JP2018512043A - 活性化ホルミルグリシン生成酵素ならびにその生成方法及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年2月5日に出願された米国仮特許出願第62/112,422号、及び2015年3月17日に出願された米国仮特許出願第62/134,461号の利益を主張し、これらの出願全体を参照により本明細書に援用する。
部位特異的タンパク質結合によって治療用タンパク質の特性を強化することができる。1つ以上の遺伝的にコードされるアルデヒド基を介して、哺乳類細胞内で発現される組換えタンパク質を部位特異的に修飾することができる。例えば、小胞体(ER)内在性ホルミルグリシン生成酵素(FGE)によって認識されるペプチド配列は、わずか5残基の短さとすることができ、哺乳類細胞内で発現される異種タンパク質中に遺伝的にコードされ得る。FGEは、FGE認識部位のシステインまたはセリン残基をホルミルグリシン残基へと共翻訳的に変換し、それによって唯一のアルデヒド基を有するタンパク質を生成する。このアルデヒド基は、タンパク質への目的の作用物質(例えば治療薬、造影剤など)の部位特異的結合に利用され得る。
本開示の態様は、活性化ホルミルグリシン生成酵素(FGE)の作製方法、及び目的のタンパク質中のFGE認識配列におけるアミノ酸の変換によってホルミルグリシン含有タンパク質を生成するための活性化FGEの使用方法を含む。活性化FGEならびに1つ以上のFGE認識配列及び/または1つ以上のホルミルグリシン残基を含む目的のタンパク質を含む組成物も提供する。
本明細書で用いる場合、「ホルミルグリシン生成酵素」(または「FGE」)は、スルファターゼモチーフ(または「FGE認識部位」)中のシステインまたはセリンを2−ホルミルグリシン(FGly)残基(本明細書においてホルミルグリシン残基とも呼ぶ)に酸化する酵素である。したがって、「FGE」は本明細書において、FGE認識部位のシステイン(「Cys」もしくは「C」)のFGlyへの変換を媒介するFGly生成酵素として作用することができるか、またはFGE認識部位のセリン(「Ser」もしくは「S」)のFGlyへの変換を媒介することのできる任意の酵素のことをいうために用いる。FGE認識部位へのFGEの作用との関連で用いる場合の「変換」は、FGE認識部位中のシステインまたはセリン残基のホルミルグリシン(FGly)残基への生化学的修飾(例えばCysからFGly、またはSerからFGly)のことをいう。FGEによってFGlyを含有するように修飾されたFGE認識部位を本明細書では「変換FGE認識部位」と呼ぶ場合もある。
表4:例示的な全長ヒトFGE(非下線部及び下線部のアミノ酸)ならびに例示的な切断型ヒトFGE(下線部のみ)
タンパク質のFGE認識部位(本明細書では「スルファターゼモチーフ」とも呼ぶ)は様々であり得る。最小認識部位は通常5または6アミノ酸残基長、通常6アミノ酸残基長以下である。タンパク質中に与えられる認識部位全体は少なくとも5または6アミノ酸残基であり、例えば、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7または6アミノ酸残基長未満のFGE認識部位を定めるように、5〜16、6〜16、5〜15、6〜15、5〜14、6〜14、5〜13、6〜13、5〜12、6〜12、5〜11、6〜11、5〜10、6〜10、5〜9、6〜9、5〜8、または6〜8アミノ酸残基長とすることができる。ある実施形態において、タンパク質のFGE認識部位を次の式で記述する。
X1Z1X2Z2X3Z3 (I)
FGE認識部位を含むタンパク質は目的の任意のタンパク質であってよく、目的の作用物質、例えば治療薬、造影剤などを結合させるのに望ましいタンパク質を含む。目的のタンパク質としては、自然発生アミノ酸配列を有するもの、N末端メチオニンを有する天然アミノ酸配列、自然発生タンパク質の断片、ならびに非自然発生タンパク質及びその断片が挙げられる。いくつかの実施形態において、タンパク質はスルファターゼもしくはその断片以外、レポータータンパク質以外、またはプレプロラクチンもしくはプロラクチン以外のタンパク質である。
本開示は、活性化FGEの生成方法を提供する。本明細書で用いる場合、「活性化ホルミルグリシン生成酵素」または「活性化FGE」は、FGEを発現する細胞への酸化試薬の添加によって、及び/または単離したFGEへの酸化試薬の添加によって、酸化試薬で処理されたFGEのことをいう。したがって、ある態様において、本開示は、FGEを酸化試薬で処理して活性化FGEを生成することを含む活性化FGEの生成方法を提供する。「酸化試薬」はFGEを酸化可能な試薬(「酸化剤と呼ばれることもある」)、FGEの酸化を触媒可能な試薬、またはこれらの組合せを意味する。FGEの酸化を触媒可能な試薬の一例はCu2+である。FGEを酸化可能な試薬及びFGEの酸化を触媒する試薬を含む酸化試薬の一例は、最終酸化剤としての元素状酸素及び遷移金属、例えば、限定はしないがCu2+などを含む試薬である。これらの及び他の好適な酸化試薬を以下に記載する。
本開示の活性化FGEは、例えば、目的のタンパク質(または「標的タンパク質」)中のFGE認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換することが望ましい様々なインビボ及びインビトロ用途において有用である。ホルミルグリシン残基のアルデヒド基は、例えば目的の作用物質(例えば治療薬、造影剤など)を標的タンパク質に部位特異的に結合させるのに有用である。したがって、本開示は活性化FGEの使用方法を提供する。
ホルミルグリシン残基を含むタンパク質は、インビボタンパク質合成及び変換方法の一部として宿主細胞内で生成され得る。ある実施形態において、活性化FGEとFGE認識部位を含むタンパク質との組み合わせは、FGE及びFGE認識部位を含むタンパク質を含む細胞を培養することを含む。培養は、FGEがFGE認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する細胞培養条件の下、酸化試薬としてCu2+を含む細胞培養培地中で行う。ある態様では、細胞はFGE及びFGE認識部位を含むタンパク質をコードする核酸を含み、そのためFGE及びFGE認識部位を含むタンパク質が細胞内で共発現される。
ホルミルグリシン残基を含むタンパク質は、インビトロ無細胞タンパク質合成及び変換方法の一部として生成され得る。ある態様において、この方法は、酸化試薬(例えばCu2+)を含む無細胞反応混合物中で、FGEがFGE認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する条件の下、FGE及びFGE認識部位を含むタンパク質を発現させることを含む。こうした態様において、無細胞反応混合物は、FGE及びFGE認識部位を含むタンパク質が細胞内ではなく、インビトロタンパク質合成に適した反応混合物中で発現されるものである。例示的な無細胞反応混合物としては、FGE及びFGE認識部位を含むタンパク質の合成用の核酸テンプレートを伴う無細胞抽出物、細胞ライセート、及び再構成翻訳系が挙げられるが、これらに限定されない。無細胞反応混合物の成分は、活性化FGEを生成するためのインビトロ無細胞タンパク質合成方法に関して前述した通りであり得る。
ホルミルグリシン残基を含むタンパク質は、無細胞反応混合物中で活性化FGE及びFGE認識部位を含むタンパク質を組み合わせるインビトロ変換方法の一部として生成され得る。こうした実施形態において、FGE及びFGE認識部位を含むタンパク質は無細胞反応混合物中で発現されない。そのような方法は、FGEを発現させ(例えば細胞内または無細胞翻訳系で)、FGEを精製し、その後、インビトロでFGEを酸化試薬により処理して活性化FGEを生成することに基づく。そのようなインビトロ活性化FGEは、非活性化FGEによるそれ以外は同一の条件下での変換に比べて高い効率で、FGE認識部位を含むタンパク質のFGE認識部位中のシステインまたはセリン残基を変換する(下記の実施例の節を参照)。
本開示は、ある態様において本開示の方法の実施に有用な組成物である組成物を提供する。
本開示の態様はキットをさらに含む。本開示のある実施形態に従うキットは本開示の方法の実施において有用である。
マイクロピペット(毎年較正):ResearchPlus 2.5、10、20、100、200、1000(Eppendorf);セロロジカルピペット:Pipettor Plus(Omega);天秤(毎月較正):XS4001S、NewClassic MF(ML204)、AT200(Mettler Toledo);pH測定(毎月較正):SevenCompact(Mettler Toledo)、InLab Expert Pro電極(Mettler Toledo)、Orion Standards(Thermo Scientific);SDS−PAGE:PowerPac Basic(Bio−Rad)、Mini−PROTEAN(登録商標) Tetra System(Bio−Rad);PAGEゲルイメージング:Image Quant LAS 4000(GE Healthcare);ウェルプレートウォッシャー:ELx405(BioTek);ウェルプレートリーダー:SpectraMax M5(Molecular Devices);遠心分離機:Sorvall RC 6 Plus(Thermo Scientific)、5415 R及び5810 R(Eppendorf);反応混合機:Thermomixer R(Eppendorf)、ボルテクサー:vortex genie 2(Scientific Industries);振とう機:Lab Companion SI−600R(JEIO Tech Co. Ltd.)、振とう培養機(Shel Labs);PCRサイクラー:Mastercycler Pro(Eppendorf);滅菌:Hiclave(Hirayama)。
NanoDrop(商標)2000(Thermo Scientific)分光光度計で製造業者が提供するソフトウェアにより、またはVISIONlite(商標)ソフトウェアで制御されたGENESYS(商標)10S分光光度計(Thermo Scientific)でUV及び可視吸収スペクトルを記録した。分光計は測光精度のためにNISTトレーサブルな二クロム酸カリウム標準液で較正した(Starna Scientific及びThermo Scientific)。
Agilent OpenLAB CDS Chemstation Editionで制御された1100/1200シリーズ計測器(Agilent Technologies)で逆相高性能液体クロマトグラフィーを実施した。この計測器はインライン溶媒デガッサー、分析用クォータナリーポンプ、バイアルオートサンプラー、サーモスタット付カラムコンパートメント、及びダイオードアレイ検出器を含んでいた。Aeris(商標)コアシェル250×2.1mm XB−C18 Wideporeカラム(Phenomenex, Inc.)でクロマトグラフィーを達成した。Chemstation(Agilent)で曲線下面積(AUC)を計算した。
インライン溶媒デガッサー、分析用バイナリーポンプ、及びサーモスタット付バイアル/ウェルプレートオートサンプラーを含む1100シリーズHPLC(Agilent Technologies)と併せた4000 QTRAP(登録商標)質量分析計(AB Sciex)で質量分析データを収集した。クロマトグラフィーは、PST−CHCコントローラ(Phoenix S&T)で65℃に設定したバタフライカラムヒーターに包まれたJupiter(商標)150×1.0mm C18カラム(Phenomenex, Inc.)で達成した。LC−MRM(多重反応モニタリング)/MSトランジション質量の計算及び得られたデータの積分はSkyline 2.6で実施した。
UPC−900、P−900及びFrac−950モジュールからなるGE Healthcare Aktaタンパク質精製システムで高速性能液体クロマトグラフィーを実施した。HisTrap(登録商標)Excel 5mLカラム(GE Healthcare)でニッケルアフィニティークロマトグラフィーを実施した。使い捨てのSephadex(登録商標)G−25カラム(GE Healthcare)でゲル濾過を手動で実施した。
Catalentの分析サービスの中核的研究拠点(Morrisville, NC)によって誘導結合プラズモン質量分析(ICP−MS)が実施された。酵素原液の280nm吸収強度から測定したタンパク質濃度を基準としたモル比として銅及びカルシウムの比を計算した(表3)。
表3.FGE調製物はICP−MSによって測定した場合に銅及びカルシウムの両方を含有する。
1μg/mLのHisタグ付きCD22(Sino Biological 11958−H08H)によってPBS中1μg/mLで16時間、4℃にてELISAプレート(Maxisorp)をコーティングした。次に、プレートをPBS 0.1% Tween−20(PBS−T)で4回洗浄し、その後、200μLのELISAブロッカー(Thermo)でブロッキングした。第2プレートで、ELISAブロッカー中に20μg/mLとする競合抗体の原液の段階3倍希釈(50μL+100μL)から11点標準曲線を作成した。次に、ビオチンタグ付きCD22(10ng/mLで100μL)をウェルのすべてに添加した。最後に、競合剤及びビオチンタグ付きCD22の混合物をコーティングしたELISAプレートに移し(100μL/ウェル)、室温で1〜2時間、振とうさせながらインキュベートした。ビオチンタグ付きCD22の最終濃度は5ng/mLであり、競合剤の最高濃度は10μg/mLであった。プレートをPBS−Tで4回洗浄し、その後、ストレプトアビジン−HRP(Thermo 21130)の1:10,000希釈液(ブロッキングバッファー中)の100μLを加え、室温で振とうさせながら1〜2時間プレートをインキュベートした。次に、プレートをPBS−Tで4回洗浄し、1−Step Ultra TMB(100μL/ウェル、Pierce #34038)で発色させた。50μlの2M硫酸で反応をクエンチし、450nmで吸光度を測定した。非線形回帰によってEC50値を求めた。
棒グラフで示した場合の不確かな測定値は、以下の式を用いてサンプルサイズ(n)が3以上の平均値の標準誤差から計算した95%信頼区間を表す。
式中、sはn個のサンプルで測定された標準偏差である。酵素速度論パラメータについて報告する誤差は、活性データのミカエリス・メンテン式への非線形回帰中に見出される最小二乗和から計算される誤差の推定値を表す。
式中、Etは溶液中の全酵素であり、kcat及びKMはSTRENDA委員会によって規定された標準酵素パラメータである。酵素比活性の単位はカタールであり、1kat=1mol・s−1である。速度論パラメータは、GraphPad prismを用いた[基質]対初期速度の非線形回帰から求めた。
すべての計測器データ収集ワークステーションは、Microsoft Windows OS及び製造業者によって提供された計測器制御ソフトウェアを実行しているPCで操作した。データ解析は、MS windowsを実行するPCまたはOS X 10.10を用いるApple iMacのいずれかで実施した。線形及び非線形回帰はGraphPad Prism 6.0eを用いて実施した。HPLCクロマトグラムの積分はOpenLAB CDS Chemstation Editionを用いて実施した。LC−MRM/MSトランジション質量の計算及び得られたデータの積分はSkyline 2.6(MacCoss Lab, University of Washington)で実施した。統計計算はMicrosoft Excelで実施した。グラフ及び図はAdobe Creative Suiteで作成した。タンパク質結晶構造のレンダリングはオープンソースのPyMOL 1.7で実施した。
試薬、材料、化学物質、及び略号
すべての水は脱イオン化されており(18MΩ)、Milli−Q Integral 5システム(EMD Millipore)から得た。市販の化学物質は試薬グレード(またはこれより高く、その場合表示する)であった。化学物質及び材料の供給元は以下の通りであった:Sigma−Aldrich―β−メルカプトエタノール(βME)、トリフルオロ酢酸(TFA)、メトキシルアミン水和物、硫酸銅(II)五水和物、硫酸ストレプトマイシン、ヨードアセトアミド(IAA);Acros―ギ酸、トリエタノールアミン(TEAM)、ジチオスレイトール(DTT)、グリセロール、グルコース、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム;Fisher Scientific―イミダゾール、チルプトン(tyrptone)、酵母エキス、塩化ナトリウム;Honeywell Burdick & Jackson―アセトニトリル+0.1% TFA(HPLCグレード)、アセトニトリル+0.1% ギ酸(HPLCグレード);Thermo Scientific―トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、PageRuler Plusタンパク質スタンダード;Bio−Rad Laboratories―10Xタンパク質アッセイ;IBI scientific―イソプロピルチオガラクトシド(IPTG);Amresco―アンピシリンナトリウム塩(USP);Roche diagnostics―cOmplete−mini EDTA不含プロテアーゼインヒビターカクテル;EMD Millipore―BugBuster(登録商標)Master Mix;Invitrogen―ウルトラコンピテントE. coli BL21(DE3)細胞。
抗体生成のために、GPEx技術を用いて抗体発現細胞のバルク安定プールを生成した。プロテインAクロマトグラフィー(MabSelect、GE Healthcare Life Sciences)を用いて抗体を馴化培地から精製した。
すべてのペプチド合成は固相上で行い、≧95%に精製した。
Sc−FGE―UniProt受託番号:Q9F3C7;PDB 2Q17。
FGE及びFGE認識部位を含むタンパク質を発現する哺乳類細胞の細胞培養培地中のCu2+(硫酸銅)の存在による変換への影響を調査した。組換えヒトFGE及びFGE認識配列LCTPSRを含む組換えαHER2 mAb(同一細胞における重鎖及び軽鎖)を発現するCHO細胞を、CellBoost4フィード、Efficient Feed C、ならびにグルコース及び/またはガラクトースを補添したEfficient Feed Cを含むFortiCHO培地で培養した。FortiCHO培地(Life Technologies)、CellBoost4フィード(Thermo Scientific)及びEfficient Feed C(Life Technologies)。
銅は乳酸消費の潜在的な刺激因子であるので、他の潜在的な乳酸消費の刺激因子の、標的タンパク質中のFGE認識部位がFGlyを含むようになる変換の効率を増加させるためのFGEを活性化させる能力を調査した。
選択した部位にホルミルグリシン残基を有する抗体を生成するために、293 Expi一過性共形質移入系(Life Technologies)を用いた。この系では不定な変換率(10〜95%)とともに高い抗体力価(100〜500mg/L)が得られた。培養培地中にCu2+を添加することでこの系の変動性を減少させることができるかどうか判定するために、CT−1.1タグ付きHer2の形質移入の直前または形質移入の翌日に50μMの硫酸銅を添加した。3つの独立した実験において、形質移入前に50μMの硫酸銅で処理した、または処理していないExpi 293Fに、N末端KDELアミノ酸配列を含む(+KDEL)全長ヒトFGE及びCTタグ付き抗体の発現プラスミドを抗体:FGE DNAが3:1の比で一過的に共形質移入した。形質移入の5〜6日後に培養物を採取し、ELISAによって力価を評価し、タンパク質を精製して質量分析によって変換を測定した。
ヒトFGEの+KDEL形態の変換効率の変動性はCu2+の添加によって減少され得る。上記の実施例3において記載したのと同じ実験条件を用いて、ヒトFGEの非KDEL形態の変換効率の変動性を減少させるCu2+の能力を確認するために実験を行った。形質移入前に50μMの硫酸銅で処理した、または処理していないExpi 293F細胞に、様々な形態のヒトFGE(+KDEL、WT、myc−His)及びCTタグ付き抗体の発現プラスミドを抗体:FGE DNAが3:1の比で一過的に共形質移入した。形質移入の5日後に培養物を採取し、ELISAによって力価を評価し、タンパク質を精製して質量分析によって変換を測定した。
表2
Cu2+と比較した、酸化的リン酸化の刺激因子及びインヒビターによるヒトFGEの変換効率への影響を確認するために実験を行った。
硫化水素(H2S)はFGE触媒サイクルの推定上の副生成物である。硫化物キノンレダクターゼ(SQR)はH2Sを酸化して解毒するミトコンドリア酵素である。流加培養の間のH2S蓄積がヒトFGE活性を阻害するかどうか、及びCu2+がこの影響を打ち消すかどうか判定するために実験を行った。
Cu2+処理細胞で観察される変換の向上がFGE酵素の比活性の増加に起因するかどうか判定するために、Expi細胞をCu2+処理及び未処理とし、ヒトFGE−mycHis(pRW529)で形質移入した。FGEをニッケルクロマトグラフィーによって精製し、比活性について試験したところ、Cu2+処理細胞から単離したFGEは一貫して著しく高い活性を示した。実験条件は上記の実施例3と同じであった。比活性は下記の実施例9に記載のように測定した。
原核細胞でのCu2+のFGEを活性化して変換を向上させる能力を調査した。S. coelicolor(「Sc」)FGE及びFGE認識部位を含むタンパク質を共発現するE.coli細胞をCu2+の存在または不在下で培養した。図4に示すように、Cu2+の不在下で培養した細胞と比較して、Cu2+で処理した細胞では変換が向上した。
本実施例は、FGEがCuSO4での処理によってインビトロで活性化され、未処理/非活性化FGEと比較して高い比活性を有する被処理/活性化FGEが得られ得ることを実証する。
S. coelicolor(Sc)FGEの増強組換え発現及び精製を実施した。N末端ヘキサヒスチジンタグ及びTEVプロテアーゼ切断部位を有する野生型Sc−FGEをコードするpET151−D/TOPOベクターを、42℃の熱ショックによってLB培地中のウルトラコンピテントE.coli BL21(DE3)細胞に形質転換した。アンピシリン選択下37℃でLB/アガロース上に播種して一晩成長させた後、単独コロニーをテリフィックブロス(TB)中で125mLまで増幅させた。ODが0.4〜0.5の時点で、IPTGを1mMになるまで加えた。培養フラスコを18℃に冷却し、200RPMで16時間振とうさせた。6,000rcf、20分間で細胞を収集した。細胞を溶解バッファー(25mM トリエタノールアミン、50mM NaCl、プロテアーゼインヒビター、pH8.0)に再懸濁し、BugBuster(登録商標)溶解試薬で溶解した。25,000rcfで25分間の遠心分離によって溶液を清澄化した。1%w/vの最終濃度となるまで上清を硫酸ストレプトマイシン溶液中に希釈することによって残りのDNAを沈殿させた。溶液を4℃で15分間撹拌してから、25,000RPMで25分間遠心分離にかけた。上清をNi−NTAセファロースFFカラムに添加し、自然流下で溶出した。5CVの洗浄バッファー(25mMトリエタノールアミン、250mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8)で洗浄することによって、非特異的結合タンパク質を除去した。精製タンパク質は溶出バッファー(25mMトリエタノールアミン、250mM NaCl、300mMイミダゾール、pH8)で単離した。タンパク質を含有する画分(ブラッドフォードアッセイによって判断)をプールし、保存バッファー(25mMトリエタノールアミン、50mM NaCl、8%v/vグリセロール、pH7.4)で平衡化したSephadex(登録商標)G−25カラム(PD−10、GE Healthcare)に添加した。そして、保存バッファーでタンパク質を溶出し、10kD Amicon(登録商標)限外濾過膜(Millipore, Inc.)で濃縮し、77Kで瞬間冷凍した。単離酵素の典型的な収量:50〜75mg/L培地。SDS−PAGE電気泳動(10%ゲル、Bio−Rad, Inc.)、逆相HPLC、インタクトな球状タンパク質のLCMS、酵素のトリプシン消化物のLCMS、UV−Vis吸収分光測定、比活性(以下に記載)によって精製酵素を特徴付けした。
不連続酵素活性アッセイを用いてFGEの比活性を測定した。FGEの基質はコンセンサス配列を含有する14アミノ酸のペプチド(H2N−ALCTPSRGSLFTGR−COOH)であった。逆相HPLCにおける出発物質(Cys)及び生成物(fGly)含有ペプチドの215nmのピーク面積を積分することによって、反応速度を求めた。生成物(及び副生成物)ピークの同一性はRP−HPLC MS/MSによって確認した。各反応水溶液(60μL)は基質ペプチド(100μM)、FGE(1μM)、DTT(1mM)、及びバッファー(25mMトリエタノールアミン、pH9)を含有していた。1回の時間経過で2分ごとに5つの時点でデータを収集した。FGE原液を添加して3秒間ボルテックスした時点で反応開始とした。各時点において、マイクロピペットにより手動で反応混合物の10μLを1μLの1M HCl中に希釈することによってクエンチした。反応の完了後、RP−HPLCによって各時点について分析した。
基質、生成物、及びFGE基質ペプチドALCTPSRGSLFTGRの副生成物を、0.1% TFAを含有する18% MeCN水溶液のアイソクラティックによる7分間のRP−HPLCで分離した。基質のfGly(2.1分)、Cys(3.3分)、βME−DS(3.6分)、及びCys−DS(6.2分)形態の積分した面積を用いて合計面積及びそれぞれの分率を計算した。
緩衝水溶液(25mMトリエタノールアミン、pH7.4、50mM NaCl)中のホルミルグリシン生成酵素(S.coelicolor、50μM)の溶液に硫酸銅(II)(100μM)を加えた。1500RPMで1時間25℃にて混合物をボルテックスした。その後、Sephadex(登録商標)樹脂(製造業者の指示に従うGE healthcare PD−10カラム)を用いた25mMトリエタノールアミン、pH7.4、50mM NaClへのバッファー交換によって、反応混合物からタンパク質を取り出した。交換後、本明細書に記載の標準的な活性アッセイを用いてFGEの比活性を測定した。
インビトロ活性化実験の結果は図6に示してあり、Cu2+源としてのCuSO4で処理したFGE及び未処理FGEの比活性のグラフを示す。この実施例における被処理FGEの比活性の増加に示されるように、Cu2+での処理の結果としてFGEが活性化された。
H.sapiens FGEの触媒「コア」とこれに続く精製のためのC末端His6タグ(Hs−cFGE)をコードするDNAを、PCRによって先行のコンストラクト(Rabuka,et al.,Nat.Protocols.,(2012), 7,1052−1067を参照)から増幅した。Hs−cFGE配列及びプライマーを以下に挙げる。Hs−cFGEコードバキュロウイルスの調製はBac−to−Bacバキュロウイルス発現系(Invitrogen)を用いて行った。
Bac−to−Bac発現系でのHs−cFGEのクローニングに用いたプライマー。
フォワード:GAGGCTAACGCTCCGGGCCC
リバース:GTCCATAGTGGGCAGGCGGTC
TEVプロテアーゼ部位及びHis6タグを有するHs−cFGEの一次配列
Hs−cFGEバキュロウイルスを0.1のMOIでHi5昆虫細胞(Invitrogen)に形質移入した。72時間の培養後、馴化培地を遠心分離及び濾過(0.45μm PES)によって清澄化し、FPLCによってHisTrap(登録商標)Excel樹脂上に5mL/minで添加した。樹脂を10カラム体積(CV)の洗浄バッファー(25mM TEAM、250mM NaCl、5mM酢酸カルシウム、10mMイミダゾール、pH8)で洗浄した。その後、溶出バッファー(25mMトリエタノールアミン(TEAM)、5mM酢酸カルシウム、300mMイミダゾール、pH8)でカラムから酵素を取り出した。タンパク質を含有する画分(FPLC溶出のUV検出によって確認)をプールし、保存バッファーで(25mM TEAM、8%v/vグリセロール、pH7.4)平衡化したSephadex(登録商標)G−25カラムに添加した。そして、保存バッファーでタンパク質を溶出し、10kD Amicon(登録商標)限外濾過膜(Millipore)で濃縮し、液体窒素中で瞬間冷凍した。単離酵素の典型的な収量は10〜20mg/L培地であった。SDS−PAGE電気泳動(図10)、逆相HPLC、インタクトなタンパク質のLC/MS、トリプシン消化とこれに続くLC−MS/MS、吸収分光測定、及び比活性(以下の実施例で記載する)によって精製酵素を特徴付けした。
不連続酵素活性アッセイを用いてFGEの比活性を測定した。FGEの基質はCXPXRコンセンサス配列を含有する14アミノ酸のペプチド(ALCTPSRGSLFTGR)であった。逆相HPLCにおける基質システイン(Csub)及び生成物(fGly)ペプチドの215nmのピーク面積を積分することによって、反応速度を求めた。生成物(及び副生成物)ピークの同一性はRP−HPLC MS/MSによって確認した(下記参照)。各反応水溶液(120μL)はCsub(100μM)、FGE(0.1〜1μM)、DTT(1mM)、及びバッファー(25mM TEAM、pH9)を含有していた。1回の時間経過において、等間隔をあけた5つの時点でデータを収集した。FGE原液を添加して3秒間ボルテックスした時点で反応開始とした。反応バイアルをthermomixer R(Eppendorf)で1,500RPM及び25℃にてボルテックスした。各時点において、マイクロピペットを用いて反応混合物の20μLを2μLの1M HClに加えることによって手動でクエンチした。反応の完了後、RP−HPLCによって各時点について分析した(下記参照)。
Csubに対するFGEによるインビトロ変換の中間体及び生成物を同定するために、FGE活性アッセイからの反応混合物をクエンチしてLC/MSによって分析した。反応混合物は、200μLの全体積中に0.5mMペプチド、0.5μMヒトFGE、5mM 2−メルカプトエタノール(βME)、及び25mM TEAM、pH9を含んでいた。各時点において、反応混合物の20μLを2μLの1M HClに加えることによって調製した。グラジエントは、0.1%のギ酸を含む水中のMeCNが10分間で5〜25%であった。RP−HPLCにおいて215nmで検出した4つのペプチドのピークの相対強度及び保持時間がLC−MS/MSデータにおいて再現され、質量による各ピークの割当てが可能となった。計算された及び観察されたm/zイオン、ならびに各ペプチド種の割当てを図11、図12、及び図13に示す。
基質、生成物、及びFGE基質ペプチドALCTPSRGSLFTGRの副生成物を、0.1% TFAを含有する18% MeCN水溶液のアイソクラティックによる7分間のRP−HPLCで分離した。基質のfGly(2.1分)、Csub(3.3分)、Csub/βMEジスルフィド(Csub−βME、3.6分)、及び基質/基質ジスルフィド(Csub−Csub、6.1分)形態の積分面積を用いて合計面積及びそれぞれの分率を計算した。
Sc−FGEまたはHs−FGEいずれかのチオール残基の酸化状態を確認するために、逐次的標識化、消化、及び直交標識化を用いて、LC/MSによってチオール及びジスルフィドをマッピングする手法を開発した。ステップ1、最初の標識化及びトリプシン消化:反応混合物は全体積30μL中のFGE(7.5μg)、NH4HCO3(50mM)、ヨードアセトアミド(20mM)、及びトリプシン(0.75μg)で構成されていた。サンプルを含むチューブを37℃で16時間インキュベートした。ステップ2、クエンチング:水(6μL)及びDTT(0.5M、50mMの最終濃度で4.8μL)をステップ1の反応混合物に加えた。サンプルを含むチューブを37℃及び1500RPMで1時間インキュベートした。ステップ3、第2の標識化:N−エチルマレイミド(0.5M、150mMの最終濃度で7.2μL)をステップ2の反応混合物に加えた。その後、サンプルを含むチューブを37℃及び1500RPMで1時間インキュベートした。ステップ3の後、反応混合物をHCl(1M、100mMの最終濃度で4.8μL)でクエンチした。0.1%ギ酸を含む水中のMeCNを15分間で0〜50%とするグラジエントで、消化されたペプチドを分離した。ヨードアセトアミド、エチルマレイミド、及びCys残基の酸化修飾を観察するMRM/MSによって、システイン含有ペプチドを検出した。
緩衝水溶液(25mM TEAM、pH7.4、50mM NaCl)中のSc−FGE(10μM)の溶液に硫酸銅(50μM、5モル当量)を加えた。1500RPMで1時間25℃にて混合物をボルテックスした。Sephadex(登録商標)G−25樹脂を用いた25mM TEAM、pH7.4、50mM NaClへのバッファー交換によって、反応混合物からタンパク質を精製した。その後、上記の活性アッセイを用いてFGEの比活性を測定した。
緩衝水溶液(25mM NH4HCO3)中のmAb(20μg)の溶液にDTT(20mM)を20μLの最終体積まで加えた。サンプルを含むチューブを37℃で15分間1500RPMでインキュベートした。その後、HCl(50mM)を溶液に加え、混合されるまでチューブをボルテックスした。次に、炭酸水素アンモニウム(100mM)を溶液に加え、混合されるまでチューブをボルテックスした。トリプシン(1μg)及びヨードアセトアミド(50mM)を加え、チューブを37℃及び1500RPMで60分間暗所でインキュベートした。最後に、クエン酸ナトリウム(150mM、pH5.5)及びメトキシルアミン(100mM)を溶液に加え、チューブを37℃で16時間インキュベートした。その後、処理したサンプルをLC−MRM/MSによって分析した。MRMトランジションは、システイン、ヨードアセトアミドで修飾されたシステイン、ホルミルグリシン、ホルミルグリシン水和物(コリジョンセル内での水の喪失を含む)、及びホルミルグリシンメチルオキシムを含むCys含有ペプチドの修飾を含んでいた。各種の存在量はその前駆体/生成物イオン対の最も強力な5つによって定義し、これらを積分して全シグナル及び各成分の相対分率を求めた。上記の最適化した消化及びキャッピング手法において、バックグラウンドを超える未反応のCys、fGly、またはfGly水和物は検出されず、カルボキシアセトアミドメチルCys(CAM)及びfGlyのメチルオキシム(MeOx)のみが観察された。カルボキシアセトアミドメチルCys(CAM)及びfGlyのメチルオキシム(MeOx)は検出可能であった。
25mM TEAM pH9.0、50mM NaCl及び1mM βME中のアルデヒドタグを含有するIgG(C末端KがSLCTPSRGSで置換された)の溶液にHs−cFGEを加えた。酵素は、抗体重鎖のアルデヒドタグ中のCsubの濃度に対して10mol%で加えた。溶液を1,000RPMで16時間18℃でボルテックスし、その後、溶液を0.5Mクエン酸ナトリウム、pH5.5の0.25体積当量で(最終濃度100mMクエン酸まで)クエンチし、mAb SelectプロテインA樹脂に結合させるために溶液のpHを約7まで減少させた。標準的な方法を用いてIgGを精製した。典型的な反応において抗体中の最終fGly含有率は95〜100%が得られ、90〜100%の反応変換収率に相当した。これまでに、20μg〜0.6gのスケールの範囲にわたって反応を実施した。
エチレンジアミン四酢酸(EDTA、15mM)及びトリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP、15mM)を、緩衝水溶液(25mM TEAM、pH7.4、50mM NaCl)中のSc−FGEホロ酵素(5μM)の溶液に添加した。750RPMで1時間37℃にて混合物をボルテックスした。Sephadex(登録商標)G−25樹脂を用いた25mM TEAM、pH7.4、50mM NaClへのバッファー交換によって、反応混合物からタンパク質を精製した。その後、上記の活性アッセイを用いてFGEの比活性を測定した。
実施例10〜19の結果を以下の節で説明する。
良好な収率でのSc−FGE及びHs−cFGEの組換え産生のための方法が本明細書に記載されている。さらに、両方のFGEの速度論パラメータを測定する不連続HPLCアッセイが記載されている。これらの結果は、Hs−FGEのN末端伸長部がインビトロでの触媒活性に必要ではなかったことを示していた。昆虫細胞培養から単離した場合、ヒト酵素は、E.coliで産生した場合のS. coelicolor由来のFGEの細菌形態よりも活性が著しく高かった。
Claims (96)
- ホルミルグリシン残基を含むタンパク質の生成方法であって、
FGE認識部位を含むタンパク質と活性化ホルミルグリシン生成酵素(FGE)を、前記活性化FGEが前記FGE認識部位のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換する条件下で組み合わせて、ホルミルグリシン残基を含むタンパク質を生成することを含む前記方法。 - 前記組み合わせが
ホルミルグリシン生成酵素(FGE);及び
前記FGE認識部位を含む前記タンパク質
を含む細胞を、前記FGEが前記FGE認識部位の前記システイン残基または前記セリン残基を前記ホルミルグリシン残基に変換する細胞培養条件の下、Cu2+を含む細胞培養培地中で培養すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記Cu2+が前記細胞培養培地中に1nM〜10mMの濃度で存在する、請求項2に記載の方法。
- 前記Cu2+が前記細胞培養培地中に1μM〜1mMの濃度で存在する、請求項3に記載の方法。
- 前記FGEが前記細胞にとって内因性である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がFGEを発現するように遺伝子改変されている、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
- FGE認識部位を含有する前記タンパク質が前記細胞にとって内因性である、請求項2〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がFGE認識部位を含む前記タンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項2〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞が、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、NIH 3T3細胞、Huh−7細胞、PC12細胞、RAT1細胞、マウスL細胞、HLHepG2細胞、NSO細胞、C127細胞、ハイブリドーマ細胞、PerC6細胞、CAP細胞、及びSp−2/0細胞からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記真核細胞が酵母細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記組み合わせが、Cu2+を含む無細胞反応混合物中で、前記FGEが前記FGE認識部位の前記システイン残基または前記セリン残基を前記ホルミルグリシン残基に変換する条件の下、FGE及び前記FGE認識部位を含む前記タンパク質を発現させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 還元剤を含む反応混合物中で前記活性化FGE及び前記FGE認識部位を含む前記タンパク質を組み合わせる、請求項15に記載の方法。
- 前記還元剤が前記FGE認識部位の前記システイン残基または前記セリン残基の前記ホルミルグリシン残基への変換を促進する、請求項16に記載の方法。
- 前記還元剤が2−メルカプトエタノールである、請求項17に記載の方法。
- 無細胞反応混合物中で前記活性化FGE及び前記FGE認識部位を含む前記タンパク質を組み合わせる、請求項1に記載の方法。
- 前記FGE認識部位を含む前記タンパク質と前記活性化FGEを組み合わせる前に、Cu2+でFGEを活性化することを含む、請求項19に記載の方法。
- 元素状酸素が最終酸化剤として存在する、請求項20に記載の方法。
- 前記元素状酸素が酸素、酸素及び硫化水素の混合物、または塩基性条件下の酸素によってもたらされる、請求項21に記載の方法。
- 前記元素状酸素がCu2+によって触媒される反応における最終酸化剤である、請求項21に記載の方法。
- 前記Cu2+が硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、及びベネディクト試薬から選択されるCu2+源によってもたらされる、請求項20〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cu2+源が硫酸銅である、請求項20〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FGEがN末端切断型FGEである、請求項19〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FGEがN末端切断型ヒトFGEである、請求項26に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体、抗体断片、リガンド、酵素、または抗原である、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体または抗体断片が、IgGまたはその断片、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、ScFv、二重特異性抗体またはその断片、ダイアボディまたはその断片、キメラ抗体またはその断片、モノクローナル抗体またはその断片、ヒト化抗体またはその断片、及び完全ヒト抗体またはその断片からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記抗体が腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原に特異的に結合する、請求項29または請求項30に記載の方法。
- 前記腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原がHER2、CD19、CD22、CD30、CD33、CD56、CD66/CEACAM5、CD70、CD74、CD79b、CD138、ネクチン―4、メソテリン、膜貫通糖タンパク質NMB(GPNMB)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、SLC44A4、CA6、及びCA−IXからなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記タンパク質がリガンドである、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンドが成長因子である、請求項33に記載の方法。
- 前記リガンドがホルモンである、請求項33に記載の方法。
- 前記ホルミルグリシン残基を含む前記タンパク質に前記ホルミルグリシン残基のアルデヒド部分を介して作用物質を結合させることをさらに含む、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記作用物質が治療薬である、請求項36に記載の方法。
- 前記治療薬が、細胞傷害剤、抗増殖剤、抗新生物剤、抗生物質剤、抗真菌剤、及び抗ウイルス剤からなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記作用物質が造影剤である、請求項36に記載の方法。
- 前記造影剤が、蛍光色素、近赤外(NIR)造影剤、及び単光子放出型コンピュータ断層撮影(SPECT)/CT造影剤、核磁気共鳴(NMR)造影剤、磁気共鳴造影(MRI)剤、陽電子放出型断層撮影(PET)剤、X線造影剤、コンピュータ断層撮影(CT)造影剤、Kエッジ造影剤、超音波造影剤、光音響造影剤、音響光学造影剤、マイクロ波造影剤、核造影剤、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
- Cu2+を含む細胞培養培地;及び
前記細胞培養培地中に存在する細胞
を含む組成物であって、前記細胞がホルミルグリシン生成酵素(FGE)を発現する組成物。 - 前記Cu2+が前記細胞培養培地中に0.1μM〜10mMの濃度で存在する、請求項41に記載の組成物。
- 前記Cu2+が前記細胞培養培地中に1μM〜1mMの濃度で存在する、請求項42に記載の組成物。
- 前記FGEが前記細胞にとって内因性である、請求項41〜43のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞がFGEを発現するように遺伝子改変されている、請求項41〜43のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞がFGE認識部位を含むタンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項41〜45の1項に記載の組成物。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項41〜46のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項47に記載の組成物。
- 前記哺乳類細胞が、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、NIH 3T3細胞、Huh−7細胞、PC12細胞、RAT1細胞、マウスL細胞、HLHepG2細胞、NSO細胞、C127細胞、ハイブリドーマ細胞、PerC6細胞、CAP細胞、及びSp−2/0細胞からなる群から選択される、請求項48に記載の組成物。
- 前記真核細胞が酵母細胞である、請求項47に記載の組成物。
- 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項47に記載の組成物。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項41〜46のいずれか1項に記載の組成物。
- Cu2+を含む細胞培養培地中でホルミルグリシン生成酵素(FGE)をコードする核酸を含む細胞を培養することを含む方法であって、前記培養を前記FGEが前記細胞内で発現される条件の下で行う方法。
- 前記Cu2+が前記細胞培養培地中に0.1μM〜10mMの濃度で存在する、請求項53に記載の方法。
- 前記Cu2+が前記細胞培養培地中に1μM〜1mMの濃度で存在する、請求項53に記載の方法。
- 前記FGEが前記細胞にとって内因性である、請求項53〜55のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がFGEを発現するように遺伝子改変されている、請求項53〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がFGE認識部位を含むタンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項53〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項53〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項59に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞が、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、NIH 3T3細胞、Huh−7細胞、PC12細胞、RAT1細胞、マウスL細胞、HLHepG2細胞、NSO細胞、C127細胞、ハイブリドーマ細胞、PerC6細胞、CAP細胞、及びSp−2/0細胞からなる群から選択される、請求項60に記載の方法。
- 前記真核細胞が酵母細胞である、請求項59に記載の方法。
- 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項53〜58のいずれか1項に記載の方法。
- FGEをCu2+で処理して活性化FGEを生成することを含む、活性化ホルミルグリシン生成酵素(FGE)の生成方法。
- Cu2+での前記FGEの処理が、Cu2+を含む細胞培養培地中で前記FGEをコードする核酸を含む細胞を培養することを含み、前記培養を前記FGEが前記細胞内で発現される条件の下で行う、請求項65に記載の方法。
- 前記Cu2+が前記細胞培養培地中に0.1μM〜10mMの濃度で存在する、請求項66に記載の方法。
- 前記Cu2+が前記細胞培養培地中に1μM〜1mMの濃度で存在する、請求項66に記載の方法。
- 前記FGEが前記細胞にとって内因性である、請求項66〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がFGEを発現するように遺伝子改変されている、請求項66〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項66〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項71に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞が、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、NIH 3T3細胞、Huh−7細胞、PC12細胞、RAT1細胞、マウスL細胞、HLHepG2細胞、NSO細胞、C127細胞、ハイブリドーマ細胞、PerC6細胞、CAP細胞、及びSp−2/0細胞からなる群から選択される、請求項72に記載の方法。
- 前記真核細胞が酵母細胞である、請求項71に記載の方法。
- 前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項71に記載の方法。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項66〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞から前記FGEを精製することをさらに含む、請求項66〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FGEの処理がCu2+を含む無細胞反応混合物中で前記FGEを発現させることを含む、請求項65に記載の方法。
- 無細胞反応混合物中で前記FGEをCu2+で処理する、請求項65に記載の方法。
- 元素状酸素が最終酸化剤として存在する、請求項79に記載の方法。
- 前記元素状酸素が酸素、酸素及び硫化水素の混合物、または塩基性条件下の酸素によってもたらされる、請求項80に記載の方法。
- 前記元素状酸素がCu2+によって触媒される反応における最終酸化剤である、請求項80に記載の方法。
- 前記Cu2+がl硫酸銅、クエン酸銅、酒石酸銅、フェーリング試薬、及びベネディクト試薬からなる群から選択されるCu2+源によってもたらされる、請求項79〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FGEがN末端切断型FGEである、請求項79〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FGEがN末端切断型ヒトFGEである、請求項84に記載の方法。
- 前記Cu2+から前記FGEを精製することをさらに含む、請求項65〜85のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項65〜86のいずれか1項に記載の方法によって生成される活性化ホルミルグリシン生成酵素(FGE)。
- 活性化ホルミルグリシン生成酵素(FGE);及び
バッファー
を含む無細胞組成物。 - FGE認識部位を含むタンパク質をさらに含む、請求項84に記載の組成物。
- 前記FGEがN末端切断型FGEである、請求項88または請求項89に記載の組成物。
- 前記FGEがN末端切断型ヒトFGEである、請求項90に記載の組成物。
- 活性化ホルミルグリシン生成酵素(FGE);及び
タンパク質のFGE認識部位中に存在するシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン残基に変換するための前記活性化FGEの使用説明書
を含むキット。 - 前記FGEがN末端切断型FGEである、請求項92に記載のキット。
- 前記FGEがN末端切断型ヒトFGEである、請求項93に記載のキット。
- ホルミルグリシン生成酵素(FGE)をコードする核酸;及び
Cu2+またはCu2+源
を含むキット。 - 前記核酸によってコードされる前記FGEを発現させるのに適した細胞をさらに含む、請求項87に記載のキット。
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