KR20170057105A - 5' 말단의 인산기가 제거된 rna를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물 - Google Patents

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Abstract

5' 말단의 인산기가 제거된 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물 및 이를 이용한 리보핵산단백질 전달 방법이 제공된다.

Description

5' 말단의 인산기가 제거된 RNA를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물{RGEN RNP delivery method using 5'-phosphate removed RNA}
5' 말단의 인산기가 제거된 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물 및 이를 이용한 리보핵산단백질 전달 방법에 관한 것이다.
Cas9 단백질과 가이드 RNA (guide RNA)의 복합체 (complex) 또는 Cpf1 단백질과 crRNA의 복합체와 같은 리보핵산단백질 (ribonucleoprotein; RNP)을 세포에 직접 전달하는 방법(RNP delivery)은 일반적으로 사용하는 DNA 전달 방법에 비해서 많은 장점을 가지고 있다. 즉 DNA 일부가 조각나 유전체에 삽입되는 문제를 배제할 수 있고 외부 DNA 도입에 따르는 cGAS (cyclic-GMP-AMP synthetase) 활성화를 피할 수 있다. 또한 단백질과 RNA 발현이 필요한 DNA 전달 방법에 비해 RNP는 세포 내에서 즉시 작용하고 24시간 내에 분해되기 때문에 표적 부위에 대한 활성 (on-target activity)에 손상 없이 비표적 부위에 대한 영향 (off-target effect)을 줄일 수 있다.
이와 같은 리보핵산단백질이 보다 효과적으로 생체에 적용되기 위해서, 리보핵산단백질의 생체 내 적용시 발생하는 부작용에 대한 연구와 이의 해결을 위한 기술 개발이 요구된다.
1. Pichlmair, A. et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science 314, 997-1001 (2006). 2. Hornung, V. et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science 314, 994-997 (2006). 3. Kim, D.H. et al. Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase. Nature biotechnology 22, 321-325 (2004).
본 발명은 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질과 같은 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-guided endonuclease; RGEN)과 가이드 RNA의 복합체(ribonucleoprotein; RNP)를 유기체에 전달함에 있어, 5'-트리포스페이트를 제거한 가이드 RNA를 이용함으로써 면역반응이 유도되는 것을 억제 및/또는 완화시키는 기술 및/또는 이로 인하여 세포 독성을 저감시키는 기술을 제안한다.
일 예는 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA를 포함하는 세포 독성이 저감된 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-guided endonuclease: RGEN) 리보핵산단백질 전달용 조성물을 제공한다.
다른 예는, 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA를 이용하는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질을 유기체에 전달하는 방법을 제공한다.
다른 예는, RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질을 유기체에 전달하는 방법에 있어서, 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA를 이용하여 세포 독성을 저감시키는 방법을 제공한다.
다른 예는 가이드 RNA, 구체적으로 crRNA 또는 sgRNA의 5' 말단의 인산기 (예컨대, 다이포스페이트 및/또는 트리포스페이트)를 제거하는 단계를 포함하는 면역 반응 유도능 및/또는 세포 독성이 감소된 가이드 RNA의 제조 방법을 제공한다.
다른 예는 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA (예컨대, crRNA 또는 sgRNA)를 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질)와 혼합하는 단계를 포함하는, 면역 반응 유도능 및/또는 세포 독성이 감소된 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 제조 방법을 제공한다.
RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 (RGEN RNP)에 포함되는 대부분의 가이드 RNA는 T7 박테리오파지의 프로모터를 인식하는 T7 RNA 폴리머라아제를 이용한 in vitro transcription 방법을 통해 얻게 되는데, 이 때 T7 RNA 폴리머라아제는 생성된 가이드 RNA의 5' 말단에 트리포스페이트 (5'-PPP)를 남기게 된다. 이와 같이 in vitro transcription을 통해 합성된 가이드 RNA의 5'-트리포스페이트 부위 (5’-triphosphate moiety)가 유기체 내에서 Type1 인터페론 (IFN-α 및 IFN-β)의 발현을 유도하여 면역 반응을 일으키고, 표적 세포의 사멸을 유도함을 확인하였다. 또한, 가이드 RNA의 5' 말단에 다이포스페이트 (5'-PP)가 포함된 경우에도 면역 반응이 유발되는 것을 확인하였다.
RNA에 의한 면역 반응의 유발 여부는 RNA의 형태, RNA와 복합체를 이루는 파트너의 종류, 형태, 및/또는 특성, 복합체에서 RNA의 외부 (세포 환경) 노출 여부, 노출 정도, 및/또는 노출 위치 등 다양한 요인에 의하여 달라진다. 본 명세서에서는 특정한 형태를 갖는 가이드 RNA가 특정한 형태 및 특성을 갖는 단백질인 RGEN (예컨대, Cas9, Cpf1 등)와 함께 특정 형태의 복합체 RGEN RNP를 이루어 작용함에 있어서, 5' 말단에 인산-인산 결합 (예컨대, 다이포스페이트 및/또는 트리포스페이트)을 갖는 가이드 RNA가 면역 반응을 유도하고, 세포독성 (표적 세포 사멸 유도)을 나타낼 수 있음을 최초로 제안하는 것이다.
본 명세서에서는 RGEN RNP의 유기체 전달시에, 5' 말단의 인산-인산 결합을 제거 (예컨대, 2개 이상의 인산기 제거)한 가이드 RNA를 이용함으로써 면역반응이 유도되는 것을 억제 및/또는 완화시키고, 세포 독성을 저감시킬 수 있음을 제안한다.
본 명세서에서, '세포 독성'이라 함은, 별도의 언급이 없는 한, 면역 반응, 대사 저해, 세포 성분 유실, 유전자 변형 등 다양한 세포 유해 현상을 유발하여 세포 생존 및/또는 증식을 저해, 및/또는 세포 손상, 용혈, 및/또는 사멸을 유도하는 것을 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
또한, '세포 독성 저감 (감소)'는, 별도의 언급이 없는 한,
면역 반응(innate immunity)을 유발하지 않음; 및/또는
세포 생존 저해, 세포 증식 저해, 및/또는 세포의 손상, 용혈, 및/또는 사멸 유도의 완화 (감소) 및/또는 제거 (해소)
를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 예는 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA를 포함하는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 전달용 조성물을 제공한다. 상기 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 전달용 조성물은, 5' 말단에 인산-인산 결합 (예컨대, 다이포스페이트 또는 트리포스페이트)을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 경우와 비교하여, 면역 반응 유도능 및/또는 세포 독성이 현저히 감소된 것을 특징으로 한다.
상기 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 전달용 조성물은, 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA에 더하여, RNA 가이드 엔도뉴클레아제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 RNA 가이드 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질, Cpf1 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 예는 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA를 이용하는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질을 유기체에 전달하는 방법을 제공한다.
상기 전달하는 방법은, 5' 말단에 인산-인산 결합 (예컨대, 다이포스페이트 또는 트리포스페이트)을 포함하는 가이드 RNA를 이용하는 경우와 비교하여, 면역 반응 유도능 및/또는 세포 독성이 현저히 감소된 것을 특징으로 한다.
따라서, 다른 예는, RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질을 유기체에 전달하는 방법에 있어서, 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA를 이용하여 세포 독성을 저감시키는 방법을 제공한다.
상기 전달하는 방법 및/또는 세포 독성을 저감시키는 방법은 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA와 RNA 가이드 엔도뉴클레아제와의 혼합물을 유기체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 RNA 가이드 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질, Cpf1 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질"은 RNA 가이드 엔도뉴클레아제와 가이드 RNA를 포함하는 단백질-리보핵산 복합체를 의미하고, 용어 "리보핵산단백질"은 특별한 언급이 없는 한 "RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질"와 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서에서 엔도뉴클레아제는 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA와 복합체를 형성하며 RNA에 포함된 유전자 표적부위 타겟팅 서열을 절단하여 유전자 교정/편집 작용을 하는 엔도뉴클레아제를 의미하는 것으로, 대표적으로 Cas9 단백질 (CRISPR associated protein 9), Cpf1 단백질 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 등과 같은 타입 Ⅱ (Cas9), 및/또는 타입 V (Cpf1)의 CRISPR/Cas 시스템에 수반되는 엔도뉴클레아제일 수 있다.
Cas9 단백질은 스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 예컨대, 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것 (SwissProt Accession number Q99ZW2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cpf1 단백질은 Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, 또는 Eubacterium eligens 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 .
상기 Cas9 단백질, Cpf1 등의 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 진핵세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소 (예컨대, 핵위치신호 (nuclear localization signal; NLS) 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제안되는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 전달용 조성물 또는 이와 관련된 방법에 사용되는 가이드 RNA는 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA 것을 특징으로 한다. 상기 인산-인산 결합은 2개 이상의 인산기 간에 형성된 에스테르 결합을 의미한다. 예컨대, 상기 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA는 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하는 작용기, 즉, 다이포스페이트 및/또는 트리포스페이트를 포함하지 않는 가이드 RNA를 의미한다. 예컨대, 상기 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA는 5' 말단에 모노포스페이트기 또는 OH기를 포함하거나, 이 외에도, 바이러스 또는 박테리아와 같은 pathogen과 구별되는 진핵 세포 또는 진핵 생물 내에 세포 독성 유발 없이 존재 가능한 모든 RNA의 5' 말단의 변형된 형태 (예컨대, 면역 억제, 안정성 증진, 표지 등의 이유로 자연적 또는 인공적으로 변형된 5' 말단 형태)를 갖는 것을 의미할 수 있다.
RNA 가이드 엔도뉴클레오타이드 리보핵산단백질에 사용하기 위한 가이드 RNA 제조 시, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)를 기질로 하는 T7 RNA 폴리머라아제 (T7 박테리오파지의 프로모터를 인식하는 폴리머라아제)와 같은 원핵 세포 RNA 폴리머라아제를 사용하는 in vitro 전사 (transcription)에 의하는 경우, 진핵 세포 유래의 RNA 폴리머라아제를 사용하는 경우와 비교하여, 생산 수율이 높다는 이점이 있다. 한편, 이와 같이 T7 RNA 폴리머라아제와 같은 원핵 세포 RNA 폴리머라아제를 사용하는 in vitro 전사에 의하여 가이드 RNA를 제작하는 경우, 제작된 가이드 RNA의 5' 말단의 트리포스페이트 (PPP-5')의 변조 (modification)가 일어나지 않아서, 가이드 RNA의 5' 말단에 트리포스페이트 (PPP-5')가 남아있게 된다. 상기 원핵 세포 RNA 폴리머라아제는 박테리오파지의 프로모터를 인식하는 RNA 폴리머라아제일 수 있으며, 예컨대, T7 RNA 폴리머라아제, T3 RNA 폴리머라아제, SP6 RNA 폴리머라아제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, RNA 합성시 5' 말단에 트리포스페이트를 남기는 모든 원핵 세포 (예컨대, 박테리오파지) RNA 폴리머라아제 중에서 선택될 수 있다.
이와 같이, 5' 말단에 트리포스페이트를 포함하는 가이드 RNA는 유기체 내에 전달 (도입)시 인터페론 및/또는 인터페론 반응과 관련된 유전자의 발현을 증가시켜 면역 반응을 유도함이 확인되었으며, 5' 말단의 트리포스페이트를 제거하거나 5' 말단에 트리포스페이트를 포함하지 않는 형태로 화학 합성된 가이드 RNA (crRNA 또는 sgRNA)를 사용하는 경우, 5' 말단에 트리포스페이트를 포함하는 경우와 비교하여, 인터페론 및/또는 인터페론 반응과 관련된 유전자의 발현이 현저히 감소하여 면역 반응 유도가 억제됨 (실시예 1.2, 1.3, 및 2.2 참조)과, 세포 독성이 현저히 감소됨 (즉, 세포 생존률이 현저히 증가함; 실시예 1.4 참조)이 확인되었다. 또한, 이와 같이 5' 말단의 트리포스페이트가 제거되거나 화학 합성되어 5' 말단에 트리포스페이트를 포함하지 않는 가이드 RNA를 사용하여도 목적하는 표적 부위의 유전자 교정/편집 효율에 영향이 없음을 확인하였다 (실시예 1.5, 및 2.3 참조).
따라서, 본 발명에서 사용 가능한 가이드 RNA는 T7 RNA 폴리머라아제와 같은 원핵 세포 RNA 폴리머라아제를 사용하는 in vitro 전사에 의하여 제작된 후 5' 말단의 3개의 인산기 중 2개 이상의 인산기, 예컨대 3개의 인산기가 제거 (즉, 트리포스페이트 및/또는 다이포스페이트가 제거)된 것, 또는 5' 말단에 인산-인산 결합 (예컨대, 다이포스페이트 및/또는 트리포스페이트)을 포함하지 않도록 화학 합성된 것일 수 있다.
본 명세서에서, '5' 말단의 인산기의 제거'는 RNA의 5' 말단의 3개의 인산기 중에서 2개 이상의 인산기, 예컨대, 3개의 인산기 (즉, 트리포스페이트 및/또는 다이포스페이트)를 제거함을 의미한다.
상기 5' 말단의 인산기의 제거, 예컨대, 2개 이상의 인산기 (즉, 트리포스페이트 및/또는 다이포스페이트)의 제거는 인산기와의 에스테르 결합을 분해하여 2개 또는 3개의 인산기를 RNA로부터 유리시키는 모든 통상적인 모든 방법에 의할 수 있으며, 예컨대, 포스파타아제 (phosphatase)를 처리하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 포스파타아제는 Calf Intestinal alkaline Phosphatase (CIP), Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP), Antarctic Phosphatase 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, RNA로부터 인산기를 유리시키는 모든 효소들 중에서 선택될 수 있다.
상기 가이드 RNA는 복합체를 형성할 엔도뉴클레아제의 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 엔도뉴클레오타이드 종류에 따라서, CRISPR RNA (crRNA) 단독, CRISPR RNA (crRNA) 및 trans-activating crRNA (tracrRNA)의 복합체, 또는 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
예컨대, Cas9 단백질을 포함하는 복합체 (Cas9 시스템)은 목적하는 유전자 교정/편집을 위하여 두 개의 가이드 RNA, 즉, 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 CRISPR RNA (crRNA)와 추가적인 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 필요로 하며, 이들 crRNA와 tracrRNA는 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체 형태, 또는 링커를 통하여 연결되어 단일 가닥 가이드 RNA (single-stranded guide RNA; sgRNA) 형태로 사용된다. Cpf1 단백질을 포함하는 복합체 (Cpf1 시스템)은 목적하는 유전자 교정/편집을 위하여 하나의 가이드 RNA, 즉, 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 crRNA을 필요로 한다.
상기 가이드 RNA의 구체적 서열은 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질의 종류 (유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다.
일 예에서, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 crRNA는 다음의 일반식 1으로 표현될 수 있다:
5'-(Ncas9)l-GUUUUAGAGCUA-(Xcas9)m-3' (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
Ncas9는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열 부위로서 표적 유전자의 표적 부위에 따라서 결정되는 부위이며, l은 상기 타겟팅 서열 부위에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 18 내지 22의 정수, 예컨대 20일 수 있고;
상기 타겟팅 서열 부위의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12개의 뉴클레오타이드(GUUUUAGAGCUA; 서열번호 1)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이고,
Xcas9는 crRNA의 3' 쪽에 위치하는 (즉, 상기 crRNA의 필수적 부분의 3' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, m은 8 내지 12의 정수, 예컨대 10일 수 있으며, 상기 m개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
본 명세서에서, 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열은 유전자 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다 (이하, 특별한 언급이 없는 한 동일한 의미로 사용된다).
일 예에서, 상기 Xcas9는 UGCUGUUUUG (서열번호 2)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:
5'-(Ycas9)p-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3' (일반식 2)
상기 일반식 2에서,
60개의 뉴클레오타이드 (UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC; 서열번호 3)를 포함하는 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고,
Ycas9는 상기 tracrRNA의 필수적 부분의 5' 말단에 인접하여 위치하는 p개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, p는 6 내지 20의 정수, 예컨대 8 내지 19의 정수일 수 있으며, 상기 p개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
또한, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 sgRNA는 상기 Cas9의 crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부위와 상기 Cas9의 tracrRNA의 필수적 부위를 포함하는 tracrRNA 부위가 뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조를 형성하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부위와 상기 Cas9의 tracrRNA의 필수적 부위를 포함하는 tracrRNA 부위가 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서 crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.
crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위 및 tracrRNA의 필수적 부위는 앞서 설명한 바와 같다. 상기 sgRNA에 포함되는 뉴클레오타이드 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
상기 Cas9 단백질의 crRNA (예컨대, 일반식 1로 표현됨) 또는 sgRNA는 5' 말단 (즉, crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 Cas9 단백질의 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분(60nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예에서, Cpf1 단백질을 포함한 Cpf1시스템에 사용되는 crRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:
5'-n1-n2-A-U-n3-U-C-U-A-C-U-n4-n5-U-U-G-U-A-G-A-U-(Ncpf1)q-3' (일반식 3; [서열번호 4]-(Ncpf1)q).
상기 일반식 3에서,
n1은 U, A, 또는 G이고, n2는 A 또는 G이고, n3은 U, A, 또는 C이고, n4는 존재하지 않거나 G, C, 또는 A이고, n5는 A, U, C, 또는 G이고,
Ncpf1는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열 부위로서 표적 유전자의 표적 부위에 따라서 결정되는 부위이며, q는 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 17 내지 24의 정수, 예컨대 18 내지 23일 수 있다.
상기 일반식 3에서 5' 말단에서 카운팅하여 6번째부터 10번째까지의 5개의 뉴클레오타이드 (5' 말단 스템 부위)와 15번째 (n4가 존재하는 경우 16번째)부터 19번째 (n4가 존재하는 경우 20번째)까지의 5개 뉴클레오타이드(3' 말단 스템 부위)은 서로 역평행 (antiparallel)하게 상보적 뉴클레오타이드로 이루어져 이중 가닥 구조 (스템 구조)를 형성하고, 상기 5' 말단 스템 부위와 3' 말단 스템 부위 사이의 3 내지 5개 뉴클레오타이드가 루프 구조를 형성한다.
일 예에서, 상기 Cpf1 단백질의 crRNA는 일반식 3의 첫 번째 뉴클레오타이드(n1)을 포함하지 않을 수 있다.
상기 Cpf1 단백질의 crRNA (예컨대, 일반식 3으로 표현됨)는 5' 말단에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.
Cpf1 유래 미생물에 따라 사용 가능한 Cpf1 단백질의 crRNA 서열의 5' 말단 부위 서열 (타겟팅 서열 부위 제외한 부분)을 표 1에 예시적으로 기재하였다:
Cpf1 유래 미생물 가이드 RNA (crRNA)의 5' 말단 부위 서열 (5'-3') 서열번호
Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpf1) AAAUUUCUACU-UUUGUAGAU 5
Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10 (PeCpf1) GGAUUUCUACU-UUUGUAGAU 6
Acidaminococcus sp. BVBLG (AsCpf1) UAAUUUCUACU-CUUGUAGAU 7
Porphyromonas macacae (PmCpf1) UAAUUUCUACU-AUUGUAGAU 8
Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpi1) GAAUUUCUACU-AUUGUAGAU 9
Porphyromonas crevioricanis(PcCpf1) UAAUUUCUACU-AUUGUAGAU 10
Prevotella disiens (PdCpf1) UAAUUUCUACU-UCGGUAGAU 11
Moraxella bovoculi 237 (MbCpf1) AAAUUUCUACUGUUUGUAGAU 12
Leptospira inadai (LiCpf1) GAAUUUCUACU-UUUGUAGAU 13
Lachnospiraceae bacterium MA2020 (Lb2Cpf1) GAAUUUCUACU-AUUGUAGAU 14
Francisella novicida U112 (FnCpf1) UAAUUUCUACU-GUUGUAGAU 15
Candidatus Methanoplasma termitum (CMtCpf1) GAAUCUCUACUCUUUGUAGAU 16
Eubacterium eligens (EeCpf1) UAAUUUCUACU--UUGUAGAU 17
(-: 뉴클레오타이드가 존재하지 않음을 의미)
본 명세서에서 사용되는 가이드 RNA는 앞서 설명한 바와 같은 crRNA, tracrRNA, 및 sgRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에서 제안되는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 전달용 조성물 또는 전달 방법 (또는 세포 독성 저감 방법)은 리보핵산단백질의 유기체 내 전달과정에서 인터페론 및/또는 인터페론 반응과 관련된 유전자의 발현 증가를 유도하지 않음으로써 이에 의한 면역 반응을 억제 또는 완화시킬 수 있고, 세포 독성을 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
명세서에서 제안되는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 전달용 조성물에서, 상기 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 전달 대상 유기체는 모든 진핵 세포 (예컨대, 효모 등의 균류, 진핵 동물 및/또는 진핵 생물 유래 세포 (배아세포, 줄기세포, 체세포, 생식세포 등) 등), 진핵 동물 (예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 마우스, 래트 등) 및 진핵 식물 (예컨대, 녹조류 등의 조류, 옥수수, 콩, 밀, 벼 등)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 명세서에서 제안되는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 전달 방법 또는 세포 독성 저감 방법에서 상기 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 전달 대상 유기체는 모든 진핵 세포 (예컨대, 효모 등의 균류, 진핵 동물 및/또는 진핵 생물 유래 세포 (배아세포, 줄기세포, 체세포, 생식세포 등) 등), 진핵 동물 (예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 마우스, 래트 등의 포유류 등) 및 진핵 식물 (예컨대, 녹조류 등의 조류, 옥수수, 콩, 밀, 벼 등)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질 전달 방법의 일 예에서, 상기 진핵 동물은 인간을 제외한 것일 수 있으며, 이 경우, 상기 진핵 세포는 인간을 포함한 진핵 동물에서 분리된 세포를 포함한다.
다른 예는 원핵 세포 RNA 폴리머라이제를 사용하는 in vitro 전사에 의하여 제작된 가이드 RNA의 5' 말단의 2개 이상의 인산기 (예컨대, 트리포스페이트 및/또는 다이포스페이트)를 제거하는 단계를 포함하는, 면역 반응 유도능 및/또는 세포 독성이 감소된 가이드 RNA의 제조 방법 또는 가이드 RNA의 면역 반응 유도능 및/또는 세포 독성을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 가이드 RNA 제조 방법 또는 감소시키는 방법은
(1) 원핵 세포 RNA 폴리머라아제를 사용하는 in vitro 전사에 의하여 제작된 가이드 RNA를 준비하는 단계; 및
(2) 상기 가이드 RNA의 5' 말단의 인산기 중 2개 이상의 인산기 (예컨대, 트리포스페이트 및/또는 다이포스페이트)를 제거하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 원핵 세포 RNA 폴리머라아제를 사용하는 in vitro 전사에 의하여 제작된 가이드 RNA는, 앞서 설명한 바와 같이, 5' 말단에 트리포스페이트를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 원핵 세포 RNA 폴리머라아제는, 앞서 설명한 바와 같이, 박테리오파지 RNA 폴리머라아제일 수 있으며, 예컨대, T7 RNA 폴리머라아제, T3 RNA 폴리머라아제, SP6 RNA 폴리머라아제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, RNA 합성시 5' 말단에 트리포스페이트를 남기는 모든 원핵 세포 (예컨대, 박테리오파지) RNA 폴리머라아제 중에서 선택될 수 있다.
상기 가이드 RNA의 5' 말단의 2개 이상의 인산기를 제거하는 단계는 인산기와의 에스테르 결합을 분해하여 2개 또는 3개의 인산기를 RNA로부터 유리시키는 모든 통상적인 방법에 의할 수행될 수 있으며, 예컨대 포스파타아제를 처리하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 포스파타아제는 Calf Intestinal alkaline Phosphatase (CIP), Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP), Antarctic Phosphatase 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, RNA로부터 인산기를 유리시키는 모든 효소들 중에서 선택될 수 있다.
다른 예는 5' 말단에 인산-인산 결합 (예컨대, 트리포스페이트 및/또는 다이포스페이트)을 포함하지 않는 가이드 RNA를 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질과 혼합하는 단계를 포함하는, 면역 반응 유도능 및/또는 세포 독성이 감소된 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 제조 방법 또는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 면역 반응 유도능 및/또는 세포 독성을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 5' 말단에 인산-인산 결합을 포함하지 않는 가이드 RNA는 상기 가이드 RNA 제조 방법 (예컨대, 상기 단계 (1) 및 (2)를 포함)에 의하여 제조되거나, 5' 말단에 다이포스페이트 및/또는 트리포스페이트를 포함하지 않도록, 예컨대, 5' 말단에 모노포스페이트기 또는 OH기를 포함하거나, 이 외에도, 바이러스와 같은 pathogen과 구별되는 진핵 세포 또는 진핵 생물 내에 세포 독성 유발 없이 존재 가능한 모든 RNA의 변형된 5' 말단 형태 (예컨대, 면역 억제, 안정성 증진, 표지 등의 이유로 자연적 또는 인공적으로 변형된 5' 말단 형태 포함)를 갖도록, 화학 합성된 것일 수 있다.
상기 가이드 RNA 제조 방법 및 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 제조 방법에서 수행되는 모든 단계는 세포 외 또는 생체 외에서 수행되는 것일 수 있다.
5' 말단에서 2개 이상의 인산기 (예컨대, 트리포스페이트)를 제거한 가이드 RNA를 이용하여 RGEN RNP 전달과정에서 면역반응이 유도되는 것을 방지 및/또는 완화 시키는 방법을 제공함으로써, RGEN을 이용한 효과적이고 부작용이 저감된 치료제 개발에 이용될 수 있다.
도 1a는 HeLa cell line에 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cas9 단백질과 함께 또는 따로 delivery 한 뒤 RT-qPCR을 통해 측정한 IFN-β 유전자의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 1b는 HeLa cell line에 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cas9 단백질과 함께 또는 따로 delivery 한 뒤 RT-qPCR을 통해 측정한 RIG-I 유전자의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 1c는 HeLa cell line에 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cas9 단백질과 함께 또는 따로 delivery 한 뒤 RT-qPCR을 통해 측정한 OAS2 유전자의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 2는 HeLa cell line에 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcript RNA 각각을 Cas9 단백질과 함께 또는 따로 delivery 한 뒤 ELISA를 통하여 IFN-β 단백질의 분비량을 측정한 결과이다.
도 3은 HeLa cell line에 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cas9 단백질과 함께 또는 따로 delivery 한 후의 cell viability를 측정하여 정량한 결과를 보여주는 그래프이다. (n.s.: not significant; ***: P<0.001)
도 4는 HeLa cell line에 HBB 유전자를 타겟팅하는 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cas9 단백질과 함께 RNP delivery 한 후의 HBB 유전자에 유도된 돌연변이 비율 (Indel (%))을 보여주는 그래프이다.
도 5a는 HeLa cell line에 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cpf1 단백질과 함께 또는 따로 delivery 한 뒤 RT-qPCR을 통해 측정한 IFN-β 유전자의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 5b는 HeLa cell line에 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cpf1 단백질과 함께 또는 따로 delivery 한 뒤 RT-qPCR을 통해 측정한 RIG-I 유전자의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 5c는 HeLa cell line에 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cpf1 단백질과 함께 또는 따로 delivery 한 뒤 RT-qPCR을 통해 측정한 OAS2 유전자의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 6은 HeLa cell line에 DNMT1 유전자를 타겟팅하는 합성 가이드 RNA, CIP-처리 가이드 RNA, 및 in vitro transcribed 가이드 RNA 각각을 Cpf1 단백질과 함께 RNP delivery 한 후의 DNMT1 유전자에 유도된 돌연변이 비율 (Indel (%))을 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1: CAs9 RNP 전달
1.1: 가이드 RNA의 준비
HBB (human beta-globin) 유전자를 타겟팅하는 가이드 RNA crRNA 와 tracrRNA를 각각 in vitro transcription을 이용하거나(PPP-crRNA / PPP-tracrRNA) 또는 화학 합성 (Syn-crRNA / Syn-tracrRNA)을 이용해 준비하였다. HBB 유전자를 타겟팅하는 single-chain guide RNA(sgRNA)는 in vitro transcription (T7 promoter)을 이용하여 준비하였다 (PPP-sgRNA).
상기 In vitro transcription은 각 RNA에 대응하는 올리고머(표 2 참조)를 어닐링시킨 뒤, phusion polymerase(NEB)를 이용하여 extension 하여 준비한 template를 T7 RNA polymerase(NEB) reaction에 넣어주어 진행하였다.
In vitro transcription template로 사용된 올리고머 서열
sgRNA_F 5'-GAAATTAATACGACTCACTATA gTTGCCCCACAGGGCAGTAA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3' 65mer 서열번호18
sgRNA_R 5'-AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTAT
TTCTAGCTCTAAAAC-3'		 80mer 서열번호19
crRNA_F 5'-GAAATTAATACGACTCACTATA gTTGCCCCACAGGGCAGTAA GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTG-3' 64mer 서열번호20
crRNA_R 5'-CAAAACAGCATAGCTCTAAAAC TTACTGCCCTGTGGGGCAAc TATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3' 64mer 서열번호21
tracRNA_F　 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG-3' 67mer 서열번호22
tracRNA_R 5'-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATG-3' 69mer 서열번호23
(밑줄 그은 부분(20nt): X20 sequence (HBB-타겟팅 서열; 타겟팅하는 유전자 또는 유전자 내 타겟팅하는 부위와 혼성화 가능하도록 적절히 설계 가능함))
In vitro transcription을 이용해 준비된 RNA에 각각 Calf Intestinal alkaline Phosphatase (CIP; NEB)를 100U per 200ul reaction 의 양으로 처리한 뒤 Phenol/Chloroform extraction과 column purification을 거쳐 5'-triphosphate가 제거된 형태 (CIP-crRNA / CIP-tracrRNA / CIP-sgRNA)로 준비하였다 (표 3).
< RGEN (Cas9)의 guide RNA 서열>
Sequence (5' - 3') length 서열번호
PPP-sgRNA
/CIP-sgRNA		 GUUGCCCCACAGGGCAGUAA GUUUUAGAGCUA GAAA UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU 102nt 24
PPP-crRNA
/CIP-crRNA
/Syn-crRNA		 GUUGCCCCACAGGGCAGUAA GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 42nt 25
PPP-tracrRNA
/CIP-tracrRNA		 GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU 86nt 26
Syn_tracrRNA AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU 69nt 27
(밑줄: HBB-타겟팅 서열; 이탤릭체: crRNA 유래 서열; 볼드체: tracrRNA 유래 서열; 밑줄 + 볼드체: 링커)
1.2: Type I interferon response와 관련된 유전자의 mRNA 수준 측정
Cas9 RNP delivery를 하기 위해서, streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질 4.4ug (25pmol)과 상기 실시예 1.1에서 준비된 HBB 유전자를 타겟팅하는 가이드 RNA인 crRNA/tracrRNA 또는 sgRNA (25pmol)을 섞어주고, Lipofectamine2000 (Invitrogen) reagent를 이용해 human HeLa cell line (ATCC)에 transfection(Cas9 단독 또는 Cas9과 가이드 RNA 혼합물) 한 뒤, 24 시간 뒤에 media를 취하여 IFN-beta ELISA를 수행하고, cell 을 lysis 하여 total RNA을 얻었다. 48시간 뒤에 genomic DNA를 얻어 RGEN RNP에 의해 유도된 mutation 효율을 측정하였다.
상기 얻어진 Total RNA를 이용해 RT-qPCR을 진행하여 Type I interferon response에 의해 up-regulation 된다고 알려진 IFN-β (Interferon-beta), RIG-I (retinoic acid-inducible gene 1), 및 OAS2 (2'-5'-oligoadenylate synthetase 2) 유전자의 mRNA 양을 측정하였다. 상기 RT-qPCR에 사용된 프라이머를 아래의 표 4에 정리하였다:
Beta-actin-F CCCAGCCATGTACGTTGCTA (서열번호 28) Beta-actin-R TCACCGGAGTCCATCACGAT (서열번호 29)
IFN-b-F TGCTTCTCCACTACAGCTCTT (서열번호 30) IFN-b-R GCAGTATTCAAGCCTCCCAT (서열번호 31)
OAS2- F TCAGAAGAGAAGCCAACGTGA (서열번호 32) OAS2- R CGGAGACAGCGAGGGTAAAT (서열번호 33)
RIG-1-F GGACGTGGCAAAACAAATCAG (서열번호 34) RIG-1-R GCAATGTCAATGCCTTCATCA (서열번호 35)
상기 얻어진 유전자 발현 (mRNA 양) 결과를 도 1a(IFN-β), 1b(RIG-I) 및 1c(OAS2)에 각각 나타내었다 (Syn: 합성 crRNA & tracrRNA (5'-triphospate를 갖지 않음); CIP: CIP-treated in vitro transcript (5'-triphospate 제거됨); PPP: in vitro transcript (5'-triphospate를 가짐)).
도 1a-1c에 나타난 바와 같이, 5'-OH 말단을 가지고 있는 (즉, 5'-triphospate가 존재하지 않는) 합성 가이드 RNA 및 CIP를 처리한 가이드 RNA를 각각 처리한 경우에는 Cas9 protein의 처리유무에 관계없이 Mock transfection한 sample과 같은 background level의 IFN-β, RIG-I 및 OAS2 유전자 발현량을 보여준 반면, in vitro transcribed PPP-crRNA/PPP-tracrRNA 또는 PPP-sgRNA를 처리한 경우에는 IFN-β 및 RIG-I 유전자는 약 100배, OAS2 유전자는 약 10000배 가량 증가된 발현량을 볼 수 있었다. 이를 통해 Cas9 RNP의 가이드 RNA에 존재하는 5'-triphosphate에 의해 Type I interferon response가 유도됨을 알 수 있다. 합성 가이드 RNA 또는 CIP-처리 가이드 RNA 를 이용하면 이러한 면역 반응을 피해갈 수 있음도 확인하였다.
1.3: IFN -β 단백질 발현량 측정
IFN-β 단백질 발현량의 변화를 보기 위해, HeLa cell line(ATCC)에 Cas9 단백질과 상기 실시예 1.1에서 준비된 각각의 가이드 RNA를 함께 또는 따로 delivery(transfection)하고 24시간 후의 IFN-β 단백질의 분비량을 VeriKineTM Human IFN Beta ELISA Kit을 이용한 IFN-β ELISA를 수행하여 측정하였다.
얻어진 결과를 도 2에 나타내었다 (Syn: synthetic crRNA & tracrRNA (5'-triphospate를 갖지 않음); CIP: CIP-treated in vitro transcript (5'-triphospate 제거됨); PPP: in vitro transcript (5'-triphospate를 가짐)). 도 2에서 (A)는 Human IFN-β Standard sample에 대한 시험 결과이고, (B)는 Cas9과 가이드 RNA (RNP)가 transfection된 세포 배지에서 측정된 IFN-β level을 나타낸 것이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 5'-OH 말단을 가지고 있는 (즉, 5'-triphospate가 존재하지 않는) 합성 가이드 RNA 및 CIP를 처리한 가이드 RNA를 각각 처리한 경우에는 Cas9 protein의 처리유무에 관계없이 Mock transfection한 sample과 같은 background level의 IFN-β 양을 보여준 반면, in vitro transcribed PPP-crRNA/PPP-tracrRNA 또는 PPP-sgRNA를 처리했을 때, 122-243 pg/mL의 증가된 IFN-β 발현량을 볼 수 있었다. 이를 통해 Cas9 RNP의 guide RNA에 존재하는 5'-triphosphate에 의해 Type I interferon response가 유도됨과 CIP-treated guideRNA (즉, in vitro transcript 가이드 RNA의 5'-triphosphate가 제거된 guideRNA)를 사용함으로써 interferon induction이 완화되는 효과를 확인하였다.
1.4: Cytopathic effect 측정
5'-triphosphated RNA에 의한 면역 반응에 의해서 유도되는 Cytopathic effect를 확인하였다. HeLa cell line (ATCC)에 상기 실시예 1.1에서 준비된 합성 가이드 RNA, CIP-treated 가이드 RNA, in vitro transcript 가이드 RNA를 Cas9 protein과 함께 또는 따로 delivery하고, 72시간 뒤에 WST assay (WST based Cell Viability/Cytotoxicity Assay; EZ-Cytox kit (㈜ 대일랩서비스) 사용)를 통해서 cell viability를 정량하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다 (Syn: synthetic crRNA & tracrRNA (5'-triphospate를 갖지 않음); CIP: CIP-treated in vitro transcript (5'-triphospate 제거됨); PPP: in vitro transcript (5'-triphospate를 가짐) (n.s.: not significant; ***: P < 0.001).
in vitro transcribed PPP-crRNA/PPP-tracrRNA 또는 PPP-sgRNA를 처리했을 때만, immune response에 의한 cytopathic effect를 확인할 수 있었다. 이와 같은 in vitro transcript 가이드 RNA의 cytophatic effect는 CIP-treated guide RNA (즉, in vitro transcript 가이드 RNA의 5'-triphosphate가 제거된 가이드 RNA)를 사용함으로써 피해갈 수 있음을 확인하였다.
1.5: Genome Editing 효율 시험
면역 반응을 피해가기 위해 합성 가이드 RNA 또는 CIP-처리 가이드 RNA를 사용했을 때 genome editing 효율에 차이가 있는지 확인하였다. HeLa cell line(ATCC)에 상기 실시예 1.1에서 준비된 HBB 유전자를 타겟팅하는 합성 가이드 RNA, CIP-처리 RNA, 및 in vitro transcript 가이드 RNA를 각각 Cas9 단백질과 함께 RNP delivery하고 48시간 뒤에 genomic DNA를 얻어 HBB 유전자에 유도된 on-target 돌연변이 비율 (삽입/결실 (Indel) %)을 차세대뉴클레오타이드 서열분석법 (NGS; Illumina sequencing)를 통해 확인하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다 (Syn: synthetic crRNA & tracrRNA (5'-triphospate를 갖지 않음); CIP: CIP-treated in vitro transcript (5'-triphospate 제거됨); PPP: in vitro transcript (5'-triphospate를 가짐).
도 4에 나타난 바와 같이, 합성 가이드 RNA 또는 CIP-처리 가이드 RNA를 사용했을 때도 기존의 방법인 in vitro transcribed PPP-guide RNA를 사용했을 때와 비슷한 gene editing 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 2: Cpf1 RNA 전달
2.1: 가이드 RNA의 준비
DNMT1 유전자를 타겟팅하는 crRNA를 in vitro transcription을 이용하거나(PPP-crRNA) 또는 화학 합성 (Syn-crRNA)을 이용해 준비하였다.
상기 In vitro transcription은 각 RNA에 대응하는 올리고머(표 5 참조)를 어닐링시킨 뒤, phusion polymerase(NEB)를 이용하여 extension 하여 준비한 template를 T7 RNA polymerase(NEB) reaction에 넣어주어 진행하였다.
In vitro transcription template로 사용된 올리고머 서열
crRNA_46nt_F GAAATTAATACGACTCACTATAGGG 25mer 서열번호36
crRNA_46nt_R GAGTAACAGACATGGACCATCAGATCTACAAGAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC 68mer 서열번호37
crRNA_44nt_F GAAATTAATACGACTCACTATAG 23mer 서열번호38
crRNA_44nt_R GAGTAACAGACATGGACCATCAGATCTACAAGAGTAGAAATTACTATAGTGAGTCGTATTAATTTC 66mer 서열번호39
In vitro transcription을 이용해 준비된 crRNA에 Calf Intestinal alkaline Phosphatase (CIP)를 200U per 200ul reaction의 양으로 처리한 뒤 Phenol/Chloroform extraction과 column purification을 거쳐 5'-triphosphate가 제거된 형태 (CIP-crRNA)로 준비하였다 (표 6).
< RGEN (Cpf1)의 guide RNA 서열>
　 Sequence (5' - 3') length 서열번호
PPP-crRNA / CIP-crRNA /Syn-crRNA GUAAUUUCUACUCUUGUAGAU CUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUC 44nt 40
PPP-crRNA / CIP-crRNA GGGUAAUUUCUACUCUUGUAGAU CUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUC 46nt 41
(밑줄: DNMT1-타겟팅 서열)
2.2: Type I interferon response와 관련된 유전자의 mRNA 수준 측정
Cpf1 RNP delivery를 하기 위해서, Acidaminococcus sp. BV3L6 유래의 Cpf1 단백질 (AsCpi1) 5ug (25pmol)과 상기 실시예 2.1에서 준비된 DNMT1 유전자를 타겟팅하는 crRNA (PPP-crRNA, Syn-crRNA, 또는 CIP-crRNA) 0.4ug (25pmol)을 섞어주고 Lipofectamine2000 (Invitrogen) reagent를 이용해 human HeLa cell line (ATCC)에 transfection 을 한 뒤 24 시간 뒤에 세포를 용해시켜 total RNA를 얻었다. 48시간 뒤에는 genomic DNA를 얻어 Cpf1 RNP에 의해 유도된 mutation 효율을 측정하였다.
상기 얻어진 Total RNA를 이용해 RT-qPCR을 진행하여 Type I interferon response에 의해 up-regulation 된다고 알려진 IFN-β, RIG-I, 및 OAS2 유전자의 mRNA 양을 측정하였다. 상기 RT-qPCR에 사용된 프라이머를 아래의 표 6에 정리하였다:
Beta-actin-F CCCAGCCATGTACGTTGCTA (서열번호 28) Beta-actin-R TCACCGGAGTCCATCACGAT (서열번호 29)
IFN-b-F TGCTTCTCCACTACAGCTCTT (서열번호 30) IFN-b-R GCAGTATTCAAGCCTCCCAT (서열번호 31)
OAS2- F TCAGAAGAGAAGCCAACGTGA (서열번호 32) OAS2- R CGGAGACAGCGAGGGTAAAT (서열번호 33)
RIG-1-F GGACGTGGCAAAACAAATCAG (서열번호 34) RIG-1-R GCAATGTCAATGCCTTCATCA (서열번호 35)
상기 얻어진 유전자 발현 (mRNA 양) 결과를 도 5a(IFN-β), 5b(RIG-I) 및 5c(OAS2)에 각각 나타내었다 (Syn: 합성 crRNA (5'-triphospate를 갖지 않음); CIP: CIP-treated in vitro transcript (5'-triphospate 제거됨); PPP: in vitro transcript (5'-triphospate를 가짐)).
도 5a-5c에 나타난 바와 같이, 5'-OH 말단을 가지고 있는 (즉, 5'-triphospate가 존재하지 않는) 합성 가이드 RNA 및 CIP를 처리한 가이드 RNA를 각각 처리한 경우에는 Cas9 protein의 처리유무에 관계없이 Mock transfection한 sample과 같은 background level의 IFN-β, RIG-I 및 OAS2 유전자 발현량을 보여준 반면, in vitro transcribed PPP-crRNA/PPP-tracrRNA 또는 PPP-sgRNA를 처리한 경우에는 IFN-β, RIG-I, 및 OAS2 유전자의 발현량 (nRNA 양)이 현저하게 증가함을 알 수 있다. 이를 통해 Cpf1 RNP의 가이드 RNA에 존재하는 5'-triphosphate에 의해 Type I interferon response가 유도됨을 알 수 있다. 합성 가이드 RNA 또는 CIP-처리 가이드 RNA 를 이용하면 이러한 면역 반응을 피해갈 수 있음도 확인하였다.
2.3: Genome Editing 효율 시험
immune response를 피해가기 위해 합성 가이드 RNA 또는 CIP-처리 가이드 RNA를 사용했을 때 genome editing 효율에 차이가 있는지 확인하였다. HeLa cell line(ATCC)에 상기 실시예 2.1에서 준비된 DNMT1 유전자를 타겟팅하는 합성 가이드 RNA, CIP-처리 RNA, 및 in vitro transcript 가이드 RNA를 각각 Cpf1 단백질과 함께 RNP delivery하고 48시간 뒤에 genomic DNA를 얻어 DNMT1 유전자에 유도된 on-target 돌연변이 비율 (삽입/결실 (Indel) %)을 T7 endonuclease I (T7E1) assay (T7 endonuclease I; (NEB))를 통해 확인하였다.
상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다 (Syn: synthetic crRNA (5'-triphospate를 갖지 않음); CIP: CIP-treated in vitro transcript (5'-triphospate 제거됨); PPP: in vitro transcript (5'-triphospate를 가짐).
도 6에 나타난 바와 같이, 합성 가이드 RNA 또는 CIP-처리 가이드 RNA를 사용했을 때도 기존의 방법인 in vitro transcribed PPP-guide RNA를 사용했을 때와 비슷한 gene editing 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE <120> RGEN RNP delivery method using 5'-phosphate removed RNA <130> DPP20160672KR <160> 41 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of an essential part of crRNA for Cas9 <400> 1 guuuuagagc ua 12 <210> 2 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-terminal sequence of crRNA for Cas9 <400> 2 ugcuguuuug 10 <210> 3 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of an essential part of tracrRNA for Cas9 <400> 3 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 60 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is U, A, G, or absent <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is A or Gn <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n is U, A, or C <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is absent, G, C, or A <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n is A, U, C, or G <400> 4 nnaunucuac unnuuguaga u 21 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (PbCpi1) <400> 5 aaauuucuac uuuuguagau 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (PeCpf1) <400> 6 ggauuucuac uuuuguagau 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (AsCpf1) <400> 7 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (PmCpf1) <400> 8 uaauuucuac uauuguagau 20 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (LbCpi1) <400> 9 gaauuucuac uauuguagau 20 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (PcCpf1) <400> 10 uaauuucuac uauuguagau 20 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (PdCpf1) <400> 11 uaauuucuac uucgguagau 20 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (MbCpf1) <400> 12 aaauuucuac uguuuguaga u 21 <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (LiCpf1) <400> 13 gaauuucuac uuuuguagau 20 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (Lb2Cpf1) <400> 14 gaauuucuac uauuguagau 20 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (FnCpf1) <400> 15 uaauuucuac uguuguagau 20 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (CMtCpf1) <400> 16 gaaucucuac ucuuuguaga u 21 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-terminal sequence of crRNA for Cpf1 (EeCpf1) <400> 17 uaauuucuac uuuguagau 19 <210> 18 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template for sgRNA_F for Cas9 <400> 18 gaaattaata cgactcacta tagttgcccc acagggcagt aagttttaga gctagaaata 60 gcaag 65 <210> 19 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template for sgRNA_R for Cas9 <400> 19 aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 60 ttgctatttc tagctctaaa ac 82 <210> 20 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template for crRNA_F for Cas9 <400> 20 gaaattaata cgactcacta tagttgcccc acagggcagt aagttttaga gctatgctgt 60 tttg 64 <210> 21 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template for crRNA_R for Cas9 <400> 21 caaaacagca tagctctaaa acttactgcc ctgtggggca actatagtga gtcgtattaa 60 tttc 64 <210> 22 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template for tracRNA_F for Cas9 <400> 22 gaaattaata cgactcacta taggaaccat tcaaaacagc atagcaagtt aaaataaggc 60 tagtccg 67 <210> 23 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template for tracRNA_R for Cas9 <400> 23 aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60 cttgctatg 69 <210> 24 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an example of sgRNA for Cas9 <400> 24 guugccccac agggcaguaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 25 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an example of crRNA for Cas9 <400> 25 guugccccac agggcaguaa guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 26 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an example of tracrRNA for Cas9 <400> 26 ggaaccauuc aaaacagcau agcaaguuaa aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa 60 aguggcaccg agucggugcu uuuuuu 86 <210> 27 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an example of synthetic tracrRNA for Cas9 <400> 27 aaacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga 60 gucggugcu 69 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin-F primer <400> 28 cccagccatg tacgttgcta 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin-R primer <400> 29 tcaccggagt ccatcacgat 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-b-F primer <400> 30 tgcttctcca ctacagctct t 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-b-R primer <400> 31 gcagtattca agcctcccat 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OAS2- F primer <400> 32 tcagaagaga agccaacgtg a 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OAS2- R primer <400> 33 cggagacagc gagggtaaat 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RIG-1-F primer <400> 34 ggacgtggca aaacaaatca g 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RIG-1-R primer <400> 35 gcaatgtcaa tgccttcatc a 21 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template of crRNA_46nt_F for Cpf1 <400> 36 gaaattaata cgactcacta taggg 25 <210> 37 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template of crRNA_46nt_R for Cpf1 <400> 37 gagtaacaga catggaccat cagatctaca agagtagaaa ttaccctata gtgagtcgta 60 ttaatttc 68 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template of crRNA_44nt_F for Cpf1 <400> 38 gaaattaata cgactcacta tag 23 <210> 39 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcriptional template of crRNA_44nt_R for Cpf1 <400> 39 gagtaacaga catggaccat cagatctaca agagtagaaa ttactatagt gagtcgtatt 60 aatttc 66 <210> 40 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an example of crRNA (44nt) for Cpf1 <400> 40 guaauuucua cucuuguaga ucugaugguc caugucuguu acuc 44 <210> 41 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an example of crRNA (46nt) for Cpf1 <400> 41 ggguaauuuc uacucuugua gaucugaugg uccaugucug uuacuc 46

Claims (13)

  1. 5' 말단에 다이포스페이트 및 트리포스페이트를 포함하지 않는 가이드 RNA를 포함하고,
    상기 5' 말단에 다이포스페이트 및 트리포스페이트를 포함하지 않는 가이드 RNA는 원핵 세포 폴리머라아제를 사용하는 in vitro 전사에 의하여 제작된 후 5' 말단의 다이포스페이트 및 트리포스페이트가 제거된 것 또는 화학 합성된 CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    세포독성이 감소된 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 유기체 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질을 추가로 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인, 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 Cpf1 단백질은 Parcubacteria bacterium, Peregrinibacteria bacterium, Acidaminococcus sp., Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida, Candidatus Methanoplasma termitum, 또는 Eubacterium eligens 유래의 것인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기체는 진핵 세포, 진핵 동물, 또는 진핵 식물인, 조성물.
  6. 5' 말단에 다이포스페이트 및 트리포스페이트를 포함하지 않는 가이드 RNA 및 RNA 가이드 엔도뉴클레아제의 혼합물을 유기체에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 5' 말단에 다이포스페이트 및 트리포스페이트를 포함하지 않는 가이드 RNA는 원핵 세포 폴리머라아제를 사용하는 in vitro 전사에 의하여 제작된 후 5' 말단의 다이포스페이트 및 트리포스페이트가 제거된 것 또는 화학 합성된 CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 유기체는 진핵 세포, 인간을 제외한 진핵 동물, 또는 진핵 식물인,
    세포독성이 감소된 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 유기체 전달 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 RNA 가이드 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질인, 전달 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인, 전달 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 Cpf1 단백질은 Parcubacteria bacterium, Peregrinibacteria bacterium, Acidaminococcus sp., Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida, Candidatus Methanoplasma termitum, 또는 Eubacterium eligens 유래의 것인, 전달 방법.
  10. (1) 원핵 세포 폴리머라아제를 사용하는 in vitro 전사에 의하여 제작된 가이드 RNA를 준비하는 단계; 및
    (2) 상기 가이드 RNA의 5' 말단의 다이포스페이트 또는 트리포스페이트를 제거하는 단계
    를 포함하고,
    상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    세포 독성이 감소된 가이드 RNA의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 가이드 RNA의 5' 말단의 다이포스페이트 또는 트리포스페이트를 제거하는 단계는 포스파타아제를 처리하여 수행되는 것인, 가이드 RNA의 제조 방법.
  12. 5' 말단에 다이포스페이트 및 트리포스페이트를 포함하지 않는 가이드 RNA를 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질과 혼합하는 단계를 포함하는, 세포 독성이 감소된 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 5' 말단에 다이포스페이트 및 트리포스페이트를 포함하지 않는 가이드 RNA는 화학 합성된 것 또는 제11항 또는 제12항의 방법에 의하여 제조된 것인, RNA 가이드 엔도뉴클레아제 리보핵산단백질의 제조 방법.
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