わずか５残基の短さとすることができ、哺乳類細胞内で発現される異種タンパク質中に遺伝的にコードされ得る。ＦＧＥは、ＦＧＥ認識部位のシステインまたはセリン残基をホルミルグリシン残基へと共翻訳的に変換し、それによって唯一のアルデヒド基を有するタンパク質を生成する。このアルデヒド基は、タンパク質への目的の作用物質（例えば治療薬、造影剤など）の部位特異的結合に利用され得る。
本開示は、活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）、活性化ＦＧＥの生成方法、及びホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基を含むタンパク質の生成方法におけるその使用を提供する。活性化ＦＧＥの生成方法、及びＦＧｌｙ含有タンパク質の生成における活性化ＦＧＥの使用方法は、細胞ベースの方法及び無細胞方法の両方を含む。例えば本開示の方法の実施において有用となる組成物及びキットも提供する。
本開示の態様は、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法を含む。この方法は、ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質と活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を、活性化ＦＧＥがＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する条件下で組み合わせて、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質を生成することを含む。
いくつかの実施形態において、組み合わせは、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）、及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を含む細胞を、ＦＧＥがＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する細胞培養条件の下、Ｃｕ２＋を含む細胞培養培地中で培養することを含む。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１ｎＭ〜１０ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する。
ホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法に細胞が関与するいくつかの実施形態において、ＦＧＥは細胞にとって内因性であり、及び／または細胞はＦＧＥを発現するように遺伝子改変されており、かつ、ＦＧＥ認識部位を含有するタンパク質は細胞にとって内因性であり、及び／または細胞はＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を発現するように遺伝子改変されている。ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含有するタンパク質の一方もしくは両方が細胞にとって内因性であってもよく、または細胞がＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含有するタンパク質の一方もしくは両方を発現するように遺伝子改変されていてもよい。細胞がＦＧＥを発現するように遺伝子改変されている場合でも、細胞は細胞にとって内因性のＦＧＥも発現し得る。
いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞である。
いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、哺乳類細胞はヒト細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は酵母細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は昆虫細胞である。
いくつかの実施形態において、組み合わせは、Ｃｕ２＋を含む無細胞反応混合物中で、ＦＧＥがＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する条件の下、ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を発現させることを含む。
いくつかの実施形態において、還元剤を含む反応混合物中で活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を組み合わせる。いくつかの実施形態において、還元剤はＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基のホルミルグリシン残基への変換を促進する。いくつかの実施形態において、還元剤は２−メルカプトエタノールである。
いくつかの実施形態において、無細胞反応混合物中で活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を組み合わせる。
いくつかの実施形態において、ＦＧＥ認識部位を有するタンパク質と活性化ＦＧＥを組み合わせる前に、この方法はＣｕ２＋でＦＧＥを活性化することを含む。
いくつかの実施形態において、元素状酸素が最終酸化剤として存在する。
いくつかの実施形態において、元素状酸素は酸素、酸素及び硫化水素の混合物、または塩基性条件下の酸素によってもたらされる。
いくつかの実施形態において、元素状酸素はＣｕ２＋によって触媒される反応における最終酸化剤である。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、及びベネディクト試薬から選択されるＣｕ２＋源によってもたらされる。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋源は硫酸銅である。
いくつかの実施形態において、無細胞反応混合物中で活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を組み合わせる場合、活性化ＦＧＥはＮ末端切断型ＦＧＥである。Ｎ末端切断型ＦＧＥはＮ末端切断型ヒトＦＧＥであり得る。
いくつかの実施形態において、タンパク質は抗体または抗体断片である。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、ＩｇＧまたはその断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、二重特異性抗体またはその断片、ダイアボディまたはその断片、キメラ抗体またはその断片、モノクローナル抗体またはその断片、ヒト化抗体またはその断片、及び完全ヒト抗体またはその断片から選択される。
いくつかの実施形態において、抗体は腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原はＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ６６／ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８、ネクチン―４、メソテリン、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ６、及びＣＡ−ＩＸから選択される。
いくつかの実施形態において、タンパク質はリガンドである。
いくつかの実施形態において、リガンドは成長因子である。
いくつかの実施形態において、リガンドはホルモンである。
いくつかの実施形態において、この方法は、ホルミルグリシン残基を有するタンパク質にホルミルグリシン残基のアルデヒド部分を介して作用物質を結合させることをさらに含む。
いくつかの実施形態において、作用物質は治療薬である。
いくつかの実施形態において、治療薬は、細胞傷害剤、抗増殖剤、抗新生物剤、抗生物質剤、抗真菌剤、及び抗ウイルス剤から選択される。
いくつかの実施形態において、作用物質は造影剤である。
いくつかの実施形態において、造影剤は、蛍光色素、近赤外（ＮＩＲ）造影剤、及び単光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴ造影剤、核磁気共鳴（ＮＭＲ）造影剤、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）剤、陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）剤、Ｘ線造影剤、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）造影剤、Ｋエッジ造影剤、超音波造影剤、光音響造影剤、音響光学造影剤、マイクロ波造影剤、核造影剤、ならびにこれらの組合せから選択される。
本開示の態様は、Ｃｕ２＋を含む細胞培養培地、及び細胞培養培地中に存在する細胞を含む組成物を含み、細胞はホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を発現する。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に０．１μＭ〜１０ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する。
組成物が細胞を含むいくつかの実施形態において、ＦＧＥは細胞にとって内因性であり、及び／または細胞はＦＧＥを発現するように遺伝子改変されており、かつ、ＦＧＥ認識部位を含有するタンパク質は細胞にとって内因性であり、及び／または細胞はＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を発現するように遺伝子改変されている。ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含有するタンパク質の一方もしくは両方が細胞にとって内因性であってもよく、または細胞がＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含有するタンパク質の一方もしくは両方を発現するように遺伝子改変されていてもよい。細胞がＦＧＥを発現するように遺伝子改変されている場合でも、細胞は細胞にとって内因性のＦＧＥも発現し得る。
いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞である。
いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は酵母細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は昆虫細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は原核細胞である。
本開示の態様は、Ｃｕ２＋を有する細胞培養培地中でホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）をコードする核酸を含む細胞を培養することを含む方法を含み、培養はＦＧＥが細胞内で発現される条件の下で行う。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に０．１μＭ〜１０ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞である。
いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は酵母細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は昆虫細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は原核細胞である。
本開示の態様は、活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の生成方法を含み、この方法はＦＧＥをＣｕ２＋で処理して活性化ＦＧＥを生成することを含む。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋でのＦＧＥの処理は、Ｃｕ２＋を有する細胞培養培地中でＦＧＥをコードする核酸を有する細胞を培養することを含み、培養はＦＧＥが細胞内で発現される条件の下で行う。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に０．１μＭ〜１０ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞である。
いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は酵母細胞である。
いくつかの実施形態において、真核細胞は昆虫細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は原核細胞である。
いくつかの実施形態において、この方法は細胞からＦＧＥを精製することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＥの処理はＣｕ２＋を含む無細胞反応混合物中でＦＧＥを発現させることを含む。
いくつかの実施形態において、無細胞反応混合物中でＦＧＥをＣｕ２＋で処理する。
いくつかの実施形態において、元素状酸素が最終酸化剤として存在する。
いくつかの実施形態において、元素状酸素は酸素、酸素及び硫化水素の混合物、または塩基性条件下の酸素によってもたらされる。
いくつかの実施形態において、元素状酸素はＣｕ２＋によって触媒される反応における最終酸化剤である。
いくつかの実施形態において、Ｃｕ２＋は硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、及びベネディクト試薬から選択されるＣｕ２＋源によってもたらされる。
いくつかの実施形態において、この方法はＣｕ２＋からＦＧＥを精製することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、無細胞反応混合物中でＦＧＥをＣｕ２＋で処理する場合、ＦＧＥはＮ末端切断型ＦＧＥである。いくつかの実施形態において、ＦＧＥはＮ末端切断型ヒトＦＧＥである。
本開示の態様は、本明細書に開示の方法によって生成される活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を含む。
本開示の態様は、活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）、及びバッファーを含む無細胞組成物を含む。いくつかの実施形態において、無細胞組成物中に含まれる活性化ＦＧＥはＮ末端切断型ＦＧＥ（例えばＮ末端切断型ヒトＦＧＥ）である。
いくつかの実施形態において、組成物はＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を含む。
本開示の態様はキットを含む。このキットは、活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）、及びタンパク質のＦＧＥ認識部位中に存在するシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換するための活性化ＦＧＥの使用説明書を含む。いくつかの実施形態において、キットに含まれる活性化ＦＧＥはＮ末端切断型ＦＧＥ（例えばＮ末端切断型ヒトＦＧＥ）である。
本開示の態様は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）をコードする核酸、及びＣｕ２＋またはＣｕ２＋源を含むキットを含む。
いくつかの実施形態において、このキットは核酸によってコードされるＦＧＥを発現させるのに適した細胞も含む。そのような細胞は内因性ＦＧＥを発現し得る、及び／またはＦＧＥ認識部位を含有する内因性タンパク質を発現し得る。
本開示のある実施形態に従うＣｕ２＋処理細胞におけるインビボＦＧＥ活性化／変換の増加を示すデータを提供する。 本開示のある実施形態に従うＣｕ２＋処理細胞におけるインビボＦＧＥ活性化／変換の増加を示すデータを提供する。 本開示のある実施形態に従うＣｕ２＋処理細胞におけるインビボＦＧＥ活性化／変換の増加を示すデータを提供する。 Ｃｕ２＋処理細胞及び未処理細胞の生存密度を比較するデータを示す。 Ｃｕ２＋処理細胞及び未処理細胞のタンパク質力価を比較するデータを示す。 本開示の実施形態に従うＣｕ２＋処理細胞におけるインビボＦＧＥ活性化／変換の増加を示すデータを提供する。 本開示の実施形態に従うＣｕ２＋処理細胞におけるインビボＦＧＥ活性化／変換の増加を示すデータを提供する。 Ｃｕ２＋処理Ｅ．ｃｏｌｉ細胞及び未処理Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から単離したＦＧＥを比較する液体クロマトグラフィー質量分析データを提供する。 本開示のある実施形態に従うＣｕＳＯ４を用いたＳｃ ＦＧＥのインビトロ活性化を実証するデータを示す。 本開示のある実施形態に従うＣｕ２＋の存在下またはＣｕ２＋の不在下での変換率（％）のグラフを示す。 Ｃｕ２＋の存在下または不在下での乳酸消費のグラフを示す。 Ｃｕ２＋の存在下または不在下でのグルコース消費のグラフを示す。 本開示の実施形態に従うＣｕ２＋処理細胞でのインビボＦＧＥ活性化の変換効率における変動性の減少を示すデータを提供する。 パネルＡ及びパネルＢは、本開示のある実施形態において、細胞培養培地にＣｕ２＋を供給した結果のＦＧＥのレベルは同様であったが、ＦＧＥの活性は銅培養からの方が著しく高かったことを示すデータを提供する。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって特徴付けられる精製ＦＧＥの画像を示す。Ｓｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ｃＦＧＥ調製物から酵素が良好な量及び純度で得られた。図１０のパネルａのレーンは、以下の通りにＳｃ−ＦＧＥの精製の中間段階を示す：１―細胞溶解後の全可溶性タンパク質；２―１％ｗ／ｖ硫酸ストレプトマイシンでのＤＮＡ沈殿後の全可溶性タンパク質；３―Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上へのライセートの添加から回収したフロースルー中の可溶性タンパク質；４―Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーの洗浄画分中の可溶性タンパク質；及び５―Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーの溶出画分中の可溶性タンパク質。図１０のパネルｂはＨｉ５細胞で発現されたＨｓ−ｃＦＧＥの１０産生バッチの最終純度を示す。 出発物質及び生成物ペプチドのＬＣ／ＭＳ特性を示す。示されたスペクトルは、図１４のパネルａからの保持時間ｔ＝２．１分（図１１のパネルａ）、及びｔ＝３．３分（図１１のパネルｂ）におけるピークのものである。 基質二量体化の関数としての反応阻害のグラフを示す。図１２のパネルａは、Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂ二量体の同一性がＦＧＥでのインビトロ変換の間に形成された副生成物ピークのＬＣ−ＭＳによって確認されたことを表すグラフを示す。図１２のパネルｂは、ＦＧＥ反応混合物への過酸化水素の添加により、基質二量体が急速に形成されて生成物形成が阻害されたことを表すグラフを示す。図１２のパネルｃは、反応混合物中のＣｕ２＋の存在によっても生成物形成が阻害されたことを表すグラフを示す。この阻害は、ＤＴＴの消費（図１２のパネルｄ）及び二量体化による基質の捕捉（図１２のパネルｅ）の結果であった。 ＦＧＥによって形成された基質ジスルフィドの同定及び監視に関するデータを示す。図１３のパネルａはＣｓｕｂ−ＢＭＥのＬＣ／ＭＳ同定を示す。図１３のパネルｂは、化学量論的還元剤としてＢＭＥを含有するＦＧＥ反応混合物の長時間のＨＰＬＣ記録を示す。還元剤の不在下（図１３のパネルｃ）、２．５モル当量の還元剤（図１３のパネルｄ）及び１００モル当量の還元剤（図１３のパネルｅ）でのＦＧＥによって触媒された生成物形成。 不連続活性アッセイを用いてＦＧＥの比活性を測定したことを示すデータを提示する。図１４のパネルａは、１４アミノ酸のペプチド基質を用いてＦＧＥ触媒作用のカイネティクスを測定したデータを示す。Ｃｙｓ及びｆＧｌｙ含有ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって分離し、それらの量を２１５ｎｍでのピーク面積を積分することによって求めた。アスタリスクはペプチド合成中に形成された不純物を表す。図１４のパネルｂは、瞬間的な反応速度（ｐ／ｔ）のプロットを時間（ｔ）に対してｙ軸（ｔ＝０）まで外挿することによって反応の初期速度（ｖ０）を求めたことを表すデータを示す。図１４のパネルｃは、野生型Ｈｓ−ＦＧＥが、ＥＲ誘導シグナル配列、ＥＲ保持のためにＥＲｐ４４と相互作用するＮ末端伸長部、及び触媒コアの３つの一次ドメインを含有することを表す概略図を示す。図１４のパネルｄは、細胞培養から精製したままの状態の真核性及び原核性ＦＧＥの比活性を示すグラフを示す。全長（Ｈｓ−ＦＧＥ）及びＮＴＥを欠いたコア（Ｈｓ−ｃＦＧＥ）はほぼ同等の比活性を有していた。Ｈｓ−ＦＧＥとの高い配列的及び構造的相同性にもかかわらず、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されたままの状態の原核性Ｓｃ−ＦＧＥはＨｓ−ｃＦＧＥよりも活性が低かった。 化学量論量の銅（ＩＩ）での処理で著しく増加したＦＧＥの比活性を表すデータを示す。図１５のパネルａは、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されたままの状態では、Ｓｃ−ＦＧＥが低い比活性を有したことを表すグラフを示す。２電子酸化剤または還元剤（それぞれＤＨＡＡまたはＤＴＴ）でのＳｃ−ＦＧＥの処理は酵素の活性を変化させなかった。対照的に、過剰なＣｕＳＯ４での処理とこれに続くＣｕ２＋を除去するゲル濾過は、ＦＧＥ活性を著しく増加させた。図１５のパネルｂは、亜化学量論量のＣｕ２＋ではＳｃ−ＦＧＥが完全に活性化されなかったことを表すグラフを示す。１モル当量以上のＣｕ２＋の添加で酵素が完全に活性化された。図１５のパネルｃは、精製されたままの状態では、Ｓｃ−ＦＧＥは約０．０１Ｃｕ／ＦＧＥを含有し、Ｈｓ−ｃＦＧＥは約０．３４Ｃｕ／ＦＧＥを含有していたことを表すグラフを示す。インビトロでの活性化の後、Ｓｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ＦＧＥはそれぞれ１．１及び１．４Ｃｕ／ＦＧＥを含有していた。すべての場合において、精製酵素の調製物に含有されていた銅の量は酵素の比活性と相関があった。図１５のパネルｄは、銅によって触媒されたジスルフィド形成の結果としてのＤＴＴの酸化形態及びＣｓｕｂ−Ｃｓｕｂの形成を示す。 Ｈｓ−ｃＦＧＥの比活性は活性部位残基Ｃ３４１の酸化還元状態と相関がなかったことを表すデータを示す。図１６のパネルａは、２つの構造的ジスルフィド及びアポ酵素においてジスルフィドを形成することができる２つの活性部位システインを含有するＨｓ−ｃＦＧＥの概略図を示す。図１６のパネルｂは、Ｃ３４１の酸化還元状態をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定できることを表すグラフを示す。Ｃｕ２＋での活性化の後、溶液に接触可能なＣ３４１の量は約２８％であった。還元剤（ＤＴＴ）で処理すると、接触可能なＣ３４１の量は９３％に増加した。しかし、酵素の比活性は減少しなかった。ＤＴＴでの処理はＣ２３５含有構造的ジスルフィドに影響を与えなかった。 ＦＧＥ触媒作用がシアン化物によって阻害されたことを表すデータを示す。図１７のパネルａは、ＥＤＴＡまたはＫＣＮでの活性化ＦＧＥの前処理の結果、比活性がほとんど変化しなかったことを表すグラフを示す。Ｈｓ−ｃＦＧＥ活性のみＫＣＮ処理の後にわずかに減少した。図１７のパネルｂは、Ｓｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ｃＦＧＥの両方とも代謝回転の間、銅に対する強力なリガンドであるＣＮ−によって濃度依存的に阻害されたことを表すグラフを示す。図１７のパネルｄは、還元剤（ＤＴＴ、ＴＣＥＰ）または金属キレート剤（ＥＤＴＡ）での活性化Ｓｃ−ＦＧＥ（ｎ＝６）の前処理が酵素の比活性を変化させないことを示す。還元剤及びキレート剤を組み合わせた場合（それぞれ１５ｍＭ、１時間、３７℃）、ＦＧＥ活性はほぼ消失する。 非線形回帰によって求めたＳｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ｃＦＧＥの速度論パラメータのデータを示す。図１８のパネルａは、Ｓｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ｃＦＧＥ（図１８のパネルｂ）についての基質濃度をｖ０と相関させるミカエリス・メンテンプロットを示す。非線形回帰によってデータをミカエリス・メンテン式にフィッティングして速度論パラメータを求めた（図１８のパネルｃ）。 ＦＧＥが、生成物収率にとって阻害的であり得る基質／還元剤ジスルフィド形成を触媒することができることを表すデータを示し、基質は活性部位でジスルフィドとして結合されることが確認される。図１９のパネルａは、０〜１０ｍＭのβＭＥの範囲にわたるＦＧＥ反応混合物中の生成物形成のグラフを示す。βＭＥなしでは、ｆＧｌｙ及びＣｓｕｂ−Ｃｓｕｂが同等な速度で形成された。［βＭＥ］を増加させるにつれて、Ｃｓｕｂ−ＣｓｕｂがＣｓｕｂ−βＭＥに取って代わられ、生成物はより高い速度で形成された。図１９のパネルｂは、βＭＥがある場合のＦＧＥ触媒作用の初期速度の方がＤＴＴの場合よりも高かったことを表すグラフを示す。図１９のパネルｃは、これらのデータから、ＥとＳとの間のジスルフィドで［Ｅ・Ｓ］の形成ｉが生じたことが確認されることを表す概略図を示す。触媒作用ｉｉによって基質が生成物に変換され、その後、生成物が遊離されたｉｉｉ。チオール還元剤の存在下では、ｋｃａｔで定義される触媒作用の速度は、Ｅ・Ｓ複合体を解離させてＣｓｕｂ−Ｒを遊離させる速度定数ｋＤＳのチオール−ジスルフィド交換ｉｖと競合していた。この種はその後、別の当量の還元剤と反応しｖ、遊離基質を再生成することができる。添加した試薬が強力な非チオール還元剤（例えばＴＣＥＰ）または環化することができるチオール（ＤＴＴ）であった場合、ｉｖ及びｖが単一ステップにまとめられた。還元剤がモノチオールであった場合、Ｃｓｕｂ−Ｒは速度定数ｋ−ＤＳで［Ｅ・Ｓ］を再形成するのに十分長く残存することができた。 ＦＧＥを用いて高収率でアルデヒドタグ付きｍＡｂを生成することができることを表すデータを示す。図２０のパネルａは、アルデヒドタグがＩｇＧ１重鎖の重鎖の３つの領域（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３）に導入されたことを表す概略図を示す。インビトロでのＦＧＥとの反応の後、Ｃｙｓ及びｆＧｌｙの量を測定した。最適条件の下では、ＣｙｓからｆＧｌｙへの変換の収率は一様に８５〜９５％であった。図２０のパネルｂは、２つの個別のｍＡｂで０．８、８．０及び８０．０ｍｇテストケースにおいて測定した場合に、生物触媒性ｆＧｌｙ生成の収率が反応スケールに依存しなかったことを表すグラフを示す。図２０のパネルｃは、より広いスケールの反応の代表例のグラフを示す。ＦＧＥでの変換後、ｆＧｌｙ含有率は９８．１％であり、９７．８％の変換収率に相当した。 Ｃｙｓ及びｆＧｌｙ含有タンパク質のＬＣ−ＭＲＭ／ＭＳ特性に関するデータを示す。図２１のパネルａは、以下のステップによって、モノクローナル抗体を分解及び消化し、Ｃｙｓ及びｆＧｌｙ官能基を、特徴付けのためにそれぞれカルボキシアミドメチル（ＣＡＭ）及びメチルオキシム（ＭｅＯｘ）種として捕捉したことを表す概略図を示す：ｉ）ＤＴＴ、３７℃、１５分；ｉｉ）ＨＣｌ、その後、ＮＨ４ＨＣＯ３；ｉｉｉ）トリプシン、ヨードアセトアミド、ｐＨ８、３７℃、１時間；ｉｖ）メトキシルアミン、ｐＨ５．５、１６時間。図２１のパネルｂは、導入されたタグ配列を含有する固有のトリプシンペプチドによって各アルデヒドタグの位置を特徴付けしたことを表すグラフを示す。ここで、トリプシンによって９マーペプチドが生成された。ターゲットＭＲＭ−ＭＳを用いてＣＡＭまたはＭｅＯｘとして修飾されたペプチドを定量した。最も強度の高い５つの前駆体／生成物イオントランジションをピーク面積積分に選択した。図２１のパネルｃは、ＣＡＭ及びＭｅＯｘ含有ペプチドのイオンクロマトグラムを示す。ＭｅＯｘ含有ペプチドはオキシム形成の結果として存在するジアステレオマーに分離した。 インビトロ変換反応条件を受けたｍＡｂの生物物理学的特性に関するデータを示す。図２２のパネルａ及び図２２のパネルｂは、２つのＩｇＧ１ ｍＡｂに対する抗体／抗原親和性のＥＬＩＳＡ測定のグラフを示す。図２２のパネルｃは、ＩｇＧ１スキャホールドのＣＨ３ドメイン中の２５２位における酸化メチオニンの割合の測定値が反応の間に変化しなかったことを表すグラフを示す。 銅補助因子を考慮したＦＧＥの提唱される触媒機構の概略図を示す。ステップａに示すように、基質Ｓは酵素Ｅに結合し、Ｃ３４１を介して共有結合される。この共有結合形成はＣｕ２＋によって触媒され得るか、または既存のＣ３４１ジスルフィドと基質との間のチオール−ジスルフィド交換に起因し得る。ステップｂに示すように、Ｃｕ１＋へのＣｕ２＋の還元が、Ｃｕ２＋スーパーオキソ中間体としての分子状酸素の結合（ステップｃ）を可能にするであろう。ステップｄに示すように、プロトン共役電子移動（おそらく水素原子移動）を経たＣｕ（ＩＩ）−Ｏ２ −による基質の酸化でジスルフィドラジカルが生成され、これはチオアルデヒド及びチイルラジカルへと急速に崩壊する（ステップｅ）。第２の１Ｈ＋／１ｅ−還元及び加水分解でＣ３４１が再生成される。この還元の発生の仕方は複数の経路を経て進行し得るが、これには、直接的なチイルラジカル還元及びＨ２Ｏ２を遊離する銅パーオキシドの加水分解；またはスルフェン酸を生成するＣｕ（ＩＩ）−ＯＯＨからラジカルへのオキソ移動とこれに続く銅−オキシル還元及びスルフェン酸加水分解が挙げられるがこれらに限定されない。
本開示は、活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）、活性化ＦＧＥの生成方法、及びホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基を含むタンパク質の生成方法におけるその使用を提供する。活性化ＦＧＥの生成方法、及びＦＧｌｙ含有タンパク質の生成における活性化ＦＧＥの使用方法は、細胞ベースの方法及び無細胞方法の両方を含む。例えば本開示の方法の実施において有用となる組成物及びキットも提供する。
本開示の方法及び組成物をより詳細に記載する前に、本方法及び組成物は記載する特定の実施形態に限定されず、そのため当然変化し得ることを理解されたい。本方法及び組成物の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を記載する目的のためにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
値の範囲を規定する場合、文脈からそうでないことが明らかに分かる場合を除いて下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間の各値、及び明記した範囲内の任意の他の明記したまたはその間の値が本方法及び組成物に包含されると理解される。こうしたより小さな範囲の上限及び下限は、独立してそのより小さな範囲に含まれる場合があり、明記した範囲内の任意の上下限が具体的に除外されて、本方法及び組成物に包含される。明記した範囲が上下限の一方または両方を含む場合、そのような包含された上下限のいずれかまたは両方を除外する範囲も本方法及び組成物に含まれる。
別段の定義がない限り、本明細書において用いるすべての科学技術用語は、本方法が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な任意の方法及び組成物を本方法及び組成物の実施または試験に用いることができるが、代表的な例示的方法及び組成物をこれから記載する。
本明細書に引用するあらゆる刊行物及び特許は、あたかも個別の刊行物または特許をそれぞれ参照により援用すると具体的かつ個別に示したものとして、参照により本明細書に援用し、また、引用する刊行物が関連する材料及び／または方法及び組成物を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用する。いかなる刊行物の引用も出願日より前のその開示に関するものであり、本方法及び組成物がそのような刊行物に先行する権利がないという自認として解釈すべきではなく、提供する公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認を必要とし得る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈からそうでないことが明らかに分かる場合を除いて、複数形の言及を含むことが留意される。さらに、特許請求の範囲はあらゆる任意の要素を除外するように起草されている場合があることに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単独で」、「のみ」などの排他的用語の使用の、または「否定的」限定の使用の前提的基礎としての役割を果たすことを意図する。
本方法及び組成物のある特徴は、明瞭化のために別個の実施形態との関連で記載されるが、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいと理解される。反対に、本方法及び組成物の様々な特徴は、簡潔のために、単一の実施形態との関連で記載されるが、別々にまたは任意の好適な部分的組合せで提供されてもよい。実施形態のすべての組合せが、そのような組合せが実施可能なプロセス及び／またはデバイスを包含する限りにおいて、本開示に具体的に包含され、まさにあたかもすべての組合せが個別に及び明示的に開示されたものとして本明細書に開示される。さらに、そのような変数を記載する実施形態で列挙されるすべての部分的組合せも、本方法及び組成物に具体的に包含され、まさにあたかもすべてのそのような部分的組合せが本明細書で個別に及び明示的に開示されたものとして本明細書に開示される。
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態それぞれは、本方法の範囲または精神から逸脱することなく、他の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるか、またはそれらと組み合わされ得る孤立した構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順番で、または論理的に可能な任意の他の順番で実施することができる。
ホルミルグリシン生成酵素、ＦＧＥ認識配列、及び標的タンパク質
本開示の態様は、活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作製方法、及び目的のタンパク質中のＦＧＥ認識配列におけるアミノ酸の変換によってホルミルグリシン含有タンパク質を生成するための活性化ＦＧＥの使用方法を含む。活性化ＦＧＥならびに１つ以上のＦＧＥ認識配列及び／または１つ以上のホルミルグリシン残基を含む目的のタンパク質を含む組成物も提供する。
本開示の方法及び組成物に用いるために活性化され得るＦＧＥの例、目的のタンパク質中に与えられ得るＦＧＥ認識配列の例、ならびに例えば作用物質（例えば治療薬、造影剤など）を目的のタンパク質に結合させるのに有用なホルミルグリシン残基を含むように、ＦＧＥによって変換され得る目的のタンパク質の例を以下に記載する。
ホルミルグリシン生成酵素
本明細書で用いる場合、「ホルミルグリシン生成酵素」（または「ＦＧＥ」）は、スルファターゼモチーフ（または「ＦＧＥ認識部位」）中のシステインまたはセリンを２−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基（本明細書においてホルミルグリシン残基とも呼ぶ）に酸化する酵素である。したがって、「ＦＧＥ」は本明細書において、ＦＧＥ認識部位のシステイン（「Ｃｙｓ」もしくは「Ｃ」）のＦＧｌｙへの変換を媒介するＦＧｌｙ生成酵素として作用することができるか、またはＦＧＥ認識部位のセリン（「Ｓｅｒ」もしくは「Ｓ」）のＦＧｌｙへの変換を媒介することのできる任意の酵素のことをいうために用いる。ＦＧＥ認識部位へのＦＧＥの作用との関連で用いる場合の「変換」は、ＦＧＥ認識部位中のシステインまたはセリン残基のホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基への生化学的修飾（例えばＣｙｓからＦＧｌｙ、またはＳｅｒからＦＧｌｙ）のことをいう。ＦＧＥによってＦＧｌｙを含有するように修飾されたＦＧＥ認識部位を本明細書では「変換ＦＧＥ認識部位」と呼ぶ場合もある。
一般に、文献ではＦＧＥ認識部位中のＣｙｓをＦＧｌｙに変換するＦＧｌｙ生成酵素をＦＧＥと呼び、ＦＧＥ認識部位中のＳｅｒをＦＧｌｙに変換する酵素をＡｔｓ−Ｂ様と呼ぶことに留意すべきである。しかし、本開示の解釈上、「ＦＧＥ」は、ＦＧＥ認識部位（すなわちＣｙｓ含有もしくはＳｅｒ含有）及び／またはＦＧＥ認識部位を含む標的タンパク質に応じて適切なＦＧＥが選択され得るという理解の下で、ＦＧＥ認識部位でＦＧｌｙ生成酵素活性を示す任意の酵素のことを総称していうために用いられる。
活性部位にＦＧｌｙを有するスルファターゼの遍在によって立証されるように、ＦＧＥは、真核細胞及び原核細胞の両方を含め、多様な細胞型に見出される。ＦＧＥには少なくとも２つの形態がある。真核性スルファターゼは一般にそのスルファターゼモチーフ中にシステインを含有し、「ＳＵＭＦ１型」ＦＧＥによって修飾されるが（例えば、Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２００３，１１３，（４），４４５−５６； Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２００３，１１３，（４），４３５−４４を参照）、このＦＧＥはＳＵＭＦ１遺伝子によってコードされ得る。原核性スルファターゼはそのスルファターゼモチーフ中にシステインまたはセリンのいずれかを含有することができ、それぞれ「ＳＵＭＦ１型」ＦＧＥまたは「ＡｔｓＢ型」ＦＧＥのいずれかによって修飾される（例えばＳｚａｍｅｉｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９，２７４，（２２），１５３７５−８１を参照）。原核性ＦＧＥの例としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）ＦＧＥ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＦＧＥが挙げられる。ＦＧＥは、脊椎動物及び棘皮動物を含む後口動物においても見られる（例えば、Ｐｅｐｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１３，４４５−４５６，Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１３，４３５−４４４；Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２３，５７６−５８１を参照）。
真核生物において、ＦＧＥ認識配列を含有するタンパク質に対するＦＧＥ活性は、小胞体（ＥＲ）においてタンパク質の翻訳中またはその後間もなく発生し得る（Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９７， ９４（２２）：１１９６３−８）。理論に縛られるものではないが、原核生物では、ＳＵＭＦ１型ＦＧＥはサイトゾル中で機能し、ＡｔｓＢ型ＦＧＥは細胞膜またはその近傍で機能すると考えられている。脊椎動物及び棘皮動物をはじめとする後口動物ではＳＵＭＦ２ ＦＧＥについても記載されている（例えば、Ｐｅｐｅ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｃｅｌｌ １１３，４４５−４５６，Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｃｅｌｌ １１３，４３５−４４４；Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２３，５７６−５８１を参照）。
本明細書に開示の方法及び組成物に用いるためのＦＧＥは、自然発生源から得ることができるか、または合成的に生成することができる。例えば、ＦＧＥを自然産生するか、またはＦＧＥをコードする組換え遺伝子を発現するように遺伝子改変されている生物源から適切なＦＧＥを得ることができる。本明細書に記載の方法が宿主細胞の使用を伴う場合、ＦＧＥは宿主細胞本来のものであってもよく、ＦＧＥを発現するように宿主細胞を遺伝子改変することもできる。したがって、本開示は、ＦＧＥを発現するように遺伝子改変された組換え宿主細胞も提供し、このＦＧＥは選択したＦＧＥ認識部位を有する標的タンパク質の変換に用いるのに適合するように選択され得る。いくつかの実施形態において、ヒトＦＧＥに適合するスルファターゼモチーフ（例えば、ＳＵＭＦ１型ＦＧＥを参照、例えば、Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １１３，４４５−５６ （２００３）； Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １１３，４３５−４４（２００３）を参照）を用い、ヒトＦＧＥを発現するヒト細胞において、またはヒトＦＧＥを発現するように遺伝子改変された宿主細胞、通常は哺乳類細胞において、ＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を発現することが望ましい場合がある。
ある実施形態において、ＦＧＥは真核性ＦＧＥ、例えば限定はしないが哺乳類ＦＧＥなどである。場合によっては、哺乳類ＦＧＥはヒトＦＧＥである。ある実施形態において、ＦＧＥは原核性ＦＧＥ、例えば限定はしないが細菌ＦＧＥなどである。場合によっては、細菌ＦＧＥはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）ＦＧＥまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）ＦＧＥである。
ＦＧＥ、及び複数のＦＧＥをコードする核酸は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｐｒｅｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２８０（１５）：１４９００−１０ （Ｅｐｕｂ ２００５ Ｊａｎ １８）（ヒトＦＧＥ及びそれをコードする核酸について記載）；Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（１５）：１４５７０−８（Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊａｎ ２８）（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａの細菌ホルミルグリシン生成スルファターゼ修飾酵素ＡｔｓＢ及びそれをコードする核酸について記載）；Ｌａｎｄｇｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ２００３ Ｏｃｔ １６；３１６：４７−５６（ヒトＦＧＥをコードする遺伝子（ＳＵＭＦ１）の同定及びＦＧＥをコードする原核性遺伝子に対するその保存性について記載）；Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ． １９９８ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２３（１）：６１−５；Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． ２００３ Ｍａｙ １６；１１３（４）：４３５−４４（ヒトＦＧＥをコードする遺伝子及びこの遺伝子中のマルチプルスルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）の原因となる変異について記載）；Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３ Ｍａｙ １６） Ｃｅｌｌ １１３（４）：４４５−５６（ヒトＦＧＥをコードする遺伝子及びこの遺伝子中のマルチプルスルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）の原因となる変異について記載）；Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ （２００３ Ｍａｙ １６） Ｃｅｌｌ １１３（４）：４２１−２（総説）；Ｄｉｅｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００５ Ｍａｙ ２０；１２１（４）：５４１−５２；Ｒｏｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６ Ｊａｎ ３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（１）：８１−６；ＷＯ ２００４／０７２２７５（ヒトＦＧＥをコードする核酸及びそのバリアントについて記載）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１８２７６０（ヒトＦＧＥの一塩基バリアント）；ならびにＣａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００８ ２８３：２０１１７−２０１２５（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）ＦＧＥ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）ＦＧＥをコードする核酸について記載）を参照。
ある実施形態において、ＦＧＥは全長ＦＧＥである。「全長」は、ＦＧＥが、対応する野生型ＦＧＥの任意の野生型アイソフォーム（例えば選択的スプライシングの結果としての）を含めた野生型ＦＧＥの完全な成熟アミノ酸配列を有することを意味する。全長ＦＧＥの一例として、ＦＧＥは全長ヒトＦＧＥ、例えばアミノ酸配列ＭＡＡＰＡＬＧＬＶＣＧＲＣＰＥＬＧＬＶＬＬＬＬＬＬＳＬＬＣＧＡＡＧＳＱＥＡＧＴＧＡＧＡＧＳＬＡＧＳＣＧＣＧＴＰＱＲＰＧＡＨＧＳＳＡＡＡＨＲＹＳＲＥＡＮＡＰＧＰＶＰＧＥＲＱＬＡＨＳＫＭＶＰＩＰＡＧＶＦＴＭＧＴＤＤＰＱＩＫＱＤＧＥＡＰＡＲＲＶＴＩＤＡＦＹＭＤＡＹＥＶＳＮＴＥＦＥＫＦＶＮＳＴＧＹＬＴＥＡＥＫＦＧＤＳＦＶＦＥＧＭＬＳＥＱＶＫＴＮＩＱＱＡＶＡＡＡＰＷＷＬＰＶＫＧＡＮＷＲＨＰＥＧＰＤＳＴＩＬＨＲＰＤＨＰＶＬＨＶＳＷＮＤＡＶＡＹＣＴＷＡＧＫＲＬＰＴＥＡＥＷＥＹＳＣＲＧＧＬＨＮＲＬＦＰＷＧＮＫＬＱＰＫＧＱＨＹＡＮＩＷＱＧＥＦＰＶＴＮＴＧＥＤＧＦＱＧＴＡＰＶＤＡＦＰＰＮＧＹＧＬＹＮＩＶＧＮＡＷＥＷＴＳＤＷＷＴＶＨＨＳＶＥＥＴＬＮＰＫＧＰＰＳＧＫＤＲＶＫＫＧＧＳＹＭＣＨＲＳＹＣＹＲＹＲＣＡＡＲＳＱＮＴＰＤＳＳＡＳＮＬＧＦＲＣＡＡＤＲＬＰＴＭＤ（配列番号１；下表４に示す）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはこれより高い（例えば１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む全長ヒトＦＧＥなどであり得る。
他の実施形態において、ＦＧＥはホルミルグリシン生成活性を保持するＮ末端切断型ＦＧＥである。「Ｎ末端切断型」は、ＦＧＥが含むＮ末端に存在するアミノ酸の数が、対応する野生型ＦＧＥの任意の野生型アイソフォーム（例えば選択的スプライシングの結果としての）を含めた対応する野生型ＦＧＥのＮ末端に存在するアミノ酸の数未満であることを意味する。Ｎ末端切断型ＦＧＥがホルミルグリシン生成活性を保持するかどうかは、ホルミルグリシン生成活性を有するＦＧＥがＦＧＥ認識部位のシステイン（またはセリン）残基をホルミルグリシン残基に変換する条件の下、ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質と切断型ＦＧＥをインビトロで組み合わせること、及びＦＧＥ認識部位のシステイン（またはセリン）残基がホルミルグリシン残基に変換されたかどうか判定することを含む任意の簡便なアプローチを用いて判定され得る。例示的なインビトロ反応条件及びホルミルグリシン残基への変換の検出方法は本明細書の他の箇所に記載する。
ある態様では、Ｎ末端切断型ＦＧＥ（例えばＮ末端で切断されたヒトＦＧＥ）は１〜７２アミノ酸のＮ末端切断を有し、おそらく対応する全長ＦＧＥに対してＮ末端の１〜５アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜１５アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１〜２５アミノ酸、１〜３０アミノ酸、１〜３５アミノ酸、１〜４０アミノ酸、１〜４５アミノ酸、１〜５０アミノ酸、１〜５５アミノ酸、１〜６０アミノ酸、または１〜７０アミノ酸を欠く。
ある態様では、切断型ＦＧＥはＮ末端で切断されたヒトＦＧＥであり、Ｎ末端切断型ヒトＦＧＥは３００〜３７３アミノ酸長（例えば３０２〜３７３アミノ酸長）、例えば３０２〜３７０、３０２〜３６０、３０２〜３５０、３０２〜３４０、３０２〜３３０、３０２〜３２０、または３０２〜３１０アミノ酸長などである。
ある実施形態において、Ｎ末端切断型ＦＧＥは自然発生ＦＧＥプロテアーゼ切断産物と長さが一致する。例えば、Ｎ末端切断型ＦＧＥはヒトＦＧＥのフーリン切断産物と長さが一致し得る。フーリン酵素はヒトＦＧＥの７２位のアルギニンと７３位のグルタミン酸との間を切断し、フーリン酵素によって切断されていないヒトＦＧＥに対して７２アミノ酸のＮ末端切断を有する切断産物を生じる。一実施形態において、表４（配列番号１）に示すように、Ｎ末端切断型ヒトＦＧＥは、全長ヒトＦＧＥに対して７２アミノ酸のＮ末端切断を生じるヒトＦＧＥのフーリン切断産物と一致する。
表４：例示的な全長ヒトＦＧＥ（非下線部及び下線部のアミノ酸）ならびに例示的な切断型ヒトＦＧＥ（下線部のみ）
Figure 2018512043
全長ＦＧＥまたは切断型ＦＧＥをコードする核酸、及びそれを含む発現ベクターは、組換えＤＮＡベースのアプローチを含んだ任意の好適なアプローチを用いて調製され得る。例として、切断型ＦＧＥをコードする核酸は、全長ＦＧＥをコードする核酸の制限消化、または全長ＦＧＥをコードする核酸をテンプレートとして用いた切断型ＦＧＥをコードする領域のＰＣＲ増幅によって調製され得る。そのような制限消化または増幅産物は、目的の宿主細胞における全長または切断型ＦＧＥの発現に適した発現ベクター中にクローニングされ得る。次に、目的の宿主細胞は、その後の宿主細胞でのＦＧＥの産生のために、発現ベクターで形質転換／形質移入され得る。全長及び切断型ＦＧＥの産生に有用となる発現ベクター及び宿主細胞については後述する。
ＦＧＥ（例えば全長ＦＧＥまたはＮ末端切断型ＦＧＥ）は、ＦＧＥがＦＧＥに異種であるアミノ酸配列（例えば、精製タグ、プロテアーゼ認識配列、分泌シグナル配列、小胞体（ＥＲ）誘導シグナル配列、ＥＲ保持配列（例えばＫＤＥＬ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ））、及び／または同様のもの）に融合している融合タンパク質として得ることができる。本明細書に開示のＦＧＥ（例えば全長ＦＧＥ、Ｎ末端切断型ＦＧＥ及び／またはこれらの融合タンパク質）は、活性化ＦＧＥを得るための本明細書に開示の方法に用いられ得る。
ＦＧＥ認識部位
タンパク質のＦＧＥ認識部位（本明細書では「スルファターゼモチーフ」とも呼ぶ）は様々であり得る。最小認識部位は通常５または６アミノ酸残基長、通常６アミノ酸残基長以下である。タンパク質中に与えられる認識部位全体は少なくとも５または６アミノ酸残基であり、例えば、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７または６アミノ酸残基長未満のＦＧＥ認識部位を定めるように、５〜１６、６〜１６、５〜１５、６〜１５、５〜１４、６〜１４、５〜１３、６〜１３、５〜１２、６〜１２、５〜１１、６〜１１、５〜１０、６〜１０、５〜９、６〜９、５〜８、または６〜８アミノ酸残基長とすることができる。ある実施形態において、タンパク質のＦＧＥ認識部位を次の式で記述する。
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３Ｚ３ （Ｉ）
式中、
Ｚ１はシステインまたはセリンである（（Ｃ／Ｓ）と表すこともできる）；
Ｚ２はプロリンまたはアラニン残基のいずれかである（（Ｐ／Ａ）と表すこともできる）；
Ｚ３は塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）であり、リシン（Ｋ）もしくはヒスチジン（Ｈ）であってもよく、通常はリシンである）、または脂肪族アミノ酸（アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、もしくはプロリン（Ｐ）、通常はＡ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、もしくはＩ）である；
Ｘ１は存在または不在であり、存在する場合、任意のアミノ酸とすることができるが、一般に脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸、または極性無電荷アミノ酸（すなわち芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）、一般にＬ、Ｍ、Ｖ、ＳまたはＴ、より一般にはＬ、Ｍ、ＳまたはＶである。ただし、ＦＧＥ認識部位が標的ポリペプチドのＮ末端にある場合、Ｘ１は存在する；及び
Ｘ２及びＸ３は独立して任意のアミノ酸とすることができるが、一般に脂肪族アミノ酸、極性無電荷アミノ酸、または硫黄含有アミノ酸（すなわち芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外）、例えばＳ、Ｔ、Ａ、Ｖ、ＧまたはＣ；例えばＳ、Ｔ、Ａ、ＶまたはＧである。一例において、タンパク質のＦＧＥ認識部位は式Ｌ（Ｃ／Ｓ）ＴＰＳＲ（配列番号３）、例えばＬＣＴＰＳＲ（配列番号４）またはＬＳＴＰＳＲ（配列番号５）のものである。
ＦＧＥ認識部位の例は、例えば米国特許第７，９８５，７８３号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１１７６２１号に記載されており、あらゆる目的のためにその開示全体を参照により本明細書に援用する。
ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質
ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質は目的の任意のタンパク質であってよく、目的の作用物質、例えば治療薬、造影剤などを結合させるのに望ましいタンパク質を含む。目的のタンパク質としては、自然発生アミノ酸配列を有するもの、Ｎ末端メチオニンを有する天然アミノ酸配列、自然発生タンパク質の断片、ならびに非自然発生タンパク質及びその断片が挙げられる。いくつかの実施形態において、タンパク質はスルファターゼもしくはその断片以外、レポータータンパク質以外、またはプレプロラクチンもしくはプロラクチン以外のタンパク質である。
ＦＧＥ認識配列を含むタンパク質はＦＧＥと同じまたは異なる起源のものとすることができる。本開示の方法が細胞ベースの方法を伴う場合、ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質は宿主細胞にとって内因性であってよく（例えばスルファターゼ）、及び／または宿主細胞はＦＧＥ認識配列を含むタンパク質を発現するように遺伝子改変されていてよい。この実施形態では、ＦＧＥは宿主細胞にとって内因性であってよく、及び／またはＦＧＥを発現するように宿主細胞が遺伝子改変されていてよい。
ある態様では、タンパク質は治療的または他の臨床的有益性をもたらし得るタンパク質であり、ある部分への結合が、例えば、タンパク質が標的細胞（例えば癌細胞）に結合した際の細胞傷害性の増加、タンパク質が結合する細胞の画像化（例えばインビボ画像化）、血清半減期の増加、有害な免疫応答の減少、追加のもしくは代替的な生物活性もしくは機能性、または他の恩恵もしくは有害な副作用の低減の１つ以上をもたらすことができるタンパク質を含む。治療用タンパク質がワクチン用の抗原である場合、修飾によってタンパク質の免疫原性を強化することができる。
タンパク質は治療用タンパク質などの分類のタンパク質のメンバーであり得るが、これにはサイトカイン、ケモカイン、リガンド、成長因子、ホルモン、成長ホルモン、酵素（例えばスルファターゼ、例えばヒトスルファターゼまたはその機能的断片）、抗体及び抗体断片（抗原結合性抗体断片を含む）、ならびに抗原が挙げられるがこれらに限定されない。さらなる例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ、例えば天然ＥＰＯ、合成ＥＰＯ（例えば、ＵＳ ２００３／０１９１２９１を参照））、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−ω、コンセンサスインターフェロンなど）、インスリン、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、血液因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）など）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）など）、形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２など）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、例えばａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、グリア細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＲＡＮＴＥＳなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、タンパク質は目的の部分、例えば薬物及び／または造影剤などの結合のためのスキャホールドを提供し得る。そのようなタンパク質の例としては、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン）、Ｆｃポリペプチド（例えばＩｇＧ Ｆｃ断片（例えばＩｇＧ１ Ｆｃ断片、ＩｇＧ２ Ｆｃ断片、ＩｇＧ３ Ｆｃ断片、またはＩｇＧ４ Ｆｃ断片））などが挙げられるが、これらに限定されない。ここでタンパク質がＦｃポリペプチドである場合、Ｆｃポリペプチドは哺乳類Ｆｃポリペプチド（例えばヒトＦｃポリペプチド）であり得る。
ある実施形態において、タンパク質は抗体または抗体断片である。用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、任意のアイソタイプの抗体もしくは免疫グロブリン、全抗体（例えば、全ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体をはじめとする、四量体で構成されており、この四量体がさらに重鎖及び軽鎖ポリペプチドのヘテロ二量体２つで構成される抗体）；半抗体（例えば重鎖及び軽鎖ポリペプチドの二量体を１つのみ含む抗体）；限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及びダイアボディを含む、目的の抗原への特異的結合を保持する抗体断片（例えば全抗体の断片、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体の断片など）；キメラ抗体；モノクローナル抗体；ヒト化抗体（例えばヒト化モノクローナル抗体、もしくはヒト化抗体断片）；または完全ヒト抗体（ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体）を含む。体細胞変異及び／またはＶ−Ｄ−Ｊ再構成の結果としてのＮもしくはＰヌクレオチド付加及び欠失を有するヒトモノクローナル抗体も含まれる。合成配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）に挿入されているヒト抗体（例えば、Ｍｉｅｒｓｃｈ Ｓ＆Ｓｉｄｈｕ ＳＳ（２０１２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５７（４）：４８６−９８；及びＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｆｕｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ （ＨｕＣＡＬ）ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ ａｎｄ ＣＤＲｓ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６（１）：５７−８６を参照）も含まれる。ある態様では、本開示の抗体は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦａｂ’から選択される。
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合性断片、及び残りの名称が容易に結晶化できることを表している「Ｆｃ」断片が生じる。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小抗体断片を含む。この領域は、密接に非共有結合性会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定めるのは、この構造中である。合計で６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
「Ｆａｂ」断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数残基の追加分だけＦａｂ’断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２は元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能とする。
用語「ダイアボディ」は２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片のことをいい、この断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインは別の鎖の相補ドメインと対合せざるを得なくなり、２つの抗原結合部位を形成する。
用語「組換え」抗体は本明細書で用いる場合、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたすべての抗体、例えば（ｉ）宿主細胞に形質移入した組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体；（ｉｉ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体；（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入した動物（例えばマウス）から単離された抗体；または（ｉｖ）例えばインビトロ翻訳技術（例えば、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ａ ｓｃａｌａｂｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ４， Ｉｓｓｕｅ ２を参照）を含めた、他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離された抗体などを含むことを意図する。そのような組換え抗体には、ヒト化、ＣＤＲ移植、キメラ、脱免疫化、及びインビトロ生成抗体が含まれ、任意によりヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含むことができる。
「ヒト化抗体」は、ヒト及び非ヒト免疫グロブリンの両方に由来する配列を含有する免疫グロブリン、半抗体、免疫グロブリン鎖（例えば軽鎖ポリペプチド）またはこれらの断片（例えばＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列など）を意味する。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が所望の特異性、親和性及び容量を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ラマ、ラクダまたはウサギなどのＣＤＲの残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり得る。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体はレシピエント抗体にも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。
ヒト軽鎖ポリペプチドは一般にκ及びλ軽鎖に分類される。さらに、ヒト重鎖ポリペプチドは一般にμ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥに定まる。軽鎖及び重鎖内において、可変及び定常領域は約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域も含む。
ある態様では、ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質はＩｇＧまたはその断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、二重特異性抗体またはその断片、ダイアボディまたはその断片、キメラ抗体またはその断片、モノクローナル抗体またはその断片、ヒト化抗体またはその断片、及び完全ヒト抗体またはその断片である。
抗体が特異的に結合する目的の抗原としては、腫瘍特異抗原、例えば悪性細胞の表面上に存在し、非悪性細胞上には存在しない抗原が挙げられる。他の態様では、抗体によって結合される抗原は腫瘍関連抗原である。「腫瘍関連抗原」は、悪性細胞上で発現されるが正常組織の細胞上では発現が限定的である抗原、正常細胞に対して悪性細胞ではるかに高い密度で発現される抗原、または発生的に発現される抗原を意味する。
任意の腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原が本開示の抗体の標的とされ得る。ある態様では、本開示の方法が癌の治療用である場合、本開示の抗体または結合体の抗体コンポーネントによって特異的に結合される抗原としては、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ６６／ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８、ネクチン―４、メソテリン、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ６、ＣＡ−ＩＸ、または任意の他の目的の腫瘍関連抗原もしくは腫瘍特異抗原が挙げられ得るが、これらに限定されない。
抗体の特徴との関連における「特異的結合」または「特異的に結合する」は、異なる抗原の均一混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する抗体の能力のことをいう。ある実施形態において、特異的結合相互作用は、サンプルまたは生物（例えばヒト）中の望ましい抗原及び望ましくない抗原（または「標的」抗原及び「非標的」抗原）を区別し、いくつかの実施形態において、約１０〜１００倍超またはこれより高い（例えば約１０００または１０，０００倍超）。ある実施形態において、抗体と抗原との間の親和性は、抗体−抗原複合体中で特異的に結合している場合、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、もしくは約１０−１２Ｍ未満またはこれより小さいＫＤ（解離定数）によって特徴づけられる。
活性化ＦＧＥの生成方法
本開示は、活性化ＦＧＥの生成方法を提供する。本明細書で用いる場合、「活性化ホルミルグリシン生成酵素」または「活性化ＦＧＥ」は、ＦＧＥを発現する細胞への酸化試薬の添加によって、及び／または単離したＦＧＥへの酸化試薬の添加によって、酸化試薬で処理されたＦＧＥのことをいう。したがって、ある態様において、本開示は、ＦＧＥを酸化試薬で処理して活性化ＦＧＥを生成することを含む活性化ＦＧＥの生成方法を提供する。「酸化試薬」はＦＧＥを酸化可能な試薬（「酸化剤と呼ばれることもある」）、ＦＧＥの酸化を触媒可能な試薬、またはこれらの組合せを意味する。ＦＧＥの酸化を触媒可能な試薬の一例はＣｕ２＋である。ＦＧＥを酸化可能な試薬及びＦＧＥの酸化を触媒する試薬を含む酸化試薬の一例は、最終酸化剤としての元素状酸素及び遷移金属、例えば、限定はしないがＣｕ２＋などを含む試薬である。これらの及び他の好適な酸化試薬を以下に記載する。
活性化ＦＧＥは、宿主細胞内でＦＧＥを発現させて活性化させるインビボタンパク質合成方法の一部として生成され得、この方法は任意によりＦＧＥ認識部位を含有する目的のタンパク質の宿主細胞内での共発現を含み得る。すなわち、ＦＧＥが宿主細胞内に存在する場合があり、宿主細胞を培養している細胞培養培地中に酸化試薬（例えばＣｕ２＋）を供給することによって、ＦＧＥを処理して活性化ＦＧＥを生成する。例えば、本発明者らは、酸化試薬、例えばＣｕ２＋などによるＦＧＥ発現細胞の処理（細胞培養培地中にＣｕ２＋を供給することによる）がＦＧＥ活性化をもたらし、その結果、処理した細胞内で共発現した標的タンパク質のＦＧＥ認識部位中のシステイン残基が、Ｃｕ２＋では処理していないがそれ以外は同一条件下の細胞における変換に比べて高い収率でホルミルグリシン残基に変換されることを発見した（下記の実施例の節を参照）。例えば、本明細書に記載の酸化試薬によるＦＧＥ発現細胞の処理は、ＦＧＥ発現細胞によって生成される活性化ＦＧＥの総数の増加をもたらし得る。同様に、本明細書に記載の酸化試薬によるＦＧＥ発現細胞の処理は、ＦＧＥ発現細胞によって生成される活性化ＦＧＥではないＦＧＥの総数の減少をもたらし得る。
したがって、ある実施形態において、酸化試薬はＣｕ２＋であり、ＦＧＥの処理は、Ｃｕ２＋を含む細胞培養培地中でＦＧＥをコードする核酸を含む細胞を培養することを含み、培養はＦＧＥが細胞内で発現される条件の下で行う。ある態様では、本開示は、Ｃｕ２＋を含む細胞培養培地中でＦＧＥをコードする核酸を含む細胞を培養することを含み、培養をＦＧＥが細胞内で発現される条件の下で行う方法を提供する。
Ｃｕ２＋源（例えば銅塩または他の好適なＣｕ２＋源）及び細胞培養培地中のＣｕ２＋濃度は、例えば細胞生存率、タンパク質発現レベルなどに影響を及ぼすことなく、または実質的に影響を及ぼすことなく、細胞培養に適合するように選択され得る。例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、Ｃｕ２＋源及び濃度は原核細胞培養に適合するように選択され得る。同様に、宿主細胞が例えば哺乳類細胞である場合、Ｃｕ２＋源及び濃度は哺乳類細胞培養に適合するように選択され得る。原核細胞及び哺乳類細胞でのインビボＦＧＥ活性化に適した培養条件の例は、下記の実施例の節で提供する。
ある態様では、細胞培養培地への銅塩の添加によってＣｕ２＋を供給する。好適な銅塩としては、硫酸銅（すなわち硫酸銅（ＩＩ）、ＣｕＳＯ４）、クエン酸銅、酒石酸銅、硝酸銅、及びこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｃｕ２＋はＦＧＥ活性化に適した濃度で細胞培養培地中に存在する。ある態様では、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１ｎＭ〜１００ｍＭ、例えば０．１μＭ〜１０ｍＭ、０．５μＭ〜５ｍＭ、１μＭ〜１ｍＭ、２μＭ〜５００μＭ、３μＭ〜２５０μＭ、４μＭ〜１５０μＭ、または５μＭ〜１００μＭ（例えば５μＭ〜５０μＭ）などの濃度で存在する。
ある実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、１μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、２００μＭ以上、３００μＭ以上、４００μＭ以上、５００μＭ以上、１ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上の濃度で存在する。ある態様では、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、５００μＭ以下、４００μＭ以下、３００μＭ以下、２００μＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の濃度で存在する。
インビボＦＧＥ活性化に適した宿主細胞としては、例えば、原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞）及び真核細胞（例えば酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞など）が挙げられる。細胞は目的のＦＧＥを発現するように遺伝子改変され得る、及び／またはＦＧＥは細胞にとって内因性であり得る。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは活性化ＦＧＥの生成方法を実施するのに用いられ得る原核宿主細胞の例である。使用に適した他の微生物宿主としては、桿菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなど、及び他の腸内細菌科、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａなど、ならびに様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が挙げられる。これらの原核宿主では、一般に宿主細胞に適合する発現制御配列（例えば複製開始点）を含有する発現ベクターを作製することができる。さらに、任意の数の様々な公知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系などが存在することになるである。プロモーターは一般に、転写及び翻訳を開始及び終了させるために、任意によりオペレーター配列とともに発現を制御し、リボソーム結合部位配列などを有する。
他の微生物、例えば酵母なども活性化ＦＧＥの生成方法の実施に有用である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＰｉｃｈｉａが好適な酵母宿主細胞の例であり、好適なベクターは所望により発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列などを有する。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素を含む。誘導性酵母プロモーターはとりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、ならびにマルトース及びガラクトースの利用を担う酵素に由来するプロモーターを含む。
微生物に加えて、哺乳類細胞が活性化ＦＧＥの生成方法を実施するのに用いられ得る。哺乳類細胞はげっ歯類細胞、ヒト細胞、または任意の他の目的の哺乳類細胞であってよく、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞から選択される細胞が挙げられるがこれらに限定されない。これらの細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））など、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などを含むことができる。好適な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９ （１９９２）を参照。
宿主細胞でＦＧＥを発現させるのに適した培養条件は、例えば米国特許第７，９８５，７８３号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１１７６２１号に記載されており、あらゆる目的のためにその開示全体を参照により本明細書に援用する。ＦＧＥは宿主細胞にとって内因性であってもよく、または宿主細胞が、宿主細胞にとって異種である好適なＦＧＥのための組換え型であってもよい。ＦＧＥ発現は、ＦＧＥ遺伝子にとって内因性の発現系によってもたらすことができるか（例えば、宿主細胞の天然ＦＧＥ遺伝子に存在するプロモーター及び他の制御要素によって発現がもたらされる）、またはＦＧＥコード配列が異種プロモーターに作用可能に連結しており、恒常的発現または誘導発現をもたらす組換え発現系からもたらすことができる。高レベルのＦＧＥ発現をもたらす強力なプロモーターの使用が、ある実施形態において特に対象とされ得る。細胞培養培地の種類及びその中の成分はＦＧＥが発現される特定の細胞型に適合するように選択され得る。
この方法は細胞及び／または酸化試薬から活性化ＦＧＥを精製することをさらに含み得る。任意の都合の良いタンパク質精製法が活性化ＦＧＥを単離するために用いられ得る。例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂｕｒｇｅｓｓ＆Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｄ．）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００９）（ＩＳＢＮ： ９７８０１２３７４５３６１）を参照。例えば、活性化ＦＧＥを産生する細胞からライセートが調製され、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどを用いて精製され得る。
活性化ＦＧＥはインビトロ無細胞タンパク質合成方法の一部として生成してもよく、この方法は反応混合物中でのＦＧＥ認識配列を含有する標的ポリペプチドの共発現を任意により含み得る。したがって、ある態様において、本開示の方法は、酸化試薬を含む無細胞反応混合物中でＦＧＥを発現することを含み、酸化試薬はＣｕ２＋とすることができる。こうした態様において、無細胞反応混合物は、ＦＧＥが細胞内ではなく、インビトロタンパク質合成に適した反応混合物中で発現されるものである。例示的な無細胞反応混合物としては、ＦＧＥ及び任意の他の望ましいタンパク質（例えば本明細書の他の箇所に記載するＦＧＥ認識部位を有するタンパク質）の合成用の核酸テンプレート（複数可）を伴う無細胞抽出物、細胞ライセート、及び再構成翻訳系が挙げられるが、これらに限定されない。
無細胞反応混合物は、巨大分子を合成するためのモノマー、例えばアミノ酸、ヌクレオチドなど、ならびにそのような補助因子、酵素及び任意の他の必要な試薬、例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子などを含み得る。無細胞抽出物、核酸テンプレート、及びアミノ酸などの上記の成分に加えて、タンパク質合成に特に必要とされる材料が反応に加えられ得る。この材料としては、塩、フォリン酸、環状ＡＭＰ、タンパク質または核酸分解酵素に対するインヒビター、タンパク質合成のインヒビターまたはレギュレーター、酸化／還元電位の調節剤、非変性界面活性剤、バッファー成分、スペルミン、スペルミジン、プトレシンなどが挙げられ得る。様々な無細胞合成反応系が、例えばＫｉｍ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．６６：１８０−８（１９９９）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：３８５−９０ （２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４：３０９−１６ （２００１）；Ｓｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．２６７：１６９−８２（２００４）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５：１２２−２９（２００４）；Ｊｅｗｅｔｔ，Ｍ．Ｃ． ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ． ８６：１９−２６（２００４）；Ｙｉｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８６：１８８−９５（２００４）； Ｊｅｗｅｔｔ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：４６５−７２（２００４）；Ｖｏｌｏｓｈｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ． ９１：５１６−２１（２００５）に記載されている。目的のタンパク質の無細胞合成のためのさらなる条件が国際公開第ＷＯ２０１０／０８１１１０号に記載されており、その開示全体を参照により本明細書に援用する。
ある実施形態において、無細胞タンパク質合成は従来のインビボタンパク質発現方法に勝る一定の利点を提供する。無細胞系は、細胞の代謝資源のすべてではないがほとんどを１つのタンパク質の排他的な生成に誘導することができる。その上、インビトロでの細胞壁及び細胞膜コンポーネントの欠如は、合成環境の制御を可能とするので有利となり得る。例えば、発現されている遺伝子のコドン使用頻度を反映するようにｔＲＮＡレベルを変化させることができる。細胞成長または生存力の懸念が存在しないので、酸化試薬の種類もしくは濃度、酸化還元電位、ｐＨ、またはイオン強度も、インビボタンパク質合成よりも高い柔軟性で変化させることができる。さらに、精製された適切にフォールディングしたタンパク質産物の直接回収を容易に達成することができる。
活性化ＦＧＥはインビトロ活性化方法の一部としても生成され得る。そのような実施形態において、ＦＧＥは酸化試薬の存在下で発現されない。そのような方法は、ＦＧＥを発現させ（例えば細胞内または無細胞翻訳系で）、ＦＧＥを精製し、その後、インビトロでＦＧＥを酸化試薬により処理した結果、ＦＧＥが活性化されるという本発明者らの発見に基づく。そのようなインビトロ活性化ＦＧＥは、非活性化ＦＧＥによるそれ以外は同一の条件下での変換に比べて高い効率で、標的タンパク質のＦＧＥ認識部位中のシステインまたはセリン残基を変換する（下記の実施例の節を参照）。
ＦＧＥの活性化に用いられる酸化試薬は、所望の反応条件に適合する任意の都合の良い酸化試薬から選択され得る。例えば、酸化試薬は元素状酸素、例えば最終酸化剤としての元素状酸素などであり得る。場合によっては、最終酸化剤としての元素状酸素は酸素、酸素及び硫化水素の混合物、塩基性条件下の酸素などとして供給され得る。
ある実施形態において、酸化試薬は元素状酸素、例えば最終酸化剤としての元素状酸素などであり、反応は遷移金属によって触媒される。こうした場合において、酸化試薬は、限定はしないが、酸素活性化を触媒することができる銅（ＩＩ）（すなわち、Ｃｕ２＋）または銅（ＩＩ）源（例えば、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、クエン酸銅、酒石酸銅、硝酸銅、フェーリング試薬、ベネディクト試薬など）を含み得る。場合によっては、酸素活性化を触媒することができる酸化試薬（例えばＣｕ２＋）は酸素の存在下で供給される。例えば、酸化試薬は酸素及びＣｕ２＋、Ｃｕ２＋源、またはこれらの組合せを含み得る。
ある実施形態において、酸化試薬は銅（ＩＩ）（すなわちＣｕ２＋）または銅（ＩＩ）源（すなわちＣｕ２＋源）である。場合によっては、銅（ＩＩ）または銅（ＩＩ）源は酸素の存在下で供給される。場合によっては、酸化試薬は銅（ＩＩ）、例えば銅（ＩＩ）及び酸素などである。場合によっては、酸化試薬は銅（ＩＩ）源、例えば銅（ＩＩ）源及び酸素などである。ある場合において、銅（ＩＩ）源は硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、ベネディクト試薬、これらの組合せなどであるがこれらに限定されない。場合によっては、銅（ＩＩ）源は硫酸銅（ＣｕＳＯ４）である。
タンパク質のインビトロ酸化のための反応条件は用いられる具体的な酸化試薬に応じて変化し得る。例示的な酸化試薬を用いたＦＧＥのインビトロ活性化のための例示的な反応条件は、下記の実施例の節で提供する。
ＦＧＥの活性化は、ＦＧＥ活性化反応混合物中でＦＧＥ及び酸化試薬を一緒にすることを含み得る。場合によっては、ＦＧＥ活性化反応混合物は水溶液である。ある場合において、ＦＧＥ活性化反応混合物は緩衝水溶液、例えば、限定はしないがトリエタノールアミンなどのバッファーを含む水溶液である。ある場合において、緩衝水溶液はＦＧＥに適合するｐＨ範囲、例えば５〜１０、または５〜９、または６〜８のｐＨ範囲など、例えば約７のｐＨ、例えば７．４のｐＨなどを有する。
ある実施形態において、ＦＧＥの活性化はＦＧＥ活性化反応混合物中でＦＧＥ及び酸化試薬を一緒にすることを含み得るが、ＦＧＥがＦＧＥ活性化反応混合物中に存在し、次に酸化試薬をＦＧＥ活性化反応混合物に加える。他の実施形態において、ＦＧＥの活性化はＦＧＥ活性化反応混合物中でＦＧＥ及び酸化試薬を一緒にすることを含み得るが、酸化試薬がＦＧＥ活性化反応混合物中に存在し、次にＦＧＥをＦＧＥ活性化反応混合物に加える。
ある実施形態において、ＦＧＥ活性化反応混合物中のＦＧＥ対酸化試薬のモル比は５：１、または４：１、または３：１、または２：１、または１：１、または１：２、または１：３、または１：４、または１：５である。場合によっては、ＦＧＥ活性化反応混合物中のＦＧＥ対酸化試薬のモル比は１：２である。
ある場合において、ＦＧＥ活性化反応混合物中でＦＧＥ及び酸化試薬を一緒した後、ＦＧＥ活性化反応混合物を混合する。ＦＧＥ活性化反応混合物を混合するための任意の都合の良い方法、例えば撹拌、ボルテックスなどが用いられ得る。ＦＧＥ活性化反応混合物は、活性化ＦＧＥへのＦＧＥの十分な活性化を可能とする時間、例えば１５分以上、または３０分以上または４５分以上、または１時間以上、または２時間以上、または３時間以上、または４時間以上、または５時間以上などにわたって混合され得る。場合によっては、ＦＧＥ活性化反応混合物を１時間混合する。ＦＧＥ活性化反応混合物の混合は約室温、例えば２０℃〜３０℃の範囲の温度、例えば２５℃などで実施され得る。活性化に適した温度は用いられる特定の酸化試薬に応じて変化し得る。
活性化ＦＧＥへのＦＧＥの十分な活性化は本明細書に記載するＦＧＥ活性アッセイを用いて測定され得る。活性化ＦＧＥへのＦＧＥの十分な活性化の後、活性化ＦＧＥはＦＧＥ活性化反応混合物から分離され得る。タンパク質分離のための任意の都合の良い方法が、ＦＧＥ活性化反応混合物から活性化ＦＧＥを分離するために用いられ得るが、例えば限定はしないが透析、バッファー交換、透析濾過、沈降、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などである。場合によっては、活性化ＦＧＥはバッファー交換によってＦＧＥ活性化反応混合物から分離され得る。
活性化ＦＧＥを生成するための本明細書に記載の方法のいずれかによって生成される活性化ＦＧＥも本開示により提供する。ある実施形態において、活性化ＦＧＥは酸化試薬から精製されていない。例えば、ＦＧＥは、ＦＧＥが酸化試薬で処理された細胞または反応混合物中に存在し得る。他の態様では、好適なタンパク質分離法、例えば本明細書の他の箇所に記載の任意のそのような手法などを用いて、活性化ＦＧＥをＦＧＥ活性化反応混合物から分離する。
活性化ＦＧＥの使用方法
本開示の活性化ＦＧＥは、例えば、目的のタンパク質（または「標的タンパク質」）中のＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換することが望ましい様々なインビボ及びインビトロ用途において有用である。ホルミルグリシン残基のアルデヒド基は、例えば目的の作用物質（例えば治療薬、造影剤など）を標的タンパク質に部位特異的に結合させるのに有用である。したがって、本開示は活性化ＦＧＥの使用方法を提供する。
ある態様では、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法を提供する。この方法は、ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質と活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を、活性化ＦＧＥがＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する条件下で結合させて、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質を生成することを含む。
いくつかの実施形態において、還元剤を含む反応混合物中で活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を結合させる。いくつかの実施形態において、還元剤はＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基のホルミルグリシン残基への変換を促進する。いくつかの実施形態において、還元剤は２−メルカプトエタノールである。本明細書で用いる場合、ＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基のホルミルグリシン残基への変換を促進するとは、還元剤の不在下での変換反応と比較した、活性化ＦＧＥによって生成されるｆＧｌｙの量（例えば濃度）の増加のことをいう。ある場合において、還元剤は活性化ＦＧＥによって生成されるｆＧｌｙの量を、還元剤の不在下での変換反応と比較して５％以上、または１０％以上、または１５％以上、または２０％以上、または２５％以上、または３０％以上、または３５％以上、または４０％以上、または４５％以上、または５０％以上、または５５％以上、または６０％以上、または６５％以上、または７０％以上、または７５％以上、または８０％以上、または８５％以上、または９０％以上、または９５％以上、または１００％以上増加させる。ある実施形態において、還元剤は活性化ＦＧＥによって生成されるｆＧｌｙの量を、還元剤の不在下での変換反応と比較して５０％以上増加させる。
インビボ変換
ホルミルグリシン残基を含むタンパク質は、インビボタンパク質合成及び変換方法の一部として宿主細胞内で生成され得る。ある実施形態において、活性化ＦＧＥとＦＧＥ認識部位を含むタンパク質との組み合わせは、ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を含む細胞を培養することを含む。培養は、ＦＧＥがＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する細胞培養条件の下、酸化試薬としてＣｕ２＋を含む細胞培養培地中で行う。ある態様では、細胞はＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質をコードする核酸を含み、そのためＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質が細胞内で共発現される。
Ｃｕ２＋源（例えば銅塩または他の好適なＣｕ２＋源）及び細胞培養培地中のＣｕ２＋濃度は、例えば細胞生存率、タンパク質発現レベルなどに影響を及ぼすことなく、または実質的に影響を及ぼすことなく、細胞培養に適合するように選択され得る。例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、Ｃｕ２＋源及び濃度は原核細胞培養に適合するように選択され得る。同様に、宿主細胞が例えば哺乳類細胞である場合、Ｃｕ２＋源及び濃度は哺乳類細胞培養に適合するように選択され得る。原核細胞及び哺乳類細胞でのインビボＦＧＥ活性化に適した培養条件の例は、下記の実施例の節で提供する。
ある態様では、細胞培養培地への銅塩の添加によってＣｕ２＋を供給する。好適な銅塩としては、硫酸銅（すなわち硫酸銅（ＩＩ）、ＣｕＳＯ４）、クエン酸銅、酒石酸銅、硝酸銅、及びこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｃｕ２＋はＦＧＥ活性化に適した濃度で細胞培養培地中に存在する。ある態様では、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１ｎＭ〜１００ｍＭ、例えば０．１μＭ〜１０ｍＭ、０．５μＭ〜５ｍＭ、１μＭ〜１ｍＭ、２μＭ〜５００μＭ、３μＭ〜２５０μＭ、４μＭ〜１５０μＭ、または５μＭ〜１００μＭ（例えば５μＭ〜５０μＭ）などの濃度で存在する。
ある実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、１μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、２００μＭ以上、３００μＭ以上、４００μＭ以上、５００μＭ以上、１ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上の濃度で存在する。ある態様では、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、５００μＭ以下、４００μＭ以下、３００μＭ以下、２００μＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の濃度で存在する。
ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質の共発現に適した宿主細胞としては、例えば、原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞）及び真核細胞（例えば酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞など）が挙げられる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法を実施するのに用いられ得る原核宿主細胞の例である。使用に適した他の微生物宿主としては、桿菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなど、及び他の腸内細菌科、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａなど、ならびに様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が挙げられる。これらの原核宿主では、一般に宿主細胞に適合する発現制御配列（例えば複製開始点）を含有する発現ベクターを作製することができる。さらに、任意の数の様々な公知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系などが存在することになる。プロモーターは一般に、転写及び翻訳を開始及び終了させるために、任意によりオペレーター配列とともに発現を制御し、リボソーム結合部位配列などを有する。
他の微生物、例えば酵母なども、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法の実施に有用である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＰｉｃｈｉａが好適な酵母宿主細胞の例であり、好適なベクターは所望により発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列などを有する。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素を含む。誘導性酵母プロモーターはとりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、ならびにマルトース及びガラクトースの利用を担う酵素に由来するプロモーターを含む。
微生物に加えて、哺乳類細胞がホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法を実施するために用いられ得る。哺乳類細胞はげっ歯類細胞、ヒト細胞、または任意の他の目的の哺乳類細胞であってよく、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞から選択される細胞が挙げられるがこれらに限定されない。これらの細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））など、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などを含むことができる。好適な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照。
インビトロ転写方法との関連での無細胞変換
ホルミルグリシン残基を含むタンパク質は、インビトロ無細胞タンパク質合成及び変換方法の一部として生成され得る。ある態様において、この方法は、酸化試薬（例えばＣｕ２＋）を含む無細胞反応混合物中で、ＦＧＥがＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する条件の下、ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を発現させることを含む。こうした態様において、無細胞反応混合物は、ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質が細胞内ではなく、インビトロタンパク質合成に適した反応混合物中で発現されるものである。例示的な無細胞反応混合物としては、ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質の合成用の核酸テンプレートを伴う無細胞抽出物、細胞ライセート、及び再構成翻訳系が挙げられるが、これらに限定されない。無細胞反応混合物の成分は、活性化ＦＧＥを生成するためのインビトロ無細胞タンパク質合成方法に関して前述した通りであり得る。
活性化ＦＧＥを用いたインビトロ変換
ホルミルグリシン残基を含むタンパク質は、無細胞反応混合物中で活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を組み合わせるインビトロ変換方法の一部として生成され得る。こうした実施形態において、ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質は無細胞反応混合物中で発現されない。そのような方法は、ＦＧＥを発現させ（例えば細胞内または無細胞翻訳系で）、ＦＧＥを精製し、その後、インビトロでＦＧＥを酸化試薬により処理して活性化ＦＧＥを生成することに基づく。そのようなインビトロ活性化ＦＧＥは、非活性化ＦＧＥによるそれ以外は同一の条件下での変換に比べて高い効率で、ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質のＦＧＥ認識部位中のシステインまたはセリン残基を変換する（下記の実施例の節を参照）。
いくつかの実施形態において、反応混合物は、銅（ＩＩ）イオン（すなわちＣｕ２＋）、または銅（ＩＩ）イオン源、例えば硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、クエン酸銅、酒石酸銅などを含む。Ｃｕ２＋を含む無細胞反応混合物中でのＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質の発現は、本明細書に記載するように、ＦＧＥがＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基（ＦＧｌｙ）に変換する条件下で生じ得る。
ある実施形態において、ＦＧｌｙ残基を有するタンパク質のインビトロ生成方法は、無細胞反応混合物中で活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を組み合わせることを含む。これらの実施形態において、活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を組み合わせる前に、ＦＧＥが活性化されて活性化ＦＧＥが形成され得る。「活性化」は、活性化ＦＧＥが活性化されていないＦＧＥと比べてより高い活性を有する、例えばＦＧＥ認識部位のシステインまたはセリン残基をＦＧｌｙに変換する活性がより高いことを意味する。例えば、活性化ＦＧＥは、活性化されていないＦＧＥの１．５倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上の活性、例えば２００倍以上、３００倍以上、または４００倍以上、または５００倍以上、または６００倍以上、または７００倍以上、または８００倍以上、または９００倍以上、または１０００倍以上、または１５００倍以上、または２０００倍以上、または２５００倍以上、または３０００倍以上、または３５００倍以上、または４０００倍以上、または４５００倍以上、または５０００倍以上、または５５００倍以上、または６０００倍以上、または６５００倍以上、または７０００倍以上、または７５００倍以上、または８０００倍以上、または８５００倍以上、または９０００倍以上、または９５００倍以上、または１０，０００倍以上などの活性（本明細書に記載するＦＧＥ活性アッセイを用いて測定した場合）を有し得る。ある場合において、活性化ＦＧＥは活性化されていないＦＧＥの３０００倍の活性（本明細書に記載するＦＧＥ活性アッセイを用いて測定した場合）を有する。場合によっては、活性化ＦＧＥは、活性化されていないＦＧＥよりも１．５〜１０，０００倍高い、２〜１０，０００倍高い、５〜１０，０００倍高い、１０〜１０，０００倍高い、２０〜１０，０００倍高い、３０〜１０，０００倍高い、４０〜１０，０００倍高い、５０〜１０，０００倍高い、６０〜１０，０００倍高い、７０〜１０，０００倍高い、８０〜１０，０００倍高い、９０〜１０，０００倍高い、１００〜１０，０００倍高い活性、例えば５００〜９０００倍高い、１０００〜８０００倍高い、または１０００〜７０００倍高い、または１０００〜６０００倍高い、または１０００〜５０００倍高い、または１０００〜４０００倍、または２０００〜４０００倍高い活性など（本明細書に記載するＦＧＥ活性アッセイを用いて測定した場合）を有する。ある場合において、活性化ＦＧＥは活性化されていないＦＧＥの２０００〜４０００倍高い活性（本明細書に記載するＦＧＥ活性アッセイを用いて測定した場合）を有する。
ある実施形態において、活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を組み合わせる前に、ＦＧＥが活性化されて活性化ＦＧＥが形成され得る。そのため、場合によっては、この方法は、ＦＧＥ認識部位を有するタンパク質と活性化ＦＧＥを組み合わせる前に、酸化試薬でＦＧＥを活性化させることを含む。
ＦＧＥの活性化に用いられる酸化試薬は、所望の反応条件に適合する任意の都合の良い酸化試薬から選択され得る。例えば、酸化試薬は元素状酸素、例えば最終酸化剤としての元素状酸素などであり得る。場合によっては、最終酸化剤としての元素状酸素は酸素、酸素及び硫化水素の混合物、塩基性条件下の酸素などとして供給され得る。
ある実施形態において、酸化試薬は元素状酸素、例えば最終酸化剤としての元素状酸素などであり、反応は遷移金属によって触媒される。こうした場合において、酸化試薬は、限定はしないが、酸素活性化を触媒することができる銅（ＩＩ）、銅（ＩＩ）源（例えば、硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、ベネディクト試薬など）を含み得る。場合によっては、酸素活性化を触媒することができる酸化試薬（例えばＣｕ２＋）は酸素の存在下で供給される。例えば、酸化試薬は酸素及びＣｕ２＋、Ｃｕ２＋源、またはこれらの組合せを含み得る。
ある実施形態において、酸化試薬は銅（ＩＩ）または銅（ＩＩ）源である。場合によっては、銅（ＩＩ）または銅（ＩＩ）源は酸素の存在下で供給される。場合によっては、酸化試薬は銅（ＩＩ）、例えば銅（ＩＩ）及び酸素などである。場合によっては、酸化試薬は銅（ＩＩ）源、例えば銅（ＩＩ）源及び酸素などである。ある場合において、銅（ＩＩ）源は硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、ベネディクト試薬、これらの組合せなどであるがこれらに限定されない。場合によっては、銅（ＩＩ）源は硫酸銅である。
上記のように、ある実施形態において、ＦＧＥ対酸化試薬のモル比は５：１、または４：１、または３：１、または２：１、または１：１、または１：２、または１：３、または１：４、または１：５である。場合によっては、ＦＧＥ活性化反応混合物中のＦＧＥ対酸化試薬のモル比は１：２である。
上記のように、ある実施形態において、ＦＧｌｙ残基を有するタンパク質のインビトロ生成方法は、無細胞反応混合物中で活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を組み合わせることを含む。上記のように、活性化ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を有するタンパク質を組み合わせる前に、ＦＧＥが活性化されて活性化ＦＧＥが形成され得る。活性化ＦＧＥを生成するアプローチは上記の活性化ＦＧＥの生成方法の説明で詳細に記載している。
ある実施形態において、ＦＧＥ認識部位を有するタンパク質に対する活性化ＦＧＥの比（すなわち変換反応における活性化ＦＧＥ対タンパク質の比）は、２００モル％以下、例えば１５０モル％以下、または１００モル％以下、または７５モル％以下、または５０モル％以下、または２５モル％以下、または１０モル％以下、または５モル％以下、または３モル％以下、または１モル％以下、または０．７モル％以下、または０．５モル％以下、または０．４モル％以下、または０．３モル％以下、または０．２モル％以下、または０．１モル％以下、または０．０７モル％以下、または０．０５モル％以下、または０．０３モル％以下、または０．０１モル％以下、または０．００５モル％以下などである。ある実施形態において、ＦＧＥ認識部位を有するタンパク質に対する活性化ＦＧＥの比は０．１モル％以下、例えば０．１モル％などである。
ある実施形態において、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法は、生成されたタンパク質にホルミルグリシン残基のアルデヒド部分を介して作用物質を結合させることをさらに含む。ある態様では、作用物質は治療薬、造影剤、被検者に投与した際のタンパク質の血清半減期を増加させる作用物質、被検者に投与した際のタンパク質の免疫原性を減少させる作用物質、被検者に投与した際のタンパク質の免疫原性を増加させる作用物質（例えばタンパク質がワクチンの場合）、または生成されたタンパク質への結合に望ましい任意の他の作用物質である。
ある実施形態において、この方法はタンパク質に治療薬を結合させることを含む。ある態様では、治療薬は細胞傷害剤、抗増殖剤、抗新生物剤、抗生物質剤、抗真菌剤、及び抗ウイルス剤から選択される。
ある実施形態において、目的の作用物質は造影剤である。造影剤は、例えば蛍光色素、近赤外（ＮＩＲ）造影剤、及び単光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴ造影剤、核磁気共鳴（ＮＭＲ）造影剤、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）剤、陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）剤、Ｘ線造影剤、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）造影剤、Ｋエッジ造影剤、超音波造影剤、光音響造影剤、音響光学造影剤、マイクロ波造影剤、核造影剤、ならびにこれらの組合せであり得る。
目的の作用物質は、生成されたタンパク質のホルミルグリシン残基のアルデヒドとの反応における反応パートナーの成分として供給される。タンパク質のホルミルグリシン残基に目的の作用物質を結合させるために、幅広い市販の試薬を用いることができる。例えば、いくつかの目的の作用物質のアミノオキシ、ヒドラジド、またはチオセミカルバジド誘導体が好適な反応パートナーであり、容易に入手可能であるか、または標準的な化学的方法を用いて生成することができる。
組成物
本開示は、ある態様において本開示の方法の実施に有用な組成物である組成物を提供する。
第１態様において、細胞培養に適合する酸化試薬、例えばＣｕ２＋などを含む細胞培養培地及び細胞培養培地中に存在し、ＦＧＥを発現する細胞を含む組成物を提供する。
Ｃｕ２＋は、ＦＧＥ活性化に適した濃度などの任意の所望の濃度で細胞培養培地中に存在し得る。ある態様では、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１ｎＭ〜１００ｍＭ、例えば０．１μＭ〜１０ｍＭ、０．５μＭ〜５ｍＭ、１μＭ〜１ｍＭ、２μＭ〜５００μＭ、３μＭ〜２５０μＭ、４μＭ〜１５０μＭ、または５μＭ〜１００μＭ（例えば５μＭ〜５０μＭ）などの濃度で存在する。
ある実施形態において、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、１μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、２００μＭ以上、３００μＭ以上、４００μＭ以上、５００μＭ以上、１ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上の濃度で存在する。ある態様では、Ｃｕ２＋は細胞培養培地中に１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、５００μＭ以下、４００μＭ以下、３００μＭ以下、２００μＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の濃度で存在する。
細胞培養培地中に存在する細胞は、原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞）、真核細胞（例えば酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞など）であり得る。細胞培養培地中に存在する細胞は、ＦＧＥが発現される核酸テンプレート及び任意により、ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質の発現のための核酸テンプレートを含み得る。
ある態様では、細胞培養培地中に存在する細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞から選択される哺乳類細胞である。
無細胞組成物も提供する。ある態様では、無細胞組成物は活性化ＦＧＥ及びバッファーを含む。例えば、活性化ＦＧＥはバッファー中に存在し得る。活性化ＦＧＥを生成するための本明細書に記載の方法のいずれかによって生成される活性化ＦＧＥをはじめとして、任意の目的の活性化ＦＧＥが無細胞組成物中に含まれ得る。ある実施形態において、活性化ＦＧＥは、例えば透析、バッファー交換、透析濾過、沈降、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、及び／または同様のものによって、反応混合物（例えばインビボまたは無細胞タンパク質合成反応混合物、及びＦＧＥ活性化反応混合物など）から分離された精製活性化ＦＧＥである。
活性化ＦＧＥを活性化形態に維持するのに適したバッファーが用いられ得る。ある態様では、バッファーは、活性化ＦＧＥに適合するｐＨ範囲、例えば５〜９、または６〜８のｐＨ範囲など、例えば約７のｐＨ、例えば７．４のｐＨなどを有する緩衝水溶液を得るのに適している。
本開示の無細胞組成物はＦＧＥ認識部位を含むタンパク質をさらに含み得る。本明細書の上のＦＧＥ認識部位を含むタンパク質に関する節で記載したタンパク質のいずれか、例えばＦＧＥ認識部位を有する目的の抗体または抗体断片などを含む、ＦＧＥ認識部位を有する任意の目的のタンパク質が無細胞組成物中に存在し得る。
キット
本開示の態様はキットをさらに含む。本開示のある実施形態に従うキットは本開示の方法の実施において有用である。
一実施形態において、活性化ＦＧＥ、及びタンパク質のＦＧＥ認識部位中に存在するシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換するための活性化ＦＧＥの使用説明書を含むキットを提供する。そのようなキットは、活性化ＦＧＥがタンパク質のＦＧＥ認識部位中に存在するシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換するために用いられ得る反応混合物の調製に用いるバッファーをさらに含み得る。ＦＧＥ及びバッファーは同一または異なる容器（例えばチューブ）で提供され得る。活性化ＦＧＥの認識部位を含むタンパク質（例えば抗体または任意の他の目的のタンパク質）もキットに含まれ得る。
ＦＧＥをコードする核酸、及び酸化試薬を含むキットも提供する。ある態様では、ＦＧＥをコードする核酸は、原核または真核（例えば哺乳類）細胞において細胞内にベクターを形質転換または形質移入した場合に、ＦＧＥを発現するのに適した発現ベクターである。酸化試薬は、上記の本開示の方法に関する節で記載した酸化試薬のいずれかをはじめとする、ＦＧＥを活性化する任意の好適な酸化試薬であり得る。ある態様では、酸化試薬はＣｕ２＋である。キットは、核酸によってコードされるＦＧＥを発現させるのに適した細胞（例えば本明細書に記載の原核または真核細胞のいずれか）をさらに含み得る。例えば酸化試薬によるＦＧＥの活性化及び／または核酸による目的の細胞型の形質転換もしくは形質移入のための使用説明書がキットに含まれ得る。
本開示のキットの構成要素が別々の容器中に存在してもよく、または複数の構成要素が単一容器中に存在してもよい。
上述の構成要素に加えて、本開示のキットは、例えば本開示の方法を実施するためのキットの構成要素の使用説明書をさらに含み得る。使用説明書は一般に好適な記録媒体に記録されている。例えば、使用説明書は、被印刷物、例えば紙またはプラスチックなどに印刷され得る。そのため、使用説明書は、添付文書としてキットの中に、キットまたはその構成要素の容器のラベル中（すなわち包装または小分け包装に付随して）などに存在し得る。他の実施形態において、使用説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体上、例えばＣＤ−ＲＯＭ、Ｂｌｕ−Ｒａｙ、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、コンピュータ可読メモリ（例えばフラッシュドライブ）などに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の使用説明書はキットの中に存在しないが、リモートソースから、例えばインターネットを介して、使用説明書を入手する手段を提供する。この実施形態の例は、使用説明書を閲覧することができる、及び／または使用説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。使用説明書と同様に、使用説明書を入手するためのこの手段は好適な被印刷物上に記録されている。
本開示の実施形態をどのように作製及び使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために、以下の実施例を提示するが、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定する意図も、以下の実験が実施したすべてのまたは唯一の実験であることを表す意図もない。用いる数値（例えば、量、温度など）については、正確性を確保するように努めたが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。「平均」は相加平均を意味する。標準的な略号が用いられ得るが、例えばｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；ｓ．ｃ．、皮下；などである。
機器
マイクロピペット（毎年較正）：ＲｅｓｅａｒｃｈＰｌｕｓ ２．５、１０、２０、１００、２００、１０００（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；セロロジカルピペット：Ｐｉｐｅｔｔｏｒ Ｐｌｕｓ（Ｏｍｅｇａ）；天秤（毎月較正）：ＸＳ４００１Ｓ、ＮｅｗＣｌａｓｓｉｃ ＭＦ（ＭＬ２０４）、ＡＴ２００（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）；ｐＨ測定（毎月較正）：ＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）、ＩｎＬａｂ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐｒｏ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）、Ｏｒｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＰｏｗｅｒＰａｃ Ｂａｓｉｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標） Ｔｅｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；ＰＡＧＥゲルイメージング：Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ウェルプレートウォッシャー：ＥＬｘ４０５（ＢｉｏＴｅｋ）；ウェルプレートリーダー：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）；遠心分離機：Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ ６ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５４１５ Ｒ及び５８１０ Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；反応混合機：Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ボルテクサー：ｖｏｒｔｅｘ ｇｅｎｉｅ ２（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；振とう機：Ｌａｂ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ＳＩ−６００Ｒ（ＪＥＩＯ Ｔｅｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）、振とう培養機（Ｓｈｅｌ Ｌａｂｓ）；ＰＣＲサイクラー：Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；滅菌：Ｈｉｃｌａｖｅ（Ｈｉｒａｙａｍａ）。
吸収分光測定
ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）分光光度計で製造業者が提供するソフトウェアにより、またはＶＩＳＩＯＮｌｉｔｅ（商標）ソフトウェアで制御されたＧＥＮＥＳＹＳ（商標）１０Ｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＵＶ及び可視吸収スペクトルを記録した。分光計は測光精度のためにＮＩＳＴトレーサブルな二クロム酸カリウム標準液で較正した（Ｓｔａｒｎａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
逆相ＨＰＬＣ
Ａｇｉｌｅｎｔ ＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｉｏｎで制御された１１００／１２００シリーズ計測器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆相高性能液体クロマトグラフィーを実施した。この計測器はインライン溶媒デガッサー、分析用クォータナリーポンプ、バイアルオートサンプラー、サーモスタット付カラムコンパートメント、及びダイオードアレイ検出器を含んでいた。Ａｅｒｉｓ（商標）コアシェル２５０×２．１ｍｍ ＸＢ−Ｃ１８ Ｗｉｄｅｐｏｒｅカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｉｎｃ．）でクロマトグラフィーを達成した。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。
ＬＣ／ＭＳ
インライン溶媒デガッサー、分析用バイナリーポンプ、及びサーモスタット付バイアル／ウェルプレートオートサンプラーを含む１１００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と併せた４０００ ＱＴＲＡＰ（登録商標）質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）で質量分析データを収集した。クロマトグラフィーは、ＰＳＴ−ＣＨＣコントローラ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｓ＆Ｔ）で６５℃に設定したバタフライカラムヒーターに包まれたＪｕｐｉｔｅｒ（商標）１５０×１．０ｍｍ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｉｎｃ．）で達成した。ＬＣ−ＭＲＭ（多重反応モニタリング）／ＭＳトランジション質量の計算及び得られたデータの積分はＳｋｙｌｉｎｅ ２．６で実施した。
ＦＰＬＣ
ＵＰＣ−９００、Ｐ−９００及びＦｒａｃ−９５０モジュールからなるＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｋｔａタンパク質精製システムで高速性能液体クロマトグラフィーを実施した。ＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ ５ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でニッケルアフィニティークロマトグラフィーを実施した。使い捨てのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲル濾過を手動で実施した。
ＩＣＰ−ＭＳ
Ｃａｔａｌｅｎｔの分析サービスの中核的研究拠点（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ， ＮＣ）によって誘導結合プラズモン質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）が実施された。酵素原液の２８０ｎｍ吸収強度から測定したタンパク質濃度を基準としたモル比として銅及びカルシウムの比を計算した（表３）。
表３．ＦＧＥ調製物はＩＣＰ−ＭＳによって測定した場合に銅及びカルシウムの両方を含有する。
Figure 2018512043
抗体親和性の競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）評価
１μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＣＤ２２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １１９５８−Ｈ０８Ｈ）によってＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで１６時間、４℃にてＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）をコーティングした。次に、プレートをＰＢＳ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄し、その後、２００μＬのＥＬＩＳＡブロッカー（Ｔｈｅｒｍｏ）でブロッキングした。第２プレートで、ＥＬＩＳＡブロッカー中に２０μｇ／ｍＬとする競合抗体の原液の段階３倍希釈（５０μＬ＋１００μＬ）から１１点標準曲線を作成した。次に、ビオチンタグ付きＣＤ２２（１０ｎｇ／ｍＬで１００μＬ）をウェルのすべてに添加した。最後に、競合剤及びビオチンタグ付きＣＤ２２の混合物をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移し（１００μＬ／ウェル）、室温で１〜２時間、振とうさせながらインキュベートした。ビオチンタグ付きＣＤ２２の最終濃度は５ｎｇ／ｍＬであり、競合剤の最高濃度は１０μｇ／ｍＬであった。プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、その後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ ２１１３０）の１：１０，０００希釈液（ブロッキングバッファー中）の１００μＬを加え、室温で振とうさせながら１〜２時間プレートをインキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ（１００μＬ／ウェル、Ｐｉｅｒｃｅ ＃３４０３８）で発色させた。５０μｌの２Ｍ硫酸で反応をクエンチし、４５０ｎｍで吸光度を測定した。非線形回帰によってＥＣ５０値を求めた。
不確かさ評価
棒グラフで示した場合の不確かな測定値は、以下の式を用いてサンプルサイズ（ｎ）が３以上の平均値の標準誤差から計算した９５％信頼区間を表す。
Figure 2018512043
式中、ｓはｎ個のサンプルで測定された標準偏差である。酵素速度論パラメータについて報告する誤差は、活性データのミカエリス・メンテン式への非線形回帰中に見出される最小二乗和から計算される誤差の推定値を表す。
Figure 2018512043
式中、Ｅｔは溶液中の全酵素であり、ｋｃａｔ及びＫＭはＳＴＲＥＮＤＡ委員会によって規定された標準酵素パラメータである。酵素比活性の単位はカタールであり、１ｋａｔ＝１ｍｏｌ・ｓ−１である。速度論パラメータは、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍを用いた［基質］対初期速度の非線形回帰から求めた。
ＨＰＬＣ実験の曲線下面積（ＡＵＣ）はＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアによって、「新指数型」アルゴリズムを用い、１ｍＡＵのスロープ感度を設定して計算した。速度論パラメータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いた［基質］対初期速度の非線形回帰から求めた。
ソフトウェア
すべての計測器データ収集ワークステーションは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳ及び製造業者によって提供された計測器制御ソフトウェアを実行しているＰＣで操作した。データ解析は、ＭＳ ｗｉｎｄｏｗｓを実行するＰＣまたはＯＳ Ｘ １０．１０を用いるＡｐｐｌｅ ｉＭａｃのいずれかで実施した。線形及び非線形回帰はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ｅを用いて実施した。ＨＰＬＣクロマトグラムの積分はＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｉｏｎを用いて実施した。ＬＣ−ＭＲＭ／ＭＳトランジション質量の計算及び得られたデータの積分はＳｋｙｌｉｎｅ ２．６（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）で実施した。統計計算はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで実施した。グラフ及び図はＡｄｏｂｅ Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｓｕｉｔｅで作成した。タンパク質結晶構造のレンダリングはオープンソースのＰｙＭＯＬ １．７で実施した。
材料
試薬、材料、化学物質、及び略号
すべての水は脱イオン化されており（１８ＭΩ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｉｎｔｅｇｒａｌ ５システム（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から得た。市販の化学物質は試薬グレード（またはこれより高く、その場合表示する）であった。化学物質及び材料の供給元は以下の通りであった：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ―β−メルカプトエタノール（βＭＥ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メトキシルアミン水和物、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、硫酸ストレプトマイシン、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）；Ａｃｒｏｓ―ギ酸、トリエタノールアミン（ＴＥＡＭ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グリセロール、グルコース、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ―イミダゾール、チルプトン（ｔｙｒｐｔｏｎｅ）、酵母エキス、塩化ナトリウム；Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ―アセトニトリル＋０．１％ ＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）、アセトニトリル＋０．１％ ギ酸（ＨＰＬＣグレード）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ―トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｌｕｓタンパク質スタンダード；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ―１０Ｘタンパク質アッセイ；ＩＢＩ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ―イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）；Ａｍｒｅｓｃｏ―アンピシリンナトリウム塩（ＵＳＰ）；Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ―ｃＯｍｐｌｅｔｅ−ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼインヒビターカクテル；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ―ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ―ウルトラコンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞。
抗体生成
抗体生成のために、ＧＰＥｘ技術を用いて抗体発現細胞のバルク安定プールを生成した。プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて抗体を馴化培地から精製した。
ペプチド合成
すべてのペプチド合成は固相上で行い、≧９５％に精製した。
生物材料の識別
Ｓｃ−ＦＧＥ―ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９Ｆ３Ｃ７；ＰＤＢ ２Ｑ１７。
Ｈｓ−ＦＧＥ―ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ８ＮＢＫ３；ＰＤＢ １Ｙ１Ｅ。
実施例１：Ｃｕ２＋による哺乳類細胞におけるインビボでのＦＧＥの変換効率の増加
ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を発現する哺乳類細胞の細胞培養培地中のＣｕ２＋（硫酸銅）の存在による変換への影響を調査した。組換えヒトＦＧＥ及びＦＧＥ認識配列ＬＣＴＰＳＲを含む組換えαＨＥＲ２ ｍＡｂ（同一細胞における重鎖及び軽鎖）を発現するＣＨＯ細胞を、ＣｅｌｌＢｏｏｓｔ４フィード、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ、ならびにグルコース及び／またはガラクトースを補添したＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃを含むＦｏｒｔｉＣＨＯ培地で培養した。ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＢｏｏｓｔ４フィード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
様々な条件で試験した結果を以下にまとめる。
図１（パネルＡ）に示すように、Ｃｕ２＋（０日目に５０μＭ）は、ＣｅｌｌＢｏｏｓｔ４フィード、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ、及びＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ＋グルコースを含むＦｏｒｔｉＣＨＯ培地における変換を増加させた。図１（パネルＢ）に示すように、Ｃｕ２＋（０日目に５０μＭ）は、グルコースまたはガラクトースの添加を含めたＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ含有ＰＦ−ＣＨＯ培地における変換を向上させた。
図２に示すように、０日目に５μＭまたは２０μＭのＣｕ２＋を添加した場合の変換に対する効果は５０μＭと同じであった。３日目または５日目に５０μＭのＣｕ２＋を添加した場合の変換に対する効果は０日目の添加と同じであった。Ｃｕ２＋（０日目に５０μＭ）は、ＰＦ−ＣＨＯ、アミノ酸、ＡＧＴ ＣＤ ５ｘ培地、ＣｅｌｌＢｏｏｓｔ４、グルコースフィード、及び温度変化を含む培養条件下での変換を向上させた。
上記の実験により、Ｃｕ２＋の存在下で細胞を培養するとＦＧＥが活性化され、ひいては標的タンパク質中のＦＧＥ認識部位がＦＧｌｙを含むようになる変換が増加すると実証された。
様々な濃度の他のイオン源、例えば硫酸鉄（ＩＩ）、ＭｎＣｌ２及びＺｎＣｌ２などの存在による変換への影響を試験するための実験も行った。実験条件は上記のＣｕ２＋実験に用いたものと同じであった。結果は、硫酸鉄（３日目に０．１ｍＭまたは０．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（０日目に５０ｕＭまたは１０ｕＭ）、及びＺｎＣｌ２（０日目に５０ｕＭ）は標的ポリペプチドの変換に検出可能なまたは有意な増加をもたらさないことを示していた。
図３のパネルＡは、Ｃｕ２＋処理細胞及び未処理細胞の生存密度を比較するデータを示す。図３のパネルＢは、Ｃｕ２＋処理細胞及び未処理細胞のタンパク質力価を比較するデータを示す。図３のパネルＣは、Ｃｕ２＋処理細胞におけるインビボＦＧＥ活性化／変換の増加を表すデータを示す。図３に示したデータは、Ｃｕ２＋を添加していない実験と比較して、Ｃｕ２＋の存在下で力価及び細胞生存率がそれほど変化しないことを示している。
実施例２：乳酸消費の潜在的な刺激因子のインビボでの変換効率に対する影響
銅は乳酸消費の潜在的な刺激因子であるので、他の潜在的な乳酸消費の刺激因子の、標的タンパク質中のＦＧＥ認識部位がＦＧｌｙを含むようになる変換の効率を増加させるためのＦＧＥを活性化させる能力を調査した。
実験条件は上記の実施例１に記載したものと同じであった。細胞培養培地への乳酸（Ｓｉｇｍａ）またはピルビン酸（Ｓｉｇｍａ）（１．５ｇ／Ｌ、フィード含有）の添加は、ＦＧＥの変換効率を増加させなかった。ＰｏｗｅｒＦｅｅｄＡ（Ｌｏｎｚａ）は、乳酸消費を刺激すると報告されているが、変換効率を増加させなかった。乳酸レベルの分析では、Ｃｕ２＋の存在または不在で変換効率が異なるにもかかわらず、Ｃｕ２＋の存在または不在で乳酸消費の差は示されなかった。
図７のパネルＡは、Ｃｕ２＋の存在下またはＣｕ２＋の不在下での変換率（％）のグラフを示し、Ｃｕ２＋の存在下での変換率（％）の方が高いことを示している。図７のパネルＢは、Ｃｕ２＋の存在下または不在下での乳酸消費のグラフを示し、Ｃｕ２＋存在下または不在下での乳酸消費に有意差がないことを示している。図７のパネルＣは、Ｃｕ２＋の存在下または不在下でのグルコース消費のグラフを示し、Ｃｕ２＋存在下または不在下でのグルコース消費に有意差がないことを示している。
実施例３：Ｃｕ２＋による２９３ Ｅｘｐｉ系における変換効率の変動性の減少
選択した部位にホルミルグリシン残基を有する抗体を生成するために、２９３ Ｅｘｐｉ一過性共形質移入系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。この系では不定な変換率（１０〜９５％）とともに高い抗体力価（１００〜５００ｍｇ／Ｌ）が得られた。培養培地中にＣｕ２＋を添加することでこの系の変動性を減少させることができるかどうか判定するために、ＣＴ−１．１タグ付きＨｅｒ２の形質移入の直前または形質移入の翌日に５０μＭの硫酸銅を添加した。３つの独立した実験において、形質移入前に５０μＭの硫酸銅で処理した、または処理していないＥｘｐｉ ２９３Ｆに、Ｎ末端ＫＤＥＬアミノ酸配列を含む（＋ＫＤＥＬ）全長ヒトＦＧＥ及びＣＴタグ付き抗体の発現プラスミドを抗体：ＦＧＥ ＤＮＡが３：１の比で一過的に共形質移入した。形質移入の５〜６日後に培養物を採取し、ＥＬＩＳＡによって力価を評価し、タンパク質を精製して質量分析によって変換を測定した。
結果は図４及び表１に示してあり、Ｃｕ２＋が２９３細胞において力価を著しく低下させることなく変換を向上させることを示している。
表１
Figure 2018512043
実施例４：Ｃｕ２＋による様々な形態のＦＧＥの変換効率における変動性の減少
ヒトＦＧＥの＋ＫＤＥＬ形態の変換効率の変動性はＣｕ２＋の添加によって減少され得る。上記の実施例３において記載したのと同じ実験条件を用いて、ヒトＦＧＥの非ＫＤＥＬ形態の変換効率の変動性を減少させるＣｕ２＋の能力を確認するために実験を行った。形質移入前に５０μＭの硫酸銅で処理した、または処理していないＥｘｐｉ ２９３Ｆ細胞に、様々な形態のヒトＦＧＥ（＋ＫＤＥＬ、ＷＴ、ｍｙｃ−Ｈｉｓ）及びＣＴタグ付き抗体の発現プラスミドを抗体：ＦＧＥ ＤＮＡが３：１の比で一過的に共形質移入した。形質移入の５日後に培養物を採取し、ＥＬＩＳＡによって力価を評価し、タンパク質を精製して質量分析によって変換を測定した。
結果は図８及び表２に示してあり、ヒトＦＧＥの非ＫＤＥＬ形態をタグ付き抗体とともに共形質移入した場合、特にＷＴ ＦＧＥ及びＣ末端にｍｙｃ−Ｈｉｓタグを付けたＦＧＥで、Ｃｕ２＋がＥｘｐｉ系における変換効率の変動性を減少させることを示していた。
表２
Figure 2018512043
実施例５：酸化的リン酸化の刺激因子及びインヒビターによる変換への影響
Ｃｕ２＋と比較した、酸化的リン酸化の刺激因子及びインヒビターによるヒトＦＧＥの変換効率への影響を確認するために実験を行った。
ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）はミトコンドリア呼吸を刺激するピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼインヒビターである。ロテノンはミトコンドリア複合体１インヒビターであり、酸化的リン酸化を阻害する。両作用物質（４時間処理）によるＡＴＰ生成についての投与量反応を行い、予想通り各薬剤がＡＴＰ生成に影響を及ぼすことを確認した。複数の濃度のＤＣＡ（ＤＣＡ：０μＭ；１６μＭ；８０μＭ；４００μＭ；２０００μＭ；１０，０００μＭ；及び５０，０００μＭ）で細胞を処理する、ならびにＣｕ２＋（硫酸銅）及び複数の濃度のロテノン（ロテノン：０ｎＭ；５ｎＭ；２４ｎＭ；１２０ｎＭ；６００ｎＭ；３０００ｎＭ；及び１５，０００ｎＭ）で細胞を処理する複数の実験を実施した。細胞をプレートに播種し、１０μＬのＤＣＡまたはロテノンを４時間処理の間添加した。細胞を室温に平衡させ、１００μＬ／ウェルのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。プレートを２分間振とうさせ、室温で１０分間インキュベートし、その後プレートリーダーで読み取った。
結果はＤＣＡまたはロテノンのいずれも変換に影響がないことを示していた。ＤＣＡ処理細胞は未処理細胞よりもわずかに低い変換を示し、ロテノン及びＣｕ２＋で処理した細胞はＣｕ２＋のみで処理した細胞と同様の変換効率を有していた。これらの結果は、Ｃｕ２＋処理で観察される変換の向上に酸化的リン酸化がおそらく関与しないことを示していた。
実施例６：硫化物キノンレダクターゼ（ＳＱＲ）の変換への影響
硫化水素（Ｈ２Ｓ）はＦＧＥ触媒サイクルの推定上の副生成物である。硫化物キノンレダクターゼ（ＳＱＲ）はＨ２Ｓを酸化して解毒するミトコンドリア酵素である。流加培養の間のＨ２Ｓ蓄積がヒトＦＧＥ活性を阻害するかどうか、及びＣｕ２＋がこの影響を打ち消すかどうか判定するために実験を行った。
細胞をプレートに播種した。ＤＮＡをＯｐｔｉｐｒｏ無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍａｘ形質移入試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＯｐｔｉｐｒｏ無血清培地を混合した。室温で１０〜２０分間ＤＮＡ及び試薬を混合した。得られた複合体を細胞に加えた。
ＳＱＲに対する抗体を用いて、Ｃｕ２＋で処理した、またはＣｕ２＋で処理していない細胞のライセートにウエスタンブロッティングを実施し、Ｃｕ２＋がＳＱＲのレベルを増加させたかどうか判定した。ＳＱＲのレベルに有意差は観察されなかった。変換を増加させることにおいて、Ｅｘｐｉ細胞でのＳＱＲの過剰発現がＣｕ２＋の代わりとなり得るかどうか試験するための実験も行った。結果は、対照と比較してＳＱＲ過剰発現細胞での変換に有意差がなかったことを示していた。ＣＨＯ一過性形質移入においてＳＱＲ過剰発現が確認された。したがって、ＳＱＲは定常期における高変換の維持におそらく関与していない。
実施例７：Ｃｕ２＋処理細胞から単離したＦＧＥは高い比活性を有する
Ｃｕ２＋処理細胞で観察される変換の向上がＦＧＥ酵素の比活性の増加に起因するかどうか判定するために、Ｅｘｐｉ細胞をＣｕ２＋処理及び未処理とし、ヒトＦＧＥ−ｍｙｃＨｉｓ（ｐＲＷ５２９）で形質移入した。ＦＧＥをニッケルクロマトグラフィーによって精製し、比活性について試験したところ、Ｃｕ２＋処理細胞から単離したＦＧＥは一貫して著しく高い活性を示した。実験条件は上記の実施例３と同じであった。比活性は下記の実施例９に記載のように測定した。
銅の不在以外は同一の条件の下で培養した細胞と比較して、処理細胞から単離したＦＧＥの比活性が高いことに示されるように、細胞培養培地にＣｕ２＋を供給した結果、ＦＧＥが活性化された。図９のパネルＡ及び図９のパネルＢに示すように、ＦＧＥのレベルは同じ（または銅の方が低い；図９のパネルＡを参照）であったが、銅での培養からのＦＧＥの活性は著しく高かった（図９のパネルＢを参照）。
実施例８：原核細胞でのＦＧＥ活性化及び変換の向上
原核細胞でのＣｕ２＋のＦＧＥを活性化して変換を向上させる能力を調査した。Ｓ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（「Ｓｃ」）ＦＧＥ及びＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を共発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞をＣｕ２＋の存在または不在下で培養した。図４に示すように、Ｃｕ２＋の不在下で培養した細胞と比較して、Ｃｕ２＋で処理した細胞では変換が向上した。
Ｃｕ２＋によるＦＧＥ活性化の潜在的な機構を調査するために、Ｃｕ２＋の存在または不在下で培養したＥ．ｃｏｌｉ細胞から単離したＳｃ−ＦＧＥに液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を行った。図５に示すように、Ｃｕ２＋処理の結果、Ｓｃ−ＦＧＥの２つの活性部位チオール基が酸化され、ＦＧＥ活性化は２つの活性部位システイン残基が関与するジスルフィド形成を伴い得ることを示していた。
実施例９：インビトロＦＧＥ活性化
本実施例は、ＦＧＥがＣｕＳＯ４での処理によってインビトロで活性化され、未処理／非活性化ＦＧＥと比較して高い比活性を有する被処理／活性化ＦＧＥが得られ得ることを実証する。
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのＳｃ−ＦＧＥの組換え発現及び精製
Ｓ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｓｃ）ＦＧＥの増強組換え発現及び精製を実施した。Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有する野生型Ｓｃ−ＦＧＥをコードするｐＥＴ１５１−Ｄ／ＴＯＰＯベクターを、４２℃の熱ショックによってＬＢ培地中のウルトラコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。アンピシリン選択下３７℃でＬＢ／アガロース上に播種して一晩成長させた後、単独コロニーをテリフィックブロス（ＴＢ）中で１２５ｍＬまで増幅させた。ＯＤが０．４〜０．５の時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭになるまで加えた。培養フラスコを１８℃に冷却し、２００ＲＰＭで１６時間振とうさせた。６，０００ｒｃｆ、２０分間で細胞を収集した。細胞を溶解バッファー（２５ｍＭ トリエタノールアミン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビター、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）溶解試薬で溶解した。２５，０００ｒｃｆで２５分間の遠心分離によって溶液を清澄化した。１％ｗ／ｖの最終濃度となるまで上清を硫酸ストレプトマイシン溶液中に希釈することによって残りのＤＮＡを沈殿させた。溶液を４℃で１５分間撹拌してから、２５，０００ＲＰＭで２５分間遠心分離にかけた。上清をＮｉ−ＮＴＡセファロースＦＦカラムに添加し、自然流下で溶出した。５ＣＶの洗浄バッファー（２５ｍＭトリエタノールアミン、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）で洗浄することによって、非特異的結合タンパク質を除去した。精製タンパク質は溶出バッファー（２５ｍＭトリエタノールアミン、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）で単離した。タンパク質を含有する画分（ブラッドフォードアッセイによって判断）をプールし、保存バッファー（２５ｍＭトリエタノールアミン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、８％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。そして、保存バッファーでタンパク質を溶出し、１０ｋＤ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｉｎｃ．）で濃縮し、７７Ｋで瞬間冷凍した。単離酵素の典型的な収量：５０〜７５ｍｇ／Ｌ培地。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（１０％ゲル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｉｎｃ．）、逆相ＨＰＬＣ、インタクトな球状タンパク質のＬＣＭＳ、酵素のトリプシン消化物のＬＣＭＳ、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光測定、比活性（以下に記載）によって精製酵素を特徴付けした。
ＦＧＥ活性アッセイ
不連続酵素活性アッセイを用いてＦＧＥの比活性を測定した。ＦＧＥの基質はコンセンサス配列を含有する１４アミノ酸のペプチド（Ｈ２Ｎ−ＡＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ−ＣＯＯＨ）であった。逆相ＨＰＬＣにおける出発物質（Ｃｙｓ）及び生成物（ｆＧｌｙ）含有ペプチドの２１５ｎｍのピーク面積を積分することによって、反応速度を求めた。生成物（及び副生成物）ピークの同一性はＲＰ−ＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳによって確認した。各反応水溶液（６０μＬ）は基質ペプチド（１００μＭ）、ＦＧＥ（１μＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、及びバッファー（２５ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ９）を含有していた。１回の時間経過で２分ごとに５つの時点でデータを収集した。ＦＧＥ原液を添加して３秒間ボルテックスした時点で反応開始とした。各時点において、マイクロピペットにより手動で反応混合物の１０μＬを１μＬの１Ｍ ＨＣｌ中に希釈することによってクエンチした。反応の完了後、ＲＰ−ＨＰＬＣによって各時点について分析した。
ＨＰＬＣによるＦＧＥ基質及び生成物ペプチドの定量
基質、生成物、及びＦＧＥ基質ペプチドＡＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲの副生成物を、０．１％ ＴＦＡを含有する１８％ ＭｅＣＮ水溶液のアイソクラティックによる７分間のＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。基質のｆＧｌｙ（２．１分）、Ｃｙｓ（３．３分）、βＭＥ−ＤＳ（３．６分）、及びＣｙｓ−ＤＳ（６．２分）形態の積分した面積を用いて合計面積及びそれぞれの分率を計算した。
ＦＧＥの活性化
緩衝水溶液（２５ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中のホルミルグリシン生成酵素（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、５０μＭ）の溶液に硫酸銅（ＩＩ）（１００μＭ）を加えた。１５００ＲＰＭで１時間２５℃にて混合物をボルテックスした。その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）樹脂（製造業者の指示に従うＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＰＤ−１０カラム）を用いた２５ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌへのバッファー交換によって、反応混合物からタンパク質を取り出した。交換後、本明細書に記載の標準的な活性アッセイを用いてＦＧＥの比活性を測定した。
結果
インビトロ活性化実験の結果は図６に示してあり、Ｃｕ２＋源としてのＣｕＳＯ４で処理したＦＧＥ及び未処理ＦＧＥの比活性のグラフを示す。この実施例における被処理ＦＧＥの比活性の増加に示されるように、Ｃｕ２＋での処理の結果としてＦＧＥが活性化された。
実施例１０：ヒトＦＧＥのコアをコードする組換えバキュロウイルスの製造
Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ＦＧＥの触媒「コア」とこれに続く精製のためのＣ末端Ｈｉｓ６タグ（Ｈｓ−ｃＦＧＥ）をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによって先行のコンストラクト（Ｒａｂｕｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．，（２０１２）， ７，１０５２−１０６７を参照）から増幅した。Ｈｓ−ｃＦＧＥ配列及びプライマーを以下に挙げる。Ｈｓ−ｃＦＧＥコードバキュロウイルスの調製はＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系でのＨｓ−ｃＦＧＥのクローニングに用いたプライマー。
フォワード：ＧＡＧＧＣＴＡＡＣＧＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣ
リバース：ＧＴＣＣＡＴＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＴＣ
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系によってＮ末端に４残基が追加され、アミノ酸配列ＤＲＳＬ（配列番号６）のシグナル配列が付与される。この発現ベクターから発現されるＨｓ−ｃＦＧＥの一次配列を以下に示す。
ＴＥＶプロテアーゼ部位及びＨｉｓ６タグを有するＨｓ−ｃＦＧＥの一次配列
Figure 2018512043
実施例１１：Ｈｉ５細胞からのＨｓ−ｃＦＧＥの発現及び精製
Ｈｓ−ｃＦＧＥバキュロウイルスを０．１のＭＯＩでＨｉ５昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質移入した。７２時間の培養後、馴化培地を遠心分離及び濾過（０．４５μｍ ＰＥＳ）によって清澄化し、ＦＰＬＣによってＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ樹脂上に５ｍＬ／ｍｉｎで添加した。樹脂を１０カラム体積（ＣＶ）の洗浄バッファー（２５ｍＭ ＴＥＡＭ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ酢酸カルシウム、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）で洗浄した。その後、溶出バッファー（２５ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡＭ）、５ｍＭ酢酸カルシウム、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）でカラムから酵素を取り出した。タンパク質を含有する画分（ＦＰＬＣ溶出のＵＶ検出によって確認）をプールし、保存バッファーで（２５ｍＭ ＴＥＡＭ、８％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．４）平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラムに添加した。そして、保存バッファーでタンパク質を溶出し、１０ｋＤ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、液体窒素中で瞬間冷凍した。単離酵素の典型的な収量は１０〜２０ｍｇ／Ｌ培地であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図１０）、逆相ＨＰＬＣ、インタクトなタンパク質のＬＣ／ＭＳ、トリプシン消化とこれに続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、吸収分光測定、及び比活性（以下の実施例で記載する）によって精製酵素を特徴付けした。
実施例１２：ＦＧＥ触媒活性のアッセイ
不連続酵素活性アッセイを用いてＦＧＥの比活性を測定した。ＦＧＥの基質はＣＸＰＸＲコンセンサス配列を含有する１４アミノ酸のペプチド（ＡＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ）であった。逆相ＨＰＬＣにおける基質システイン（Ｃｓｕｂ）及び生成物（ｆＧｌｙ）ペプチドの２１５ｎｍのピーク面積を積分することによって、反応速度を求めた。生成物（及び副生成物）ピークの同一性はＲＰ−ＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳによって確認した（下記参照）。各反応水溶液（１２０μＬ）はＣｓｕｂ（１００μＭ）、ＦＧＥ（０．１〜１μＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、及びバッファー（２５ｍＭ ＴＥＡＭ、ｐＨ９）を含有していた。１回の時間経過において、等間隔をあけた５つの時点でデータを収集した。ＦＧＥ原液を添加して３秒間ボルテックスした時点で反応開始とした。反応バイアルをｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で１，５００ＲＰＭ及び２５℃にてボルテックスした。各時点において、マイクロピペットを用いて反応混合物の２０μＬを２μＬの１Ｍ ＨＣｌに加えることによって手動でクエンチした。反応の完了後、ＲＰ−ＨＰＬＣによって各時点について分析した（下記参照）。
実施例１３：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びＲＰ−ＨＰＬＣによるＦＧＥペプチド中間体の同定
Ｃｓｕｂに対するＦＧＥによるインビトロ変換の中間体及び生成物を同定するために、ＦＧＥ活性アッセイからの反応混合物をクエンチしてＬＣ／ＭＳによって分析した。反応混合物は、２００μＬの全体積中に０．５ｍＭペプチド、０．５μＭヒトＦＧＥ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（βＭＥ）、及び２５ｍＭ ＴＥＡＭ、ｐＨ９を含んでいた。各時点において、反応混合物の２０μＬを２μＬの１Ｍ ＨＣｌに加えることによって調製した。グラジエントは、０．１％のギ酸を含む水中のＭｅＣＮが１０分間で５〜２５％であった。ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２１５ｎｍで検出した４つのペプチドのピークの相対強度及び保持時間がＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータにおいて再現され、質量による各ピークの割当てが可能となった。計算された及び観察されたｍ／ｚイオン、ならびに各ペプチド種の割当てを図１１、図１２、及び図１３に示す。
実施例１４：ＨＰＬＣによるＦＧＥ基質及び生成物ペプチドの定量
基質、生成物、及びＦＧＥ基質ペプチドＡＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲの副生成物を、０．１％ ＴＦＡを含有する１８％ ＭｅＣＮ水溶液のアイソクラティックによる７分間のＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。基質のｆＧｌｙ（２．１分）、Ｃｓｕｂ（３．３分）、Ｃｓｕｂ／βＭＥジスルフィド（Ｃｓｕｂ−βＭＥ、３．６分）、及び基質／基質ジスルフィド（Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂ、６．１分）形態の積分面積を用いて合計面積及びそれぞれの分率を計算した。
実施例１５：ＦＧＥのチオール及びジスルフィドマッピング
Ｓｃ−ＦＧＥまたはＨｓ−ＦＧＥいずれかのチオール残基の酸化状態を確認するために、逐次的標識化、消化、及び直交標識化を用いて、ＬＣ／ＭＳによってチオール及びジスルフィドをマッピングする手法を開発した。ステップ１、最初の標識化及びトリプシン消化：反応混合物は全体積３０μＬ中のＦＧＥ（７．５μｇ）、ＮＨ４ＨＣＯ３（５０ｍＭ）、ヨードアセトアミド（２０ｍＭ）、及びトリプシン（０．７５μｇ）で構成されていた。サンプルを含むチューブを３７℃で１６時間インキュベートした。ステップ２、クエンチング：水（６μＬ）及びＤＴＴ（０．５Ｍ、５０ｍＭの最終濃度で４．８μＬ）をステップ１の反応混合物に加えた。サンプルを含むチューブを３７℃及び１５００ＲＰＭで１時間インキュベートした。ステップ３、第２の標識化：Ｎ−エチルマレイミド（０．５Ｍ、１５０ｍＭの最終濃度で７．２μＬ）をステップ２の反応混合物に加えた。その後、サンプルを含むチューブを３７℃及び１５００ＲＰＭで１時間インキュベートした。ステップ３の後、反応混合物をＨＣｌ（１Ｍ、１００ｍＭの最終濃度で４．８μＬ）でクエンチした。０．１％ギ酸を含む水中のＭｅＣＮを１５分間で０〜５０％とするグラジエントで、消化されたペプチドを分離した。ヨードアセトアミド、エチルマレイミド、及びＣｙｓ残基の酸化修飾を観察するＭＲＭ／ＭＳによって、システイン含有ペプチドを検出した。
実施例１６：硫酸銅（ＩＩ）でのＦＧＥの活性化
緩衝水溶液（２５ｍＭ ＴＥＡＭ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＳｃ−ＦＧＥ（１０μＭ）の溶液に硫酸銅（５０μＭ、５モル当量）を加えた。１５００ＲＰＭで１時間２５℃にて混合物をボルテックスした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５樹脂を用いた２５ｍＭ ＴＥＡＭ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌへのバッファー交換によって、反応混合物からタンパク質を精製した。その後、上記の活性アッセイを用いてＦＧＥの比活性を測定した。
実施例１７：インタクトなｍＡｂ中のｆＧｌｙ含有量の定量
緩衝水溶液（２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）中のｍＡｂ（２０μｇ）の溶液にＤＴＴ（２０ｍＭ）を２０μＬの最終体積まで加えた。サンプルを含むチューブを３７℃で１５分間１５００ＲＰＭでインキュベートした。その後、ＨＣｌ（５０ｍＭ）を溶液に加え、混合されるまでチューブをボルテックスした。次に、炭酸水素アンモニウム（１００ｍＭ）を溶液に加え、混合されるまでチューブをボルテックスした。トリプシン（１μｇ）及びヨードアセトアミド（５０ｍＭ）を加え、チューブを３７℃及び１５００ＲＰＭで６０分間暗所でインキュベートした。最後に、クエン酸ナトリウム（１５０ｍＭ、ｐＨ５．５）及びメトキシルアミン（１００ｍＭ）を溶液に加え、チューブを３７℃で１６時間インキュベートした。その後、処理したサンプルをＬＣ−ＭＲＭ／ＭＳによって分析した。ＭＲＭトランジションは、システイン、ヨードアセトアミドで修飾されたシステイン、ホルミルグリシン、ホルミルグリシン水和物（コリジョンセル内での水の喪失を含む）、及びホルミルグリシンメチルオキシムを含むＣｙｓ含有ペプチドの修飾を含んでいた。各種の存在量はその前駆体／生成物イオン対の最も強力な５つによって定義し、これらを積分して全シグナル及び各成分の相対分率を求めた。上記の最適化した消化及びキャッピング手法において、バックグラウンドを超える未反応のＣｙｓ、ｆＧｌｙ、またはｆＧｌｙ水和物は検出されず、カルボキシアセトアミドメチルＣｙｓ（ＣＡＭ）及びｆＧｌｙのメチルオキシム（ＭｅＯｘ）のみが観察された。カルボキシアセトアミドメチルＣｙｓ（ＣＡＭ）及びｆＧｌｙのメチルオキシム（ＭｅＯｘ）は検出可能であった。
実施例１８：ＦＧＥでのインタクトなｍＡｂのインビトロ変換
２５ｍＭ ＴＥＡＭ ｐＨ９．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ βＭＥ中のアルデヒドタグを含有するＩｇＧ（Ｃ末端ＫがＳＬＣＴＰＳＲＧＳで置換された）の溶液にＨｓ−ｃＦＧＥを加えた。酵素は、抗体重鎖のアルデヒドタグ中のＣｓｕｂの濃度に対して１０ｍｏｌ％で加えた。溶液を１，０００ＲＰＭで１６時間１８℃でボルテックスし、その後、溶液を０．５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５の０．２５体積当量で（最終濃度１００ｍＭクエン酸まで）クエンチし、ｍＡｂ ＳｅｌｅｃｔプロテインＡ樹脂に結合させるために溶液のｐＨを約７まで減少させた。標準的な方法を用いてＩｇＧを精製した。典型的な反応において抗体中の最終ｆＧｌｙ含有率は９５〜１００％が得られ、９０〜１００％の反応変換収率に相当した。これまでに、２０μｇ〜０．６ｇのスケールの範囲にわたって反応を実施した。
実施例１９：ＦＧＥアポ酵素の生成
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、１５ｍＭ）及びトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１５ｍＭ）を、緩衝水溶液（２５ｍＭ ＴＥＡＭ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＳｃ−ＦＧＥホロ酵素（５μＭ）の溶液に添加した。７５０ＲＰＭで１時間３７℃にて混合物をボルテックスした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５樹脂を用いた２５ｍＭ ＴＥＡＭ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌへのバッファー交換によって、反応混合物からタンパク質を精製した。その後、上記の活性アッセイを用いてＦＧＥの比活性を測定した。
結果
実施例１０〜１９の結果を以下の節で説明する。
Ｓｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ｃＦＧＥは細胞培養から単離した場合においてわずかな触媒活性を有していた。ＦＧＥの組換え発現のための方法を開発した。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ及びＨ．ｓａｐｉｅｎｓの２種に由来するＦＧＥを研究のために選択したが、その理由は、酵素の原核生物及び真核生物形態両方を代表するものであったためである。Ｓｃ−ＦＧＥは、Ｅ．ｃｏｌｉの形質移入及び清澄化細胞ライセートからの精製によって調製した。Ｈｓ−ｃＦＧＥは、昆虫細胞のウイルス形質導入によって高純度かつ良好な収量で調製した。ヒト形態は昆虫細胞で産生した。
ヒト酵素については、沈殿（下で詳細に記載）を助長すると思われる非触媒部分を除去した。可溶性酵素について、細胞培養から生成したＦＧＥの活性、及び触媒作用に必要とされる反応条件を評価した。
ＦＧＥの比活性を測定するために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて出発物質及びクエンチした反応混合物の生成物を定量する不連続アッセイを行った。アッセイでは、ＦＧＥコンセンサス配列を含有するペプチドのＣｙｓ及びｆＧｌｙ形態の分離及び定量両方のために逆相ＨＰＬＣを用いた。非修飾１４アミノ酸ペプチドＡＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲを酵素のＳｃ及びＨｓ形態両方に対する基質として用いた。
ＣｙｓからｆＧｌｙへの変換は、Ｃｙｓチオールの２Ｈ＋／２ｅ−酸化及び硫黄と酸素との交換を用いていた。現在のデータは分子状酸素が最終電子受容体である機構を実証している。しかし、Ｏ２は４Ｈ＋／４ｅ−受容体であるので、還元剤を用いて２Ｈ＋及び２ｅ−の第２当量を与え、Ｏ２から２ｍｏｌのＨ２Ｏへの還元を完了させた。２Ｈ＋／２ｅ−酸化剤をインビトロ反応に直接加えることによって、還元剤の使用を省略することができるかどうか試験するために、 酸化剤Ｈ２Ｏ２を加えたが、ジスルフィドの生成による基質の二量体化（Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂ）が生じ、反応が停止した（図１２のパネルａ及び図１２のパネルｂ）。定型的な活性測定に還元剤（ＤＴＴ）及びＯ２の混合物を用いた。
予混合したＣｓｕｂ及び還元剤の緩衝溶液中にＦＧＥを素早く混合することによって、個々のＦＧＥ反応を開始させた。すべての緩衝溶液は２５℃で約２７０μＭの酸素を含有していると想定された（ヘンリーの法則に基づく）。各時点において、ＨＣｌで手動により化学的にクエンチした。以下に記載するように、ＦＧＥの比活性はその活性部位の化学的状態の関数として変化する可能性があり、そのため、このアッセイにおける酵素濃度は０．１〜１０μＭ（０．１〜１０ｍｏｌ％）酵素の範囲に及んだ。Ｃｙｓ及びｆＧｌｙ含有ペプチドの同一性はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって確認した（図１１）。そして、これらの割当てをＨＰＬＣ保持時間と相関させた（図１４のパネルａ）。Ｂｏｅｋｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（１９８４），２２３，１５；ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，（１９８５），２２６，２９）によって記載された方法を用いてＦＧＥの初期速度（図１４のパネルｂ）を計算するために、基質及び生成物の積分ピーク面積を用いた。
Ｈｓ−ＦＧＥは、シグナルペプチド、Ｎ末端伸長部（ＮＴＥ）、及び基質に結合して代謝回転を行うコアの３つの一次ドメインを含有する（図１４のパネルｃ）。ＥＲへの輸送及びシグナルペプチドのタンパク質分解による除去の後、「全長」野生型酵素（Ｈｓ−ＦＧＥ）はＮＴＥ及びコアの両方を含有する。ＮＴＥは、Ｃ５０及び／またはＣ５２とＥＲｐ４４との間のジスルフィド結合形成によるＥＲ保持を助長し得る。ＮＴＥとコアとの間の境界は、プロタンパク質転換酵素、例えばフーリン及びＰＡＣＥなどによるタンパク質分解切断部位である。ＦＧＥが分泌経路においてこれらの酵素に遭遇した場合、ＮＴＥが除去されて切断型コアが分泌され得る。インビトロにおいて、全長ＦＧＥは高濃度で凝集する傾向を有していたため、切断型コア（ｃＦＧＥ）を調製した。Ｈｓ−ｃＦＧＥの比活性（１，１４３ｐｋａｔ・ｍｇ−１、３３．３ｋＤ）は、ＮＴＥを含有するＨｓ−ＦＧＥ（８５０ｐｋａｔ・ｍｇ−１、３６．９ｋＤ）とほぼ同等であった。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたＳｃ−ＦＧＥは、昆虫細胞で発現されたヒト酵素と比較して著しく低い比活性（２１４ｐｋａｔ・ｍｇ−１）を有していた（図１４のパネルｄ）。したがって、実験により、両方の種からの良好な収率及び高純度での活性ＦＧＥの生成が示された。ＦＧＥが触媒作用を行う機構を調査するため、及びＦＧＥの活性を強化するために、さらなる実験を上記のように実施した。
場合により、ＦＧＥの活性は活性部位システイン残基の酸化還元状態ではなく銅補助因子の存在に依存していた。ＦＧＥが活性部位ジスルフィド残基の存在を必要とするのかどうか試験するために実験を行った。ＦＧＥの還元及び酸化形態を調製し、それらの比活性を測定した。
還元型活性部位Ｃｙｓ残基の形成は、過剰（１００モル当量）の強力な還元剤（ＤＴＴ）でＳｃ−ＦＧＥを１時間２５℃で前処理することによって達成し、その後、試薬をゲル濾過によって除去した。酸化型活性部位の形成は、過剰（１００モル当量）の（Ｌ）−デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）またはＣｕＳＯ４のいずれかで酵素を１時間２５℃で前処理することによって達成し、その後、試薬をゲル濾過によって除去した。ＤＨＡＡは化学量論的にジスルフィドを形成することができ、Ｃｕ２＋は急速かつ綺麗に溶存酸素でのジスルフィド形成を触媒することができる。これらの処理の後、標準的な速度論的アッセイを用いて各酵素の比活性を測定した。ＣｕＳＯ４での前処理のみ活性に何らかの著しい変化が得られた（図１５のパネルａ）。
銅の前処理及び除去がより活性なＦＧＥにつながったので、Ｓｃ−ＦＧＥを活性化することのできる銅の量を調査するために実験を行った。１、１０、または１００ｍｏｌ％のＣｕＳＯ４でのＦＧＥの処理により、化学量論量の銅が高度に活性な酵素を生成すると実証された（図１５のパネルｂ）。１モル当量未満では比例的に低い活性という結果となり、活性部位チオールの触媒活性化とは矛盾する観察結果であった。
銅を反応混合物に直接加えることによってＦＧＥ反応速度を高めることが可能であるかどうか判定するために実験を行った。データから、反応に銅を混入することによって生成物形成は著しく阻害されることが確認された（図１２のパネルｃ）。ＤＴＴの酸化形態の急速な形成（図１２のパネルｄ）、及び銅により触媒されたジスルフィド形成の結果としてのＣｓｕｂ−Ｃｓｕｂ（図１２のパネルｅ）が観察された。
１時間２５℃での５モル当量のＣｕＳＯ４とこれに続く過剰な銅の除去によって、Ｓｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ｃＦＧＥを効率的に活性化することができた。Ｓｃ−ＦＧＥの比活性は２１４±３４ｐｋａｔ・ｍｇ−１から３５７９±２１５ｐｋａｔ・ｍｇ−１まで１桁超増加し、Ｈｓ−ｃＦＧＥ比活性は１，１４３±８４ｐｋａｔ・ｍｇ−１から３，０５０±１１５ｐｋａｔ・ｍｇ−１まで３倍に増加した（図１５のパネルｃ）。銅で処理したＦＧＥが精製後にこの金属を含んでいるかどうか判定するために実験を行った。ＩＣＰ−ＭＳを用いて未活性化及び活性化ＦＧＥサンプルの両方における銅の量を測定した。Ｅ．ｃｏｌｉで産生したＳｃ−ＦＧＥは測定ノイズのレベルを超える銅をほとんど含んでいなかった。対照的に、Ｈｓ−ｃＦＧＥは、昆虫細胞から単離されたままの状態で、ＦＧＥ１ｍｏｌ当たり０．３５ｍｏｌのＣｕを含んでいた。銅で処理したＦＧＥの「活性化」形態は両方とも、ちょうど１ｍｏｌ Ｃｕ／ＦＧＥを超えるだけ含んでいた。さらに、これらの酵素調製物のそれぞれの比活性はＣｕ／ＦＧＥの比と相関しており、銅がＦＧＥの活性化形態の不可欠な構成要素であることを示していた（図１５のパネルｃ）。
次に、銅を反応混合物に直接加えることによってＦＧＥ反応速度を高めることが可能であるかどうかを考えた。データは、反応に銅を混入することによって生成物形成は著しく阻害されることを示していた。具体的には、ＤＴＴの酸化形態及びＣｓｕｂ−Ｃｓｕｂの非常に急速な形成が、銅によって触媒されたジスルフィド形成の結果として観察された（図１５のパネルｄ）。ｆＧｌｙ、Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂ及びＤＴＴＯＸのそれぞれにおける左から右までの縦棒は、０μＭ、５μＭ及び５０μＭのＣｕ２＋濃度に対応する。
ＦＧＥの活性化形態における触媒活性は活性部位ジスルフィドに依存しないことを確認するために、活性化した酵素への強力な還元剤の添加が得られる物質の比活性を減少させるかどうか判定するための実験を行った。活性部位ジスルフィドの完全性が代謝回転に重要であるならば、強力な還元剤はＦＧＥ代謝回転速度を減少させるはずであった。
Ｈｓ−ｃＦＧＥは、活性部位ジスルフィド（Ｃ３３６−Ｃ３４１）ならびにタンパク質の他の箇所の２つの構造的ジスルフィド（Ｃ３４６−Ｃ２３５及びＣ３６５−Ｃ２１８）を形成し得る（図１６のパネルａ）。２０ｍＭ ＤＴＴ（または２０ｍＭ ＴＣＥＰ、図示せず）でのＨｓ−ｃＦＧＥの処理によって、比活性が変化していないＦＧＥが生成された（図１６のパネルｂ）。関連するＣｙｓ残基がこの処理の結果として酸化還元状態を変化させたことを確認するために、ＬＣ−ＭＲＭ／ＭＳアッセイを用いて活性部位の溶液接触Ｃｙｓ残基を検出した。この方法で、Ｃ３４１及びＣ２３５含有ペプチドの両方を監視した。ＤＴＴでの処理によって、接触可能活性部位Ｃ３４１の割合が２８％から９３％に増加した。Ｃ２３５は、埋もれた構造的ジスルフィドに関与しており、ＤＴＴ処理にかかわらず接触不能（したがって、ジスルフィド状態）であった。まとめると、これらのデータから、還元処理はほぼ定量的に還元された活性部位チオールを生成し、他の構造的ジスルフィドを摂動させず、しかし、ＦＧＥの触媒活性に影響を及ぼさなかったことが確認された。
ＦＧＥが酵素当たり約１銅原子を含有していたことを観察した後、銅が触媒活性に必要であるかどうかを判定するために、この金属を除去する実験を行った。５モル当量のＥＤＴＡの添加によって銅を除去する試みでは、銅で処理されたＳｃ−ＦＧＥまたはＨｓ−ｃＦＧＥの触媒活性は変化しなかった（図１７のパネルａ）。しかし、ＫＣＮはＨｓ−ｃＦＧＥの活性をわずかな量減少させており、結合した銅に接触することができたことを示している。ＫＣＮでの前処理がＨｓ−ｃＦＧＥの活性をわずかに減少させたので、反応混合物中にＫＣＮを混入させることによってＦＧＥ代謝回転を阻害することができるかどうか試験するために実験を行った。図１７のパネルｂに示すように、Ｓｃ−ＦＧＥ（ＩＣ５０＝４８０μＭ）及びＨｓ−ｃＦＧＥ（８８μＭ）の両方における活性の濃度依存的阻害が観察された。銅アミンオキシダーゼの場合では、ジチオン酸ナトリウムであらかじめ還元した酵素からＫＣＮで銅を抽出することによって、アポ酵素が生成されている。同様に、このアプローチはＦＧＥでも成功した。還元剤及びキレート剤（１５ｍＭのＴＣＥＰ及びＥＤＴＡ）の両方で処理（１時間、３７℃）すると活性は著しく減少したが、各成分で個別に処理すると減少しなかった（図１７のパネルｄ）。
Ｓｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ｃＦＧＥ両方の標準酵素パラメータを求めるために実験を行った（図１８）。これらは２つの種の間で著しく異なっていた。Ｓｃ−ＦＧＥは基質とそれほど強く相互作用せず（ＫＭ＝９６μＭ）、比較的速いｋｃａｔ（１７．３ｍｉｎ−１）を示し、これらを合わせた結果、ｋｃａｔ／ＫＭ＝３．０×１０４Ｍ−１・ｓ−１のわずかな酵素効率となった（図１８のパネル１）。これに対して、Ｈｓ−ｃＦＧＥはより遅い触媒速度定数（ｋｃａｔ＝６．０６ｍｉｎ−１）で基質を代謝回転したが、基質ペプチドとの強力な相互作用を示した（ＫＭ＝０．３４μＭ）。まとめると、Ｈｓ−ｃＦＧＥ（ｋｃａｔ／ＫＭ＝３．０×１０６Ｍ−１・ｓ−１）は細菌の方よりも約１０倍効率が高かった。
このデータにより、細胞培養から単離したＦＧＥのわずかに活性な形態は、銅補助因子を欠いたアポ酵素、及び高度に活性であり、ペプチド基質上のＣｙｓをｆＧｌｙに効率的に変換するホロ酵素の混合物であることが実証された。フォールディングしたタンパク質基質に対する生物触媒反応においてＦＧＥホロ酵素を用いるための条件を開発するために実験を行った。
ＦＧＥは、フォールディングしたタンパク質上のＣｙｓからｆＧｌｙへのインビトロ変換のための効率的な生物触媒であった。アルデヒドタグ付きｍＡｂの生成にインビトロ変換を用いるために、以下の反応条件を試験した。ほとんどの基質で、５〜１０モル当量のＤＴＴが完全な変換を達成するのに十分であった。トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、リポ酸、及びビス（２−メルカプトエチル）スルホン（ＢＭＳ）でも代謝回転が可能であった。しかし、１モル当量の強力な還元剤（例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、リポ酸、またはＢＭＳ）の存在でさえｍＡｂ基質に存在するジスルフィドを切断することができた。基質のジスルフィド切断を回避するために、代わりの還元剤を反応に用いた。より弱い還元剤、例えばβＭＥまたはＧＳＨであれば抗体基質が耐性を示し、ＦＧＥ触媒作用も可能とした。しかし、環化還元剤（ＤＴＴ）から非環化還元剤（βＭＥ）に変更したことで、それまでは観察されなかった副生成物が生じた（以下で説明する）。副生成物形成を減少させ、生成物収率を増加させるために、酵素代謝回転における還元剤の役割（複数可）を確認するための実験を行った。
基質ペプチドに結合したＦＧＥ（アポ酵素）のＸ線結晶構造解析は、活性部位でジスルフィドによって共有結合したＣ３４１及びＣｓｕｂを示した。代謝回転の間にこのＣ３４１−Ｃｓｕｂジスルフィドによって基質が固定されるとすれば、外因性チオールがチオール−ジスルフィド交換によって酵素−基質複合体（Ｅ・Ｓ）と反応し、チオール−Ｃｓｕｂジスルフィドの形態で基質を遊離させることが可能であり得る。代謝回転の間にＦＧＥによって２つのオフ経路生成物が形成された。第１に、還元剤を反応に加えなかった場合、Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂ二量体形成が観察された。第２に、モノチオールを還元剤として加えた場合（例えばβＭＥ）、Ｃｓｕｂ−βＭＥジスルフィドの急速な生成が観察された（図１３のパネルａ）。酵素を欠いた対照反応では、Ｃｓｕｂ−ＣｓｕｂもＣｓｕｂ−βＭＥも生成されなかった。
Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂ及びＣｓｕｂ−βＭＥの形成を反応条件の関数として監視した。まず、反応中の還元剤の濃度を変化させ、反応が半分完了したときにクエンチした。［Ｃｓｕｂ］に対して低い［βＭＥ］では、Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂが支配的であった（図１９のパネルａ）。［βＭＥ］を増加させた結果、これに伴いＣｓｕｂ−Ｃｓｕｂが減少し、Ｃｓｕｂ−βＭＥが増加した。［βＭＥ］を増加させた結果、ｆＧｌｙのより高い収率も得られた。
反応が時間経過に伴って進行する際の［βＭＥ］の影響を確認するために実験を行った（図１３のパネルｂ）。上記のように、外因性還元剤の不在下では生成物は形成されなかったが、かなりの割合のＣｓｕｂ−Ｃｓｕｂが生成され（図１３のパネルｃ）、Ｃｓｕｂが代謝回転の間に還元剤の代わりに作用することができるが、生成物収率が犠牲となることを示していた。低い［βＭＥ］（０．２５ｍＭ、Ｃｓｕｂに対して２．５モル当量）では、初期には生成物形成に競合する速度でＣｓｕｂ−Ｃｓｕｂが増加したが（図１３のパネルｄ）、反応が進行するにつれて最大に達し、その後、徐々に減衰した。この［βＭＥ］では、Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂが消費され、Ｃｓｕｂ−βＭＥが急速に全ペプチドの１３％のプラトーに到達し、そこから変化しなかった。次のより高い［βＭＥ］（１０ｍＭ）での反応において、Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂの消費はより急速であった（図１３のパネルｅ）。さらに、低い［βＭＥ］とは対照的に、Ｃｓｕｂ−βＭＥはすぐに全基質の１０％に上昇したが、減衰も急速であった。すべての場合において、Ｃｓｕｂ−Ｃｓｕｂ及びＣｓｕｂ−βＭＥ両方の消費は、生成物形成の収率の増加と相関があった。代謝回転の間のジスルフィド生成は生成物形成と競合的であり、酵素の不在下では発生しなかったので、これらのデータから、ＦＧＥと基質との間のジスルフィド形成がＦＧＥ触媒サイクルの一部であることが確認された。
βＭＥとは対照的に、ＤＴＴを化学量論的還元剤として用いた場合、中間Ｃｓｕｂ−ＣｓｕｂもＣｓｕｂ−ＤＴＴも観察されなかった。これはおそらく、ＤＴＴは環化して分子内ジスルフィドを形成し、基質を遊離させることができるためであった。しかし、βＭＥ及びＤＴＴを用いた反応における生成物形成の速度は同じではなかった（図１９のパネルｂ）。具体的には、生成物形成の速度はβＭＥまたはＤＴＴの存在下でそれぞれ５．０７または３．２７ｍｉｎ−１であった。還元剤は基質及び酵素の両方に対して大過剰で存在したので、代謝回転の速度の制限に関与した可能性がある。
還元剤が１電子機構によって作用するならば、その相対反応速度はその還元電位に直接依存するはずである。
Ｅ０′（βＭＥ）＝−２０７ｍＶ及びＥ０′（ＤＴＴ）＝−３２３ｍＶ。そうではなく、還元剤がチオール−ジスルフィド交換によって作用するならば、それらの反応速度は、グルタチオンジスルフィドに対して測定したｋβＭＥ＝１及びｋＤＴＴ＝６×１０５のチオール−ジスルフィド交換速度定数と相関があるはずである。これらのシナリオのどちらからも、ＤＴＴの存在下で実施した反応はβＭＥの存在下で実施するよりも速い速度を有するはずであることが予測される。これに反して、ＤＴＴで実施した反応はβＭＥでのものよりも遅かったので、反応におけるチオールの役割はチオールの反応速度のみに依存し得ない。
上記の実験によって確認されたＥ・Ｓ中の共有結合性ジスルフィドが上記の反応速度の差の原因であり得る（図１９のパネルｃ）。この状態から、Ｅ・Ｓはｋｃａｔの速度定数で生成物へと進行することができるか、またはチオール−ジスルフィド交換によって、ｋＤＳの速度定数で外因性チオールと反応することができる。いかなる所与の還元剤についても、酸化還元化学ではなく基質遊離が律速している類似の銅依存型オキシダーゼの機構に基づくと、ｋｃａｔはおそらく同じであろう。しかし、ｋＤＳは溶液中の還元剤の素性及びそのチオール−ジスルフィド反応速度定数に直接依存し得る。換言すれば、Ｅ・Ｓはより強力な還元剤の存在下ではより速く解離し、生成物形成と競合するはずである。さらに、基質がすぐには減衰しないジスルフィド（βＭＥ−ＤＳのように）として遊離される場合、酵素と再び反応してＥ・Ｓを再生成し得る。したがって、より強力な還元剤はＥ・Ｓ複合体を解離することによって代謝回転を減速させるはずである。サイクルのこの側面は、ｐＨ７に対してｐＨ９で観察されたより速い代謝回転速度も説明し得る。チオール−ジスルフィド交換は塩基性条件下の方が速い。
アルデヒドタグはＮもしくはＣ末端または任意の溶媒接触可能な内部配列に導入することができる。ここで、ｍＡｂの３つの独立した領域において（図２０のパネルａ）、ならびに３つの独立したｍＡｂに対して広範囲の反応スケール（０．８〜２００ｍｇ）にわたって（図２０のパネルｂ、及び図２０のパネルｃ）、Ｈｓ−ｃＦＧＥによって高収率でＣｙｓがｆＧｌｙに変換された。いずれの場合においても、インビトロ変換収率は、ＬＣ−ＭＲＭ／ＭＳによって測定した際に＞９０％であった（図２１）。さらに、ｐＨ９の反応条件は、抗原結合親和性（図２２のパネルａ及び図２２のパネルｂ）、またはＦｃＲｎ結合及びインビボでのｍＡｂ循環に重要な残基であるＭｅｔ２５２の酸化（図２２のパネルｃ）に影響を及ぼさなかった。
考察
良好な収率でのＳｃ−ＦＧＥ及びＨｓ−ｃＦＧＥの組換え産生のための方法が本明細書に記載されている。さらに、両方のＦＧＥの速度論パラメータを測定する不連続ＨＰＬＣアッセイが記載されている。これらの結果は、Ｈｓ−ＦＧＥのＮ末端伸長部がインビトロでの触媒活性に必要ではなかったことを示していた。昆虫細胞培養から単離した場合、ヒト酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉで産生した場合のＳ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のＦＧＥの細菌形態よりも活性が著しく高かった。
ＦＧＥ代謝回転の機構を確認するために実験を行った。既存の機構仮説は、結晶構造解析によって明らかにされたＦＧＥ活性部位システイン残基の酸化還元状態に焦点を当てている。以前にＨｓ−ｃＦＧＥが単離された際に、Ｃ３３６（Ｓｃ−ＦＧＥではＣ２７２）及びＣ３４１（Ｃ２７７）が還元及び酸化形態の混合物である酵素中に存在した。Ｃ３３６及びＣ３４１の酸化状態は、溶液中で化学試薬を用いて操作して、Ｃ３３６−Ｃ３４１ジスルフィドを形成するか、またはＨ２Ｏ２でより長い時間をかけて両方の位置でスルホン酸を形成するかのいずれかにできる。さらに、Ｃ３３６Ｓ変異は、Ｃ３４１との分子間ジスルフィドとしてのＣｓｕｂの「捕捉」を可能とした。これにより、ＦＧＥはチオール−ジスルフィド交換を用いてＣｓｕｂを固定し、Ｃ３３６を活性化することが示された。この残基は次に、分子状酸素の活性化を行い、より高い酸化状態のＣｙｓ残基（スルフェン酸またはシステインパーオキシド）を形成し、続いて基質を酸化し得る。
ＦＧＥは、モノチオール還元剤が溶液中に存在した場合に、基質のＣｙｓにおけるジスルフィドの形成を触媒することができた。これにより、ＦＧＥはジスルフィドでＣｓｕｂに結合すること、及びｋｃａｔが溶液中の還元剤との反応速度よりも遅い場合、Ｃｓｕｂをジスルフィドとして遊離させることができることが示された。ジチオール試薬、例えばＤＴＴなどを用いた場合、ＤＴＴ環化によっていかなる分子間ジスルフィドもすぐに消失した。
ＦＧＥは銅を触媒作用の補助因子として取り込む。結果は、ＦＧＥの組換え発現からは、ほとんどの場合、アポ酵素が得られ、ｐＨ７で硫酸銅（ＩＩ）を添加することによってホロ酵素として再構成できることを示していた。ヒト及び細菌ＦＧＥ両方の触媒速度は化学量論量のＣｕ２＋による活性化で著しく増加し、代謝回転はＦＧＥ反応混合物へのシアン化物の添加によって阻害された。
このデータから、ＦＧＥは、２Ｈ＋／２ｅ−酸化を行い、分子状酸素を活性し、触媒サイクルを完了させるのに外因性還元剤を必要とする銅オキシダーゼであり得ることが示された。
上記のデータから、副生成物の形成は、［Ｅ・Ｓ］複合体が共有結合性ジスルフィド架橋を伴うことを示していた（図２３のステップａ）。還元剤は活性部位のＣｕ（Ｉ）状態を生成するように働くのであろうが（図２３のステップｂ）、これは基質を酸化できるばかりの状態である第二銅スーパーオキソＣｕ（ＩＩ）−Ｏ２ −として分子状酸素を結合させる（図２３のステップｃ）ための中間体である。その後、プロトン共役電子移動によって基質のシステイン側鎖が反応し得るが、水素原子移動の形態の可能性が最も高い（図２３のステップｄ）。酸化後、ジスルフィドラジカルはチオアルデヒド及びチイルラジカルに崩壊し得る（図２３のステップｅ）。１Ｈ＋／１ｅ−の第２当量は活性部位Ｃｙｓを再生成し、チオアルデヒドは急速に生成物ｆＧｌｙに加水分解するであろう（図２３のステップｆ及びステップｇ）。形式的には、Ｈ２Ｏ２が反応生成物として置き換わることによって酸化反応は完了するであろうが、第二銅パーオキシドＣｕ（ＩＩ）−ＯＯＨもさらなる還元を受けて副生成物としてＨ２Ｏのみを生成し得る。このとき、銅上の休止状態リガンドは水酸化物であり得るが、代替的な機構を介したＣ３４１の直接的な関与も可能であり得る。
上記のように、基質タンパク質中に存在する分子内ジスルフィドを破壊することのないｆＧｌｙの効率的な生成のために反応条件を開発した。ＦＧＥが良好な収率で生成され、インビトロでのアルデヒドタグ付きタンパク質の生成に生物触媒として用いられた。ＦＧＥでの反応は、質量で少なくとも３桁のスケールにわたって収率に大きな減少がなく、既存のジスルフィドを摂動させることなく、またはインビボでのｍＡｂ性能に重要な残基を修飾することなく進行した。
理解を明確にする目的で例証及び例示としてある程度詳細に上記の発明を記載したが、本発明の教示を踏まえて、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある程度の変更及び修正がなされ得ることが当業者にとって容易に明らかでる。
したがって、前述は本発明の原理を単に例示しているに過ぎない。当業者であれば、本明細書で明示的に記載または提示していないが、本発明の原理を具現化し、その精神及び範囲内に含まれている様々な翻案を考案することができると理解されよう。さらに、本明細書で述べたすべての例及び条件的文言は主として、本発明の原理及び当該技術分野を発展させるために本発明者らによって提供された概念に対する読者の理解を助けることを意図しており、そのような具体的に述べた例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。その上、本発明の原理、態様、及び実施形態、ならびにその具体例を説明する本明細書のすべての記述は、その構造的及び機能的両方の均等物を包含することを意図する。加えて、そのような均等物は、現在公知の均等物及び将来開発される均等物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす任意の開発された要素を含むことを意図する。したがって、本発明の範囲が本明細書に提示及び記載した例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲及び精神は添付の特許請求の範囲によって具現化される。

Claims (96)

  1. ホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法であって、
    ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質と活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を、前記活性化ＦＧＥが前記ＦＧＥ認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する条件下で組み合わせて、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質を生成することを含む前記方法。
  2. 前記組み合わせが
    ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）；及び
    前記ＦＧＥ認識部位を含む前記タンパク質
    を含む細胞を、前記ＦＧＥが前記ＦＧＥ認識部位の前記システイン残基または前記セリン残基を前記ホルミルグリシン残基に変換する細胞培養条件の下、Ｃｕ２＋を含む細胞培養培地中で培養すること
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｃｕ２＋が前記細胞培養培地中に１ｎＭ〜１０ｍＭの濃度で存在する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ｃｕ２＋が前記細胞培養培地中に１μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＦＧＥが前記細胞にとって内因性である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記細胞がＦＧＥを発現するように遺伝子改変されている、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. ＦＧＥ認識部位を含有する前記タンパク質が前記細胞にとって内因性である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記細胞がＦＧＥ認識部位を含む前記タンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記細胞が真核細胞である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記真核細胞が酵母細胞である、請求項９に記載の方法。
  14. 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項９に記載の方法。
  15. 前記組み合わせが、Ｃｕ２＋を含む無細胞反応混合物中で、前記ＦＧＥが前記ＦＧＥ認識部位の前記システイン残基または前記セリン残基を前記ホルミルグリシン残基に変換する条件の下、ＦＧＥ及び前記ＦＧＥ認識部位を含む前記タンパク質を発現させることを含む、請求項１に記載の方法。
  16. 還元剤を含む反応混合物中で前記活性化ＦＧＥ及び前記ＦＧＥ認識部位を含む前記タンパク質を組み合わせる、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記還元剤が前記ＦＧＥ認識部位の前記システイン残基または前記セリン残基の前記ホルミルグリシン残基への変換を促進する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記還元剤が２−メルカプトエタノールである、請求項１７に記載の方法。
  19. 無細胞反応混合物中で前記活性化ＦＧＥ及び前記ＦＧＥ認識部位を含む前記タンパク質を組み合わせる、請求項１に記載の方法。
  20. 前記ＦＧＥ認識部位を含む前記タンパク質と前記活性化ＦＧＥを組み合わせる前に、Ｃｕ２＋でＦＧＥを活性化することを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 元素状酸素が最終酸化剤として存在する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記元素状酸素が酸素、酸素及び硫化水素の混合物、または塩基性条件下の酸素によってもたらされる、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記元素状酸素がＣｕ２＋によって触媒される反応における最終酸化剤である、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記Ｃｕ２＋が硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、及びベネディクト試薬から選択されるＣｕ２＋源によってもたらされる、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記Ｃｕ２＋源が硫酸銅である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ＦＧＥがＮ末端切断型ＦＧＥである、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＦＧＥがＮ末端切断型ヒトＦＧＥである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記タンパク質が抗体、抗体断片、リガンド、酵素、または抗原である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記抗体または抗体断片が、ＩｇＧまたはその断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、二重特異性抗体またはその断片、ダイアボディまたはその断片、キメラ抗体またはその断片、モノクローナル抗体またはその断片、ヒト化抗体またはその断片、及び完全ヒト抗体またはその断片からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記抗体が腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原に特異的に結合する、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
  32. 前記腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原がＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ６６／ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８、ネクチン―４、メソテリン、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ６、及びＣＡ−ＩＸからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記タンパク質がリガンドである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記リガンドが成長因子である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記リガンドがホルモンである、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記ホルミルグリシン残基を含む前記タンパク質に前記ホルミルグリシン残基のアルデヒド部分を介して作用物質を結合させることをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記作用物質が治療薬である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記治療薬が、細胞傷害剤、抗増殖剤、抗新生物剤、抗生物質剤、抗真菌剤、及び抗ウイルス剤からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記作用物質が造影剤である、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記造影剤が、蛍光色素、近赤外（ＮＩＲ）造影剤、及び単光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴ造影剤、核磁気共鳴（ＮＭＲ）造影剤、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）剤、陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）剤、Ｘ線造影剤、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）造影剤、Ｋエッジ造影剤、超音波造影剤、光音響造影剤、音響光学造影剤、マイクロ波造影剤、核造影剤、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
  41. Ｃｕ２＋を含む細胞培養培地；及び
    前記細胞培養培地中に存在する細胞
    を含む組成物であって、前記細胞がホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を発現する組成物。
  42. 前記Ｃｕ２＋が前記細胞培養培地中に０．１μＭ〜１０ｍＭの濃度で存在する、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記Ｃｕ２＋が前記細胞培養培地中に１μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記ＦＧＥが前記細胞にとって内因性である、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
  45. 前記細胞がＦＧＥを発現するように遺伝子改変されている、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
  46. 前記細胞がＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項４１〜４５の１項に記載の組成物。
  47. 前記細胞が真核細胞である、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
  48. 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞からなる群から選択される、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記真核細胞が酵母細胞である、請求項４７に記載の組成物。
  51. 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項４７に記載の組成物。
  52. 前記細胞が原核細胞である、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
  53. Ｃｕ２＋を含む細胞培養培地中でホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）をコードする核酸を含む細胞を培養することを含む方法であって、前記培養を前記ＦＧＥが前記細胞内で発現される条件の下で行う方法。
  54. 前記Ｃｕ２＋が前記細胞培養培地中に０．１μＭ〜１０ｍＭの濃度で存在する、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記Ｃｕ２＋が前記細胞培養培地中に１μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記ＦＧＥが前記細胞にとって内因性である、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記細胞がＦＧＥを発現するように遺伝子改変されている、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記細胞がＦＧＥ認識部位を含むタンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記細胞が真核細胞である、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記真核細胞が酵母細胞である、請求項５９に記載の方法。
  63. 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項５９に記載の方法。
  64. 前記細胞が原核細胞である、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  65. ＦＧＥをＣｕ２＋で処理して活性化ＦＧＥを生成することを含む、活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の生成方法。
  66. Ｃｕ２＋での前記ＦＧＥの処理が、Ｃｕ２＋を含む細胞培養培地中で前記ＦＧＥをコードする核酸を含む細胞を培養することを含み、前記培養を前記ＦＧＥが前記細胞内で発現される条件の下で行う、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記Ｃｕ２＋が前記細胞培養培地中に０．１μＭ〜１０ｍＭの濃度で存在する、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記Ｃｕ２＋が前記細胞培養培地中に１μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記ＦＧＥが前記細胞にとって内因性である、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記細胞がＦＧＥを発現するように遺伝子改変されている、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記細胞が真核細胞である、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＰＣ１２細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、及びＳｐ−２／０細胞からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記真核細胞が酵母細胞である、請求項７１に記載の方法。
  75. 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項７１に記載の方法。
  76. 前記細胞が原核細胞である、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記細胞から前記ＦＧＥを精製することをさらに含む、請求項６６〜７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記ＦＧＥの処理がＣｕ２＋を含む無細胞反応混合物中で前記ＦＧＥを発現させることを含む、請求項６５に記載の方法。
  79. 無細胞反応混合物中で前記ＦＧＥをＣｕ２＋で処理する、請求項６５に記載の方法。
  80. 元素状酸素が最終酸化剤として存在する、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記元素状酸素が酸素、酸素及び硫化水素の混合物、または塩基性条件下の酸素によってもたらされる、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記元素状酸素がＣｕ２＋によって触媒される反応における最終酸化剤である、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記Ｃｕ２＋がｌ硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、及びベネディクト試薬からなる群から選択されるＣｕ２＋源によってもたらされる、請求項７９〜８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記ＦＧＥがＮ末端切断型ＦＧＥである、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記ＦＧＥがＮ末端切断型ヒトＦＧＥである、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記Ｃｕ２＋から前記ＦＧＥを精製することをさらに含む、請求項６５〜８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 請求項６５〜８６のいずれか１項に記載の方法によって生成される活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）。
  88. 活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）；及び
    バッファー
    を含む無細胞組成物。
  89. ＦＧＥ認識部位を含むタンパク質をさらに含む、請求項８４に記載の組成物。
  90. 前記ＦＧＥがＮ末端切断型ＦＧＥである、請求項８８または請求項８９に記載の組成物。
  91. 前記ＦＧＥがＮ末端切断型ヒトＦＧＥである、請求項９０に記載の組成物。
  92. 活性化ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）；及び
    タンパク質のＦＧＥ認識部位中に存在するシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換するための前記活性化ＦＧＥの使用説明書
    を含むキット。
  93. 前記ＦＧＥがＮ末端切断型ＦＧＥである、請求項９２に記載のキット。
  94. 前記ＦＧＥがＮ末端切断型ヒトＦＧＥである、請求項９３に記載のキット。
  95. ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）をコードする核酸；及び
    Ｃｕ２＋またはＣｕ２＋源
    を含むキット。
  96. 前記核酸によってコードされる前記ＦＧＥを発現させるのに適した細胞をさらに含む、請求項８７に記載のキット。
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