KR20170054420A - 인플루엔자 바이러스 감염에 사용하기 위한 피롤로피리미딘 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인플루엔자 감염의 또는 이에 대한 치료에 사용될 수 있는 화학식 I의 구조를 갖는 화합물에 관한 것이다.
[화학식 I]

Description

인플루엔자 바이러스 감염에 사용하기 위한 피롤로피리미딘{PYRROLOPYRIMIDINES FOR USE IN INFLUENZA VIRUS INFECTION}

인플루엔자는 인간 집단에서 높은 발병률로 잦은 대규모 이환율 및 사망률을 초래하는 심각한 공중 보건 문제이다. 이는 급성 열병(acute febrile illness)을 야기하는 고도로 접촉전염성인 공기매개 질병(highly contagious airborne disease)이다. 전신 증상은 중증도에 있어서 경미한 피로부터 호흡 부전 및 사망에 이르기까지 다양하다. WHO에 따르면, 매년 발생되는 유행병의 평균 전세계 부담은 약 10억 건 정도의 사례일 수 있으며, 3백만 내지 5백만 건의 사례는 심각한 병(severe illness)이고, 300,000 내지 500,000건의 사망건수가 해마다 발생되고 있다. 해마다, 인플루엔자 바이러스는 인간에서 순환하여, 전형적으로 모든 연령 그룹 내에 있는 인구의 5 내지 20%에 영향을 주는데, 이 숫자는 대유행기에는 최대 30%까지 상승한다. 심각한 병 및 사망의 비율은 65세 초과의 사람, 2세 미만의 어린이, 및 인플루엔자로부터 합병증에 대한 증가 위험에 놓이게 하는 의학적 질환, 예컨대 만성 심장, 폐, 신장, 간, 혈액 또는 대사성 질병, 또는 약화된 면역 시스템을 갖는 임의의 연령의 사람 사이에서 최고이다. 사망이 어린이 사이에서 드물기는 하지만, 입원율은 동반이환(co-morbid) 상태의 존재 또는 부재에 따라, 5세 미만의 어린이의 경우 100,000건당 대략 100 내지 500건의 범위이다. 24개월 미만의 어린이 사이에서의 입원율은 65세 초과의 사람 사이에서 보고된 입원율과 비견된다.

미국에서, 매년 발생되는 인플루엔자 유행병은 대략 3000만 외래환자 내원을 초래하며, 그 결과 해마다 100억 달러의 의료 비용이 들게 된다. 병 및 사망으로 인한 상실 수익액(lost earning)은 해마다 150억 달러를 초과하는 비용을 나타내고, 매년 발생되는 인플루엔자 유행병의 총 미국 경제적 부담은 850억 달러를 초과하기에 이른다.

인플루엔자를 야기하는 병원체는, 오르토믹소바이러스과(family Orthomyxoviridae)에 속하는, 네거티브 센스 단일-가닥 RNA 바이러스이다. A형, B형 및 C형의 3가지 유형의 인플루엔자 바이러스가 있다. A형 인플루엔자 바이러스는 가장 일반적인 형태로, 이는 포유동물 및 조류에서 확산될 수 있다. A형 인플루엔자의 아형은 표면 단백질인 혈구응집소(H) 및 뉴라미니다제(N)의 유형에 따라 명명된다. 18개의 상이한 혈구응집소 및 11개의 알려진 뉴라미니다제가 있다. 인간에서 발견되는 현재의 계절성 인플루엔자 바이러스는 주로 H1N1 및 H3N2 아형이다. B형 인플루엔자 바이러스는 단지 인간에게서만 통상 발견된다. 이것은 아형으로 세분되지 않지만, 상이한 바이러스주(strain)로 추가로 나누어질 수 있다. 순환성 인플루엔자 바이러스는 매년마다 매우 변동되기 쉬우며, A형 및 B형 인플루엔자 둘 모두 전세계에 걸쳐 계절성 유행병을 야기한다. C형 인플루엔자 바이러스는 훨씬 더 경미한 증상을 나타내며, 이는 유행병을 야기하지 않는다.

3가지 모든 유형의 바이러스는 유사한 게놈 구조를 갖는다. 게놈은 유형에 따라 9 내지 11개의 단백질을 인코딩하는 8개의 절편을 포함한다. A형 인플루엔자는 11개의 단백질을 인코딩하는데, 이에는 표면 단백질(혈구응집소(HA) 및 뉴라미니다제(NA)), 중합효소 복합체(PA, PB1 및 PB2), 핵단백질(NP), 막 단백질(M1 및 M2), 및 기타 단백질(NS1, NS2, NEP)이 포함된다. 3가지 인플루엔자 바이러스 유형 중에서, A형 인플루엔자가 최고의 돌연변이율을 갖는다. B형 인플루엔자는 A형보다는 더 느리게, 그러나 C형보다는 더 빠르게 진화된다. 절편화된 게놈은 유전자가 상이한 바이러스주들 사이에서 교환될 수 있게 하며, 이는 인플루엔자 바이러스의 신종 변이체를 발생시킨다.

인플루엔자 바이러스는 감염된 개인 또는 바이러스-오염된 물질과의 직접 접촉에 의해 인간들 사이에서 전염될 수 있다. 사람들은 또한 공기 중에 떠다니는 바이러스 비말(droplet)의 흡입에 의해 감염될 수 있다. 비말은 기침, 재채기에 의해 또는 감염자가 말할 때 발생된다. 계절성 인플루엔자는 고열, 기침(통상 마른 기침), 두통, 근육 및 관절 통증, 심각한 권태감(찌뿌드한 느낌), 인후염 및 콧물의 갑작스러운 발생에 의해 특징지어진다. 기침은 심각할 수 있어서 2주 이상 지속될 수 있다. 대부분의 사람들은 의학적 치료에 대한 필요 없이 1주 이내에 열 및 기타 증상으로부터 회복한다. 그러나, 인플루엔자는, 특히 상기 언급된 바와 같은 고위험에 처한 사람들에서 심각한 병 또는 사망을 야기할 수 있다. 잠복기(incubation period)로 알려진, 감염으로부터 병에 이르기까지의 시간은 약 2일이다.

그러한 병으로부터의 질병 및/또는 심각한 결과를 방지하는 가장 효과적인 방법은 백신화(vaccination)이다. 안전하고 효과적인 백신이 입수가능하고, 60세 초과의 사람에게 사용되어 왔다. 건강한 성인들 사이에서, 인플루엔자 백신은 합리적인 보호를 제공할 수 있다. 그러나, 백신화는 몇몇 제한을 갖는다. 먼저, 인플루엔자 백신은 고령자들 사이에서 병을 예방하는 데 덜 효과적일 수 있고, 단지 질병의 중증도 및 합병증 및 사망의 발생률을 감소시킬 수 있을 뿐이다. 게다가, 인플루엔자 백신화는 순환성 바이러스가 백신 바이러스와 잘 매칭될 때 가장 효과적이어서, 백신화의 성공은 그 계절의 가장 우세한 바이러스 유형의 우수한 예측에 대체로 좌우된다. 현재의 인플루엔자 백신에 대한 백신-유도 면역 반응의 단수명 성질과 결합된, 항원 소변이(antigenic drift)를 통한 인플루엔자 바이러스주의 신속하고 계속적인 진화는, 계절적으로 적절한 바이러스주에 의한 백신화가 예방을 위해 해마다 필요함을 의미한다.

인플루엔자의 현재의 치료는 직접 항바이러스 약물, 또는 인플루엔자-유도 증상을 풀어주는 의약을 사용한다. 시장에서 입수가능한 다음 2가지 부류의 인플루엔자 항바이러스 약물이 있다: 뉴라미니다제 억제제 및 M2 채널 억제제. 뉴라미니다제 억제제인 오셀타미비르(oseltamivir) 또는 자나미비르(zanamivir)는 인플루엔자의 예방 및 치료를 위해 권장되는 1차 항바이러스제이다. 이들은 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 둘 모두에 대해 효과적이다. 이들 항바이러스 약물에 대한 내성의 발생이 계절성 인플루엔자의 치료 동안에, 그리고 산발성 오셀타미비르-내성 2009 H1N1 바이러스에서 확인되었지만, 공중 보건 영향은 지금까지 제한되어 있다. M2 채널 억제제, 예컨대 아만타딘 및 리만타딘(아만타단)은 A형 인플루엔자 바이러스주에 대해서는 활성이지만, B형 인플루엔자 바이러스주에 대해서는 비활성이다. 순환성 A형 인플루엔자 바이러스들 사이에서의 아만타단 내성은 2003년 내지 2004년을 시작으로 그 두 해 동안 전세계적으로 급속히 증가하였다. 따라서, 아만타딘 및 리만타딘은 현재의 순환성 A형 인플루엔자 바이러스주의 항바이러스 치료 또는 화학예방(chemoprophylaxis)에 권장되지 않는다.

2009년에, 신종 돼지(swine) H1N1 바이러스주는 인간, 피그(pig), 및 조류의 H1N1 바이러스로부터의 유전자의 재편성(reassortment)의 결과로서 예기치 않은 인플루엔자 범유행(pandemic)을 야기하였다. 고병원성 조류 H5N1 바이러스주의 계속 진행 중인 순환, 및 중국에 격리되어 있고 40% 사망률을 갖는 심각한 호흡기 질병 - 이는 잠재적으로 인간-대-인간 전염에 대해 적응될 수 있음 - 과 관련된 조류 기원의 신종 재편성체인 H7N9 바이러스의 최근의 출현과 함께, 이러한 과거의 범유행은 신종 인플루엔자 바이러스주에 대한 전세계 인구의 취약성을 강조하였다. 백신화가 인플루엔자 감염을 제어하기 위한 주요 예방적 전략을 유지하여 신종 백신이 입수가능하게 되기 전에 그 기간을 이어주고 심각한 인플루엔자 사례를 치료할 뿐만 아니라, 바이러스 내성의 문제에 대응하기도 하지만, 항-인플루엔자 약물의 더 넓은 선택이 요구되고 있다. 따라서, 신규한 인플루엔자 항바이러스제의 개발은 다시 높은 우선도 및 충족되지 않은 의학적 필요성을 갖게 되었다.

본 발명은 바이러스성 인플루엔자 감염의 또는 감염에 대한 치료에 사용될 수 있는 화학식 I의 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체에 관한 것이다:

[화학식 I]

(상기 식에서,

X는 N 또는 C이며, N 및 C는 -CN, -CF₃, -C_1-3 알킬-N-C(O)-C_1-3 알킬, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH-C_1-3 알킬, -C(O)N-(디알킬) 또는 -CH₂-NC(O)-CH₃에 의해 선택적으로 치환되고;

R₁은 H 또는 CH₃이고;

R₂는 H 또는 NH₂이고;

R₃은 카르복실산에 의해 치환된 C_1-8 알킬이거나; 또는

카르복실산, -N-C_{1- 3}알킬설폰, 또는 C_1-6 알킬에 의해 선택적으로 치환된 -N-C(O)-C_3-6헤테로사이클에 의해 치환된 C_3-8 사이클로알킬이거나; 또는

-N-C(O)-C_3-6헤테로사이클에 의해 치환된 C_3-6 헤테로사이클임).

바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물은, R₁ 및 R₂가 둘 모두 H인 화학식 I에 따른 화합물이다.

본 발명에 따른 바람직한 화합물은 구조식

또는

를 갖는다.

또한, 본 발명의 일부는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 약제학적 조성물은 또한 추가 치료제, 예컨대 또 다른 항바이러스제 또는 인플루엔자 백신, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.

또한, 약제로서 사용하기 위한, 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체, 또는 약제학적 조성물이 본 발명에 속한다.

추가적으로, 본 발명은 인플루엔자의 치료에 사용하기 위한, 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체, 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 일부는 생물학적 샘플 또는 환자에서 인플루엔자 바이러스(들)의 복제를 억제하기 위한 하기 구조식 I로 나타낸 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체의 용도이다.

[화학식 I]

(상기 식에서,

X는 N 또는 C이며, N 및 C는 -CN, -CF₃, -C_1-3 알킬-N-C(O)-C_1-3 알킬, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH-C_1-3 알킬, -C(O)N-(디알킬) 또는 -CH₂-NC(O)-CH₃에 의해 선택적으로 치환되고;

R₁은 H 또는 CH₃이고;

R₂는 H 또는 NH₂이고;

R₃은 카르복실산에 의해 치환된 C_1-8 알킬이거나; 또는

카르복실산, -N-C_{1- 3}알킬설폰, 또는 C_1-6 알킬에 의해 선택적으로 치환된 -N-C(O)-C_3-6헤테로사이클에 의해 치환된 C_3-8 사이클로알킬이거나; 또는

-N-C(O)-C_3-6헤테로사이클에 의해 치환된 C_3-6 헤테로사이클임).

상기 용도는 또한 추가 치료제의 병용-투여를 포함할 수 있으며, 상기 추가 치료제는 항바이러스제 또는 인플루엔자 백신, 또는 둘 모두로부터 선택된다.

용어 "알킬"은 지정된 개수의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 지방족 탄화수소를 지칭한다.

용어 "사이클로알킬"은 지정된 개수의 탄소 원자를 함유하는 카보사이클릭 고리를 지칭한다.

용어 "헤테로사이클"은 N, O 또는 S로부터, 특히 N 및 O로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 포화 또는 부분 포화된 분자를 지칭한다. 상기 헤테로사이클은 4, 5, 6 또는 7개의 고리 원자를 가질 수 있다.

화학식 I의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 이의 산 부가 염 및 염기 염을 포함한다. 적합한 산 부가 염은 비독성 염을 형성하는 산으로부터 형성된다. 적합한 염기 염은 비독성 염을 형성하는 염기로부터 형성된다.

본 발명의 화합물은 또한 비용매화된 형태 및 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "용매화물"은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 용매 분자, 예를 들어 에탄올을 포함하는 분자 복합체를 기술하기 위해 사용된다.

용어 "다형체"는, 본 발명의 화합물이 하나 초과의 형태 또는 결정 구조로 존재할 수 있음을 지칭한다.

본 발명의 화합물은 결정질 또는 비정질 생성물로서 투여될 수 있다. 이는 침전, 결정화, 냉동 건조, 분무 건조, 또는 증발 건조와 같은 방법에 의해, 예를 들어 고체 조각(solid plug), 분말, 또는 필름으로서 수득될 수 있다. 이는 단독으로 투여되거나, 또는 본 발명의 하나 이상의 다른 화합물과 병용하거나 하나 이상의 다른 약물과 병용하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 이는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 회합하여 제형으로서 투여될 것이다. 본 명세서에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 기술하기 위해 사용된다. 부형제의 선택은 특정 투여 방식, 용해성 및 안정성에 미치는 부형제의 영향, 및 투여형의 성질과 같은 인자들에 대체로 좌우된다.

본 발명의 화합물 또는 이의 임의의 하위그룹은 투여 목적을 위하여 다양한 약제학적 형태로 제형화될 수 있다. 적절한 조성물로서는, 전신 투여 약물에 통상 사용되는 모든 조성물이 언급될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위하여, 활성 성분으로서, 선택적으로 부가 염 형태인 특정 화합물의 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 친밀한 혼화물(admixture) 상태로 배합하며, 이러한 담체는 투여에 요구되는 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 바람직하게는, 예를 들어 경구, 직장, 또는 경피 투여에 적합한 단일 투여형(unitary dosage form)이다. 예를 들어, 경구 투여형의 조성물을 제조하는 데 있어서는, 통상의 약제학적 매체 중 임의의 것이 사용될 수 있는데, 예를 들어, 현탁액, 시럽, 엘릭서(elixir), 에멀젼, 및 용액과 같은 경구 액체 제제의 경우에는 물, 글리콜, 오일, 알코올 등과 같은 약제학적 매체가 사용되거나; 또는 분말, 환제, 캡슐, 및 정제의 경우에는 고체 담체, 예컨대 전분, 당, 카올린, 희석제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 약제학적 매체가 사용된다. 투여에 있어서의 용이성 때문에, 정제 및 캡슐이 가장 유리한 경구 투여 단위형을 나타내며, 이 경우에 고체 약제학적 담체가 명백히 사용된다. 또한, 사용 직전에 액체 형태로 변환될 수 있는 고체 형태 제제가 포함된다. 경피 투여에 적합한 조성물에서, 담체는 선택적으로 침투 향상제 및/또는 적합한 습윤제를 포함하는데, 이들은 선택적으로 미소한 비율로 임의의 성질의 적합한 첨가제와 배합되며, 이러한 첨가제는 피부에 대해 상당한 유해 영향을 미치지 않는다. 상기 첨가제는 피부에 대한 투여를 촉진시킬 수 있고/있거나 원하는 조성물을 제조하는 데 도움이 될 수 있다. 이들 조성물은 다양한 방법으로, 예를 들어 경진피(transdermal) 패치로서, 스폿-온(spot-on)으로서, 연고로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 흡입 또는 취입(insufflation)을 통해 투여될 수 있는데, 이는 이러한 방식을 통한 투여를 위해 당업계에 사용되는 방법 및 제형에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 일반적으로 본 발명의 화합물은 용액, 현탁액 또는 건조 분말의 형태로 폐에 투여될 수 있다.

투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여, 상기 언급된 약제학적 조성물을 단위 투여형(unit dosage form)으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단위 투여형은 단일 투여량(unitary dosage)으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위들을 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 회합하여 원하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유한다. 그러한 단위 투여형의 예는 정제(스코어링(scored) 또는 코팅(coated) 정제를 포함함), 캡슐, 환제, 분말 패킷, 웨이퍼, 좌제, 주사 용액 또는 현탁액 등, 및 이들의 분리된 다회분(segregated multiple)이다.

감염성 질병의 치료에 관한 숙련자는 이후에 제출되는 검사 결과로부터 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로는, 유효 일일량이 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg 체중, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 체중일 것으로 고려된다. 필요한 용량을 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 하위용량으로 하루 종일 적절한 간격으로 투여하는 것이 적절할 수 있다. 상기 하위용량은 단위 투여형으로 제형화될 수 있는데, 이러한 단위 투여형은, 예를 들어 단위 투여형당 1 내지 1000 mg, 특히 5 내지 200 mg의 활성 성분을 함유할 수 있다.

정확한 투여량 및 투여 빈도는 사용되는 특정 화학식 I의 화합물, 치료되는 특정 질환, 치료되는 질환의 중증도, 특정 환자의 연령, 체중 및 일반적인 신체 상태뿐만 아니라 개인이 복용 중일 수 있는 다른 투약제에도 좌우되는데, 이는 당업자에게 잘 알려진 바와 같다. 더욱이, 유효량은 치료되는 대상체의 반응에 따라 그리고/또는 본 발명의 화합물을 처방하는 의사의 평가에 따라 감소 또는 증가될 수 있음이 명백하다. 따라서, 상기 언급된 유효량 범위는 단지 가이드라인이며, 본 발명의 범주 또는 용도를 전혀 제한하고자 하지 않는다.

실시예

화학식 I의 화합물의 제조

반응도식 1. 화합물 7의 제조

반응도식 1. i) Br₂, DMF, rt, 8h, ii) NaH, TsCl, THF, iii) 비스(피나콜레이토)디보론, Pd(dppf)Cl₂, KOAc, 1,4-디옥산, 80℃, 16h, iv) EtOH/THF, DIPEA, v) Na₂CO₃, 테트라키스(Tetrakis), 잔트포스(Xantphos), 1,4-디옥산, 전자레인지(microwave) 150℃, 15 min, vi) NaOCH₃, CH₃OH

중간체 1의 제조

DMF(350 mL) 중 7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(11.5g, 73.92 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 DMF(50 mL) 중 브롬(11.8 g, 73.84 mmol)을 첨가하였다. 냉각조(cooling bath)를 제거하고, 반응을 20℃에서 8시간 동안 교반하고, 이어서 반응 혼합물을 빙수에 붓고 Na₂CO₃로 염기성화하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 10% aq. Na₂S₂O₃, 염수로 세척하고, MgSO₄로 건조시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켜, 황색 고체로서 5-브로모-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘, 1을 수득하였으며, 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 7.84 (s, 1 H), 8.84 (s, 1 H), 8.92 (s, 1 H), 12.57 (br, 1 H).

중간체 2의 제조

THF 중 5-브로모-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(12.8 g, 55.11 mmol)의 교반된 용액에 질소 하에서 0℃에서 NaH(4.48 g, 112.01 mmol)를 일부씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 5℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 p-톨루엔설포닐 클로라이드(11.6 g, 60.85 mmol)를 일부씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃까지 가온되게 하고, 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 얼음 및 1 M aq. HCl의 혼합물에 부었다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO₄로 건조시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트로부터의 결정화에 의해 정제하여, 백색 고체로서 5-브로모-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘, 2를 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 2.36 (s, 3 H), 7.47 (d, J=8.0 Hz, 2 H), 8.06 (d, J=8.0 Hz, 2 H), 8.31 (s, 1 H), 9.03 (s, 1 H), 9.06 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 351.8; Rt: 1.16분, 방법 D.

중간체 3의 제조

1,4-디옥산(170 mL, 질소로 탈기됨) 중 5-브로모-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(10 g, 28.39 mmol), 비스(피나콜레이토)디보론(14.42 g, 56.79 mmol), 포타슘 아세테이트(8.36 g, 85.18 mmol), Pd(dppf)Cl₂(1 g, 1.37 mmol)의 혼합물을 환류 응축기를 구비한 500 mL 둥근바닥 플라스크에서 질소 하에서 80℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 패킹된 셀라이트(packed Celite)를 통해 여과하고, 고체를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 헵탄부터 에틸 아세테이트까지의 구배를 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 감압 하에서 농축시켜 5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-7-토실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘, 3을 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ ppm 1.33 (s, 12 H) 2.37 (s, 3 H) 7.47 (d, J=8.36 Hz, 2 H) 8.11 (d, J=8.58 Hz, 2 H) 8.14 (s, 1 H) 9.00 (s, 1 H) 9.10 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 318.1; Rt: 0.74분, 방법 A.

중간체 5의 제조

2,4-디클로로-5-플루오로-피리미딘(2.76 g, 16.55 mmol)의 용액을 에탄올(70 mL) 및 THF(70 mL) 중에서 실온에서 교반하였다. (+/-)-시스-N-(3-아미노사이클로헥실)피롤리딘-1-카르복스아미드(4.1 g, 16.55 mmol) 및 DIPEA(8.56 mL, 49.64 mmol)를 반응 혼합물에 적가하고, 70℃에서 1시간 동안 그리고 이어서 주위 온도에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물의 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 물 중에 재구성하고, DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 물로 세척하고, MgSO₄로 건조시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피(구배: CH₂Cl₂부터 CH₂Cl₂/CH₃OH: 90/10까지)에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 풀링(pooling)하고 증발 건조시켜, 백색 고체로서 5를 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 342.3; Rt: 0.75분, 방법 A.

중간체 4의 제조

THF(250 mL) 중 (+/-)-시스-3-(boc-아미노)사이클로헥산카르복실산(9.51 g, 39.09 mmol), 디페닐 포스포릴 아지드(12.61 mL, 58.63 mmol) 및 Et₃N(7.61 mL, 54.72 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 환류하였다. 용액을 실온에 도달하게 하고, 이어서 피롤리딘(9.81 mL, 117.26 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 환류하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 침전물을 여과에 의해 단리하고 THF로 세척하고, 진공 중에서 건조시켜, 백색 분말로서 t-부틸 (+/-)-(시스-3-(피롤리딘-1-카르복스아미도)사이클로헥실)카르바메이트, 4a를 수득하였다.

HCl(1,4-디옥산 중 4 M, 344 mL) 중 (+/-)-t-부틸 (시스-3-(피롤리딘-1-카르복스아미도)사이클로헥실)카르바메이트(23.77 g, 76.33 mmol)의 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용액을 감압 하에서 농축시키고, 이어서 진공 중에서 건조시켜, 백색 고체로서 (+/-)-N-((시스)-3-아미노사이클로헥실)피롤리딘-1-카르복스아미드, 4를 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 212.2; Rt: 1.06분, 방법 C.

7의 제조

3(799 mg, 2 mmol), 5(684 mg, 2 mmol) 및 Na₂CO₃(3 mL, 2 M, 6 mmol)의 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온에서 1,4-디옥산(10 mL) 중에서 교반하였다. 이어서, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(116 mg, 0.1 mmol) 및 잔트포스(58 mg, 0.1 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 탈기하였다. 반응물을 전자레인지에서 150℃에서 15분 동안 가열하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 NaOCH₃(100 mL, CH₃OH 중 0.5 M)와 1시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 물 중에서 교반하고, 산성 산으로 중화시켰다. 용액을 CH₂Cl₂로 3회 추출하고, MgSO₄로 건조시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 CH₂Cl₂/CH₃OH: 98/2부터 90/10까지의 구배를 사용하여 실리카 상에서 정제하였다. 최상의 분획을 풀링하고, 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성물을 아세토니트릴로부터 재결정화하였다. 황백색(off-white) 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공 중에서 건조시켜 7을 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.06 - 1.52 (m, 4 H), 1.67 - 1.89 (m, 6 H), 1.97 (d, J=11.2 Hz, 1 H), 2.06 - 2.18 (m, 1 H), 3.11 - 3.23 (m, 5 H), 3.55 - 3.75 (m, 1 H), 4.02 - 4.27 (m, 1 H), 5.82 (d, J=7.9 Hz, 1 H), 7.54 (d, J=7.7 Hz, 1 H), 8.10 - 8.22 (m, 2 H), 8.80 (s, 1 H), 9.59 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 425.4; Rt: 1.42분, 방법 B.

중간체 8의 제조

THF(40 mL) 중 2,6-디클로로-5-플루오로-3-피리딘카르보니트릴(4.77 g, 25 mmol)의 용액을 실온에서 교반하였으며, 이 동안에 ACN(20 mL) 중 4(6.19 g, 25 mmol) 및 DIPEA(8.62 mL, 50 mmol)의 혼합물을 적가하였다. 반응을 주위 온도에서 2일 동안 교반되게 하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 물질(crude)을 디이소프로필에테르/에틸아세테이트(1/1) 중에 용해시키고 물로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 디이소프로필에테르 중에 분쇄시키고 진공 중에서 건조시켜, 백색 고체, (+/-)-N-((시스)-3-((6-클로로-5-시아노-3-플루오로피리딘-2-일)아미노)사이클로헥실)피롤리딘-1-카르복스아미드, 8을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 366.1; Rt: 0.88분, 방법 A.

9의 제조

후벽 유리 튜브(thick-wall glass tube) 내로 DME(15 mL) 및 물(5 mL) 중 3(500 mg, 1.25 mmol), Pd(PPh₃)₄(145 mg, 0.125 mmol), K₂CO₃(346 mg, 2.51 mmol) 및 8(481 mg, 1.32 mmol)의 혼합물을 넣고, 100℃까지 가열하고 16시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 잔류물을 DCM 중에서 교반하고, 여과하고, 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피(제1 구배: 헵탄-에틸 아세테이트; 제2 구배: DCM-DCM/CH₃OH 100부터 90/10까지)에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켜, (+/-)- N-((시스)-3-((5-시아노-3-플루오로-6-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)피리딘-2-일)아미노)사이클로헥실)피롤리딘-1-카르복스아미드, 9를 수득하였다.

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.15 - 1.31 (m, 2 H) 1.34 - 1.44 (m, 1 H) 1.48 (q, J=11.93 Hz, 1 H) 1.75 - 1.78 (m, 4 H) 1.78 - 1.84 (m, 2 H) 2.00 (d, J=11.30 Hz, 1 H) 2.03 - 2.06 (m, 1 H) 3.16 - 3.19 (m, 4 H) 3.53 - 3.56 (m, 1 H) 4.12 - 4.15 (m, 1 H) 5.84 (d, J=7.92 Hz, 1 H) 7.74 (d, J=7.04 Hz, 1 H) 7.87 (d, J=11.30 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 8.85 (s, 1 H) 9.56 (s, 1 H) 12.66 (br. s., 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 449.2; Rt: 1.55분, 방법 B.

중간체 10의 제조

CH₂Cl₂(100 mL) 중 (+/-)-tert-부틸 ((시스)-3-아미노사이클로헥실)카르바메이트(5 g, 23.3 mmol) 및 DMAP(7.1 g, 58.3 mmol)의 혼합물을 주위 온도에서 교반하고, 이어서 1-메틸-1H-이미다졸-4-카르복실산(2.9 g, 23.3 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, EDC(6.7 g, 35 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 시트르산(5% 수용액)으로 세척하고, 유기 층을 회수하고, 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하여 (+/-)-t-부틸 ((시스)-3-(1-메틸-1H-이미다졸-4-카르복스아미도)사이클로헥실)카르바메이트, 10a를 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 323.5; Rt: 0.75분, 방법 A. 중간체 4를 제조하는 방법에서와 같이, boc 기의 제거를 1,4-디옥산 중 HCl을 통해 진행하여 (+/-)-N-((시스)-3-아미노사이클로헥실)-1-메틸-1H-이미다졸-4-카르복스아미드, 10을 수득하였다.

중간체 11의 제조

(+/-)-N-[(시스)-3-아미노사이클로헥실]-1-메틸-이미다졸-4-카르복스아미드(4.64 g, 15.7 mmol) 및 2,6-디클로로-5-플루오로-3-피리딘카르보니트릴(3 g, 15.7 mmol)의 용액을 ACN(50 mL) 중에서 실온에서 교반하였다. DIPEA(10 mL, 54 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. CH₂Cl₂를 첨가하고, 여과를 통해 백색 침전물로서 (+/-)-N-((시스)-3-((6-클로로-5-시아노-3-플루오로피리딘-2-일)아미노)사이클로헥실)-1-메틸-1H-이미다졸-4-카르복스아미드, 11을 단리하고, 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 377.1; Rt: 1.58분, 방법 B.

12의 제조

20 mL 후벽 유리 바이알 내로 3(0.25 g, 0.63 mmol), Pd(PPh₃)₄(72 mg, 0.0626 mmol), K₂CO₃(173 mg, 1.25 mmol), DME(5 mL), 물(1.5 mL), 및 11(0.25 g, 0.63 mmol)을 넣었다. 바이알을 밀봉하고, 유조(oil bath)에서 100℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 진한 HCl의 첨가를 통해 pH 6이 되게 하였다. DMSO를 첨가하고, 용액을 여과하였다. 조 물질을 분취용 HPLC(RP SunFire Prep C18 OBD-10 μm, 30 x 150 mm, 이동상 0.25% aq. 탄산암모늄부터 CH₃OH까지)에 의해 정제하였다. 최상의 분획을 풀링하고, 용매를 감압 하에서 제거하여, 백색 고체로서 12를 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.18 - 1.54 (m, 3 H), 1.62 (q, J=11.7 Hz, 1 H), 1.84 (d, J=10.8 Hz, 2 H), 2.06 (t, J=14.2 Hz, 2 H), 3.67 (s, 3 H), 3.85 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 4.20 (dd, J=7.8, 3.6 Hz, 1 H), 7.59 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 7.63 (d, J=0.9 Hz, 1 H), 7.68 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 7.77 (d, J=7.0 Hz, 1 H), 7.87 (d, J=11.2 Hz, 1 H), 8.33 (d, J=2.4 Hz, 1 H), 8.86 (s, 1 H), 9.59 (s, 1 H), 12.65 (br. s., 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 460.1; Rt: 0.71분, 방법 A.

중간체 13의 제조

10(5.3 g, 18 mmol) 및 2,4-디클로로-5-플루오로-피리미딘(3 g, 18 mmol)의 용액을 ACN(50 mL) 중에서 실온에서 교반하였다. DIPEA(10 mL, 54 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 조 물질을 헵탄부터 에틸 아세테이트까지의 구배를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 최상의 분획을 풀링하고, 용매를 제거하여, 황백색 고체로서 13을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 353.1; Rt: 1.34분, 방법 B.

14의 제조

중간체 3(0.3 g, 0.75 mmol)을 화합물 12에 대해 기재된 것과 동일한 스즈키(Suzuki) 반응 조건 하에서 13(0.265 g, 0.75 mmol)과 반응시켰다. 조 물질을 분취용 HPLC(고정상: RP Vydac Denali C18 - 10 μm, 200 g, 5 cm), 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃OH)에 의해 정제하고, 최상의 분획을 풀링하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 14를 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.27 - 1.44 (m, 2 H) 1.54 (m, J=11.70, 11.70, 11.70 Hz, 2 H) 1.84 (m, J=11.00 Hz, 2 H) 2.00 (m, J=12.30 Hz, 1 H) 2.14 (m, J=11.90 Hz, 1 H) 3.67 (s, 3 H) 3.89 - 4.04 (m, 1 H) 4.21 (m, J=7.80, 3.40 Hz, 1 H) 7.53 - 7.71 (m, 4 H) 8.10 - 8.26 (m, 2 H) 8.81 (s, 1 H) 9.62 (s, 1 H) 12.47 (br. s., 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 436.2; Rt: 1.27분, 방법 B.

중간체 15의 제조

THF/CH₃OH(1/1)의 혼합물(50 mL) 중 2-브로모-3,5,6-트리플루오로피리딘(3 g, 14.153 mmol), 10(3.25 g, 18.87 mmol) 및 DIPEA(3.94 mL, 28.31 mmol)의 용액을 압력 용기에서 16시간 동안 95℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 가열하면서 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 농축시켰다. 조 물질을 헵탄부터 에틸 아세테이트까지의 구배를 사용하여 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켜, 고체로서 15를 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 414.1; Rt: 0.91분, 방법 A.

16의 제조

중간체 3(0.20 g, 0.50 mmol)을 화합물 7의 형성에 대해 기재된 것과 동일한 스즈키 반응 조건 하에서 15(0.207 g, 0.50 mmol)와 반응시켰다. 조 물질을 초음파조(ultrasonic bath)에서 1시간 동안 NaOCH₃(2.8 mL, CH₃OH 중 0.5 M)와 추가로 반응시키고, 이어서 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 물질을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 1 M HCl로 중화시키고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고(MgSO₄), 고체를 감압 하에서 제거하여 고체를 수득하였다. 조 물질을 DCM부터 DCM/CH₃OH까지 100부터 90/10까지의 구배를 사용하여 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켜 16을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.17 - 1.42 (m, 2 H) 1.44 - 1.61 (m, 2 H) 1.76 - 1.93 (m, 2 H) 2.00 - 2.21 (m, 2 H) 3.65 (s, 3 H) 3.78 - 3.95 (m, 1 H) 3.95 - 4.17 (m, 1 H) 6.46 - 6.65 (m, 1 H) 7.50 - 7.79 (m, 4 H) 7.99 (d, J=2.42 Hz, 1 H) 8.71 - 8.89 (m, 1 H) 9.72 (s, 1 H) 12.46 (br. s., 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 453.0; Rt: 0.72분, 방법 A.

(+/-)-3-아미노-4,4-디메틸펜타네이트의 제조

메탄올(20 mL) 중 메틸 4,4-디메틸-3-옥소펜타노에이트(2 mL, 12.5 mmol)의 용액에 암모늄 아세테이트(6.75 g, 87.6 mmol) 및 NaCNBH₃(944 mg, 15.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물의 첨가에 의해 켄칭(quenching)하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 재구성하고, 유기 층을 NaOH(aq., 1 M)로 세척하고, 이어서 MgSO₄로 건조시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하여, 무색 액체로서 (+/-)-3-아미노-4,4-디메틸펜타네이트를 수득하였으며, 이것을 추가의 정제 또는 특성화 없이 사용하였다.

중간체 17의 제조

DMA(5 mL) 중 2,6-디클로로-3-플루오로-5-(트리플루오로메틸)피리딘(1 g, 4.15 mmol) 및 (+/-)-3-아미노-4,4-디메틸펜타네이트(974 mg, 4.98 mmol)의 용액에 DIPEA(2.86 mL, 16.58 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 전자레인지에서 140℃에서 45분 동안 밀봉된 튜브에서 가열하였다. 반응 혼합물을 빙수 중에서 켄칭하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 생성물을 등용매 디클로로메탄을 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 제거하여 17을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 357.2; Rt: 0.92분, 방법 A.

18의 제조

중간체 3(0.35 g, 0.88 mmol)을 화합물 7의 형성에 대해 기재된 것과 동일한 스즈키 반응 조건 하에서 17(0.36 g, 1.02 mmol)과 반응시켰다. 조 물질을 초음파조에서 1시간 동안 NaOCH₃(1.35 mL, CH₃OH 중 0.5 M)에 첨가하였다. 용액을 CH₃OH(10 mL) 및 물(10 mL)로 희석시켰다. LiOH(16 mg, 0.67 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 반응을 pH=4가 될 때까지 진한 HCl로 처리하고, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켰다. 조 물질을 분취용 HPLC(고정상: RP Vydac Denali C18 - 10 μm, 200 g, 5 cm, 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃OH)에 의해 정제하였다. 최상의 분획을 풀링하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 18을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 0.76 - 0.93 (m, 9 H) 2.54 - 2.61 (m, 2 H) 4.60 - 4.77 (m, 1 H) 7.35 (d, J=8.58 Hz, 1 H) 7.64 - 7.81 (m, 1 H) 7.64 - 7.81 (m, 1 H) 8.82 (s, 1 H) 9.51 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 426.2; Rt: 1.42분, 방법 B.

19의 제조

2-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(426 mg, 3.2 mmol)을 빙조에서 냉각된 DMF(54 mL) 중에 용해시키고, 질소 하에서 일부씩의 N-브로모석신이미드(569 mg, 3.2 mmol)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 20분 동안 교반하여, 실온까지 가온되게 하고, 10분 동안 교반하였다. 반응을 CH₃OH(5 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 헵탄부터 에틸 아세테이트까지의 구배를 사용하여 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 5-브로모-2-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘, 19를 수득하였다.

중간체 20의 제조

(+/-)-3-아미노-4,4-디메틸펜타네이트(3.09 g, 13.32 mmol) 및 2,6-디클로로-5-플루오로니코티노니트릴(3 g, 15.71 mmol)의 용액을 아세토니트릴/THF/EtOH(50/25/25 mL)의 혼합물 중에서 실온에서 교반하였다. DIPEA(5.414 mL, 31.42 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 조 물질을 헵탄부터 에틸 아세테이트까지의 구배를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 정제하여, 고체로서 20을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 314.1; Rt: 1.13분, 방법 A.

21의 제조

중간체 3(0.35 g, 0.88 mmol)을 화합물 7의 형성에 대해 기재된 것과 동일한 스즈키 반응 조건 하에서 17(0.36 g, 1.16 mmol)과 반응시켰다. 조 물질을 초음파조에서 1시간 동안 NaOCH₃(4 mL, CH₃OH 중 0.5 M)에 첨가하였다. 용액을 CH₃OH(10 mL) 및 물(10 mL)로 희석시켰다. LiOH(16 mg, 0.67 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 조 물질을 분취용 HPLC(고정상: RP Vydac Denali C18 - 10 μm, 200 g, 5 cm, 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃OH)에 의해 정제하였다. 최상의 분획을 풀링하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 21을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 0.87 - 0.95 (m, 9 H) 2.54 - 2.62 (m, 2 H) 4.81 (d, J=5.28 Hz, 1 H) 7.83 (d, J=11.22 Hz, 1 H) 7.87 (d, J=9.02 Hz, 1 H) 8.29 (s, 1 H) 8.85 (s, 1 H) 9.82 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 383.2; Rt: 0.66분, 방법 A.

22의 제조

THF/CH₃OH의 혼합물(1/1, 50 mL) 중 2-브로모-3,5,6-트리플루오로피리딘(1.5 g, 7.08 mmol), 4(1645 mg, 7.78 mmol) 및 Et₃N(1.967 mL, 14.15 mmol)의 용액을 압력 용기에서 2일 동안 85℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켰다. 조 물질을 헵탄부터 에틸 아세테이트까지의 구배를 사용하여 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켜 중간체 22를 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 403.1; Rt: 1.90분, 방법 B.

23의 제조

중간체 3(0.40 g, 1.0 mmol)을 화합물 7의 형성에 대해 기재된 것과 동일한 스즈키 반응 조건 하에서 22(0.33 g, 0.82 mmol)과 반응시켰다. 조 물질을 초음파조에서 1시간 동안 NaOCH₃(1.5 mL, CH₃OH 중 0.5 M)에 첨가하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 물질을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, HCl(1 M aq.)로 중화시키고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 고체를 실리카 상에서의 실리카 플래시 컬럼 크로마토그래피(DCM-DCM/CH₃OH(100부터 90/10까지))에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켜 (시스)-메틸 3-((2-클로로-5-플루오로피리미딘-4-일)아미노)바이사이클[2.2.2]옥탄-2-카르복실레이트, 23을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.11 - 1.33 (m, 2 H) 1.35 - 1.51 (m, 2 H) 1.71 - 1.92 (m, 2 H) 1.71 - 1.92 (m, 4 H) 2.10 (d, J=11.22 Hz, 2 H) 3.18 (t, J=6.60 Hz, 4 H) 3.59 (m, J=7.80, 3.80, 3.80 Hz, 1 H) 3.93 - 4.11 (m, 1 H) 5.81 (d, J=7.92 Hz, 1 H) 6.51 (d, J=7.26 Hz, 1 H) 7.68 (t, J=10.45 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=2.20 Hz, 1 H) 8.82 (s, 1 H) 9.70 (s, 1 H) 12.48 (br. s., 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 441.0; Rt: 1.64분, 방법 B.

24의 제조

24a(283 mg, 0.90 mmol)(제조를 위해 문헌[J. Med. Chem. 2014, DOI:　10.1021/jm5007275] 참조)를 7의 형성에서 기재된 바와 동일한 조건 하에서 중간체 3(400 mg, 1.00 mmol)과 반응시켰다. 조 혼합물에 바이알에서 CH₃CN(5 mL) 중 KOAc(559 mg, 5.69 mmol)를 첨가하고, 이를 밀봉하고 전자레인지에서 120℃에서 10분 동안 가열하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 화합물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, pH 5가 될 때까지 진한 HCl로 처리하였다. 화합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 물질을 분취용 HPLC(고정상: RP Vydac Denali C18 - 10 μm, 200 g, 5 cm), 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, CH₃OH)에 의해 정제하고, 원하는 분획을 수집하고; 용매를 감압 하에서 제거하여, 고체로서 24를 수득하였다. ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.22 - 1.88 (m, 13 H) 1.92 (br. s., 1 H) 1.94 (br. s., 1 H) 1.99 (br. s., 1 H) 2.01 (br. s., 1 H) 2.81 (dd, J=10.27, 2.20 Hz, 1 H) 2.84 (d, J=7.04 Hz, 1 H) 4.34 - 4.44 (m, 1 H) 4.71 (t, J=6.82 Hz, 1 H) 7.61 (d, J=6.75 Hz, 1 H) 8.11 (d, J=3.81 Hz, 1 H) 8.12 (s, 1 H) 8.14 (s, 1 H) 8.18 (d, J=3.81 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 8.80 (s, 1 H) 8.81 (s, 1 H) 9.64 (s, 1 H) 9.68 (s, 1 H) 10.20 (br. s., 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 383.2; Rt: 0.55분, 방법 A.

중간체 26의 제조

1 L 둥근바닥 플라스크에서 1,4-디옥산(200 mL) 중 (+/-)-시스-3-아미노사이클로헥산카르복실산 (25 g, 174.6 mmol)의 현탁액에 1 N NaOH(262 mL, 1 M aq., 262 mmol)를 첨가하였다. 15분 동안 교반한 후에, 혼합물은 투명 용액이 되었으며, boc-무수물(49.54 g, 226.98 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물 부피를 감압 하에서 감소시키고, 반응 혼합물을 1 M HCl로 산성(pH 5)으로 만들었다. 형성된 침전물을 여과에 의해 단리하고, 물로 세척하고, 진공 하에서 건조시켜, 백색 고체로서 25를 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 0.93 - 1.31 (m, 4 H), 1.37 (s, 9 H), 1.64 - 1.75 (m, 2 H), 1.79 (d, J=12.3 Hz, 1 H), 1.95 (d, J=12.3 Hz, 1 H), 2.15 - 2.30 (m, 1 H), 3.12 - 3.21 (m, 2 H), 6.75 (d, J=7.9 Hz, 1 H).

트리에틸아민(35 mL, 251.6 mmol) 및 디페닐포스포릴 아지드(39.056 mL, 181.09 mmol)를 톨루엔(600 mL) 중 (+/-)-시스-3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]사이클로헥산카르복실산(38.99 g, 160.25 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 벤질 알코올(33.17 mL, 320.51 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 100℃까지 가열하였다. 12시간 후에, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 생성된 혼합물을 염수로 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄), 진공 중에서 농축시켜, 조 고체 26을 수득하였다. LC-MS ES^- m/z = 347.1; Rt: 0.66분, 방법 B.

중간체 27의 제조

14를 제조하는 방법에 따라 화합물 27을 제조하였다. ¹H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.06 - 1.33 (m, 4 H), 1.61 (d, J=13.4 Hz, 1 H), 1.78 (s, 1 H), 1.87 - 1.98 (m, 1 H), 2.08 (d, J=12.3 Hz, 1 H), 2.21 (d, J=10.3 Hz, 1 H), 2.38 (s, 3 H), 2.55 (d, J=11.4 Hz, 1 H), 3.65 - 3.82 (m, 1 H), 4.16 - 4.31 (m, 1 H), 4.74 (br. s., 1 H), 5.00 (dd, J=7.7, 1.8 Hz, 1 H), 5.05 - 5.16 (m, 2 H), 7.31 (d, J=8.1 Hz, 6 H), 8.08 (d, J=3.1 Hz, 1 H), 8.16 (d, J=8.4 Hz, 2 H), 8.45 (s, 1 H), 9.05 (s, 1 H).

28의 제조

자석 교반 바를 구비한 20 mL 유리 바이알 내로 중간체 27(500 mg, 0.81 mmol), CH₃OH(10 mL), 및 KOAc(250 mg, 2.55 mmol)를 넣었다. 바이알을 밀봉하고, 전자레인지에서 15분 동안 150℃까지 가열하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 조 생성물을 분취용 HPLC(고정상: Uptisphere C18 ODB - 10 μm, 200 g, 5 cm, 이동상: 0.5% NH₄Ac 수용액 / 10% CH₃CN, CH₃CN)를 통해 정제하였다. 수집된 분획을 암모니아로 알칼리화하고, 감압 하에서 부피를 감소시키고, 침전물을 여과하고, 물로 세척하여 염을 제거하여 28을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.05 - 1.56 (m, 4 H), 1.75 - 1.91 (m, 2 H), 1.96 (d, J=10.3 Hz, 1 H), 2.14 (d, J=10.6 Hz, 1 H), 3.45 - 3.62 (m, 1 H), 4.05 - 4.26 (m, 1 H), 5.00 (s, 2 H), 7.15 - 7.44 (m, 6 H), 7.56 (d, J=7.7 Hz, 1 H), 8.10 - 8.26 (m, 2 H), 8.81 (s, 1 H), 9.61 (s, 1 H), 12.48 (br. s., 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 462.2; Rt: 1.70분, 방법 B.

일반적 방법 A. 화합물 27을 실온에서 TFA에 첨가하고, 2일 동안 교반되게 하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물에 aq. NaHCO₃ 및 CH₂Cl₂를 첨가하였다. 유기 층을 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하고, 이어서 실리카 겔을 통해 여과하였다. 이어서, 조 물질을 THF 또는 아세토니트릴 중에서 0℃ 내지 실온에서 유기 염기(Et₃N, 또는 DIPEA) 및 친전자체(산 클로라이드, 클로로포르메이트, 또는 이소시아네이트)와 혼합하였다. 반응물질이 카르복실산이라면, 극성 용매(예를 들어, DMF) 중에서 커플링제(예를 들어, HATU, EDC)를 사용하여 아미드 결합을 또한 형성할 수 있다. 이후에, 과량의 포타슘 t-부톡사이드를 첨가하고 이를 실온에서 1일 동안 교반함으로써 토실 기를 제거하였다. 생성물을 CH₂Cl₂부터 CH₂Cl₂ 중 10% CH₃OH까지의 구배를 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다.

중간체 29a의 제조

중간체 27(3 g, 4.873 mmol)이 담긴 반응 플라스크에, 실온에서 TFA(30 mL)를 첨가하였다. 생성된 용액을 주위 온도에서 2일 동안 교반되게 하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, NaHCO₃ 및 CH₂Cl₂를 첨가하였다. 유기 층을 농축시키고 건조시켰다. 유기 층을 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 화합물을 용리제(eluent)로서 디클로로메탄 및 메탄올을 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 29a를 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 482; Rt: 0.77분, 방법 C.

중간체 29b의 제조

THF(4 mL) 중 중간체 29a(100 mg, 0.208 mmol)가 담긴 반응 플라스크에 HBTU(285 mg, 0.75 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.131 mL, 0.75 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 불활성 분위기 하에서 실온에서 5분 동안 교반하였다. 피라졸로[1,5-a]피리미딘-5-카르복실산(41 mg, 0.25 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. THF를 감압 하에서 제거하고, 생성된 잔류물을 DCM 및 물로 추출하였다. 유기 층을 감압 하에서 농축시켜 29b를 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 627; Rt: 1.26분, 방법 C.

29의 제조

THF(4 mL) 중에 용해된 29b(130 mg, 0.207 mmol)가 담긴 반응 플라스크에 포타슘 tert-부톡사이드(1.04 mL, 1.04 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응을 NaHCO₃ 및 CH₂Cl₂로 켄칭하였다. 유기 층을 건조시키고(MgSO₄), 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과액의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 화합물을 용매로서 디클로로메탄 및 메탄올을 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 29를 수득하였다.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.18 - 2.09 (m, 8 H) 3.99 - 4.09 (m, 1 H) 4.25 (br s, 1 H) 6.90 (d, J=1.51 Hz, 1 H) 7.55 (d, J=7.29 Hz, 1 H) 8.17 (d, J=3.85 Hz, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 8.37 (d, J=2.20 Hz, 1 H) 8.80 (s, 1 H) 8.83 - 8.93 (m, 1 H) 9.25 (d, J=7.15 Hz, 1 H) 9.61 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 473; Rt: 2.16분, 방법 C.

42의 제조

100 mL 둥근바닥 플라스크 내로 2,6-디클로로-3-플루오로-5-(트리플루오로메틸)피리딘(2 g, 8.291 mmol), 42a(제조를 위해 문헌[J. Med. Chem. 2014, DOI : 10.1021/jm5007275] 참조, 1.822 g, 7.794 mmol), ACN(40 mL), 및 DIPEA(3.215 g, 24.874 mmol)를 넣었다. 생성된 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반되게 하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 조 물질을 헵탄부터 에틸 아세테이트까지의 구배를 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 최상의 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 42를 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 394.1; Rt: 1.37분, 방법 A.

43의 제조

3(400 mg, 0.98 mmol), 42(400 mg, 0.983 mmol), Pd(PPh₃)₄(116 mg, 0.1 mmol), 잔트포스(58 mg, 0.1 mmol), Na₂CO₃(2.8 mL, 2 M aq., 5.77 mmol), 및 1,4-디옥산(10 mL)의 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 150℃에서 10분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. DCM을 첨가하고, 이어서 혼합물을 실리카 플러그를 통해 여과하고, 5 부피의 DCM으로 플러싱하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. KOAc(200 mg) 및 에탄올(7 mL)을 첨가하고, 전자레인지에서 10분 동안 120℃까지 가열하였다. 잔류물을 헵탄부터 에틸 아세테이트까지의 구배를 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 최상의 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 43을 수득하였다.

44의 제조

100 mL 플라스크에서, 43(1.6 g, 2.533 mmol)을 60℃에서 1,4-디옥산(90 mL) 중에서 교반하였으며, 이 동안에 물(10 mL) 중 LiOH(606.6 mg, 25.33 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 환류되게 하고, 주위 온도에서 하룻밤 교반되게 하였다. 1,4-디옥산을 증발시키고, 잔류물을 20 mL의 에틸 아세테이트 중에 흡수시키고, 교반하고, 진한 HCl로 중화시켰다. 잔류물을 감압 하에서 농축시켰다. 분취용 HPLC(고정상: RP XBridge Prep C18 ODB- 5 μm, 30 x 250 mm, 이동상: 0.25% NH₄HCO₃ 수용액, 메탄올)를 통해 정제를 수행하였다. 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켰다. 메탄올을 첨가한 후에, 용액을 재차 농축시켜, 백색 고체로서 44를 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ ppm 1.27 - 1.45 (m, 4 H) 1.75 (m, 4 H) 1.78 - 1.86 (m, 1 H) 1.91 - 2.01 (m, 1 H) 2.74 (m, 1 H) 4.64 (m, 1 H) 7.42 (m, 1 H) 7.70 - 7.76 (m, 2 H) 8.82 (s, 1 H) 9.37 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 449; Rt: 1.58분, 방법 B.

46의 제조

7을 제조하는 방법에 따라 화합물 46을 제조하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 424.2; Rt: 1.41분, 방법 B.

48의 제조

분취용 SFC(고정상: Chiralcel Diacel OD 20 x 250 mm, 이동상: CO₂, 0.2% 이소프로필아민을 갖는 이소프로판올)를 통해 화합물 14를 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 48을 수득하였다.

50의 제조

3(4.39 g, 11 mmol), 2-클로로-5-플루오로-4-메틸설파닐-피리미딘(1.96 g, 11 mmol) 및 인산칼륨(7 g, 33 mmol)의 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온에서 물(44 mL) 및 Me-THF(132 mL) 중에서 교반하였다. 이어서, 잔트포스(629 mg, 1.32 mmol) 및 Pd₂(dba)₃(302.19 mg, 0.33 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 통한 질소 버블링에 의해 10분 동안 탈기를 행하였다. 반응물을 80℃까지 가열하고, 밀폐된 용기에서 이 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 1시간 동안 냉각되게 하고, 이어서 200 mL의 에틸 아세테이트 중에 재구성하고, 염수로 2회 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 용리제로서 디클로로메탄/메탄올(99/1)을 사용하여 실리카 상에서 정제하였다. 원하는 분획을 증발시키고, 잔류물을 아세토니트릴 중에서 결정화하였다. 결정을 여과에 의해 수집하고, 진공 중에서 건조시켰다(50). LC-MS ES⁺ m/z = 415; Rt: 2.00분, 방법 B.

51의 제조

메탄올(2 mL) 및 DCM(1.15 mL) 중 50(415.47 mg, 1 mmol)의 용액을 실온에서 교반하였다. m-CPBA(739.58 mg, 3 mmol)를 10분의 기간에 걸쳐 일부씩 첨가하고, 주위 온도에서 하룻밤 교반을 계속하였다. 혼합물을 30 mL의 DCM으로 희석시키고, 포화 중탄산나트륨 수용액으로 2회 그리고 물로 1회 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 디이소프로필에테르/아세토니트릴(20/1) 중에 분쇄시켰다. 황색 침전물을 여과에 의해 수집하고, 건조시켜 51을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 447; Rt: 1.59분, 방법 B.

일반적 방법 B. 화합물 51을 실온에서 1,4-디옥산에 첨가하였다. 이어서, 조 물질을 유기 염기(Et₃N 또는 DIPEA) 및 아민과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 환류되게 하고, 1일 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 생성된 조 물질을 실리카 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 이후에, 과량의 포타슘 t-부톡사이드를 첨가하고 이를 실온에서 1일 동안 교반함으로써 토실 기를 제거하였다. 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다.

52의 제조

1,4-디옥산(30 mL) 중 51(1.683 g, 3.76 mmol) 및 DIPEA(2 mL)의 용액에 3-아미노-3-(1-메틸-사이클로펜틸)-프로피온산 에틸 에스테르(1.500 g, 7.527 mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 70℃에서 하룻밤 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 실리카 컬럼 크로마토그래피(헵탄:에틸 아세테이트 60:40)를 통해 정제하여 52를 수득하였다.

3-아미노-3-(1- 메틸 - 사이클로펜틸 )-프로피온산 에틸 에스테르의 제조

단계 1. 질소 하에서, LiHMDS(THF 중 1 M)(189 mL, 189 mmol)를 -78℃에서 THF(64 mL) 중 사이클로펜탄카르보니트릴(15 g, 158 mmol)의 용액에 적가하였다. 이어서, 혼합물을 30분에 교반하고, CH₃I(14.7 mL, 240 mmol)를 한꺼번에 첨가하고, 혼합물을 하룻밤 실온까지 서서히 가온하였다. EtOAc(250 mL)를 첨가하고, NH₄Cl 10%(200 mL)를 0℃에서 서서히 첨가하였다. 이어서, 물(100 mL)을 첨가하여 용액을 형성하고, 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 1-메틸사이클로펜탄카르보니트릴(16.8 g, 황색 오일)을 수득하였으며, 이것을 다음 단계에 정제 없이 사용하였다.

단계 2. 질소 하에서 -78℃에서, DIBAL(37 mL, 37 mmol)을 CH₂Cl₂(117 mL) 중 1-메틸사이클로펜탄카르보니트릴(2.0 g, 18 mmol)의 용액에 적가하였으며, 첨가를 종료한 후, 혼합물을 -78℃에서 15분 교반하였다. CH₃OH(37 mL)를 -78℃에서 서서히 첨가하고, 반응을 실온까지 가온시켰다. NaOH(1 M) 200 mL를 첨가하고, 수용액을 CH₂Cl₂로 2회 추출하고, MgSO₄로 건조시키고, 농축시켰다. 혼합물을 HCl 수용액(3 M) 중에서 1시간 동안 교반하고, CH₂Cl₂로 추출하고, MgSO₄로 건조시키고, 농축시켜 1-메틸사이클로펜탄카르브알데하이드(1.4 g, 황색 오일)를 수득하였다.

단계 3. EtOH(5.6 mL) 중 1-메틸사이클로펜탄카르브알데하이드(1.4 g, 12 mmol), 말론산(1.0 g, 9.6 mmol), NH₄OAc(1.5 g, 19 mmol)를 밀봉된 튜브에서 80℃에서 하룻밤 교반하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 여과하고, EtOH로 세척하였다. H₂SO₄(0.51 mL, 9.6 mmol)를 여과액에 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 물 중에 흡수시키고, DCM(3x)으로 세척하였다. 유기 혼합물을 폐기하고, 수성 층을 NaOH(3 N)로 염기성화하고, DCM으로 추출하였다. 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 3-아미노-3-(1-메틸-사이클로펜틸)-프로피온산(0.75 g, 무색 오일)을 수득하였다.

단계 4. 3-아미노-3-(1-메틸-사이클로펜틸)-프로피온산을 에탄올과 혼합하고, 그것에 0℃에서 SOCl₂를 적가하였다. 첨가 후에, 반응 혼합물을 가열 환류하고, 6시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 물질을 DCM 중에 용해시키고, aq. 포화 NaHCO₃로 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 3-아미노-3-(1-메틸-사이클로펜틸)-프로피온산 에틸 에스테르를 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

53의 제조

52(400 mg, 0.706 mmol)가 담긴 밀폐된 용기에 불활성 분위기 하에서 포타슘 t-부톡사이드(3.63 mL, 3.63 mmol) 및 THF(10 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이후에, 소량의 물(10 μL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃까지 가열하였다. 반응 혼합물의 용매를 증발 건조시키고, 분취용 HPLC(방법: 90%[수성 상] - 10%[유기 상]부터 54%[AP] - 46%[OP]까지. AP: 25 mM NH₄HCO₃, OP: MeCN:메탄올 1:1)에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 53을 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.04 (s, 3 H) 1.17 - 1.43 (m, 2 H) 1.54 - 1.69 (m, 5 H) 1.73 - 1.83 (m, 1 H) 2.55 - 2.61 (m, 2 H) 4.87 - 4.94 (m, 1 H) 7.01 - 7.10 (m, 1 H) 8.04 (s, 1 H) 8.10 (d, J=3.96 Hz, 1 H) 8.77 (s, 1 H) 9.69 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 384.5; Rt: 1.24분, 방법 B.

중간체 59의 제조

THF(50 mL) 중 이소프로필아민(2.66 mL, 29.95 mmol) 및 DIPEA(5.16 mL, 29.95 mmol)의 용액을 -10℃에서 교반하였으며, 이 동안에 2,4-디클로로-5-플루오로피리미딘(5 g, 29.95 mmol)을 일부씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 하룻밤 교반하였다. 혼합물을 100 mL의 에틸 아세테이트 및 50 mL의 디이소프로필에테르로 희석시켰다. 이 용액을 물로 2회 세척하였다. 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 증발시켜, 67을 수득하였다. 잔류물을 그대로 사용하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 189; Rt: 1.65분, 방법 B.

60의 제조

3(798.6 mg, 2 mmol), 59(379.24 mg, 2 mmol) 및 Na₂CO₃(3 mL, 2 M, 6 mmol)의 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온에서 1,4-디옥산(10 mL) 중에서 교반하였다. 이어서, Pd(PPh₃)₄(115.56 mg, 0.1 mmol) 및 잔트포스(57.86 mg, 0.1 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 통한 질소 버블링에 의해 10분 동안 탈기를 행하였다. 반응물을 마이크로파 조사 하에서 15분 동안 150℃까지 가열하였다. 혼합물을 물로 희석시키고 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 층을 염수로 1회 세척하고, MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 약 10% 아세토니트릴을 갖는 디이소프로필에테르 중에서 결정화하였다. 황백색 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공 중에서 건조시켜 60을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 426; Rt: 2.22분, 방법 B.

61의 제조

60(300 mg, 0.7 mmol) 및 NaOMe(15 mL, 0.5 M, 7.5 mmol)의 혼합물을 10분 동안 초음파 처리하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 빙수 중에 재구성하고, 교반하고, 7.5 mL의 1 N aq. HCl로 중화시켰다. 수층을 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 구배로서 디클로로메탄/메탄올(98/2로부터 95/5까지)을 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 상응하는 분획을 증발시키고, 잔류물을 디이소프로필에테르/아세토니트릴(2/1) 중에서 결정화하였다. 결정을 여과에 의해 수집하고, 진공 중에서 건조시켜, 61을 수득하였다. ¹H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.29 (d, J=6.59 Hz, 6 H) 4.40 - 4.51 (m, 1 H) 7.49 (br d, J=7.68 Hz, 1 H) 8.15 - 8.18 (m, 2 H) 8.82 (s, 1 H) 9.61 (s, 1 H) 12.51 (br s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 272.1; Rt: 1.45분, 방법 B.

메틸 3-아미노-4,4-디메틸펜타노에이트의 제조

100 mL의 EtOH 중 트리메틸아세트알데하이드(33.25 g, 386.027 mmol), 말론산(30.204 g, 290.246 mmol), NH₄OAc(44.746 g, 580.492 mmol)의 혼합물을 6시간 동안 환류하였다. 침전물을 여과에 의해 단리하고, 에탄올로 세척하였다. 용액을 그대로 사용하고, H₂SO₄(15.5 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 5시간 동안 가열 환류하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 조 물질을 300 mL의 물 및 150 mL의 Et₂O에 첨가하였다. 수성 층을 NaOH 6 N aq.로 중화시켰다. 생성물을 EtOAc로 추출하였다. 유기 상을 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다.

메탄올(50 mL) 중 잔류물(10 g, 68.87 mmol)을 빙조 상에서 냉각시키고, SOCl₂(5 mL, 68.87 mmol)를 적가하였다. 첨가 후에, 반응 혼합물을 가열 환류하고, 6시간 동안 교반하였다. 반응을 완료하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 물질을 DCM 중에 용해시키고, aq. 포화 NaHCO₃ 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 메틸 3-아미노-4,4-디메틸펜타노에이트를 수득하였다.

67의 제조

2,4-디클로로-5-플루오로-피리미딘(3 g, 17.967 mmol)의 용액을 EtOH(72 mL) 및 THF(72 mL) 중에서 실온에서 교반하였다. 메틸 3-아미노-4,4-디메틸펜타노에이트(3.622 g, 22.749 mmol) 및 DIPEA(9.289 mL, 53.90 mmol)를 반응 혼합물에 적가하고, 70℃에서 1시간 동안, 이어서 주위 온도에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시켰다. 잔류물을 물 중에 재구성하고, DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 물로 1회 세척하고, MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 상에서의 플래시 컬럼 크로마토그래피(용리제: DCM-DCM/메탄올(100부터 90/10까지))에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켜 67을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 289.1; Rt: 0.99분, 방법 A.

68의 제조

압력 튜브에서, DME(50 mL) 및 물(15 mL) 중 3(3.5 g, 8.766 mmol), Pd(PPh₃)₄(1013 mg, 0.877 mmol), K₂CO₃(2423 mg, 17.53 mmol) 및 67(2.667 g, 9.204 mmol)의 혼합물을 100℃까지 가열하고 16시간 동안 교반하였다. 반응을 완료하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 잔류물을 DCM 중에 흡수시키고 여과하였다. 여과액을 실리카 상에서의 플래시 컬럼 크로마토그래피(구배: 헵탄-EtOAc(100부터 100까지))에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켰다. 잔류물을 DCM/메탄올(1/1)의 혼합물 중에 용해시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(구배: 헵탄-EtOAc(100부터 100까지))를 통해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 68을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ ppm 0.97 (s, 9 H) 2.65 (m, 1 H) 2.78 (m, 1 H) 3.44 (s, 3 H) 4.76 - 4.94 (m, 1 H) 7.41 (m, 1 H) 8.07 - 8.27 (m, 2 H) 8.82 (s, 1 H) 9.73 (s, 1 H) 12.47 (br. s., 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 372.2; Rt: 0.84분, 방법 A.

69의 제조

물(4 mL) 및 1,4-디옥산(8 mL) 중 68(150 mg, 0.39 mmol) 및 LiOH(37.379 mg, 1.561 mmol)의 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 하에서 제거하고, 수층을 1 N HCl로 산성화하였다. 형성된 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 50℃에서 진공 하에서 건조시켜 69를 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 0.96 (s, 9 H) 2.54 - 2.62 (m, 2 H) 4.68 - 4.84 (m, 1 H) 7.69 (m, 1 H) 8.11 - 8.15 (m, 2 H) 8.81 (s, 1 H) 9.73 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 358.1; Rt: 1.15분, 방법 B.

70의 제조

67을 제조하는 방법에 따라 중간체 70을 제조하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 315; Rt: 1.11분, 방법 A.

71의 제조

68을 제조하는 방법에 따라 71을 제조하였다.

87의 제조

69를 제조하는 방법에 따라 중간체 72를 제조하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 358.1; Rt: 1.15분, 방법 B.

중간체 74의 제조

중간체 2를 제조하는 방법에 따라 중간체 74를 제조하였다.

75의 제조

1,4-디옥산(6 mL) 중 74(580 mg, 1.5 mmol), 2,4-디메톡시벤질아민(276 mg, 1.65 mmol), 및 K₂CO₃(414 mg, 3 mmol)의 용액을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에 도달되게 하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 반응 혼합물을 실리카 상에서의 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (구배: 석유 에테르-EtOAc(100부터 50/50까지)). 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켜 75를 수득하였다.

76의 제조

중간체 3을 제조하는 방법에 따라 76을 제조하였다.

77의 제조

1,4-디옥산(80 mL) 및 물(20 mL) 중 76(2.73 g, 1.47 mmol), 5(0.5 g, 1.47 mmol), K₃PO₄(0.62 g, 2.93 mmol), 및 [1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(96 mg, 0.147 mmol)의 혼합물을 10시간 동안 70℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 위로 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고 물로 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 역상 HPLC(컬럼: SYNERGI 250 x 50 10 μm, 유량: 80 mL/min, 이동상 A: 물(0.1% TFA를 함유함), 이동상 B: 아세토니트릴, 구배: 45%부터 75%까지(%B))에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 77을 수득하였다.

중간체 78의 제조

DCM(2 mL) 중 77(120 mg, 0.161 mmol)의 용액에 TFA(2 mL)를 첨가하고, 용액 전체를 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 78을 함유하는 잔류물을 다음 단계에 직접 사용하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 594.2; Rt: 0.78분, 방법 E.

79의 제조

메탄올(5 mL) 중 78(90 mg, 0.152 mmol)이 담긴 플라스크에 실온에서 소듐 메톡사이드(33 mg, 0.608 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 농축시켰다. 조 혼합물을 역상 컬럼 크로마토그래피(Agela DuraShell C18 150 x 25 x 5 μm, 유량: 35 ml/min, 이동상 A: 물(0.05% NH₃.H₂O를 함유함), 이동상 B: 아세토니트릴, 구배: 26%부터 56%까지(%B))에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 79를 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.97 - 1.35 (m, 3 H) 1.42 - 1.68 (m, 2 H) 1.86 - 1.95 (m, 4 H) 1.96 - 2.13 (m, 2 H) 2.64 - 2.76 (m, 1 H) 3.28 - 3.35 (m, 3 H) 3.83 - 3.97 (m, 1 H) 4.04 - 4.12 (m, 1 H) 4.94 (br d, J=7.03 Hz, 1 H) 7.94 (d, J=3.01 Hz, 1 H) 7.98 (s, 1 H) 8.26 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 440.2; Rt: 3.72분, 방법 E.

80의 제조

톨루엔(15 mL) 중 5-브로모-6-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(300 mg, 1.415 mmol)의 용액에, 테트라부틸 암모늄 하이드로겐 설페이트(28.4 mg, 0.113 mmol)에 이어서 NaOH(물 중 50%)(5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 격렬하게 교반하였다. 톨루엔(15 mL) 중 p-톨루엔설포닐 클로라이드(378 mg, 1.98 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물 전체를 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 물로 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 농축시켰다. 80을 함유하는 조 물질을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 367; Rt: 1.031분, 방법 C.

81의 제조

3을 제조하는 방법에 따라 화합물 81을 제조하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 414; Rt: 1.257분, 방법 C.

82의 제조

98(100 mg, 0.242 mmol), 5(107.7 mg, 0.315 mmol), Pd(PPh₃)₄(140 mg, 0.121 mmol), 잔트포스(70 mg, 0.121 mmol), 2 M Na₂CO₃(0.363 mL, 2 M, 0.726 mmol), 디옥산(10 mL)의 혼합물을 80℃에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 82를 함유하는 잔류물을 다음 단계에 직접 사용하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 593; Rt: 1.094분, 방법 C.

83의 제조

29를 제조하는 방법에 따라 화합물 83을 제조하였다. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.20 - 1.44 (m, 5 H) 1.72 - 1.86 (m, 6 H) 1.87 - 2.06 (m, 1 H) 2.08 - 2.21 (m, 1 H) 2.86 (s, 2 H) 3.16 - 3.22 (m, 4 H) 3.50 - 3.68 (m, 1 H) 3.97 - 4.13 (m, 1 H) 5.82 (br d, J=7.97 Hz, 1 H) 7.54 (br d, J=7.56 Hz, 1 H) 8.21 (d, J=3.85 Hz, 1 H) 8.73 (s, 1 H) 9.57 (s, 1 H) 12.33 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 439; Rt: 2.160분, 방법 C.

84의 제조

아세톤(20 mL) 중 5-브로모-4-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(2 g, 9.43 mmol)의 용액에, 0℃에서 2 N NaOH 용액(9.43 mL, 18.87 mmol)에 이어서, p-톨루엔설포닐 클로라이드(1.98 g, 10.38 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 수층을 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 물로 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 농축시켰다. 84를 함유하는 잔류물을 다음 단계에 직접 사용하였다.

85의 제조

화합물 3을 제조하는 방법에 따라 85를 제조하였다.

86의 제조

1,4-디옥산(15 mL) 및 물(3 mL) 중 84(180 mg, 1.47 mmol), 5(223.5 mg, 0.65 mmol), K₃PO₄(278 mg, 1.31 mmol), 및 [1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(28.5 mg, 0.04 mmol)의 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 20분 동안 100℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 위로 여과하고, 농축시켰다. 85를 함유하는 혼합물을 다음 단계에 직접 사용하였다.

86의 제조

메탄올(10 mL) 중 86(180 mg, 0.304 mmol)의 혼합물에 NaOMe(66 mg, 1.22 mmol)를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고 EtOAc로 3회 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 물로 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄), 농축시켰다. 조 혼합물을 역상 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 컬럼: Waters Xbridge C18 150 x 20 mm x 5 μm, 유량: 25 mL/min, 이동상 A: 물(0.05% NH₃.H₂O를 함유함), 이동상 B: 아세토니트릴, 구배: 18%부터 48%까지(%B). 원하는 분획을 농축시켜 87을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.09 (br d, J=11.54 Hz, 4 H) 1.51 - 1.59 (m, 1 H) 1.85 - 1.94 (m, 6 H) 2.03 - 2.16 (m, 2 H) 2.60 - 2.69 (m, 1 H) 3.09 (s, 3 H) 3.27 - 3.36 (m, 4 H) 3.80 - 3.92 (m, 1 H) 4.04 (d, J=7.28 Hz, 1 H) 4.12 - 4.29 (m, 1 H) 4.90 (br d, J=5.52 Hz, 1 H) 8.00 (s, 1 H) 8.09 (d, J=3.01 Hz, 1 H) 8.79 (s, 1 H) 9.87 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 439.2; Rt: 3.19분, 방법 E.

88의 제조

THF(4 mL) 중 2-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(400 mg, 2.253 mmol)의 혼합물에 NBS(480 mg, 2.70 mmol)를 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 침전물을 여과에 의해 단리하고, DCM으로 세척하고, 진공 하에서 건조시켜 원하는 화합물 88을 수득하였다.

89의 제조

THF(25 mL) 중 88(230 mg, 1.085 mmol)의 교반된 용액에 질소 하에서 실온에서 NaH(80 mg, 2 mmol)를 일부씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 p-톨루엔설포닐 클로라이드(264 mg, 1.385 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켰다. 조 반응 혼합물을 실리카 상에서의 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (구배: 석유 에테르/EtOAc(65/35)). 원하는 분획을 수집하고 증발 건조시켜 89를 수득하였다.

107의 제조

중간체 3을 제조하는 방법에 따라 중간체 90을 제조하였다.

91의 제조

1,4-디옥산(20 mL) 및 물(5 mL) 중 90(165.4 mg, 0.484 mmol), 5(200 mg, 0.484 mmol), K₃PO₄(308 mg, 1.45 mmol), 및 [1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(31.5 mg, 0.049 mmol)의 혼합물을 18시간 동안 80℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 위로 여과하고, 농축시켰다. 91을 함유하는 혼합물을 다음 단계에 직접 사용하였다.

92의 제조

104를 제조하는 방법에 따라 화합물 92를 제조하였다. ¹H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.08 - 1.29 (m, 4 H) 1.88 - 1.92 (m, 4 H) 2.08 (m, J=14.10 Hz, 1 H) 2.17 - 2.25 (m, 1 H) 2.62 - 2.69 (m, 1 H) 2.77 - 2.83 (m, 1 H) 2.81 (s, 2 H) 3.25 - 3.29 (m, 1 H) 3.29 - 3.34 (m, 3 H) 3.84 - 3.93 (m, 1 H) 4.04 - 4.09 (m, 1 H) 4.09 - 4.18 (m, 1 H) 4.88 (m, 1 H) 8.05 - 8.08 (m, 2 H) 9.58 (s, 2 H). LC-MS ES⁺ m/z = 439.2; Rt: 3.44분, 방법 E.

93의 제조

분취용 SFC(고정상: Chiralcel Diacel OD 20 x 250 mm, 이동상: CO₂, 0.2% 이소프로필아민을 갖는 이소프로판올)를 통해 화합물 9를 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 93을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d ₄) δ ppm 1.22 - 1.53 (m, 9 H) 1.55 - 1.67 (m, 1 H) 1.85 - 1.91 (m, 4 H) 2.13 - 2.22 (m, 1 H) 2.24 - 2.32 (m, 1 H) 3.36 - 3.44 (m, 1 H) 3.70 - 3.80 (m, 1 H) 4.17 - 4.27 (m, 1 H) 5.81 (m, 1 H) 7.52 (m, 1 H) 8.39 (s, 1 H) 8.80 (s, 1 H) 9.62 (s, 1 H). LC-MS ES⁺ m/z = 448.2; Rt: 1.55분, 방법 A.

94의 제조

메탄올(1.5 L) 중 벤질 tert-부틸 (+/-)-사이클로헥산-1,3-디일디카르바메이트(52.27 g, 150 mmol)의 용액을 질소 분위기 하에서 교반하고, Pd/C(10%)(1.6 g, 1.5 mmol)를 첨가하고, 수소(3.75 L, 0.04 M, 150 mmol) 하에서의 교반을 실온에서 하룻밤 행하였다. 촉매를 질소 하에서 데칼라이트(decalite) 위로 여과하고, 메탄올로 2회 헹구고, 여과액을 증발 건조시켜 94를 수득하였다.

95의 제조

THF(200 mL) 중 2,6-디클로로-5-플루오로-피리딘-3-카르보니트릴(19.1 g, 100 mmol)의 용액을 실온에서 교반하였으며, 이 동안에 ACN(100 mL) 중 94(12.54 g, 50 mmol) 및 DIPEA(26 mL, 150 mmol)의 혼합물을 적가하였다. 반응을 주위 온도에서 주말에 걸쳐 교반되게 하였다. 혼합물의 용매를 증발시키고, 잔류물을 물 중에 분쇄시키고, 하룻밤 교반하였다. 침전물을 여과하고, 진공 중에서 건조시켜 95를 수득하였다.

96의 제조

메탄올(50 mL) 중 HCl(iPrOH 중 6 M)(16.7 mL, 6 M, 100 mmol)의 용액에 95(4.61 g, 10 mmol)를 일부씩 첨가하고, 반응물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 증발 건조시키고, 잔류물을 디이소프로필에테르/아세톤 중에 분쇄시켰다. 결정을 여과에 의해 수집하고, 진공 중에서 건조시켜, 96을 수득하였다.

97의 제조

THF(18 mL) 중 피콜린산(240.521 mg, 41.954 mmol)이 담긴 플라스크에 실온에서 HBTU(1411 mg, 3.721 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 불활성 분위기 하에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, DMSO(1 mL) 중 96(500 mg, 1.86 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.81 mL, 4.652 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물로 희석시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고(Mg₂SO₄), 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 실리카 겔 컬럼(헵탄:AcOEt 50:50)을 사용하여 정제를 수행하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 97을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 373.9; Rt: 1.38분, 방법 C.

155의 제조

1,4-디옥산(5 mL) 및 물(0.5 mL) 중 3(200 mg, 0.501 mmol), 97(187 mg, 0.501 mmol), K₃PO₄(33 mg, 0.0501 mmol), 및 [1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(318 mg, 1.503 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 90℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 위로 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고 물로 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 역상 HPLC(방법: MG3BIC 70%[수성 상] - 30%[유기 상]부터 27%[AP] - 73%[OP]까지. AP= 25 mM aq. NH₄HCO₃, OP= 아세토니트릴:메탄올 1:1)에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 98을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 457.2; Rt: 2.39분, 방법 C.

99의 제조

ACN(30 mL) 중에 용해된 2,6-디클로로-5-플루오로-3-피리딘카르보니트릴(1 g, 5.26 mmol), 트리에틸아민(1.61 mL, 11.54 mmol) 및 (+/-)-메틸 3-아미노바이사이클로[2.2.2]옥탄-2-카르복실레이트(1.04 g, 4.73 mmol)가 담긴 플라스크를 12시간 동안 환류하였다. 반응 혼합물을 EtOAc 및 염수에 넣어 희석시켰다. 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 중에서 농축시켰다. 99를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

100의 제조

THF(40 mL) 및 물(10 mL) 중 3(2.814 g, 7.049 mmol) 및 99(2 g, 54.92 mmol)를 함유하는 용액을 불활성 분위기 하에서 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, Pd₂(dba)₃(0.103 g, 0.141 mmol), 인산삼칼륨(3.753 g, 17.69 mmol) 및 잔트포스(0.336 g, 0.705 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 120℃에서 12시간 동안 교반하였다. 조 물질을 감압 하에서 농축시키고, 100을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

101의 제조

THF(10 mL) 중 100(5.103 g, 8.88 mmol)이 담긴 플라스크에 소듐 메톡사이드(11.5 mL, 53.28 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이후에, 반응물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합물을 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (시작: 유기 상 19%; 종료: 유기 상 55%; 유기 상: 0.1% HCOOH:아세토니트릴, 수성 상 1:1:25 mM NH₄HCO₃). 원하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 제거하여 101을 수득하였다. LC-MS ES⁺ m/z = 407; Rt: 2.69분, 방법 C.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 측정은 LC 펌프, 다이오드-어레이(DAD) 또는 UV 검출기, 및 각각의 방법에 지정된 바와 같은 컬럼을 사용하여 수행하였다. 필요하다면, 추가의 검출기를 포함하였다(하기의 방법의 표 참조).

컬럼으로부터의 유동을 대기압 이온 공급원으로 구성된 질량 분석계(MS)로 가져왔다. 화합물의 공칭 단일동위원소(monoisotopic) 분자량(MW)의 확인을 가능하게 하는 이온을 얻기 위하여 조정 파라미터(예를 들어, 스캐닝 범위, 유지 시간(dwell time) 등)를 설정하는 것은 숙련자의 지식 내에 있다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터 획득을 수행하였다.

화합물들은 그들의 실험 체류 시간(R_t) 및 이온에 의해 기재되어 있다. 데이터의 표에 상이하게 지정되어 있지 않다면, 기록된 분자 이온은 [M+H]⁺(양성자화된 분자) 및/또는 [M-H]^-(탈양성자화된 분자)에 상응한다. 화합물이 직접 이온화 불가능한 경우에는, 부가생성물의 유형이 지정된다(즉, [M+NH₄]⁺, [M+HCOO]^- 등). 다수의 동위원소 패턴을 갖는 분자(Br, Cl 등)의 경우에, 기록된 값은 최저 동위원소 질량에 대해 얻어진 것이다. 사용된 방법과 일반적으로 관련된 실험 불확실성을 수반하면서 모든 결과를 얻었다.

"SQD" 단일 사중극 검출기, "RT" 실온, "BEH" 가교된 에틸실록산/실리카 하이브리드, "HSS" 고강도 실리카, "DAD" 다이오드 어레이 검출기. 유량은 mL/min으로; 컬럼 온도(T)는 ℃로; 실행 시간은 분으로 표현됨.

화학식 I의 화합물의 생물학적 활성

세포-기반 항바이러스 검정을 사용하여 화합물의 시험관내(in vitro) 항바이러스 활성을 결정하였다. 이 검정에서는, 인플루엔자 바이러스 A/타이완(Taiwan)/1/86(H1N1)에 의해 감염된 마딘-다비 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney, MDCK) 세포에서의 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 화합물의 존재 또는 부재 하에서 모니터링하였다. 백색의 384웰 미세적정 검정 플레이트(Greiner사)를 에코 액체 핸들러(echo liquid handler)(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 Labcyte사)를 사용하여 음향 액적 분사(acoustic drop ejection)를 통해 충전하였다. 200 나노리터의 화합물 스톡 용액(100% DMSO)을 검정 플레이트에 전달하였다. MDCK 세포를 25,000 또는 6,000개 세포/웰의 최종 밀도로 플레이트에 분배하였다. 이어서, A형 인플루엔자/타이완/1/86(H1N1) 바이러스를 각각 0.001 또는 0.01의 감염 다중도로 첨가하였다. 웰은 부피당 0.5% DMSO를 수용한다. 바이러스- 및 모의(mock)-감염된 대조군을 각각의 시험에 포함시켰다. 플레이트를 5% CO₂ 중에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 바이러스 노출 후 3일째에, ATPlite™ 키트(벨기에 자벤템 소재의 PerkinElmer사)를 제조업체의 사용설명서에 따라 사용하여 ATP 수준의 감소를 측정함으로써 세포변성 효과를 정량화하였다. IC₅₀을 50% 억제 농도로 정의하였다. 이와 동시에, 백색 384웰 미세적정 플레이트에서 3일 동안 화합물을 인큐베이션하고, MDCK 세포에서의 화합물의 시험관내 세포독성을, ATPlite™ 키트(벨기에 자벤템 소재의 PerkinElmer사)를 제조업체의 사용설명서에 따라 사용하여 세포의 ATP 함량을 측정함으로써 결정하였다. 세포독성은 세포 생존력의 50% 감소를 야기하는 농도인 CC₅₀으로 기록되어 있다.

화학식 I의 화합물의 생물학적 활성

화합물 #	A형 인플루엔자/타이완/1/86 IC50 μM	TOX MDCK CC50 μM
7	0.005	>25
9	0.009	8.74
12	0.030	>25
14	0.047	>25
16	0.036	>25
18	0.044	2.48
21	0.106	13.4
23	0.033	>25
24	0.325	>25
28	0.351	>25
29	0.010	>25
30	0.021	>25
31	0.021	>25
32	0.035	>25
33	0.042	>100
34	0.040	>25
35	0.002	>25
36	0.040	>25
37	0.205	>25
38	0.380	>25
39	0.114	>25
40	0.190	>25
41	0.319	>25
44	0.003	9.4
45	0.004	>25
46	0.005	>25
47	0.011	>25
48	0.035	>25
49	0.046	>25
53	0.65	>25
54	0.46	>25
55	0.55	>25
56	0.60	>25
57	0.66	5.2
58	0.63	>100
61	0.63	>25
62	0.70	>25
63	0.72	>25
64	0.76	>25
65	0.81	11.6
66	0.82	>25
69	0.83	>25
72	0.86	10.3
73	0.93	>25
79	0.15	>25
83	0.71	>25
87	0.47	>25
92	0.18	>25
93	0.006	>25
98	0.002	>25
101	0.036	10.5

Claims (9)

1. 화학식 I의 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체:
   [화학식 I]
   

   

   
   (상기 식에서,
   X는 N 또는 C이며, N 및 C는 -CN, -CF₃, -C_1-3 알킬-N-C(O)-C_1-3 알킬, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH-C_1-3 알킬, -C(O)N-(디알킬) 또는 -CH₂-NC(O)-CH₃에 의해 선택적으로 치환되고;
   R₁은 H 또는 CH₃이고;
   R₂는 H 또는 NH₂이고;
   R₃은 카르복실산에 의해 치환된 C_1-8 알킬이거나;
   카르복실산, -N-C_{1- 3}알킬설폰, 또는 C_1-6 알킬에 의해 선택적으로 치환된 -N-C(O)-C_3-6헤테로사이클에 의해 치환된 C_3-8 사이클로알킬이거나;
   -N-C(O)-C_3-6헤테로사이클에 의해 치환된 C_3-6 헤테로사이클임).
2. 제1항에 있어서, R₁ 및 R₂ 모두가 H인 화합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 구조식
   

   

   또는

   

   를 갖는 화합물.
4. 제1항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
5. 약제로서 사용하기 위한, 제1항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체, 또는 제4항에 따른 약제학적 조성물.
6. 인플루엔자의 치료에 사용하기 위한, 제1항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체, 또는 제4항에 따른 약제학적 조성물.
7. 생물학적 샘플 또는 환자에서 인플루엔자 바이러스(들)의 복제를 억제하기 위한 하기 구조식 I로 나타낸 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체의 용도:
   [화학식 I]
   

   

   
   (상기 식에서,
   X는 N 또는 C이며, N 및 C는 -CN, -CF₃, -C_1-3 알킬-N-C(O)-C_1-3 알킬, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH-C_1-3 알킬, -C(O)N-(디알킬) 또는 -CH₂-NC(O)-CH₃에 의해 선택적으로 치환되고;
   R₁은 H 또는 CH₃이고;
   R₂는 H 또는 NH₂이고;
   R₃은 카르복실산에 의해 치환된 C_1-8 알킬이거나;
   카르복실산, -N-C_{1- 3}알킬설폰, 또는 C_1-6 알킬에 의해 선택적으로 치환된 -N-C(O)-C_3-6헤테로사이클에 의해 치환된 C_3-8 사이클로알킬이거나;
   -N-C(O)-C_3-6헤테로사이클에 의해 치환된 C_3-6 헤테로사이클임).
8. 제7항에 있어서, 추가 치료제를 병용-투여하는 것을 추가로 포함하는 용도.
9. 제8항에 있어서, 추가 치료제가 항바이러스제 또는 인플루엔자 백신, 또는 둘 모두로부터 선택되는 용도.