KR20170043805A - 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 중간엽 줄기세포를 포함하는 완충용액을 튜브에 공급하는 단계; 및 (b) 단계(a)의 상기 튜브를 원심분리하여 응집체를 형성하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법을 제공한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법에 따르면, 중간엽 줄기세포 응집체 형성을 위한 최적 농도, 속도 및 시간의 원심분리 공정을 제시하고, 이와 같은 간단하고 경제적인 공정을 통해, 중간엽 줄기세포 응집체를 효과적으로 형성시킬 수 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법에 따르면, 중간엽 줄기세포 응집체 형성을 위한 최적 농도, 속도 및 시간의 원심분리 공정을 제시하고, 이와 같은 간단하고 경제적인 공정을 통해, 중간엽 줄기세포 응집체를 효과적으로 형성시킬 수 있다.
Description
본 발명은 중간엽 줄기세포의 응집체 형성 방법에 관한 것이다.
최근 조직공학을 이용한 재생의학 분야에서 줄기세포의 이용기술이 난치병 치료를 위한 새로운 분야로 제시되고 있다. 이에 줄기세포에 대한 관심이 높아지고, 증식과 분화를 통하여 조직을 형성할 수 있는 줄기세포를 이용해 질병 또는 조직 훼손 등의 치료를 위해 사용될 수 있을 것으로 인식되고 있다.
줄기세포(Stem Cell)란, 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 상기한 줄기세포는 전분화능 줄기세포(Pluripotent Stem Cell; PSC)와 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)로 나누어 분류된다.
그 중, 중간엽 줄기세포는 골수 내에 존재하는 줄기세포로 배양시 증식력이 탁월하고 적절한 환경이 주어지면 신경세포, 혈관내피세포, 뼈세포 또는 연골세포 등 다양한 계통의 세포로 분화할 수 있는 특성을 가져, 중간엽 줄기세포를 이용한 세포치료기술이 각광받고 있다.
상기한 줄기세포를 이용한 바이오장기 및 조직 재생을 위하여 활용시, 줄기세포의 3D 배양은 필수적이며, 배양된 줄기세포가 단일세포보다 응집체 형성시 근거리분비형신호(paracrine signal) 방출량이 커져 인체에 도입시 치료 효과가 더욱 큰 것으로 알려져 있다.
종래에는 줄기세포 응집체 형성을 위한 행잉 드롭 방식(Hanging drop method), 마이크로 패턴 방식(micropattern method) 또는 컨케이브 칩 방식(concave chip method) 등의 방법을 활용하여 왔으나, 상기한 방법은 중간엽 줄기세포와 같이 사이즈가 큰 세포의 응집체 형성에는 효과적이지 않다는 단점이 있다.
또한, 전분화능 줄기세포의 경우 배상체를 형성하기 위한 기술력과 제품들이 상용화되어 있지만 중간엽 줄기세포 응집체를 형성하는 방법에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 고안된 것으로, 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법에 관한 기술내용을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 (a) 중간엽 줄기세포를 포함하는 완충용액을 튜브에 공급하는 단계; 및 (b) 단계(a)의 상기 튜브를 원심분리하여 응집체를 형성하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법을 제공한다.
단계(a)의 완충용액의 세포 농도가 1×106 ~ 5×106/mL인 것을 특징으로 한다.
상기 완충용액을 이용해 형성한 응집체 내의 세포수는 1×103 ~ 1×104/1개 응집체인 것을 특징으로 한다.
상기 완충용액을 이용해 형성한 응집체의 응집효율이 80% 이상인 것을 특징으로 한다.
단계(b)의 상기 원심분리는 1000~5000 rpm의 속도에서 1~10 분 동안 수행하는 것을 특징으로 한다.
단계(b)의 응집체 형성 후 37 ℃에서 24 시간 동안 유지 관찰하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체를 포함하는 중간엽 줄기세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법에 따르면, 중간엽 줄기세포 응집체 형성을 위한 최적 농도, 속도 및 시간의 원심분리 공정을 제시하고, 이와 같은 간단하고 경제적인 공정을 통해, 중간엽 줄기세포 응집체를 효과적으로 형성시킬 수 있다.
또한, 세포 치료를 위한 이식 등의 목적에 따라 줄기세포 응집체의 세포수 및 크기를 조절할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따른 줄기세포 응집체 형성 방법을 모식적으로 나타낸 개념도이다.
도 2는 실시예 2에 따른 줄기세포 응집체 형성 방법을 모식적으로 나타낸 개념도이다.
도 3은 실시예 1에 따른 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체의 현미경 이미지이다.
도 4는 실시예 2에 따른 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체의 현미경 이미지이다.
도 5는 실시예 2에 따른 방법에 의해 줄기세포 응집체 형성 24시간 경과한 시점의 현미경 이미지이다.
도 6은 비교예에 따른 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체의 현미경 이미지이다.
도 7은 비교예에 따른 방법에 의해 줄기세포 응집체 형성 24시간 경과한 시점의 현미경 이미지이다.
도 2는 실시예 2에 따른 줄기세포 응집체 형성 방법을 모식적으로 나타낸 개념도이다.
도 3은 실시예 1에 따른 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체의 현미경 이미지이다.
도 4는 실시예 2에 따른 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체의 현미경 이미지이다.
도 5는 실시예 2에 따른 방법에 의해 줄기세포 응집체 형성 24시간 경과한 시점의 현미경 이미지이다.
도 6은 비교예에 따른 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체의 현미경 이미지이다.
도 7은 비교예에 따른 방법에 의해 줄기세포 응집체 형성 24시간 경과한 시점의 현미경 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은 (a) 중간엽 줄기세포를 포함하는 완충용액을 튜브에 공급하는 단계; 및 (b) 단계(a)의 상기 튜브를 원심분리하여 응집체를 형성하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법을 제공한다.
먼저, 단계(a)는 중간엽 줄기세포를 포함하는 완충용액을 튜브에 공급하는 단계이다.
상기 줄기세포를 포함하는 완충용액은 중간엽 줄기세포가 삼투압에 의해 파괴되지 않도록 pH, 염 등을 조절한 등장액 배지일 수 있으며, 글루코오스를 포함하는 액상의 영양배지일 수 있다.
또한, 세포 농도가 1×106/mL 미만일 경우, 줄기세포 응집체가 제대로 형성되지 않을 수 있으며, 5×106/mL 초과할 경우에는, 줄기세포 수 증가에 따른 효과가 미미하여 세포 농도가 1×106 ~ 5×106/mL가 되도록 완충용액의 농도를 조절할 수 있다.
이에 따라, 상기 완충용액을 이용해 형성한 응집체는 평균적으로 세포수를 1×103 ~ 1×104/1개 응집체의 농도로 포함한다.
또한, 응집효율이 80% 이상으로 효과적으로 중간엽 줄기세포 응집체를 형성시킬 수 있다.
상기 튜브는 일반적으로 실험실에서 쓰이는 에펜도르프 튜브, 코니칼 튜브 또는 팔콘 튜브 등의 튜브를 사용할 수 있으며, 원심분리가 가능한 용기라면 어떤 것이라도 사용할 수 있다.
예를 들어, 주사기(syringe)의 경우 원심분리가 가능하도록 플런저(plunger)가 주사기에서 분리가능한 것이라면 활용할 수 있으며, 플런저를 주사기로부터 분리하고 주사기 입구를 막은 후 주사기를 그대로 원심분리할 수 있다.
본 단계에서 줄기세포를 포함하는 완충용액은 피펫을 이용하여 튜브에 공급할 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
단계(b)는 단계(a)의 상기 튜브를 원심분리하여 응집체를 형성하는 단계로서, 본 단계에서는 원심분리 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포를 튜브의 밑바닥으로 침전시켜 응집체를 형성하도록 구성할 수 있다.
상기 원심분리는 바람직하게는 1000~5000 rpm의 속도로 1~10 분 동안 수행하도록 구성할 수 있다.
상기 원심분리가 1000 rpm 이하의 속도로 수행될 경우, 줄기세포의 침전이 제대로 이루어지지 않아 응집체가 형성이 어려우며, 5000 rpm 이상의 속도로 수행될 경우 중력가속도에 의한 튜브 관과 줄기세포의 마찰 등에 의해 줄기세포가 파괴될 수 있다.
상기 원심분리가 1분 이하로 수행될 경우, 중간엽 줄기세포의 침전이 제대로 이루어지지 않으며, 10분 이상으로 수행될 경우에는 시간경과에 따른 효과가 미미하여 상기와 같은 시간 범위로 원심분리를 수행할 수 있다.
상기한 원심분리는 보다 바람직하게는 3000 rpm의 속도로 5분 동안 수행하도록 구성할 수 있다.
본 발명은 단계(b)의 응집체 형성 후 37 ℃에서 24 시간 동안 유지 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
형성된 중간엽 줄기세포 응집체는 세포 사이의 충분한 결합력과 응집체가 분리되지 않도록 37 ℃에서 24 시간 동안 유지하여 안정적인 응집체 여부를 관찰할 수 있다.
본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체를 포함하는 중간엽 줄기세포 치료제를 제공한다.
상기 중간엽 줄기세포 치료제는 바이오장기 및 조직 재생을 위하여 활용될 수 있으며, 응집체 형태로써 근거리분비형신호(paracrine signal) 방출량이 커 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.
또한, 동일한 마이크로 튜브 내에서 세포수를 조절함으로써 응집체의 크기를 2~3 배까지 조절하여 용도에 따른 줄기세포 응집체를 포함하는 중간엽 줄기세포 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법에 따르면, 중간엽 줄기세포 응집체 형성을 위한 최적 농도, 속도 및 시간의 원심분리 공정을 제시하고, 이와 같은 간단하고 경제적인 공정을 통해, 중간엽 줄기세포 응집체를 효과적으로 형성시킬 수 있다.
또한, 세포 치료를 위한 이식 등의 목적에 따라 줄기세포 응집체의 세포수 및 크기를 조절할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하도록 한다. 제시된 실시예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 목적으로 제공되는 것이 아니다.
<실시예 1>
DEME 배양액에 MEF (Mouse embryonic Fibroblast) 세포를 세포수 1.5×106 개가 되도록 배양하여 세포 배양액을 제조하였다. 1.5mL 마이크로 튜브(Axygen)에 상기 세포 배양액 0.5~1 mL를 피펫팅(pipetting)하였다.
세포 배양액이 담긴 마이크로 튜브를 3000 rpm의 속도로 5 분간 원심분리하여 MEF 세포 응집체를 수득하였다.
<실시예 2>
1.5mL 마이크로 튜브 대신 8개가 1줄로 형성된 PCR용 0.2mL 마이크로 튜브(8-strip PCR tube, Axygen)를 이용하고, MEF 세포 대신 중간엽 줄기세포를 배양한 세포 배양액 0.2 mL를 피펫팅한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 세포 응집체를 수득하였다.
<비교예>
배양접시에서 배양된 중간엽 줄기세포를 0.05% ~ 0.25% Trypsin-EDTA 효소를 이용하여 단일세포로 부유시킨 후, AggreWell(Stemcell Technologies)에 중간엽 줄기세포를 넣고 1000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 세포 응집체를 수득하였다.
<실험예> 세포 응집체 형성 확인 및 분석
본 발명에 따른 실시예 1, 실시예 2 및 비교예에 따른 세포 응집체의 형성을 확인하기 위하여 광학현미경을 이용하여 관찰하여 도3 내지 도7에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 따른 방법은 MEF 세포가 응집되었음을 확인할 수 있다.
또한, 도 4 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에 따른 방법에 따라 중간엽 줄기세포 응집체가 형성되었으며, PCR 마이크로 튜브 2개 이상을 이용하여 응집체의 크기를 조절할 수 있음을 확인할 수 있다. 24 시간 후에도 세포 응집체가 해리되지 않아, 세포 응집체를 안정적으로 확보할 수 있음을 알 수 있다.
반면, 도 6 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 비교예에 따른 방법은 세포가 응집현상을 보였으나 세포 수확과정에서 응집현상이 해리되었으며, 24 시간 후에는 세포가 평평하게 배양되어 응집체가 형성되지 않았다.
이에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 방법을 이용하면 중간엽 줄기세포 응집체를 안정적으로 확보할 수 있음을 확인할 수 있다.
Claims (7)
- (a) 중간엽 줄기세포를 포함하는 완충용액을 튜브에 공급하는 단계; 및
(b) 단계(a)의 상기 튜브를 원심분리하여 응집체를 형성하는 단계
를 포함하는 중간엽 줄기세포 응집체 형성 방법. - 제1항에 있어서, 단계(a)의 완충용액의 세포 농도가 1×106 ~ 5×106/mL인 것을 특징으로 하는 줄기세포 응집체 형성 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 완충용액을 이용해 형성한 응집체 내의 세포수는 1×103 ~ 1×104/1개 응집체인 것을 특징으로 하는 줄기세포 응집체 형성 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 완충용액을 이용해 형성한 응집체의 응집효율이 80% 이상인 것을 특징으로 하는 줄기세포 응집체 형성 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 원심분리는 1000~5000 rpm의 속도에서 1~10 분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 응집체 형성 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(b)의 응집체 형성 후 37 ℃에서 24 시간 동안 유지 관찰하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 응집체 형성 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 형성된 줄기세포 응집체를 포함하는 중간엽 줄기세포 치료제.
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