KR20170045023A

KR20170045023A - 강글리오사이드 gd3을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물

Info

Publication number: KR20170045023A
Application number: KR1020150144897A
Authority: KR
Inventors: 추영국; 곽동훈
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2017-04-26
Also published as: KR101773343B1

Abstract

본 발명은 강글리오사이드 GD3(Ganglioside GD3)를 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells)로부터 조골세포(osteoblast) 분화 유도용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 강글리오사이드 GD3는 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화유도된 조골세포에서 발현이 증가하고, ERK1/2와 MEK1/2를 활성화시켜 중간엽 줄기세포를 조골세포로 유의적으로 분화유도하는 효과를 가지므로, 상기 강글리오사이드 GD3는 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물, 분화유도 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

강글리오사이드 GD3을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물{Composition for inducing differentiation of the Mesenchymal Stem Cells into osteoblast containing Ganglioside GD3 as an active ingredient}

본 발명은 강글리오사이드 GD3(Ganglioside GD3)을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells)로부터 조골세포(osteoblast) 분화 유도용 조성물, 및 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도 방법에 관한 것이다.

최근 세포막표면에 존재하는 수많은 종류의 당단백질, 당지질을 이루고 있는 복합당쇄는 세포간의 인식, 접착 등의 상호작용에 의한 세포의 암(cancer)화 및 암 전이, 박테리아 및 비루스의 숙주세포에의 감염, 세균독소의 접착, 백혈구와 같은 면역담당세포의 분화 유도 등을 포함하는 수정 및 발생, 분화의 과정에서 결정적인 역할을 하고 있는 것으로 보고되고 있다. 이들 중 특히 강글리오사이드 (Ganglioside)는 시알산(sialic acid)을 함유하는 스핑고당지질로서 대부분의 포유동물 세포의 이중막 바깥쪽에 위치하며 세포 성장과 분화와 관련하여 중용한 세포 생물학적 조절 기능을 담당하고 있다. 이들 대두분은 세포막상에 삽입되어 있으며 세포막의 지질 중 약 5%를 이루고 있다. 강글리오사이드의 합성은 세포기관 중 골지체에서 이루어지는데 글루코실세라미드(glycosylceramide)에 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), N-아세티 갈락토사민(N-acetyl galactosamine) 및 시알산 등이 붙어 올리고당 사슬을 이룬다. 이러한 강글리오사이드는 특히 세포-세포 접착, 항암, 세포분화 및 성장 그리고 세포 간 신호전달에 관여한다는 사실이 최근 속속 알려지면서 현재는 각종 질환의 발생원인규명에서 이들의 역할이 큰 주목을 받고 있다. 최근 이들과 관련된 중요한 연구보고 중 몇 가지를 보면 뉴런(neuron)에서 강글리오사이드의 항상성 조절은 NPC1(Nieman-Pick disease type C)에 의해 매개되고, 종양이 진행되면 강글리오사이드 GD3가 과발현된다는 것이 밝혀지고 있다.

중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells)는 성체 줄기세포의 하나로, 배아줄기세포에서 일반적으로 문제가 되는 암화나 윤리적인 문제에서 자유로울 뿐 아니라 지방세포, 골세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하다고 보고되어 있다. 또한, 중간엽 줄기세포는 이식 시에도 면역반응을 유발시키지 않기 때문에 세포치료의 효과적인 수단으로 각광받고 있다.

그러나, 중간엽 줄기세포로부터 분화가 완전히 진행된 세포를 공급자의 조직으로부터 분리하여 환자에게 이식하는 방법으로는, 환자에게 공급할 충분한 세포를 얻는데 어려움이 있다. 따라서, 이러한 세포 공급의 문제를 해결하기 위하여, 중간엽 줄기세포를 분리하고 이를 체외에서 배양 및 증식시킨 다음, 원하는 계통의 세포로 분화를 유도하고, 이렇게 분화된 세포를 환자에게 이식하는 기술을 확립하는 것이 연구되고 있다.

구체적으로, 최근 뇌에서 중간엽 줄기세포가 신경교세포로 분화하는 잠재력을 지닌 것으로 알려지면서, 중간엽 줄기세포를 이용하여 중추신경계의 질병을 치료할 수 있다는 가능성이 제기된바 있다(Li et al., Neurosci. Lett., 315, 67-70(2001); 및 Chen., et al., Stroke 32, 1005-1011(2001)). 이에, 중간엽 줄기세포로부터 신경세포로의 분화를 유도하는 물질로 성장인자 또는 호르몬을 사용하는 방법이 알려져 있으나, 이 경우 신경세포 이외의 다른 여러 가지 세포들이 추가로 생겨난다는 문제점이 있어(Sanchez-Ramos., et al., Exp. Neurol., 164, 247-256(2000); Woodbury., et al., J. Neurosci. Res., 61, 364-370(2000); 및 Deng., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 282, 148-152(2001)), 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화되도록 유도하는 직접적인 방법의 개발이 계속 요구되고 있는 실정이다.

또한, 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 유도하여 조직공학 또는 세포치료제로서 연골을 제작하는 기술에 대한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 중간엽 줄기세포를 이용하여 연골세포로의 분화를 유도하는 방법이 명확히 제시되지 못하고 있다.

아울러, 골수 유래 성체 줄기세포가 골형성 세포로 분화되는 것이 확인되었고(Friedenstein A.J. et al., Transplantation., 6:230-247, 1968), 골수로부터 분리한 줄기세포를 배양하여 골아세포로 분화 증식시키는 방법에 진전이 있으며 이를 통한 임상적용의 가능성이 높아지고 있다(Ohgushi H. et al., J. Biomed Mater Res., 48:913-927, 1999). 따라서, 중간엽 줄기세포로부터 골세포를 분화시키는 방법이 주도적으로 연구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포로부터 조골세포를 분화유도하는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포(minipig adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)로부터 분화유도된 조골세포에서 강글리오사이드 GD3의 발현이 증가하고, 상기 강글리오사이드 GD3이 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포의 조골세포 분화를 ERK1/2와 MEK1/2를 활성화시켜 분화유도함으로 확인하여, 상기 강글리오사이드 GD3을 중간엽 줄기세포의 조골세포 분화 유도용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

Characterization of GD3 ganglioside as a novel biomarker of mouse neural stem cells, Yoshihiko Nakatani, Makoto Yanagisawa, Yusuke Suzuki and Robert K Yu, Glycobiology, Volume 20, Issue 1, pp. 78-86 Ganglioside GD3: structure, cellular distribution, and possible function, Thomas N. Seyfrieda, Robert K. Yu, Molecular and Cellular Biochemistry September 1985, Volume 68, Issue 1, pp 3-10 Suppression of Ganglioside GD3 Expression in a Rat F-11 Tumor Cell Line Reduces Tumor Growth, Angiogenesis, and Vascular Endothelial Growth Factor Production, Guichao Zeng, Luoyi Gao, Stephane Birkle, and Robert K. Yu, Cancer Research, December 1, 2000 60; 6670 Synthetic studies on cell-surface glycans. 65. Highly stereoselective synthesis of ganglioside GD3, Yukishige Ito, Masaaki Numata, Mamoru Sugimoto, Tomoya Ogawa J. Am. Chem. Soc., 1989, 111 (22), pp 8508?8510 β-Amyloid-Induced Synthesis of the Ganglioside Gd3 Is a Requisite for Cell Cycle Reactivation and Apoptosis in Neurons, Agata Copani, Daniela Melchiorri, Andrea Caricasole, Francesca Martini, Patrizio Sale, Roberto Carnevale4, Roberto Gradini, Maria Angela Sortino, Luisa Lenti, Ruggero De Maria, and Ferdinando Nicoletti, The Journal of Neuroscience, 15 May 2002, 22(10): 3963-3968

본 발명은 목적은 강글리오사이드 GD3(Ganglioside GD3)을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells)로부터 조골세포(osteoblast) 분화 유도용 조성물, 및 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도 방법에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 강글리오사이드 GD3(Ganglioside GD3)을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells)로부터 조골세포(osteoblast) 분화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포에 강글리오사이드 GD3을 처리하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 강글리오사이드 GD3에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 강글리오사이드 GD3(Ganglioside GD3)는 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포(minipig adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)로부터 분화유도된 조골세포(osteoblast)에서 발현이 증가하고, ERK1/2와 MEK1/2를 활성화시켜 중간엽 줄기세포를 조골세포로 유의적으로 분화유도하는 효과를 가지므로, 상기 강글리오사이드 GD3는 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물, 분화유도 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 미니돼지 유래 중간엽 줄기세포(minipig adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)의 조골세포(osteoblast)로의 분화에서 관련 강글리오사이드(Ganglioside) 발현을 확인한 도이다.
도 2는 강글리오사이드 GD3 합성유전자의 제어를 통한 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화관련 ERK1/2와 MEK1/2 활성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 3은 강글리오사이드 GD3 합성유전자의 제어를 통한 조골세포 분화 억제효과를 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 강글리오사이드 GD3(Ganglioside GD3)을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells)로부터 조골세포(osteoblast) 분화 유도용 조성물을 제공한다.

상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 배아 및 제대혈로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것이 바람직하고, 지방유래인 것이 보다 바람직하며, 미니돼지 지방유래인 것이 가장 바람직하다.

상기 강글리오사이드 GD3은 ERK1/2 및 MEK1/2을 발현을 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 미니돼지 지방 유래 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양한 후, 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화에서 관련 강글리오사이드 발현을 확인한 결과, 분화유도된 조골세포에서 강글리오사이드 GD3이 유의적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 1 참조).

또한, 본 발명자들은 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화에서 관련 ERK1/2와 MEK1/2 활성을 확인한 결과, 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양하고 조골세포 분화유도물질을 처리하여 조골세포로 분화를 유도할 경우, ERK1/2의 활성 및, ERK1/2의 상위 조절기전인 MEK1/2의 활성이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 강글리오사이드 GD3 합성유전자의 제어를 통한 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화관련 ERK1/2와 MEK1/2 활성 억제 효과 및 조골세포분화 억제 효과를 확인한 결과, 강글리오사이드 GD3 합성유전자 siRNA를 처리한 후, 분화유도된 세포에서 강글리오사이드 GD3 발현 및 조골세포로의 분화가 현저히 억제된 것을 확인하였다(도 3a 및 3b 참조). 또한, 강글리오사이드 GD3 합성유전자 제어에 따른 분화된 조골세포에서 조골세포 분화에 중요한 기전인 ERK1/2와 그 조절 인자인 MERK 1/2의 활성이 유의적으로 억제됨을 확인하였다(도3 C 및 도3 D 참조).

따라서, 본 발명의 강글리오사이드 GD3는 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화유도된 조골세포에서 발현이 증가하고, ERK1/2와 MEK1/2를 활성화시켜 중간엽 줄기세포를 조골세포로 유의적으로 분화유도하는 효과를 가지므로, 상기 강글리오사이드 GD3는 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 강글리오사이드 GD3에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화 검출용 조성물을 제공한다.

상기 강글리오사이드 GD3에 특이적으로 결합하는 물질은 강글리오사이드 GD3에 특이적으로 결합하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체 단편, 항체 모방체 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.

상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 배아 및 제대혈로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것이 바람직하다.

상기 검출은 항체분석, 화학발광분석 및 질량 분광분석방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 강글리오사이드 GD3은 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화유도된 조골세포에서 발현이 증가하므로, 상기 강글리오사이드 GD3에 특이적으로 결합하는 물질은 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화 검출용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 분화유도된 조골세포를 제공한다.

본 발명의 강글리오사이드 GD3은 ERK1/2와 MEK1/2를 활성화시켜 중간엽 줄기세포를 조골세포로 유의적으로 분화유도하는 효과를 가지므로, 상기 방법으로 분화유도된 조골세포는 골질환 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명의 치료제는, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화하는 것을 생각된다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다. 또한, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수가 있다.

주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다.

유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로 카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.

환자의 체내에의 투여는 바람직하게는 비경구투여이며, 구체적으로는 정맥에의 1회 내지 3회의 투여가 기본이지만 그 이상의 투여라도 좋다. 또, 투여 시간은 단시간이라도 장시간 지속 투여라도 좋다. 더욱 구체적으로는, 주사제형, 경피투여형등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 선택적 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사, 골수액강내 주사 등에 의해 투여할 수가 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다. 정맥내 주사의 경우, 통상의 수혈의 요령에서의 이식이 가능해져 환자를 수술할 필요가 없고, 나아가 국소 마취도 필요 없기 때문에, 환자 및 의사 쌍방의 부담이 가볍다. 또 병동에서의 이식 조작이 가능한 점으로써 매우 적합하다. 장래의 구급의료의 발전을 고려하면, 구급 반송중, 혹은 발증 현장의 투여도 생각할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 미니돼지 지방 유래 중간엽 줄기세포( minipig adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)의 분리 및 배양

미니돼지 지방 조직을 채취하여 배양액이 담겨 있는 배양 접시에 넣고 매스와 가위로 잘게 부순 후 조직에 트립신을 처리하여 세포를 낱개로 분리하였다. 그런 다음 거즈로 상기 조직 및 덩어리를 걸러낸 후 4000 rpm으로 20분간 원심분리기로 원심분리하여 순수 세포만 분리한 후 배양 접시에 배양하였다.

상기 배양은 분리된 중간엽 줄기세포를 FBS 10%, P.S 1% 및 20 ug/ml로 희석된 Basic fibroblast growth factor를 0.5 ul/ml로 첨가된 DMEM 배양액에서, 37℃, CO₂ 5% 인큐베이터에서 배양하였다.

< 실험예 1> 미니돼지 유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화에서 관련 강글리오사이드( Ganglioside ) 발현 확인

미니돼지 유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화에서 관련 강글리오사이드 발현을 확인하였다.

<1-1> 미니돼지 유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화 유도

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 분리 및 배양한 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포에 분화유도물질인 dexamethasone(Sigma Cat.D-1756) 100 nM, ascorbic acid 2-phosphate(Sigma Cat.A8960) 200 uM, β-glyceroposphate(Sigma Cat.G9422) 10mM을 DMEM 배양액(Gibco Cat.11995), FBS 10%(Gibco Cat.16000), penicillin streptomycin 1%(Gibco Cat.15140), Basic fibroblast growth factor (20ug/ml로 희석하여 0.5 ul/ml로 사용 R&D system)에 21일간 2~3일 간격으로 배양액을 바꿔주며 조골세포로 분화를 유도하였다.

분화 유도된 조골세포는 Alizarin S red 염색법으로 염색하여 분화 21일 후 붉은 색으로 염색된 조골세포 확인 및 조골세포 마커인 osteopotin과 osteocalcin의 mRNA 발현을 통해 확인하였다.

구체적으로, 알리자린 s 염색은 Alizarin Red S 2 g을 2차 증류수 100 ml에 희석시킨 후 HCL과 NH₄OH를 사용하여 pH를 4.1~4.3으로 조정한 후 사용하였다. 분화된 세포를 DPBS로 세척하고, 포르말린 10% 용액으로 30분 동안 세포를 고정시킨다. 이후 2차 증류수로 세포 표면을 세척해주고, Alizarin Red S 용액을 배양 접시 별 용량에 맞게 넣어 세포층을 덮어준 후 빛이 들어가지 않게 호일 같은 것으로 감싸주고 실온에 45분 동안 염색한다. 염색 후 2차 증류수 1 ml로 4번 세척한다. 이후 DPBS로 넣고 현미경으로 관찰한다.

또한, 조골세포 마커인 osteopotin과 osteocalcin의 mRNA 발현을 확인하기 위하여, 분화 유도된 조골세포에 RNA를 트리졸을 사용하여 채취하였고, AccuPower사에서 나온 RT Primix를 사용해 RNA 1000 ng과 Oligo-dT 200 pM로 RT-PCR을 하였고, 얻은 cDNA와 osteopotin은 프라이머(Gnotect제작) F-5`GAGCAAACAGACGATGTGGA3`(서열번호: 1), R-5`GAAATCGGTGACCAGCTCAT3`(서열번호: 2), osteocalcin은 프라이머(Gnotect제작) F-5`AAAGCCTAGTGGTGCGGA3`(서열번호: 3) R-5`ATGCCATAGAAGCGCCGATA3`(서열번호: 4)를 각 20 pm씩 사용하여 57.3℃에서 PCR을 하여 얻은 것을 전기영동 후 상기 osteopotin과 osteocalcin의 mRNA 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포에서 분화 유도된 조골세포를 Alizarin S red 염색법으로 염색하여 분화 21일 후 붉은 색으로 염색된 조골세포를 확인하였고, 조골세포 마커인 osteopotin과 osteocalcin의 mRNA도 유의적으로 발현하는 것을 확인하였다(도 1a).

<1-2> 분화유도된 조골세포에서 강글로사이드 발현 확인

상기 실험예 <1-1>에서 분화 유도된 조골세포에서 강글리오사이드 발현을 HPTLC법으로 확인하였다.

구체적으로, 분화된 조골세포를 cell scraper로 긁어 모아서 conical tube로 옮긴 후 실온에서 centrifuge로 2000 rpm으로 5분간 실시하였다. 침전된 세포 외의 배양액은 제거하고, DPBS로 침전된 세포를 풀어주며 세척하고, 다시 2000 rpm 5분간 실온에서 centrifuge를 하였다. 침전된 세포 외의 DPBS를 제거한 후 D.W 550 ul로 세포를 풀어준 후 Ep tube로 옮긴 후 ice위에서 실험하였다. Ep tube에 있는 세포액을 음파처리(sonication) 20~30 amplitude에서 약간 뜨거워질 때까지 음파처리 하고 ice에 넣어 식힌 후 다시 2번 반복해 음파처리하였다. 음파처리 한 액 550 ul중 50 ul는 따로 담아 15,000 rpm으로 원심분리 후 단백질 양을 측정하고 이후 HPTLC 실험에 정량 값으로 사용하였다. 남은 500 ul는 긴 유리병(18Φ125 mm)으로 옮긴 후 2 ml에 메탄올과 4 ml에 클로로포름을 넣어준 후 10분간 실온에서 voltaxing한 후, 37℃인 진탕 배양기(shaking incubator)에서 30분간 90 rpm에 넣어둔 이후 진탕 배양기에서 꺼내고 액에 2 ml에 메탄올을 추가로 넣어주고 voltaxing 하였다. 액을 1500 rpm으로 10분간 실온에서 원심분리를 해 지방 성분 외에 찌꺼기를 침전시키고, 상층 액은 새 유리병으로 옮겨 찌꺼기를 제거하였다. 다시 2 ml에 메탄올과 4 ml에 클로로포름을 이용하여, 상기 침전과정까지를 반복하여 지방 성분이 아닌 찌꺼기를 제거하였다.

액은 23Φ90 mm 인 유리병으로 옮겨 담고 30℃에서 질소 가스(N₂)로 완전히 바닥까지 말려주었다. 샘플은 이 상태에서 -80℃에 장기간 보관 가능하다.

다음은 산성 지질을 추출과정으로, 말린 샘플에 클로로포름 30 ml, 메탄올 60 ml, 2차 증류수 8 ml로 만든 액을 8 ml 넣어주고, 음파처리를 20분간 하였다. 샘플을 거르기 위해 파스테르 파이펫(pasteure pipette)을 사용하는데, 파이펫에 얇아지는 위치를 유리섬유를 넣어 막고, 섬유 5 cm위를 표시해 주었다. 파이펫은 스탠드에 수직으로 고정시키고, 상기 표시한 5 cm까지 DEAE sephadex A25액(사용 하루 전에 만들어야 하며 DEAE sephadex A25 3 g에 클로로포름 30 ml, 메탄올 60 ml, D.W 8 ml을 넣어 만든다.)을 sephadex가 쌓이도록 넣어주었다. 이때 나오는 액을 비커에 받쳐 버렸다. 쌓인 sephadex위에 클로로포름 30 ml, 메탄올 60 ml, 2차 증류수 8 ml으로 만들어진 액 20ml을 넣어 여과시켰다. 음파처리한 샘플은 전의 액을 다 여과한 후 sephadex위에 넣어주고, 여과 후 클로로포름 30 ml, 메탄올 60 ml, 2차 증류수 8 ml으로 만들어진 액 35 ml을 다시 여과하였다. 전의 여과가 끝나면 클로로포름 30 ml, 메탄올 60 ml, 0.8M Sodium Acetate 8 ml으로 만든 액을 15 ml를 여과하며 이 과정부터 여과되어 나오는 액은 23Φ90 mm인 유리병에 받았다. 샘플이 모두 여과되면 30℃에서 질소가스로 바닥까지 완전히 말려주었다. 말린 병에 12N 암모니아액 25 ul와 클로로포름과 메탄올을 1:1로 썩은 액을 500 ul 넣어주고, 16시간 동안 실온에 보관하였다. 16시간 이후 샘플은 다시 30℃에서 질소가스로 바닥까지 완전히 말려주고, 병에 2차 증류수 500 ul를 넣고 20분간 음파처리기로 증류수에 잘 녹게 하였다.

이후는 강글리오사이드 추출과정으로 Hamilton 주사기와 Sep-pak C18 카트리지를 연결하여 스탠드에 수직으로 고정시켰다. 고정된 주사기에 메탄올 - 클로로포름 - 메탄올 - 2차 증류수를 순서대로 5 ml 2번씩 넣어 여과하였다. 나오는 여과액은 비커에 받아 버렸다. 이후 음파처리된 샘플액 500 ul를 넣어 여과시켰다. 이후 샘플을 담았던 병을 2차 증류수 500 ul로 세척하고 주사기에 넣어 여과시킨다. 주사기에 2차 증류수 5 ml을 2번 여과시키고, 이후 여과액을 23Φ90 mm인 유리병에 받을 준비를 하였다. 주사기에 메탄올 2 ml - 클로로포름과 메탄올을 2:1로 썩은 액 4 ml 순으로 주사기에 넣어 여과해 받았다. 클로로포름과 메탄올에 여과가 끝나면 샘플은 다시 30℃에서 질소가스로 바닥까지 완전히 말려주고, Sep-pak C18 카트리지는 메탄올 5ml을 여과시켜 세척하고 이후 3회까지 같은 샘플 여과에 사용할 수 있다.

다음은 HPTLC과정이다. silica gel plate에 미리 선을 그어 준비를 하는데, 바닥 쪽으로 사용할 면은 판 밑에서 1.5 cm에 수평으로 선을 긋고, 오른쪽과 왼쪽면은 판 끝에서 1 cm에서 수직으로 선을 긋고 밑면으로부터 1.5 cm 지점에서 6 cm위에 지점에 선을 그어 샘플이 올라가 부분을 표시해 준다. 또한, 샘플찍는 곳은 밑면으로부터 1.5 cm에 그은 선위에 찍는데, 선위에 5 mm 거리를 표시하고 샘플을 찍고 다른 샘플들과는 3 mm 만큼 거리를 벌린다. 5 mm-3 mm-5 mm-3 mm-5 mm 이런 방식으로 사용할 샘플만큼 선위에 수직으로 선을 그려 표시해준다. 샘플은 초기에 정량했던 값을 기준으로 5 mg/100 ul에 농도로 맞추어 클로로포름과 메탄올 1:1로 썩은 액으로 희석한다. 만든 샘플액은 silica gel plate에 표기한 곳에 20~40 ul를 얇은 유리관을 이용해 찍어주는데, 10 ul씩 나누어 찍으며 silica gel plate에서 샘플액이 지정된 위지 옆으로 퍼지지 않도록 드라이기로 말려가며 찍어준다. 샘플과 강그리오사이드 마커를 판에 찍었으면, 전개조 넣어 크로마토그래피를 하는데 전개조는 실험 5시간 이전 클로로포름 50 ml과 메탄올 40ml, 2차 증류수에 녹인 0.25% CaCl₂를 10 ml를 넣어 준비한다. 전개조에 샘플을 찍은 판을 넣어 전개액이 6 cm 지점에 그은 선까지 올라오기를 기다기고, 전개액이 올라오면 전개조에서 판을 꺼내어 액을 완전히 말린다. 다음은 발색 과정으로 발색에는 resorcinol 0.04g과 염산 16 ml, 0.1M CuSO₄.5H₂O(50 ul), 2차 증류수 3.96 ml이 사용되며, 용액을 유리 스프레이에 넣고 후드안에서 샘플을 찍은 판에 골고루 뿌려준다. 판 위에 용액이 뿌려졌으면 드라이기로 완전히 말려주고, 샘플을 찍은 앞면에 유리를 한 장 덮고 옆쪽을 집게로 잡아 고정해 105℃에서 30분 동안 발색 시킨다. 발색 이후 마커와 샘플을 비교하여 강그리오사이드에 발현 양상을 비교 확인하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 분화유도된 조골세포에서 강글리오사이드 GD3이 유의적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 1b).

< 실험예 2> 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화에서 관련 ERK1 /2와 MEK1 /2 활성 확인

상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로, 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양하고 조골세포 분화유도물질을 처리하여 조골세포로 분화 유도하였다. 그런 다음, 배양된 미니대지 지방유래 중간엽 줄기세포와 분화된 조골세포 관련 중요기전인 ERK1/2 활성, 및 ERK1/2의 상위 조절기전인 MEK1/2의 활성을 웨스턴 블랏(western blot)을 이용하여 확인하였다.

구체적으로 웨스턴 블랏 12% 겔에 샘플을 넣어 60 V로 30분 110 V로 1시간 30분 전기영동 한 후, 겔에서 Polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane으로 90 V 110분 동안 단백질을 이동시켰다. 이후 membrane을 ponceau로 5분간 염색하여 단백질이 유무를 확인하고, 30분간 TBS로 5분 간격으로 6번 액을 갈아 주며 세척한다. 세척 후 활성 ERK1/2는 TBS-T용액에 BSA 5%을 첨가한 액으로, ERK1/2와 MEK1/2는 TBS-T에 SKIM milk 5% 첨가하여 만든 액에 상온에서 1시간 동안 blocking 하며, 이후 TBS-T용액으로 30분간 5분 간격으로 6번 액을 갈아주며 세척한다. 항체는 활성 ERK1/2는 TBS-T용액에 BSA 3%을 첨가한 액으로, ERK1/2와 MEK1/2는 TBS-T에 SKIM milk 3% 첨가한 액에 1:3000으로 희석하여 4℃에서 16시간 동안 부착한다. 부착 후 TBS-T용액으로 30분간 5분 간격으로 6번 액을 갈아주며 세척하고, 2차 항체는 활성 ERK1/2는 TBS-T용액에 BSA 3%을 첨가한 액으로 anti-mouse 항체를 1:5,000 희석하여 사용했고, ERK1/2와 MEK1/2는 TBS-T에 SKIM milk 3% 첨가한 액에 anti-rabbit 항체를 1:5,000으로 희석하여 상온에서 1시간 30분 동안 부착하였다. 2차 항체 부착 후 TBS-T용액으로 1시간 30분간 15분 간격으로 6번 액을 갈아주며 세척한 후 감광하여 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양하고 조골세포 분화유도물질을 처리하여 조골세포로 분화를 유도할 경우, ERK1/2의 활성 및, ERK1/2의 상위 조절기전인 MEK1/2의 활성이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 2).

< 실험예 3> 강글리오사이드 GD3 합성유전자의 제어를 통한 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화관련 ERK1 /2와 MEK1 /2 활성 억제 및 조골세포분화 억제 확인

상기 <실시예 1>에서 준비한 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양하고 강글리오사이드 GD3 합성유전자(ST8SIA1 gene)의 siRNA(F-5'CGUGCAAGGACAGCUCACUdTdT3'(서열번호: 5)과 R-5'AGUGAGCUGUCCUUGCACG(dTdt)3'(서열번호: 6)(Bioneer에서 구입)를 처리하여 GD3 합성유전자의 발현을 억제시켰다. 그런 다음, 강글리오사이드 GD3 합성유전자가 발현이 억제된 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포에 조골세포 분화유도물질을 처리하여 조골세포로 분화 유도한 후, 강글리오사이드 GD3 발현을 상기 <실험예 1>의 HPTLC법을 이용하여 확인하였다.

또한, 상기 강글리오사이드 GD3 합성유전자 siRNA를 처리한 후, 분화유도된 세포에 대하여, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 조골세포 마커인 osteopotin과 Osteocalcin를 이용하여 조골세포 분화 유도 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 강글리오사이드 GD3 합성유전자 siRNA를 처리한 후, 강글리오사이드 GD3 합성을 억제한 중간엽 줄기세포에서 분화된 조골세포를 확인하기 위하여 Alizarin S red 염색법으로 염색한 결과 도 1a의 정상적인 조골세포분화에 비하여 붉게 염색된 조골세포의 뚜렷한 감소와 조골세포 마커인 osteopotin과 osteocalcin의 mRNA 발현 억제를 확인함으로써 강글리오사이드 GD3 합성유전자가 제어된 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포에서 조골세포로의 분화는 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 3a). 더욱이 강글리오사이드 GD3의 합성 억제를 확인하기 위하여 HPTLC기법으로 확인 한 결과 강글리오사이드 GD3 합성유전자 siRNA를 처리한 후, 강글리오사이드 GD3합성이 억제 유도된 세포에서 강글리오사이드 GD3 발현이 현저히 억제되었고(도 3 b), 또한, 강글리오사이드 GD3 합성유전자가 제어에 따른 분화된 조골세포에서 조골세포 분화에 중요한 기전인 ERK1/2와 그 조절 인자인 MERK 1/2의 활성이 유의적으로 억제됨을 확인하였다(도 3 C 및 도 3 D).

따라서, 강글리오사이드 GD3은 미니돼지 지방유래 중간엽 줄기세포의 조골세포 분화를 ERK1/2와 MEK1/2를 활성화함으로써 유도함을 확인하였다.

<110> Cooperation Foundation Wonkwang University <120> Composition for inducing differentiation of the Mesenchymal Stem Cells into osteoblast containing Ganglioside GD3 as an active ingredient <130> p2015-303 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> osteopotin F-primer <400> 1 gagcaaacag acgatgtgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> osteopotin R-primer <400> 2 gaaatcggtg accagctcat 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> osteocalcin F-primer <400> 3 aaagcctagt ggtgcgga 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> osteocalcin R-primer <400> 4 atgccataga agcgccgata 20 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ST8SIA1 gene siRNA f <400> 5 cgugcaagga cagcucacu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ST8SIA1 gene siRNA R <400> 6 agugagcugu ccuugcacg 19

Claims

강글리오사이드 GD3(Ganglioside GD3)를 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells)로부터 조골세포(osteoblast) 분화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 배아 및 제대혈로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조골세포 분화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 강글리오사이드 GD3은 ERK1/2 및 MEK1/2을 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조골세포 분화 유도용 조성물.
중간엽 줄기세포에 강글리오사이드 GD3을 처리하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells)로부터 조골세포(osteoblast) 분화 유도 방법.
제4항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 배아 및 제대혈로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포로부터 조골세포 분화 유도 방법.
강글리오사이드 GD3에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화 검출용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 강글리오사이드 GD3에 특이적으로 결합하는 물질은 강글리오사이드 GD3에 특이적으로 결합하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체 단편, 항체 모방체 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화 검출용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 배아 및 제대혈로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화 검출용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 검출은 항체분석, 화학발광분석 및 질량분광분석방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화 검출용 조성물.