KR20170060700A - 고리-매개 등온증폭법을 이용한 노제마병 신속 검출 방법 - Google Patents

고리-매개 등온증폭법을 이용한 노제마병 신속 검출 방법 Download PDF

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Abstract

양봉현장에서 실제로 사용 가능하고, 노제마병의 정확한 진단을 위한 노제마 아피스(Nosema apis)와 노제마 세라나에(Nosema ceranae)를 각각 검출할 수 있는 특이 LAMP법으로서, 고리-매개 등온증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplification; LAMP)을 사용하여 노제마병을 탐지할 수 있는 방법이 개시된다. 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 또는 서열번호 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 노제마병(Nosema disease)을 검출하는 방법을 제공한다.

Description

고리-매개 등온증폭법을 이용한 노제마병 신속 검출 방법{METHOD FOR THE RAPID DETECTION OF NOSEMA DISEASE BY LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION}
본 발명은 꿀벌의 질병 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고리-매개 등온 증폭법을 이용한 노제마병 신속 검출 방법에 관한 것이다.
노제마병은 미포자충류(Microsporidia)에 속하는 병원균(Nosema apis 및 Nosema ceranae)이 성봉의 소화기 및 부속기관에 감염, 기생함으로써 발병하는 내부기생충성 전염병이다. 노제마 아피스(Nosema apis)는 1907년 Enock Zander에 의해 아피스 멜리페라(Apis mellifera)에서의 감염이 처음 보고 되었고, 아피스 멜리페라(Apis mellifera)에서 백여년 전 부터 노제마병을 일으킨다고 알려져 있다(Mariano et al., 2007). 반면에 노제마 세라나에(Nosema ceranae)는 1994년 Ingemar Fries에 의해 아시아 꿀벌종인 아피스 세라나에(Apis ceranae)에서 처음 진단되었다(Fries et al., 1996). 노제마병은 일벌의 활동둔화, 수명단축(Wang and Moeller, 1970), 꿀의 생산성 감소를 일으키고(Anderson and Giacon, 1992), 여왕벌이 감염되면 산란력이 감소되고(Webster et al., 2004) 심한 경우 산란을 중단하고 사망하게 된다.
노제마(Nosema)는 봉군내에서 일벌의 먹이교환에 의해 전염된다(Michael L.Smith, 2012). 노제마병은 아프리카와 중동을 제외한 모든 지역에서 발생되었으며, 우리나라에서는 60년대 후반 처음 발생되어 전국으로 확산되었다. 봄철 감염률이 가장 높고 여름철에 감염률이 현저하게 저하되는 것으로 나타났으며, 봉군이 약세일 때 크게 발병하는 것으로 알려져 있다.
국립수의과학검역원에서 2013년도에 발표한 국내 꿀벌 질병 현황에 따르면, 노제마병은 36.49%로 가장 높게 나타났다. 노제마병과 꿀벌봉군 감소의 연관성에 대한 연구결과가 최근 보고(Higes M et al., 2006, 2007)됨에 따라 노제마병의 진단이 매우 중요해졌다.
현재까지 개발된 노제마 진단법으로는 PCR(Lim et al., 2014, Byeon et al., 2014), 실시간(Real-time) PCR(Yoo et al., 2011), 고리-매개 등온증폭법(LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification) method)(Lee et al., 2010) 등이 있으나, 이 방법들은 실험실적인 방법들로 시료 채취 후 실험실에서 검사하기까지 오랜 시간이 걸려 시료의 손상을 막기 어려울 뿐만 아니라 핵산 증폭기(thermal cycler)와 같은 고가의 장비 사용으로 현장적용이 어려웠다. 뿐만 아니라 이 방법들은 노제마 아피스(Nosema apis)와 노제마 세라나에(Nosema ceranae)를 구별할 수 없었다.
2000년도에 개발된 LAMP법은 등온조건에서 빠르게 핵산을 증폭시킬 수 있는 새로운 방법으로 높은 특이성과 민감도를 갖고 있다(Notomi et al., 2000). LAMP법은 3가지 주된 특징을 갖고 있다. 첫 번째로 모든 반응이 등온조건에서 일어난다. PCR과 실시간(Real-time) PCR과 비교했을 때 고가의 장비인 핵산 증폭기 없이 간단한 항온기 만으로 실험이 가능하다(Notomi et al., 2000). 두 번째로 증폭 효율이 높다(Yamazaki et al., 2008). 세 번째는 반응이 높은 특이성을 갖고 있다는 것이다(Yamazaki et al., 2009).
한편, 2013년도에 개발된 GenecheckerTM 기기(Genesystem)는 고도의 형광 감지기술을 채택하고 있어 장비 위의 창을 통한 반응결과의 실시간 확인이 가능하다. 또한 크기가 작고 휴대성이 좋으며, 구동전원으로 직류 12V 전압을 채택함으로써 배터리나 차량 전원에 연결이 가능하여 현장 분석에 용이하다.
이에 본 발명은 LAMP법의 장점과 GenecheckerTM 기기의 장점을 결합하여 양봉현장에서 실제로 사용 가능하고, 노제마병의 정확한 진단을 위한 노제마 아피스(Nosema apis)와 노제마 세라나에(Nosema ceranae)를 각각 검출할 수 있는 특이 LAMP법으로서, 고리-매개 등온증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplification; LAMP)을 사용하여 노제마병을 탐지할 수 있는 방법을 제시하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 또는 서열번호 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 노제마병(Nosema disease)을 검출하는 방법을 제공한다.
또한 상기 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트는 노제마 아피스(Nosema apis) 병원균 검출을 위해 사용되고, 상기 서열번호 5 내지 8의 프라이머 세트는 노제마 세라나에(Nosema ceranae) 병원균 검출을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 등온증폭반응은 40~57℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 등온증폭반응은 내부 프라이머 농도 20~100pmole 및 외부 프라이머 농도 5~20pmole에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 등온증폭반응은 dNTP 농도 2.5~15mM에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 등온증폭반응은 Bst DNA 중합효소(polymerase) 농도 4~20U에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 프라이머 조성물은 서열번호 9 내지 10의 프라이머 세트 및 서열번호 11 내지 12의 프라이머 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
이러한 본 발명에 따르면, 기존 PCR이나 실시간 PCR 반응을 수행하여 꿀벌의 질병을 검출하는 방법보다 신속하고 감도가 좋은 고리-매개 등온증폭법을 이용하여, 등온이라는 장점으로 현장에 적용 가능할 뿐만 아니라, 꿀벌의 바이러스 감염 여부도 쉽게 모니터링하여 판단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 4에서 Nosema apis 유전자의 주형가닥 염기서열을 나타낸 도면,
도 2는 본 발명의 실시예 5에서 N. apis-LAMP 결과를 나타낸 온도구배 전기영동 사진,
도 3 내지 도 5는 본 발명의 실시예 6에서 각각 프라이머 농도, dNTP 농도 및 Bst DNA 중합효소 농도 변화에 따른 N. apis-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진,
도 6 및 도 7은 본 발명의 실시예 7에서 각각 N. apis-specific LAMP 및 N. ceranae-specific LAMP에서 고리 프라이머의 위치를 설명하는 유전자의 염기서열을 나타낸 도면,
도 8은 본 발명의 실시예 7에서 고리 프라이머를 이용한 N. apis-specific LAMP(A) 및 N. ceranae-specific LAMP(B) 결과를 나타낸 전기영동 사진,
도 9 및 도 10은 본 발명의 실시예 8에서 각각 실시간 형광측정법을 이용한 DNA 카피(copy) 수에 따른 N. apis-specific LAMP 및 N. ceranae-specific LAMP 측정 결과를 나타낸 형광 사진 및 전기영동 사진,
도 11은 본 발명의 실시예 9에서 GenecheckerTM 기기를 사용한 N. apis-specific LAMP(A)와 N. ceranae-specific LAMP(B) 결과를 나타낸 형광 사진 및 전기영동 사진.
도 12는 본 발명의 실시예 10에서 GenecheckerTM 기기를 사용한 N. apis-specific LAMP(A)와 N. ceranae-specific LAMP(B)의 검출한계 테스트 결과를 나타낸 형광 사진 및 전기영동 사진,
도 13은 본 발명의 실시예 11에서 프라이머 특이성 확인을 위해 N. apis-specific LAMP(A)와 N. ceranae-specific LAMP(B)를 수행한 결과를 나타낸 형광 사진 및 전기영동 사진,
도 14는 본 발명의 실시예 12에서 형광 염색 시험(Fluorescent Dye test)을 이용한 증폭여부 확인 결과를 나타낸 사진.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 또는 서열번호 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행할 경우 신속, 정확하게 노제마 아피스(Nosema apis) 병원균과 노제마 세라나에(Nosema ceranae) 병원균을 특이적으로 검출할 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 또는 서열번호 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 노제마병(Nosema disease)을 검출하는 방법을 개시한다. 이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예 1: 시료 준비
본 실시예에서 사용된 모든 꿀벌 시료는 질병의 진단을 위하여 국내 양봉가로부터 한국꿀벌질병연구소로 위탁된 것으로 성충 및 유충 시료를 사용하였다.
실시예 2: 유전체(Genomic) DNA 분리
MagNa Lyser(Roche, Switzerland)를 사용하여 꿀벌 성충 및 유충 시료를 분쇄 시킨 후, DNA 추출 키트(AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit, Bioneer Inc, Korea)를 사용하여 유전체 DNA를 추출하였으며, 실험은 제작자의 지시에 따라 진행되었다. 추출된 유전체 DNA에 대하여 OD 260nm에서 농도를 측정한 뒤 LAMP 반응에 사용하였고, 잔여 유전체 DNA는 초저온 냉동고(-70℃)에 보관시켰다.
실시예 3: 주형 DNA 준비
본 실시예에서는 노제마 아피스(Nosema apis) 서열(sequence)(GenBank No. U97150)의 99%의 상동성을 보이는 서열(sequence), T 벡터(pBlueXcm T vector)를 포함하는 클론(pBX-Nosema apis clone)(임 등, 2014)과, 노제마 세라나에(Nosema ceranae) 서열(sequence)(Genbank No. DQ486027)의 99%의 상동성을 보이는 서열(sequence), T 벡터(pBlueXcm T vector)를 포함하는 클론(pBX-Nosema clone)(유 등, 2008)을 사용하였다. 각각의 클론(clone)은 최적조건 확인, 민감도 확인 등의 실험에 주형으로 사용되었다.
실시예 4: 프라이머 설계 및 제작
노제마 아피스-특이 LAMP(N. apis-specific LAMP)에 사용된 프라미어(primer)는 리보솜 RNA 유전자(Nosema apis small subunit ribosomal RNA gene)(GenBank no.U97150.1)(도 1 참조)를 기반으로 제작되었으며 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
표 1 및 도 1을 참조하면, 정방향 내부 프라이머(Forward inner primer)인 N. apis-FIP는 N. apis 안티-센스 서열(anti-sense sequence)의 상보적인 염기서열(F2)과 TTTT 연결자(linker) 및 고리(loop)를 형성하는 염기서열(F1c) 부분을 합한 것으로 45개 뉴클레오티드(45nt)의 긴 뉴클레오티드(long-nucleotide)로 제작되었다. 역방향 내부 프라이머(Reverse inner primer)인 N. apis-BIP는 N. apis 센스 서열(sense sequence)의 상보적인 염기서열(B2)과 TTTT 연결자(linker) 및 고리(loop)를 형성하는 염기서열(B1c) 부분을 합한 것으로 47개 뉴클레오티드(47nt)의 긴 뉴클레오티드(long-nucleotide)로 제작되었다. 또한 외부 프라이머(Outer primer)인 N. apis-F3와 N. apis-B3는 내부 프라이머(inner primer)들의 바깥쪽에 위치하도록 설계되었으며 각각 21개 뉴클레오티드(21nt) 및 25개 뉴클레오티드(25nt)의 크기로 제작되었고, 이 프라이머들은 Bionics사(Korea)에 의뢰하여 제작되었다.
한편 노제마 세라나에-특이 LAMP(N. ceranae-specific LAMP)에 사용된 프라이머(primer)는 이 등(2010)에 의해 개발된 것으로 45개 뉴클레오티드(45nt)의 정방향 내부 프라이머(Forward inner primer), 48개 뉴클레오티드(48nt)의 역방향 내부 프라이머(Reverse inner primer), 각각 25개 뉴클레오티드(25nt), 19개 뉴클레오티드(19nt)의 외부 프라이머(Outer primer)로 제작되었다.
실시예 5: LAMP법의 최적 반응 온도 측정
N. apis-LAMP의 특이적 검출을 위하여 반응 최적온도를 확인하고자 하였다. 반응액은 주형인 노제마 아피스 클론(pBX-Nosema apis clone)(임 등, 2014) 1ng과 80pmole의 내부 프라이머, 20pmole의 외부 프라이머, 8U Bst DNA 중합효소(polymerse)(NEB, USA), 10×완충액(Reaction Buffer)(ThermoPol Reaction Buffer, 20mM Tris-HCl, 10mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, NEB, USA), 10mM의 dNTP, DMSO(최종농도 5%), D.W로 총 25㎕의 반응액을 조성하였다. 1시간 동안 DNA 변형 합성을 진행하였고, 85℃에서 10분간 반응시킨 후 종료하였다. DNA 신장의 최적 온도 측정은 40.0~57.0℃ 구간에서 1시간 동안 등온조건하에서 수행되었으며, 각 LAMP 반응이 끝난 후 전기영동으로 확인하여 N. apis-specific LAMP에 대한 최적온도를 측정하였다.
N. ceranae-LAMP의 최적 온도는 이 등(2010)에 의해 개발된 방법에 따랐다.
도 2는 N. apis-LAMP 결과를 나타낸 온도구배 전기영동 사진이다. 도 2에서 레인 1 내지 6은 각각 41.5℃, 44.7℃, 47.2℃, 50.0℃, 54.3℃, 57.0℃에서 진행한 LAMP 결과이고, 레인 M은 100bp 래더 마커(ladder marker)(Bioneer), 레인 N은 LAMP-PCR의 음성 대조군(주형이 없는) 결과를 나타내고 있다.
도 2 참조하면, 41.5~54.3℃의 범위에서 N. apis-specific DNA가 신장되는 것을 확인하였으며, N. apis-specific LAMP의 최적 등온 온도는 N. ceranae와의 동시 진단을 위하여 54.0℃로 측정되었으며, 이후의 실험은 최적 온도인 54.0℃에서 수행되었다.
한편, N. ceranae-specific LAMP의 경우 이 등(2010)이 제시한 54.0℃를 최적 등온 온도로 사용하였다.
실시예 6: LAMP법의 최적 반응액 조성
N. apis-LAMP의 최적 반응조건을 확립하기 위하여 여러 가지 조성 성분에 대한 최적 조건을 확인하였다. 프라이머의 농도는 Notomi 등(2000)이 제시한 외부 프라이머와 내부 프라이머의 농도가 1:4일 때 가장 높은 효율을 보였다는 결과를 바탕으로 이 비율을 유지하되 프라이머의 절대농도만을 변화시켜 그 결과를 측정하였다. 즉, 외부 프라이머의 각 농도를 5pmole, 10pmole, 15pmole, 20pmole, 25pmole로 하여 LAMP를 수행하였으며, 이때 내부 프라이머의 각 농도를 20pmole, 40pmole, 60pmole, 80pmole, 100pmole로 맞추었다.
또한 dNTP의 농도는 각각 2.5mM, 5.0mM, 7.5mM, 10.0mM, 12.5mM, 15.0mM로 조성하여 측정하였고, Bst DNA 중합효소(polymerase)의 경우에는 각각 4U, 8U, 12U, 16U, 20U을 첨가하여 조성함으로써 최적 반응조건을 확인하였다.
N. apis-LAMP의 최적 반응액 조성은 이 등(2010)에 의해 개발된 방법에 따랐다.
도 3 내지 도 5는 각각 상기 프라이머 농도, dNTP 농도 및 Bst DNA 중합효소 농도 변화에 따른 N. apis-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 도 3에서 레인 M은 1kb 래더 마커(Bioneer), 레인 N은 음성 대조군(negative control), 레인 1 내지 5는 각각 내부 프라이머 농도/외부 프라이머 농도가 20pmole/5pmole, 40pmole/10pmole, 60pmole/15pmole, 80pmole/20pmole, 100pmole/25pmole일 때의 결과를 나타내고 있다. 또한 도 4에서 레인 M은 1kb 래더 마커(Bioneer), 레인 N은 음성 대조군, 레인 1 내지 6은 각각 dNTP 농도가 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM, 12.5mM, 15mM일 때의 결과를 나타내고 있다. 또한 도 5에서 레인 M은 1kb 래더 마커(Bioneer), 레인 N은 음성 대조군, 레인 1 내지 5는 각각 Bst DNA 중합효소 농도가 4U, 8U, 12U, 16U, 20U일 때의 결과를 나타내고 있다.
도 3을 참조하면, 내부 프라이머 농도 80pmole 및 외부 프라이머 농도 20pmole일 때 가장 많은 LAMP 생성물이 형성되었으며, 반복실험을 통하여 최적 프라이머의 농도를 내부 프라이머 80pmole 및 외부 프라이머 20pmole로 결정하였다.
또한 도 4를 참조하면, dNTP의 경우 dNTP의 양이 7.5~10mM일 때, 로딩 웰(loading well)까지 DNA의 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 반복실험을 통해 연속적 합성과정이 중단되지 않는 반응조건을 고려하여 N. apis-specific LAMP에서 dNTP의 최적 농도를 10mM로 결정하였다.
또한 도 5를 참조하면, Bst DNA polymerase의 경우, 4~16U을 첨가한 경우에는 로딩 웰까지 DNA가 신장되었으나 20U 이상에서는 로딩 웰까지 DNA가 신장되지 않았다. 8U을 첨가하였을 때 다양한 크기와 많은 생성물이 확인되어 Bst DNA 중합효소의 최적농도를 8U으로 결정하였다.
따라서 N. apis-specific LAMP를 위한 최적 반응액 조성은 총 25㎕를 기준으로, 각각 80pmole의 내부 프라이머, 각각 20pmole의 외부 프라이머, 10mM dNTP, 10×완충액(Reaction buffer), 8U Bst DNA 중합효소(NEB, U.S.A)로 결정하였으며, 54℃의 등온조건에서 60분간 수행하는 것을 N. apis-specific LAMP의 표준조건으로 결정하였다.
실시예 7: 고리 프라이머(Loop primer)의 추가
Notomi 등이(2002) 제시한 고리 프라이머(Loop primer) 쌍의 추가가 LAMP 반응시간을 최대 반으로 줄였다는 결과를 바탕으로 N. apis와 N. ceranae의 특이 LAMP법을 위한 고리 프라이머 쌍을 제작하였다. N. apis-specific LAMP법을 위한 고리 프라이머 쌍은 노제마 아피스 리보솜 RNA 유전자(Nosema apis large subunit ribosomal RNA gene, GenBank no.U97150.1)를 기반으로 제작되었으며(도 6 참조), 정방향 고리 프라이머(Forward Loop primer)인 N. apis Loop F의 경우 N. apis 센스 서열(sense sequence)의 상보적인 염기서열 F2C와 F1C사이에 위치하도록 설계하였으며, 역방향 고리 프라이머(Reverse Loop primer)인 N. apis Loop B의 경우 N. apis 안티-센스 서열(anti-sense sequence)의 상보적인 염기서열 B1C와 B2C사이에 위치하도록 설계하였다.
또한 N. ceranae-specific LAMP법을 위한 고리 프라이머(Loop primer) 쌍은 노제마 세라나에 리보솜 RNA 유전자(Nosema ceranae small subunit ribosomal RNA gene, GenBank no.DQ486027)를 기반으로 제작되었으며(도 7 참조), 정방향 고리 프라이머(Forward Loop primer)인 Nosema Loop F의 경우 N. ceranae 센스 서열(sense sequence)의 상보적인 염기서열 F2C와 F1C사이에 위치하도록 설계하였으며, 역방향 고리 프라이머(Reverse Loop primer)인 Nosema Loop B의 경우 N. ceranae 안티-센스 서열(anti-sense sequence)의 상보적인 염기서열 B1C와 B2C사이에 위치하도록 설계하였다.
이상의 LAMP법을 위한 고리 프라이머 쌍을 하기 표 2에 나타내었다.
Figure pat00002
도 8은 각각 고리 프라이머를 이용한 N. apis-specific LAMP(A) 및 N. ceranae-specific LAMP(B) 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 도 8(A)에서 레인 1 및 2는 각각 고리 프라이머를 사용한 LAMP 반응 및 사용하지 않은 LAMP 반응에 대한 결과이다. 또한 도 8(B)에서 레인 M은 100bp 래더 마커(Bioneer), 레인 1 및 2는 각각 고리 프라이머를 사용한 LAMP 반응 및 사용하지 않은 LAMP 반응에 대한 결과이다.
도 8을 참조하면, 고리 프라이머의 추가 결과, 같은 시간동안 반응시켰을 때 고리 프라이머가 추가된 레인이 고리 프라이머를 넣지 않은 레인보다 로딩 웰까지 DNA 신장이 일어난 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 실시간 형광측정법을 이용한 DNA 카피(copy) 수에 따른 LAMP 반응 시간 측정
N. apis에 대한 N. apis-specific LAMP의 DNA 카피 수에 따른 반응 시간과 N. ceranae에 대한 N. ceranae-specific LAMP의 DNA 카피 수에 따른 반응 시간을 확인하기 위하여 노제마 아피스 클론(pBX-Nosema apis clone)(임 등, 2014)과 노제마 클론(pBX-Nosema clone)(유 등, 2008)을 각각 1/10씩 단계별로 희석한 후, 이를 주형으로 사용하여 실시간(Real-time) LAMP를 수행하였다. 1주기(cycle)를 1분으로 설정한 뒤 70분 동안 DNA 변형 합성을 진행하였고, 85℃에서 10분간 반응시킨 후 종료하였다. LAMP 반응이 끝난 후 전기영동으로 확인하여 결과를 재확인하였다.
도 9 및 도 10은 각각 실시간 형광측정법을 이용한 DNA 카피(copy) 수에 따른 N. apis-specific LAMP 및 N. ceranae-specific LAMP 측정 결과를 나타내고 있다. 도 9 및 도 10에서 A는 형광 측정 결과, B는 전기영동 사진 및 C는 표준곡선(standard curve)를 나타낸다.
도 9 및 도 10을 참조하면, N. apis-specific LAMP 및 N. ceranae-specific LAMP 반응시간 측정결과, 각각 35분 이내에 104 카피 및 30분 이내에 105 카피까지 검출 가능함을 확인할 수 있었고, 이는 전기영동으로도 다시 한 번 확인할 수 있었다.
실시예 9: Genechecker TM 기기를 사용한 LAMP 반응 확인
GenecheckerTM 기기를 사용하여 N. apis-specific LAMP와 N. ceranae-specific LAMP의 반응여부를 확인하고자 하였다. GenecheckerTM 기기에 사용되는 칩(Rapi-chip)에 사용할 수 있는 최대 부피(volume)가 10㎕이므로 확립된 최적조건을 10㎕에 맞게 조정하여 LAMP를 수행하였다.
도 11은 GenecheckerTM 기기를 사용한 N. apis-specific LAMP(A)와 N. ceranae-specific LAMP(B) 결과를 나타낸 형광 사진 및 전기영동 사진이다. 도 11에서 레인 N은 주형을 사용하지 않은 음성 대조군, 레인 P는 각각 pBX-Nosema apis 플라스미드(1ng) 및 pBX-Nosema 플라스미드(1ng)를 사용한 결과이다.
도 11을 참조하면, 반응결과 주형을 넣지 않은 레인에서는 형광이 나타나지 않았고, 주형을 넣은 레인에서는 형광이 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 이는 전기영동 결과와 같음을 확인하였다.
실시예 10: N. apis -LAMP와 N. ceranae -LAMP에서 프라이머의 검출한계
Nosema apis의 검출에 있어 N. apis-specific LAMP의 검출한계를 측정하기 위하여 pBX-Nosema apis 플라스미드의 카피 수를 1×108 카피부터 1/10씩 단계희석한 후, 각각의 희석액 1㎕를 주형으로 하여 확립된 최적 조건에서 LAMP를 수행하였고, Nosema ceranae의 검출에 있어 N. ceranae-specific LAMP의 검출한계를 측정하기 위하여 pBX-Nosema 플라스미드의 카피 수를 1×108 카피부터 1/10씩 단계희석한 후, 각각의 희석액 1㎕를 주형으로 하여 확립된 최적 조건에서 LAMP를 수행하였다.
도 12는 GenecheckerTM 기기를 사용한 N. apis-specific LAMP(A)와 N. ceranae-specific LAMP(B)의 검출한계 테스트 결과를 나타낸 형광 사진 및 전기영동 사진이다. 도 12에서 레인 M은 100bp 래더 마커(Bioneer), 레인 1 내지 7은 각각 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102 카피를 이용한 LAMP 결과, 레인 8은 음성 대조군의 결과를 나타내고 있다.
도 12를 참조하면, 검출한계 측정 결과 N. apis-specific LAMP의 경우 102 카피까지 녹색형광을 확인할 수 있었고, N.ceranae-specific LAMP의 경우 103 카피까지 녹색형광을 확인할 수 있었다. 이는 전기영동 결과로도 확인되었다.
실시예 11: N. apis -LAMP와 N. ceranae -LAMP 프라이머의 특이성 확인
Nosema apis specific LAMP 프라이머(N. apis F3, N. apis B3, N. apis FIP, N. apis BIP, N. apis Loop F, N. apis Loop B)와 Nosema ceranae specific LAMP 프라이머(Nosema F3, Nosema B3, Nosema FIP, Nosema BIP, Nosema Loop F, Nosema Loop B)의 특이성을 확인하기 위해, PCR을 통해 Ascosphaera apis, Aspergillus flavus, Nosema ceranae에 감염되었다고 확인된 꿀벌시료와 인위적으로 만든 Nosema apis 시료를 가지고 N. apis-specific LAMP법과 N. ceranae-specific LAMP법을 이용하여 반응이 일어나는지 확인하고자 하였다. N. apis-specific LAMP법과 N. ceranae-specific LAMP법은 각각의 확립된 표준 조건에 따라 수행되었다.
도 13은 상기 프라이머 특이성 확인을 위해 N. apis-specific LAMP(A)와 N. ceranae-specific LAMP(B)를 수행한 결과를 나타낸 형광 사진 및 전기영동 사진이다. 도 13에서 레인 M은 DNA 사이즈 마커(각각 2, 1.6, 1.2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1kb), 레인 N은 음성 대조군, 레인 P는 pBX-Nosema apis 클론(A) 및 pBX-Nosema 클론(B)을 사용한 결과, 레인 1은 A. apis 및 A. flavus에 감염된 유전체 DNA를 사용한 결과, 레인 2는 N. ceranae에 감염된 유전체 DNA를 사용한 결과, 레인 3은 N. apis에 감염된 유전체 DNA를 사용한 결과이다.
도 13을 참조하면, N. apis-specific LAMP에서는 N. apis 인공시료를 사용한 레인에서만 녹색형광을 확인할 수 있었고 다른 병원균을 사용한 레인에서는 녹색형광이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이는 전기영동 상에서도 똑같이 확인되었다. 또한 N. ceranae-specific LAMP에서는 Nosema ceranae에 감염된 꿀벌시료를 사용한 레인에서만 녹색형광을 확인할 수 있었고 다른 병원균을 사용한 레인에서는 녹색형광이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이는 전기영동 상에서도 똑같이 확인되었다. 상기 결과는 Nosema apis와 Nosema ceranae를 구분할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 12: 형광 염색 시험(Fluorescent Dye test)을 이용한 증폭여부 확인
N. apis-specific LAMP 종료 후 전기영동의 수행 없이 확인하기 위하여, DNA 이중 가닥에 삽입되어 녹색의 형광을 발현하는 시약(SYBR Green I, Gene-FinderTM Nucleic acid fluorescent dye)(Baygene Biotech Company Limited, China)을 사용하였다. SYBR Green I을 사용한 반응액에 대해 영상분석장치(ultraviolet transilluminator) 상에서 관찰하였고 그 결과를 도 14(B)에 나타내었다. 또한 Gene-FinderTM Nucleic acid fluorescent dye를 사용한 반응액에 대해서는 형광등을 광원으로 하여 관찰하였고 그 결과를 도 14(A)에 나타내었다. 도 14에서 P는 N. apis-specific LAMP 산물의 결과, N은 음성 대조군 결과를 나타내고 있다.
도 14를 참조하면, Gene-FinderTM Nucleic acid fluorescent dye를 사용한 경우에는 N. apis-specific LAMP 산물에서는 노란색, 음성 대조군에서는 주황색으로 발현되었고, SYBR Green I을 사용한 경우에는 N. apis-specific LAMP 산물이 좀 더 밝은 형광을 나타내었고 이처럼 색이 변하는 것을 확인할 수 있었기에, 현장진단에 매우 유용하다고 할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 N. apis와 N. ceranae를 특이적으로 검출하는 현장 진단용 LAMP법을 제시하였다. N. apis-specific LAMP의 경우 노제마 아피스 리보솜 RNA 유전자(Nosema apis large subunit ribosomal RNA gene, GenBank no.U97150)를 바탕으로 N. apis 특이 프라이머 6개(N. apis-F3/FIP/BIP/B3/Loop F/Loop B)를 설계하였다. pBX-Nosema apis 플라스미드를 주형으로 하여 N. apis-specific LAMP는 54.0℃에서 성공적으로 N. apis 특이 DNA를 신장하였다. 또한 GenecheckerTM 기기를 LAMP법에 적용하여 결과를 전기영동 없이 육안으로 관찰할 수 있었으며, 1×102 카피까지 검출이 가능하고 다른 병원균에서는 반응이 일어나지 않음을 보여주었다. 또한 SYBR Green Ⅰ과 Gene-FinderTM Nucleic acid fluorescent dye를 사용하여 전기영동 없이 육안으로 관찰할 수 있었다.
N. ceranae-specific LAMP의 경우 기존에 개발되었던 방법(이 등, 2010)을 보완하였다. 고리 프라이머를 추가 제작하여 기존 시간의 반인 30분내에서도 DNA 신장이 성공적으로 일어나는 것을 확인하였으며, GenecheckerTM 기기를 LAMP법에 적용하여 결과를 전기영동 없이 육안으로 관찰할 수 있었으며, 1×103 카피까지 검출이 가능하고 높은 특이성을 가지고 실제 N. ceranae에 감염된 시료에서 검출이 가능함을 보여주었다. 또한 SYBR Green Ⅰ과 Gene-FinderTM Nucleic acid fluorescent dye를 사용하여 전기영동 없이 육안으로 관찰할 수 있었다.
따라서 본 발명에서 제시된 N. apis-specific LAMP법과 N. ceranae-specific LAMP법은 구동전원이 직류 12V 전압으로 배터리나 차량 전원에 연결이 가능한 GenecheckerTM 기기를 사용함으로써 현장에서 바로 적용이 가능하기 때문에 매우 유용하며, Nosema apis와 Nosema ceranae를 신속하고 정확하게 검출함으로써 양봉현장에서 유용하게 적용될 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
<110> Kyonggi University Industry & Academia Cooperation Foundation <120> METHOD FOR THE RAPID DETECTION OF NOSEMA DISEASE BY LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Outer Primer <400> 1 agaggatgta tatccgttat a 21 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Outer Primer <400> 2 ttataactta tcaagctaat aacga 25 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Inner Primer <400> 3 gtaccattat atttaacctt agtttttgag atatataaaa gtaat 45 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Inner Primer <400> 4 gacttgtgaa aatgtgttgg ttttttacgt tgttatctcg ctataat 47 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Outer Primer <400> 5 ctacgttaaa gtgtagataa gatgt 25 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Outer Primer <400> 6 tcccataact gcctcagat 19 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Inner Primer <400> 7 acccgtcaca gccttgttaa ttttgtaaga gtgagaccta tcagc 45 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Inner Primer <400> 8 actttgtaat attccggaga aggagttttc cataggtcaa gtttcgcc 48 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop Primer <400> 9 ctacctatat tcaaactgca ctacc 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop Primer <400> 10 cgtcttgaaa cacggaccaa ggag 24 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop Primer <400> 11 gccattacct taacaacta 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop Primer <400> 12 gacggctact aagtctaagg 20

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 노제마병(Nosema disease)을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트는 노제마 아피스(Nosema apis) 병원균 검출을 위해 사용되고, 상기 서열번호 5 내지 8의 프라이머 세트는 노제마 세라나에(Nosema ceranae) 병원균 검출을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 등온증폭반응은 40~57℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 등온증폭반응은 내부 프라이머 농도 20~100pmole 및 외부 프라이머 농도 5~20pmole에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 등온증폭반응은 dNTP 농도 2.5~15mM에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 등온증폭반응은 Bst DNA 중합효소(polymerase) 농도 4~20U에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 조성물은 서열번호 9 내지 10의 프라이머 세트 및 서열번호 11 내지 12의 프라이머 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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