KR20170052323A - 모린을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물 - Google Patents
모린을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 모린(Morin)을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뽕나무 추출물 유래의 모린과 항생제를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항균 조성물은 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하므로, 인체에 독성이 없고 부작용이 적은 항균제로 사용할 수 있으며, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 이용하여 의약제품, 의약품, 화장품, 식품 및 동물 사료에 적용하여 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 모린(Morin)을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뽕나무 추출물 유래의 모린과 항생제를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물, 의약품, 화장품, 건강기능식품 및 동물 사료에 관한 것이다.
자연계에 널리 분포되어 있는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus; S. aureus)은 세계적으로 널리 알려진 식중독균 중의 하나로, 황금색 색소를 생성하고 용혈성을 가지며 응고효소(coagulase)를 생성하는 종으로, 화농성질환이나 창상감염 등의 피부감염, 골관절염, 폐렴, 패혈증 등을 일으키는 병원성 높은 대표적인 유해세균으로 알려져 있다(Kim SK et al., The Journal of the Korean Society for Microbiology, 28:251, 1993).
황색포도상구균은 일반적으로 환경에 대한 저항성이 강하여 건강한 성인의 비강, 피부, 구강 등에서도 존재하고 동물의 상처부위를 통한 전염이나 식품의 생산과정, 제조 공정 등의 여러 단계를 거치면서 식품 유통망을 타고 짧은 시간에 전국적으로 전파될 수 있으며, 전파된 황색포도상구균은 사람에게 전이되어 또 다른 매개체가 될 수 있다. 따라서 황색포도상구균과 같은 유해세균을 억제하기 위하여 사람과 동물의 질병 치료와 예방에 항생제를 사용하고 있으나, 황색포도상구균에 의한 식중독 발생률은 노로 바이러스와 살모넬라, 병원성 대장균과 함께 꾸준히 높은 수치를 나타내고 있으며 매년 발생이 증가되고 있다 (Lee JH et al., Korean Journal for Food Science of Animal Resources,30:410, 2010).
더욱이 항생제 오·남용 등의 원인으로, 최근 미국이나 네덜란드 등의 국가에서는 식품과 관련한 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant S. aureus; MRSA)의 오염이 보고되고 있으며 1996년에는 반코마이신(vancomycin)에 대하여 저하된 감수성을 나타내는 황색포도상구균이 일본에서 발견된 이후, 여러 나라에서 반코마이신 내성 황색포도상구균(vancomycin-resistant S. aureus; VRSA)가 나타나기 시작하면서 슈퍼박테리아로 불리기 시작하였다 (Kang TY et al., Journal of Life Science, 2:190, 2010).
MRSA와 VRSA 같은 슈퍼박테리아는 출현 이후 지역사회에 빠르게 증가되고 광범위하게 노출되어있어 그 심각성이 점차 높아지고 있으며, 일반 황색포도상구균과 달리 세팔로스포린(cephalosporin), 암피실린(ampicillin), 나프실린(nafcillin) 등과 같은 베타-락탐(β-lactam) 계열 항생제를 비롯하여 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크로라이드(macrolides) 계열의 항생제에 대해서도 내성을 지니고 있는 균주로 발전되어 감염증 치료에 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다.
오늘날, 우리나라는 인구 고령화와 웰빙 (Well-being)이라는 건강 지향적 트렌드가 자리하면서, 채식위주의 음식문화와 맞물려 가공하지 않는 신선식품으로의 이용이 증가되고 있으나 유통 및 저장과정에서 황색포도상구균 등의 유해 미생물 증식에 의해 발생하기 쉬운 오염을 억제하거나 식품으로 전파되는 유해 미생물의 내성 연구는 아직 미흡한 실정이며, 그 중 공중보건학 측면에서 황색포도상구균의 내성수준은 매우 심각한 문제로 보고되고 있다 (Kim KM et al., Korean Journal of Nosocomial Infection Control, 11:79, 2006).
또한, 현재 축산에 사용되는 많은 항생제의 경우 내성률이 심각한 수준에 있으며 일부의 항생제의 경우 100% 근접해 있다. 현재 축산에서 항생제는 주로 사료 첨가제로 또는 육계의 경우 7일에서 10일 사이에 정기적으로 클리닝(Cleaning) 목적으로 사용된다. 보고에 의하면 전국 도축장에 온 소, 돼지, 닭에게서 분리한 살모넬라, 장내구균 따위의 식중독균의 항생제 내성률을 조사한 결과 닭 분변에서 나온 대장균은 퀴놀론계 항생제에 57%를 웃도는 내성률을 보였다. 이와 같이 현재 축산에 사용되고 항생제는 대부분 세균들이 내성을 지니고 있어 축산에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제 개발이 시급하다.
최근에는 유통 및 저장 중 오염 및 품질저하를 방지하기 위하여 가열 처리나 레토르 등의 물리적 방법과 식품보존제 등의 화학합성물질을 첨가하는 방법 등이 널리 이용되고 있으나, 영양성분 파괴, 품질저하 및 독소잔류 등의 건강에 대한 안전성 문제가 제기되고 있다. 따라서 황색포도상구균과 같은 유해세균에 대한 새로운 항균물질의 개발이 시급히 요구되고 있으며, 전통적으로 감염질환의 치료에 사용되어 온 약용식물을 바탕으로 알칼로이드(alkaloid), 플라보노이드(flavonoid), 테르페노이드(terpenoid), 페놀성 화합물(phenolic compound), 퀴논(quinone), 휘발유(volatile oil) 등의 2차 대사산물 또는 그 유도체들이 후보물질로 활발히 진행되고 있다 (Kim NY et al., Journal of Life Science, 20:589, 2010).
한편, 모린(morin)은 화학식 C15H10O7 의 플라보노이드의 일종으로, 열대산 Chlorophora tinctoria Gaudich(Morus tinctoria L.) 및 뽕나무 Morus bombycis Koidz.(뽕나무과)의 심재, Acacia deolbata(콩과)의 화분에 각각 유리해서 포함되어 있다. 모린의 항산화 효과와 항균 효과에 대해서는 기존에 공지되어 있으나(yang et al., Evaluation of antioxidant and antibacterial activities of morin isolated from mulberry fruits, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, August 2012, Volume 55, Issue 4, pp 485-489 ), 모린과 항생제를 병용 투여하여 개선된 항균효과를 갖는 항균조성물에 대해서는 연구가 미진하며, 특히, 여러 항생제 중에서 어떠한 항생제와 병용 투여할 때가 적합한지, 얼마만큼의 배합에서 가장 항균효과가 탁월한지에 대한 연구가 필요하였다.
이에, 본 발명자들은 항생제 내성을 가지는 황색포도상구균에 대한 항균활성을 가지고, 기존 항생제의 부작용을 최소화한 항균 조성물을 제공하기 위해 예의 노력한 결과, 모린과 항생제를 혼합하여 사용할 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 모린을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는, 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 해결하려는 과제는 상기 항균 조성물을 포함하는 의료제품, 약품, 화장품, 건강기능성 식품 및 동물 사료를 제공하는 것이다.
상술한 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 모린을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 모린은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 항생제 내성 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 모린은 93.75 내지 750 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함한다.
본 발명의 베타락탐계 항생제는 메티실린, 디클록사신, 옥사실린, 플루클록사신, 아목시실린, 암피실린, 피페라실린, 티카실린, 아즐로실린 또는 카르베니실린 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 항균 조성물에서 항생제는 모린 100 중량부에 대하여 0.001 내지 600 중량부로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 세번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 항균 조성물을 포함하는 의약품, 화장품, 기능성 식품 및 동물 사료를 포함한다.
본 발명의 모린을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물은 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하며, 특히, 모린을 항생제와 함께 병용투여 할 때, 항균에 대한 상승효과가 일어나 항생제의 사용을 대폭 줄일 수 있다. 또한, 모린은 인체에 독성이 없고 부작용이 적은 항균제로 사용할 수 있으며, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 이용하여 의약제품, 의약품, 화장품, 식품 및 동물성 사료에 적용하여 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 임상검체로부터 분리한 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA) DPS-1 균주에 모린을 처리하였을 때, 타임-킬(Time-kill) 곡선을 나타낸 데이터이다.
도 2는 임상검체로부터 분리한 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA) DPS-2 균주에 모린을 처리하였을 때, 타임-킬(Time-kill) 곡선을 나타낸 데이터이다.
도 3은 각 실험군에 대한 페니실린 결합 단백질 2a(PBP2a)의 발현량을 측정한 웨스턴블롯 사진이다(CON : 비약물처리군, morin : 모린 250 ㎍/㎖ 처리군, OX : 옥사실린 32㎍/㎖ 처리군, morin+OX : 모린 250 ㎍/㎖와 옥사실린 32㎍/㎖ 처리군).
도 4는 모린을 30분 동안 처리하였을 때, 메티실린1 내성 황색포도상구균의 광학전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 이미지를 나타낸 데이터로, (A) 약물을 처리하지 않은 메티실린 내성 황색포도상구균, (B) 125㎍/㎖의 모린을 처리한 메티실린 내성 황색포도상구균 및 (C) 250㎍/㎖의 모린을 처리한 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 TEM 이미지이다.
도 2는 임상검체로부터 분리한 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA) DPS-2 균주에 모린을 처리하였을 때, 타임-킬(Time-kill) 곡선을 나타낸 데이터이다.
도 3은 각 실험군에 대한 페니실린 결합 단백질 2a(PBP2a)의 발현량을 측정한 웨스턴블롯 사진이다(CON : 비약물처리군, morin : 모린 250 ㎍/㎖ 처리군, OX : 옥사실린 32㎍/㎖ 처리군, morin+OX : 모린 250 ㎍/㎖와 옥사실린 32㎍/㎖ 처리군).
도 4는 모린을 30분 동안 처리하였을 때, 메티실린1 내성 황색포도상구균의 광학전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 이미지를 나타낸 데이터로, (A) 약물을 처리하지 않은 메티실린 내성 황색포도상구균, (B) 125㎍/㎖의 모린을 처리한 메티실린 내성 황색포도상구균 및 (C) 250㎍/㎖의 모린을 처리한 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 TEM 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 현재 사용되고 있는 항생제는 대부분의 세균들이 내성을 지니고 있어, 의약, 식품뿐만 아니라, 축산분야에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제의 개발이 시급하다.
본 발명은 모린을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 인체에 독성이 없고 부작용이 적으며 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과 우수한 항균활성을 가진 조성물을 제공하는 효과가 있다.
따라서, 본 발명은 모린을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 항생제 내성 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus) 일 수 있다.
본 발명의 항균 조성물은 반코마이신(vancomycin), 세팔로스포린(cephalosporin), 엠피실린(ampicillin), 나프실린(nafcillin) 등과 같은 베타-락탐(β-lactam) 계열 항생제를 비롯하여 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크로라이드(macrolides)에 내성을 가지는 황색포도상구균에 대한 항균활성을 가질 수 있으며, 특히 메티실린(Methicillin)에 내성이 있는 황색포도상구균에 대한 항균활성을 가지고 있다.
상기 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus; MRSA)은 페니실린(메티실린, 디콜록사실린, 납실린, 옥사실린 외)과 세팔로스포린을 포함한 β-락탐계 항생물질 등 거의 모든 항생제에 강한 내성을 지닌 세균으로 대부분 병원내 감염으로 발생한다. 또한, MRSA는 사람에게 감염되어 여러 가지 난치병을 일으키는 세균으로 다제내성 황색포도상구균 또는 '옥사실린 내성 황색포도상구균'(ORSA)이라고도 한다.
본 발명의 모린은 하기 화학식 1의 구조를 가지고 있는 모린일 수 있다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 항균 조성물에 포함된 모린의 농도는 93.75 내지 750 ㎍/㎖일 수 있으며, 바람직하게는 125 내지 500 ㎍/㎖일 수 있다. 모린의 농도가 93.75 ㎍/㎖보다 낮은 경우 항균 활성을 보이지 않을 수 있으며, 모린의 농도가 750 ㎍/㎖보다 높은 경우, 세포 독성을 띌 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus; MRSA, 이하 'MRSA'로 표기함)에 대한 항균활성 여부를 확인하기 위해, MRSA 표준균주 ATCC 33591 균주와 환자로 부터 분리한 5개의 균주 총 6개의 균주를 준비하였으며, 표 1에서 확인한 바와 같이, 모린이 황색포도상구균에 대하여 항균활성을 가진다는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 항균 조성물은 항생제 내성 황색포도상구균을 포함하는 황색포도상구균에 대해 항균활성을 다른 식물 유래 추출물 또는 상업적으로 판매되고 있는 항생제와 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 식물 유래 추출물 또는 항생제와의 혼합사용으로 항균활성에 대한 상승효과를 가지게 된다.
본 발명의 세번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항생제 내성 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus) 일 수 있다.
본 발명의 항생제는 베타락탐계 항생제일 수 있으며, 이에 한정하지는 않으나, 베타락탐계 항생제로는 메티실린, 디클록사신, 옥사실린, 플루클록사신, 아목시실린, 암피실린, 피페라실린, 티카실린, 아즐로실린 및 카르베니실린를 예로 들 수 있다. 본 발명에 모린과 혼합되는 항생제로 더욱 바람직하게는 베타락타메이즈 (β-lactamase) 저해성 페니실린 항생제일 수 있으며, 베타락타메이즈 저해성 페니실린 항생제로는 메티실린, 디클록사신, 옥사실린 및 플루클록사신일 수 있다. 가장 바람직하게는 옥사실린일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 모린-암피실린(표 2), 모린-옥사실린(표 3)의 혼합에 따른 상승효과를 검토하였다.
MRSA ATCC 33591 균주에 대하여 암피실린 250 ㎍/㎖과 모린 61.25 ㎍/㎖를 혼합하여 처리하였을 때, FICI 수치가 0.31로 상승효과를 나타내었다. 또한, 임상검체인 DPS-3에 대하여, 암피실린 0.24 ㎍/㎖과 모린 62.5 ㎍/㎖를 혼합하여 처리하였을 때, FICI 수치가 0.50로 임상검체에 대하여도 상승효과를 나타내었다(표 2 참조).
또한, 모린과 옥사실린을 혼합하여 처리한 경우에는, MRSA 표준균주와 5개의 임상 검체에서 모두 상승효과를 나타나는 것으로 확인되었다. ATCC 33591 균주에 대하여 암피실린 0.97㎍/㎖와 모린 250㎍/㎖를 처리하였을 때 FICI 값이 0.53으로 부분적인 상승효과를 나타내었으며, DPS-1 내지 DPS-5 균주에 대해서도 FICI 값이 0.28 내지 0.75로 상승효과를 나타내었다(표 3 참조).
모린과 베타락탐 항생제의 상승효과를 시간대별로 측정한 타임-킬 분석에서도 모린과 옥사실린을 혼합한 실험군에서 효과적으로 황색포도상구균을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).
본 발명의 상기 항균 조성물에서 항생제는 모린 100 중량부에 대하여 0.001 내지 600 중량부로 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는 모린 100 중량부에 대하여 항생제 50 내지 550 중량부로 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 모린 100 중량부에 대하여 항생제 100 내지 500 중량부로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 MRSA 표준 균주인 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant staphylococcus aureus , ATCC 33591)에 대하여 암피실린 0.97 ㎍/㎖과 모린 250 ㎍/㎖를 혼합하여 처리하는 것이 가장 적은 항생제를 사용하여 MRSA 균주를 사멸시킨다는 것을 확인하였다. 0.97 ㎍/㎖이상의 암피실린과 모린 250 ㎍/㎖를 함께 처리할 때에는 MRSA 표준 균주를 억제하였으나, 0.48 ㎍/㎖ 의 암피실린과 모린 250 ㎍/㎖을 함께 처리할 때에는 MRSA 표준 균주를 사멸시키지 못하였다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 MRSA 표준균주에 대하여 모린 62.25 ㎍/㎖와 옥사실린 250 ㎍/㎖를 혼합하여 처리하는 것이 가장 적은 항생제를 사용하여 균주를 사멸시킨다는 것을 확인하였다.
이를 모린 100 중량부에 대한 값으로 환산하면, 모린 100 중량부에 항생제가 0.001 중량부보다 적게 포함되면, MRSA 균주가 효과적으로 사멸되지 않는 부작용이 발생할 수 있으며, 모린 100 중량부에 항생제가 600 중량부보다 많게 포함되면 불필요하게 항생제가 남용될 수 있다.
본 발명의 항균조성물은 바람직하게는 모린과 옥사실린이 혼합된 항균 조성물일 수 있으며, MRSA 표준 균주인 ATCC 33591 균주에 대하여, 모린 100 중량부에 옥사실린 300 내지 600 중량부로 포함된 항균 조성물일 수 있다. 더욱 바람직하게는 모린 100 중량부에 대하여 옥사실린 350 내지 500 중량부로 포함된 항균 조성물일 수 있다.
본 발명의 모린과 베타락탐계 항생제를 혼합하여 사용하는 것은 항균 활성에 대한 상승효과를 나타내는 것을 특징으로 하며, 황색포도상구균의 PBP2a 단백질 발현을 저해하여, 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 모린, 옥사실린, 모린과 옥사실린을 각각 처리한 균주의 PBP2a 단백질 발현을 측정하였으며, 모린과 옥사실린을 함께 처리하였을 때 PBP2a 단백질의 발현이 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도3 참조). 일반적으로 펩타이드의 교차결합에 관여하는 효소들을 페니실린 결합 단백(penicllin-binding-proteins; PBPs)이라 한다. 이 계열의 항생제들은 페니실린-결합 단백질(penicillin-binding proteins ; PBPs)과 결합을 형성한 후 이 단백질의 활성을 제거함으로써 약효를 발휘한다. 그러나 황색포도상구균이 mec(methicillin resistant determinant) A 유전자를 받아들이거나 여러 경로를 통하여 내성을 획득하면 β-락탐계 항생제에 의해 영향을 받지 않는 변종 페니실린-결합 단백질인 PBP2a가 생성되며 약물 저항성이 나타난다. 이를 통하여, 모린과 옥사실린이 혼합된 항균 조성물은 황색포도상구균의 mecA 유전자에 의하여 발현되는 PBP2a 단백질 을 억제하여 MRSA 균이 항생제에 내성을 갖지 못하도록 하는 효과를 나타내는 동시에 내성의 유무와 상관없이 항균활성을 발휘한다.
따라서, 본 발명의 모린을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물은 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하며, 특히, 모린을 항생제와 함께 병용투여 할 때, 항균에 대한 상승효과가 일어나 항생제의 사용을 대폭 줄일 수 있다. 또한, 모린은 인체에 독성이 없고 부작용이 적은 항균제로 사용할 수 있으며, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 이용하여 의약제품, 의약품, 화장품, 식품 및 동물성 사료에 적용하여 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 세번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 항균 조성물은 식품, 화장품, 의약품에 항생제 내성 황색포도상구균을 포함하는 황색포도상 구균에 대한 보존제(항균물질)로 사용될 수 있으며, 기존이 항생제 대신 동물성 사료에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 모린을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 또는 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 모린을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 또는 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 모린을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 또는 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 50 ㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 오미자 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 모린을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 또는 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 모린을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물 또는 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 화장료 조성물에 활용될 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 준비
1-1) 재료 준비
본 실험에 사용한 암피실린, 옥사실린 그리고 모린(C15H10O7)은 시그마로부터 구입하였으며, 영양 배지로는 Difco-Mueller-Hinton broth(MHB)를 사용하였다. 또한, 마우스 항-PBP2a 항체는 DiNonA Inc로부터 구입하였다.
1-2) 메티실린 내성 황색포도상구균 준비 및 배양 조건
모린의 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus; MRSA, 이하 'MRSA'로 표기함)에 대한 항균활성 여부를 확인하기 위하여, 6개의 MRSA 균주를 준비하였다. 5개의 MRSA 균주는 원광대학교 병원 5명의 환자로부터 수득하였으며, 다른 하나의 균주는 S.aureus ATCC 33591(메티실린 내성 균주)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 상업적으로 구입하여 수득하였다.
모든 균주는 사용하기 직전까지 -70 ℃의 온도에서 30% 글리세롤에 보관하였으며, 실험에 사용하기 위해 뮬러-힌트 배지(Mueller-Hinton broth; MH broth)에 현탁시킨 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 뮬러-힌트 아가(MH agar) 및 뮬러-힌트 배지(MH broth)는 미국의 디프코사(Difco Laboratories)에서 구입하여 사용하였다. 모든 균주는 MH agar에서 유지시켰으며, 항균활성 측정(antibacterial assays)은 MH broth에서 수행하였다. 균주의 성장은 600nm에서 OD(optical density) 값으로 혼탁도(turbidity)를 측정하였다.
모린의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 최소억제농도 측정
모린의 황색포도상구균에 대한 항균효과를 알아보기 위해 균주를 억제하는 최소 억제 농도(Minimum inhibitiry concentration, MIC)에 대한 실험을 진행하였다.
최소억제농도 (Minimum inhibitory concentrations, MICs)의 측정은 CLSI 가이드 라인(Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines, 2006)에 기술된 액체배지미량희석법(broth microdilution method)에 따라 수행하였으며, 황색포도상구균에 대한 모린의 최소억제농도 값은 마이크로플레이트(microplate) 및 마이크로튜브(micro tube)를 이용하여 측정하였다.
실험 전, 모린은 DMSO(diluted using MHbroth; v/v)를 이용하여 연속 2배 희석으로 96-웰 플레이트(96 well plates)와 마이크로튜브(micro tube)에 준비하였다. 황색포도상구균 접종물들은 0.5 McFarland standard (약 1.58 colony-forming units (CFU)/㎖)로 조정하였으며, 최종적으로 접종물들은 약 1.55 CFU/spot로 희석되었다. 최소억제농도 값은 37℃에서 24시간 동안 배양하여 황색포도상구균의 성장이 억제되는 가장 낮은 농도로서 정의하였다.
| S. aureus strains | MIC (㎍/㎖) | ||
| Morin | Ampicillin | Oxacillin | |
| ATCC 33591 | 500 | 1000 | 31.25 |
| DPS-1 | 125 | 250 | 15.6 |
| DPS-2 | 250 | 1.95 | 1.95 |
| DPS-3 | 250 | 15.6 | 500 |
| DPS-4 | 250 | 15.6 | 500 |
| DPS-5 | 250 | 250 | 500 |
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 모린의 최소억제농도는 125 ~ 500 ㎍/㎖로 확인되었으며, 6종의 메티실린 내성 황색포도상구균 모두에 높은 항균활성을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 암피실린 항생제의 최소억제 농도는 1.95 ~ 1000 ㎍/㎖로 확인되었으며, 옥사실린 항생제의 최소억제농도는 1.95 ~ 500 ㎍/㎖로 나타났다.
본 발명의 모린을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 125 ~ 500 ㎍/㎖의 농도로 황색포도상구균을 억제할 수 있는 것으로 보이며, 몇몇 균주에서는 항생제보다 더 적은 농도에서 더욱 뛰어난 항균효과를 가지는 것으로 보인다. 즉, 모린은 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하여, 이를 활용하여 의약제품, 약품, 화장품, 건강기능 식품에 적용하여 유용하게 활용할 수 있다.
모린과 항생제의 혼합에 따른 상승효과 확인
본 실시예 3은 모린과 항생제 사이의 상호 영향을 확인하기 위하여 실시되었다. 항생제 중에서도 특히 베타-락탐계 항생제와의 영향을 확인하기 위하여 실시되었다. 베타-락탐계 항생제 중 좁은 스펙트럼의 베타-락타메이즈 저해성 페니실린인 옥사실린과 중간 스펙트럼의 페니실린인 암피실린을 선정하였다.
MHA(Mueller-Hinton agar)에서 밤새 배양된 집락을 취하여 최종적으로 1.5 ×105 CFU/spot으로 접종하였다. 96웰-플레이트에 혼합효과를 측정할 모린과 옥사실린, 모린과 암피실린을 최고 농도에서 연속 2배 희석하여 모린은 수평축으로 항생제는 수직축으로 각 웰에 연속적으로 희석하였다. 이후 37 ℃에서 24시간 동안 배양한 후에 모린과 항생제의 상호적으로 억제한 가장 낮은 농도로서 정의하였으며, 두 약재 사이의 상호작용은 FIC(fractional inhibitory concentration)으로 나타내었다.
FIC index는 하기 공식에 따라 계산되었다.
A는 A 희석열에서 억제효과를 보이는 최소농도이며, B는 B열에서 억제효과를 보이는 최소농도이다. MICA와 MICB는 모린과과 항생제(암피실린 또는 옥사실린) 각각의 최소억제농도이다. FIC index가 0.5 이하이면 상승효과(synergism), 0.5초과 0.75 이하이면 부분적 상승효과, 0.75 초과 1 이하이면 첨가효과, 1 초과 4 이하이면 효과 없음, 4 초과이면 길항작용(antagonism)으로 정의하였다.
| S. aureus strains |
Minimum Inhibitory Concentrations(㎍/㎖) | |||||
| Morin | Amp | Morin + Amp | FIC (morin/amp) |
FICI | 효과 | |
| ATCC33591 | 500 | 1000 | 61.25 + 250 | 0.06/ 0.25 | 0.31 | 상승효과 |
| DPS-1 | 125 | 250 | 31.25 + 125 | 0.25/ 0.5 | 0.75 | 부분적 상승효과 |
| DPS-2 | 250 | 1.95 | 62.5 + 0.24 | 0.25/ 0.12 | 0.37 | 상승효과 |
| DPS-3 | 250 | 15.6 | 125 + 7.8 | 0.5/ 0.5 | 1.0 | 첨가효과 |
| DPS-4 | 250 | 15.6 | 125 + 7.8 | 0.5/ 0.5 | 1.0 | 첨가효과 |
| DPS-5 | 250 | 250 | 125 + 62.5 | 0.5/ 0.25 | 0.75 | 부분적 상승효과 |
| S. aureus strains |
Minimum Inhibitory Concentrations(㎍/㎖) | |||||
| Morin | Oxa | Morin + Oxa | FIC (morin/Oxa) |
FICI | 효과 | |
| ATCC33591 | 500 | 31.25 | 250 + 0.97 | 0.5/ 0.03 | 0.53 | 부분적 상승효과 |
| DPS-1 | 125 | 15.6 | 7.8 + 3.9 | 0.03/ 0.25 | 0.28 | 상승효과 |
| DPS-2 | 250 | 1.95 | 62.5 + 0.97 | 0.25/ 0.5 | 0.75 | 부분적 상승효과 |
| DPS-3 | 250 | 500 | 62.5 + 62.5 | 0.25/ 0.12 | 0.37 | 상승효과 |
| DPS-4 | 250 | 500 | 62.5 + 125 | 0.25/ 0.25 | 0.5 | 상승효과 |
| DPS-5 | 250 | 500 | 62.5 + 125 | 0.25/ 0.25 | 0.5 | 상승효과 |
상기 표2에 나타난 결과 값과 같이, 모린과 암피실린을 혼합하였을 경우, 황색포도상구균에 대하여 상승효과, 부분적 상승효과 및 첨가효과를 나타내는 것으로 모린 또는 암피실린은 단독으로 처리하였을 때보다 최소억제농도가 2배 내지 16배 감소하였다.
또한, 상기 표3에 나타난 결과 값과 같이, 모린과 옥사실린을 혼합하였을 경우, 황색포도상구균에 대하여 상승효과 및 부분적 상승효과를 나타내었으며, 모린 또는 옥사실린을 단독으로 처리하였을 때보다 최소억제농도다 2배 내지 32배 감소하였다.
즉, 결론적으로 모린과 베타락탐계 항생제를 혼합 사용할 경우, 더욱 뛰어난 MRSA 억제 효과를 발휘함을 확인하였다.
모린과 항생제의 혼합에 따른 Time-kill 분석
본 실시예4는 MRSA에 대해 모린과 베타락탐 항생제의 상승효과를 시간대별로 측정하기 위하여 수행하였다. 실험 균주에 대한 타임-킬 분석은 Fu et al., phytotherapy research, 21:989-994(2007) 및 choi et al., journal of microbiology and biotechnology, 18:1848-1852(2008)의 방법을 변형하여 측정하였으며, 자세하게는 다음과 같이 측정하였다.
시험균주는 MH broth에 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양하였고, 이후 모린과 항생제를 연속 2 배 희석하여 모린은 수평축으로 베타락탐 항생제를 수직축으로 각 웰이 연속적으로 희석하였으며, MRSA의 접종물은 MIC 실험법과 동일하게 하여 최종적으로 약 1.5 ×105 CFU/well이 되도록 첨가하였다. 이후 0, 4, 8, 16, 24 시간 동안 37 ℃에서 각각 배양한 후 600nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다. 콜로니 계수의 최소 감도는 100 CFU/㎖ 이며, 사용된 항균제는 기존 최소억제농도보다 낮은 농도에서 실시하였으며, 본 실험은 3회 이상 수행한 후, 결과값의 평균값을 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 모린과 베타락탐 항생제의 혼합사용의 상승효과는 타임-킬 분석을 통해 확인되었다. 도 1에서는 24시간 동안 모린 또는 옥사실린의 단독처리에서 균의 세포 사멸을 유도하지 않았다. 반면, 모린과 옥사실린을 함께 사용할 때, 24시간의 관찰 시간동안 신속하고 효과적인 항균 효과를 나타내었다. ½모린 MIC 농도와 ½옥사실린 MIC 농도를 혼합한 항균 조성물은 24시간 후에 3log10 CFU/㎖(DPS-1, DPS-3)으로 효과적인 항균효과를 보였다. 따라서 모린과 베타락탐 항생제, 특히 베타락타메이즈 저해성 페니실린이 혼합된 조성물을 효과적인 항균제로 사용이 가능할 것이며, 우수한 신약후보물질이 될 수 있을 것으로 사료된다.
모린과 항생제 혼합에 따른 PBP2a 발현량 관찰
본 발명자들은 모린과 옥사실린의 조합이 mecA 유전자에 의해 코딩되는 PBP2a 단백질의 수준에 영향을 미칠 것으로 기대하고, PBP2a 발현량 관찰을 위한 웨스턴블롯을 수행하기 위하여, MRSA 배양(ATCC 33591)은 MHB에서 배양하였으며, OD600에서 0.4가 되도록 균을 배양하였다. 배양된 균주 세포에 30분간 모린, 옥사실린, 모린과 옥사실린을 각각 처리한 후에 세포를 용해시켜 세포내 단백질을 준비하였다. 단백질 농도는 바이오래드(Hercules, CA) 단백질 분석을 통해 측정하였다. 세포 용해물을 튜브에 옮긴 후, 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 웨스턴블롯 분석에서 전기영동 겔은 아머샴 하이본드 TM-P-멤브레인(GE Healthcare, 서울)로 옮겨졌으며, 멤브레인에 마우스 항-PBP2a 일차항체를 처리하여 PBP2a 단백질을 표지하고, 2차로 면역글로불린 G 이차항체로 표지하였다. 로딩 차이는 단일클론 항-글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소로 표준화하였다. 웨스턴 블롯에 나타난 밴드는 LAS-4000 미니 화학발광 이미지를 이용하여 시각화하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 모린 또는 암피실린을 단독으로 처리하였을 때에는 미미하게 PBP2a의 단백질 발현량이 감소하였으나, 모린과 암피실린은 함께 처리하였을 때, 확연하게 PBP2a 단백질의 발현량이 감소함을 알 수 있었다.
즉, 옥사실린과 모린을 함께 처리하였을 때 MRSA에 PBP2a 단백질 발현이 억제되고, 그로인해 MRSA가 사멸되는 것이 확인되었다. 따라서, 모린은 MRSA에 대하여 베타락탐 항생제의 효과를 증강시킨다.
모린 처리에 의한 황색포도상구균 세포막 변화 관찰
모린 처리에 의한 메티실린 내성 황색포도상구균의 세포막은 TEM(transmission electron microscope)를 이용하여 관찰하였다.
먼저, MRSA의 대수증식기배양(exponential-phase culture)는 MH broth 배지에서 하룻밤 동안 배양시킨 후 희석하여 준비한 다음, 중간-로그기(mid-logarithmic phase)에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. MH broth에서 성장한 대수기 MRSA(MHB-grown exponential-phase MRSA)에 125 ㎍/㎖ 및 250 ㎍/㎖ 농도의 모린을 첨가하여 30분간 반응시킨 다음, 2㎖의 배양액을 10,000×ｇ에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 남아있는 세포 펠렛(pellets)은 Karnovsky fixative (2.5% glutaraldehyde 및 2% paraformaldehyde)를 사용하여 세포를 고정시켰으며, 투과전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope; LIBRA 120; Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 관찰하였다. 투과된 전자 시그널은 전자현미경에 부착된 4 ×4 k2 slow-scan charge-coupled device camera (Ultrascan 4000 SP; Gatan, 캐나다)를 이용하여 기록하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 모린을 처리하지 않은 MRSA 균주는 별개의 격막이 관찰(도 4A)되는 반면, 125 ㎍/㎖ 농도의 모린을 처리한 경우(도 4B), MRSA 균주의 세포막이 손상된 것을 확인하였다. 또한, 250㎍/㎖ 농도의 모린을 처리한 경우(도 4C)에는 MRSA 균주의 세포막이 파괴되어 세포질이 분리된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 모린을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균 조성물은 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하며, 인체에 독성이 없고 부작용이 적은 항균제로 사용할 수 있다. 또한, 모린과 베타락탐 항생제를 혼합하여 사용할 경우, 모린의 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성이 증가하므로, 이를 활용하여 의약제품, 약품, 화장품, 건강기능 식품에 적용하여 유용하게 활용할 수 있다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- 모린(morin)을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant staphylococcus aureus , ATCC 33591)인 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 모린은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
[화학식 1]
- 제1항의 모린과 베타락탐계 항생제를 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant staphylococcus aureus , ATCC 33591)인 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 베타락탐계 항생제는 메티실린, 디클록사신, 옥사실린, 플루클록사신, 아목시실린, 암피실린, 피페라실린, 티카실린, 아즐로실린 및 카르베니실린으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 모린과 베타락탐계 항생제를 혼합하여 사용하는 것은 항균 활성에 대한 상승효과를 나타내는 것을 특징으로 하며, 황색포도상구균의 PBP2a 단백질 발현을 저해하여, 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 의약품.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 화장품.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 건강기능식품.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 동물 사료.
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