CN107250372B - 活化的甲酰甘氨酸生成酶及其生成和使用方法 - Google Patents
活化的甲酰甘氨酸生成酶及其生成和使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开文本提供活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE),生成活化的FGE的方法,及它们在生成包含甲酰甘氨酸(FGly)残基的蛋白质的方法中的用途。生成活化的FGE的方法,以及在生成含FGly蛋白质中使用活化的FGE的方法包括基于细胞的和无细胞的方法二者。还提供了可用于例如实施本公开文本的方法的组合物和试剂盒。
Description
对相关申请的交叉援引
本申请要求2015年2月5日提交的美国临时专利申请No.62/112,422,和2015年3月17日提交的美国临时专利申请No.62/134,461的权益,通过援引将这些申请完整收入本文。
前言
治疗性蛋白质的特性能通过位点特异性蛋白质缀合来增强。哺乳动物细胞中表达的重组蛋白质能经由一个或多个遗传编码的醛基团而进行位点特异性修饰。例如,受到驻留内质网(ER)的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)识别的肽序列(它可以短至5个残基)可以遗传编码入哺乳动物细胞中表达的异源蛋白质。FGE将FGE识别位点的半胱氨酸或丝氨酸残基共翻译转变成甲酰甘氨酸残基,由此生成携带独特醛基团的蛋白质。此醛基团可以用于将感兴趣药剂(例如治疗剂,成像剂,等)位点特异性缀合至蛋白质。
概述
本公开文本提供活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE),生成活化的FGE的方法,及它们在生成包含甲酰甘氨酸(FGly)残基的蛋白质的方法中的用途。生成活化的FGE的方法以及在生成含FGly蛋白质中使用活化的FGE的方法包括基于细胞的和无细胞的方法二者。还提供了可用于例如实施本公开文本的方法的组合物和试剂盒。
本公开文本的多个方面包括生成包含甲酰甘氨酸残基的蛋白质的方法。该方法包括在下述条件下组合活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)与包含FGE识别位点的蛋白质,在该条件中活化的FGE将FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基,以生成包含甲酰甘氨酸残基的蛋白质。
在一些实施方案中,组合包括在包含Cu2+的细胞培养基中在下述细胞培养条件下培养包括甲酰甘氨酸生成酶(FGE)和具有FGE识别位点的蛋白质的细胞,在该条件下FGE将FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。
在一些实施方案中,Cu2+以1nM至10mM的浓度存在于细胞培养基中。
在一些实施方案中,Cu2+以1μM至1mM的浓度存在于细胞培养基中。
在生成包含甲酰甘氨酸残基的蛋白质的方法牵涉细胞的一些实施方案中,FGE对于细胞是内源的和/或细胞经遗传修饰而表达FGE,且含有FGE识别位点的蛋白质对于细胞是内源的和/或细胞经遗传修饰而表达含有FGE识别位点的蛋白质。FGE和含有FGE识别位点的蛋白质任一或二者可以对于细胞是内源的,或细胞可以经遗传修饰而表达FGE和含有FGE识别位点的蛋白质任一或二者。在细胞经遗传修饰而表达FGE的情况中,细胞还可以表达对于细胞是内源的FGE。
在一些实施方案中,细胞是真核细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中,哺乳动物细胞选自CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞。
在一些实施方案中,哺乳动物细胞是人细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是酵母细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是昆虫细胞。
在一些实施方案中,组合包括在包括Cu2+的无细胞反应混合物中在下述条件下表达FGE和包含FGE识别位点的蛋白质,在该条件中FGE将FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。
在一些实施方案中,活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质在包括还原剂的反应混合物中组成。在一些实施方案中,还原剂促进FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。在一些实施方案中,还原剂是2-巯基乙醇。
在一些实施方案中,活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质在无细胞反应混合物中组合。
在一些实施方案中,在组合活化的FGE与具有FGE识别位点的蛋白质之前,该方法包括用Cu2+活化FGE。
在一些实施方案中,元素氧作为终末氧化剂存在。
在一些实施方案中,元素氧由氧,氧和硫化氢的混合物,或在碱性条件下的氧提供。
在一些实施方案中,元素氧是由Cu2+催化的反应中的终末氧化剂。
在一些实施方案中,Cu2+由选自硫酸铜,柠檬酸铜,酒石酸铜,Fehling氏试剂,和Benedict氏试剂的Cu2+源提供。
在一些实施方案中,Cu2+源是硫酸铜。
在一些实施方案中,当活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质在无细胞反应混合物中组合时,活化的FGE是N端截短的FGE。N端截短的FGE可以是N端截短的人FGE。
在一些实施方案中,蛋白质是抗体或抗体片段。
在一些实施方案中,抗体或抗体片段选自IgG或其片段,Fab,F(ab’)2,Fab’,Fv,ScFv,双特异性抗体或其片段,双抗体或其片段,嵌合抗体或其片段,单克隆抗体或其片段,人源化抗体或其片段,和完全人抗体或其片段。
在一些实施方案中,抗体特异性结合肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中,肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原选自HER2,CD19,CD22,CD30,CD33,CD56,CD66/CEACAM5,CD70,CD74,CD79b,CD138,柄蛋白(Nectin)-4,间皮素(Mesothelin),跨膜糖蛋白NMB(GPNMB),前列腺特异性膜抗原(PSMA),SLC44A4,CA6,和CA-IX。
在一些实施方案中,蛋白质是配体。
在一些实施方案中,配体是生长因子。
在一些实施方案中,配体是激素。
在一些实施方案中,该方法进一步包括经甲酰甘氨酸残基的醛模块将药剂缀合至具有甲酰甘氨酸残基的蛋白质。
在一些实施方案中,药剂是治疗剂。
在一些实施方案中,治疗剂选自细胞毒性药剂,抗增殖性药剂,抗赘生性药剂,抗生药剂,抗真菌药剂,和抗病毒药剂。
在一些实施方案中,药剂是成像剂。
在一些实施方案中,成像剂选自荧光染料,近红外(NIR)成像剂,和单光子发射计算机断层照相术(SPECT)/CT成像剂,核磁共振(NMR)成像剂,磁共振成像(MRI)药剂,正电子发射断层照相术(PET)药剂,x射线成像剂,计算机断层照相术(CT)成像剂,K-edge成像剂,超声成像剂,光声成像剂,声光成像剂,微波成像剂,核成像剂,和其组合。
本公开文本的多个方面包括一种组合物,其包括包括Cu2+的细胞培养基,和存在于细胞培养基中的细胞,其中该细胞表达甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。
在一些实施方案中,Cu2+以0.1μM至10mM的浓度存在于细胞培养基中。
在一些实施方案中,Cu2+以1μM至1mM的浓度存在于细胞培养基中。
在组合物包括细胞的一些实施方案中,FGE对于细胞是内源的和/或细胞经遗传修饰而表达FGE,且含有FGE识别位点的蛋白质对于细胞是内源的和/或细胞经遗传修饰而表达含有FGE识别位点的蛋白质。FGE和含有FGE识别位点的蛋白质任一或二者可以对于细胞是内源的,或细胞可以经遗传修饰而表达FGE和含有FGE识别位点的蛋白质任一或二者。在细胞经遗传修饰而表达FGE的情况中,细胞还可以表达对于细胞是内源的FGE。
在一些实施方案中,细胞是真核细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中,哺乳动物细胞选自CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是酵母细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是昆虫细胞。
在一些实施方案中,细胞是原核细胞。
本公开文本的多个方面包括一种方法,其包括在具有Cu2+的细胞培养基中培养包括编码甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的核酸的细胞,其中该培养在下述条件下进行,在该条件中FGE在细胞中表达。
在一些实施方案中,Cu2+以0.1μM至10mM的浓度存在于细胞培养基中。
在一些实施方案中,Cu2+以1μM至1mM的浓度存在于细胞培养基中。
在一些实施方案中,细胞是真核细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中,哺乳动物细胞选自CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是酵母细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是昆虫细胞。
在一些实施方案中,细胞是原核细胞。
本公开文本的多个方面包括一种生成活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的方法,其中该方法包括用Cu2+处理FGE以生成活化的FGE。
在一些实施方案中,用Cu2+处理FGE包括在具有Cu2+的细胞培养基中培养具有编码FGE的核酸的细胞,其中该培养在下述条件下进行,在该条件中FGE在细胞中表达。
在一些实施方案中,Cu2+以0.1μM至10mM的浓度存在于细胞培养基中。
在一些实施方案中,Cu2+以1μM至1mM的浓度存在于细胞培养基中。
在一些实施方案中,细胞是真核细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中,哺乳动物细胞选自CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是酵母细胞。
在一些实施方案中,真核细胞是昆虫细胞。
在一些实施方案中,细胞是原核细胞。
在一些实施方案中,该方法进一步包括自细胞纯化FGE。
在一些实施方案中,处理FGE包括在包含Cu2+的无细胞反应混合物中表达FGE。
在一些实施方案中,FGE在无细胞反应混合物中用Cu2+处理。
在一些实施方案中,元素氧作为终末氧化剂存在。
在一些实施方案中,元素氧由氧,氧和硫化氢的混合物,或在碱性条件下的氧提供。
在一些实施方案中,元素氧是由Cu2+催化的反应中的终末氧化剂。
在一些实施方案中,Cu2+由选自硫酸铜,柠檬酸铜,酒石酸铜,Fehling氏试剂,和Benedict氏试剂的Cu2+源提供。
在一些实施方案中,该方法进一步包括自Cu2+纯化FGE。
在一些实施方案中,当FGE在无细胞反应混合物中用Cu2+处理时,FGE是N端截短的FGE。在一些实施方案中,FGE是N端截短的人FGE。
本公开文本的多个方面包括通过本文中公开的方法生成的活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)。
本公开文本的多个方面包括一种无细胞组合物,其包括活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE),和缓冲剂。在一些实施方案中,无细胞组合物中包括的活化的FGE是N端截短的FGE(例如N端截短的人FGE)。
在一些实施方案中,组合物包括具有FGE识别位点的蛋白质。
本公开文本的多个方面包括一种试剂盒。试剂盒包括活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE),和关于使用活化的FGE将蛋白质的FGE识别位点中存在的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基的说明书。在一些实施方案中,试剂盒中包括的活化的FGE是N端截短的FGE(例如N端截短的人FGE)。
本公开文本的多个方面包括一种试剂盒,其包括编码甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的核酸,和Cu2+或Cu2+源。
在一些实施方案中,试剂盒还包括适合于表达由核酸编码的FGE的细胞。此类细胞可表达内源FGE和/或表达含有FGE识别位点的内源蛋白质。
附图简述
图1小图A-B提供数据,显示依照本公开文本的某些实施方案Cu2+处理细胞中的体内FGE活化/升高的转变。
图2提供数据,显示依照本公开文本的某些实施方案Cu2+处理细胞中的体内FGE活化/升高的转变。
图3小图A显示数据,比较Cu2+处理细胞和未处理细胞的活密度。图3小图B显示数据,比较Cu2+处理细胞和未处理细胞的蛋白质滴度。图3小图C提供数据,显示依照本公开文本的一个实施方案Cu2+处理细胞中的体内FGE活化/升高的转变。
图4提供数据,显示依照本公开文本的一个实施方案Cu2+处理细胞中的体内FGE活化/升高的转变。
图5提供液体层析-质谱术数据,比较自Cu2+处理大肠杆菌细胞和未处理大肠杆菌细胞分离的FGE。
图6显示数据,展现依照本公开文本的某些实施方案使用CuSO4的体外Sc FGE活化。
图7小图A显示依照本公开文本的某些实施方案在Cu2+存在或缺失下的%转变的图。图7小图B显示在Cu2+存在或缺失下的乳酸盐消耗的图。图7小图C显示在Cu2+存在或缺失下的葡萄糖消耗的图。
图8提供数据,显示依照本公开文本的一个实施方案Cu2+处理细胞中体内FGE活化的转变效率的降低的变异性。
图9小图A和图9小图B提供数据,显示依照本公开文本的某些实施方案在细胞培养基中提供Cu2+导致相似水平的FGE但来自铜培养物的FGE活性显著更高。
图10显示通过SDS-PAGE电泳表征的纯化的FGE的图像。Sc-FGE和Hs-cFGE制备物以较好的数量和纯度产生酶。图10小图a泳道如下显示Sc-FGE纯化的中间体阶段:1–细胞裂解后总的可溶性蛋白质;2–DNA沉淀后总的可溶性蛋白质,含1%w/v硫酸链霉素;3–自在Ni-NTA树脂上加载裂解物回收的流出液中的可溶性蛋白质;4–Ni-NTA层析的清洗级分中的可溶性蛋白质;和5–Ni-NTA层析的洗脱级分中的可溶性蛋白质。图10小图b显示在Hi5细胞中表达的Hs-cFGE的10个生产批次的最终纯度。
图11显示起始材料和产物肽的LC/MS表征。显示的是来自图14小图a的保留t=2.1分钟(图11小图a)和t=3.3分钟(图11小图b)的峰的谱。
图12显示作为底物二聚化的函数的反应抑制的图。图12小图a显示指示通过用FGE体外转变期间形成的副产物峰的LC-MS确认的Csub-Csub二聚体的身份的图。图12小图b显示指示将过氧化氢添加至FGE反应混合物快速形成底物二聚体且抑制产物形成的图。图12小图c显示指示产物形成也受到反应混合物中存在Cu2+的抑制的图。此抑制是消耗DTT(图12小图d)和通过二聚化诱捕底物(图12小图e)的结果。
图13显示涉及鉴定和监测由FGE形成的底物二硫化物的数据。图13小图a显示Csub-BME的LC/MS鉴定。图13小图b显示含有BME作为化学计量性还原剂的FGE反应混合物的扩展HPLC迹线。在还原剂缺失下(图13小图c),有2.5个摩尔当量的还原剂时(图13,小图d),和有100个摩尔当量的还原剂时(图13,小图e),由FGE催化的产物形成。
图14呈现数据,显示使用不连续活性测定法测量的FGE的比活性。图14小图a显示数据,其中使用14个氨基酸的肽底物来测量FGE催化的动力学。通过RP-HPLC将含Cys和fGly肽分开,并通过215nm峰面积积分来测定它们的数量。星号指示肽合成期间形成的杂质。图14小图b显示数据,指示通过将即时反应速度(p/t)对时间(t)的曲线外推至y轴(t=0)确定反应初速度(v0)。图14小图c显示示意图,指示野生型Hs-FGE含有3个主要域:ER引导信号序列,与ERp44相互作用以实现ER保留的N端延伸,和催化核心。图14小图d显示图,显示自细胞培养物纯化的真核和原核FGE的比活性。全长(Hs-FGE)和缺少NTE的核心(Hs-cFGE)具有相似的比活性。尽管与Hs-FGE有高序列和结构同源性,然而在大肠杆菌中生成的原核Sc-FGE的活性比Hs-cFGE要少。
图15显示数据,指示FGE的比活性在用化学计量性量的铜(II)处理后显著升高。图15小图a显示图,指示在大肠杆菌中生成的Sc-FGE具有低比活性。用两电子氧化剂或还原剂(分别是DHAA或DTT)处理Sc-FGE不改变酶的活性。相反,用过量的CuSO4处理继以凝胶过滤以去除Cu2+显著提高FGE活性。图15小图b显示图,指示亚化学计量性量的Cu2+没有完全活化Sc-FGE。添加1或更多个摩尔当量的Cu2+完全活化酶。图15小图c显示图,指示纯化的Sc-FGE含有~0.01Cu/FGE,而Hs-cFGE含有0.34Cu/FGE。体外活化后,Sc-FGE和Hs-FGE分别含有1.1和1.4Cu/FGE。在所有情况中,纯化的酶的制备物中含有的铜的量与酶的比活性有关联。图15小图d显示氧化形式的DTT以及Csub-Csub的形成,作为铜催化的二硫化物形成的结果。
图16显示数据,指示Hs-cFGE的比活性与活性位点残基C341的氧化还原状态没有关联。图16小图a显示含有两个结构性二硫化物和两个活性位点半胱氨酸的Hs-cFGE的示意图,它能在脱辅基酶中形成二硫化物。图16小图b显示图,指示可通过LC-MS/MS来测量C341的氧化还原状态。用Cu2+活化后,溶液可及的C341的量是~28%。用还原剂(DTT)处理后,可及C341的量升高至93%。然而,酶的比活性没有降低。DTT处理不影响含有C235的结构性二硫化物。
图17显示数据,指示FGE催化受到氰化物抑制。图17小图a显示图,指示用EDTA或KCN预处理活化的FGE导致比活性变化很少至没有变化。只有Hs-cFGE活性在KCN处理后适度降低。图17小图b和c显示图,指示Sc-FGE(小图b)和Hs-cFGE(小图c)二者在周转期间以浓度依赖性方式受到CN-抑制,它是铜的强配体。图17小图d显示用还原剂(DTT,TCEP)或金属螯合剂(EDTA)预处理活化的Sc-FGE(n=6)不改变酶的比活性。当组合还原剂和螯合剂时(各15mM,1小时,37℃),FGE活性接近消除。
图18显示通过非线性回归确定的Sc-FGE和Hs-cFGE的动力学参数的数据。图18小图a和b显示Michaelis-Menten图,对Sc-FGE(小图a)和Hs-cFGE(小图b)关联底物浓度与v0。通过非线性回归将数据拟合至Michaelis-Menten方程以确定动力学参数(图18小图c)。
图19显示数据,指示FGE能催化对产物产率可能是抑制性的底物/还原剂二硫化物形成,并确认作为二硫化物的底物在活性位点中结合。图19小图a显示跨越0-10mMβME范围的FGE反应混合物中的产物形成的图。没有βME时,fGly和Csub-Csub以相当的速率形成。随着[βME]升高,Csub-Csub被Csub-βME替换,且产物以更高速率形成。图19小图b显示图,指示βME时FGE催化的初速度比DTT时更高。图19小图c显示示意图,指示这些数据确认[E·S]形成导致E和S之间的二硫化物(i)。催化将底物转变成产物(ii),然后释放(iii)。在硫醇还原剂存在下,以kcat定义的催化速率与速率常数kDS的硫醇-二硫化物交换竞争(iv),后者解离E·S复合物并释放Csub-R。然后此种类能与另一个当量的还原剂反应以再生游离底物(v)。当添加的试剂是强非硫醇还原剂(例如TCEP)或能环化的硫醇(DTT)时,iv和v瓦解成一个步骤。当还原剂是单硫醇时,Csub-R能坚持足够长,从而以速率常数k-DS再形成[E·S]。
图20显示数据,指示FGE可用于以高产率生成带醛标签的单抗。图20小图a显示示意图,指示在IgG1重链的重链的三个区(铰链,CH2,和CH3)中安置醛标签。在体外与FGE反应后,测定Cys和fGly的数量。在优化条件下,Cys转变成fGly的产率一致地是85-95%。图20小图b显示图,指示生物催化性fGly生成的产率不依赖于反应规模,如对两种个别单抗在0.8,8.0和80.0mg测试案例中测量的。图20小图c显示来自更大规模反应的一个代表例的图。用FGE转变后,fGly含量是98.1%,对应于转变产率97.8%。
图21显示涉及含Cys和fGly蛋白质的LC-MRM/MS表征的数据。图21小图a显示示意图,指示为了表征,经由下述步骤,分解并消化单克隆抗体,分别作为羧基乙酰胺基甲基(CAM)和甲基肟(MeOx)种类诱捕Cys和fGly官能团:i)DTT,37℃,15分钟;ii)HCl,然后NH4HCO3;iii)胰蛋白酶,碘乙酰胺,pH 8,37℃,1小时;iv)甲氧胺,pH 5.5,16小时。图21小图b显示图,指示通过含有安置的标签序列的独特胰蛋白酶肽表征每个醛标签位置。在这里,由胰蛋白酶生成9聚物肽。使用靶向MRM-MS来定量作为CAM或MeOx修饰的肽。选择5个强度最高的前体/产物离子跃迁用于峰面积积分。图21小图c显示含CAM和MeOx肽的离子层析图。含MeOx肽分离成作为肟形成的结果存在的非对映异构体。
图22显示涉及提交体外转变反应条件的单抗的生物物理学特性的数据。图22小图a和图22小图b显示两种IgG1单抗的抗体/抗原亲和力的ELISA测量的图。图22小图c显示图,指示IgG1支架的CH3域中的位置252处氧化的甲硫氨酸的比例的测量在反应过程里不变化。
图23显示考虑了铜辅因子的FGE的建议催化机制的示意图。如步骤a中显示的,底物S结合酶E并经由C341共价附着。此共价键形成可能是由Cu2+催化的,或者它可能源自现有C341二硫化物和底物之间的硫醇-二硫化物交换。如步骤b中显示的,Cu2+还原成Cu1+会能够实现分子氧结合(步骤c),作为Cu2+超氧基中间体。如步骤d中显示的,Cu(II)–O2 -经由质子耦合电子转移(很可能是氢原子转移)氧化底物会生成二硫根,它会快速瓦解(步骤e)成硫醛和含硫(thiyl)根。第二1H+/1e-还原和水解会再生C341。此还原发生的方式可能经由多种途径行进,包括但不限于:直接含硫根还原和铜-过氧化物水解以释放H2O2;或氧自Cu(II)-OOH转移至根以生成次磺酸,继以铜-氧基还原和次磺酸水解。
详述
本公开文本提供活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE),生成活化的FGE的方法,及它们在生成包含甲酰甘氨酸(FGly)残基的蛋白质的方法中的用途。生成活化的FGE的方法以及在生成含FGly蛋白质中使用活化的FGE的方法包括基于细胞的和无细胞的方法二者。还提供了可用于例如实施本公开文本的方法的组合物和试剂盒。
在极为详细地描述本公开文本的方法和组合物之前,应了解,方法和组合物不限于所描述的特定实施方案,它们当然可以有变化。还应了解,本文中使用的术语仅仅出于描述特定实施方案的目的,并不意图是限制性的,因为方法和组合物的范围会仅受所附权利要求书的限制。
在提供数值的范围的情况中,应了解,除非上下文另有明确规定,方法和组合物内涵盖介于范围的上限和下限之间相隔下限单位十分之一的每个居间值和规定范围内的任何其它规定值或居间值。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小范围中,而且也涵盖于方法和组合物内,服从于在规定范围内任何特定排除的界限。在规定范围包括两个界限之一或二者的情况中,排除那些所包括的界限中的任一或两者的范围也包括于方法和组合物中。
除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然也可以使用与本文中描述的方法和组合物类似或等同的任何方法和组合物来实施或测试方法和组合物,但是现在描述代表性的例示性方法和组合物。
通过援引将本说明书中引用的任何出版物和专利收入本文,就如同明确地且个别地指出通过援引来收录每一篇个别的出版物或专利并通过援引将其收入本文以公开和描述与所引用的出版物有关的材料和/或方法和组合物。对任何出版物的引用是因为它在提交日之前公开,而不应解释为承认本方法和组合物没有资格早于此类出版物,因为所提供的公开日期可能不同于真实的公开日期,这可能需要独立确认。
应注意,除非上下文另有明确规定,如本文和所附权利要求书中使用的,单数形式“一个”,“一种”,和“所述/该”包括复数指示物。应进一步注意,权利要求书可以撰写成排除任何任选要素。这样的话,这个陈述意图充当与列举权利要求的要素或使用“负向”限制相结合来使用诸如“只”,“仅”等排他性术语的在先基础。
应领会,为清楚起见在分开的实施方案的上下文中描述的方法和组合物的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。反之,为简便起见在单个实施方案的上下文中描述的方法和组合物的各种特征也可以分开或以任何合适的子组合提供。
各个实施方案的所有组合皆具体地涵盖在本公开文本中且公开在本文中,就如同每个和每一个组合均个别地且明确地公开一般,其程度是此类组合涵盖可操作的工艺和/或装置。另外,描述此类变量的各个实施方案中列出的所有子组合也具体地涵盖在本方法和组合物中并且公开在本文中,就如同每个和每一个此类子组合个别地且明确地在本文中公开一样。
正如本领域技术人员在阅读本公开文本后会清楚的,本文中描述和例示的每一个单独的实施方案具有离散的成分和特征,它们可以容易地与任何其它实施方案的特征分开或组合而不背离本方法的范围或精神。任何叙述的方法可以以事件叙述次序或以逻辑上可能的任何其它次序进行。
甲酰甘氨酸生成酶,FGE识别序列,和靶蛋白质
本公开文本的多个方面包括生成活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的方法,及使用活化的FGE通过感兴趣蛋白质中的FGE识别序列中的氨基酸的转变来生成含甲酰甘氨酸蛋白质的方法。还提供了包括活化的FGE和感兴趣蛋白质(包括一个或多个FGE识别序列和/或一个或多个甲酰甘氨酸残基的蛋白质)的组合物。
下文描述的是可以活化以用于本公开文本的方法和组合物的FGE的例子,可以在感兴趣蛋白质中提供的FGE识别序列的例子,和可以由FGE转变以包括甲酰甘氨酸残基(对于例如将药剂(例如治疗剂,成像剂,等)缀合至感兴趣蛋白质有用的)的感兴趣蛋白质的例子。
甲酰甘氨酸生成酶
如本文中使用的,“甲酰甘氨酸生成酶”(或“FGE”)是将硫酸酯酶基序(或“FGE识别位点”)中的半胱氨酸或丝氨酸氧化成2-甲酰甘氨酸(FGly)残基(本文中也称作甲酰甘氨酸残基)的酶。如此,本文中使用“FGE”来指任何能作为FGly生成酶起作用,介导FGE识别位点的半胱氨酸(“Cys”或“C”)转变成FGly或能介导FGE识别位点的丝氨酸(“Ser”或“S”)转变成FGly的酶。在FGE作用于FGE识别位点的语境中使用的“转变”指FGE识别位点中的半胱氨酸或丝氨酸残基变成甲酰甘氨酸(FGly)残基(例如Cys变成FGly,或Ser变成FGly)的生化修饰。由FGE修饰以含有FGly的FGE识别位点在本文中可称作“转变后的FGE识别位点”。
应注意,一般而言,文献把将FGE识别位点中的Cys转变成FGly的FGly生成酶称作FGE,并把将FGE识别位点中的Ser转变成FGly的酶称作Ats-B样。然而,为了本公开文本,一般使用“FGE”来指任何在FGE识别位点处展现FGly生成酶活性的酶,理解的是,可以依据FGE识别位点(即含有Cys的或含有Ser的)和/或含有FGE识别位点的靶蛋白质来选择适宜的FGE。
正如在活性位点处具有FGly的硫酸酯酶的普遍存在所证明的,在极其多种细胞类型中找到了FGE,包括真核生物和原核生物二者。有至少两种形式的FGE。真核硫酸酯酶通常在它们的硫酸酯酶基序中含有半胱氨酸且受到可以由SUMF1基因编码的“SUMF1型”FGE修饰(参见例如Cosma et al.Cell2003,113,(4),445-56;Dierks et al.Cell 2003,113,(4),435-44)。原核硫酸酯酶可以在它们的硫酸酯酶基序中含有半胱氨酸或丝氨酸任一且分别受到“SUMF1型”FGE或“AtsB型”FGE任一修饰(参见例如Szameit et al.J Biol Chem 1999,274,(22),15375-81)。原核FGE的例子包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)FGE和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)FGE。FGE还见于后口动物,包括脊椎动物和棘皮动物(参见例如Pepe et al.(2003)Cell 113,445-456;Dierks et al.(2003)Cell 113,435-444;Cosma et al.(2004)Hum.Mutat.23,576-581)。
在真核生物中,FGE对含有FGE识别序列的蛋白质的活性可发生于蛋白质在内质网(ER)中翻译期间或之后不久(Dierks et al.Proc Natl Acad Sci U S A1997,94(22):11963-8)。不受理论束缚,在原核生物中,认为SUMF1型FGE在胞质溶胶中发挥功能,而AtsB型FGE在细胞膜处或附近发挥功能。SUMF2FGE还有后口动物中的记载,包括脊椎动物和棘皮动物(参见例如Pepe et al.(2003)Cell 113,445-456;Dierks et al.(2003)Cell 113,435-444;Cosma et al.(2004)Hum.Mutat.23,576-581)。
供本文中公开的方法和组合物中使用的FGE可以自天然发生来源获得或合成生成。例如,适宜的FGE可以自天然生成FGE或经遗传修饰而表达编码FGE的重组基因的生物学来源衍生。当本文中描述的方法牵涉使用宿主细胞时,FGE可以对于宿主细胞是天然的,或宿主细胞可以经遗传修饰而表达FGE。因而,本公开文本还提供经遗传修饰而表达FGE的重组宿主细胞,FGE可以选择成对于转变具有选定FGE识别位点的靶蛋白质是相容的。在一些实施方案中,可能期望使用与人FGE(例如SUMF1型FGE)相容的硫酸酯酶基序(参见例如Cosma et al.Cell 113,445-56(2003);Dierks et al.Cell 113,435-44(2003)),并在表达人FGE的人细胞中或在经遗传修饰而表达人FGE的宿主细胞(通常是哺乳动物细胞)中表达具有FGE识别位点的蛋白质。
在某些实施方案中,FGE是真核FGE,诸如但不限于哺乳动物FGE。在一些情况中,哺乳动物FGE是人FGE。在某些实施方案中,FGE是原核FGE,诸如但不限于细菌FGE。在一些情况中,细菌FGE是结核分枝杆菌(Mtb)FGE或天蓝色链霉菌(S.coelicolor)FGE。
FGE以及编码多种FGE的核酸是本领域已知的。参见例如Preusser etal.2005J.Biol.Chem.280(15):14900-10(Epub 2005Jan 18)(记载人FGE和编码它们的核酸);Fang et al.2004J Biol Chem.279(15):14570-8(Epub 2004Jan 28)(记载肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)的细菌甲酰甘氨酸生产性硫酸酯酶修饰性酶AtsB和编码它的核酸);Landgrebe et al.Gene 2003Oct 16;316:47-56(记载编码人FGE的基因(SUMF1)的鉴定和它与编码FGE的原核基因的保守性);Dierks et al.1998FEBS Lett.423(1):61-5;Dierks et al.Cell.2003May 16;113(4):435-44(记载编码人FGE的基因和其中引起多重硫酸酯酶缺陷(MSD)的突变);Cosma et al.(2003May 16)Cell 113(4):445-56(记载编码人FGE的基因和其中引起多重硫酸酯酶缺陷(MSD)的突变);Baenziger(2003May 16)Cell113(4):421-2(综述);Dierks et al.Cell.2005May 20;121(4):541-52;Roeser et al.(2006Jan 3)Proc Natl Acad Sci USA 103(1):81-6;WO 2004/072275(记载编码人FGE及其变体的核酸);GenBank登录号NM_182760(人FGE的一种单核苷酸变体);和Carlson etal.J Biol Chem.2008283:20117-20125(记载编码结核分枝杆菌(Mtb)FGE和天蓝色链霉菌(S.coelicolor)FGE的核酸)。
依照某些实施方案,FGE是全长FGE。“全长”意味着FGE具有野生型FGE的完整,成熟氨基酸序列,包括相应野生型FGE的任何野生型同等型(例如作为可变剪接的结果)。作为全长FGE的一个例子,FGE可以是全长人FGE,诸如包括与氨基酸序列
MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD(SEQ ID NO:1;下文表4中提供)具有至少80%,85%,90%,95%,或更多(例如100%)序列同一性的氨基酸序列的全长人FGE。
在其它实施方案中,FGE是保留甲酰甘氨酸生成活性的N端截短的FGE。“N端截短的”意味着FGE包括比相应野生型FGE的N端处存在的氨基酸的数目要少,包括相应野生型FGE的任何野生型同等型(例如作为可变剪接的结果)。N端截短的FGE是否保留甲酰甘氨酸生成活性可以使用任何便利办法来测定,包括在体外在下述条件下组合截短的FGE与包括FGE识别位点的蛋白质,在该条件中具有甲酰甘氨酸生成活性的FGE会将FGE识别位点的半胱氨酸(或丝氨酸)残基转变成甲酰甘氨酸残基,并测定FGE识别位点的半胱氨酸(或丝氨酸)残基是否转变成甲酰甘氨酸残基。用于检测转变成甲酰甘氨酸残基的体外反应条件和方法的例子描述于本文中别处。
在某些方面,N端截短的FGE(例如在N端处截短的人FGE)具有1-72个氨基酸N端截短,而且可以相对于相应的全长FGE在N端处缺失1-5个氨基酸,1-10个氨基酸,1-15个氨基酸,1-20个氨基酸,1-25个氨基酸,1-30个氨基酸,1-35个氨基酸,1-40个氨基酸,1-45个氨基酸,1-50个氨基酸,1-55个氨基酸,1-60个氨基酸,或1-70个氨基酸。
在某些方面,截短的FGE是在N端处截短的人FGE,其中N端截短的人FGE长300至373个氨基酸(例如长302至373个氨基酸),诸如长302至370,302至360,302至350,302至340,302至330,302至320,或302至310个氨基酸。
依照某些实施方案,N端截短的FGE在长度上对应于天然发生FGE蛋白酶切割产物。例如,N端截短的FGE可以在长度上对应于人FGE的弗林蛋白酶切割产物。弗林蛋白酶在人FGE的位置72处的精氨酸和位置73处的谷氨酸之间切割,产生相对于没有受到弗林蛋白酶切割的人FGE具有72个氨基酸N端截短的切割产物。依照一个实施方案,N端截短的人FGE对应于人FGE的弗林蛋白酶切割产物,产生相对于全长人FGE的72个氨基酸N端截短,如表4中显示的(SEQ ID NO:1)。
表4:例示性全长人FGE(没有下划线的和标有下划线的氨基酸)和例示性截短的人FGE(仅标有下划线的)
编码全长FGE或截短的FGE的核酸,以及包括它们的表达载体可以使用任何合适办法来制备,包括基于重组DNA的办法。作为一个例子,编码截短的FGE的核酸可以通过限制性消化编码全长FGE的核酸,或使用编码全长FGE的核酸作为模板,PCR扩增编码截短的FGE的区域来制备。可以将此类限制性消化或扩增产物克隆入适合于在感兴趣宿主细胞中表达全长或截短的FGE的表达载体。然后可以用表达载体转化/转染感兴趣宿主细胞,随后在宿主细胞中生成FGE。可用于生成全长和截短的FGE的表达载体和宿主细胞描述于本文中下文。
FGE(例如全长FGE或N端截短的FGE)可以作为融合蛋白质来提供,其中FGE融合至对于FGE是异源的氨基酸序列(例如纯化标签,蛋白酶识别序列,分泌信号序列,内质网(ER)引导信号序列,ER停留序列(例如KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)),和/或诸如此类)。本文中公开的FGE(例如全长FGE,N端截短的FGE,和/或它们的融合蛋白质)可用于本文中公开的方法以提供活化的FGE。
FGE识别位点
蛋白质的FGE识别位点(在本文中也称作“硫酸酯酶基序”)可以有变化。最小限度的识别位点通常长5或6个氨基酸残基,通常长不多于6个氨基酸残基。蛋白质中提供的整个识别位点是至少5或6个氨基酸残基,而且可以长例如5至16,6-16,5-15,6-15,5-14,6-14,5-13,6-13,5-12,6-12,5-11,6-11,5-10,6-10,5-9,6-9,5-8,或6-8个氨基酸残基,从而限定长少于16,15,14,13,12,11,10,9,8,7或6个氨基酸残基的FGE识别位点。在某些实施方案中,蛋白质的FGE识别位点通过下式来描述:
X1Z1X2Z2X3Z3(I)
其中
Z1为半胱氨酸或丝氨酸(它也可以由(C/S)代表);
Z2为脯氨酸或丙氨酸残基任一(它也可以由(P/A)代表);
Z3为碱性氨基酸(例如精氨酸(R),而且可以是赖氨酸(K)或组氨酸(H),通常是赖氨酸),或脂肪族氨基酸(丙氨酸(A),甘氨酸(G),亮氨酸(L),缬氨酸(V),异亮氨酸(I),或脯氨酸(P),通常是A,G,L,V,或I);
X1存在或缺失,而且当存在时,可以为任何氨基酸,尽管通常是脂肪族氨基酸,含硫氨基酸,或极性,不带电荷氨基酸(即除芳香族氨基酸或带电荷氨基酸以外),通常是L,M,V,S或T,更加通常是L,M,S或V,前提是当FGE识别位点处于靶多肽的N端时,X1存在;且
X2和X3可以独立为任何氨基酸,尽管通常是脂肪族氨基酸,极性,不带电荷的氨基酸,或含硫氨基酸(即除芳香族氨基酸或带电荷氨基酸以外),例如S,T,A,V,G或C;例如S,T,A,V或G。在一个例子中,蛋白质的FGE识别位点是式L(C/S)TPSR(SEQ ID NO:3)的,例如LCTPSR(SEQ ID NO:4)或LSTPSR(SEQ ID NO:5)。
FGE识别位点的例子记载于例如美国专利No.7,985,783和美国专利申请公开文本No.US2011/0117621,通过援引将它们的公开文本完整收入本文用于所有目的。
包括FGE识别位点的蛋白质
含有FGE识别位点的蛋白质可以是任何感兴趣蛋白质且包括期望缀合感兴趣药剂,例如治疗剂,成像剂,等的蛋白质。感兴趣蛋白质包括那些具有天然发生氨基酸序列,具有N端甲硫氨酸的天然氨基酸序列的,天然发生蛋白质的片段,和非天然发生蛋白质和其片段。在一些实施方案中,蛋白质是除硫酸酯酶或其片段以外的,除报告蛋白质以外的,或除preprolactin或促乳素以外的蛋白质。
含有FGE识别序列的蛋白质可以是与FGE相同或不同起源的。在本公开文本的方法牵涉基于细胞的方法的情况中,含有FGE识别位点的蛋白质可以对于宿主细胞是内源的(例如硫酸酯酶)和/或宿主细胞可以经遗传修饰而表达含有FGE识别序列的蛋白质。在这个实施方案中,FGE可以对于宿主细胞是内源的和/或宿主细胞可以经遗传修饰而表达FGE。
在某些方面,蛋白质是可提供治疗或其它临床益处的蛋白质,包括附着至模块能提供下述一项或多项的蛋白质:例如蛋白质结合至靶细胞(例如癌细胞)后升高的细胞毒性,蛋白质结合的细胞的成像(例如体内成像),血清半衰期延长,不利免疫应答降低,另外的或备选的生物学活性或功能性,或其它益处或不利副作用降低。在治疗性蛋白质是用于疫苗的抗原的情况中,修饰能提供增强的蛋白质的免疫原性。
蛋白质可以是一类蛋白质的成员,诸如治疗性蛋白质,包括但不限于细胞因子,趋化因子,配体,生长因子,激素,生长激素,酶(例如硫酸酯酶,例如人硫酸酯酶或其功能性片段),抗体和抗体片段(包括抗原结合性抗体片段),和抗原。别的例子包括红细胞生成素(EPO,例如天然EPO,合成EPO(参见例如US 2003/0191291),人生长激素(hGH),牛生长激素(bGH),促卵泡激素(FSH),干扰素(例如IFN-γ,IFN-β,IFN-α,IFN-ω,共有干扰素,诸如此类),胰岛素,胰岛素样生长因子(例如IGF-I,IGF-II),血液因子(例如因子VIII,因子IX,因子X,组织纤溶酶原激活剂(TPA),诸如此类),集落刺激因子(例如粒细胞-CSF(G-CSF),巨噬细胞-CSF(M-CSF),粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF),诸如此类),转化生长因子(例如TGF-β,TGF-α),白介素(例如IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-12,诸如此类),表皮生长因子(EGF),血小板衍生生长因子(PDGF),成纤维细胞生长因子(FGF,例如aFGF,bFGF),胶质细胞系衍生生长因子(GDNF),神经生长因子(NGF),RANTES,诸如此类。
在一些实施方案中,蛋白质可以提供支架用于附着感兴趣模块,诸如药物和/或成像剂。此类蛋白质的例子包括但不限于血清清蛋白(例如人血清清蛋白,牛血清清蛋白),Fc多肽(例如IgG Fc片段(例如IgG1Fc片段,IgG2Fc片段,IgG3Fc片段,或IgG4Fc片段)),诸如此类。在这里蛋白质是Fc多肽,该Fc多肽可以是哺乳动物Fc多肽(例如人Fc多肽)。
依照某些实施方案,蛋白质是抗体或抗体片段。术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白,全抗体(例如抗体由四聚体构成,其继而由两个重和轻链多肽的异二聚体构成,包括全IgG,IgA,IgD,IgE,或IgM抗体);半抗体(例如抗体包括一个重和轻链多肽的二聚体);保留对感兴趣抗原的特异性结合的抗体片段(例如全抗体的片段,诸如IgG,IgA,IgD,IgE,或IgM抗体的片段),包括但不限于Fab,F(ab′)2,Fab’,Fv,scFv,双特异性抗体和双抗体;嵌合抗体;单克隆抗体;人源化抗体(例如人源化单克隆抗体,或人源化抗体片段);或完全人抗体(只包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体)。还包括的是由于V-D-J重排而拥有体细胞突变和/或N-或P-核苷酸添加和删除的人单克隆抗体。还包括的是已经将合成序列插入互补决定区(CDR)的人抗体(参见例如Miersch S&Sidhu SS(2012)Synthetic antibodies:concepts,potential and practical considerations.Methods57(4):486-98;和Knappik et al.(2000)Fully synthetic human combinatorialantibody libraries(HuCAL)based on modular consensus frameworks and CDRsrandomized with trinucleotides.J.Mol.Biol.296(1):57-86)。在某些方面,本公开文本的抗体选自IgG(例如IgG1,IgG2,IgG3或IgG4抗体),Fab,F(ab′)2,和Fab′。
抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个相同的抗原结合片段,称作“Fab”片段,每个具有一个抗原结合位点,和剩余的“Fc”片段,命名反映了易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍然能够交联抗原的F(ab′)2片段。
“Fv”包含最小限度的抗体片段,其含有完整抗原识别和抗原结合位点。此区由紧密,非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体的界面上限定抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使一个可变域(或只包含三个对抗原特异性的CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,尽管处于比整个结合位点要低的亲和力。
“Fab”片段还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab片段与Fab′片段的不同在于在重链CH1域的羧基端处添加少数残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中关于如下Fab′的命名,其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab′片段生成的,它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域,其中这些域存在于一条多肽链中。在一些实施方案中,Fv多肽进一步包含VH和VL域之间的多肽接头,使得sFv能够形成抗原结合期望的结构。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,该片段包含在同一多肽链(VH-VL)中连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用短得不容许同一条链上的两个域之间配对的接头,迫使各域与另一条链的互补域配对并创建两个抗原结合位点。
如本文中使用的,术语“重组”抗体意图包括通过重组手段制备,表达,创建,或分离的所有抗体,诸如(i)使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体;(ii)自重组,组合抗体库分离的抗体;(iii)自对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体;或(iv)通过牵涉将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它手段制备,表达,创建,或分离的抗体,包括例如体外翻译技术(参见例如Yin et al.(2012)Aglycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable invitro transcription-translation system,Landes Bioscience,Volume 4,Issue 2)。此类重组抗体包括人源化,CDR嫁接,嵌合,去免疫化,和体外生成抗体;而且可以任选包括自人种系免疫球蛋白序列衍生的恒定区。
“人源化抗体”意味着免疫球蛋白,半抗体,免疫球蛋白链(例如轻链多肽)或其片段(诸如Fv,scFv,Fab,Fab′,F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)含有自人和非人免疫球蛋白二者衍生的序列。人源化抗体可以是如下的人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有期望特异性,亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠,大鼠,lama,骆驼或家兔的CDR的残基替换。在一些情况中,人免疫球蛋白的Fv框架残基由相应的非人残基替换。而且,人源化抗体可以包含在受体抗体中和在所输入的CDR或框架序列中均没有找到的残基。
人轻链多肽典型地归类为卡帕(κ)和拉姆达(λ)轻链。而且,人重链多肽典型地归类为缪(μ),德耳塔(δ),伽马(γ),阿尔法(α),或厄普西隆(ε),而且将抗体的同种型分别定义为IgM,IgD,IgG,IgA,和IgE。在轻和重链内,可变和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包括约10或更多个氨基酸的“D”区。
在某些方面,包含FGE识别位点的蛋白质是IgG或其片段,Fab,F(ab’)2,Fab’,Fv,ScFv,双特异性抗体或其片段,双抗体或其片段,嵌合抗体或其片段,单克隆抗体或其片段,人源化抗体或其片段,和完全人抗体或其片段。
抗体特异性结合的感兴趣抗原包括肿瘤特异性抗原,例如存在于恶性细胞的表面上且不存在于非恶性细胞上的抗原。在其它方面,受到抗体结合的抗原是肿瘤相关抗原。“肿瘤相关抗原”意味着在恶性细胞上表达且在正常组织的细胞上有限表达的抗原,在恶性细胞上比在正常细胞上以高得多的密度表达的抗原,或发育性表达的抗原。
任何肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原可以由本公开文本的抗体靶向。在某些方面,当本公开文本的方法用于治疗癌症时,由本公开文本的抗体或缀合物的抗体成分特异性结合的抗原可以包括但不限于HER2,CD19,CD22,CD30,CD33,CD56,CD66/CEACAM5,CD70,CD74,CD79b,CD138,柄蛋白-4,间皮素,跨膜糖蛋白NMB(GPNMB),前列腺特异性膜抗原(PSMA),SLC44A4,CA6,CA-IX,或任何其它感兴趣肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。
“特异性结合”在抗体的特征的语境中指抗体优先结合存在于不同抗原的均质混合物中的特定抗原的能力。在某些实施方案中,特异性结合相互作用会区分样品或有机体(例如人)中的想要的和不想要的抗原(或“靶”和“非靶”抗原),在一些实施方案中超过约10至100倍或更多(例如超过约1000或10,000倍)。在某些实施方案中,当它们在抗体-抗原复合物中特异性结合时抗体和抗原之间的亲和力特征在于小于10-6M,小于10-7M,小于10-8M,小于10-9M,小于10-10M,小于10-11M,或小于约10-12M或更小的KD(解离常数)。
生成活化的FGE的方法
本公开文本提供生成活化的FGE的方法。如本文中使用的,“活化的甲酰甘氨酸生成酶”或“活化的FGE”指通过将氧化试剂添加至表达FGE的细胞和/或通过将氧化试剂添加至分离的FGE,已经用氧化试剂处理的FGE。因而,在某些方面,本公开文本提供生成活化的FGE的方法,该方法包括用氧化试剂处理FGE以生成活化的FGE。“氧化试剂”意味着能够氧化FGE的试剂(它可以称作“氧化性药剂”),能够催化FGE氧化的试剂,或其组合。能够催化FGE氧化的试剂的一个例子是Cu2+。包括能够氧化FGE的试剂和催化FGE氧化的试剂的氧化试剂的一个例子是包括作为终末氧化剂的元素氧和诸如但不限于Cu2+的过渡金属的试剂。这些和其它合适氧化试剂在下文描述。
活化的FGE可以作为在宿主细胞内表达并活化FGE的体内蛋白质合成方法的一部分而生成,该方法可任选包括在宿主细胞中共表达含有FGE识别位点的感兴趣蛋白质。就是说,FGE可以存在于宿主细胞中,并且通过在培养宿主细胞的细胞培养基中提供氧化试剂(例如Cu2+)来处理FGE以生成活化的FGE。例如,本发明人发现(通过在细胞培养基中提供Cu2 +)用氧化试剂诸如Cu2+处理表达FGE的细胞提供FGE活化,使得经过处理的细胞中共表达的靶蛋白质的FGE识别位点内的半胱氨酸残基以与未用Cu2+处理但其它方面处于相同条件下的细胞中的转变相比升高的产率转变成甲酰甘氨酸残基(见下文实施例部分)。例如,如本文所述用氧化试剂处理表达FGE的细胞可引起由表达FGE的细胞生成的活化的FGE的群体增多。类似地,如本文所述用氧化试剂处理表达FGE的细胞可引起不是由表达FGE的细胞生成的活化的FGE的FGE群体减少。
因而,在某些实施方案中,氧化试剂是Cu2+,而且处理FGE包括在包括Cu2+的细胞培养基中培养包括编码FGE的核酸的细胞,其中该培养在下述条件下进行,在该条件中FGE在细胞中表达。在某些方面,本公开文本提供包括在包括Cu2+的细胞培养基中培养包括编码FGE的核酸的细胞的方法,其中该培养在下述条件下进行,在该条件中FGE在细胞中表达。
Cu2+源(例如铜盐或其它合适Cu2+源)和细胞培养基中的Cu2+浓度可以选择成细胞培养相容的,例如不影响或没有实质性影响细胞存活力,蛋白质表达水平,等。例如,当宿主细胞是原核细胞时,Cu2+源和浓度可以选择成与原核细胞培养相容。类似地,当宿主细胞是例如哺乳动物细胞时,Cu2+源和浓度可以选择成与哺乳动物细胞培养相容。适合于原核和哺乳动物细胞中的体内FGE活化的培养条件的例子在下文实施例部分中提供。
在某些方面,Cu2+通过将铜盐添加至细胞培养基来提供。合适的铜盐包括但不限于硫酸铜(即硫酸铜(II),CuSO4),柠檬酸铜,酒石酸铜,硝酸铜,和其任何组合。
Cu2+以适合于FGE活化的浓度存在于细胞培养基中。在某些方面,Cu2+以1nM至100mM,诸如0.1μM至10mM,0.5μM至5mM,1μM至1mM,2μM至500μM,3μM至250μM,4μM至150μM,或5μM至100μM(例如5μM至50μM)的浓度存在于细胞培养基中。
依照某些实施方案,Cu2+以1nM或更多,10nM或更多,100nM或更多,1μM或更多,5μM或更多,10μM或更多,20μM或更多,30μM或更多,40μM或更多,50μM或更多,100μM或更多,200μM或更多,300μM或更多,400μM或更多,500μM或更多,1mM或更多,10mM或更多,或100mM或更多的浓度存在于细胞培养基中。在某些方面,Cu2+以100mM或更少,10mM或更少,1mM或更少,500μM或更少,400μM或更少,300μM或更少,200μM或更少,100μM或更少,50μM或更少,40μM或更少,30μM或更少,20μM或更少,10μM或更少,5μM或更少,1μM或更少,100nM或更少,10nM或更少,或1nM或更少的浓度存在于细胞培养基中。
适合于体内FGE活化的宿主细胞包括例如原核细胞(例如大肠杆菌细胞)和真核细胞(例如酵母细胞,昆虫细胞,哺乳动物细胞,等)。细胞可以经遗传修饰而表达FGE或感兴趣蛋白质和/或FGE可以对于细胞是内源的。
大肠杆菌(Escherichia coli)是可用于实施生成活化的FGE的方法的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌,诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),和其它肠细菌,诸如沙门氏菌属(Salmonella),沙雷氏菌属(Serratia),和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中,可以生成表达载体,它们典型地会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外,会存在任何数目的多种公知启动子,诸如乳糖启动子系统,色氨酸(trp)启动子系统,β-内酰胺酶启动子系统,或来自噬菌体拉姆达(λ)的启动子系统。启动子典型地会控制表达,任选与操纵基因序列一起,而且具有核糖体结合位点序列,诸如此类,用于起始和完成转录和翻译。
其它微生物(诸如酵母)对于实施生成活化的FGE的方法也是有用的。糖酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母属(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子,合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子),复制起点,终止序列,诸如此类。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸酯激酶和其它糖酵解酶。诱导型酵母启动子格外包括来自醇脱氢酶,异细胞色素C,和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
在微生物之外,可以采用哺乳动物细胞来实施生成活化的FGE的方法。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞,人细胞,或任何其它感兴趣哺乳动物细胞,包括但不限于选自CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞的细胞。用于这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列,诸如复制起点,启动子,和增强子(Queen et al.,Immunol.Rev.89:49(1986)),和必要的加工信息位点,诸如核糖体结合位点,RNA剪接位点,聚腺苷酸化位点,和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是自免疫球蛋白基因,SV40,腺病毒,牛乳头状瘤病毒,巨细胞病毒,诸如此类衍生的启动子。参见Co et al.,J.Immunol.148:1149(1992)。
适合于在宿主细胞中表达FGE的培养条件记载于例如美国专利No.7,985,783和美国专利申请公开文本No.US2011/0117621,通过援引将其公开文本完整收入本文用于所有目的。FGE可以对于宿主细胞是内源的,或宿主细胞可以对于对于宿主细胞是异源的合适的FGE是重组的。FGE表达可以由对于FGE基因是内源的表达系统来提供(例如由宿主细胞的天然FGE基因中存在的启动子和其它控制元件提供的表达),或可以由其中FGE编码序列可操作连接至异源启动子以提供组成性或诱导型表达的重组表达系统来提供。使用强启动子来提供高水平的FGE表达在某些实施方案中可能特别感兴趣。细胞培养基的类型和其中的成分可以选择成与FGE在其中表达的特定细胞类型相容。
该方法可以进一步包括自细胞和/或氧化试剂纯化活化的FGE。可以使用任何方便的蛋白质纯化规程来分离活化的FGE。参见例如Guide to Protein Purification,2ndEdition(Burgess&Deutscher ed.)(Academic Press,2009)(ISBN:9780123745361)。例如,可以自生成活化的FGE的细胞制备裂解物,并使用HPLC,大小排阻层析,凝胶电泳,亲和层析,诸如此类纯化。
活化的FGE也可以作为体外,无细胞蛋白质合成方法的一部分而生成,该方法可任选包括在反应混合物中共表达含有FGE识别序列的靶多肽。因而,在某些方面,本公开文本的方法包括在具有氧化试剂的无细胞反应混合物中表达FGE,其中氧化试剂可以是Cu2+。依照这些方面,无细胞反应混合物使得FGE不在细胞中,而是在适合于体外蛋白质合成的反应混合物中表达。例示性的无细胞反应混合物包括但不限于无细胞提取物,细胞裂解物,和重建的翻译系统,连同用于合成FGE和任何其它期望蛋白质(例如具有FGE识别位点的蛋白质,如本文中别处描述的)的核酸模板。
无细胞反应混合物可包括要合成的高分子的单体,例如氨基酸,核苷酸,等,和此类辅因子,酶和任何其它必需试剂,例如核糖体,tRNA,聚合酶,转录因子,等。在上述成分诸如无细胞提取物,核酸模板,和氨基酸之外,可以将蛋白质合成特异性需要的材料添加至反应。材料可包括盐,亚叶酸,环状AMP,蛋白质或核酸降解酶的抑制剂,蛋白质合成的抑制剂或调节剂,氧化/还原势的调节剂,非变性表面活性剂,缓冲剂成分,精胺,亚精胺,腐胺,等。多种无细胞合成反应系统记载于例如Kim,D.M.and Swartz,J.R.Biotechnol.Bioeng.66:180-8(1999);Kim,D.M.and Swartz,J.R.Biotechnol.Prog.16:385-90(2000);Kim,D.M.and Swartz,J.R.Biotechnol.Bioeng.74:309-16(2001);Swartz et al,Methods MoLBiol.267:169-82(2004);Kim,D.M.and Swartz,J.R.Biotechnol.Bioeng.85:122-29(2004);Jewett,M.C.and Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.86:19-26(2004);Yin,G.andSwartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.86:188-95(2004);Jewett,M.C.and Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.87:465-72(2004);Voloshin,A.M.and Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.91:516-21(2005)。另外的用于感兴趣蛋白质的无细胞合成的条件记载于国际公开文本No.WO2010/081110,通过援引将其公开文本完整收入本文。
在某些实施方案中,无细胞蛋白质合成提供某些优势胜过常规的体内蛋白质表达方法。无细胞系统能将细胞的大多数(如果不是所有)代谢资源指引朝向一种蛋白质的排他性生成。此外,在体外没有细胞壁和膜成分可能是有利的,因为它容许控制合成环境。例如,能改变tRNA水平以反映所表达的基因的密码子选择。也能以比体内蛋白质合成更大的灵活性改变氧化试剂的类型或浓度,氧化还原势,pH,或离子强度,因为不存在细胞生长或存活力的担心。而且,能容易地实现纯化的,正确折叠的蛋白质产物的直接回收。
活化的FGE也可以作为体外活化方法的一部分而生成。依照此类实施方案,没有在氧化试剂存在下表达FGE。此类方法基于本发明人的发现,即表达FGE(例如在细胞或无细胞翻译系统中),纯化FGE,然后在体外用氧化试剂处理FGE导致FGE活化。此类体外活化的FGE以与非活化的FGE在其它方面相同条件下的转变相比升高的效率转变靶蛋白质的FGE识别位点内的半胱氨酸或丝氨酸残基(见下文实施例部分)。
用于活化FGE的氧化试剂可以选自任何方便的与期望的反应条件相容的氧化试剂。例如,氧化试剂可以是元素氧,诸如作为终末氧化剂的元素氧。在一些情况中,作为终末氧化剂的元素氧可以作为氧,氧和硫化氢的混合物,在碱性条件下的氧,诸如此类来提供。
在某些实施方案中,氧化试剂是元素氧,诸如作为终末氧化剂的元素氧,其中反应由过渡金属催化。在这些情况中,氧化试剂可包括但不限于能催化氧活化的铜(II)(即Cu2+)或铜(II)源(例如硫酸铜(CuSO4),柠檬酸铜,酒石酸铜,硝酸铜,Fehling氏试剂,Benedict氏试剂,等)。在一些情况中,能催化氧活化的氧化试剂(例如Cu2+)在氧存在下提供。例如,氧化试剂可包括氧和Cu2+,Cu2+源,或其组合。
在某些实施方案中,氧化试剂是铜(II)(即Cu2+)或铜(II)源(即Cu2+源)。在一些情况中,铜(II)或铜(II)源在氧存在下提供。在一些情况中,氧化试剂是铜(II),诸如铜(II)和氧。在一些情况中,氧化试剂是铜(II)源,诸如铜(II)源和氧。在某些情况中,铜(II)源是但不限于硫酸铜,柠檬酸铜,酒石酸铜,Fehling氏试剂,Benedict氏试剂,其组合,诸如此类。在一些情况中,铜(II)源是硫酸铜(CuSO4)。
用于体外蛋白质氧化的反应条件可以随所采用的具体氧化试剂而变化。用于使用例示性氧化试剂体外FGE活化的例示性反应条件在下文实施例部分中提供。
FGE的活化可包括在FGE活化反应混合物中组合FGE和氧化试剂。在一些情况中,FGE活化反应混合物是水性溶液。在某些情况中,FGE活化反应混合物是缓冲的水性溶液,例如包括缓冲剂的水性溶液,诸如但不限于三乙醇胺。在某些情况中,缓冲的水性溶液具有与FGE相容的pH范围,诸如5至10,或5至9,或6至8的pH范围,例如约7的pH,诸如pH 7.4。
在某些实施方案中,FGE的活化可包括在FGE活化反应混合物中组合FGE和氧化试剂,其中FGE存在于中FGE活化反应混合物中且氧化试剂然后添加至FGE活化反应混合物。在其它实施方案中,FGE的活化可包括在FGE活化反应混合物中组合FGE和氧化试剂,其中氧化试剂存在于FGE活化反应混合物中且FGE然后添加至FGE活化反应混合物。
在某些实施方案中,FGE活化反应混合物中FGE与氧化试剂的摩尔比是5:1,或4:1,或3:1,或2:1,或1:1,或1:2,或1:3,或1:4,或1:5。在一些情况中,FGE活化反应混合物中FGE与氧化试剂的摩尔比是1:2。
在某些情况中,在FGE活化反应混合物中组合FGE和氧化试剂之后,混合FGE活化反应混合物。可以使用用于混合FGE活化反应混合物的任何方便的方法,诸如搅动,漩涡震荡,诸如此类。FGE活化反应混合物可以混合一定时间段以容许FGE变成活化的FGE的充分活化,诸如15分钟或更多,或30分钟或更多,或45分钟或更多,或1小时或更多,或2小时或更多,或3小时或更多,或4小时或更多,或5小时或更多。在一些情况中,FGE活化反应混合物混合1小时。混合FGE活化反应混合物可以于室温左右实施,例如范围为20℃至30℃的温度,诸如25℃。适合于活化的温度可以随所采用的特定氧化试剂而变化。
FGE变成活化的FGE的充分活化可以使用FGE活性测定法测量,如本文中描述的。在FGE变成活化的FGE的充分活化之后,活化的FGE可以与FGE活化反应混合物分开。可以使用任何方便的用于蛋白质分离的方法将活化的FGE与FGE活化反应混合物分开,诸如但不限于透析,缓冲液交换,渗滤,沉淀,离子交换层析,亲和层析,电泳,诸如此类。在一些情况中,可以通过缓冲液交换将活化的FGE与FGE活化反应混合物分开。
本公开文本还提供的是通过本文中描述的用于生成活化的FGE的任何方法生成的活化的FGE。依照某些实施方案,活化的FGE没有自氧化试剂纯化。例如,FGE可以存在于细胞或反应混合物中,在其中用氧化试剂处理FGE。在其它方面,使用合适的蛋白质分离规程将活化的FGE与FGE活化反应混合物分开,包括本文中别处描述的任何此类分离规程。
使用活化的FGE的方法
本公开文本的活化的FGE可用于想要它的多种体内和体外应用,例如感兴趣蛋白质(或“靶蛋白质”)中的FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。甲酰甘氨酸残基的醛基团对于例如感兴趣药剂(例如治疗剂,成像剂,等)对靶蛋白质的位点特异性缀合是有用的。因而,本公开文本提供使用活化的FGE的方法。
在某些方面,提供的是生成包括甲酰甘氨酸残基的蛋白质的方法。该方法包括在下述条件下组合活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)与包括FGE识别位点的蛋白质,在该条件中活化的FGE将FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基,以生成包括甲酰甘氨酸残基的蛋白质。
在一些实施方案中,活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质在包括还原剂的反应混合物中组合。在一些实施方案中,还原剂促进FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。在一些实施方案中,还原剂是2-巯基乙醇。如本文中使用的,促进FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基指由活化的FGE生成的fGly的量(例如浓度)与在还原剂缺失下的转变反应相比增多。在某些情况中,还原剂将由活化的FGE生成的fGly的量与在还原剂缺失下的转变反应相比增多5%或更多,或10%或更多,或15%或更多,或20%或更多,或25%或更多,或30%或更多,或35%或更多,或40%或更多,或45%或更多,或50%或更多,或55%或更多,或60%或更多,或65%或更多,或70%或更多,或75%或更多,或80%或更多,或85%或更多,或90%或更多,或95%或更多,或100%或更多。在某些实施方案中,还原剂将由活化的FGE生成的fGly的量与在还原剂缺失下的转变反应相比增多50%或更多。
体内转变
包括甲酰甘氨酸残基的蛋白质可以作为体内蛋白质合成和转变方法的一部分在宿主细胞内生成。依照某些实施方案,组合活化的FGE与包括FGE识别位点的蛋白质包括培养包括FGE和包括FGE识别位点的蛋白质的细胞。培养在包括Cu2+作为氧化试剂的细胞培养基中在下述细胞培养条件下进行,在该条件下FGE将FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。在某些方面,细胞包括编码FGE和包括FGE识别位点的蛋白质的核酸,使得FGE和包括FGE识别位点的蛋白质在细胞中共表达。
细胞培养基中的Cu2+源(例如铜盐或其它合适的Cu2+源)和Cu2+浓度可以选择成与细胞培养相容,例如不影响或没有实质性影响细胞存活力,蛋白质表达水平,等。例如,当宿主细胞是原核细胞时,Cu2+源和浓度可以选择成与原核细胞培养相容。类似地,当宿主细胞是例如哺乳动物细胞时,Cu2+源和浓度可以选择成与哺乳动物细胞培养相容。适合于原核和哺乳动物细胞中的体内FGE活化的培养条件的例子在下文实施例部分中提供。
在某些方面,Cu2+通过将铜盐添加至细胞培养基来提供。合适的铜盐包括但不限于硫酸铜(即硫酸铜(II),CuSO4),柠檬酸铜,酒石酸铜,硝酸铜,和其任何组合。
Cu2+以适合于FGE活化的浓度存在于细胞培养基中。在某些方面,Cu2+以1nM至100mM,诸如0.1μM至10mM,0.5μM至5mM,1μM至1mM,2μM至500μM,3μM至250μM,4μM至150μM,或5μM至100μM(例如5μM至50μM)的浓度存在于细胞培养基中。
依照某些实施方案,Cu2+以1nM或更多,10nM或更多,100nM或更多,1μM或更多,5μM或更多,10μM或更多,20μM或更多,30μM或更多,40μM或更多,50μM或更多,100μM或更多,200μM或更多,300μM或更多,400μM或更多,500μM或更多,1mM或更多,10mM或更多,或100mM或更多的浓度存在于细胞培养基中。在某些方面,Cu2+以100mM或更少,10mM或更少,1mM或更少,500μM或更少,400μM或更少,300μM或更少,200μM或更少,100μM或更少,50μM或更少,40μM或更少,30μM或更少,20μM或更少,10μM或更少,5μM或更少,1μM或更少,100nM或更少,10nM或更少,或1nM或更少的浓度存在于细胞培养基中。
适合于共表达FGE和包括FGE识别位点的蛋白质的宿主细胞包括例如原核细胞(例如大肠杆菌细胞)和真核细胞(例如酵母细胞,昆虫细胞,哺乳动物细胞,等)。
大肠杆菌(Escherichia coli)是可用于实施生成包括甲酰甘氨酸残基的蛋白质的方法的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌,诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),和其它肠细菌,诸如沙门氏菌属(Salmonella),沙雷氏菌属(Serratia),和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中,可以生成表达载体,它们典型地会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外,会存在任何数目的多种公知启动子,诸如乳糖启动子系统,色氨酸(trp)启动子系统,β-内酰胺酶启动子系统,或来自噬菌体拉姆达(λ)的启动子系统。启动子典型地会控制表达,任选与操纵基因序列一起,而且具有核糖体结合位点序列,诸如此类,用于起始和完成转录和翻译。
其它微生物(诸如酵母)对于实施生成包括甲酰甘氨酸残基的蛋白质的方法也是有用的。糖酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母属(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子,合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子),复制起点,终止序列,诸如此类。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸酯激酶和其它糖酵解酶。诱导型酵母启动子格外包括来自醇脱氢酶,异细胞色素C,和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
在微生物之外,可以采用哺乳动物细胞来实施生成包括甲酰甘氨酸残基的蛋白质的方法。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞,人细胞,或任何其它感兴趣哺乳动物细胞,包括但不限于选自CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞的细胞。用于这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列,诸如复制起点,启动子,和增强子(Queen et al.,Immunol.Rev.89:49(1986)),和必要的加工信息位点,诸如核糖体结合位点,RNA剪接位点,聚腺苷酸化位点,和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是自免疫球蛋白基因,SV40,腺病毒,牛乳头状瘤病毒,巨细胞病毒,诸如此类衍生的启动子。参见Co et al.,J.Immunol.148:1149(1992)。
体外转录方法的背景中的无细胞转变
包括甲酰甘氨酸残基的蛋白质可以作为体外,无细胞蛋白质合成和转变方法的一部分而生成。在某些方面,该方法包括在包括氧化试剂(例如Cu2+)的无细胞反应混合物中在下述条件下表达FGE和包括FGE识别位点的蛋白质,在该条件中FGE将FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。依照这些方面,无细胞反应混合物使得FGE和包括FGE识别位点的蛋白质不在细胞中,而是在适合于体外蛋白质合成的反应混合物中表达。例示性的无细胞反应混合物包括但不限于无细胞提取物,细胞裂解物,和重建的翻译系统,连同用于合成FGE和包括FGE识别位点的蛋白质的核酸模板。无细胞反应混合物的成分可以如本文中上文关于用于生成活化的FGE的体外,无细胞蛋白质合成方法描述的。
使用活化的FGE的体外转变
包括甲酰甘氨酸残基的蛋白质也可以作为体外转变方法的一部分而生成,其中在无细胞反应混合物中组合活化的FGE和包括FGE识别位点的蛋白质。依照这些实施方案,FGE和包括FGE识别位点的蛋白质不在无细胞反应混合物中表达。此类方法基于表达FGE(例如在细胞或无细胞翻译系统中),纯化FGE,然后在体外用氧化试剂处理FGE以产生FGE的活化。此类体外活化的FGE以与非活化的FGE在其它方面相同条件下的转变相比升高的效率转变包括FGE识别位点的蛋白质的FGE识别位点内的半胱氨酸或丝氨酸残基(见下文实施例部分)。
在一些实施方案中,反应混合物包括铜(II)离子(即Cu2+),或铜(II)离子源,例如硫酸铜(CuSO4),柠檬酸铜,酒石酸铜,诸如此类。在含有Cu2+的无细胞反应混合物中表达FGE和具有FGE识别位点的蛋白质可以在下述条件下发生,在该条件中FGE将FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸(Fgly)残基,如本文中描述的。
在某些实施方案中,生成具有FGly残基的蛋白质的体外方法包括在无细胞反应混合物中组合活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质。在这些实施方案中,可以在组合活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质之前活化FGE以形成活化的FGE。“活化的”意味着活化的FGE具有与尚未活化的FGE相比更大的活性,例如更大的将FGE识别位点的半胱氨酸或丝氨酸残基转变成FGly的活性。例如,活化的FGE可具有与尚未活化的FGE相比1.5倍或更多,2倍或更多,5倍或更多,10倍或更多,20倍或更多,30倍或更多,40倍或更多,50倍或更多,60倍或更多,70倍或更多,80倍或更多,90倍或更多,100倍或更多有活性,诸如200倍或更多有活性的活性(如使用本文中描述的FGE活性测定法测量的),包括有300倍或更多,或400倍或更多,或500倍或更多,或600倍或更多,或700倍或更多,或800倍或更多,或900倍或更多,或1000倍或更多,或1500倍或更多,或2000倍或更多,或2500倍或更多,或3000倍或更多,或3500倍或更多,或4000倍或更多,或4500倍或更多,或5000倍或更多,或5500倍或更多,或6000倍或更多,或6500倍或更多,或7000倍或更多,或7500倍或更多,或8000倍或更多,或8500倍或更多,或9000倍或更多,或9500倍或更多,或10,000倍或更多活性。在某些情况中,活化的FGE具有与尚未活化的FGE相比3000倍或更多有活性的活性(如使用本文中描述的FGE活性测定法测量的)。在一些情况中,活化的FGE具有与尚未活化的FGE相比1.5至10,000倍,2至10,000倍,5至10,000倍,10至10,000倍,20至10,000倍,30至10,000倍,40至10,000倍,50至10,000倍,60至10,000倍,70至10,000倍,80至10,000倍,90至10,000倍,100至10,000倍更有活性的活性(如使用本文中描述的FGE活性测定法测量的),诸如500至9000倍,包括1000至8000倍,或1000至7000倍,或1000至6000倍,或1000至5000倍,或1000至4000倍,或2000至4000倍更有活性。在某些情况中,活化的FGE具有与尚未活化的FGE相比2000至4000倍更有活性的活性(如使用本文中描述的FGE活性测定法测量的)。
在某些实施方案中,可以在组合活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质之前活化FGE以形成活化的FGE。照此,在一些情况中,该方法包括在组合活化的FGE与具有FGE识别位点的蛋白质之前用氧化试剂活化FGE。
用于活化FGE的氧化试剂可以选自任何方便的与期望的反应条件相容的氧化试剂。例如,氧化试剂可以是元素氧,诸如作为终末氧化剂的元素氧。在一些情况中,作为终末氧化剂的元素氧可以作为氧,氧和硫化氢的混合物,在碱性条件下的氧,诸如此类来提供。
在某些实施方案中,氧化试剂是元素氧,诸如作为终末氧化剂的元素氧,其中反应由过渡金属催化。在这些情况中,氧化试剂可包括但不限于能催化氧活化的铜(II)或铜(II)源(例如硫酸铜,柠檬酸铜,酒石酸铜,Fehling氏试剂,Benedict氏试剂,等)。在一些情况中,能催化氧活化的氧化试剂(例如Cu2+)在氧存在下提供。例如,氧化试剂可包括氧和Cu2 +,Cu2+源,或其组合。
在某些实施方案中,氧化试剂是铜(II)或铜(II)源。在一些情况中,铜(II)或铜(II)源在氧存在下提供。在一些情况中,氧化试剂是铜(II),诸如铜(II)和氧。在一些情况中,氧化试剂是铜(II)源,诸如铜(II)源和氧。在某些情况中,铜(II)源是但不限于硫酸铜,柠檬酸铜,酒石酸铜,Fehling氏试剂,Benedict氏试剂,其组合,诸如此类。在一些情况中,铜(II)源是硫酸铜。
如上文描述的,在某些实施方案中,FGE与氧化试剂的摩尔比是5:1,或4:1,或3:1,或2:1,或1:1,或1:2,或1:3,或1:4,或1:5。在一些情况中,FGE活化反应混合物中FGE与氧化试剂的摩尔比是1:2。
如上文描述的,在某些实施方案中,生成具有FGly残基的蛋白质的体外方法包括在无细胞反应混合物中组合活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质。如上文描述的,可以在组合活化的FGE和具有FGE识别位点的蛋白质之前活化FGE以形成活化的FGE。用于生成活化的FGE的办法在上文用于生成活化的FGE的方法的描述中详细描述。
在某些实施方案中,活化的FGE与具有FGE识别位点的蛋白质的比(即转变反应中活化的FGE与蛋白质的比)是以摩尔计200%或更少,诸如以摩尔计150%或更少,或以摩尔计100%或更少,或以摩尔计75%或更少,或以摩尔计50%或更少,或以摩尔计25%或更少,或以摩尔计10%或更少,或以摩尔计5%或更少,或以摩尔计3%或更少,或以摩尔计1%或更少,或以摩尔计0.7%或更少,或以摩尔计0.5%或更少,或以摩尔计0.4%或更少,或以摩尔计0.3%或更少,或以摩尔计0.2%或更少,或以摩尔计0.1%或更少,或以摩尔计0.07%或更少,或以摩尔计0.05%或更少,或以摩尔计0.03%或更少,或以摩尔计0.01%或更少,或以摩尔计0.005%或更少。在某些实施方案中,活化的FGE与具有FGE识别位点的蛋白质的比是以摩尔计0.1%或更少,诸如以摩尔计0.1%。
依照某些实施方案,生成包含甲酰甘氨酸残基的蛋白质的方法进一步包括经由甲酰甘氨酸残基的醛模块将药剂缀合至所生成的蛋白质。在某些方面,药剂是治疗剂,成像剂,在施用于受试者后延长蛋白质的血清半衰期的药剂,在施用于受试者后降低蛋白质的免疫原性的药剂,在施用于受试者后提高蛋白质的免疫原性的药剂(例如当蛋白质是疫苗时),或任何其它期望缀合至所生成的蛋白质的药剂。
依照某些实施方案,该方法包括将治疗剂缀合至蛋白质。在某些方面,治疗剂选自细胞毒性药剂,抗增殖性药剂,抗赘生性药剂,抗生药剂,抗真菌药剂,和抗病毒药剂。
依照某些实施方案,感兴趣药剂是成像剂。成像剂可以是例如荧光染料,近红外(NIR)成像剂,和单光子发射计算机断层照相术(SPECT)/CT成像剂,核磁共振(NMR)成像剂,磁共振成像(MRI)药剂,正电子发射断层照相术(PET)药剂,x射线成像剂,计算机断层照相术(CT)成像剂,K-edge成像剂,超声成像剂,光声成像剂,声光成像剂,微波成像剂,核成像剂,和其组合。
作为用于与所生成的蛋白质的甲酰甘氨酸残基的醛反应的反应性配偶的成分提供感兴趣药剂。可使用一个较宽范围的商品化试剂来将感兴趣药剂附着至蛋白质的甲酰甘氨酸残基。例如,多种感兴趣药剂的氨氧基(aminooxy),酰肼(hydrazide),或氨基硫脲(thiosemicarbazide)衍生物是合适的反应性配偶,而且易于得到或可以使用标准化学方法生成。
组合物
本公开文本提供组合物,它们在某些方面是在实施本公开文本的方法中有用的组合物。
在第一个方面,提供的是包括细胞培养基的组合物,细胞培养基包括与细胞培养相容的氧化试剂,诸如Cu2+,和存在于细胞培养基中的细胞,其中细胞表达FGE。
Cu2+可以以任何期望浓度存在于细胞培养基中,包括适合于FGE活化的浓度。在某些方面,Cu2+以1nM至100mM,诸如0.1μM至10mM,0.5μM至5mM,1μM至1mM,2μM至500μM,3μM至250μM,4μM至150μM,或5μM至100μM(例如5μM至50μM)的浓度存在于细胞培养基中。
依照某些实施方案,Cu2+以1nM或更多,10nM或更多,100nM或更多,1μM或更多,5μM或更多,10μM或更多,20μM或更多,30μM或更多,40μM或更多,50μM或更多,100μM或更多,200μM或更多,300μM或更多,400μM或更多,500μM或更多,1mM或更多,10mM或更多,或100mM或更多的浓度存在于细胞培养基中。在某些方面,Cu2+以100mM或更少,10mM或更少,1mM或更少,500μM或更少,400μM或更少,300μM或更少,200μM或更少,100μM或更少,50μM或更少,40μM或更少,30μM或更少,20μM或更少,10μM或更少,5μM或更少,1μM或更少,100nM或更少,10nM或更少,或1nM或更少的浓度存在于细胞培养基中。
存在于细胞培养基中的细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌细胞),真核细胞(例如酵母细胞,昆虫细胞,哺乳动物细胞,等)。存在于细胞培养基中的细胞可包括自其表达FGE的核酸模板,和任选的用于表达包括FGE识别位点的蛋白质的核酸模板。
在某些方面,存在于细胞培养基中的细胞是选自CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞的哺乳动物细胞。
还提供的是无细胞组合物。在某些方面,无细胞组合物包括活化的FGE和缓冲剂。例如,活化的FGE可以存在于缓冲液中。任何活化的感兴趣FGE可以包括在无细胞组合物中,包括通过本文中描述的用于生成活化的FGE的任何方法生成的活化的FGE。依照某些实施方案,活化的FGE是纯化的活化的FGE,已经与反应混合物(例如体内或无细胞蛋白质合成反应混合物,和FGE活化反应混合物,等)分开,例如通过透析,缓冲液交换,渗滤,沉淀,离子交换层析,亲和层析,电泳,诸如此类。
可以采用适合于以活化的形式维持活化的FGE的缓冲剂。在某些方面,缓冲剂适合于提供具有与活化的FGE相容的pH范围的缓冲水性溶液,诸如5至9,或6至8的pH范围,例如pH约7,诸如pH 7.4。
本公开文本的无细胞组合物可进一步包括包括FGE识别位点的蛋白质。任何感兴趣的具有FGE识别位点的蛋白质可存在于无细胞组合物中,包括本文中在上文涉及包括FGE识别位点的蛋白质的部分中描述的任何蛋白质,例如感兴趣的具有FGE识别位点的抗体或抗体片段,等。
试剂盒
本公开文本的多个方面进一步包括试剂盒。依照本公开文本的某些实施方案的试剂盒可用于实施本公开文本的方法。
依照一个实施方案,提供的是包括活化的FGE,和关于使用活化的FGE将蛋白质的FGE识别位点中存在的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基的说明书的试剂盒。此类试剂盒可进一步包括用于制备反应混合物的缓冲剂,在其中可使用活化的FGE将蛋白质的FGE识别位点中存在的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。FGE和缓冲剂可以在相同或不同的容器(例如管)中提供。包括活化的FGE的识别位点的蛋白质(例如抗体或任何其它感兴趣蛋白质)也可以包括在试剂盒中。
还提供的是包括编码FGE的核酸和氧化试剂的试剂盒。在某些方面,编码FGE的核酸是在将载体转化或转染入细胞后适合于在原核或真核(例如哺乳动物)细胞中表达FGE的表达载体。氧化试剂可以是任何适合于活化FGE的氧化试剂,包括在上文涉及本公开文本的方法的部分中描述的任何氧化试剂。在某些方面,氧化试剂是Cu2+。试剂盒可进一步包括适合于表达由核酸编码的FGE的细胞(例如本文中描述的任何原核或真核细胞)。例如关于用氧化试剂活化FGE和/或用核酸转化或转染感兴趣细胞类型的说明书可以包括在试剂盒中。
本公开文本的试剂盒的各成分可以存在于分开的容器中,或多种成分可以存在于一个容器中。
在上文提到的成分之外,本公开文本的试剂盒可进一步包括关于使用试剂盒的各成分来例如实施本公开文本的方法的说明书。说明书一般记录在合适的记录介质上。例如,说明书可以印刷在基片,诸如纸或塑料,等上。照此,说明书可以作为包装插页,在试剂盒或其成分的容器的标签(即与包装或子包装相关的),等存在于试剂盒中。在其它实施方案中,说明书作为合适的计算机可读存储介质,例如CD-ROM,蓝光,硬盘驱动器(HDD),计算机可读存储器(例如闪盘驱动器),等上存在的电子存储数据文件存在。在还有其它实施方案中,实际的说明书不存在于试剂盒中,但是提供了用于自远程来源,例如经由因特网获得说明书的手段。这个实施方案的一个例子是包括能查看和/或下载说明书的网址的试剂盒。与说明书一样,这种用于获得说明书的手段记录在合适的基片上。
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何生成和使用本公开文本的实施方案的全面公开和描述,并非意图限制发明人视为其发明的范围,也并非意图宣称下面的实验是所实施的所有或唯一实验。已经做出了努力来确保关于所用数值(例如量,温度,等)的准确性,但是一些实验误差和偏差应当考虑在内。除非另有指示,份是重量份,分子量是重量平均分子量,温度是摄氏度,而压力是处于或接近大气压。“平均值”表示算术均值。可以使用标准缩写,例如,bp,碱基对;kb,千碱基;pl,皮升;s或sec,秒;min,分钟;h或hr,小时;aa,氨基酸;kb,千碱基;bp,碱基对;nt,核苷酸;i.m.,肌肉内;i.p.,腹膜内;s.c.,皮下;诸如此类。
实施例
设备
微量移液器(每年校准):ResearchPlus 2.5,10,20,100,200,1000(Eppendorf);血清学移液器:Pipettor Plus(Omega);天平(每月校准):XS4001S,NewClassic MF(ML204),AT200(Mettler Toledo);pH测量(每月校准):SevenCompact(Mettler Toledo),InLab Expert Pro电极(Mettler Toledo),Orion标准品(Thermo Scientific);SDS-PAGE:PowerPac Basic(Bio-Rad), Tetra系统(Bio-Rad);PAGE凝胶成像:Image Quant LAS 4000(GE Healthcare);多孔板洗板仪:ELx405(BioTek);多孔板读板仪:SpectraMax M5(Molecular Devices);离心机:Sorvall RC 6Plus(Thermo Scientific),5415R&5810R(Eppendorf);反应混合器:Thermomixer R(Eppendorf),漩涡震荡器:vortexgenie 2(Scientific Industries);摇床:Lab Companion SI-600R(JEIO Tech Co.Ltd.),Shaking Incubator(Shel Labs);PCR循环仪:Mastercycler Pro(Eppendorf);灭菌:Hiclave(Hirayama)。
吸收分光术
在带有制造商提供的软件的NanoDropTM2000(Thermo Scientific)分光光度计上,或在用VISIONliteTM软件控制的GENESYSTM10S分光光度计(Thermo Scientific)上记录UV和可见吸收谱。为了光度术精确度用NIST可追踪重铬酸钾标准品(Starna Scientific和Thermo Scientific)校准分光计。
反相HPLC
在用Agilent OpenLAB CDS Chemstation Edition控制的1100/1200系列仪器(Agilent Technologies)上实施反相高效液体层析。该仪器包括嵌入式溶剂除气器,分析性四联泵,管形瓶自动取样器,恒温柱隔室,和二极管阵列检测器。在AerisTMcore-shell250×2.1mm XB-C18Widepore柱(Phenomenex,Inc.)上实施层析。用Chemstation(Agilent)计算曲线下面积(AUC)。
LC/MS
在4000质谱仪(AB Sciex)及包括嵌入式溶剂除气器,分析性二联泵,和恒温管形瓶/多孔板自动取样器的1100系列HPLC(Agilent Technologies)上收集质谱术数据。在装在设为65℃的带有PST-CHC控制器(Phoenix S&T)的蝶形柱加热器中的JupiterTM150×1.0mm C18柱(Phenomenex,Inc.)上实施层析。用Skyline 2.6实施LC-MRM(多重反应监测)/MS跃迁质量的计算和所得数据的积分。
FPLC
在由UPC-900,P-900和Frac-950模块组成的GE Healthcare 蛋白质纯化系统上实施快效液体层析。用 Excel 5mL柱(GE Healthcare)实施镍亲和层析。用一次性G-25柱(GE Healthcare)手工实施凝胶过滤。
ICP-MS
由Catalent Center for Excellence in Analytical Services(Morrisville,NC)实施感应耦合等离子体质谱术(ICP-MS)。基于自酶储备溶液的280nm吸收强度测量的蛋白质浓度作为摩尔比计算铜和钙的比(表3)。
表3:FGE制剂含有铜和钙二者,如通过ICP-MS测量的。
*使用储备蛋白质溶液在280nm处的吸收测量蛋白质浓度。使用ExPASy生物信息学服务器上的分析工具自酶的一级序列计算蛋白质的消光系数。对于Hs-cFGE,ε=85,745M- 1cm-1和MW=33,286Da;对于Sc-FGE,ε=88,000M-1cm-1和MW=37,432Da。
抗体亲和力的竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)评估
将ELISA板(Maxisorp)以PBS中1μg/mL用1μg/mL带His标签的CD22(SinoBiological 11958-H08H)于4℃包被16小时。将板然后用PBS 0.1%Tween-20(PBS-T)清洗4次,然后用200μL ELISA封闭液(Thermo)封闭。在第二块板中,自20μg/mL竞争抗体的储备溶液在ELISA封闭液中的3倍连续稀释液(50μL+100μL)制备11点标准曲线。接着,将带生物素标签的CD22(100μL 10ng/mL)添加至所有孔。最后,将竞争者和带生物素标签的CD22的混合物转移至经过包被的ELISA板(100μL/孔),在摇动中于RT温育1-2小时。带生物素标签的CD22的终浓度是5ng/mL,而且竞争者的最高浓度是10μg/mL。将板用PBS-T清洗4次;然后,添加100μL链霉亲合素-HRP(Thermo 21130)的1:10,000稀释液(在封闭缓冲液中)并将板在摇动中于RT温育1-2小时。接着,将板用PBS-T清洗4次,并用一步式Ultra TMB(100μL/孔,Pierce#34038)显色。用50μl 2M硫酸淬灭反应,并于450nm测量吸光度。通过非线性回归来确定EC50值。
不确定性的评估
当在柱形图展示上时,不确定性的测量代表使用下述方程自样本容量(n)为3或更多的均值的标准误差计算的95%置信区间:
其中s是对n份样品测量的标准偏差。对酶动力学参数报告的误差代表自活性数据对Michaelis-Menten方程的非线性回归期间发现的最小平方和计算的误差的估值:
其中Et是溶液中的全部酶,且kcat和KM是由STRENDA委员会规定的标准酶参数。酶比活性的单位是katal,其中1kat=1mol·s-1。使用GraphPad prism自[底物]对初速度的非线性回归确定动力学参数。
由Chemstation软件使用“新指数式”算法并将斜率灵敏度设为1mAU计算HPLC运行的曲线下面积(AUC)。使用GraphPad Prism自[底物]对初速度的非线性回归确定动力学参数。
软件
用运行Microsoft Windows OS和由制造商提供的仪器控制软件的PC操作所有仪器数据收集工作站。在运行MS Windows的PC或使用OS X 10.10的Apple iMac任一上实施数据分析。使用GraphPad Prism 6.0e实施线性和非线性回归。使用OpenLAB CDSChemstation Edition实施HPLC层析图的积分。用Skyline 2.6(MacCoss Lab,Universityof Washington)实施LC-MRM/MS跃迁质量的计算和所得数据的积分。用Microsoft Excel实施统计学计算。用Adobe Creative Suite绘制各式图。用开放源码PyMOL 1.7实施蛋白质晶体结构的描绘。
材料
试剂,材料,化学制品,和缩写
所使用的水均是来自Milli-Q Integral 5系统(EMD Millipore)的去离子18MΩ水。商品化化学制品是试剂级的(或更高,如指示的)。化学制品和材料的来源如下:Sigma-Aldrich--β-巯基乙醇(βME),三氟乙酸(TFA),甲氧胺水合物,硫酸铜(II)五水合物,硫酸链霉素,碘乙酰胺(IAA);Acros--甲酸,三乙醇胺(TEAM),二硫苏糖醇(DTT),甘油,葡萄糖,磷酸二氢钾,磷酸氢二钾;Fisher Scientific--咪唑,胰化蛋白胨,酵母提取物,氯化钠;Honeywell Burdick&Jackson--乙腈+0.1%TFA(HPLC级),乙腈+0.1%甲酸(HPLC级);Thermo Scientific--三(羧乙基)膦(TCEP),PageRuler Plus蛋白质标准品;Bio-RadLaboratories--10X蛋白质测定法;IBI scientific--异丙基硫代半乳糖苷(IPTG);Amresco--氨苄青霉素钠盐(USP);Roche diagnostics--cOmplete-mini无EDTA蛋白酶抑制剂混合物;EMD Millipore-- Master混合物;Invitrogen--超感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
抗体生成
为了抗体生成,使用GPEx技术来生成表达抗体的细胞的大批稳定集合。使用蛋白A层析(MabSelect,GE Healthcare Life Sciences)自条件化培养基纯化抗体。
肽合成
在固相上实施所有肽合成并纯化至≥95%。
生物材料的鉴定
Sc-FGE----UniProt登录号:Q9F3C7;PDB 2Q17。
Hs-FGE----UniProt登录号:Q8NBK3;PDB 1Y1E。
实施例1:在体内在哺乳动物细胞中Cu2+提高FGE的转变效率
调查表达FGE和包括FGE识别位点的蛋白质的哺乳动物细胞的细胞培养基中在Cu2+(硫酸铜)存在下对转变的影响。在带有细胞加强4补料,高效补料C,和高效补料C,补充有葡萄糖和/或半乳糖的FortiCHO培养基中培养表达重组人FGE和含有FGE识别序列LCTPSR的重组αHER2单抗(重和轻链在同一细胞中)的CHO细胞。FortiCHO培养基(Life Technologies),细胞加强4(Thermo Scientific)补料和高效补料C(Life Technologies)。
测试多种条件,结果汇总于下文。
如图1(小图A)中显示的,Cu2+(50μM,第0天)提高带有细胞加强4补料,高效补料C,和高效补料C+葡萄糖的FortiCHO培养基中的转变。如图1(小图B)中显示的,Cu2+(50μM,第0天)改善带有高效补料C,包括添加葡萄糖或半乳糖的PF-CHO培养基中的转变。
自第0天添加5μM或20μM Cu2+对转变具有与50μM相同的影响,如图2中显示的。在第3天或第5天添加50μM Cu2+对转变具有与自第0天添加相同的影响。Cu2+(50μM D0)改善包括PF-CHO,氨基酸,AGT CD 5x培养基,细胞加强4,葡萄糖补料,和温度变动的培养条件下的转变。
上文描述的实验证明在Cu2+存在下培养细胞导致FGE活化,而且继而提高靶蛋白质中的FGE识别位点的转变以包括FGly。
还实施实验来测试在多种浓度的其它离子源,诸如硫酸铁(II),MnCl2,和ZnCl2存在下对转变的影响。实验条件与上文Cu2+实验中使用的那些相同。结果指示硫酸铁(0.1mM或0.5mM,第3天),MnCl2(50uM或10uM,第0天),和ZnCl2(50uM,第0天)没有实现靶多肽转变的可检测或显著升高。
图3,小图A显示比较Cu2+处理细胞和未处理细胞的活密度的数据。图3,小图B显示比较Cu2+处理细胞和未处理细胞的蛋白质滴度的数据。图3,小图C显示指示Cu2+处理细胞中体内FGE活化/转变升高的数据。图3中显示的数据指示在Cu2+存在下滴度和细胞存活力与不添加Cu2+的实验相比没有显著变化。
实施例2:在体内乳酸盐消耗的潜在刺激物对转变效率的影响
因为铜是乳酸盐消耗的潜在刺激物,所以调查乳酸盐消耗的其它潜在刺激物活化FGE以提高转变靶蛋白质中的FGE识别位点以包括FGly的效率的能力。
实验条件与上文实施例1中描述的那些相同。添加乳酸盐(Sigma)或丙酮酸盐(Sigma)(1.5g/L及补料)至细胞培养基没有提高FGE的转变效率。报告说刺激乳酸盐消耗的有力补料A(Lonza)没有提高转变效率。乳酸盐水平的分析显示在Cu2+存在或缺失下乳酸盐消耗没有差异,不管在Cu2+存在或缺失下转变效率中的差异。
图7,小图A显示在Cu2+存在或缺失下%转变的图,指示在Cu2+存在下的更高%转变。图7,小图B显示在Cu2+存在或缺失下乳酸盐消耗的图,指示在Cu2+存在或缺失下乳酸盐消耗没有显著差异。图7,小图C显示在Cu2+存在或缺失下葡萄糖消耗的图,指示在Cu2+存在或缺失下葡萄糖消耗没有显著差异。
实施例3:在293Expi系统中Cu2+降低转变效率中的变异性
使用293Expi瞬时共转染系统(Life Technologies)来生成在选定位点处具有甲酰甘氨酸残基的抗体。该系统生成高抗体滴度(100-500mg/L)及可变(10-95%)转变。为了确定在培养基中添加Cu2+是否能降低这种系统中的变异性,临转染带CT-1.1标签的Her2之前或转染后那天添加50μM硫酸铜。在三个独立实验中以抗体:FGE DNA比3:1用具有N端KDEL氨基酸序列的全长人FGE(+KDEL)和带CT标签的抗体的表达质粒瞬时共转染在转染之前用或不用50μM硫酸铜处理的Expi 293F。在转染后5-6天收获培养物,通过ELISA评估滴度,纯化蛋白质并通过质谱术测量转变。
结果显示于图4和表1,指示Cu2+增强293细胞中的转变,滴度没有显著降低。
表1
实施例4:Cu2+降低多种形式的FGE的转变效率中的变异性
+KDEL形式的人FGE的可变转变效率可以通过添加Cu2+来降低。使用上文实施例3中描述的相同实验条件,实施实验来测定Cu2+降低非KDEL形式的人FGE的转变效率中的变异性的能力。以抗体:FGE DNA比3:1用多种形式的人FGE(+KDEL,WT,myc-His)和带CT标签的抗体的表达质粒瞬时共转染在转染之前用或不用50μM硫酸铜处理的Expi 293F细胞。在转染后5天收获培养物,通过ELISA评估滴度,纯化蛋白质并通过质谱术测量转变。
结果显示于图8和表2,指示当非KDEL形式的人FGE与带标签的抗体(具体是WT FGE和C端带myc-His标签的FGE)共转染时Cu2+降低Expi系统中的转变效率中的变异性。
表2
实施例5:氧化性磷酸化的刺激物和抑制剂对转变的影响
实施实验来测定与Cu2+相比,氧化性磷酸化的刺激物和抑制剂对人FGE的转变效率的影响。
二氯乙酸盐(DCA)是刺激线粒体呼吸的丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂。鱼藤酮是线粒体复合物1抑制剂且抑制氧化性磷酸化。实施两种药剂(处理4小时)的ATP生成的剂量响应并确认每种药物如预期地影响ATP生成。运行数个实验,用数个浓度的DCA处理细胞(DCA:0μM;16μM;80μM;400μM;2000μM;10,000μM;和50,000μM)并用Cu2+(硫酸铜)和数个浓度的鱼藤酮处理细胞(鱼藤酮:0nM;5nM;24nM;120nM;600nM;3000nM;和15,000nM)。分配细胞并添加10μL DCA或鱼藤酮处理4小时。将细胞平衡至室温,将100μL/孔Cell titerglo试剂(Promega)添加至每个孔。将板摇动2分钟,于室温温育10分钟,然后在读板仪上读数。
结果指示DCA或鱼藤酮任一对转变没有影响。DCA处理细胞展现比未处理细胞略微更低的转变,而且用鱼藤酮和Cu2+处理的细胞具有与单独用Cu2+处理的细胞相似的转变效率。这些结果指示氧化性磷酸化很可能不牵涉对Cu2+处理观察到的转变增强。
实施例6:硫化醌还原酶(SQR)对转变的影响
硫化氢(H2S)是FGE催化性循环的推定副产物。硫化醌还原酶(SQR)是H2S氧化和解毒的线粒体酶。实施实验来确定H2S随补料分批过程的积累是否抑制人FGE活性,及Cu2+是否抵消这种影响。
分配细胞。混合DNA与Optipro无血清培养基(Life Technologies)。混合FreeStyle Max转染试剂(Life Technologies)和Optipro无血清培养基。DNA和试剂于室温组合10-20分钟。将所得复合物添加至细胞。
对来自用或未用Cu2+处理的细胞的裂解物实施Western印迹,使用针对SQR的抗体测定Cu2+是否提高SQR水平。没有观察到SQR水平的显著差异。还实施实验来测试Expi细胞中的SQR过表达是否能在提高转变中替代Cu2+。结果指示过表达SQR的细胞中的转变与对照相比没有显著差异。在CHO瞬时转染中确认SQR过表达。如此,SQR很可能不牵涉在静止期维持高转变。
实施例7:自Cu2+处理细胞分离的FGE具有升高的比活性
为了确定在Cu2+处理细胞中观察到的转变增强是否是由于FGE酶的比活性升高,用或不用Cu2+处理Expi细胞并用人FGE-mycHis(pRW529)转染。经由镍层析纯化FGE并测试比活性,自Cu2+处理细胞分离的FGE一致展现显著更高的活性。实验条件与上文实施例3中相同。如下文实施例9中所述测量比活性。
在细胞培养基中提供Cu2+导致FGE活化,如自经处理细胞分离的FGE与在铜缺失下但其它方面在相同条件下培养的细胞相比更高的比活性指示的。如图9小图A和图9小图B中显示的,FGE水平相同(或更低,在有铜的情况下;见图9,小图A)但来自铜培养物的FGE的活性显著更高(见图9,小图B)。
实施例8:原核细胞中的FGE活化和增强的转变
调查Cu2+在原核细胞中活化FGE和增强转变的能力。在Cu2+存在或缺失下培养共表达天蓝色链霉菌(“Sc”)FGE和包括FGE识别位点的蛋白质的大肠杆菌细胞。如图4中显示的,转变在用Cu2+处理的细胞中与在Cu2+缺失下培养的细胞相比增强。
为了调查Cu2+活化FGE的潜在机制,对自在Cu2+存在或缺失下培养的大肠杆菌细胞分离的Sc-FGE进行液体层析-质谱术(LCMS)。如图5中显示的,Cu2+处理导致Sc-FGE的两个活性位点硫醇基团氧化,指示FGE活化可能牵涉涉及两个活性位点半胱氨酸残基的二硫化物形成。
实施例9:体外FGE活化
本实施例证明FGE可以在体外通过CuSO4处理来活化,导致经处理/活化的FGE具有与未处理/非活化的FGE相比更大的比活性。
来自大肠杆菌细胞的Sc FGE重组表达和纯化
实施增强的天蓝色链霉菌(Sc)FGE重组表达和纯化。通过42℃热休克将编码携带N端六组氨酸标签和TEV蛋白酶切割位点的野生型Sc-FGE的pET151-D/TOPO载体转化入50μLLB培养基中的超感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在LB/琼脂糖上涂板并在氨苄青霉素选择下于37℃生长过夜后,在terrific broth(TB)中将个别菌落扩增至125mL。于OD 0.4-0.5,添加IPTG至达到1mM。将培养瓶冷却至18℃并以200RPM摇动16小时。以6,000rcf收集细胞20分钟。在裂解缓冲剂(25mM三乙醇胺,50mM NaCl,蛋白酶抑制剂,pH 8.0)中重悬浮细胞并用裂解试剂裂解。通过以25,000rcf离心25分钟来澄清溶液。通过在硫酸链霉素溶液中稀释上清液,达到1%w/v的终浓度来沉淀残余DNA。将溶液于4℃搅动15分钟,然后以25,000RPM离心25分钟。将上清液加载到Ni-NTA sepharose FF柱上并在重力流下洗脱。通过用5CV清洗缓冲液(25mM三乙醇胺,250mM NaCl,10mM咪唑,pH 8)清洗来去除非特异性结合的蛋白质。用洗脱缓冲液(25mM三乙醇胺,250mM NaCl,300mM咪唑,pH 8)分离纯化的蛋白质。合并含有蛋白质(如通过Bradford测定法判断的)的级分并加载到用贮存缓冲液(25mM三乙醇胺,50mM NaCl,8%v/v甘油,pH 7.4)平衡的G-25柱(PD-10,GEHealthcare)上。然后用贮存缓冲液洗脱蛋白质,用10kD 超滤膜(Millipore,Inc.)浓缩,并于77K闪冻。分离的酶的典型产率:50-75mg/L培养基。通过SDS-PAGE电泳(10%凝胶,Bio-Rad,Inc.),反相HPLC,完整球状蛋白质的LCMS,酶的胰蛋白酶消化物的LCMS,UV-Vis吸收分光术,比活性(如下文描述的)表征纯化的酶。
FGE活性测定法
使用不连续酶活性测定法测量FGE的比活性。FGE的底物是14个氨基酸的含有共有序列的肽(H2N-ALCTPSRGSLFTGR-COOH)。通过反相HPLC上含有起始材料(Cys)和产物(fGly)的肽于215nm的峰面积的积分来测定反应速率。通过RP-HPLC MS/MS来确定产物(和副产物)峰的身份。每个水性反应溶液(60μL)含有底物肽(100μM),FGE(1μM),DTT(1mM),和缓冲液(25mM三乙醇胺,pH 9)。一个时间过程由每2分钟收集的5个数据点组成。反应在添加FGE储备溶液并漩涡震荡3秒后启动。通过用微量移液器手工在1μL 1M HCl中稀释10μL反应混合物来淬灭时间点。在反应完成后,通过RP-HPLC分析每个时间点。
FGE底物和产物肽通过HPLC的定量
在RP-HPLC上用含有0.1%TFA的水中的等度18%MeCN在7分钟里将FGE底物肽ALCTPSRGSLFTGR的底物,产物,和副产物分开。使用fGly(2.1分钟),Cys(3.3分钟),βME-DS(3.6分钟),和Cys-DS(6.2分钟)形式的底物的积分面积来计算总面积和其每项分数。
FGE的活化
对甲酰甘氨酸生成酶(天蓝色链霉菌,50μM)在缓冲水性溶液(25mM三乙醇胺,pH7.4,50mM NaCl)中的溶液添加硫酸铜(II)(100μM)。将混合物于25℃以1500RPM漩涡震荡1小时。然后使用G-25树脂(GE healthcare PD-10柱,遵循制造商的说明书)通过25mM三乙醇胺,pH 7.4,50mM NaCl中的缓冲液交换自反应混合物去除蛋白质。交换后,使用本文中描述的标准活性测定法测量FGE的比活性。
结果
体外活化实验的结果显示于图6,显示用CuSO4作为Cu2+源处理的FGE和未处理的FGE的比活性的图。Cu2+处理导致FGE活化,如这个实施例中通过经处理FGE的比活性升高指示的。
实施例10:编码人FGE的核心的重组杆状病毒的生成
通过PCR自先前的构建物(参见Rabuka,et al.,Nat.Protocols.,(2012),7,1052-1067)扩增编码人FGE的催化“核心”,接着是用于纯化的C端His6标签的DNA(Hs-cFGE)。Hs-cFGE序列和引物列于下文。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)实施编码Hs-cFGE的杆状病毒的制备。
为Bac-to-Bac表达系统用于克隆Hs-cFGE的引物。
正向:GAGGCTAACGCTCCGGGCCC
反向:GTCCATAGTGGGCAGGCGGTC
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在N末端产生另外的4个残基以提供信号序列氨基酸序列DRSL(SEQ ID NO:6)。自此表达载体表达的Hs-cFGE的一级序列提供于下文。
带有TEV蛋白酶位点和His6标签的Hs-cFGE的一级序列
实施例11:来自Hi5细胞的Hs-cFGE表达和纯化
以0.1的MOI将Hs-cFGE杆状病毒转染入Hi5昆虫细胞(Invitrogen)。培养72小时后,通过离心和过滤(0.45μm PES)来澄清条件化培养基,并通过FPLC以5mL/min加载到 Excel树脂上。用10个柱体积(CV)的清洗缓冲液(25mM TEAM,250mM NaCl,5mM乙酸钙,10mM咪唑,pH 8)清洗树脂。然后用洗脱缓冲液(25mM三乙醇胺(TEAM),5mM乙酸钙,300mM咪唑,pH 8)自柱去除酶。合并含有蛋白质(如通过FPLC洗出液的UV检测确定的)的级分并加载到用贮存缓冲液(25mM TEAM,8%v/v甘油,pH 7.4)平衡的G-25柱上。然后,用贮存缓冲液洗脱蛋白质,用10kD 超滤膜(Millipore)浓缩,并在液氮中闪冻。分离的酶的典型产率是10-20mg/L培养基。通过SDS-PAGE电泳(图10),完整蛋白质的反相HPLC,LC/MS,胰蛋白酶消化继以LC-MS/MS,吸收分光术,和比活性(如下文实施例中描述的)表征纯化的酶。
实施例12:FGE催化活性的测定法
使用不连续酶活性测定法测量FGE的比活性。FGE的底物是14个氨基酸的含有CXPXR共有序列的肽(ALCTPSRGSLFTGR)。通过反相HPLC上底物半胱氨酸(Csub)和产物(fGly)肽于215nm的峰面积的积分来测定反应速率。通过RP-HPLC MS/MS来确定产物(和副产物)峰的身份(见下文)。每个水性反应溶液(120μL)含有Csub(100μM),FGE(0.1-1μM),DTT(1mM),和缓冲液(25mM TEAM,pH 9)。一个时间过程包括以均匀间隔的时间间隔收集的5个数据点。反应在添加FGE储备溶液并漩涡震荡3秒后启动。将反应管形瓶在热混合仪R(Eppendorf)中于25℃以1,500RPM漩涡震荡。通过使用微量移液器将20μL反应混合物添加至2μL 1M HCl来手工淬灭时间点。在反应完成后,通过RP-HPLC分析每个时间点(见下文)。
实施例13:FGE肽中间体通过LC-MS/MS和RP-HPLC的鉴定
为了鉴定FGE体外转变Csub的中间体和产物,淬灭来自FGE活性测定法的反应混合物并通过LC/MS分析。反应混合物在200μL总体积中包括0.5mM肽,0.5μM人FGE,5mM 2-巯基乙醇(βME),和25mM TEAM,pH 9。通过将20μL反应混合物添加至2μL 1M HCl来制备时间点。梯度是10分钟里含0.1%甲酸的水中的5-25%MeCN。在RP-HPLC上于215nm检测到的4个肽峰的相对强度和保留时间在LC-MS/MS数据中重复,容许以质量指派每个峰。每个肽物种的计算和观察m/z离子,和指派显示于图11,图12,和图13。
实施例14:FGE底物和产物肽通过HPLC的定量
在RP-HPLC上在7分钟里用含有0.1%TFA的水中的等度18%MeCN将FGE底物肽ALCTPSRGSLFTGR的底物,产物,和副产物分开。使用fGly(2.1分钟),Csub(3.3分钟),Csub/βME二硫化物(Csub-βME,3.6分钟),和底物/底物二硫化物(Csub-Csub,6.1分钟)形式的底物的积分面积来计算总面积和其每项分数。
实施例15:FGE的硫醇和二硫化物绘图
为了测定Sc-FGE或Hs-FGE任一上的硫醇残基的氧化状态,开发使用连续标记,消化,和正交标记通过LC/MS用于硫醇和二硫化物绘图的规程。步骤1,初始标记和胰蛋白酶消化:反应混合物由总体积30μL中的FGE(7.5μg),NH4HCO3(50mM),碘乙酰胺(20mM),和胰蛋白酶(0.75μg)构成。将装有样品的管于37℃温育16小时。步骤2,淬灭:将水(6μL)和DTT(4.8μL0.5M,50mM终浓度)添加至来自步骤1的反应混合物。将装有样品的管于37℃和1500RPM温育1小时。步骤3,第二标记:将N-乙基马来酰亚胺(7.2μL 0.5M,150mM终浓度)添加至来自步骤2的反应混合物。然后将装有样品的管于37℃和1500RPM温育1小时。在步骤3之后,用HCl(4.8μL 1M,100mM终浓度)淬灭反应混合物。在15分钟里用含0.1%甲酸的水中的0-50%MeCN梯度将经过消化的肽分开。通过MRM/MS检测含半胱氨酸肽,监测Cys残基的碘乙酰胺,N-乙基马来酰亚胺,和氧化性修饰。
实施例16:用硫酸铜(II)活化FGE
将硫酸铜(50μM,5个摩尔当量)添加至Sc-FGE(10μM)在缓冲水性溶液(25mM TEAM,pH 7.4,50mM NaCl)中的溶液。将混合物于25℃以1500RPM漩涡震荡1小时。使用G-25树脂通过25mM TEAM,pH 7.4,50mM NaCl中的缓冲液交换自反应混合物纯化蛋白质。然后,使用上文描述的活性测定法测量FGE的比活性。
实施例17:完整单抗中fGlyd的定量
将DTT(20mM)添加至单抗(20μg)在缓冲水性溶液(25mM NH4HCO3)中的溶液至终体积20μL。将装有样品的管于37℃以1500RPM温育15分钟。然后,将HCl(50mM)添加至溶液并将管漩涡震荡直至混合。接着,将碳酸氢铵(100mM)添加至溶液并将管漩涡震荡直至混合。添加胰蛋白酶(1μg)和碘乙酰胺(50mM),并将管在黑暗中于37℃和1500RPM温育60分钟。最后,将柠檬酸钠(150mM,pH 5.5)和甲氧胺(100mM)添加至溶液,并将管于37℃温育16小时。然后通过LC-MRM/MS分析经过加工的样品。MRM跃迁包括含Cys肽的修饰,包括:半胱氨酸,用碘乙酰胺修饰的半胱氨酸,甲酰甘氨酸,甲酰甘氨酸水合物(包括碰撞细胞中的水损失),和甲酰甘氨酸甲基肟。每个种类的丰度通过它的5个强度最高的前体/产物离子对来定义,将它们积分至给出总信号和每种成分的相对分数。在上文描述的优化消化和加帽规程中,没有检测到超出背景的未反应的Cys,fGly,或fGly水合物,只观察羧基乙酰胺基甲基Cys(CAM)和fGly的甲基肟(MeOx)。羧基乙酰胺基甲基Cys(CAM)和fGly的甲基肟(MeOx)是可检测的。
实施例18:用FGE体外转变完整单抗
将Hs-cFGE添加至含有醛标签的IgG(其中C端K用SLCTPSRGS替代)在含有50mMNaCl和1mMβME的25mM TEAM pH 9.0中的溶液。以相对于抗体重链的醛标签内的Csub的浓度的10mol%添加酶。将溶液于18℃以1,000RPM漩涡震荡16小时,然后用0.25个体积当量的0.5M柠檬酸钠,pH 5.5(至终浓度100mM柠檬酸盐)淬灭溶液以将溶液的pH降低至~7供结合至单抗Select蛋白A树脂。使用标准方法纯化IgG。典型反应产生95-100%的最终抗体中fGly含量,对应于反应转变产率90-100%。至今,已经跨越20μg至0.6g的规模范围实施反应。
实施例19:FGE Apo酶的生成
将乙二胺四乙酸(EDTA,15mM)和三(羧甲基)膦(TCEP,15mM)添加至Sc-FGE全酶(5μM)在缓冲水性溶液(25mM TEAM,pH 7.4,50mM NaCl)中的溶液。将混合物于37℃以750RPM漩涡震荡1小时。使用G-25树脂通过25mM TEAM,pH 7.4,50mM NaCl中的缓冲液交换自反应混合物纯化蛋白质。然后,使用上文描述的活性测定法测量FGE的比活性。
结果
在下面的部分中讨论来自实施例10-19的结果。
自细胞培养物分离的Sc-FGE和Hs-cFGE具有适度的催化活性。开发了用于重组表达FGE的方法。选择来自两个物种(天蓝色链霉菌和人)的FGE进行研究,因为它们代表原核和真核形式的酶二者。通过转染大肠杆菌并自澄清的细胞裂解物纯化来制备Sc-FGE。通过病毒转导昆虫细胞以较高的纯度和较好的产量制备Hs-cFGE。在昆虫细胞中生成人形式。
就人酶而言,去除酶的非催化部分,表现为推动沉淀(下文详细描述)。对于可溶性酶,评估自细胞培养物生成的FGE的活性,和催化需要的反应条件。
为了测量FGE的比活性,实施不连续测定法,使用MALDI-MS来定量淬灭的反应混合物中的起始材料和产物。在测定法中,使用反相HPLC来将Cys和fGly形式的含有FGE共有序列的肽分开和定量二者。使用未修饰的14个氨基酸的肽ALCTPSRGSLFTGR作为Sc和Hs形式的酶二者的底物。
Cys至fGly的转变利用底物Cys硫醇的2H+/2e–氧化以及硫对氧的交换。当前数据支持分子氧是终末电子受体的机制。然而,因为O2是4H+/4e–受体,所以使用还原剂来提供第二个当量的2H+和2e–,完成O2至2摩尔H2O的还原。为了测试是否能够通过直接将2H+/2e–氧化剂添加至体外反应来规避使用还原剂,添加氧化剂H2O2,但是通过生成二硫化物(Csub-Csub)导致底物二聚化,停止反应(图12,小图a和图12,小图b)。使用还原剂(DTT)和O2的混合物进行例行活性测量。
通过快速将FGE混合入预混合的Csub和还原剂的缓冲溶液中来启动个别FGE反应。假设所有缓冲溶液于25℃含有~270μM氧(基于Henry氏定律)。用HCl手工化学淬灭时间点。如下文描述的,FGE的比活性可作为其活性位点的化学状态的函数而变化,因此此测定法中的酶浓度跨越0.1-10μM(0.1-10mol%)酶的范围。通过LC-MS/MS确认含Cys和fGly肽二者的身份(图11)。然后关联这些指派与HPLC保留时间(图14,小图a)。使用Boeker(Biochem.J.,(1984),223,15和Biochem.J.,(1985),226,29)记载的方法使用底物和产物的积分峰面积来计算FGE的初速度(图14,小图b)。
Hs-FGE含有3个主要域:信号肽,N端延伸(NTE),和结合底物并实施周转的核心(图14,小图c)。在转运至ER和蛋白水解去除信号肽后,“全长”野生型酶(Hs-FGE)含有NTE和核心二者。NTE可经由C50和/或C52与ERp44之间的二硫键形成推动ER保留。NTE和核心之间的边界是蛋白质原转化酶诸如弗林蛋白酶和PACE的蛋白水解切割位点。当FGE在分泌途径中遭遇这些酶时,NTE被去除且截短的核心可被分泌。在体外,全长FGE具有在高浓度聚集的倾向,因而制备截短的核心(cFGE)。Hs-cFGE的比活性(1,143pkat·mg-1,33.3kD)与含有NTE的Hs-FGE(850pkat·mg-1,36.9kD)相似。另外,在大肠杆菌中表达的Sc-FGE具有相对于在昆虫细胞中表达的人酶显著更低的比活性(214pkat·mg-1)(图14,小图d)。如此,实验显示自两个物种以较好的产率和较高的纯度生成活性FGE。如上所述实施进一步实验来调查FGE实施催化的机制及增强FGE的活性。
在一些情况中,FGE的活性依赖于铜辅因子的存在,而非活性位点半胱氨酸残基的氧化还原状态。实施实验来测试FGE是否需要存在活性位点二硫化物残基。制备还原和氧化形式的FGE并测量它们的比活性。
通过将Sc-FGE于25℃用过量(100个摩尔当量)的强还原剂(DTT)预处理1小时,之后通过凝胶过滤去除试剂来实现还原的活性位点Cys残基的形成。通过将酶于25℃用过量(100个摩尔当量)的(L)-脱氢抗坏血酸(DHAA)或CuSO4任一预处理1小时,接着通过凝胶过滤去除试剂来实现氧化的活性位点的形成。DHAA能化学计量性地形成二硫化物,而Cu2+能快速且干净地以溶解氧催化二硫化物形成。在这些处理之后,使用标准动力学测定法测量每种酶的比活性。只有CuSO4预处理导致活性的任何显著变化(图15,小图a)。
既然铜预处理和去除导致活性更高的FGE,那么实施实验来调查能活化Sc-FGE的铜数量。用1,10,或100mol%CuSO4处理FGE展现化学计量性量的铜产生高度活性的酶(图15,小图b)。小于1个摩尔当量的量导致按比例更低的活性,该观察结果与活性位点硫醇的催化活化不一致。
实施实验来确定是否有可能通过直接将铜添加至反应混合物来增强FGE反应速率。数据确认产物形成通过在反应中包括铜受到显著抑制(图12,小图c)。作为铜催化的二硫化物形成的结果,观察到氧化形式的DTT(图12,小图d)以及Csub-Csub(图12,小图e)的快速形成。
5个摩尔当量的CuSO4于25℃达1小时,继以去除过量的铜能有效活化Sc-FGE和Hs-cFGE二者。Sc-FGE的比活性升高超过一个数量级—自214±34pkat·mg-1至3579±215pkat·mg-1;Hs-cFGE比活性升高3倍,自1,143±84pkat·mg-1至3,050±115pkat·mg-1(图15,小图c)。实施实验来确定用铜处理的FGE是否在纯化后含有该金属。使用ICP-MS测量未活化的和已活化的FGE样品二者中铜的数量。在大肠杆菌中生成的Sc-FGE几乎不含有超出测量噪声水平的铜。相反,自昆虫细胞分离的Hs-cFGE含有0.35摩尔Cu每摩尔FGE。铜处理“活化”形式的FGE均含有刚刚超出1摩尔Cu/FGE。而且,这些酶制剂每种的比活性与Cu/FGE比有关联,指示铜是活性形式的FGE的构成成分(图15,小图c)。
然后考虑是否有可能通过直接将铜添加至反应混合物来增强FGE反应速率。数据指示产物形成通过在反应中包括铜受到显著抑制。具体而言,作为铜催化的二硫化物形成的结果,观察到氧化形式的DTT以及Csub-Csub的非常快速的形成(图15,小图d)。对于fGly,Csub-Csub和DTTOX中每一项,垂直柱自左至右对应于Cu2+浓度0μM,5μM和50μM。
为了确认活化形式的FGE中的催化活性不依赖于活性位点二硫化物,实施实验来确定将强还原剂添加至活化的酶是否会降低所得材料的比活性。如果活性位点二硫化物的完整性对于周转是重要的,那么强还原剂应当具有降低的FGE周转速率。
Hs-cFGE可形成活性位点二硫化物(C336-C341)以及蛋白质中别处的两个结构性二硫化物(C346-C235和C365-C218)(图16,小图a)。用20mM DTT(或20mM TCEP,未显示)处理Hs-cFGE生成比活性未变化的FGE(图16,小图b)。为了确认有关Cys残基因此处理而改变氧化还原状态,使用LC-MRM/MS测定法检测活性位点中的溶液可及Cys残基。用这种方法监测含C341和C235肽二者。DTT处理将可及活性位点C341的比例自28%提高至93%。参与埋藏的结构性二硫化物的C235是不可及的(如此,在二硫化物中),这不依赖于DTT处理。总之,这些数据确认还原性处理生成几乎定量减少的活性位点硫醇,不扰乱其它结构性二硫化物,但是对FGE的催化活性没有影响。
在观察到FGE含有~1个铜原子每个酶之后,实施实验来去除该金属以确定它是否是催化活性所需要的。经由添加5个摩尔当量的EDTA来去除铜的尝试不改变铜处理的Sc-FGE或Hs-cFGE的催化活性(图17,小图a)。然而,KCN确实将Hs-cFGE的活性降低适度的量,提示它能实现接近结合的铜。既然KCN预处理略微降低Hs-cFGE的活性,那么实施实验来测试通过在反应混合物中包括KCN是否能抑制FGE周转。如图17,小图b中显示的,观察到对Sc-FGE(IC50=480μM)和Hs-cFGE(88μM)二者活性的浓度依赖性抑制。在铜胺氧化酶的情况中,通过用KCN自用连二硫酸钠预还原的酶提取铜生成了脱辅基酶。以类似的方式,这种办法对于FGE也是成功的。活性在用还原剂和螯合剂(15mM TCEP和EDTA)二者处理(1小时,37℃)后显著降低,但是单独的每种成分不然(图17,小图d)。
实施实验来测定Sc-FGE和Hs-cFGE二者的标准酶参数(图18)。它们在两个种类之间差异显著。Sc-FGE没有与底物很强相互作用(KM=96μM)且展现相对快速的kcat(17.3min-1),它们一起导致kcat/KM=3.0×104M-1·s-1的适度的酶效率(图18,小图1)。比较而言,Hs-cFGE以更慢的催化速率常数(kcat=6.06min-1)周转底物但展现与底物肽的强相互作用(KM=0.34μM)。总之,Hs-cFGE(kcat/KM=3.0×106M-1·s-1)的效率比它的细菌对应物高大约10倍(图18,小图b)。
数据证明自细胞培养物分离的适度活性形式的FGE是缺少铜辅因子的脱辅基酶和具有高活性且将肽底物上的Cys有效转变成fGly的全酶的混合物。实施实验来开发用于在生物催化反应中对折叠的蛋白质底物使用FGE全酶的条件。
FGE是折叠的蛋白质上Cys体外转变成fGly的有效生物催化剂。为了使用体外转变来生成带醛标签的单抗,测试下述反应条件。对于大多数底物,5-10个摩尔当量的DTT足以实现完全转变。凭借三(羧乙基)膦(TCEP),硫辛酸,和二(2-巯基乙基)砜(BMS),周转也是有可能的。然而,甚至1个摩尔当量的强还原剂(例如DTT,TCEP,硫辛酸,或BMS)的存在也能切割单抗底物中存在的二硫化物。为了避免底物二硫化物切割,对反应使用备选还原剂。更弱的还原剂(例如βME或GSH)得到抗体底物耐受,而且还能够实现FGE催化。然而,环化(DTT)变成非环化还原剂(βME)产生先前没有观察到的副产物(在下文讨论)。为了降低副产物形成和提高产物产率,实施实验来测定还原剂在酶促周转中的作用。
结合至底物肽的FGE(脱辅基酶)的X射线结晶学显示C341和Csub通过活性位点中的二硫化物共价连接。如果底物在周转期间通过这个C341-Csub二硫化物锚定,那么外源硫醇可能能够通过硫醇-二硫化物交换与酶-底物复合物(E·S)反应以释放硫醇-Csub二硫化物形式的底物。在周转期间由FGE形成两个脱离途径的产物。第一,当还原剂没有添加至反应时,观察到Csub-Csub二聚体形成。第二,当单硫醇作为还原剂(例如βME)添加时,观察到Csub-βME二硫化物的快速生成(图13,小图a)。在缺少酶的对照反应中,Csub-Csub或Csub-βME无一生成。
作为反应条件的函数监测Csub-Csub和Csub-βME的形成。首先,改变反应中还原剂的浓度,并且当反应完成一半时淬灭它们。在低[βME]对[Csub],Csub-Csub占优势(图19,小图a)。提高[βME]导致并行的Csub-Csub减少和Csub-βME增多。提高[βME]还导致更高的fGly产率。
实施实验来测定反应随时间行进时[βME]的影响(图13,小图b)。如上文描述的,在外源还原剂缺失下确实形成产物,但是生成显著比例的Csub-Csub(图13,小图c),指示Csub能在周转期间代替还原剂起作用,但是代价是产物产率。在低[βME](0.25mM,2.5个摩尔当量对Csub),Csub-Csub最初以与产物形成竞争性的速率产生(图13,小图d),但是随着反应前行,它达到最大值,然后缓慢衰减。在此[βME],消耗Csub-Csub,Csub-βME快速达到13%总肽的平台,保持在那里。在具有更高[βME](10mM)的后续反应中,Csub-Csub的消耗更快(图13,小图e)。另外,虽然Csub-βME快速升高至10%总底物,但是它也快速衰减,与更低的[βME]形成对比。在所有情况中,Csub-Csub和Csub-βME二者的消耗与产物形成的更高产率的有关联。既然周转期间的二硫化物生成与产物形成是竞争性的,而且在酶缺失下不发生,那么这些数据确认FGE和底物之间的二硫化物形成是FGE催化循环的一部分。
与βME形成对比,当使用DTT作为化学计量性还原剂时,均未观察到中间体Csub-Csub或Csub-DTT二硫化物。这很可能是因为DTT能环化以形成分子内二硫化物及释放底物。然而,使用βME或DTT的反应中产物形成的速率是不同的(图19,小图b)。具体而言,在βME或DTT存在下产物形成的速率分别是5.07或3.27min-1。既然还原剂对底物和酶二者以大大过量存在,那么它可能牵涉限制周转的速率。
如果还原剂通过单电子机制起作用,那么它们的相对反应速率应直接依赖于它们的还原势:E0′(βME)=-207mV且E0′(DTT)=-323mV。如果改为还原剂通过硫醇-二硫化物交换起作用,那么它们的反应速率应与它们的硫醇-二硫化物交换速率常数有关联:kβME=1且kDTT=6×105,如对谷胱甘肽二硫化物测量的。这些情景均预测在DTT存在下实施的反应应具有比在βME存在下实施的反应更快的速率。与之对比,用DTT实施的反应比用βME实施的反应更慢,因此硫醇在反应中的作用可能不单单依赖于硫醇的反应速率。
通过上文实验确认的E·S中的共价二硫化物可能是上文描述的反应速率差异的来源(图19,小图c)。自这种状态起,E·S能以速率常数kcat行进至产物,或者它能以速率常数kDS通过硫醇-二硫化物交换与外源硫醇反应。对于任何给定还原剂,kcat很可能基于同工铜依赖性氧化酶的基质是相同的,其中底物释放,而非氧化还原化学是限速的。然而,kDS可能直接依赖于溶液中还原剂的身份和它的硫醇-二硫化物反应速率常数。换言之,E·S应在更强还原剂存在下更快解离,与产物形成竞争。另外,如果底物作为并非快速衰减的二硫化物释放(就像βME-DS的情况),那么它能再次与酶反应以再生E·S。因此,更强还原剂应通过解离E·S复合物而缓慢周转。循环的这个方面还可能解释相对于pH 7在pH 9观察到的更快周转速率;硫醇-二硫化物交换在碱性条件下更快。
可以在N或C端处或在任何溶剂可及内部序列处引入醛标签。在这里,在三种独立单抗上(图20,小图b,和图20,小图c)在单抗的三个独立区域中(图20,小图a)及跨越宽范围的反应规模(0.8-200mg),Cys被Hs-cFGE以高产率转变成fGly。在每种情况中,体外转变产率是>90%,如通过LC-MRM/MS测量的(图21)。而且,pH 9反应条件不影响抗原结合亲和力(图22,小图a,和图22,小图b)或Met252处的氧化(图22,小图c),Met252是对于体内单抗循环和FcRn结合重要的残基。
讨论
本文中描述了用于以较好的产率重组生成Sc-FGE和Hs-cFGE二者的方法。另外,描述了用于测量两种FGE的动力学参数的不连续HPLC测定法。这些结果指示在体外催化活性不需要Hs-FGE的N端延伸。自昆虫细胞培养物分离的人酶比在大肠杆菌中生成的来自天蓝色链霉菌的细菌形式的FGE显著更有活性。
实施实验来测定FGE周转的机制。现有的机制假说聚焦于FGE活性位点半胱氨酸残基的氧化还原状态,如通过结晶学揭示的。当先前分离Hs-cFGE时,还原和氧化形式的混合物的酶中存在C336(Sc-FGE中的C272)和C341(C277)。可以使用溶液中的化学试剂来操纵C336和C341的氧化状态,或是形成C336-C341二硫化物,或是在更长时间段上用H2O2在两个位置处均形成磺酸。另外,C336S突变能够作为C341的分子间二硫化物“诱捕”Csub。这指示FGE利用硫醇-二硫化物交换来锚定Csub及活化C336。然后这个残基可实施分子氧的活化以形成更高氧化状态Cys残基(次磺酸或半胱氨酸过氧化物任一)及后续氧化底物。
当溶液中存在单硫醇还原剂时,FGE能够催化底物Cys处的二硫化物形成。这指示FGE结合二硫化物中的Csub,而且当kcat比与溶液中的还原剂的反应的速率更慢时,Csub能作为二硫化物释放。当使用二硫醇试剂诸如DTT时,任何分子间二硫化物通过DTT环化快速消除。
FGE掺入铜作为催化的辅因子。结果指示重组表达FGE最常见地产生脱辅基酶,它能通过于pH 7添加硫酸铜(II)而重建为全酶。人和细菌FGE二者的催化速率在用化学计量性量的Cu2+活化后显著升高,而且周转通过将氰化物添加至FGE反应混合物而受到抑制。
数据指示FGE可能是实施2H+/2e-氧化,活化分子氧,及需要外源还原剂来完成催化循环的铜氧化酶。
根据上文描述的数据,副产物的形成指示[E·S]复合物牵涉共价二硫桥(图23,步骤a)。还原剂会起作用产生Cu(I)状态的活性位点(图23,步骤b),它是用于结合分子氧的中间体(图23,步骤c),就像为底物氧化而平衡的二价铜超氧基Cu(II)-O2 -。然后底物半胱氨酸侧链能通过质子耦合电子转移起反应,最有可能是氢原子转移的形式(图23,步骤d)。氧化后,二硫根可瓦解成硫醛和含硫(thiyl)根(图23,步骤e)。第二个当量的1H+/1e-会再生活性位点Cys,而且硫醛会快速水解成产物fGly(图23,步骤f和步骤g)。形式上,氧化反应会仅仅通过置换H2O2作为反应产物而完成,但是二价铜过氧化物Cu(II)-OOH可能还经历进一步还原,仅仅生成H2O作为副产物。在这个点,铜上的静息状态配体可能是氢氧化物,尽管C341经由备选机制直接牵涉是可能的。
如上文描述的,开发用于在没有破坏底物蛋白质中的现有分子内二硫化物的情况下有效生成fGly的反应条件。FGE在体外以较好的产率生成并用作带醛标签的蛋白质的生成的生物催化剂。FGE反应的规模在质量上跨越至少3个数量级,产率没有显著降低,而且在没有扰乱现有二硫化物或修饰对于体内单抗性能重要的残基的情况下行进。
虽然为了清楚理解的目的已经通过举例说明较为详细地描述前述发明,但是本领域普通技术人员根据本发明的教导容易明白可以在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下对本发明进行某些改变和修饰。
因而,前文仅仅说明本发明的原理。会领会,本领域技术人员会能够想到各种安排,它们尽管没有在本文中明确描述或显示,但是体现本发明的原理且包括在它的精神和范围内。而且,本文中叙述的所有例子和条件性语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和发明人促进技术贡献的概念,而且要解释成没有限于此类具体叙述的例子和条件。此外,本文中叙述本发明的原理,方面,和实施方案及其具体实施例的所有陈述意图涵盖其结构和功能等同物二者。另外,意图此类等同物包括当前已知的等同物和未来开发的等同物二者,即实施相同功能而开发的任何要件,不管结构。因此,本发明的范围并非意图限于本文中显示和描述的例示性实施方案。而是说,本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。
Claims (84)
1.一种生成包含甲酰甘氨酸残基的蛋白质的方法,该方法包含:
在下述条件下在存在Cu2+以活化甲酰甘氨酸生成酶(FGE)下表达FGE和包含FGE识别位点的蛋白质,在该条件中活化的FGE将该FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基,以生成包含甲酰甘氨酸残基的蛋白质,
其中该Cu2+以1μM至1mM的浓度存在。
2.依照权利要求1的方法,其中该表达包含:
在包含该Cu2+的细胞培养基中在下述细胞培养条件下培养包含下述各项的细胞:
甲酰甘氨酸生成酶(FGE);和
包含FGE识别位点的蛋白质,
在该条件中该FGE将该FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。
3.依照权利要求2的方法,其中该Cu2+以5μM至100μM的浓度存在于该细胞培养基中。
4.依照权利要求2或权利要求3的方法,其中该FGE对于该细胞是内源的。
5.依照权利要求2至4任一项的方法,其中该细胞经遗传修饰而表达该FGE。
6.依照权利要求2至5任一项的方法,其中该含有FGE识别位点的蛋白质对于该细胞是内源的。
7.依照权利要求2至6任一项的方法,其中该细胞经遗传修饰而表达该含有FGE识别位点的蛋白质。
8.依照权利要求2至7任一项的方法,其中该细胞是真核细胞。
9.依照权利要求8的方法,其中该真核细胞是哺乳动物细胞。
10.依照权利要求9的方法,其中该哺乳动物细胞选自由CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞组成的组。
11.依照权利要求9的方法,其中该哺乳动物细胞是人细胞。
12.依照权利要求8的方法,其中该真核细胞是酵母细胞。
13.依照权利要求8的方法,其中该真核细胞是昆虫细胞。
14.依照权利要求1的方法,其中该表达包含在包含Cu2+的无细胞反应混合物中在下述条件下表达FGE和该包含FGE识别位点的蛋白质,在该条件中该FGE将该FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。
15.依照权利要求14的方法,其中该活化的FGE和该包含FGE识别位点的蛋白质在包含还原剂的反应混合物中组合。
16.依照权利要求15的方法,其中该还原剂促进该FGE识别位点的半胱氨酸残基或丝氨酸残基转变成甲酰甘氨酸残基。
17.依照权利要求16的方法,其中该还原剂是2-巯基乙醇。
18.依照权利要求1的方法,其中该活化的FGE和该包含FGE识别位点的蛋白质在无细胞反应混合物中组合。
19.依照权利要求18的方法,其中在组合该活化的FGE与该包含FGE识别位点的蛋白质之前,该方法包含用Cu2+活化FGE。
20.依照权利要求19的方法,其中元素氧作为终末氧化剂存在。
21.依照权利要求20的方法,其中该元素氧由氧,氧和硫化氢的混合物,或在碱性条件下的氧提供。
22.依照权利要求20的方法,其中该元素氧是由Cu2+催化的反应中的终末氧化剂。
23.依照权利要求19至22任一项的方法,其中该Cu2+由选自硫酸铜,柠檬酸铜,酒石酸铜,Fehling氏试剂,和Benedict氏试剂的Cu2+源提供。
24.依照权利要求19至22任一项的方法,其中该Cu2+源是硫酸铜。
25.依照权利要求18至24任一项的方法,其中该FGE是N端截短的FGE。
26.依照权利要求25的方法,其中该FGE是N端截短的人FGE。
27.依照权利要求1至26任一项的方法,其中该蛋白质是抗体,抗体片段,配体,酶,或抗原。
28.依照权利要求1至26任一项的方法,其中该蛋白质是抗体或抗体片段。
29.依照权利要求28的方法,其中该抗体或抗体片段选自由IgG或其片段,Fab,F(ab’)2,Fab’,Fv,ScFv,双特异性抗体或其片段,双抗体或其片段,嵌合抗体或其片段,单克隆抗体或其片段,人源化抗体或其片段,和完全人抗体或其片段组成的组。
30.依照权利要求28或权利要求29的方法,其中该抗体特异性结合肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
31.依照权利要求30的方法,其中该肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原选自由HER2,CD19,CD22,CD30,CD33,CD56,CD66/CEACAM5,CD70,CD74,CD79b,CD138,柄蛋白(Nectin)-4,间皮素(Mesothelin),跨膜糖蛋白NMB(GPNMB),前列腺特异性膜抗原(PSMA),SLC44A4,CA6,和CA-IX组成的组。
32.依照权利要求1至26任一项的方法,其中该蛋白质是配体。
33.依照权利要求32的方法,其中该配体是生长因子。
34.依照权利要求32的方法,其中该配体是激素。
35.依照权利要求1至34任一项的方法,其进一步包含经甲酰甘氨酸残基的醛模块将药剂缀合至该包含甲酰甘氨酸残基的蛋白质。
36.依照权利要求35的方法,其中该药剂是治疗剂。
37.依照权利要求36的方法,其中该治疗剂选自由细胞毒性药剂,抗增殖性药剂,抗赘生性药剂,抗生药剂,抗真菌药剂,和抗病毒药剂组成的组。
38.依照权利要求35的方法,其中该药剂是成像剂。
39.依照权利要求38的方法,其中该成像剂选自由荧光染料,近红外(NIR)成像剂,和单光子发射计算机断层照相术(SPECT)/CT成像剂,核磁共振(NMR)成像剂,磁共振成像(MRI)剂,正电子发射断层照相术(PET)药剂,x射线成像剂,计算机断层照相术(CT)成像剂,K-edge成像剂,超声成像剂,光声成像剂,声光成像剂,微波成像剂,核成像剂,和其组合组成的组。
40.一种组合物,其包含:
包含Cu2+的细胞培养基;和
存在于该细胞培养基中的细胞,其中该细胞表达甲酰甘氨酸生成酶(FGE),
其中该Cu2+以1μM至1mM的浓度存在于该细胞培养基中。
41.权利要求40的组合物,其中该Cu2+以5μM至100μM的浓度存在于该细胞培养基中。
42.权利要求40或权利要求41的组合物,其中该FGE对于该细胞是内源的。
43.权利要求40或权利要求41的组合物,其中该细胞经遗传修饰而表达FGE。
44.权利要求40至43任一项的组合物,其中该细胞经遗传修饰而表达含有FGE识别位点的蛋白质。
45.权利要求40至44任一项的组合物,其中该细胞是真核细胞。
46.依照权利要求45的组合物,其中该真核细胞是哺乳动物细胞。
47.权利要求46的组合物,其中该哺乳动物细胞选自由CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞组成的组。
48.依照权利要求45的组合物,其中该真核细胞是酵母细胞。
49.依照权利要求45的组合物,其中该真核细胞是昆虫细胞。
50.权利要求40至44任一项的组合物,其中该细胞是原核细胞。
51.一种方法,其包含:
在包含Cu2+的细胞培养基中培养包含编码甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的核酸的细胞,其中该培养在下述条件下进行,在该条件中该FGE在该细胞中表达,
其中该Cu2+以1μM至1mM的浓度存在于该细胞培养基中。
52.依照权利要求51的方法,其中该Cu2+以5μM至100μM的浓度存在于该细胞培养基中。
53.依照权利要求51或权利要求52的方法,其中该FGE对于该细胞是内源的。
54.依照权利要求51至53任一项的方法,其中该细胞经遗传修饰而表达FGE。
55.依照权利要求51至54任一项的方法,其中该细胞经遗传修饰而表达含有FGE识别位点的蛋白质。
56.依照权利要求51至55任一项的方法,其中该细胞是真核细胞。
57.依照权利要求56的方法,其中该真核细胞是哺乳动物细胞。
58.依照权利要求57的方法,其中该哺乳动物细胞选自由CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞组成的组。
59.依照权利要求56的方法,其中该真核细胞是酵母细胞。
60.依照权利要求56的方法,其中该真核细胞是昆虫细胞。
61.依照权利要求51至55任一项的方法,其中该细胞是原核细胞。
62.一种生成活化的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的方法,其包含用Cu2+处理FGE以生成活化的FGE,其中该Cu2+以1μM至1mM的浓度存在。
63.依照权利要求62的方法,其中用Cu2+处理该FGE包含在包含Cu2+的细胞培养基中培养包含编码该FGE的核酸的细胞,其中该培养在下述条件下进行,在该条件中该FGE在该细胞中表达。
64.依照权利要求63的方法,其中该Cu2+以5μM至100μM的浓度存在于该细胞培养基中。
65.依照权利要求63或权利要求64的方法,其中该FGE对于该细胞是内源的。
66.依照权利要求63至65任一项的方法,其中该细胞经遗传修饰而表达FGE。
67.依照权利要求63至66任一项的方法,其中该细胞是真核细胞。
68.依照权利要求67的方法,其中该真核细胞是哺乳动物细胞。
69.依照权利要求68的方法,其中该哺乳动物细胞选自由CHO细胞,HEK细胞,BHK细胞,COS细胞,Vero细胞,Hela细胞,NIH 3T3细胞,Huh-7细胞,PC12细胞,RAT1细胞,小鼠L细胞,HLHepG2细胞,NSO细胞,C127细胞,杂交瘤细胞,PerC6细胞,CAP细胞,和Sp-2/0细胞组成的组。
70.依照权利要求67的方法,其中该真核细胞是酵母细胞。
71.依照权利要求67的方法,其中该真核细胞是昆虫细胞。
72.依照权利要求63至66任一项的方法,其中该细胞是原核细胞。
73.依照权利要求63至72任一项的方法,其进一步包含自该细胞纯化该FGE。
74.依照权利要求62的方法,其中处理该FGE包含在包含Cu2+的无细胞反应混合物中表达该FGE。
75.依照权利要求62的方法,其中该FGE在无细胞反应混合物中用Cu2+处理。
76.依照权利要求75的方法,其中元素氧作为终末氧化剂存在。
77.依照权利要求76的方法,其中该元素氧由氧,氧和硫化氢的混合物,或在碱性条件下的氧提供。
78.依照权利要求76的方法,其中该元素氧是由Cu2+催化的反应中的终末氧化剂。
79.依照权利要求75至78任一项的方法,其中该Cu2+由选自硫酸铜,柠檬酸铜,酒石酸铜,Fehling氏试剂,和Benedict氏试剂的Cu2+源提供。
80.依照权利要求75至79任一项的方法,其中该FGE是N端截短的FGE。
81.依照权利要求80的方法,其中该FGE是N端截短的人FGE。
82.依照权利要求62至81任一项的方法,其进一步包含自该Cu2+纯化该FGE。
83.一种试剂盒,其包含:
编码甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的核酸;和
Cu2+或Cu2+源,
其中该Cu2+以1μM至1mM的浓度存在。
84.权利要求83的试剂盒,其进一步包含适合于表达由该核酸编码的FGE的细胞。
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