KR20170090430A - Ａｄｈｄ 및 파킨슨병의 치료를 위한 저용량 ａ2ａ 길항제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 의약 및 특히 파킨슨병 및 주의력 결핍/과잉 행동 장애의 치료에 유용한 의약으로서의 사용을 위한 A_2A 길항제의 특이적 투여량에 관한 것이다.

Description

ＡＤＨＤ 및 파킨슨병의 치료를 위한 저용량 Ａ2Ａ 길항제 {LOW DOSAGE A2A ANTAGONIST FOR THE TREATMENT OF ADHD AND PARKINSONS}

본 발명은 그 중에서도 두 가지 변수: 주의력 결핍 과잉 행동 장애의 치료를 위한 A_2A 수용체 길항제 개념의 사용, 그리고 파킨슨병 및 주의력 결핍/과잉 행동 장애의 치료를 위한 상기 A_2A 길항제의 특정 용량을 포함한다.

A_2A 수용체 길항제는 전두-선조체(fronto-striatal) 회로를 이용하는 다양한 CNS 장애에 대한 잠재적 표적으로서 상당한 흥미를 끌고 있다. A_2A 길항제(이스트라데필린(istradefylline), 프렐라데난트(preladenant) 및 토자데난트(tozadenant))의 임상적 개발은 파킨슨병(PD)의 치료에 초점을 두고 있다.

아데노신 A_2A 수용체 길항제는 비-도파민작용성 기전을 통한 PD의 치료를 향한 새로운 방식을 대표한다. PD의 맥락에서, A_2A 길항제는 전-임상 모델에서 운동장애를 악화시키지 않고 운동 기능을 개선한다. 임상 데이터는 PD의 운동 요소에서 A_2A 길항에 대한 가능성을 지지한다. 또한, A_2A 길항제는 인지 기능장애, 불안 및 우울을 개선하는 것을 전-임상에서 보여주었고, 이에 의해 PD의 신경정신병적 요소에서의 효능에 대한 가능성을 강조한다. 지금까지, PD의 치료를 위해 시판되는 유일한 A_2A 수용체 길항제는 이스트라데필린으로 1 일 20 내지 40 mg의 개시 용량을 갖는다.

화합물 504는 개발 중인 신규의 아데노신 A_2A 수용체 길항제이고 특허 출원 WO2005/063743(화합물 504) 및 WO2010/126082에 개시되어 있다. 본 발명은 그 중에서도, 1) 화합물 504의 놀랍게도 낮은 신규의 치료 용량, 2) 다른 A_2A 길항제와 비교하여 연장된 반감기와 함께, 효과의 더 긴 지속을 보조하고, 그리고 3) PD 및 주의력 결핍/과잉 행동 장애(ADHD)에 특히 초점을 둔 CNS 장애에 적용을 개시한다.

ADHD는 인지 기능장애뿐 아니라 주의력 손상, 충동적 행동, 과잉 행동의 증상을 특징으로 하는 만성이고 고도로 유전적인 발달 장애이다. 전세계적으로 학령기 아동의 5% 내지 10% 및 성인에서 5%까지 ADHD로 고통받고 있다. 비록 ADHD의 병인은 불명으로 남아있지만, ADHD에서 피질-피질 하부 회로뿐 아니라 피질-피질 내 변화된 연결성 및 지연된 뇌 성숙에 대한 증거가 나타나 있다. 많은 문헌에서는 ADHD에서 1) 전두-선조체 네트워크 및 2) 전두-측두 네트워크에서의 저활성화에 주목한다(Rubia K et al, Am J Psychiatry. 1999 Jun;156(6):891-6, Rubia K et al, Am J Psychiatry. 2005 Jun;162(6):1067-75, 및 Rubia K, et al Neuropsychopharmacology. 2011 Jul;36(8):1575-86; Epstein JN, et al, J Child Psychol Psychiatry. 2007 Sep;48(9):899-913). ADHD에서 전두-선조체 저활성화는 운동 및 간섭 억제(Aron AR, and Poldrack RA.J Neurosci. 2006 Mar 1;26(9):2424-33.; Rubia K, et al., J Abnorm Child Psychol. 2003 Jun;31(3):301-13)뿐 아니라 지연되고 선택적인 주의 과정(Smith AB, et al Am J Psychiatry. 2006 Jun;163(6):1044-51)과 연결된다.

ADHD에 대한 치료 선택은 약물요법(흥분제 및 비-흥분제), 심리교육 및 인지 행동 요법이다. ADHD에 대한 제1 및 제2 체계의 정신약리학적 치료는 연장된 방출의 흥분제(메틸페니데이트 및 암페타민 기반의)이다. 흥분제는 성인뿐 아니라 아동의 ADHD에서 핵심 증상 결손을 개선하는 것을 일관되게 보여주었다. 비-흥분제, 특히 아토목세틴(atomoxetine)은 ADHD에서 핵심 도메인 결손의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. ADHD 의약의 작용 방식은 충분히 해명될 것이 남아있지만 현재까지 흥분제 및 비-흥분제 의약 둘 다에서 관찰된 혜택이, 특히 전두엽-전부 피질에서 증가된 도파민(DA) 및 노르에피네프린(NE) 신경전달과 밀접하게 연결된 것을 시사하는 증거가 있다. 또한, 신경 네트워크 수준에서 메틸페니데이트는 지연된 주의 및 충동성을 개선하고 동시에 중앙 전두 및 측두 기능장애를 변화시키지 않으면서 전두-선조체 네트워크를 정상화한다(Rubia K, et al Neuropsychopharmacology. 2011 Jul;36(8):1575-86, Cubillo A, et al., J Psychiatr Res. 2010 Jul;44(10):629-39, 및 Cubillo A, et al., Cereb Cortex. 2014 Jan;24(1):174-85). 요약하면, 지금까지 ADHD 문헌에서는 현재의 의약이 개선된 전두-선조체 연결성 및 증가된 전두엽-전부 DA 및 NE를 통해 ADHD의 핵심 도메인을 치료하는 데 임상적으로 효과적인 한편, 질환과 연관된 인지 기능장애를 포함하여 많은 해결되지 못한 요구는 충분히 다루어질 것이 남아있음을 시사한다(Gualtieri CT, and Johnson LG. J Atten Disord. 2008 Jan;11(4):459-69, Bidwell LC, et al., Pharmacol Biochem Behav. 2011 Aug;99(2):262-7, 및 Swanson J, et al., Neuropsychopharmacology. 2011 Jan;36(1):207-26).

비록 ADHD 환자가 흥분제에 양호하게 반응한다 하더라도, 이들은 잠재적 의존성, 오명을 갖고 블랙 박스 라벨(남용, 돌연사 및 자살경향성의 위험)로 표시된다.

흥분제는 ADHD의 치료에 매우 효과적이지만, 현재의 의약과 관련된 안전성 우려(위 참조)는 신규의 안전한 대안을 찾는 데 상당한 관심을 강조한다. 마지막으로, 흥분제는 매우 효과적이고 1에 근접한 효과 크기를 발휘하는 한편, 제형에 따라 3 내지 16 시간 동안 활성이므로 낮 동안 ADHD 동반증상을 경감시킨다. 그러나 ADHD는 사회 생활뿐 아니라 일/학업에도 피해를 주고, 따라서 환자의 개선된 삶의 질을 위해 아침 저녁 사회적 및 학업 기능을 보조하기 위한 24 시간 약물 치료의 필요성이 존재한다.

현재 시판 중인 ADHD의 치료를 위한 아데노신 A_2A 수용체 길항제는 없다. 최근, V-81444(WO2002055082에 화합물 14로 개시됨)가 100 mg의 1 일 2 회 투약 요법을 사용하여 phIb/II 개념 입증 연구에서 시험되었다. 1 일-2 회 투약 요법의 요구는 V-81444의 5 내지 7 시간 반감기(Abstracts / Journal of the Neurological Sciences 333 (2013), Abstract No: 951) 및 약 2 nM의 Ki의 발견에 의해 지지된다.

본 발명은 신규의 작용 방식(MoA)을 갖는 저용량, 1 일-1 회 ADHD 의약으로서 화합물 504를 강조한다. 신규의 MoA는 ADHD에서 인지 및 감정 기능장애에 더하여 ADHD 핵심 도메인 내 효능에 대한 가능성을 강조한다. 또한, 효능을 증가시키면서, 504는 A_2A MoA 및 저용량 요구에 기인하여 감소된 부작용을 야기할 수 있다. 흥분제 의약은 제1 및 제2 치료 체계이면서 용량 선택에서 예측성의 결핍으로 인해 특히 성인 집단에서 불량한 처방 준수와 연계된다. 504 화합물은 낮고 좁은 용량 범위로 사용될 것이고, 이에 의해 의약에 대한 처방 준수를 보조한다. 마지막으로, 1 일 1 회 투약은 흥분제와 비교하여 개선된 아침 및 저녁 기능을 보조할 수 있다.

본 발명은 이에 따라 안전하고 효과적인 신규의 ADHD 의약을 제공한다.

본 발명은, 2 내지 3 mg의 1 일 1 회 투여량과 같은, 2 내지 3 mg의 투여량으로 의약으로서 사용하기 위한, 아래 구조식으로 제시되는 화합물 504 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 관련된다.

[화합물 504]

일 양태에서 본 발명은 PD 또는 ADHD의 치료에 사용하기 위한 화합물 504와 관련된다.

또한, 본 발명은 2 내지 3 mg 1 일 투여량과 같은, 2 내지 3 mg의 투여량으로 화합물 504를 사용한 ADHD 및 PD 환자의 치료 방법과 관련된다.

도 1: 약물동력학 및 약물학적 결과
E_max 방법을 사용하여 추정된 뇌 절편 방사선촬영 스캔의 시기에 화합물 504 혈장 농도에 대한 래트 경막에서의 수용체 점유. Y-축은 수용체 점유(%)를 보여준다.
도 2: 래트 A_2A 점유 및 MPTP-처치된 마모셋 장애 역전 점수에 근거한, PD 환자에서 화합물 504 혈장 농도 범위의 치료적으로 유효한 EC_{50 -80} 예측. X-축은 혈장 농도(ng/mL)를 보여주고, Y-축(좌측)은 A2A % RO(수용체 점유)를 보여주고, Y-축(우측)은 장애 역전을 보여준다.
▲A2A % RO, - 비 선형 피트 수용체 점유; ■ 장애 역전, - 비 선형 피트 장애 역전.
도 3: E_max를 사용하여 추정된 PET 스캔 시기에 화합물 504 혈장 농도에 대한 경막에서의 수용체 점유. X-축은 CPET(ng/mL), Y-축은 점유(%)를 보여준다.

5 mg,

3 mg,

2 mg,

1 mg

0.5 mg, - 곡선 피트.

"화합물 504"라는 용어는 다음 구조식에 따른 화합물 및 이의 약제학적 허용 가능한 염을 의미하도록 의도된다.

[화합물 504]

뇌에서 A_2A 수용체는 선조체, 중격측좌핵, 담창구, 및 후신경구에서 풍부하게 발현되고, 이들이 글루타메이트 및 도파민의 시냅스 전달을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 다른 뇌 영역에서 낮은 발현 수준을 갖는다. 배후 선조체에서, A_2A 수용체는 도파민 신경전달 시스템과 밀접한 물리적 및 기능적 상호작용을 한다. A_2A 수용체는 GABA-작동성 선조체담창구 중간 가시 뉴런에서 D2 수용체와 공동-편재되는데, 여기에 A_2A와 D2 수용체 사이의 기능적 길항에 대한 증거가 있어; A_2A 길항은 간접적 출력 경로 내에서 D2 효능과 유사한 반응을 유도할 수 있다. 따라서, A_2A 수용체 길항은 피질 및 기저핵에서 도파민 작동성 전달을 증진시킨다.

도파민 작동 및 노르아드레날린 작동 활성을 갖는 의약은 도파민 및 노르에피네프린 재흡수를 차단하는 것에 의해 ADHD 증상을 감소시키는 것으로 보이고, 구조적 및 기능적 영상화 연구에서는 전두-피질하 경로에서의 기능장애뿐 아니라 도파민 작동 및 노르아드레날린 작동 시스템에서의 불균형이 ADHD의 병태생리에 기여하는 것을 시사한다. 중추신경계에서 도파민 방출에 대한 A_2A 길항제의 영향, 그리고 본원에서 제시되는 결과는 화합물 504가 ADHD 증상을 치료하는 데 효과적일 것임을 시사한다. 사실, 그리고 임상적 관찰에 추가하여, ADHD에서 A_2A 수용체의 추정되는 관심은 자발적 고혈압 래트(Takahashi et al., 2008, Front Biosci 13:2614-2632 Pires et al., 2009, Behav PharmMarch, Vol 20 , Issue 2: 134-145) 및 선택적 주의, 5-선택 일련의 반응 시간 과제의 시험에서 측정된 인지 기능장애(Higgins et al Behav Brain Res (2007); 185 (1): 32-42)를 갖는 래트 둘 다에서 측정된 주의력 결핍에 대한 A_2A 길항제의 유익한 효과를 보여준 전임상 연구에 의해 강조되었다. 중요하게는, 주의력 결핍은 ADHD에 대한 치료적으로 관련된 용량 범위에서의 메틸페니데이트 처치로 역전되었다.

시험관내에서, 화합물 504는 아래 표에서 보여주는 바와 같이 인간, 마모셋, 설치류 및 개 A_2A 수용체에 대하여 높은 친화성을 갖는다(0.1<Ki [nmol]<0.3). 화합물 504는 다른 아데노신 수용체 서브타입과 관련해서뿐 아니라 수용체, 이온 채널 및 수송체를 포함하는 광범위한 CNS 표적에 대하여 매우 선택적인 A_2A 수용체 길항제이다. 10 μM에서 50% 미만의 결합 억제는 임의의 57 카운터-스크린 표적에서 발견되었다. A1 수용체에 대한 A_2A 수용체의 선택성은 인간에서 872 배, 마모셋에서 2700 배, 래트에서 500 배, 마우스에서 97 배, 그리고 개에서 1590 배이다. 다양한 다른 수용체(DA, 5-하이드록시트립토판[5-HT], 아세틸콜린[Ach], GABA, 글루타메이트[Glu], 오피에이트, 카나비노이드를 포함하는)의 서브타입, 이온 채널(칼슘, 포타슘) 및 수송체(아데노신, 모노아민, 세로토닌, 도파민, 및 노르에피네프린)에 대해서는 친화성이 거의 또는 전혀 발견되지 않았다.

본 발명의 실시예 1에서 보여주는 바와 같이, 화합물 504의 약물동력학적(PK)/약물학적(PD) 관계는 래트 선조체 A_2A 점유(실시예 1) 및 보다 임상적으로 관련된 MPTP-병변 마모셋에서 장애 역전 점수(실시예 2)를 사용하여 평가되었다.

약 80%의 수용체 점유를 부여할 A_2A 길항제의 투여는 대부분의 경우에 임상적으로 유의미한 반응을 유도하기에 충분한 것으로 추정될 수 있다(Mihrara et al. J Nucl Med (2008) 49:1183-1188 및 Brooks et al. Synapse (2008) 62:671-681).

임상적으로 유의미한 효능을 위해 80%의 최소 A_2A 점유를 추정함으로써, PK/PD 연구는 래트 및 마모셋에서 수행되었다. 1250 ng/mL의 EC₈₀ 혈장 농도는 도 1, 실시예 1에서 보여주는 바와 같이 래트 점유 E_max PK/PD 모델로부터 예측되었다. 마모셋에서 상응하는 175 ng/mL EC₈₀ 혈장 농도는 E_max PK/PD 모델로부터 예측되었다(도 2, 실시예 2). 이들 값에 근거하여, 인간 투여량 범위는 경구 클리어런스 0.6 내지 0.8 L/h 및 동등한 혈액:뇌 비율을 인간, 래트 및 마모셋에서 추정하는 것에 의해 예측될 수 있을 것이다. 이 모델을 이용하여 1 일 용량은 3 mg 보다 낮을 수 없고 24 mg만큼 높을 수 있을 것으로 예측되었다.

10 mg 투여량은 PK/PD 모델에 근거하여 임상적으로 유의미한 것으로 믿어지는데, 이 계열의 화합물에서 관찰되는 임의의 카페인-유사 부작용을 유도할 정도로 높지 않고 임상적 효과를 갖기에 충분히 높은 것으로 추정되기 때문이다.

제1 안전성 및 용인성 연구에서는 이에 따라 10 mg 투여량을 시험하였다. 이 연구는 단일 용량(1 mg, 5 mg 또는 10 mg)을 투여한 총 17 인의 건강한 젊은 남성(18 내지 45 세), 19 인의 건강한 고령 남성(55 내지 75 세), 및 14 인의 건강한 고령 여성(55 내지 75 세)에서 실시된 무작위화, 이중-맹검, 위약-제어된, 단일-상승 연구였으며, 12 인의 대상은 단일 용량 5　mg을 3 가지 개별 시기에 투여하였다(실시예 3). 14C-표지 화합물은 젊은 남성에서 10 mg 용량에 포함되었고 음식 효과도 10 mg에서 시험되었다. 이 연구로부터의 결과는 10 mg 투여량이 최대 용인되는 투여량임을 보여주었는데, 많은 환자가 불면증으로 고통받았고 5 mg 투여량에서도 이들 부작용이 나타났기 때문이다.

인간에서의 첫 번째 연구는 10 mg 및 5 mg 투여량 둘 다 임상적으로 효과적임을 보여주었고, 따라서 PK/PD 점유 데이터를 지지하였다. 그러나, 임상적 투여량은 부작용을 일으켰다. 반면, 5 mg 아래로 가면 수용체 점유뿐 아니라 얻을 수 있는 임상적 효과에 관하여 관심이 주어졌다.

임상적으로 유의미한 투여량이 래트 및 마모셋으로부터의 PK/PD 데이터를 봄으로써 추정될 수 있는 것보다 더 낮은 것으로 보이므로, 본 발명자들은 화합물 504의 인간 점유를 조사하기 위해 인간에서 양전자 방사 단층촬영(PET) 연구를 수행하기로 결정하였다(도 3, 실시예 4). 이 연구는 트레이서 [11C]-SCH442416를 사용하여 건강한 젊은 남성에서 단일 경구 용량 이후 A_2A 수용체에서의 점유를 조사하는 개입, 오픈-라벨, PET 연구였다. 총 6 인의 건강한 젊은 남성이 0.5 mg 내지 5 mg의 단일 경구 용량을 투여받았다. 놀랍게도, 본 발명자들은 유해 사례의 최소한의 위험이 있는 임상적으로 효과적인 1 일 용량이 인간에서 3 mg 또는 심지어 2 mg만큼 낮은 투여량에서 실현 가능한 것으로 보임을 발견하였다(도 3, 실시예 4). 더 낮은 투여량은 더 높은 투여량에서 화합물 504에 관찰되는 유해 사례, 특히 불면증 및 수면 위상 리듬 교란뿐 아니라, 5 mg 및 10 mg 투여량에서 관찰되는 현기증, 피로, 두통, 다한증, 기립성 저혈압, 및 빈맥을 포함하는, 이 계열 화합물과 관련되는 다른 카페인-유사 징후 및 증상을 최소화할 것이기 때문에 이는 처치 대상에게 매우 유익하다(실시예 3).

따라서, 본 발명은 0.5 mg 내지 3 mg, 1 mg 내지 3 mg, 2 mg 내지 3 mg 사이, 약 2 mg 또는 2 mg과 같은 3 mg 이하의 1 일 투여량에서 의약으로 사용하기 위한 화합물 504의 용도와 관련된다. 특히, 본 화합물은 PD를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

추가의 양태에서, 본 화합물은 0.5 mg 내지 3 mg, 1 mg 내지 3 mg, 2 mg 내지 3 mg 사이, 약 2 mg 또는 2 mg과 같은 3 mg 이하의 1 일 투여량을 포함하는 약물학적 조성물 또는, 예를 들어 정제로 사용될 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 ADHD의 치료를 위해 화합물 504를 제공하는 것이다(실시예 5). 화합물 504는 CGS21680-유도된 활동저하의 강력한 생체내 역전을 이끌어낼 수 있는 강력하고 경구적으로 활성인 A_2A 수용체 길항제임을 보여주었다. 가능성 있는 투여량 노출 범위에 걸쳐 화합물 504는 또한 A_2A 수용체의 길항과 일치하는 주의력 수행의 양태를 개선하였다. 이처럼 이들 효과는 주의력 결핍의 치료에서 화합물 504의 가능성을 지지한다. 따라서, 화합물 504는 ADHD의 치료를 위해 사용될 수 있다. 1 일 투여량은 0.5 mg 내지 3 mg, 1 mg 내지 3 mg, 2 mg 내지 3 mg 사이, 또는 2 mg과 같은 3 mg 이하일 수 있다.

화합물 504의 평균 반감기는 19 내지 25 시간 범위로 용량 수준에 걸쳐 유사하였다. 화합물 504는 이에 따라, 1 일 1 회 주어질 수 있고 따라서 대상이 의약 섭취 24 시간 후 아침에 일어날 때 작용한다는 점에서, 예를 들어 ADHD를 치료하기 위해 시판되는 다른 약물과 바로 구별된다. 대부분의 다른 ADHD 약물은 메틸페니데이트의 경우 2 내지 12 시간, 리스덱스암페타민의 경우 8 내지 14 시간 동안만 작용하기 때문에, 또는 5 내지 7 시간의 반감기로 인해 1 일 2 회 주어지는 다른 A_2A 길항제 V-81444와 비교하여, 더 규칙적으로 주어져야 한다.

치료에 가장 효과적인 투여 경로를 선택하는 것이 바람직하고, 이의 예로는, 예를 들어 정제의 사용에 의한 경구 투여이다.

정제와 같이 경구 투여에 적절한 제제는, 예를 들어 부형제(예를 들어, 유당 및 만니톨), 붕해제(예를 들어, 전분), 활택제(예를 들어, 스테아르산마그네슘), 결합제(예를 들어, 하이드록시프로필 셀룰로스), 계면활성제(예를 들어, 지방산 에스테르) 및 가소제(예를 들어, 글리세린)를 사용하여 생산될 수 있다.

비경구 제제 또한 위의 경구 제제의 설명에서 기술된 부형제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 및 가소제, 그리고 희석제, 방부제, 풍미제 등으로부터 선택되는 하나 이상의 보조 성분을 포함할 수 있다.

위에 기술된 응용의 예에서, 일반적으로 화합물 504 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.

본 맥락에서, 용어 "치료" 및 "치료하는"은 질환과 싸우는 목적을 위한 환자의 관리 및 돌봄을 의미한다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화, 질환의 진행을 지연, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감, 그리고/또는 질환을 치유 또는 제거하기 위한 활성 화합물의 투여와 같이, 환자가 고통받는 주어진 질환에 대한 전 영역의 치료를 포함하도록 의도된다. 치료되는 환자는 바람직하게는 포유류, 특히 인간이다. 본 맥락에서, "질환"은 장애, 병태, 기능부전, 기능장애 등과 같은 의미로 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1

래트에서 선조체 A _2A 점유를 생체외 방사선촬영으로 조사하였다

본 연구에서는 수컷 래트(수컷 CD 래트(8 주령), Charles River Japan)에 화합물 504의 단일 경구 투여 후 선조체에서 수용체 점유를 조사하였다. 트리튬 표지된 SCH58561(0.3 nmol/L, GE Healthcare로부터 입수)를 A_2A 수용체 영상화를 위한 트레이서로 사용하였다. 수용체 점유는 화합물 504를 투여한 래트로부터 얻어진 뇌 절편과 트레이서의 배양에 의해 결정되었다.

화합물 504(0.06 mg/mL)를 5 mL/kg(0.3 mg/kg)의 용량으로 래트에 경구 투여하고 투여 6 및 8 시간 후에 디에틸에테르로 마취시켰다. 이후 동맥 및 정맥 혈액을 헤파린 함유 튜브로 수집하였다. 이후 즉시 뇌를 제거하고 OCT 화합물에 가라앉히고 드라이아이스로 냉각된 2-메틸 부탄에서 동결시켰다. 동결된 뇌를 사용시까지 -80℃에서 보존하였다.

크리오마이크로톰(Coldtome, 설정 온도 -20℃)을 사용하여 약 브레그마(bregma) 1.2 mm에서의 관상 절편(20 ㎛)을 준비하고 슬라이드 글라스(Super Frost, Matsunami Glass; 글라스 당 2 또는 3 절편) 상에 놓았다. 슬라이드 글라스 상에 수집된 뇌 절편을 -80℃에서 보존하였다. 0.1 또는 0.3 nmol/L로 트레이서를 함유하는 반응 용액 70 μL를 뇌 절편에 적용하고 실온에서 미리 설정한 시간 동안 배양하였다. 트레이서를 함유하는 반응 용액은 실리콘 처리된 도구를 사용하여 취급하였다. 트레이서와 배양 후, 뇌 절편을 1 분 동안 빙-냉 세척 용액으로 3 회 세척하고 빙-냉 물로 2 회 헹구었다. 0.1 mmol/L NECA의 존재 중에 약물-비처리 래트로부터 제조한 뇌 절편으로 동일한 반응을 수행하여 트레이서의 비특이적 결합을 평가하였다. 뇌 절편을 실온에서 건조하고, 카세트 내의 영상화 플레이트(BAS-TR2040, Fuji Film)에 노출시키고, 차폐함에 약 24 시간 동안 방치하였다. 방사활성을 다음 조건 하에서 기록하였다: 해상도: 50 ㎛; 계조(Gradation): 256; 감도: 10000; 관용도(Latitude): 5.

화합물 504를 아세토니트릴로 희석하여 0.01, 0.03, 0.1, 1, 10 및 30 ㎍/mL의 화합물 504를 함유하는 용액을 제조하여 혈장 샘플에 대한 교정 곡선을 만들었다. 이 용액을 1% vol의 아세토니트릴 농도의 대조 혈장 샘플에 첨가하여 화합물 504를 0.1, 0.3, 1, 10, 100 및 300 ng/mL로 함유하는 혈장 샘플을 제조하였다. 이들 혈장 샘플을 교정 곡선 샘플로서 사용하였다.

혈장 샘플을 전-처리하기 위해 내부 표준(I.S.)을 아세토니트릴에 용해시켜 I.S. 용액을 0.03 ㎍/mL으로 제조하였다. 혈장 샘플을 필요시마다 대조 혈장으로 희석하였다. 0.1 mL의 혈장 샘플에 10 μL의 I.S. 용액 및 1 mL의 10 mmol/L 아세트산암모늄을 첨가하고 교반하여 전처리를 위한 샘플을 제조하였다. 오아시스(Oasis) HLB 추출 플레이트(30 mg, Waters)를 사용하여 샘플을 전처리하였다. 각각의 웰을 1 mL의 메탄올 및 물로 순차적으로 조정하였다. 1 mL의 전처리용 샘플을 웰에 부하하였다. 각각의 웰을 1 mL의 5 vol% 메탄올로 세척한 후, 분석물을 1 mL 아세토니트릴로 용출시켰다. 용출물을 질소 기류 하에서 증발시키고 잔류물을 0.1 mL의 재구성 용액에 재용해시켰다. 샘플을 4℃에서 약 1800 xG로 5 분 동안 UNFILTER(0.45 ㎛ 친수성 PVDF, Whatman)를 사용하여 원심분리하였다. 여액의 부분 표본을 분석에 사용하였다.

선조체에서 A_2A 수용체 점유의 교정은 아래 식을 사용하여 수행하였다.

여기에서 PSL_KW- 및 PSL_Ctrl은 각각 화합물 504-비처치 및 처치된 동물의 ROI에서의 PSL 값이다. PSL은 트레이서의 검출을 위한 광 자극 발광이고 ROI는 선조체에서 트레이서 측정을 위한 관심 있는 영역이다.

각각의 동물에서의 수용체 점유로서, 2 또는 3 절편(4 내지 6 ROI)의 평균 값이 사용되었다.

혈장에서 화합물 504의 농도와 수용체 점유 사이의 관계는 도 1에서 보여준다. EC₅₀는 121 ng/mL였다(95% 신뢰 구간, 113 내지 128 ng/mL).

실시예 2

MPTP -병변 마모셋에서의 A _2A 점유

80% 인간 선조체 A_2A 점유가 파킨슨 치료에 요구된다는 예상을 갖고, 보다 임상적으로 관련된 MPTP(1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘)-병변 마모셋 모드에서 장애 역전 점수를 사용하여 화합물 504의 PK/PD 관계를 평가하였다(Rose et al (2006) European J Parm, 546, 82-87; Uchida et al (2014) J Pharmacol Sci, 124, 480-485; Kanda et al (200) Exp Neurol, 162, 321-327).

마모셋을 PK/PD 측정에 사용하기 전에 마모셋은 몇 가지 MPTP 요법(단일 MPTP 요법: 연속 3 일 동안 1 일당 2 mg/kg, s.c.)을 받았다.

첫째로, 반 구획 PK 모델(평형 반감기 < 0.5 시간)을 사용하여 잠재적 이력을 평가한 후 생체외 박편 방사선촬영에 근거하여 측두 선조체 A_2A 점유(0.3 mg/kg에서)의 PK/PD 모델링(E_max 효과 모델)으로 래트 혈장 농도 대 수용체 점유 관계를 확립하였다. 래트 선조체 점유의 EC₈₀은 PK/PD 모델링으로부터 1250 ng/mL인 것으로 예측되었다(또한 도 1 참조).

두 번째로, 혈장 농도 대 MPTP-처치된 마모셋(0.1-3 mg/kg)의 장애 역전 점수의 PK/PD 모델링(E_max 효과 모델)을, 적합화된 래트 점유 곡선으로부터 외삽된 >50% A_2A 점유에 상응하는 예측된 EC₈₀ 175 ng/mL으로 확립하였다. 인간 용량 추정에 대한 EC₈₀ A_2A 점유에 요구되는 혈장 농도에 관련되는 마모셋에서의 임의의 선조체 점유 데이터의 부재시, 예측되는 래트 선조체 점유의 EC_{50 -80} 혈장 농도 및 마모셋 장애 역전 점수에 근거하여 3 내지 24 mg의 1 일 용량 범위를 확립하였다.

도 2에서는 래트 A_2A 점유 및 MPTP-처치된 마모셋 장애 역전 점수에 근거하여 PD 환자에서 예측되는 치료적으로 유효한 EC_{50 -80} 화합물 504 혈장 농도 범위를 보여준다.

실시예 3

안전성 및 용인성 연구

본 연구의 주요 목적은 체질량지수(BMI) ≥ 19 및 ≤ 29 kg/㎡인 연령 ≥18 및 ≤45 세의 젊은 남성 및 연령 ≥55 및 ≤75 세의 고령의 남성 및 여성에게 단일 용량으로 주어지는 화합물 504의 안전성 및 용인성을 조사하기 위한 것이다. 본 연구는 3 부문: 부문 A, B, 및 C로 수행되었다.

부문 A 및 B는 각각 젊고 건강한 남성, 및 고령의 남성 및 여성에서 안전성과 용인성을 결정하기 위한 단일-용량 단계적 확대였다. 3 가지 용량(집단 A1 내지 A3)을 건강한 젊은 남성에서 시험하였다: 1 mg(N=6), 5 mg(N=6), 및 10 mg(N=5); 위약(N=8, 3 집단의 합). 14C-표지된 화합물 504(250 nCi)를 건강한 젊은 남성에게 주어지는 10　mg 용량에 포함시켰다. 두 가지 용량(집단 B1 및 B2)을 건강한 고령의 남성 및 여성에서 시험하였다: 5 mg(N=9 남성/4 여성), 10 mg(N=4 남성/4 여성); 위약(N=6 남성/4 여성, 3 집단의 합). 부문 C에서는 반복적 단일 용량을 사용하여 화합물 504 투여 후 대상-내 가변성 및 음식의 가능한 효과를 조사하였다. 총 12 인의 건강한 고령의 남성(N=6) 및 여성(N=6)은 각각 단일 용량의 화합물 504 5　mg을 3 가지 별도의 시기에 무작위 방식으로 받았다. 하나의 시기에 화합물 504는 FDA 표준 고-지방 조식 후에 투여되었고, 두 시기에 화합물 504는 야간 공복 후 투여되었다. 적어도 7 일의 세척 기간이 각각의 용량 투여를 분리하였다. 부문 A 및 B에서 화합물 504는 경구 용액(0.25　mg/mL)으로서 투여되었고, 부문 C에서 화합물 504는 고형 제제(5 mg 캡슐)로서 투여되었다.

본 연구의 부문 A, B, 및 C에서 결정된 화합물 504의 약물동력학적 파라미터는 아래 요약된다.

부문 A 및 B의 결과는 화합물 504가 투약-후 0.75 내지 1.75 시간의 중앙값 t_max로 각각의 용량에서 신속하게 흡수되는 것을 보여주었다. C_max에 도달한 후, 화합물 504의 혈장 농도는 투약-후 대략 5 시간까지 정체 상태를 유지하였고; 그 후 비록 각각의 혈장 농도는 변동하였지만 평균 혈장 농도는 감소하였다. 화합물 504에 대한 노출은 AUC_{0 -24} 및 C_max에 의해 결정되듯이, 용량 범위 1 내지 10 mg에서 대략 용량-비례적 방식으로 증가하는 것으로 나타났다. 평균 t_½은 용량에 걸쳐 유사하였고 19 내지 25 시간 범위였다.

부문 B에서는 남성과 여성 사이에 화합물 504에 대한 노출에서 현저한 차이는 없었다. 평균 t_½은 성별 사이에서, 그리고 5 내지 10 mg 용량 사이에서 대체로 유사하였다.

건강한 젊은 대상과 고령의 대상 사이에서 화합물 504의 약물동력학적 프로파일은 명백한 차이가 없었다.

부문 C에서, 음식은 화합물 504의 흡수를 지연시켰고; 중앙값 t_max는 식사 상태에서 대략 2 내지 3 시간 늦게 나타났다. 평균 C_max는 공복 상태보다 식사 상태에서 대략 23% 더 낮았다. AUC_{0 - inf} 및 AUC_{0 -t}에 근거한 전반적 노출은, 공복 상태와 비교하여 식사 상태에서 화합물 504 5 mg의 투여 후 통계적으로 유의미한 차이가 없었다. 각각의 식이 상태에서, 화합물 504에 대한 전반적 노출(평균 AUC의 검사에 근거한)은 여성보다 남성에서 더 높은 것으로 나타났다. 남성에서는, 공복 용량에 걸쳐 대상-내 가변성(CV%)은 낮아서, AUC_{0 - inf} 및 C_max는 각각 27% 및 16%였다. 여성에서, AUC_0-inf 및 C_max는 각각 59% 및 23%의 CV%로 가변성이 더 높았다.

부문 A에서는, 화합물 504의 1, 5, 및 10 mg의 단일 용량이 건강한 젊은 남성에게 투여되었다.

모두 합하여, 화합물 504 용량군에서 17 인의 대상 중 13 인이 36 AE를 가졌고 위약군에서 8 인의 대상 중 2 인이 3 AE(유해 사례)를 가졌다.

불면증이 가장 흔한 유해 사례로, 화합물 504 5 mg 군에서 4 인의 대상 및 화합물 504 10 mg 군에서 5 인의 대상 모두에서 보고되었다. 불면증은 위약 또는 화합물 504 1 mg 군의 대상에서는 보고되지 않았다. 불면증은 일반적으로 투약-후 대략 14 내지 16 시간에 보고되었는데, 이는 대략 23:00 내지 01:00의 시간에 해당하였다. 불면증의 8 사례는 가벼운 것이었고 하나는 중등도였다. 불면증은 일반적으로 2.5 내지 6.25 시간 이내에 해결되었는데; 2 인의 대상에서 불면증은 대략 2 일 동안 지속되었다.

부문 B에서는, 화합물 504의 5 mg 및 10 mg의 단일 용량이 건강한 고령의 남성 및 여성에게 투여되었다.

모두 합하여, 화합물 504 용량군에서 21 인의 대상 중 16 인이 53 AE를 가졌고 위약군에서는 10 인의 대상 중 5 인이 7 AE를 가졌다.

3 인의 대상이 화합물 504 10 mg 군에서 5 개의 중증 유해 사례를 가졌는데: 1 인의 여성은 불면증이 있었고, 불안정성 및 초조가 있었고; 1 인의 남성이 혈압 증가가 있었고; 1 인의 여성은 심실 기외수축을 가졌다. 심실 기외수축은 원격측정 중에 나타났고(투약-후 대략 3 시간), 기외수축은 투약-후 1 일 4 시간까지 간헐적으로 보였다. 대상은 본 연구 종료 후 대상을 검진한 독립적 외부 심장병전문의에게 보내졌고, 유사한 사례가 투약 51 일 후 홀터(Holter) 기록에서 검출되었다.

부문 B에서는 화합물 504 용량군에서 최고 빈도의 AE가 불면증 및 초조였으며, 이는 본 연구의 부문 A에서의 발견과 일치하였다. 10 mg 용량은 고령의 대상에서 최대 용인되는 용량에 접근하는 것으로 고려되었다.

부문 C에서는, 건강한 고령의 대상에게 투여된 화합물 504의 5 mg의 단일 용량이 식사 및 공복 상태에서 주어질 때 안전하고 용인되었다.

모두 합하여, 12 인의 대상 중 11 인이 90 AE를 가졌고, 이 중에서 15 사례는 중등도였고 3 사례는 중증이었다. 3 개의 중증 사례는 1 인의 대상에서 나타났는데: 초조, 불안정성 및 주의 방해가 각각 화합물 504(5 mg, 공복시)의 3 번째 단일 용량 투약-후 30 분, 1 시간, 및 1 시간에 나타났다. 이 사례는 1.5 일 후 처치 없이 해결되었고 이 시기 중에 대상은 또한 중등도의 불안 및 약한 불면증이 있었다.

최고 빈도의 AE는 불면증이고 12 사례의 약한 불면증 및 2 사례의 증등도 불면증이 있었다. 이 발견은 본 연구의 부문 A 및 B에서의 발견과 일치하였다.

실시예 4

A _2A 수용체 점유를 조사하는 인간에서의 Pet 연구

본 연구는 트레이서 화합물로서 [11C]-SCH442416를 사용하여 젊고 건강한 남성에서 화합물 504의 단일 경구 투여 후 A_2A 수용체 점유를 조사하는 오픈-라벨, 양전자 방사 단층촬영(PET) 연구로서 고안되었다.

본 연구는 스크리닝 시기, 자기 공명 화상(MRI) 스캔, 안전성 기준선, 처치 시기(기준선 PET 스캔, 화합물 504 투약, 및 2 처치 PET 스캔), 및 후속 조치로 구성되었다.

본 연구에는 각각 2 인의 대상을 포함하는 3 개 집단이 있었다. 집단 A1에서 2 인의 대상은 5 mg 화합물 504를 받고; 집단 A2에서는 1 인의 대상이 0.5 mg 화합물 504를 받고 1 인의 대상은 1 mg 화합물 504를 받았으며; 집단 A3에서는 1 인의 대상이 2 mg 화합물 504를 받고 1 인의 대상은 3 mg 화합물 504를 받았다.

대상의 수, 화합물 504의 용량, 및 평가 시점은 이전 집단으로부터의 예비 약물동력학적, 약물학적, 그리고 안전성 및 용인성 데이터를 기반으로 검토 및 조정하였다.

스크리닝 시기(-28 내지 -4 일)에 안전성 스크리닝 절차가 수행되었고 대상 적격성은 자기 공명 화상(MRI) 스캔(-21 내지 -2 일)에 따라 확인되었다. 적격 대상은 -1 일에 병동에 들어갔다. 1 일에 화합물 504의 단일 용량을 받기 전 기준선 PET 스캔이 수행되었다. 두 번째 PET 스캔(PET2)은 투약-후 대략 2 시간에 수행되었는데, 이는 최대 화합물 504 혈장 농도의 추정 시간(t_max)이었다. 집단 A1에서 대상은 세 번째 PET 스캔(PET3)을 투약-후 대략 24 시간에 받았고, 집단 A2 및 A3에서 대상은 세 번째 PET 스캔(PET3)을 투약-후 대략 26 시간에 받았다. 대상은 PET 트레이서 [11C]-SCH442416을 각각의 PET 스캔 직전에 받았다.

모든 대상은 -1 일부터 4 일에 투약-후 72 시간의 안전성 평가 종료까지 병동에 가두어졌다. 후속 조치 평가는 6 일에 수행되었다(1 일 전 및 2 일 후까지). 각각의 대상에서 본 연구의 전체 기간은, 스크리닝부터 후속 조치까지 대략 2.5 내지 3.5 주였다.

PET 트레이서 [11C]-SCH442416은 정맥내 투여를 위한 용액으로서 11 mL의 멸균되고 발열성 물질이 없는 유형 1 유리 바이알 중의 방사성의약품으로서 제공되었다. [11C]-SCH442416 용액은 10%까지의 에탄올 및 90% 식염수로 구성되었고 대략 20 mL의 식염수/에탄올 용액 중 정맥내 볼루스로서 대략 20 초에 걸쳐 투여되었다. 각각의 대상은 각각의 PET 스캔에서 최대 500 MBq의 [11C]-SCH442416를 받았다.

예정된 시점에서 화합물 504의 약물 농도 분석을 위해 혈액 샘플을 채취하였고 안전성 및 용인성을 평가하였다.

주요 포함 기준

체질량 지수(BMI) 18.5 내지 30 kg/㎡(극치 포함)을 갖는 25 세 내지 55 세(극치 포함)의 남성

약물동력학적 평가

화합물 504의 다음 약물동력학적 파라미터를 각각의 대상에서 계산하였다: 0부터 무한대까지 혈장 농도-시간 곡선 아래 면적(AUC_{0 - inf}); 0부터 t_last까지 혈장 농도-시간 곡선 아래 면적(AUC_{0 -t}); 관찰된 최대 혈장 농도(C_max); 각각의 투약 후 PET 스캔에서 계산된 PET 스캐닝 시기에서의 혈장 농도(C_PET); 경구 클리어런스(CL/F); 혈장에서의 겉보기 제거 반감기(t_½); C_max 발생에 상응하는 공칭 시간(t_max); 최종 정량화가능 농도 시간(t_last) 및 겉보기 분포 용적(Vz/F).

약물학적 평가

PET 데이터는 단순화된 참조 조직 방법(simplified reference tissue method, SRTM)을 사용하여 분석하였다. 이 방법은, 표적 수용체가 없는 것을 제외하고는 표적-풍부 영역과 유사한 참조 영역(이 예에서는 소뇌)을 상정하였다. SRTM 시행은 직접적으로 추정된 비-대체 성분에 대한 결합 포텐셜(BPND)을 이용하였는데, 이는 특이적 결합의 척도로서 생각될 수 있다.

다음에 관심 영역(ROI)에서의 수용체 점유(RO)를 다음과 같이 직접적으로 계산할 수 있다: RO = 100×(1- BPND(투약-후)/BPND(기준선))

등쪽 경막 및 담창구는 가장 높은 특이적 신호를 갖는 두 개의 ROI였고, 따라서 이들 ROI에 대하여 RO를 계산하였다.

통계학적 방법론

다음의 분석 세트가 사용되었다:

처치된-모든-대상 세트(ASTS) - 화합물 504 및 이에 따라 [11C]-SCH442416을 투여한 모든 대상

약물학적 세트(PDS) - 적어도 하나의 유효한 IMP-후 PET 스캔 및 상응하는 유효 평가 CPET를 갖는 모든 대상

화합물 504의 약물동력학적 파라미터는 비-구획 분석을 사용하여 추정하였다.

결합 포텐셜 및 추정 RO를 수록하고 CPET에 대하여 그래프로 제시하였다.

화합물 504의 혈장 농도와 추정 A_2A 수용체 점유 사이의 시간 경과에 따른 관계를 E_max 모델 적용에 의해 회귀 분석하고 조사하였다.

결과

도 3은 E_max를 사용하여 추정된 PET 스캔 시기에 화합물 504 혈장 농도에 대한 경막에서의 수용체 점유를 보여준다.

화합물 504는 1 내지 2 시간의 t_max로 신속하게 흡수되었는데, 이는 첫 번째 투약-후 PET 스캔(PET2)의 시기와 일치하였다. 추정된 E_max 및 EC₅₀ 값은 경막에서 88% 및 31.0 ng/mL, 그리고 담창구에서 101% 및 68.9 ng/mL였다. E_max 모델은 일반적으로 경막 데이터에 양호하게 맞추어지는 것으로 보였으며, 가변성은 담창구 데이터에서 더 높았고; 두 세트의 분석에서 나머지 플롯은 모델이 무효하다는 가정을 시사하는 어떠한 증거도 보이지 않았다.

이들 데이터로부터 3 mg 이하의 용량은 80%의 점유에 도달하는 데 충분하다는 것이 명백하다.

실시예 5

본 연구의 목적은 주의 시험, 5-선택 일련 반응 시간 과제(5-choice serial reaction time task)(5-CSRTT; Robbins, Psychopharmacology (Berl) (2002) 163(3-4):362-80.)에서 롱 에반스(Long Evans) 래트의 수행에서의 화합물 504를 조사하는 것이다.

본 연구는 3 단계로 구성되었다.

(1) 선택적 A_2A 수용체 효능제 CGS21680(Higgins et al Behav Brain Res (2007); 185 (1): 32-42)에 의해 유도된 운동 저하에 대한 화합물 504의 조사. 이 시험은 중추성 매개의 A_2A 수용체 매개 반응을 기능적으로 차단하기 위해 필요한 화합물 504의 용량을 확립하기 위한 약물학적 분석으로서 작용한다. 약물학적으로 관련된 약물의 용량에서 혈장 노출을 결정하기 위해 행동 시험과 동등한 시점에서 화합물 504의 혈장 수준을 또한 측정하였다.

(2) (1)로부터 확립된 용량에 근거하여, 개별 양태의 수행에 대한 약물의 효과를 측정하기 위해 고안된 5-CSRTT의 4 개 변수로 화합물 504를 시험하였다. (A) 표준 조건, 즉 동물이 훈련받는 최종 조건과 동등한 조건 하에서 시험, 즉, 자극 지속(SD) 0.75 초, 시도-간 간격(ITI) 5 초, 100 시도. 이 조건의 목적은 표준 조건 하에서의 수행에 대한 약물 효과를 측정하기 위한 것임. (B) 연장된(긴) ITI 조건 하에서 시험, 즉 낮은 사건 발생률, SD 0.3 초, ITI 5, 7.5, 10 초, 120 시도. 이 조건의 목적은 동물이 반응을 지연시키도록 요구하는 더 낮은 사건 발생률 하에서의 수행에 대한 약물 효과를 측정하기 위한 것임. (C) 짧은 ITI 조건 하에서 시험, 즉 높은 사건 발생률, SD 0.3 초, ITI 3, 4, 5 초, 120 시도. 이 조건의 목적은 동물이 감각 정보를 신속하게 처리하도록 요구하는 높은 사건 발생률 하에서의 수행에 대한 약물 효과를 측정하기 위한 것임. (D) 연장된 시도 조건 하에서 시험, 즉 SD 0.3 초, ITI 5 초, 250 시도. 이 조건의 목적은 지연된 주의 또는 경계를 시험하는 연장된 시도 하에서의 수행에 대한 약물 효과를 측정하기 위한 것임.

(3) 시험 장치에 잘 길들여진 래트에서 기준선 운동 활동에 대한 화합물 504의 조사.

0.01, 0.03, 0.06, 0.1 mg/kg의 용량을 증류수 중 0.5 w/v% 메틸 셀룰로스 400(점도: 400 cP)의 제형으로 시험하였다. 약물은 5 mL/kg의 용량으로 경구 투여되었다.

단계 1:

3 개월령의 육십(60) 마리 수컷 롱 에반스 래트를 군 당 N=10 래트의 6 군으로 할당하였다. 6 군은 아래 표에 수록된다:

화합물 504를 활동 시험 60 분 전에 경구 위관 영양에 의해 투여하였다. CGS21680을 활동 시험 10 분 전에 피하로 투여하였다. 래트의 자발적인 활동을 모니터링하는 활동 시험은 자동화된 Med Associates 활동 시험 챔버에서 20 분 동안 측정하였다. 트래킹 아레나는 치수 17"W x 17"L x 12"H였고, 센서 바는 이동한 거리를 추적하기 위해 마루 1" 위에 고정되었고, 두 번째 센서 바 세트는 수직 이동 및 일어서는 활동을 측정하기 위해 마루 6" 위에 놓였다. 트래킹 소프트웨어에서의 파라미터 세트는 다음과 같다: 해상도- 50 ms, 상자 크기- 4 빔, 휴식 지연- 500 ms, 및 보행 트리거- 2.

1 주일의 세척 시기 이후, 활동 연구에 사용되는 20 마리 래트를 군 당 n=5의 4 개 새로운 군으로 재할당하고, 각각 화합물 504를 활동 연구에서 사용된 용량(0.01, 0.03, 0.06, 및 0.1 mg/kg)으로 처치하였다. 최소 400 μL의 전혈을 복재 출혈을 통해 약물 투여 후 10 분, 20 분, 60 분, 및 120 분에, 즉 활동 연구(및 단계 2: 5-선택 실험)와 일치하는 시점에서 수집하였다. 혈액을 수집하고 K3 EDTA 튜브로 옮겼다. 튜브를 실온에서 대략 2 분 동안 방치하고 원심분리 전까지 습식 얼음에 놓았다. 혈액을 3,500 rpm의 속도로 15 분 동안 4 ℃에서 원심분리기로 회전시켰다. 혈장을 분리하고 표지된 0.75 mL Matrix 튜브에 넣고 마개를 하였다. 혈장 튜브를 Matrix 랙에 놓고 -80℃ 냉동고에 저장하였다. 심장 천공에 의한 혈액 수집 후 최종 시점(약물 투여 120 분 후)에, 뇌 조직을 추출하고 정중선을 따라 반으로 절개하였다. 다른 부분을 처리하는 동안, 한쪽 반구를 소뇌 없이 15 mL의 미리 칭량된 뇌 튜브에 넣었다. 뇌 튜브를 칭량하고 드라이아이스에서 동결하고 -80℃에서 저장하였다. 뇌 조직 및 혈장 샘플을 드라이아이스 위에서 스폰서(Sponsor)로 수송하였다. 화합물 504의 혈액 및 뇌 수준을 스폰서에 의해 수행하였다.

단계 2:

십육(16) 마리의 실험 경험이 없는(experimentally naive) 수컷 롱 에반스 래트를 대략 2 내지 3 개월의 시기에 걸쳐 5-CSRTT에서의 점근성 수행(asymptotic performance)에 대하여 훈련하였다. 래트를 0.75 초의 최종 자극 지속(SD), 5 초 시도-간 간격(ITI), 5 초 리미티드 홀드(LH), 시기 당 100 시도로 훈련하였다. 이들 조건 하의 표적 수행 수준은 >80% 정확도 및 <20% 누락 범위에 있었다. 화합물 504의 약물 시험은 일단 수행이 안정적이면 개시되었다.

동물군이 훈련되면, 다양한 실험 과제(아래 표 2 참조)에 따른 다중 약물 연구를 동일한 래트 집단에서 시험하였다. 화합물 504의 용량은 단계 1로부터의 결과에 근거하여 확립되었다. 본 연구 디자인은 4 실험으로, 각 실험은 2 내지 3 주 기간이고 각 실험 사이에 1 주 중개 기간으로 구성되었다.

단계 3:

십육(16) 마리의 수컷 롱 에반스 래트를 Med Associates 시험 활동 챔버(17" W x 17" L x 12" H)에서 3 회의 90-분 시기에 걸쳐 길들였다. 화합물 504 및 암페타민(1 mg/kg)의 효과를 각 처치 주기 사이에 2 내지 3 일의 세척 기간을 갖는 반복된 측정 디자인을 사용하여 90 분 시기에 걸쳐 운동 행동에 대하여 조사하였다. 전체 시기 동안 총 이동 거리 및 일어선 횟수가 1 차 측정이었다. 4 용량(0.01, 0.03, 0.06, 및 0.1 mg/kg)의 화합물 504, 단일 용량(1 mg/kg)의 암페타민, 그리고 비히클 대조를 시험하였다.

결과

A_2A 수용체 효능제 CGS21680.

CGS21680(예를 들어, Merck Millipore Corporation으로부터 입수 가능)(1 mg/kg SC) 전처치는 비히글 전처치된 래트에서 강력한 운동저하를 야기하였다. 총 이동 거리로서 정의된 운동 활동 및 일어서기는 둘 다 20 분 시험 기간에 걸쳐 측정되었는데 비히클 처치된 대조와 비교하여 각각 92% 및 99% 만큼 감소하였다. CGS21680 전 50 분에 경구 투여된 화합물 504(0.01 내지 0.1 mg/kg)는 대략(계산되지 않은) 0.06 mg/kg의 ED50으로 CGS-운동저하의 용량-관련 길항을 야기하였다. 0.1 mg/kg의 더 높은 용량에서, 화합물 504는 CGS-유도된 운동저하를 완전히 역전시켰다. 화합물 504의 유사한 효과는 일어서기 및 보행 에피소드의 측정에서 주목되었다. 공식적 분석은 이동 거리(F5,56 = 33.9, P<0.01), 일어서기(F5,56 =35.1, P<0.01) 및 보행 에피소드(F5,56 = 37.7, P<0.01)에서의 처치의 주요 효과를 밝혔다. 각각의 경우, 화합물 504는 CGS-운동저하를 0.06 및 0.1 mg/kg 용량에서, 비히클 기준선에서 0.1 mg/kg 용량으로 유의미하게 역전시켰다.

비록 화합물 504 전처치된 동물로부터의 생체분석 측정은 IVS에 의해 수행되지 않았지만, 이들 데이터는 행동 측정과의 비교를 위해 본 보고서에 포함된다. 화합물 504는 용량 범위 0.01 내지 0.1 mg/kg에 걸쳐 규칙적인 용량-혈장 노출 관계를 보여주었다. CGS-운동저하의 역전과 혈장[약물] 사이의 거의 선형적인 관계는 시험 시기에 상응하는 60 분 및 90 분 샘플 채취 시기 둘 다에서 명백하였다. 혈장 수준의 범위 150-400 ng/mL는 이들 시점에서 약물학적으로 활성인 용량 범위 0.03 내지 0.1 mg/kg 화합물 504에 걸쳐 얻어졌다.

단계 2: 5-선택 일련 반응 시간 과제에 의해 측정된 주의 수행에 대한 화합물 504의 효과.

대략 10 주의 시기에 걸쳐, 16 마리 수컷 롱 에반스 래트를 5-CSRTT에 대하여 훈련시켰다. 이 군에서 15 마리가 0.75 초 SD, 5 초 ITI, 100 시도, 5 초 LH의 최종 기준선 조건 하에서 >80% 올바른 반응 및 <20% 실패한 시도의 수행 기준에 신뢰성 있게 부합하였다. 따라서 연구의 대부분에서 샘플 크기는 15로 모든 래트가 맞균형 순서로 각각의 처치를 받았다.

표준 조건: 화합물 504(0.01 내지 1 mg/kg 경구)를 첫째로 표준 기준선 조건 하에서 5-CSRTT 수행에 대하여 평가하였다. 총 15 마리 래트를 이 연구 집단에 사용하였다. 처치의 주요 효과는 올바른 잠복기(F4,56 = 3.26, P=0.02) 및 조기 반응(F4,56 = 3.53, P=0.01)에서 주목되었다. 화합물 504는, 비록 0.1 mg/kg 용량에서만 유의성에 도달하였지만, 용량 0.03-0.1 mg/kg에서 유의미하게 반응의 속도를 증가시켰고(즉, 올바른 잠복기를 감소), 조기 반응을 증가시켰다. % 올바른, # 올바른/틀린 반응, 누락, 매거진 잠복기와 같은 다른 모든 측정은 시험된 용량에서 화합물 504에 의해 영향을 받지 않았다.

긴 ITI: 다음에, 화합물 504(0.03 내지 0.06 mg/kg 경구)를 긴 ITI의 조건 하에서 시험하였다. 집단 크기는 15였다. ITI 연장은, 비록 % 올바름, 그리고 올바른 잠복기는 영향을 받지 않았지만, 조기 반응(F2,28 = 93.3, P<0.01), 그리고 또한 올바른/틀린 시도 및 누락 횟수(F2,28 > 7.9, P<0.01)에서 유의미한 효과를 가졌다. 화합물 504(0.06 mg/kg)에 의해 증가된 조기 반응(F2,28 = 4.25, P=0.02)을 제외하고는 임의의 측정에서 화합물 504의 주요 효과 또는 Lu x ITI 상호작용은 없었다. 특이적으로 긴 ITI 하에서 정확성을 감소시키는 화합물 504의 비-유의미한 경향은 동일한 용량에서 명백하였다(F2,28 = 2.62, P=0.09).

이 실험으로부터의 데이터를 또한 다중 ITI에 걸쳐 평균화된 처치를 위해 분석하였다. 처치의 유일한 주요 효과는 조기 반응(F2,28 = 4.24, P=0.02)이었다.

짧은 ITI: 화합물 504(0.03 내지 0.06 mg/kg 경구)를 짧은 ITI의 조건 하에서 시험하였다. 집단 크기는 14였다(래트 한 마리는 수행의 불일치로 인해 제거되었다(M3)). ITI 감소는 조기 반응, # 올바른/틀린 시도, 누락(F2,26 > 3.42, P<0.05)에서 현저한 효과를 가졌으며, ITI 감소는 과제 난이도를 증가시켰다. 올바름 백분율은 ITI에 의해 영향을 받았다(F2,26 = 3.61, P=0.04). % 올바름, 틀린 반응, 누락, 조기 반응에 대한 처치의 주요 효과가 주목되었으며(F2,26 > 4.91, P<0.01), 이는 화합물 504가, 특히 짧은(3 초) ITI에서, 선택 정확성 측면에서 이 조건 하에 수행을 개선하는 것을 반영하였다.

이 실험으로부터의 데이터를 또한 다중 ITI에 걸쳐 평균화된 처치를 위해 분석하였다. 처치의 주요 효과는 % 올바름, # 틀린 반응, 누락, 조기 반응(F2,26 > 4.75, P<0.01)의 측정에서 주목되었으며, 화합물 504는 각각의 측정에서 수행을 개선, 즉 % 올바름을 증가시키고, 틀린 반응 및 누락을 감소시켰다. 올바른 잠복기는 경계 유의성(F2,26 = 3.31, P=0.05)으로 화합물 504가 반응 속도를 증가시키는 경향을 반영한다.

확장된 250 시도: 화합물 504(0.03 내지 0.1 mg/kg 경구)를 확장된 250 시도의 조건 하에서 시험하였다. 시기 지속 기간에 걸친 수행 평가의 중요성 때문에, 이들 데이터는 5 블록의 50 시도로 체계화된 시도로 제시된다. 집단 크기는 13으로, 래트 두 마리가 수행의 불일치로 제거되었다.

이들 시기의 과정에 걸쳐, 최초 150 시도(빈 1 내지 3)에서 비히클 전처치된 래트는 대략 80% 올바른 반응의 안정된 수준에서 수행하였으나, 이 정확성은 빈 5에서 52+10% 정확성으로 떨어져서, 4/13 래트가 5 번째 빈 중에 임의의 올바른 시도를 완료하지 못하였다. 올바른 반응은 빈 1 내지 3에서 평균 25 내지 27 반응으로부터 빈 5에서 14.6+3.3 반응으로 저하되었다. 누락, 즉 시작했지만 완료하지 못한 시도 역시 시기에 걸쳐 증가하여, 빈 1에서 8.2+1.4 누락은 빈 5에서 19.1+4.4로 올라갔다. 보상을 받는 데 있어서 이러한 저하는 만족에 기인하지 않음에 주목하는 것이 중요한데, 래트가 250 시도 계획과 동등한 시기에 걸쳐 250 사료 펠릿에 대한 자유로운 접근이 주어진다면 모든 펠릿이 소모될 것이기 때문이다. 오히려, 저하는 과제 지속에 대한 동기 또는 경계의 저하를 반영하는 것 같다.

화합물 504(0.03 내지 0.1 mg/kg 경구)의 전처치는, 빈 4 및 5에 걸쳐 - 특히 0.06 내지 0.1 mg/kg 용량에서, % 올바름 및 올바른 반응의 횟수에서의 감소, 그리고 누락에서의 증가에 대하여 보호하였다. 모든 래트는 화합물 504의 0.1 mg/kg 용량 이후 빈 5에서 적어도 13의 올바른 시도를 완료하였다. 따라서, 유의미한 처치 x 빈 상호작용은 올바른 반응 횟수(F12,144 = 4.58, P < 0.01) 및 누락(F12,96 = 3.27, P <0.01)에서 주목되어, 화합물 504 전처치에 따른 빈 4 및 5에서의 개선된 수행(더 높은 히트 비율)을 반영하였다. 전체 올바른 시도는 또한 비히클 대조와 비교하여 화합물 504(0.1 mg/kg) 전처치된 래트에서 유의미하게 증가하였다. 올바름 백분율은 경계 유의성이었다(처치 x 빈 상호작용: F12,144 = 1.54, P = 0.1).

단계 3: 길들인 래트에서 운동 활동에 대한 화합물 504의 효과: 암페타민과의 비교.

화합물 504(0.01 내지 1 mg/kg 경구)는 90 분 시험 시기에 걸쳐 이동 거리(F5,70 = 21.7, P<0.01) 및 일어선 횟수(F5,70 = 17.9, P<0.01)로서 측정된 운동 활동에서 용량 관련된 증가를 야기하였다. 이 효과의 크기는 0.06 내지 0.1 mg/kg 용량에서 정체 상태를 유지하였다. 화합물 504의 효과 크기는 동일한 연구에 포함된 단일 급성 용량의 암페타민(1 mg/kg IP)의 것보다 유의미하게 적었다.

화합물 504 및 암페타민에 의해 생산된 운동 활동 변화에 대한 시간 경로 역시 평가되었다. 화합물 504 활성은 첫 번째 10 분의 시간 구획 동안 최고조에 달했고 90 분 시기에 걸쳐 점차 저하되었다. 효과의 시간 패턴은 화합물 504의 모든 용량에서 유사하였다.

화합물 504는 혈장 농도 범위 100 내지 450 ng/mL에 상응하는 0.01 내지 0.1 mg/kg의 용량 범위에서 CGS21680-유도된 운동저하의 강력한 생체내 역전을 이끌어낼 수 있는 강력한, 경구적으로 활성인 A_2A 수용체 길항제임을 보여주었다. 이러한 동일 용량(및 유사한 노출) 범위에 걸쳐, 화합물 504는 또한, A_2A 수용체의 길항과 일치하는, 5-CSRTT에서 측정된 래트의 주의 수행의 양태를 개선하였다. 구체적으로, sITI 프로토콜, 즉 높은 사건 비율 하에서 증가된 정확성 및 올바른 반응 횟수, 그리고 또한 확장된 시도에서 수행의 개선으로, 지속적인 주의/경계의 개선을 시사한다. 이와 같이, 이들 효과는 ADHD의 치료에서 화합물 504의 가능성을 지지한다.

Claims (15)

1. 2 내지 3 mg 사이의 투여량으로 의약으로서 사용하기 위한, 다음 구조식의 화합물 또는 이의 약제학적 염.
   [화합물 504]
   

   
2. 제1항에 있어서, 사용은 1 일 1 회 투여량인 것인 화합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사용은 2 mg 또는 3 mg인 것인 화합물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사용은 파킨슨병을 치료하기 위한 것인 화합물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사용은 ADHD를 치료하기 위한 것인 화합물.
6. ADHD를 치료하는 데 사용하기 위한, 다음 구조식의 화합물 또는 이의 약제학적 염.
   [화합물 504]
   

   
7. 제6항에 있어서, 상기 화합물은 2 내지 3 mg 사이의 투여량으로 사용되는 것인 화합물.
8. 제7항에 있어서, 상기 화합물은 2 mg 또는 3 mg의 투여량으로 사용되는 것인 화합물.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 화합물은 1 일 1 회 투여량으로 사용되는 것인 화합물.
10. 파킨슨병 또는 ADHD 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 다음 구조식의 화합물 또는 이의 약제학적 염을 포함하는 정제 또는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 치료는 2 내지 3 mg 사이의 화합물 504를 투여하는 것을 포함하는 것인 정제 또는 약제학적 조성물.
    [화합물 504]
    

    
11. 제10항에 있어서, 화합물은 2 mg 또는 3 mg의 투여량으로 사용되는 것인 정제 또는 약제학적 조성물.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 화합물은 1 일 1 회 사용되는 것인 정제 또는 약제학적 조성물.
13. 제10항에 있어서, 정제 또는 약제학적 조성물은 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 정제 또는 약제학적 조성물.
14. 2 내지 3 mg 사이의 다음 구조식의 화합물 또는 이의 약제학적 염의 투여를 포함하는, 파킨슨병 또는 ADHD 환자의 치료 방법.
    [화합물 504]
    

    
15. 제14항에 있어서, 2 mg 또는 3 mg의 상기 화합물이 매일 투여되는 방법.

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