KR20170039168A - 비정상적 성장하는 표본 또는 조직의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 시스템, 장치 및 방법 - Google Patents
비정상적 성장하는 표본 또는 조직의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 시스템, 장치 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
라만 스펙트럼을 사용하여 비정상 종양(abnormal growths)과 같은 샘플 또는 조직의 유형 및/또는 성질을 특성화, 식별, 및/또는 진단하는 단계는, FP 및 HW 파장 영역과 같이, 두 개의 구분되는 파장 영역의 라만 스펙트럼 내에 있는, 구분 가능 한 스펙트럼 서브 구간 들을 분석하여, 하나 또는 두 개의 파장 영역내의 하나 이상의 기준 지표와의 매칭를 확인하는 단계; 및 상기 매칭에 기초하여, 상기 샘플 또는 조직의 유형 및/또는 성질을 특성화, 식별 또는 진단하는 단계;를 구비한다. 상기 FP 및 HW 영역의 라만 스펙트럼은 단일 회절 격자를 사용하여 동시에 검출되거나 획득될 수 있다.
Description
본 발명은, 분광 여기 에너지(즉, 시준광)가 조사(照射)된 샘플 또는 조직(예를 들어, 비정상 종양 또는 외견상 비정상 종양, 즉 암)의 유형 또는 성질을 정확하게 식별하기 위한 라만 분광시스템 또는 라만 분광 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 실시예에 따르면, 생체 내 또는 생체 외에서, 위장관 종양과 같은 이상 조직에 대해, 높은 정확도의 실시간 진단이 가능하며, 그 효과는 여기에 한정 되지 않는다.
내시경과 같은 최소 침습 기술을 이용하여, 조직(예를 들어 신생 위장관 종양(neoplastic gastrointestinal growths))의 성질을 정확하고 신속하게 특성화하고 식별하는 것은 바람직한 일이다. 예를 들어 대장암(colorectal cancer, CRC)은 말기에 발견되는 경우, 높은 사망률을 보이는 흔한 질병이다. 신생 용종(neoplastic polyps)의 식별 및 근절이, 대장암 사망률(mortality) 및 이환율(morbidity) 감소시킬 수 있는 주요한 방책 중 하나이다. 종래의 대장 내시경 검사 기술을 사용하여, 악성으로의 변형 위험이 거의 또는 전혀 없는 과형성 용종(hyperplastic polyps)과 악성인 잠재기를 갖는 선종(adenomas, 腺腫)을 구분해 내는 데에는, 임상적인 어려움이 남아 있다.
매년 120 만 명 이상의 암 환자가 발생하고 있으며, 608,700 명 이상이 암으로 사망하는 것으로 추정되는 현 실정에서, 대장암(CRC)은 현대 사회에서 주요하게 다루어야 할 질병이다. 치료 가능한 단계에서 전암성 용종(precancerious polyps, 즉, 선종)을 조기에 식별하고, 용종절제술 또는 점막 절제술(EMRs)과 같은 적적한 치료 중재를 하는 것이, 대장암 사망률과 이환율을 감소시키는 가장 좋은 대책이다. 기존의 대장 내시경 접근법은 여러 가지 근본적이고 임상적인 한계를 갖고 있다. 이는 기존의 대장 내시경 검사가 용종의 점막 특징의 시각화(선구 패턴(pit pattern), 혈관 패턴, 등)에 전적으로 의존하고, 그들 조직에 대한 생체분자 정보를 거의 또는 전혀 제공하지 않기 때문이다. 따라서 현재 치료 기준에서는, 대장경 검사 중에 확인된 모든 의심스러운 용종 모양의 병변 (suspicious polypoid lesions) 또는 비정상 종양(abnormal growths)의 절제를 권장하고 있다. 이러한 접근법은 노동 집약적이며, 결과적으로 고비용의 병리조직 검사를 동반한다. 아울러, 용종 모양 병변들(polypoid lesions) 중의 1/3 내지 1/2가 과형성 용종(hyperplastic polyps)으로 밝혀지는 것을 고려하면, 환자에게 필요이상의 위험을 초래하는 것이다. 용종 절제술은 절대적인 위험도는 크지 않지만, 대장내시경 검사 중, 출혈 또는 천공 등과 같은 합병증을 유발하는 원인이 된다. 기존의 임상 과제와 최근에 도입된 대장암 인구 기반 선별프로그램(population-based screening program)을 고려할 때, 진보된 내시경 접근법의 필요성이 지금처럼 높았던 적이 없다. 이에 관련한 최근의 연구 동향은, 생체 내 진단 및 분석을 개선하기 위한, 보다 정교한 분자 이미징 및 분광 기법의 개발에 중점을 두고 있다.
결장 조직 표본에 생체 외 라만 분광학을 적용함으로써, 상이한 병리학적 유형(즉, 정상적인 과형성 용종과 선종/선암종)을 매우 고무적인 정확도(즉, 89% ~ 99% 범위)로 구분해 낼 수 있다는 것을 확인해주는 증거들이 있다.
그러나 이러한 접근 방법에서도, 라만 분광기가 병리학적 유형의 특성을 확인할 수 있도록 하기 위해서는, 용종을 절제해 내야 한다는 점에서, 위에서 언급 한 일반적인 내시경 기술과 동일한 문제점을 안고 있다.
또한, 라만 분광법을 생체 내 임상 진단으로 전환하는 데에도 많은 장벽이 존재한다.
이러한 장벽들에는 조직의 라만 산란이 매우 약하고 신호 수집 시간이 길다 (5 초 이상)는 점이 포함된다. 또한 저간섭 용융 실리카, 높은 포집 효율, 및 깊이 방향의 높은 분해능을 갖는 소형의 긴(1.9 m 초과) 광섬유 탐침(fiber-optic probe) 디자인 개발에 대한 근본적인 필요성이 포함된다.
용융 실리카는 강한 라만 신호와 형광 백그라운드를 갖고 있기 때문에, 조직에서 발생되는 약한 라만 신호를 획득하는데 방해가 된다. 따라서, 탐침(probe)을 저간섭 용융실리카로 제작해야 할 필요가 있다. 현재까지는 이러한 기술적인 제한들이 해결되지 않고 남아 있다.
고속 라만 분광 기술 및 공초점 기능을 지닌 소형화된 광섬유 라만 탐침의 개발을 포함하는 최근의 기술적 진보로 인하여, 내시경 검사 중에 실시간으로 생체 내 병리조직검사 (즉, 광학생검)를 할 수 있게 되었다.
대장 용종에 대한 라만 분광학적 연구는 소위 지문(fingerprint, FP)영역의 스펙트럼 범위(800-1800 cm-1)내로 제한되어 있었다.
그러나, 고파수 (high wavenumer, HW)영역의 스펙트럼 범위(즉, ~ 3600 cm-1)에서는, 광섬유 라만 탐침이 실리카의 형광 배경으로부터 간섭을 적게 받을 뿐만 아니라 조직으로부터 강한 라만 신호를 얻을 수 있다는 점 때문에, 연구자들은 HW 영역의 스펙트럼을 사용하는데 주목하고 있다.
그러나 현재로서는 생체 내에서 암세포들을 충분한 정확도로 식별해 내는 기술이 없기 때문에, 이 기술은 실행 가능한 선택사항이 아니다.
따라서, 생체 내 및 생체 외에서 암세포를 보다 정확하게 식별할 수 있는 라만 분광 기술이 필요하다.
본 발명의 목적은 신체의 임의의 부위에서 예를 들면 암과 같은 비정상 종양(abnormal growths)의 유형 및/또는 성질을 특성화하고, 식별하고, 진단하기 위한 종래 또는 현재의 기술과 관련된 몇 가지 문제들을 극복하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 라만 분광학에 기초를 둔 정확도가 향상된 시스템 및 방법을 제공하여, 내시경 검사(예를 들어, 대장 내시경 검사와 같은 위장관 내시경 검사) 중에 용종 및 전암(precancer)과 같은 비정상 조직(abnormal tissues)의 유형 및 성질을 생체 내에서 신속하게 특성화하고, 식별하고, 진단하는 것이다.
본 발명에 따른 다양한 실시 예들에서는, 생체 내에서, 정확도 높은 생체분자 수준의 광학 생검을 가능하게 하는 비라벨 진동 분광 기술(label-free vibrational spectroscopic technique)을 제공하는 광섬유 라만 분광 시스템 및 방법을 설명한다. 여러 실시 예들에 따르면, 진행중인 내시경 검사 중에 FP 및 HW 범위의 스펙트럼을 동시에 측정할 수 있다. 생체 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 라만 스펙트럼 측정에서, FP 범위 스펙트럼 및 HW 범위 스펙트럼 결합의 이론적 근거는 다음과 같이 다양하다:
(i) FP 범위에서 조직 라만 신호를 압도하는 강렬한 자가형광을 나태 내는 조직(예: 위장, 폐, 결장, 간)의 경우, HW 범위에 진단 정보를 갖고 있는 강한 조직 라만 피크가 포함 되어 있을 수 있다;
(ii) FP 및 HW 범위는 보완적인 생체분자 정보(예 : 단백질, 지질, DNA 및 물)를 포함하므로 조직 특성화 및 진단성을 향상시킬 수 있다; 및
(iii) 상이한 결합들은 상이한 스펙트럼 범위에서 진동하므로, 두 가지 상이한 스펙트럼 범위(FP 및 HW)를 사용함으로써, 단일 스캔으로 얻을 수 있는 생체분자 정보를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른, FP/HW 조합 광섬유 공초점 라만 분광법(예를 들어, FP 및 HW 스펙트럼을 동시에 획득하는 분광법)은, 신체검사 동안에 수행되는, 암 (cancer), 전암 (precancer), 및/또는 다른 비정상 종양(abnormal growth)의 실시간 생체 내 진단 성능을 향상시킬 수 있다. FP/HW 조합 기법은 생체 외 조직 표본 분석에도 사용할 수 있기 때문에, 신체의 임의의 부분에서 나온 샘플에 존재하는 비정상 종양의 유형을 보다 정확하게 식별 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 라만 분광 장치는: 광을 인체의 조직에 조사하도록 구성된 제 1 광원; 상기 조직에 의해 산란 된 산란광으로부터 FP 및 HW 라만 스펙트럼을 동시에 검출하도록 구성된 라만 분광기; 및 적어도 하나의 프로세싱 유닛 및 상기 적어도 하나의 프로세싱 유닛에 의해 실행될 수 있는 프로그램 명령들이 기록되어 있는 메모리를 포함하는 컴퓨터 제어 및 분석 모듈을 구비하여 구성되며, 상기 프로그램 명령어들은, 한 파장 영역 또는 두 파장 영역 내의 하나 이상의 기준 지표와의 매칭을 식별하기 위해, FP 및 HW 파장 영역 내에서 검출된 라만 스펙트럼의 이산 스펙트럼 서브 구간들(예를 들면, 각각 10 내지 30 cm-1 또는 약 20 cm-1의 스펙트럼 폭을 갖는 약 3 내지 15개 또는 약 5 내지 10개의 이산 스펙트럼 서브 구간들)을 분석하기 위한 프로그램 명령어들이다.
다수의 실시 예에서, 상기 라만 분광기는 단일 광대역 회절 격자를 구비한다. 상기 제 1 광원은 조직에 인가될 여기 에너지를 발생시키기 위한 시준광 광원를 포함하며, 상기 라만 분광 장치는 성가 시준광을 조직을 향해 출사하고 조직으로부터 검출된 라만 스펙트럼을 라만 분광기로 복귀시키도록 구성된 탐침을 더 포함하여 구성된다.
상기 하나 이상의 기준 지표는 검출된 라만 스펙트럼에서의 특정 피크이거나 특정 피크를 포함한다. 상기 컴퓨터 제어 및 분석 모듈은 상기 매칭에 기초하여 비정상 종양(abnormal growths)을 진단하기 위한, 상기 적어도 하나의 프로세싱 유닛에 의해 실행될 수 있는, 프로그램 명령어들을 포함할 수 있다.
상기 탐침은 공초점 광섬유 탐침이거나 공초점 광섬유 탐침을 구비하여 구성 될 수 있다. 상기 라만 분광 장치는 상기 탐침을 내측에 수용할 수 있는 기구용 채널을 갖는 장축을 구비한 내시경을 더 구비할 수 있다.
상기 컴퓨터 제어 및 분석 모듈은, 상기 적어도 하나의 프로세싱 유닛에 의해 실행가능하며, 상기 시준광의 출력을 동적으로 조정하거나, 상기 조직이 상기 시준광에 노출되는 노출 시간을 조정하기 위한 프로그램 명령들을 포함할 수 있다.
상기 라만 분광 장치는 상기 탐침 또는 상기 라만 분광 장치 전체를 적어도 하나의 교정 기준에 맞추도록 구성된 교정 장치를 더 구비할 수 있다.
상기 라만 분광 장치는 상기 조직에 추가적인 광을 조사하도록 구성된 추가 광원; 및 상기 제 1광원에서 출사된 광과 상기 추가 광원에서 출사된 광 사이의 광 간섭을 보상하도록 구성된 핫 미러 필터를 더 구비할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 라만 분광 장치에 의해 수행되는 라만 분광 방법은, 제 1 광원으로 부터 출사된 광을 조직에 조사하는 단계와; 탐침을 이용하여 조직으로 부터 산란된 산란광의 FP 및 HW 라만 스펙트럼을 동시에 검출하는 단계; 및 FP 및 HW 파장 영역 모두에서 검출된 라만 스펙트럼의 이산 스펙트럼 서브 구간(예를들면, 각각 약 10 내지 30 cm-1 또는 약 20 cm-1의 스펙트럼 폭을 갖는 약 3 내지 15개 또는 약 5 내지 10개의 이산 스펙트럼 서브 구간)을 분석하여, 하나 또는 두 파장 영역에서, 하나 이상의 기준 지표와의 매칭을 식별 하는 단계를 포함 한다.
상기 FP 및 HW 라만 스펙트럼을 동시에 검출하는 단계는, 단일 광대역 회절 격자를 사용하여 FP 및 HW 파장 영역 모두에서 광을 회절시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 라만 분광 방법은 상기 매칭에 기초하여 비정상 종양(abnormal growths)의 성질을 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 기준 지표는 상기 검출된 라만 스펙트럼 내의 특정 피크이거나, 특정 피크를 포함할 수 있다.
상기 라만 분광 방법은 상기 광의 출력을 동적으로 조정하는 단계 및/또는 상기 조직이 상기 광에 노출되는 노출시간을 동적으로 조정하는 단계를 더 구비할 수 있다.
상기 라만 분광 방법은 상기 조직에 광을 조사하기 전에, 상기 탐침 또는 상기 라만 분광 장치 전체를 적어도 하나의 교정 기준에 맞추어 표준화하는 교정 단계 또는 표준화 단계를 수행할 수 있다.
상기 라만 분광 방법은 제1 광원에서 출력되는 광을 상기 조직에 조사하면서 추가 광원에서 출력되는 추가 광을 상기 조직에 추가적으로 조사하는 단계; 및 핫 미러 필터를 사용하여, 상기 제1 광원으로부터 출력되는 광과 상기 추가 광원으로 부터 출력되는 추가 광 사이의 광 간섭을 보상하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시 예들을 보다 잘 이해할 수 있도록 기술한다. 도면은 제한적으로 해석되어서는 안 되며, 도면의 치수들은 비례적이지 않을 수도 있다, 도면에서:
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 생체 내 조직 진단 및 특성화를 위한 공초점 라만 분광 시스템의 개략도이고;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 내시경 검사 중의 조직의 진단 및 특성화 정확도를 향상시기 위해 개발된 광대역 광섬유 공초점 라만 분광시스템의 블록도 이고;
도 3 은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 위장의 점막에서 취득한 광대역 FP 및 HW 생체 내 라만 스펙트럼 및 그에 수반 되는 자가형광 스펙트럼의 그래프이고;
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 광대역 생체 내 라만 스펙트럼 및 그에 수반 되는 FP영역 및 HW영역 모두를 포함하는 자가형광 스펙트럼에 적용되는 구간 선택의 일례를 나타내는 그래프이고;
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 그래프로서, 자가형광 배경 제거 후의 광대역 생체 내 라만 스펙트럼에 적용되는 구간 선택의 예 (여기서, (a)는 800 내지 1800 cm-1 영역,(b)는 2800 내지 3100 cm-1영역) 이고;
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 그래프로서, 3개의 병변의 라만 스펙트럼 및 ±1 표준편차와, 3 개의 병변의 사진을 도시하고;
도 7A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 스펙트럼 특징을 분해하는 차이 스펙트럼의 그래프이고;
도 7B는 본 발명의 일 실 시예에 따른 것으로, 전체 스펙트럼 범위에 걸친 3 개의 조직 카테고리의 분산 분석(ANOVA)의 결과이고;
도 7C는 본 발명의 일 실 시예에 따른 것으로, 유의미한 라만 피크의 히스토그램이고;
도 8A 내지도 8D는 종래 알려진 관행에 따른, 상이한 대장 조직 유형들에 상응하는 염색된 병리조직 슬라이드들이고;
도 9A는 본 발명의 일 실시예에 따른 사후 확률의 표현이고;
도 9B는 본 발명의 일 실 시예에 따른 것으로, 선종 및 선암을 진단하기 위한 수신기 조작 특성(receiver operating characteristics, ROC) 그래프이고;
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 양성 용종과 선종을 구별하기 위한 수신기 동작 특성(ROC)의 그래프이고;
도 11A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 식도 편평 상피암(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)에 대한 진단 알고리즘 개발을 위해 이용되는 훈련 데이터 세트(전체 데이터 세트의 80%)의 생체 내 평균 FP/HW 라만 스펙트럼 및 ±1 표준 편차(standard deviation, SD)를 도시한 도면이고;
도 11B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, ESCC의 고유한 스펙트럼 특징을 분해하는 차이 스펙트럼(ESCC - 정상) 및 ± 1 표준 편차(SD)와, 그에 상응하는 정상 식도 및 ESCC에 대한 WLR-유도 FP/HW 라만 분석 영상를 도시한 도면이고;
도 12A는 본 발명의 일 실시예에 관한 것으로, 전체 스펙트럼 범위(즉, 800 내지 1800 cm-1 and 2800 내지 3600 cm-1) 에서의, 훈련 데이터 세트(전체 데이터 세트의 80%로서, 정상 736 개 및 ESCC 202개)의 라만 피크 강도에 대한, 쌍을 이루지 않는 슈트던트 t-검정(Unpaired two-sided Student's t-test)을 도시한 도면이고(가장 관련성 높은 진단 정보를 포함하는 있는 복수(예를 들어, 7 개)의 라만 스펙트럼 서브 영역들이 확인됨);
도 12B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 가장 진단 학적으로 유의미한 라만 피크(*p <1E-10)의 히스토그램 ± 1 표준편차를 도시하고;
도 13A는 정상 표층 각화 편평 상피 및 기저층의 헤마톡실린/에오신(H/E) 염색 병리조직 슬라이드를 도시하고;
도 13B는 현저한 구조적 및 세포학적 이형성(異形性)을 보여주고 있는 침윤성 식도 편평 상피 세포 암종의 헤마톡실린/에오신 염색 병리조직 슬라이드를 도시하고;
도 14A 내지 14C는 (i) 정상 식도(736 개) 및 (ii) 훈련 데이터 세트 (전체 데이터 세트의 80%)중의 ESCC (202 개)의 생체 내 라만 스펙트럼의 사후 확률을 보여주며, 도 14A 내지 14C는 각각 FP 단독 라만 분광, HW 단독 라만 분광, FP/HW 동시측정 (또는 통합) 라만 분광 기법에 대해, 부분 최소자승 판별분석(partial least square-discriminant analysis) 및 환자별 교차 검증 (leave-one-patient out cross validation) 을 이용하여 계산되었고, 여기서 (○)는 정상식도의 데이터를 나타내고 (▲)는 ESCC의 데이터를 나타내며;
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 것으로, FP 라만, HW 라만, FP/HW 통합 동시측정 라만 기법의 각각의 경우에 있어서, 훈련 데이터 세트(총 데이터 세트의 80%)중에서 정상적인 식도 조직과 ESCC를 구분하기 위한 ROC 곡선을 도시하며, 상기 ROC 곡선의 아래 면적 (area under the ROC curve, AUC)은 각각 0.972, 0.928 및 0.995이고;
도 16A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 자궁 경부 환자로부터 측정된 복합 근적외선 자가형광 (NIR-AF) 및 라만 스펙트럼을 나타내는 그래프이고;
도 16B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 구간 PLS-DA 이후에 추출된 선택된 스펙트럼 영역을 도시하는 그래프이고;
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 전체 스펙트럼 PLS-DA 및 구간 PLS-DA의 모델 복잡도의 함수로서 도시된 분류 오차를 나타내는 그래프이며, 여기서 구간 PLS-DA는 전체 스펙트럼의 10% 이하만을 이용하고;
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 전암(pre-cancer) 그룹의 사후확률(정상 1001 개 및 전암 232 개)의 산포도이고, (a)는 전체 스펙트럼의 PLS-DA 모델링을 사용한 경우의 산포도이고, (b)는 구간 PLS-DA 모델링을 사용한 경우의 산포도이고;
도 19는 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 90 명의 위장 질병 환자(양성종양 (n = 1950) 및 암(n = 108))로부터 측정된 라만스펙트럼에 구간 PLS-DA 적용하여 얻은 연속 라만 스펙트럼 및 선택된 스펙트럼 영역의 그래프이고;
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 전체 스펙트럼 PLS-DA 및 구간 PLS에 대한 모델 복잡도의 함수로서 도시된 분류 오차의 그래프이고;
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 암 그룹(cancer group)의 사후 확률(정상(n = 1950) 및 암(n = 108))의 산포도이고, (a)는 FP 및 HW 전체 스펙트럼에 대해 PLS를 적용한 결과이고 (b)는 구간 PLS-DA모델링을 적용한 결과이고;
도 22A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 임상 내시경 검사 중에 63 명의 환자로부터 얻은, 정상 점막(n = 1083) 및 장 상피화생(intestinal metaplasia, IM)(n = 329)의 생체 내 평균 FP/HW 라만 스펙트럼 ± 1 표준편차를 도시하고;
도 22B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 정상 위장 조직(normal)과 장상피화생 위장조직 (IM) 의 각각의 고유 스펙트럼 특징을 분해하는 차이 스펙트럼(즉, IM - 정상) ± 1 표준편차를 도시하고;
도 23A 및 23B는 위장 조직을 헤마톡실린/에오신(H & E)으로 염색한 절편 슬라이드의 현미경 사진을 도시하고(여기서, A는 정상 위 점막(X200 배율), B는 광범위한 장상피화생 조직(X100 배율));
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 위장 조직의 FP/HW 통합 라만 스펙트럼으로부터 얻어진, 전체 분산의 약 88% 를 차지하는, 5 개의 주요 성분(principle components, PC)(PC1 = 45.6%, PC2 = 33.6%, PC3 = 4.2%, PC4 = 3.1%, PC5 = 1.2%)를 도시하고;
도 25A, 25B 및 25C는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, (A)는 FP 라만, (B)는 HW라만, (C)는 FP/HW 통합 라만 기법을 이용하여 얻어진 정상 위 조직 및 장상피화생 위 조직의 사후 확률의 산포도이고, 모두 PCA-LDA 및 조직 부위별 교차 검증(leave-one tissue site-out cross validation)을 통해 얻어졌으며, FP라만, HW라만 및 FP/HW 통합 라만 기법을 사용하여 정상 위 조직(○)과 장상피화생 위 조직(▲)을 구분할 때, 점선(0.5)는 96.3%(26/27), 77.8%(21/27) 및 92.9%(80/88)의 진단 민감도 및 87.5%(77/88), 78.4%(69/88)의 특이도를 나타내고 있고,
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, FP 라만, HW 라만 및 FP/HW 통합 라만 분광 기법과, PCA-LDA 알고리즘과 조직별 교차 검증(leave-one tissue site-out cross validation)기법을 사용하여 생성한 정상 위 조직과 장상피화생 위 조직을 구분하기 위한 수신기 조작 특성(ROC)곡선을 도시하고 있고, 여기서 ROC 곡선 아래 면적(AUC) 은 FP/HW 통합 라만, FP 라만 및 HW 라만 기법 각각의 경우에 대해 0.96, 0.94 및 0.79이고;
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 구강 내에서 측정된 라만 스펙트럼에 적용된 구간 PLS-DA의 예로서, 해부학적 변이가 큰 영역(예를 들어, 956 cm-1의 수산화인회석(hydroxyapatite) 영역, 1302 cm-1 및 1445 cm-1의 지질 영역 )은 변수 선택 기법에 의해 폐기되었고;
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 이산 스펙트럼 구간들이 사용될 때, 예측을 위해 라만 스펙트럼을 처리하는 방법의 흐름도이고;
도 29A 및 도 29B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 비접촉 모드에서 획득된 생체 내 라만 스펙트럼의 그래프를 도시하고 있으며, (a)는 크세논 광원 앞에 핫 미러(hot mirror)가 결합되어 있지 않은 경우의 스펙트럼이고,(b)는 크세논 광원의 앞에 핫 미러가 결합되어 있는 경우의 스펙트럼이고;
도 30A 및 30B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 접촉 모드에서 획득된 생체 내 라만 스펙트럼의 그래프를 도시하고 있으며, (a)는 핫 미러가 결합 되어 있지 않은 경우의 스펙트럼이고 (b)는 크세논 광원 앞에 핫 미러가 결합 되어 있는 경우의 스펙트럼이고;
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 생체 의학에 광섬유 라만 분광기를 응용하기 위해 사용하는 일반적인 광 필터링 시스템의 블록도 이고;
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 교정 방법의 흐름도이고;
도 33은 본 발명의 일 실시예에 관련된 것으로, 환자에게 사용하기 이전에 광섬유 라만 내시경 검사 기술을 시험하고 교정하기 위한 교정 장치의 블록도 이고;
도 34는 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 환자에게 사용하기 전에 라만 내시경을 시험하기 위한 시험 루틴을 나타낸 도면이고;
도 35는 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 2 개의 상이한 광섬유 탐침을 사용하여 획득 한 배경 스펙트럼의 예시적인 그래프이고;
도 36은 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 표준 텅스텐 램프를 사용하여, 교정 장치 내에 구비된 형광 표준 유리 용기를 교정하는 기술 또는 방법을 도시하는 블록도 이고;
도 37은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 2개의 상이한 광섬유 탐침을 교정하기 위한 교정 기능의 예를 도시하는 그래프이고;
도 38은 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 분명한 라만 피크를 갖는 물질(예: 폴리스티렌)을 측정하는 측정 예를 보여주는 그래프이고;
도 39는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 파수와 픽셀수의 다항식 맵핑을 측정하는 측정 예를 도시하는 그래프이고;
도 40A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 2개의 상이한 라만 탐침을 사용하여 2층 조직 팬텀(즉, 폴리스티렌 및 폴리에틸렌) 으로부터 획득 한 라만 스펙트럼의 비교를 나타내는 그래프이고;
도 40B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 상기 조직 팬텀 내의 상층 및 하층의 대표적인 라만 스펙트럼을 도시하는 그래프이고;
도 41은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 자동으로 레이저 여기 출력 및 누적을 조정함으로써 S/N 비를 개선하고 고체촬상소자(charge coupled device, CCD)의 포화를 방지하기 위한 기술 또는 방법을 도시한 블록도 이고;
도 42는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 노출 시간 및 누적을 자동으로 조정하여 S/N 비를 향상시키고 고체촬상소자 포화를 방지하기 위한 기술 또는 방법을 도시한 블록도 이고;
도 43은 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 상이한 탐침들 및 상이한 기관들을 위한 진단 모델을 저장하기 위한 대표적인 데이터베이스 구조를 도시하는 블록도 이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 생체 내 조직 진단 및 특성화를 위한 공초점 라만 분광 시스템의 개략도이고;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 내시경 검사 중의 조직의 진단 및 특성화 정확도를 향상시기 위해 개발된 광대역 광섬유 공초점 라만 분광시스템의 블록도 이고;
도 3 은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 위장의 점막에서 취득한 광대역 FP 및 HW 생체 내 라만 스펙트럼 및 그에 수반 되는 자가형광 스펙트럼의 그래프이고;
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 광대역 생체 내 라만 스펙트럼 및 그에 수반 되는 FP영역 및 HW영역 모두를 포함하는 자가형광 스펙트럼에 적용되는 구간 선택의 일례를 나타내는 그래프이고;
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 그래프로서, 자가형광 배경 제거 후의 광대역 생체 내 라만 스펙트럼에 적용되는 구간 선택의 예 (여기서, (a)는 800 내지 1800 cm-1 영역,(b)는 2800 내지 3100 cm-1영역) 이고;
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 그래프로서, 3개의 병변의 라만 스펙트럼 및 ±1 표준편차와, 3 개의 병변의 사진을 도시하고;
도 7A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 스펙트럼 특징을 분해하는 차이 스펙트럼의 그래프이고;
도 7B는 본 발명의 일 실 시예에 따른 것으로, 전체 스펙트럼 범위에 걸친 3 개의 조직 카테고리의 분산 분석(ANOVA)의 결과이고;
도 7C는 본 발명의 일 실 시예에 따른 것으로, 유의미한 라만 피크의 히스토그램이고;
도 8A 내지도 8D는 종래 알려진 관행에 따른, 상이한 대장 조직 유형들에 상응하는 염색된 병리조직 슬라이드들이고;
도 9A는 본 발명의 일 실시예에 따른 사후 확률의 표현이고;
도 9B는 본 발명의 일 실 시예에 따른 것으로, 선종 및 선암을 진단하기 위한 수신기 조작 특성(receiver operating characteristics, ROC) 그래프이고;
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 양성 용종과 선종을 구별하기 위한 수신기 동작 특성(ROC)의 그래프이고;
도 11A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 식도 편평 상피암(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)에 대한 진단 알고리즘 개발을 위해 이용되는 훈련 데이터 세트(전체 데이터 세트의 80%)의 생체 내 평균 FP/HW 라만 스펙트럼 및 ±1 표준 편차(standard deviation, SD)를 도시한 도면이고;
도 11B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, ESCC의 고유한 스펙트럼 특징을 분해하는 차이 스펙트럼(ESCC - 정상) 및 ± 1 표준 편차(SD)와, 그에 상응하는 정상 식도 및 ESCC에 대한 WLR-유도 FP/HW 라만 분석 영상를 도시한 도면이고;
도 12A는 본 발명의 일 실시예에 관한 것으로, 전체 스펙트럼 범위(즉, 800 내지 1800 cm-1 and 2800 내지 3600 cm-1) 에서의, 훈련 데이터 세트(전체 데이터 세트의 80%로서, 정상 736 개 및 ESCC 202개)의 라만 피크 강도에 대한, 쌍을 이루지 않는 슈트던트 t-검정(Unpaired two-sided Student's t-test)을 도시한 도면이고(가장 관련성 높은 진단 정보를 포함하는 있는 복수(예를 들어, 7 개)의 라만 스펙트럼 서브 영역들이 확인됨);
도 12B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 가장 진단 학적으로 유의미한 라만 피크(*p <1E-10)의 히스토그램 ± 1 표준편차를 도시하고;
도 13A는 정상 표층 각화 편평 상피 및 기저층의 헤마톡실린/에오신(H/E) 염색 병리조직 슬라이드를 도시하고;
도 13B는 현저한 구조적 및 세포학적 이형성(異形性)을 보여주고 있는 침윤성 식도 편평 상피 세포 암종의 헤마톡실린/에오신 염색 병리조직 슬라이드를 도시하고;
도 14A 내지 14C는 (i) 정상 식도(736 개) 및 (ii) 훈련 데이터 세트 (전체 데이터 세트의 80%)중의 ESCC (202 개)의 생체 내 라만 스펙트럼의 사후 확률을 보여주며, 도 14A 내지 14C는 각각 FP 단독 라만 분광, HW 단독 라만 분광, FP/HW 동시측정 (또는 통합) 라만 분광 기법에 대해, 부분 최소자승 판별분석(partial least square-discriminant analysis) 및 환자별 교차 검증 (leave-one-patient out cross validation) 을 이용하여 계산되었고, 여기서 (○)는 정상식도의 데이터를 나타내고 (▲)는 ESCC의 데이터를 나타내며;
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 것으로, FP 라만, HW 라만, FP/HW 통합 동시측정 라만 기법의 각각의 경우에 있어서, 훈련 데이터 세트(총 데이터 세트의 80%)중에서 정상적인 식도 조직과 ESCC를 구분하기 위한 ROC 곡선을 도시하며, 상기 ROC 곡선의 아래 면적 (area under the ROC curve, AUC)은 각각 0.972, 0.928 및 0.995이고;
도 16A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 자궁 경부 환자로부터 측정된 복합 근적외선 자가형광 (NIR-AF) 및 라만 스펙트럼을 나타내는 그래프이고;
도 16B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 구간 PLS-DA 이후에 추출된 선택된 스펙트럼 영역을 도시하는 그래프이고;
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 전체 스펙트럼 PLS-DA 및 구간 PLS-DA의 모델 복잡도의 함수로서 도시된 분류 오차를 나타내는 그래프이며, 여기서 구간 PLS-DA는 전체 스펙트럼의 10% 이하만을 이용하고;
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 전암(pre-cancer) 그룹의 사후확률(정상 1001 개 및 전암 232 개)의 산포도이고, (a)는 전체 스펙트럼의 PLS-DA 모델링을 사용한 경우의 산포도이고, (b)는 구간 PLS-DA 모델링을 사용한 경우의 산포도이고;
도 19는 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 90 명의 위장 질병 환자(양성종양 (n = 1950) 및 암(n = 108))로부터 측정된 라만스펙트럼에 구간 PLS-DA 적용하여 얻은 연속 라만 스펙트럼 및 선택된 스펙트럼 영역의 그래프이고;
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 전체 스펙트럼 PLS-DA 및 구간 PLS에 대한 모델 복잡도의 함수로서 도시된 분류 오차의 그래프이고;
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 암 그룹(cancer group)의 사후 확률(정상(n = 1950) 및 암(n = 108))의 산포도이고, (a)는 FP 및 HW 전체 스펙트럼에 대해 PLS를 적용한 결과이고 (b)는 구간 PLS-DA모델링을 적용한 결과이고;
도 22A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 임상 내시경 검사 중에 63 명의 환자로부터 얻은, 정상 점막(n = 1083) 및 장 상피화생(intestinal metaplasia, IM)(n = 329)의 생체 내 평균 FP/HW 라만 스펙트럼 ± 1 표준편차를 도시하고;
도 22B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 정상 위장 조직(normal)과 장상피화생 위장조직 (IM) 의 각각의 고유 스펙트럼 특징을 분해하는 차이 스펙트럼(즉, IM - 정상) ± 1 표준편차를 도시하고;
도 23A 및 23B는 위장 조직을 헤마톡실린/에오신(H & E)으로 염색한 절편 슬라이드의 현미경 사진을 도시하고(여기서, A는 정상 위 점막(X200 배율), B는 광범위한 장상피화생 조직(X100 배율));
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 위장 조직의 FP/HW 통합 라만 스펙트럼으로부터 얻어진, 전체 분산의 약 88% 를 차지하는, 5 개의 주요 성분(principle components, PC)(PC1 = 45.6%, PC2 = 33.6%, PC3 = 4.2%, PC4 = 3.1%, PC5 = 1.2%)를 도시하고;
도 25A, 25B 및 25C는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, (A)는 FP 라만, (B)는 HW라만, (C)는 FP/HW 통합 라만 기법을 이용하여 얻어진 정상 위 조직 및 장상피화생 위 조직의 사후 확률의 산포도이고, 모두 PCA-LDA 및 조직 부위별 교차 검증(leave-one tissue site-out cross validation)을 통해 얻어졌으며, FP라만, HW라만 및 FP/HW 통합 라만 기법을 사용하여 정상 위 조직(○)과 장상피화생 위 조직(▲)을 구분할 때, 점선(0.5)는 96.3%(26/27), 77.8%(21/27) 및 92.9%(80/88)의 진단 민감도 및 87.5%(77/88), 78.4%(69/88)의 특이도를 나타내고 있고,
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, FP 라만, HW 라만 및 FP/HW 통합 라만 분광 기법과, PCA-LDA 알고리즘과 조직별 교차 검증(leave-one tissue site-out cross validation)기법을 사용하여 생성한 정상 위 조직과 장상피화생 위 조직을 구분하기 위한 수신기 조작 특성(ROC)곡선을 도시하고 있고, 여기서 ROC 곡선 아래 면적(AUC) 은 FP/HW 통합 라만, FP 라만 및 HW 라만 기법 각각의 경우에 대해 0.96, 0.94 및 0.79이고;
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 구강 내에서 측정된 라만 스펙트럼에 적용된 구간 PLS-DA의 예로서, 해부학적 변이가 큰 영역(예를 들어, 956 cm-1의 수산화인회석(hydroxyapatite) 영역, 1302 cm-1 및 1445 cm-1의 지질 영역 )은 변수 선택 기법에 의해 폐기되었고;
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 이산 스펙트럼 구간들이 사용될 때, 예측을 위해 라만 스펙트럼을 처리하는 방법의 흐름도이고;
도 29A 및 도 29B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 비접촉 모드에서 획득된 생체 내 라만 스펙트럼의 그래프를 도시하고 있으며, (a)는 크세논 광원 앞에 핫 미러(hot mirror)가 결합되어 있지 않은 경우의 스펙트럼이고,(b)는 크세논 광원의 앞에 핫 미러가 결합되어 있는 경우의 스펙트럼이고;
도 30A 및 30B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 접촉 모드에서 획득된 생체 내 라만 스펙트럼의 그래프를 도시하고 있으며, (a)는 핫 미러가 결합 되어 있지 않은 경우의 스펙트럼이고 (b)는 크세논 광원 앞에 핫 미러가 결합 되어 있는 경우의 스펙트럼이고;
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 생체 의학에 광섬유 라만 분광기를 응용하기 위해 사용하는 일반적인 광 필터링 시스템의 블록도 이고;
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 교정 방법의 흐름도이고;
도 33은 본 발명의 일 실시예에 관련된 것으로, 환자에게 사용하기 이전에 광섬유 라만 내시경 검사 기술을 시험하고 교정하기 위한 교정 장치의 블록도 이고;
도 34는 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 환자에게 사용하기 전에 라만 내시경을 시험하기 위한 시험 루틴을 나타낸 도면이고;
도 35는 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 2 개의 상이한 광섬유 탐침을 사용하여 획득 한 배경 스펙트럼의 예시적인 그래프이고;
도 36은 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 표준 텅스텐 램프를 사용하여, 교정 장치 내에 구비된 형광 표준 유리 용기를 교정하는 기술 또는 방법을 도시하는 블록도 이고;
도 37은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 2개의 상이한 광섬유 탐침을 교정하기 위한 교정 기능의 예를 도시하는 그래프이고;
도 38은 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 분명한 라만 피크를 갖는 물질(예: 폴리스티렌)을 측정하는 측정 예를 보여주는 그래프이고;
도 39는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 파수와 픽셀수의 다항식 맵핑을 측정하는 측정 예를 도시하는 그래프이고;
도 40A는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 2개의 상이한 라만 탐침을 사용하여 2층 조직 팬텀(즉, 폴리스티렌 및 폴리에틸렌) 으로부터 획득 한 라만 스펙트럼의 비교를 나타내는 그래프이고;
도 40B는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 상기 조직 팬텀 내의 상층 및 하층의 대표적인 라만 스펙트럼을 도시하는 그래프이고;
도 41은 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 자동으로 레이저 여기 출력 및 누적을 조정함으로써 S/N 비를 개선하고 고체촬상소자(charge coupled device, CCD)의 포화를 방지하기 위한 기술 또는 방법을 도시한 블록도 이고;
도 42는 본 발명의 일 실시예에 따른 것으로, 노출 시간 및 누적을 자동으로 조정하여 S/N 비를 향상시키고 고체촬상소자 포화를 방지하기 위한 기술 또는 방법을 도시한 블록도 이고;
도 43은 본 발명의 실시예에 따른 것으로, 상이한 탐침들 및 상이한 기관들을 위한 진단 모델을 저장하기 위한 대표적인 데이터베이스 구조를 도시하는 블록도 이다.
라만 분광법은, 비탄성 광산란의 원리에 기반을 둔, 고유한 광학 진동 기술이다. 입사 레이저 광이 분자 내에서 편광 변화를 유도할 때, 적은 양의 입사 광자(108 개 중 약 1 개 이하)가 샘플 내의 분자들의 특정 라만 활성 진동 모드에 해당하는 주파수로, 비탄 성적으로 산란 된다. 상이한 분자들 또는 상이한 결합들은 상이한 주파수로 진동한다. 따라서 라만 분광법은, 조직 내의 단백질, 지질, 디옥시리보 핵산(DNA), 물 등과 같은 수많은 세포 간 및/또는 세포 내 구성 요소들로부터 풍부한 특정 생체분자 정보를 수집할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 광섬유 공초점 라만 분광 시스템 또는 장치, 또는 광섬유 공초점 라만 분광기(100)를 도시한다. 상기 시스템(100)은 지문(fingerprint, FP) 스펙트럼 범위 및 고 파수(波數)(high wavenumber, HW) 영역에서 라만 분광 측정을 동시에 수행할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따라, FP 및 HW 통합 스펙트럼 범위에서 측정값을 얻고 분석함으로써, 예를 들어, 생체분자 정보의 생체 내 및 생체 외의 분석 정확도를 높일 수 있다. 즉 위장 내 조직을 특성화, 식별 및/또는 진단 하는데 있어서, 정확도를 향상시킬 수 있다.
상기 광섬유 공초점 라만 분광기(100):는 근적외선(near infrared, NIR) 다이오드 레이저(102)와 같은 시준광 광원; 고효율 반사 영상 분광기(104); 근적외선 고체 촬상 소자(charge coupled devie, CCD)) 카메라(106); 및 광섬유(110)를 통해 상기 레이저(102) 및 상기 분광기(104) 모두에 광학적으로 결합 된 탐침(108)을 포함한다. 상기 탐침(108)은 내시경의 가늘고 긴 샤프트(105)(즉, 가늘고 긴 샤프트(105)가 제공하는 기구 채널) 내에 탑재된다. 상기 광섬유 라만 분광기(100)는 레이저 광의 배경 감쇠를 위한 대역 통과 필터(band pass filter)(112) 및 산란 된 레이저 광 및 섬유 배경 간섭을 제거하면서 조직 라만 신호를 통과시키는 장파장 투과 필터(long pass filter)(114)를 더 구비할 수 있다. 컴퓨터 또는 마이크로 컨트롤러 시스템(124)은 라만 분광기의 동작을 제어하고 라만 스펙트럼 분석을 수행하기 위한 자동화/컴퓨터 제어 및 분석 모듈을 제공할 수 있다.
대표적인 구현 예에 있어서, 상기 근적외선 다이오드 레이저(102)의 최대출력은 300mW이고 출력되는 광의 파장은 785nm이며, B & W Tek Inc.에 의해 제조 된 장치와 호환될 수 있다. 상기 근적외선 다이오드 레이저(102)는 탐침(probe)(108)의 팁(tip)(106)을 통해 여기 에너지를 발생시키며, 상기 여기 에너지는 광이 조사된 부위에서 진동을 발생시키고, 그 결과로서 라만 스펙트럼이 발생된다. 상기 근적외선 다이오드 레이저(102) 대신에, 다른 유형의 시준광 광원을 사용할 수도 있다. 상기 분광기(104)는 예를 들어 약 -70 까지 냉각시킬 수 있는 열전 냉각 기능을 구비 한다. 상기 분광기(104)는 Princeton Instruments Inc.에 의해 제조 된 Acton LS785 f/2와 같은 장치와 호환하여 사용될 수 있다. 상기 카메라(106)는 Princeton Instruments Inc.에 의해 제조된 Pixies 400BR eXcelon과 호환되어 사용될 수 있다. 이러한 대표적인 구현 예에 따르면, 상기 분광기(100)는 약 11 cm-1의 분해능으로 400 내지 3600 cm-1의 스펙트럼 범위의 생체 내 라만 스펙트럼을 얻을 수 있다. 상기의 장치들은 대표적인 예로서 제공된 것이며, 이용 가능한 장치를 제한하는 것은 아니다.
파장 교정을 위해 수은-아르곤 스펙트럼 교정 램프의 원자 방출선을 이용할 수 있다. 상기 램프는 미국 플로리다주의 Dunedin에 위치한, Ocean Optics, Inc.에 의해 제조 된 HG-1 및 AR-1과 호환 될 수 있다. 시스템의 파장 의존성 때문에, 모든 파장 교정 스펙트럼은 미국 캘리포니아주 샌디애고(San Diego)에 위치한 EG & G Gamma Scientific에 의해 제조된 RS-10과 같은 텅스텐 교정 램프를 사용하여 교정 된다.
몇몇 실시예에서, FP 및 HW 스펙트럼을 측정하기 위해, 상이한 레이저 여기 주파수를 연속적으로 전환하면서 조직 라만 신호를 측정한다. 또는, PCT 국제출원번호 PCT/SG2014/000063에 개시된 바와 같이, 이중-전송 격자를 이용함으로써 전체 스펙트럼 범위 (즉, -150 내지 1950 cm-1, 1750 내지 3600 cm- 1)의 고해상도 조직 라만 신호를 측정할 수 있다.
도 2는 또 다른 실시예를 도시한다. 이 실시예는 FP 및 HW 스펙트럼을 동시에 측정하기 위해 단일 반사 격자를 이용하는 광대역 광섬유 공초점 라만 분광 시스템 또는 장치(예를 들어, 400 내지 3600cm-1)(200)에 관한 것이다. 이 라만 분광 시스템을 이용함으로써, 내시경으로 접근 가능한 장기 및 신체 부위에서 조직 특성화 및 진단의 정확성을 향상시킬 수 있다.
상기 라만 분광 시스템(200)은 근적외선(NIR) 다이오드 레이저(202) (lex = 785 nm), 열전 냉각 근적외선 최적화 고체촬상소자 카메라(206)가 장착된 고효율 반사 분광기(204), 및 특수 설계된 1.8 mm (외경) 광섬유 공초점 라만 탐침 (208)을 포함한다. 상기 라만 분광 시스템(200)은 라만 분광기 동작을 제어하고 라만 스펙트럼 분석을 수행하기 위한 컴퓨터 자동화 제어 분석 모듈을 제공하도록 구성된 컴퓨터 또는 마이크로콘트롤러 시스템(124)을 추가적으로 포함한다. 특히, 상기 컴퓨터 또는 마이크로콘트롤러 시스템(124)은 본 발명의 실시예에 따른 특정 라만 스펙트럼의 획득 및 분석 동작, 절차, 또는 프로세스를 수행하기 위한 메모리 상주 프로그램 명령을 실행시키도록 구성된 하나 이상의 프로세싱 유닛을 포함 할 수 있다.
금 코팅 광대역 반사 격자(약 800 nm의 파장에서 90% 이상의 회절 효율을 갖고 있음)를 상기 광섬유 공초점 라만 시스템(200)에 결합시킴으로써, 약 11 cm-1의 분해능으로 전체 스펙트럼 범위(즉, 400 내지 3600 cm- 1)의 라만 신호를 측정할 수 있다. 상기 광섬유 공초점 라만 내시경 탐침 (208)은 레이저 광 방사 기능 및 생체 내 조직 라만 신호 수집 기능을 갖는다. 상기 공초점 라만 내시경 탐침(208)은 국제 특허 출원 번호 PCT/SG2014/000063 호에 개시되어 있으며, 중앙 광선 전달 섬유(직경=200㎛, NA=0.22)를 둘러싸고 있는 200㎛ 필터가 코팅된 다수의 경사 집광 섬유를 (NA=0.22)를 포함하고 있다. 여기 광을 조직에 확실히 집속(focusing)하기 위해, 소형 1.0 mm 사파이어 볼 렌즈(NA=1.78)가 상기 공초점 탐침(208)의 팁에 결합되어 있다. 이러한 구성으로 인하여, 상피 내층(깊이 < 200 ㎛)으로부터 효과적으로 라만 스펙트럼을 수집할 수 있다. 상기 광섬유 공초점 라만 탐침(208)은 의료용 내시경의 기구 채널 내에 삽입될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 광대역 공초점 라만 내시경 기술을 사용하여 생체 내 조직 특성화 및 진단을 수행할 때, 상기 생체 내 조직에 가볍게 접촉 된다.
도 3은 위장 점막에서 측정된, 광대역 FP및 HW 라만 스펙트럼들과 그에 수반되는 자가형광 스펙트럼의 예를 도시하고 있다. 즉 FP 영역 및 HW 영역 모두가 포함되어 있다. 고분해능의 조직 라만 피크는, 다음과 같은 일시적인 분자 배열 상태에서, FP 범위의 자가 형광 스펙트럼의 상단에서 관찰된다:
- v(C-C) 단백질과 관련된 853 cm-1;
- 페닐알라닌(phenylalanine)의 vs(C-C) 링 호흡(ring breathing)과 관련된 1004 cm-1;
- 지질의 v(C-C)와 관련된 1078 cm-1;
- 단백질의 아미드 III v(C-N) 및 d(N-H)과 관련된 1265 cm-1;
- 단백질의CH3CH2 비틀림 및 흔들림과 관련된1302 cm-1;
- 단백질 및 지질의 d(CH2) 변형과 관련된 1445 cm-1;
- 단백질의 아미드 I v(C = O)와 관련된 1655 cm-1 및
- 지질의 v(C = O)와 관련된 1745 cm-1.
강렬한 라만 피크는 또한 다음과 같은 HW 영역에서 나타난다;
- 지질의 CH2대칭 및 비대칭 스트레칭에 관련된 2850 cm-1 및 2885 cm-1;
- 단백질의 CH3 스트레칭과 관련된 2940 cm-1; 및
- 물의 OH 스트레칭 진동의 광대역 라만 스펙트럼과 관련 있는 3100 내지 3600 cm-1 영역 중 3400 cm-1.
본 발명의 일 실시예에 따른 광대역 기술은, 조직의 분석, 식별, 특성화 및/또는 진단을 위해 FP 스펙트럼 영역, HW 스펙트럼 영역, 또는 FP 및 HW 통합 스펙트럼 영역을 사용 할 수 있다. 따라서, 특히 상기 고체촬상소자(CCD)를 빠르게 포화시키는 강렬한 자가형광을 나타내며 내시경적으로 접근 가능한 기관의 조직 분석, 식별, 특성화 및/또는 진단에 특히 유용하다. 상기 컴퓨터/마이크로 콘트롤러 시스템(124)은, 예를 들어 그래픽 사용자 인터페이스 (graphic user interface, GUI)를 이용하여 사용자가 입력한 사용자의 입력에 따라, 조직 분석, 식별, 특성화 및/또는 진단을 위해, FP 스펙트럼 영역, HW 스펙트럼 영역, 또는 FP 및 HW 통합 영역을 선택적으로 사용하도록 구성된다.
일 실시예에서는, 상기 FP 스펙트럼 영역이 상기 고체촬상소자(CCD)의 동적 범위(dynamic range)를 초과하는 경우, 진단을 위해 HW 스펙트럼 영역을 사용한다. 다른 실시예에서는, FP 및 HW 스펙트럼 영역 모두를 조직의 특성화, 식별 및/또는 진단을 위해 사용한다. 상기 광대역 광섬유 공초점 라만 내시경 플랫폼은 고체촬상소자(CCD)의 포화 레벨 및/또는 측정된 조직 유형에 따라, 상이한 스펙트럼 영역(예를 들어, HW, FP, 또는 FP 및 HW 동시)을 사용하도록, 스펙트럼 영역의 전환(switching)을 허용한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조직을 특성화, 식별 또는 진단하는 기술 또는 방법은 광대역 FP 및 HW 스펙트럼으로부터 얻어진 보완적인 진단 정보를 이용한다. 일반적으로 조직 생체 의학 스펙트럼은 매우 복잡하다. 다양한 조직 유형들의 라만 스펙트럼들 간의 미묘한 분자적인 차이를 가치 있는 진단 정보로 변환하려면, 주성분 분석(principal components analysis, PCA)과 같은 정교한 다변량 통계 분석기법(multivariate statistical analysis)이 필요하다. 상기의 통계 분석에서는 지금까지, FP 또는 HW 영역 각각에 대한 조직 진단 및 조직 특성화를 위해서, 전체 (즉, 연속적인) 라만 스펙트럼을 이용해 왔다.
주성분분석(PCA)은 라만 스펙트럼을 주성분(principle components, PCs)들과 같은 직교 성분들의 선형 조합들로 분해함으로써 라만 스펙트럼의 차수를 축소시킨다. 그 결과로서, 데이터세트의 스펙트럼 변화를 최대화 한다. 따라서 주성분 분석(PCA)는 일반적으로 생물 의학적 라만 스펙트럼의 분류를 위한 지원 벡터 머신(support vector machine, SVM), 로지스틱 회귀(logistic regression, LR) 및 선형 판별 분석(lilear discriminant analysis, LDA)과 같은 효과적인 클러스터링 알고리즘과 결합되어 사용되어 왔다. 주성분분석(PCA)은 데이터 축소 및 분석에 매우 효율적이다.
한편으로는, 적절한 Y-지표 행렬에서 그룹 유사성을 나타내는 0과 1의 등급 구분자를 인코딩함으로써, 부분최소자승-구분분석(partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA))을 등급 분류 문제에 적용한다. 부분최소자승-구분분석(PLS-DA)은 주성분분석(PCA)의 기본 원리를 사용하고 있지만, 스펙트럼 변화와 그룹 유사성 사이의 공분산을 최대화하여 잠재변수(latent variables, LV)와 같은 성분들을 더욱 회전시킨다. 그 결과, 상기 잠재변수(LV)는 스펙트럼 데이터 세트내의 가장 현저한 변화가 아닌 진단과 상관이 있는 변화들을 설명해준다. 대부분의 경우에 있어서, 진단학적으로 유의미한 스펙트럼 변화가 처음 몇 개의 잠재변수(LV)내에 포함되어 있다.
대부분의 다변량 알고리즘들(즉, PCA 또는 PLS-DA)은 애초에 많은 양의 비관련 스펙트럼 변수를 처리하도록 설계되지 않았다. 즉, 라만 스펙트럼의 일부 스펙트럼 영역은, 큰 변화량 (large variance), 간섭, 해부학적 변이 등의 이유로 인해, 진단 모델에 악영향을 줄 수 있다.
일 실시예는 상기 광대역 광섬유 공초점 라만 분광 시스템(200)을 이용한 FP 및 HW 스펙트럼 측정을 통하여 얻어진 FP 및 HW 스펙트럼 영역으로부터 획득된 보완 정보를 이용하는 새로운 진단 기술 또는 방법을 제공한다. 이 실시예에서는, 진단을 위해, 연속적인 스펙트럼 영역이 아닌, 광대역 FW 및 HW 라만 스펙트럼 내의 이산 스펙트럼 서브 구간(예를 들어, 폭이 약 10 내지 30 cm-1 또는 약 20 cm-1인 약 3 내지 15개 또는 약 5 내지 10 개의 이산 스펙트럼 서브 구간들)을 이용한다.
도 4는 위장의 광대역 라만 측정값들의 예를 도시하고 있으며, 보완적 정보가 FP스펙트럼영역 (즉, 800 내지 1800 cm-1) 및 HW 스펙트럼영역 (즉, 2800 내지 3600 cm-1)의 두 영역 모두에서 추출 된다. 도 5A 및 5B는 FP 및 HW 범위에서 5 차 다항식 차감 후의 라만 스펙트럼을 도시하며, 특정 라만 피크를 명확하게 보여 주고 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, FP 및 HW 영역으로부터 추출 된 스펙트럼 서브 구간을 사용함으로써, 전암(pre-cancer) 또는 암(cancer)과 같은 비정상 종양(abnormal growths)에 대한 생체 내(in vivo) 라만 내시경 진단의 정확성을 크게 향상시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 일 실시예는 대장 내 비정상 종양과 같은 위장관의 비정상 종양의 진단에 관한 것이다. 생체 내 대장 조직으로부터 측정된 FP 및 HW 라만 스펙트럼은, 약한 조직 라만 신호, 강한 자가 형광 배경 신호, 및 노이즈 신호를 포함하고 있다. 라만 신호를 분석하기 위해서는, 상기 자가형광 배경 및 노이즈를 처리하거나 제거해야 한다. 따라서 스펙트럼 노이즈를 줄이기 위해, 원시 스펙트럼은 제1 차 평활화 필터 (예를 들어, 3개 픽셀의 윈도우 폭을 갖는 SavitzkyGolay 필터)에 의해 전처리 된다.
상기 FP 영역(800 내지 1800 cm- 1)에서, 5차 다항식이 자가형광 배경을 노이즈 평활화를 거친 스펙트럼에 맞추는 조정하는 데 가장 적합하다고 알려져 있다. 이후에, 5차 다항식을 교정된 FP 스펙트럼으로 부터 차감함으로써 조직 라만 스펙트럼만 남긴다. 상기 HW 범위(2800 내지 3600 cm- 1)에서, 자가형광 기저선(base line)을 제거하는 데에는 1 차식 선형 조정 (first order linear fitting)법이 가장 적합하다. 이와 같은 신호 전처리는 약 30 ms 이내에 완료되므로, 처리된 라만 스펙트럼 및 진단 결과는 컴퓨터 화면과 같은 표시장치에 실시간으로 표시될 수 있다.
상기와 같은 신호 전처리를 수행한 후, 상기 라만 스펙트럼을 분석하여 피크 및/또는 지표를 결정한다. 다음으로, 이러한 피크 또는 지표를 사용하여 스펙트럼 측정 대상조직의 성질 (병변 또는 비정상 종양의 성질)을 추정하거나, 특성화하거나, 결정한다. 이러한 처리는, 공지된 제어 스펙트럼, 기준 지표 등과 비교하는 적절한 비교수단을 갖춘 컴퓨터 시스템에 의해 수행될 수 있다. 본 출원에서 사용하는 용어인 “기준 지표”는 상기 전체 라만 스펙트럼이거나 또는 라만 스펙트럼 내에 있는 하나 이상의 개별 피크를 의미한다.
하나 이상의 라만 기준 지표가 비정상적인 세포 증식의 임의의 성질을 나타내는 경우, 획득된 스펙트럼과 기준 지표 사이의 비교는 룩업 테이블(lookup table) 등을 사용하여 수행된다. 여기서 다양한 유형의 비교 기법 또는 방법이 사용될 수 있다. 일단 비교 처리가 수행되어, 최상의 일치(best match)가 결정되면, 상기 시스템(200)의 사용자에게, 임의의 적절한 수단을 통해 상기 비정상적 세포 증식의 유형이 제시된다. 상기 적절한 수단은, 컴퓨터 화면상의 시각적 표현 및/또는 청각적 메시지를 포함한다.
상기 시스템( 200)을 이용한 실험에서, 총 50 명의 지속적인 증상을 보이는 환자가 대장 내시경 검사를 받았다. 상기 환자들은 검진 또는 선별검사(surveillance or screening)에서 빈혈, 출혈 등과 같은 다양한 대장암 징후를 보였다. 대장 내시경 검사 전에, 환자에게 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 전해질 대장 정결 제제를 투여했다. 다음으로 정맥 주사를 통해 프로포폴(propofol)을 투여하여 진정작용을 유도했다.
내시경 검사 시술자는 점검 중에 그리고 공초점 라만 스캔 수행 전에 결장을 세척하였고, 용종형 및 평편 대장 병변을 생리 식염수 용액을 흘려 넣어 교합 인자(즉, 잔류 대변 및 체액 등)를 더욱 감소시켰다. 일반적인 검사 진행 중에, 내시경은 원위 결장에 도달하도록 삽입 되었고, 인체로부터 탐침을 수거하는 동안에 의심스러운 병변에 대한 라만 스캔( 약 15 스펙트럼)이 수행되었다. 각각의 조직 라만 측정은 약 0.1 내지 0.5 초 내에 수행되었다.
이러한 방법으로 대장 용종을 신속하게 검사할 수 있었다. 대장 용종(~ 10 %)과 비접촉 상태로 획득된 모든 라만 스펙트럼은, 호텔링(Hotelling)의 T2 및 Q- residual 통계와 연관된 주성분 분석(PCA)법을 사용하는, 온라인 임상 소프트웨어에 의해 자동으로 폐기 되었다. 상기 주성분분석(PCA)법은 기 출원된 국제특허출원번호 PCT/SG2014/ 000063의 발명 대상이며, 다음과 같이 작동한다:
- 새로운 특이치 검출 방식이 호텔링(Hotelling)의 T2 및 Q-residual 통계와 결합 된 주성분분석(PCA)을 기반으로하여 도입되었고, 온라인 프레임 워크상에서 상위 모델 피드백 도구로 사용된다. 호텔링(Hotelling)의 T2 및 Q-residuals은 모델 내외의 정보를 제공하는 두 개의 독립적인 매개 변수들이다;
- 호텔링(Hotelling)의 T2 및 Q-residuals 파라미터를 사용함으로써 획득되는 스펙트럼의 품질 (즉, 탐침-조직 접촉 모드, 탐침 핸들링 변화, 백색광 간섭, 청색광 간섭, 교란 인자 등)을 통제한다. 청각 피드백이 라만 진단 시스템과 결합됨으로써, 실시간 분광 선별이 용이해지고 및 임상의에게 탐침 핸들링에 대한 조언을 용이하게 할 수 있다;
-추가 분석을 위한 스펙트럼이 확인되면, 상기 스펙트럼은 생체 내 암 진단을 위한 확률 모델에 투입된다. 이 소프트웨어는 많은 환자들의 스펙트럼으로 구성된 데이터베이스에 기초하여, 부분 최소자승-판별분석(PLS-DA), 중요성분분석-선형 판별 분석(PCA-LDA), 개미 군락 최적화(ant colony optimization)-선형판별분석(ACO-LDA), 분류 및 회귀 분석(classification and regression trees , CART), 지지 벡터 머신(SVM), 적응적 부스팅(adaptive boosting, AdaBoost) 등을 포함하는 사전에 설계된 다변량 통계 모델들을 빠르게 전환(switching)한다.
라만 스캔이 완료되고 스캔 결과가 저장된 후에, 각 조직 표본을 떼어내어 포르말린에 고정하고, 박편으로 절개하여 관찰용 시편을 만들었다. 시편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고, 병리조직학적 시험을 위해 검사실로 보냈다. 대장 조직들은 임상적으로 다음의 세 가지 주요 범주로 분류된다:
- 양성(정상 및 과형성 용종);
- 고저 등급의 선종(관상 선종, 융모 선종, 관상융모 선종); 및
- 선암.
생체 내에서 비종양성 대장 병변과 종양성 대장 병변을 구분하는 능력을 판단하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 FP 및 HW 동시측정 광섬유 공초점 라만 기법과 병리조직 검사를 비교하였다.
이 비교과정에는, FP 및 HW 동시측정 광섬유 공초점 라만 분광법이 현재 사용되고 있는 기술을 대체할 정도로 충분히 정확한지 여부를 검증하기 위한, 통계 분석이 포함되어 있다. 병리조직적 특성에 대한 일치도를 평가하기 위해 코헨의 카파 통계(Cohen's k statistics)를 사용하였다. 피셔(Fisher)의 사후 검증 (post hoc) 최소 유의차 검증(least significant difference, LSD) 테스트와 함께 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 평균 값의 차이를 테스트했다. 임상진단에 유의미한 라만 스펙트럼 특성을 추출하기 위해 다변량 통계 분석이 사용되었다. 조직 진단에는 확률적 부분최소 자승(PLS) 판별 분석(DA)을 적용하였다. 과대적합(over-fitting)의 위험성을 줄여주는 PLS-DA 모델의 복잡성을 평가하고 최적화하기 위하여 환자별 교차 검증(leave-one patient-out cross validation)을 적용하였다. 생체 내에서 비종양성 용종과 종양성 용종을 구별하는데 있어서, FP/ HW 광섬유 공초점 라만 분광법의 능력을 평가하기 위해, 수신자 조작 특성(ROC) 곡선을 생성하고 곡선아래면적(area under the curve, AUC)을 계산 하였다.
특정 피검사체군 또는 환자군에 대해 본 발명의 일 실시예를 적용한 결과를 보여주기 위한 예로서 제시된 실험에서, 평균 연령이 52세(연령범위는 23 ~ 83세)인 50명의 환자(남성 27 명 및 여성 23 명)가 광섬유 공초점 라만 검사에 응모하였다. 13명의 환자가 저등급 이형성증(異形成症 , dyplasia)을 보이는 선종을 가지고 있었고, 그중 11명은 관상형 선종을, 2명은 관상융모형 선종을 가지고 있었다. 3 명의 환자는 진행단계의 대장암 선암과 관련이 있었다. 코헨의 카파 0.89는 3개의 조직군에 대한 병리학적 소견들의 일치도가 높음을 입증한다. 126개의 병변 또는 비정상 종양(abnormal growths)으로부터 총 1731 개의 생체 내 대장 라만 스펙트럼을 획득하였다. 이 병변들 중, 1397 개는 양성이었고, 235 개는 선종이었고, 99 개는 선암 이었다. 이것은 병리조직 검사를 통해 확인 되었다.
오름잘록 창자(ascending), 가로잘록 창자(transverse), 내림잘록 창자(descending), 구불 창자(sigmoid), 곧은 창자(rectum)와 같은 병리학적 아형 및 해부학적 위치를 포함한, 환자 및 병변의 상세한 분포가 표 1에 요약되어 있다.
| 환자 정보 | 해부학적 위치 및 측정된 라만 스펙트럼 수 | |||||||||
| 병리조직 병멍 |
환자 | 병변 | 성 남성/여성 |
평균 연령 |
곧은창자 | 구불창자 | 내림잘록창자 | 가로잘록창자 | 오름잘록창자 | 총 스펙트럼수 |
| 정상편평병변 | 28 | 91 | 13/15 | 51 | 423 | 215 | 133 | 318 | 206 | 1295 |
| 과형성 용종 | 5 | 7 | 3/2 | 51 | 63 | 7 | 0 | 0 | 0 | 102 |
| 선종 | ||||||||||
| 관상 | 11 | 17 | 5/6 | 60 | 83 | 0 | 12 | 41 | 81 | 216 |
| 관상융모 | 2 | 2 | 2/0 | 41 | 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 19 |
| 선암 | 3 | 9 | 3/0 | 69 | 3 | 29 | 0 | 67 | 0 | 99 |
도 6은 양성, 선종 및 선암종과 같은 비정상 종양에서 측정된 생체 내 공초점 라만 스펙트럼의 평균 및 ± 1 표준 편차(회색 음영 부분)를 도시 한다. 임의의 분자 배치 상태에서, 현저한 조직 라만 피크는 FP 범위에서 다음과 같이 관찰된다:
- v(C-C) 단백질과 관련된 853 cm-1;
- 페닐알라닌의 ν(C-C) 링 호흡과 관련된 1004 cm-1;
- 지질의 ν(C-C)와 관련된 1078 cm-1;
- 단백질의 아미드 III v(C-N) 및 δ(N-H)에 관련된 1265 cm-1;
- 지질의 CH2의 비틀림 및 흔들림과 관련된 1302 cm-1;
- 단백질과 지질의 δ(CH2) 변형과 관련된 1445 cm-1;
- 포르피린의 v(C = C)와 관련된 1618 cm-1;
- 단백질의 아미드 I v(C = O)와 관련된 1655 cm-1; 및
- 지질의 v(C = O)와 관련된 1745 cm-1.
강렬한 라만 피크는 또한 다음과 같은 HW 영역에서 발견 된다:
- 각각 지질의 대칭 비대칭 CH2 스트레칭과 관련 있는2850 cm- 1및 2885 cm-1;
- 단백질의 CH3 스트레칭과 관련된 2940 cm-1;
- 단백질의 비대칭 =CH 스트레칭과 관련된 3009 cm-1;
- 아미드 A(단백질의 NH 스트레칭)과 관련된 ~ 3300cm-1; 및
- 물의 넓은 라만 밴드와 관련이 있는 약3200 cm-1 과 약3400 cm-1 (이것은 조직의 세포 내 및 세포 외 공간에서의 OH-결합의 국부적인 형태 및 상호 작용과 직접적으로 관련된, 물의OH 스트레칭 진동과 관련이 있다).
도 7A는 양성 선종, 양성 선암종 및 선종 선암종의 차이 스펙트럼 및 ± 1 표준편차(회색 음영 영역)를 도시하며, 상이한 대장암 병변들 간의, 피크 강도, 변이, 및 밴드 확장 등과 같은 구별 가능한 스펙트럼 특징을 보여주고 있다.
도 7B는 전체 스펙트럼 범위(각각의 라만 스펙트럼의 범위는 800 내지 1,800 cm-1 및 2800 내지 3600 cm- 1 이고, 라만 신호의 강도는 799 단계)에서, 라만 신호의 각 강도별 p-값(ANOVA)의 대수 플롯을 도시한다.
도 7C는 FP 및 HW 두 영역 모두에 대한, 가장 진단학적으로 유의미한 라만 피크 강도 (평균 ±1표준편차)의 히스토그램을 도시하고, 특히 (i) 1078 cm-1, (ii) 1265 cm-1, (iii) 1335 cm-1, (iv) 1431 cm-1, (v) 1618 cm-1, (vi) 2885 cm-1 및 (vii) 3200 cm-1 부근의 라만 피크 강도를 도시한다.
상기 생체 내 라만 스펙트럼은 상이한 병리학적 카테고리의 대표적인 병리조직 슬라이드와 상관 관계가 있다. 도 8A는 가벼운 림프구 모세 혈관 침윤이 있는 정상적인 장의 점막에 배상세포(杯狀細胞 )가 광범위하게 분포하고 있는 것을 도시한다. 도 8B는 배상(杯狀) 과형성 용종에서, 별 모양의 샘을 갖고 있는 종양의 형상을 도시한다. 도 8C는 저등급 이형성증을 갖는 관상 선종을 도시하며, 과다염색성 핵을 가진 군집세포를 도시하고 있다. 도 8D는 현저한 세포 이상 및 구조 이상이 있는 침습성 선암을 도시하고 있다. FP 및 HW 광섬유 공초점 라만 분광법은 도 7A 내지 도 7C에 도시된 대장암 발암과 관련된 상피세포에서 발생 하는 생체분자 변화를 밝혀주는 반면, 도 8A 내지 도 8D의 병리조직 특성을 통해서는 상이한 병변 유형들의 세포적 및 형태학적 특징을 알 수 있다.
FP 및 HW 스펙트럼 영역의 보완적인 생체분자 정보를 이용하여, 생체 내 진단을 위해 광섬유 라만 분광법을 적용하였다. 도 9A는, (i) 양성(n = 1397), (ii) 선종(n = 235) 및 (iii) 선암(n = 99)에 속하는 59명의 대장 종양 환자에 대해서, 본 발명의 일 실시예에 따른 FP 및 HW 광섬유 공초점 라만 분광 기술과 3차 확률론적 PLS-DA을 적용하여 산출된 사후확률을 도시한다. 민감성과 특이도 사이의 관계는 그림 9B에 도시한 ROC 곡선의 전개를 통해 결정되었다. 선종과 양성 용종의 구분에 대해, ROC 곡선 아래 면적(AUC, 즉 진단 정확도)이 0.930였고, 선암을 선종 및 양성 용종과 구분하기 위한 ROC 곡선 아래 면적(AUC, 즉 진단정확도)은 0.978이었다. ROC 분석 결과, 선종을 양성 용종 및 편평한 병변으로부터 구별할 수 있었고, 이때의 민감도는 88.5%(208/235) 였고 특이도는 80.0 %(1118/1397)였다. 스펙트럼에 기초한, 선암 검출의 민감도는 92.9%(92/99 )이었고, 특이도는 96.51%(1575/1632)이었다. FP 및 HW 영역의 생체분자 정보가 진단에 보완적인지 여부를 조사하기 위해, 그림 10에 도시한 바와 같이, 추가적인 ROC 분석을 수행하였다. FP 영역(즉, 800 내지 1800 cm- 1)에서의 AUC는 0.908이었고, HW 영역(즉, 2800 내지 3600 cm- 1)에서의 AUC는 0.895이었다. 반면, FP와 HW 영역 모두의 보완적인 정보를 사용하는 경우, AUC가 0.930으로 크게 개선되었다.
이러한 고무적인 생체 내 진단 결과에 비추어 볼 때, 상기 FP 및 HW 광섬유 공초점 라만 분광법은 생체 내에서 대장 신생 조직의 실시간 객관적인 진단을 가능하게 하는, 매우 유명한 광학적 분석법이다.
많은 사람들이, 병리조직 검사 비용을 현저하게 증가시키는 원인이 되는 작은 대장 과형성 용종이나 편평형 용종증 병변을 갖고 있다고 알려져 있다. 대장암 검사를 위해 진보된 내시경 검사법을 개발하고 채택하게 하는 중요한 동기는, 양성 과형성 용종을 선종과 구별 할 수 있는 능력이 있느냐의 여부이다. 본 발명의 실시예 들에 따르면, 최초로 FP 및 HW 영역을 포괄하는 고품질의 생체 내 공초점 라만 스펙트럼을 (동시에) 대장 용종으로 부터 측정할 수 있었고, 실시간으로 분석 할 수 있었다. 또한, 도 6에 도시한 바와 같이, 본 발명의 실시예 들은, 신생 조직을 식별하는 방법을 개선하는 데 사용될 수 있다. 본 발명 실시예의 광섬유 공초점 라만 분광 기술은, 도 7A 내지 도 7C에 도시한 바와 같이, 상피에서 발생하며 종양성 형질 전환을 수반하는 생화학적 및 생체분자적 변화를 밝히는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 신생 용종은 다음의 스펙트럼 영역에서의 상당한 라만 강도의 감소와 관련이 있다 (즉, v(C-C)와 관련 있는 1078 cm-1, δ(CH2)와 관련 있는 1431 cm-1, 및 각각 대칭 및 비대칭 CH2 스트레칭과 관련 있는 2850 cm-1 및 2885 cm-1(지질 함량의 상대적인 감소를 나타냄)(p <0.001)에서의 라만 강도의 감소와 관련이 있다). 그러한 결과는 단백질 함량의 상당히 증가를 의미한다. 이것은 페닐알라닌의 ν(CC) 링 호흡과 관련된 1004 cm-1에서의 민감한 바이오 지표와, 단백질의 아미드 I v(C = O)와 관련된 1655 cm-1에서의 밴드 확대에 의해 확인가능 하다. 이것은 신생 상피에서의 세포 증식의 증가를 의미한다. 1618 cm-1(p <0.001)에서의 신생 용종의 현저히 강한 라만 피크 강도는 항원성 발병 및 신생 혈관 형성과 연관되어 있는 헤모글로빈 함량과 밀접하게 관련되어있다.
위에서 언급한 피크 강도는 분자 내의 특정 결합의 진동과 관련이 있다. 결합의 각각의 유형은 서로 다른 피크 강도를 갖는다. 특정 결합과 연관된 피크 강도의 식별을 통해 생체분자 정보를 알 수 있다. 병변 또는 비정상 종양(abnormal growths) 이 특정 결합(들) 을 내포하고 있으며, 특정한 관련 피크 강도를 나타낸 다는 사실은, 상이한 유형의 비정상 종양(abnormal growths)을 구분하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 양성인 비정상 종양(abnormal growth)이 특정 피크 강도를 나타내는 경우, 그 피크 강도가 추후에 검출된다면, 상기 추후에 검출된 병변 또는 비정상 성장이 양성일 것이라는 결론에 도달 할 수 있다.
본 출원의 실시예에서, 비정상 종양(abnormal growths)의 유형을 식별하기 위해 피크 강도와 바이오 지표 사이의 연관성을 이용한다. 이것은 생체 내 와 생체 외에서 모두 발생할 수 있다.
몇몇 결과를 보면, 선종 내의 수분 함량이 현저하게 다르다는 것을 알 수 있다. 3200 cm-1(p <0.001)에서 넓은 비대칭 OH 스트레칭 진동의 강도 증가는 신생 상피 세포의 결합수(bound water) 함량의 증가를 의미한다. 이러한 수분 함량 증가는, 수분 침투성을 변화시키고 신생 세포의 수화(hydration)를 유도하는 수분통로(aquaporins)의 발현에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. 결합 수의 증가는 소수성 지질의 감소와 관련이 있다. 지질 및 결합 수와 연관되어 있는 피크 강도 비율 (즉, I2885/I3200)을 계산함으로써, 이러한 발견의 중요성을 분석하였다. 피크 비율만으로도, 81.3%(191/235)의 민감도와 80.4%(1132/1397)의 특이도의 수준으로 양성 용종과 선종을 구별 할 수 있다.
따라서 용종 내의 지질 함량과 수액 관류(water perfusion)는 대장 신생물을 특성화할 수 있는 매우 유용한 생물지표(biomarker) 이다. 따라서 상피 라만 스펙트럼의 특징(signitures)과, 세포 및 조직 생화학 특징 사이의 직접적인 관련성을 통해, 검사 현장에서 곧바로 대장암 발암을 생체분자 수준으로 파악할 수 있다. 상기 피크강도 또는 생물지표는 비정상 종양(abnormal growth)의 유형을 진단하는데 사용될 수 있다.
단백질, 지질, DNA, 단백질 결합수, 및 단백질 비결합수를 포함한 광범위한 보완적 광학 생물지표를 이용함으로써, 도 9A 내지 도 9B에 도시 된 바와 같이, 정확한 생체 내 선종 진단이 가능해졌음이 처음으로 증명되었다. 스펙트럼을 기반으로 선종을 양성 용종 및 편평한 병변과 구별할 수 있었으며, 이 경우 민감도는 88.5 %(208/235) 였고 특이도는 80.0%(1118/1397)였다. 광섬유 공초점형 라만 탐침을 이용하여 얕은 상피층을 선택적으로 조사함으로써, 선암종과 선종을 효과적으로 구분할 수 있었으며, 이것은 침습성 암세포가 생체분자의 현저한 이상과 관련이 있다는 것을 의미한다.
상기 결과들은, 대장 신생물의 생체 내 검출 및 진단에 있어서, FP 및 HW 광섬유 공초점 라만 대장 내시경 기술의 효과를 분명하게 보여준다. FP 및 HW 영역의 스펙트럼 모두를 사용함으로써 FP 또는 HW영역을 단독으로 사용하는 것보다 우수한 진단정확도(AUC)를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는 FP 및 HW 통합 라만 분광 기술이 분류 오류율(misclassification rate)을 대폭 감소시킬 수 있음을 보여주며, 또한 FP 및 HW 영역에서 얻은 보완적인 생체분자 정보가 추가되기 때문에 생체 내 대장암 진단 정확도가 높아진다는 것을 확인해 주는 것이다. 예를 들어, HW 영역 스펙트럼은 FP 영역 스펙트럼에 포함되지 않는 CH2 및 CH3 스트레칭 부위뿐만 아니라 물의 국부적 형태와 관련된 정보를 포함한다. FP 및 HW 통합 스펙트럼은 생체 내 진단 목적으로도 사용될 수 있다.
FP 및 HW 조합 라만 분광기 기술의 대표적인 바람직한 방식은, FP 및 HW 스펙트럼의 동시 측정법이다. 생체 내에서 FP 단독 또는 HW단독 스펙트럼을 얻을 경우, 여러 종류의 비정상 종양(abnormal growths)을 을 식별할 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 실시예에서는, FP 영역 단독, HW 영역 단독, 또는 FP 및 HW영역의 조합(즉, 동시 측정)의 형태로 라만 분광 기술을 사용할 수 있다.
광대역 FP 및 HW 스펙트럼 내의 이산 스펙트럼 서브 구간(“소정의 값” 및/또는 “기준 지표 (reference marker)”라고도 지칭)을 사용하는 경우, 진단 기술 또는 방법이 더욱 개선된다.
(예를 들어, FP 및 HW 스펙트럼을 동시에 얻기 위해) 하나의 금 코팅 광대역 반사 격자를 사용한다는 것은, 정확도가 높은 표적조직 특성화 및 진단을 위한 장비의 측면에서 중요한 발전이라고 할 수 있다. 즉, 내시경 검사 중에 잠재적 비정상 종양 또는 실제적 비정상 종양을 생체 내에서 실시간으로 정확하게 특성화/진단하기 위한 장비 개발에 있어서, 중요한 진보이다. 단일 금 코팅 광대역 반사 격자를 사용하는 것은, 생체 내 측정을 수행하는 동안, 종래 기술에서 행해졌던 회절 격자의 스위칭이 필요 없게 되었다는 것을 의미한다. 이것은 분명히 많은 장점을 가지고 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 시스템 또는 장치는 스위칭 프로세스 없이, 모든 필요한 측정을 할 수 있다. 이 장치는 복수의 회절 격자를 구비하지 않고 하나의 회절 격자를 구비하기 때문에, 소형이면서 저렴하다는 장점이 있다. 단일 격자 설계는, 이중 격자 설계에 비해서는 스펙트럼 분해능이 약간 떨어지지만, 소형 시스템의 스펙트럼 분해능이 일반적으로 조직 라만 스펙트럼 대역폭(통상적으로, ~10cm-1 의 범위)과 일치하므로, 단일격자를 구비한 이 소형 시스템은 진단 목적 또는 결과에 전혀 또는 그다지 영향을 미치지 않는다.
광섬유 공초점 라만 분광법은 정확하고 객관적인 실시간 자동 진단을 제공한다. 따라서 손쉽게 이용할 수 있고, 조영제의 투여나 추가적인 내시경 검사 훈련을 필요로 하지 않는다. 생체 내 장상피의 기능적 및 생체분자적/생화학적 평가가 가능하기 때문에, FP 및 HW 광섬유 공초점 라만 분광기의 도입은 결장경 검사와 같은 위장 내시경 검사에 큰 영향을 미친다. 이 새로운 생체분자적 내시경 접근법은, 임상적인 대장 검사에서 객관적이고 즉각적인 의사 결정을 가능하게 한다. 대장검사에서 광섬유 공초점 라만 분광법의 두 가지 주요 역할은 다음과 같다.
(i) 즉각적인 용종 절제술 또는 내시경적 점막절제술(EMR)의 대상이 되는 소형 고위험 선종의 식별을 포함한 예방 및 중재적 접근이 가능하다. 위험성이 적은 과형성 용종이나 의심스러운 평평한 병변은 절제하지 않고 남겨 두어 의료 비용을 효율적으로 줄일 수 있다.
(ii) 광섬유 공초점 라만 분광법은 또한 선종의 존재를 높은 정확도로 효율적으로 확인하거나 부인하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 실시예들은, 대장암(CRC)의 내시경 수술 및 복강경 수술에 대한 사용 가능성을 열어두며, 또한 위장 전문가들에게, 절제 경계영역의 실시간 판단 및 정의뿐만 아니라, 분자수준에서 치료 후 효능 또는 재발의 후속 평가를 할 수 있게 해주는 객관적인 도구를 제공한다. 이러한 도구는 완전한 종양 절제 및 후속적인 경계영역의 평가를 도와, 재발의 위험을 줄여 준다. 따라서, 본 발명의 실시예에 따른 FP 및 HW 광섬유 공초점 라만 분광법은 위장 내시경 검사 분야 뿐만 아니라 다른 신체 부위의 검사에도 사용 가능하고, 실시간, 생체 내(in-vivo) 객관적 조직 평가가 가능하기 때문에, 선별 기준 설정 및 대장 치료에도 응용될 수 있다.
또 다른 임상 예에서, 내시경 검사를 진행하는 동안, 식도 편평 세포 암(ESCC)의 생체 내 실시간 진단을 수행하기 위해 본 발명에 따른 실시예를 이용하였다. 이 임상 예에서, 생체 내 식도 조직으로부터 FP(즉, 800 내지 1800 cm- 1범위) 및 HW(즉, 2800 내지 3600 cm-1 범위) 영역의 라만 스펙트럼을 동시에 측정하였다.
이 일련의 실험에서, 통상의 내시경 검사를 받은 48 명의 식도 환자로부터 총 1172 개(정상860개, ESCC 312개) 의 고품질 생체 내 FP/HW 조직 라만 스펙트럼을 획득하였다. 전체 생체 내 라만 데이터 세트는, 80%의 훈련 데이터 세트와 20%의 예측 데이터 세트로 분리했다. 80%의 훈련 데이터 세트는 34명의 식도 환자로부터 얻은 937개(정상 736개, ESCC 202개)의 FP/HW 라만 스펙트럼으로 구성되고, 20%의 예측 데이터 세트는 14명의 식도 환자로부터 얻은 234개(정상 124개, ESCC 11개)의 생체 내 FP/HW 라만 스펙트럼으로 구성된다.
도 11A는 조직 진단 알고리즘 개발을 위해 이용된 훈련 데이터 세트(전체 데이터 세트의 80%)의 생체 내 조직의 평균 FP/HW 라만 스펙트럼과 ±1 표준 편차(음영 영역)를 도시한다. WLR 유도 FP/HW 라만 측정시에 촬영된 영상도 도시되어 있다. 임의의 분자 배치 상태 (tentative assignment)7-18에서, 현저한 식도 조직 라만 피크가, FP영역에서 다음과 같이 관찰 된다:
- v(C-C) 단백질과 관련된 853 cm-1;
- 페닐알라닌의 호흡과 관련된 1004 cm-1;
- 지질의 ν(C-C)와 관련된 1078 cm-1;
- 단백질의 아미드 III v(C-N) 및 δ(N-H)와 관련된 1265 cm-1;
- 지질의CH2비틀림(twisting) 및 흔들림(wagging)과 관련된 1302 cm-1;
- 단백질과 핵산의 CH3CH2 비틀림(twisting)에 관련된 1335 cm-1;
- 단백질과 지질의 δ(CH2) 변형과 관련된 1445 cm-1;
- 포르피린의 v(C = C)와 관련된 1618 cm-1;
- 단백질의 아미드 I v(C = O)와 관련된 1655 cm-1; 및
- 인지질의 v(C = O)와 관련된 1745 cm-1.
강렬한 라만 피크 강도는 또한 HW 영역18 -24에서 다음과 같이 관찰된다:
- 지질의 대칭 및 비대칭 CH2 스트레칭과 관련된 2580 및 2885 cm-1;
- 단백질의 CH3 스트레칭과 관련된 2940 cm-1;
- 아미드 A(단백질의 NH 스트레칭)와 관련된 ~3300 cm-1; 및
- 식도 조직의 세포 내 및 세포 외 공간에서의 OH 결합의 국부적인 형태 및 상호 작용과 관련된 물의 광범위한 라만 밴드(~3250 및 ~3400 cm-1에서 정점을 갖는 OH 스트레칭 진동).
도 11B는 ESCC와 정상 식도조직 간의 차이 라만 스펙트럼 및 ± 1 표준편차(음영 영역)를 도시하며, 식도의 암 진행과 관련된 라만 활성 성분 변화를 반영한다. ESCC와 정상 조직의 라만 스펙트럼 간의 유의미한 차이(p = 1.3E-8, unpaired two-sided Student's t-test)는, 식도암의 생체 내 진단을 위해, FP/HW 라만 내시경 동시 검사를 수행할 수 있다는 것을 입증한다.
진단에 있어서의 중요한 라만 활성 성분을 보여 주기 위해, 도 12A는 전체 스펙트럼 범위(즉, 800 내지 1800 cm-1 및 2800 내지 3600 cm- 1)에서, 각각의 라만 강도에 대해 계산 된 p-값(unpaired two-sided Student's t-test)의 대수 플롯을 도시한다. 특히, 스펙트럼 서브-영역들 (단백질, 지질 및 핵산과 관련이 있는 840 내지 940 cm-1, 1025 내지 1100 cm-1, 1310 내지 1355 cm-1, 1585 내지 1690 cm-1, 및 2830 내지 2975 cm-1구간)에서, ESCC와 정상 식도 사이에서, 통계적으로 유의미한 차이(p <1E-10)가 있다는 것이 발견되었다. 결합수(bound water)에 대해서는, 3160 내지 3260 cm-1 및 3370 내지 3420 cm-1의 영역에서, 유의미한 스펙트럼 차이가 관찰되었다.
도 12B는 FP 및 HW 범위 모두에서, 즉, (i) 853 cm-1, (ii) 1078 cm-1, (iii) 1335 cm-1, (iv) 1618 cm-1, (v) 1655 cm-1, (vi) 2850 cm-1, (vii) 2885 cm-1, (viii) 3250 cm-1, and (ix) 3400 cm-1에서, 가장 통계적으로 상이한 라만 피크 강도 (평균±1 표준편차)의 히스토그램을 도시한다. 도 13에 도시한 바와 같이, 병리조직 검사를 통해 ESCC에서 일어나는 현저한 세포적 및 구조적 이상을 확인하였고, 서로 다른 라만 활성 성분을 의미하는 상대적으로 높거나 낮은 FP/HW 조직 라만 밴드는 ESCC 변형을 수반하는 식도조직의 특정 생화학적/생체분자적 변화를 나타내고 있다. 조직 내의 지질, 단백질, DNA 및 수분 함량과 관련되어 있는 FP/HW 라만 스펙트럼의 변화는, FP/HW 동시측정 라만 분광기가 ESCC를 분자수준에서 검출할 수 있는 능력이 있다는 것을 재확인해 준다.
FP 및 HW 스펙트럼 범위에서 확인된 보완적인 생화학/생체분자 정보를 활용하여, 훈련 데이터 세트(전체 데이터 세트의 80%)에 대해 PLS-DA 및 LOPCV를 수행함으로써, 생체 내 ESCC 진단 정확도를 향상시키는 강력한 진단 모델을 개발했다. 코헨의 카파값 (Cohen's kappa) 0.91은 식도조직의 군 분류에 대해 병리학자들 사이의 의견 일치도가 높았다는 것을 입증한다. 도 14는 라만 예측을 교차검증 하여 얻은 PLS-DA 사후확률의 산포도이며, (a)는 FP 라만, (b)는 HW 라만, (c)는 FP/HW통합 라만의 사후확률 산포도이다. FP/HW 통합 라만 분광법의 진단 정확도는 97.3% (97.0%(196/202)의 민감도 및 97.4%(717/736)의 특이도)로서, FP 라만 분광법 (90.9%의 정확도; 93.6%(189/202)의 민감도, 및 90.2%(664/736)의 특이도) 이나 HW라만 분광법(85.5%의 정확도; 78.2%(158/202)의 민감도, 및 87.5%(644/736)의 특이도)을 단독으로 사용하는 경우에 비해 진단 정확도가 높았다. 도 15에 도시한 바와 같이, FP 라만 기법, HW 라만 기법, 및 FP/HW 통합 라만 기법의 각각에 대한 ROC 곡선이 생성되었고, ROC 곡선 아래의 통합 면적은 각각 0.972, 0.928 및 0.995이다. 상기 결과는 FP/H 통합 는 동시측정 라만 기법이 FP 단독 라만 기법이나 HW 단독 라만 기법에 비해 생체 내 ESCC 검출에 대해 더욱 훌륭한 진단 성능을 제공함을 입증한다.
이러한 유망한 진단 결과에 기초하여, FP/HW 동시측정 라만 분광기 및 개발된 진단 알고리즘을, 독립적인 테스트 데이터 세트(전체 데이터 세트의 20%)를 대상으로 한 예측 진단에 적용했다. FP/HW 통합 라만 분광법은 93.2%의 예측 정확도 (민감도 92.7%(102/110) 및 특이도 93.6%(116/124))를 보였다. 생체 내 ESCC진단에 대하여, FP/HW 통합 라만 분광 분석이, FP 단독 분광 분석 (예측 정확도 91.0%, 민감도 90.9%(100/110) 및 특이도 91.9%(113/124)) 또는 HW 단독 분광 분석(예측 정확도 80.3%, 민감도 76.4%(84/110) 및 특이도 -83.9%(104/124))에 비해 예측정확도가 높다는 것이 입증되었다.
또 다른 실시예에서는 다른 유형의 암 식별을 고려하였다. 예를 들면, 도2에 도시한 시스템 200을 이용하여 자궁 경부암 또는 다른 유형의 비정상 종양(abnormal growths)을 식별하였다.
FP 및 HW 스펙트럼 영역으로부터 보완적인 스펙트럼 구간 들을 선택하기 위해, 변수/특징 선택 기술을 광대역 라만 내시경 기술에 도입하였다. 변수/특징 선택 기법의 이점은 다음과 같다:
1. 예측 성능 향상;
2. 모델의 복잡성 감소; 및
3. 변수/특징의 중요성과 같은, 기본 분광 공정에 대한 통찰력 획득.
일 실시예에서, 구간 PLS-DA 알고리즘이 사용된다. 그러나, PCA-LDA, SVM, LR 등과 같은 임의의 클러스터링 알고리즘에 적용될, 보완적인 스펙트럼 영역을 선택하기 위해, 원칙적으로 여러 가지 특징/변수 선택 기법 또는 방법을 사용할 수 있다. 특징/변수 선택 기법에는 유전자 알고리즘(GA), 군집 지능(swarm intelligence), 선택비 등이 있다. 다시 말해, 본 출원의 명세서에서 사용되는 구간 PLS-DA는 라만 스펙트럼에서 최적의 구간 조합을 순차적으로 탐색한다. 따라서 구간 PLS-DA는 개별 PLS 모델들을 생성하고, 각 PLS 모델은 변수의 부분집합(subset) 또는 창(window)만을 사용한다. 주어진 스펙트럼 데이터 세트에 200 개의 구간이 있는 경우, 200 개의 PLS-DA 모델이 계산된다(즉, 각 구간 마다 하나씩의 PLS-DA 모델의 계산이 수행 된다).
모델 각각에 대해, 가장 높은 정확도를 제공하는 환자별 교차 유효성 검증(leave-one-patient out cross validation)를 수행하여, 상기 구간을 선택한다. 이것이 최적의 단일 구간 모델이다. 하나의 구간만이 필요한 경우, 알고리즘이 중지된다. 그러나 (정보 컨텐츠를 증가시키고 예측 성능을 개선하기 위해) 둘 이상의 구간이 필요한 경우, 추가적인 싸이클(cycles)이 수행된다. 두 번째 사이클에서 첫 번째로 선택된 구간이 모든 모델에서 사용되지만, 새로운 세트의 PLS 모델 들을 생성하는 경우, 다른 나머지 구간들과 한번에 하나씩 결합 된다. 이러한 방식으로, FP 및 HW 영역으로부터 보완적 진단 값의 범위가 추출된다. 반면, 예측력이 낮은 영역, 즉 중복되거나 관련성이 없는 스펙트럼 영역은 모델에서 제외 된다.
FP 및 HW 영역 이외의 다른 스펙트럼 영역(예를 들어, 2000 cm-1 내지 2800 cm-1 사이에 있는 라만 사일런스 영역(Raman silent range))이 특정 용도로 사용될 수 있다.
상기 실시예를 적용한 적용 예를 설명하기 위해, 자궁 경부 환자들의 광대역 라만 스펙트럼을 획득하였다. 비정상 자궁 경부 세포진 검출을 위해 질경 검사를 받은 18 세에서 70 세 사이의 비임신 여성 환자 44 명을 연구 대상으로 삼았다. 생체 내 조직 라만 스펙트럼 측정에 앞서 5% 아세트산 용액을 자궁 경부에 2 분간 국소적으로 도포한 후, 조직의 색조를 평가했다(자궁 경부의 백색 변색 정도는 전암(precancer)의 등급과 관련이 있다).
공초점 탐침을 조직에 부드럽게 접촉시켜, 공초점 광대역 라만 스펙트럼 및 그에 수반되는 자가형광 스펙트럼을 측정하였다. 도 16A는 356개의 정상 경부 조직과 120개의 전암성 경부 조직의 평균 원시 복합 라만 스펙트럼 및 자가형광 스펙트럼을 도시한다. 정상 및 전암성 자궁 경부 조직 스펙트럼 모두, 다음과 같은 파장 근처의 자가형광 스펙트럼의 상단에서 약한 라만 진동 밴드를 보인다:
- 구조 단백질 및 콜라겐의 글리코겐(CCH) 변형 방향족 및 (C-C) 스트레칭과 관련된 ~854 cm-1;
- 프롤린, 발린 및 글리코겐의 ν(C-C) 스트레칭과 관련된 ~937 cm-1;
- 페닐알라닌의 (C-C) 링 호흡에 관련된 ~1001 cm-1;
- 인지질 및 핵산과 관련된 ~1095 cm-1;
- 아미드 III에 관련된 ~1253 cm-1;
- 지질/단백질(콜라겐)의 CH3CH2 비틀림 모드(twisting mode)와 관련된 ~1313 cm-1;
- 단백질과 지질의 CH2 구부림 모드(bending mode)와 관련된 ~1445 cm-1;
- 단백질의 아미드 I 밴드-(C=O) 스트레칭 모드(stretching mode)와 관련된 ~1654 cm-1;
- 단백질-CH3 스트레칭과 관련된 ~2,946 cm-1; 및
- 물-(OH) 스트레칭과 관련된 ~3400 cm-1.
구간 선택 기법과 결합된 광대역 라만 기술이 자궁 경부암의 진단 정확도를 향상시킬 수 있음을 입증하기 위해, 종래의 PLS-DA를 연속 스펙트럼(도 16A)에 적용하고, 전술한 바와 같이 구간 PLS-DA를 적용하여 보완 영역을 추출하였다. 도 16B는 구간 PLS-DA 적용 이후에 선택된 스펙트럼 서브 영역(즉, 1000 내지 1020 cm-1, 1640 내지 1660 cm-1, 2890 내지 2910 cm-1 및 3290 내지 3310 cm- 1)을 도시한다.
도 17은 PLS-DA 모델 및 구간 PLS-DA 모델 모두에 대하여, 알고리즘 복잡도(즉, 잠재변수(LV)의 갯수)의 함수인, 분류 에러를 도시한다. 분류 에러의 최저값(minima)은 각각 잠재변수가 9일 때와 5일 때 얻어졌다. 전체 스펙트럼 보다는 FP 및 HW 영역의 보완적인 스펙트럼 영역을 사용하는 경우, 정확도가 크게 증가한다(분류 오차가 25%에서 15%로 감소 함). 이 예는, 빈약한 정보를 포함하는 영역을 제거하고, FP 및 HW 스펙트럼으로부터 보완적인 서브 구간을 선택함으로써, 전암(precancer)의 생체 내 검출 정확도를 현저하게 (약 10%) 향상시킬 수 있음을 보여준다. 이것은 FP 및 HW 영역이 실제로 조직 특성화를 위한 보완적인 정보를 포함하고 있음을 증명한다. 도 18A 및 도 18B의 산포도는 확률 분류 결과를 도시하고 있다. 결과적으로, 광대역 공초점 라만 내시경 기술에서 이용하는 이산 구간 들로 인하여, 임상의는 의심스러운 병변과 관련된 위험에 대한 보다 정확한 확률적 측정치를 얻을 수 있고, 따라서 물리적 생검의 지침(guidance)을 크게 개선 할 수 있다.
질병의 가족력과 같은 사전 정보를 통합적으로 사용함으로써, 확률 분류에 임계값을 부과할 수 있다는 점에 유의해야 한다(도 18A 및 도 18B). 예를 들어, 환자가 고위험군에 속하는 경우, 상기 장치는 자동적으로 전암 또는 암에 대해 보다 높은 감도를 갖는 임계값을 선택할 수 있다. 사전 확률을 계산하는 데 필요한 여러 유형의 데이터에는 나이, 민족, 성별, 음주 습관 등과 같은 유전적 정보와, 단백질적 정보, 역학적 정보, 영상화 결과 (예: CT, MRI 등), 및 증상 등이 포함 된다. 스펙트럼 측정을 제어하는 임상용 라만 내시경 소프트웨어에는 임계값 조정을 위한 옵션이 제공되어 있다.
광대역 공초점 라만 내시경을 사용하는 또 다른 임상 예에서, 위장 악성 종양의 조기 진단에 중점을 두고, 일련의 위장 질환 환자들로부터 광섬유 공초점 라만 스펙트럼을 획득하였다. 도 19A 는 상이한 조직 유형(양성: 1950개의 스펙트럼, 암: 108개의 스펙트럼(각각 병리조직검사 특성화를 통해 확인됨))을 가진 90 명의 환자들로부터 생체 내 공초점 FP 및 HW 라만 스펙트럼을 측정하였다. 단백질, DNA 및 지질의 조직 라만 피크가 다음의 파수 근처에서 관찰 되었다:
- v(C-C) 단백질과 관련된 936 cm-1;
- 페닐알라닌의 ν(C-C) 링 호흡과 관련된 1004 cm-1;
- 지질의 ν(C-C)와 관련된 1078 cm-1;
- 단백질의 아미드 III v(C-N) 및 δ(N-H)에 관련된 1265 cm-1;
- 단백질의 CH2 비틀림(twisting) 및 흔들림(wagging)과 관련된 1302 cm-1;
- 단백질과 지질의 δ(CH2) 변형과 관련된 1445 cm-1;
- 포르피린의 v(C=C)와 관련된 1618 cm-1;
- 단백질의 아미드 I v(C=O)와 관련된 1655 cm-1;
- 지질의 v(C=O)와 관련된 1745 cm-1;
- 단백질-CH3 스트레칭과 관련된 ~2946 cm-1; 및
- 물-(OH) 스트레칭과 관련된 ~3400 cm-1.
본 발명의 일 실시예를 설명하기 위해, 종래의 PLS-DA를 구간 PLS-DA뿐만 아니라 연속 스펙트럼에도 적용하였다. 도 19B는 구간 PLS-DA(즉, ~1050 내지 1120 cm-1, ~1323 내지 1490 cm-1 및 ~2850 내지 2870 cm-1) 적용 이후의, 선택된 보완 스펙트럼 영역을 도시한다.
도 20은 PLS-DA 및 구간 PLS-DA 모델 모두의 알고리즘 복잡도(즉, 잠재변수의 갯수)의 함수인 분류 오차를 도시한다. 분류 오류의 최소값(Minima)은 두 모델 모두 잠재변수가 5 개일 때 얻을 수 있었다. 전체 스펙트럼 영역이 아닌, FP 및 HW 영역 내에서 진단상에서 유의미한 보완적인 스펙트럼 영역을 선택할 경우, 도 21A 및 21B의 산포도에 도시된 바와 같이, 모델의 정확도가 더욱 높아진다 (분류 오차는 0.25%에서 0.18%로 감소 함) . 민감도는 72.2%에서 75.9%로 증가하고 특이도는 74.7%에서 87.9%로 증가한다. 즉, 보완 정보가 위암 진단을 정확도를 향상 시킨다는 것을 알 수 있다.
또 다른 임상 예에서 본 발명의 일 실시예를 이용하였다. 즉, 내시경 검사 중에 위장의 장상피화생(intestinal metaplasia, IM), 즉 전암성병변의 생체 내 탐지를 위해 FP 및 HW 동시측정 광섬유 라만 내시경 기술을 이용하였다. 이 임상 예에서, 라만 분광 시스템(200)은 근적외선(NIR) 다이오드 레이저(l ex =785 nm, 최대 출력: 300 mW, 제조사:B & W TEK Inc.)와, 금 코팅 830 gr/mm 격자를 구비한 고효율 반사 이미징 분광기(제품명: Acton LS-785 f/2, 제조사:Princeton Instruments Inc.)와, 열전 냉각 근적외선 최적화 CCD 카메라(제품명: PIXIS : 400BR-eXcelon, 제조사: Princeton Instruments Inc. )를 포함한다. 상기 라만 분광 시스템(200)은 약 ~9 cm-1의 분해능으로 400 내지 3600 cm-1의 스펙트럼 범위에서 생체 내 조직 라만 스펙트럼을 측정한다. 1.8 mm의 외경을 갖는 1.9 m 길이의 광섬유 라만 탐침 (108)을 이용하여 조직에 레이저 광을 방사하고 및 생체 내 상피 조직의 라만 신호를 수집하였다. 내시경 검사를 위해 설계된 라만 내시경 탐침(108) 은, 중심 광전송 섬유 (직경 200 m, NA=0.22)를 둘러싸고 있는 18 x 200 mm의 크기를 갖는 경사 집광 섬유 (NA=0.22)를 포함하여 구성된다. 위장 조직 표면에 여기 광을 집속시키기 위해, 1.0 mm 사파이어 볼 렌즈 (NA=1.78)를 탐침의 팁(tip)에 연결하였다. 이러한 구성을 통해 상피 내층으로부터 효과적으로 라만 스펙트럼을 수집할 수 있다. 상기 광섬유 라만 분광 시스템 200의 깊이 선택성은 현미경 검사 체적(<0.02 mm2)을 갖는 얕은 조직 조사(깊이 < 200 μm)를 보장함으로써, 깊은 기저 조직의 간섭 및 신호 희석을 줄이면서, 종양의 발현 및 진행과 관련된 상피를 선택적으로 또는 우선적으로 조사할 수 있도록 한다. 수은-아르곤 스펙트럼 교정 램프(제품명: HG-1 및 AR-1, 제조사: Ocean Optics, Inc., 소재재: Dunedin, FL)의 원자 방출선을 파장 교정에 사용했다. 상기 광섬유 라만 분광 시스템의 파장 의존성 때문에, 상기 모든 파장 교정 스펙트럼을 텅스텐 교정 램프(제품명: RS-10, 제조사: EG & G Gamma Scientific, 소재지: San Diego, CA)를 사용하여 교정했다. 전체 FP/HW 광섬유 라만 내시경 시스템(200)은 풋 페달(foot pedal) 및 피드백(예를 들어 청각 및/또는 시각 확률 피드백)을 실시간으로 위장 전문의에게 제공하도록 구성된 직관적인 소프트웨어 프레임워크를 사용하여 제어할 수 있다.
획득된 원시 스펙트럼에 대해 3 차 Savitzky-Golay 평활화 필터(3 픽셀의 창 너비를 가짐)를 이용한 전처리를 수행하여, 스펙트럼의 노이즈를 제거하였다. FP 영역(800 내지 1800 cm- 1)에서는, 5차 다항식이 노이즈 평활화 스펙트럼의 자가형광배경을 조정하는데 가장 적합한 것으로 밝혀졌다. 이 다항식은 이후에 측정된 FP 스펙트럼에서 감산 되어, 조직의 FP 라만 스펙트럼만 남게 된다. HW 범위(2800 내지 3600 cm- 1)에 대해서는, 자가형광배경을 제거하기 위해 1 차 다항식 조정(first-order polynomial fitting)을 수행하였다. 상기 FP/HW 라만 스펙트럼의 FP 및 HW 통합 영역에 대해 정규화 처리가 수행되었고, 그 결과로 정상 조직과 장상피화생(IM) 위장 조직 사이의 스펙트럼 모양 및 상대적인 라만 밴드 강도를 더 잘 비교할 수 있었다. 모든 원시 스펙트럼 데이터는 Matlab 환경 (매사츄세츠 나티크에 소재한 Mathworks Inc.에 의해 제공됨) 에서 개발된 소프트웨어를 이용하여 온라인으로 처리되었다. 정상 위 조직과 장상피화생 위 조직 사이의 구분을 위한 강력한 진단 알고리즘을 개발하기 위해 주성분 분석(PCA)과 선형 판별 분석(LDA)을 이용하였다. 1 개 조직 부위별 교차 검증 (leave-one tissue site-out cross-validation) 을 사용하여 개발된 진단 모델을 평가하였다. 각 조직 부위에서 1 초 이내에 여러 개의 라만 스펙트럼(10 내지 15 개)을 측정하였으며, 과반수 투표 전략을 최종 분류를 위해 적용했다. 진단 결과는 컴퓨터 화면과 같은 표시장치에 실시간으로 표시 되었다. 모든 조직을 대상으로, 바른 분류와 잘못된 분류를 판단하기 위해, 임계값을 연속적으로 변경하여 수신자 조작 특성(Receiver Operating Characteristics, ROC) 곡선을 생성하였다. 모든 스펙트럼의 전처리 및 다변량 통계 분석은 Matlab 프로그래밍 환경에서 작성된 스크립트를 사용하여 온라인으로 수행되었다.
총 115개의 부위 (병리조직 검사로 확인된 바, 정상적인 조직 부위 88개, 장상피화생 조직부위는 27 개)로부터 총 1412개의 생체 내 라만 스펙트럼 (정상조직 1088개 스펙트럼, 장상피화생 조직 329개 스펙트럼)을 성공적으로 획득하였다.
도 22A는 측정된 라만 스펙트럼(정상 및 장상피화생)의 평균 생체 내 라만 스펙트럼과 ±1 표준 편차(옅은 회색 음영 영역)를 도시한다. 임의의 분자 배치 상태에서, FP영역 내에서 현저한 라만 피크가 다음과 같이 관찰 되었다:
- v(C-C) 단백질과 관련된 875 cm-1;
- 페닐알라닌의 ν(C-C) 링 호흡과 관련된 1004 cm-1;
- 지질의 ν(C-C)와 관련된 1078 cm-1;
- 지질의CH2 비틀림과 흔들림과 관련된 1302 cm-1;
- 단백질과 지질의 δ(CH2) 변형과 관련이 있는1445 cm-1; 및
- 단백질의 아미드 I v(C=O)와 관련된 1655 cm-1.
또한, HW 영역에서 강한 라만 피크는 다음과 같이 관찰 된다:
- 지질의 대칭 및 비대칭 CH2 스트레칭과 관련된 2885 cm-1;
- 단백질의 CH3 스트레칭과 관련된 2940 cm-1;
- 아미드A(단백질의 NH 스트레칭)와 관련된 3300 cm-1; 및
- 조직의 세포 내 및 세포 외 공간의 OH 결합의 상호 작용 및 국부적인 형태와 관련된, 물(~3400 cm-1에 정점이 있는 OH 스트레칭 진동)의 광대한 라만 밴드.
도 22B는 장상피화생(IM) 전환과 관련된 특유의 스펙트럼 특성(예: 피크 강도, 변이, 및 밴드 확장)을 분석하기 위한 차이 스펙트럼(즉, IM - 정상) 과 ±1 표준편차(밝은 회색 음영)을 도시하며, 내시경 검사 중 장상피화생의 조기진단에 대한 FP/HW 라만 분광법의 잠재력을 보여준다.
도 23A 및 도 23B는 라만 내시경이 적용된 조직 부위의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 슬라이드를 도시하며, 여기서 (a)는 정상 위 점막(x200 배율)을 도시하고 (b)는 광범위한 장상피화생 조직 (즉 배상 세포(x100 배율)를 포함하고 있는 위 상피 세포를 도시한다. 병리조직적 특성화를 통해 위 조직 내의 정상 및 장상피화생 병변의 세포적 및 형태학적 특징을 밝힐 수 있고, FP/HW 동시측정 라만 내시경 검사를 통해 분자 수준에서 상피 조직의 특정 생화학적 성분(예, 단백질, 지질 및 물)을 밝힐 수 있다.
정교한 다변량 진단 알고리즘을 개발하였고, 3 가지 상이한 라만 기법(즉, FP, HW, FP/HW 통합) 간의 조직 진단 성능을 비교하기 위해, PCA-LDA와 Student's t-test를 수행하였다. 이것은, 상이한 조직 유형의 스펙트럼에서 관찰된 명백한 차이점을 평가하기 위해 획득된 생체 내 조직 라만 스펙트럼을 대상으로 수행되었다. 도 24에 도시된 바와 같이, 진단적으로 중요한 성분(PC)(p <0.01)를 기반으로 하여, 1조직 부위별 교차 검증 PCA-LDA 진단 알고리즘 (leave-one tissue site-out, cross-validated PCA-LDA diagnostic algorithms)이 개발되었다. 라만 스펙트럼 변화에 있어서, 제1 주성분(PC1)은 전체 변량의 45.6%, 제2 주성분(PC2)은 33.6%, 제3 주성분(PC3)은 4.2%, 제4 주성분(PC4)은 3.1%, 그리고 제5 주성분(PC5)은 1.2%를 차지한다. 상이한 유의미한 주성분들(PCs)의 특징은 분명하다. 특히, 도 24의 피크, 골짜기 및 스펙트럼 모양과 같은 일부 주성분(PC)의 특징은 조직 라만 스펙트럼 패턴의 그것들과 유사하다. 제1 주성분(PC1)은 스펙트럼 데이터 세트 내에서 가장 큰 변화(즉, 45.6%)를 보이며, 뒤따르는 나머지 주성분들(PCs)은 순서대로 더 작은 변화를 보인다. 5 개의 진단적으로 중요한 모든 주성분들(PCs)은, 위장 조직 진단 및 분류를 위한 1조직 교차검증(leave-one tissue-out cross-validation) 및 LDA 모델에 적용된다.
도 25A, 25B, 및 25C는 각각 FP라만 기법, HW 라만 기법 및 FP/HW 통합 라만 기법에 대하여 계산된, PCA-LDA 알고리즘 모델링에 의한, 정상 조직 및 장상피화생 병리조직 사이의 교차 검증 분류 결과(사후 확률)를 도시 한다. 사후 확률 분포도에 적용된 임계선(0.5)은 FP, HW 및 FP/HW 통합 라만 분광 기법 각각에 대해, 89.6%(103/115), 78.3%(90/115) 및 91.3%(105/115)의 진단정확도를 나타낸다. 여기서 민감도는 각각 96.3%(26/27), 77.8%(21/27), 및 92.6%(25/27)이고 특이도는 각각 87.5%(77/88), 78.4%(69/88), 및 90.9%(80/88) 이다. 이 결과는 FP/HW 통합 라만 분광법이 FP 단독 라만 분광법 또는 HW 단독 라만 분광법에 비해 위장의 장상피화생(IM) 진단 능력이 뛰어남을 입증한다.
도 26은 FP, HW 및 FP/HW 통합 라만 기법 각각에 대해 생성된 ROC 곡선을 보여 도시하며, 이것은 위장 상피화생(IM) 식별에 있어서, 진단 민감도와 특이도 간의 관계를 보여 준다. ROC 아래 면적(AUC)은 FP, HW 및 FP/HW 통합 라만 기법에 대해 각각 0.94, 0.79 및 0.96이며, 이것은 FP/HW 통합 라만 기법이, 생체 내 장상피화생(IM) 탐지에서, 최상의 진단 성능을 제공한다는 것을 재확인해준다. 전반적으로 위의 결과는 내시경 검사 중에 위장 내 전암성 병변의 조기 진단 능력을 향상시키기 위해 개발된 FP/HW 동시측정 라만 분광 기술의 잠재력이 크다는 것을 입증한다.
도 27은 구강으로부터 FP 범위에서만 측정한 라만 스펙트럼의 또 예를 도시한다. 구강 내의 상이한 조직 부위(예를 들어, 볼 및 저작기관의 점막) 사이에 현저한 해부학적 변이가 있음을 유의해야 한다. 이 실시예에서, 956 cm-1의 하이드록시 아파타이트(hydroxyapatite) 및 1302 cm-1 및 1445 cm-1의 지질과 같은, 신체 해부학적 변이가 큰 영역은 간격 선택법을 사용하여 배제하였다. 변이가 큰 스펙트럼 영역을 배제함으로써, 진단 알고리즘에 대한 해부학적 변이의 영향을 줄이기 위해, 변수/특징 선택 기법을 이용할 수 있다. 이것은 중요한 기법이며, 피부, 구강 등 다른 기관에도 적용될 것이다.
도 28은 구별 가능한 스펙트럼 서브-영역을 기반으로 확률론적 진단 모델이 구현 된 후, 상기 예측법을 실시간으로 추가되는 새로운 스펙트럼에 적용하는 방법을 보여준다. 여기에는 섬유 배경 감산 교정, 스펙트럼 구간 절단, 전처리, 질병 분류를 위한 예측자 적용 등의 여러 단계가 포함된다.
이 실시예는 선행 기술에 비해 다음과 같은 몇 가지 주요 이점을 갖는다. 첫째, 진단을 위해 전체 광대역 스펙트럼을 사용하는 대신에, 이 기술 또는 방법은 진단 모델을 크게 단순화하는 보완 정보의 부분집합 (예를 들어 5 내지 20%)만을 사용한다. 둘째, 변수 선택은 질병의 생화학 및 생체분자적 특성에 대한 질적인 통찰력을 제공한다. 셋째, 전체 스펙트럼 범위를 기반으로 하는 스펙트럼 분석에 비해 정확성이 크게 향상된다. 또한, 특정 스펙트럼 범위에 간섭 또는 교란 인자(예: 혈액) 등이 포함되어 있으면, 이러한 효과가 감소 된다.
예를 들어, 식도 역류를 의심할 수 있는 증상을 내시경으로 검사 받는 환자는 다음과 같은 검사를 거치게 된다:
- 종래의 WLR/NBI/AFI 내시경 영상 검사를, 전암 (즉, 이형성증)이 의심되는, 큰 바렛(Barrett's segment)의 출현을 보이고 있는 원위부 식도에 대해 수행한다;
- 다음으로 광대역 공초점 라만 내시경술을, 의심스러운 조직 부위의 객관적인 표적 생검에 적용한다;
- 공초점 라만 분류는 "정상"(병리 또는 위염을 갖고 있지 않음), "저 위험"(장상피화생(IM)) 및 "고위험"(이형성증/암)으로 정의 된다;
- 공초점 라만 탐침은 원위부 식도의 조직을 마주보도록 배치되며, FP 및 HW 영역에서 추출된 보완 정보를 기반으로 한 실시간 진단을 수행한다;
- 공초점 라만 내시경술을, 이후에 수행될 생검의 대상인 고위험 조직 부위를 표적으로 하여 진행한다.
본 발명에 따른 실시예는, 실시간 FP 및 HW 동시측정 광섬유 공초점 라만 분광법이 환자의 생체 내 검사 중에 수행될 수 있음을 보여 준다. 광섬유 공초점 라만 분광법은, 대장암 발암 과정에서 상피 세포에 발생되는 단백질, DNA, 지질 및 물과 같은 생체분자적 및 생화학적 변화를 찾아 낸다. FP 및 HW 범위의 보완적 생체분자 정보를 사용하면, FP 또는 HW 범위를 단독으로 사용하는 것과 비교하여, 비정상 종양(abnormal growths)의 검출 정확도를 높일 수 있다. FP 및 HW 광섬유 공초점 라만 분광 기술은 전암(precancer) 및 암(cancer)의 탐지 및 특성화 능력을 향상시킬 수 있는 가능성이 크다. 전체 스펙트럼의 부분 집합을 사용하면, 신체의 여러 부위의 비정상 종양(abnormal growths)의 처리 및 식별의 측면에서 이점이 크다. FP 및 HW 범위를 조합하여 이용함으로써, 여기서 논의된 탐지 유형에 대해 좋은 결과를 산출하는 것으로 확인되었다. 다른 유형의 탐지에 대해서는, 다른 범위를 사용하는 것이 유용할 것이다.
본 발명에 따른 실시예는 생체 의학 라만 분광법에 한정되지 않고, 다른 분야에서도 응용할 수 있다. 예를 들어, 응용 분야의 예는 형광 분광, 탄성 산란 분광, 표면 증강 라만 분광, 공정 분석 기술, 물 및 환경 감시, 제약 공정/약품 배포 제어, 식품 산업, 품질 관리 산업, 법의학 등을 포함한다. 이 실시 예들에서, 광원으로부터 방사된 여기 에너지는 타겟 샘플(예를 들어, 화학 물질, 물, 또는 환경 물질/물질 샘플, 약제/약품 또는 식품 샘플, 또는 다른 유형의 샘플)를 향해 조사될 수 있으며, 상기 샘플이 조직이어야 할 필요는 없다. 또한, 이러한 실시예에서는 내시경 또는 내시경 검사를 필요로 하지 않을 수 있다. 본 출원에서 용어 “라만”은 위에 언급한 것들을 포함하고 또한 다른 유형의 분광학을 포함 한다.
본 발명에 따른 구체 예는 폐, 상부 및 하부 위장관(예를 들어, 식도, 위장, 대장), 간, 방광, 두부 및 경부(즉, 비인두, 후두, 구강), 자궁 경부, 피부, 뼈, 또는 종래의 내시경, 복강경, 또는 관절경이 사용될 수 있는 곳 등, 임의의 기관에 대한 진단 플랫폼으로서 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 특정 실시예를 사용하여 얻어진 조직 라만 스펙트럼의 일부는 내시경 광 간섭 문제가 있을 수 있다. 이러한 간섭은 비정상 종양(abnormal growths) 에 대한 진단을 어렵게 할 수 있다. 따라서, 이러한 간섭을 제거하는 해결책을 제시하기 위해 또 다른 실시예가 제공된다.
전술 한 공초점 라만 섬유 탐침을 안내하는데 사용되는 본 발명의 실시예에 따른 삼각 내시경 영상 시스템(trimodal endoscope imaging system)은 300W 쇼트-아크 크세논 광원 (short-arc xenon light source), 위장(GI) 내시경, 및 비디오 신호 처리부를 포함한다. 크세논 광원은 복수의 필터 세트와 결합되어, 삼각 내시경 영상 (triodal endoscopic imaging)을 얻기 위한, 복수의 상이한 광(도시되지 않음)을 제공한다. 필터는 예를 들어 WLR(적색 필터 585 내지 655 nm, 녹색 필터 500 내지 575 nm, 청색 필터 390 내지 495 nm)필터, AFI(청색 필터 390 내지 470 nm, 반사 영상 정규화용 녹색 필터 540 내지 560 nm) 필터 및 NBI(녹색 필터 530 내지 550 nm, 청색 필터 390 내지 445 nm) 필터를 포함한다.
조직에서 반사 된 반사광 또는 조직에서 방출 된 형광은 위장 내시경 (미도시)의 원위 팁에 장착 된 두 개의 고체촬상소자(CCD)에 의하여 감지 된다. 두개의 고체촬상소자(CCD)는 WLR/NBI 용 고체촬상소자(CCD)와 AFI 관찰용 고감도 고체촬상소자(CCD)이다. 내시경 쇼트-아크 크세논 램프는 700 nm이상의 근적외선 스펙트럼 범위에 있는 현저한 불연속 피크를 갖는 UV/VIS/NIR을 커버하는 광대역 연속 광을 방출 한다. 785 nm 레이저 여기 스토크스 라만 분광법(Stokes Raman spectroscopy)은 또한 NIR 범위에 해당되므로, 크세논 환경광은 조직의 라만 신호를 간섭하여 생체 내 조직 측정 및 진단을 방해한다. 이러한 이유로, 라만 내시경 진단은 일반적으로 크세논 조명이 꺼지거나 희미 해진 상태에서 수행되는데, 이것은 임상 진단 설정에서 바람직하지 않다.
크세논 환경광 의 간섭을 제거하기 위해, 실시예에서는, 내시경 시스템 내에서, 크세논 광원 앞에 핫 미러 저역 통과 필터(700 nm까지는 차단, 가시광 영역은 평균적으로 약 95%까지 투과)를 설치하는 것을 제안한다. 이러한 구성으로 인하여 환경광의 간섭을 제거 할 수 있다.
이 실시예의 적용을 입증하기 위하여, 상이한 내시경 조명 조건 하에서 생체 내 라만 스펙트럼을 측정하였다. 도 29A는 핫 미러 필터를 구비하지 않은 채로 수행된 내시경 검사 중에 얻어진 비접촉 조직 라만 스펙트럼을 도시한다. 크세논 광 간섭이 조직 라만 신호를 완전히 압도 한다. 도 29B는 크세논 램프 앞에 핫 미러 저역 통과 필터를 설치한 후, 비접촉 모드에서 측정한 조직 라만 스펙트럼을 도시한다. 도시된 바와 같이, 크세논 간섭이 실질적으로 제거되었다. 임의의 분자 배치 상태에서, 고분해능 조직 라만 피크가 다음과 같이 관찰 되었다:
- v(C-C) 단백질과 관련된 853 cm-1;
- 페닐알리닌의 vs(C-C) ring 호흡과 관련된 1004 cm-1;
- 지질의 v(C-C)와 관련된 1078 cm-1;
- 단백질의 아미드 III v(C-N) 및 d(N-H)과 관련된 1265 cm-1;
- 1302 cm-1(단백질의 CH3CH2 비틀림 및 흔들기와 관련이 있음),
- 단백질 및 지질의 d(CH2) 변형과 관련된 1445 cm-1;
- 단백질의 아미드 I v(C=O)와 관련된 1655 cm-1; 및
- 지질의 v(C=O)와 관련된 1745 cm-1.
라만 스펙트럼은 탐침을 조직과 접촉시켜 측정하였다. 도 30A는 핫 미러 필터 없이 접촉 모드로 측정된 조직 라만 스펙트럼을 도시한다. 도 30B는 크세논 램프 앞에 핫 미러 저역 통과 필터가 설치된 상태에서 접촉 모드로 측정된 조직 라만 스펙트럼을 도시한다. 이러한 결과로부터, 전반적으로 핫 미러 필터가, 공초점 라만 탐침의 비접촉 및 접촉 모드 모두에서, 생체 내 조직 라만 스펙트럼에 대한 크세논 환경광 간섭을 완전히 제거한다는 것을 알 수 있다. 더욱이, 비접촉 모드에서 탐침 헤드 내로 더 많은 빛이 입사할 수 있기 때문에, 크세논 간섭은 라만 탐침이 조직과 접촉하지 않는 비접촉 모드에서 더욱 두드러진다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이 실시예는, 기침 반사의 자극 때문에 비접촉 모드가 더 선호되는 후두/기관지와 같은 기관에 적용할 때, 또는 라만 탐침의 조직 접촉으로 인해 출혈이나 암세포의 전염 위험을 유발할 수 있는 진행 단계의 종양이 있는 환자에게 적용할 때 가치가 높다.
핫 미러 필터를 이용한 가이드용 조명광 필터링의 응용은 내시경 에 국한되지 않고, 내부 및 외부 기관 (예, 피부, 자궁 경부, 방광, 위, 식도, 비인두, 후두, 구강, 결장, 직장, 폐 등)에 대한 NIR 분광을 가이드 하는데 사용되는 임의의 광의 필터링 또는 이미징 기법에서 더욱 일반적으로 응용될 수 있다.
이 개념이 요약되어 있는 도 31 은 시스템 (2100)을 도시하고 있다. 상기 시스템(2100)은 조직(2104)과 접촉 될 탐침(2102)을 구비한다. 상기 시스템(2100)은 근적외선 레이저(2106), 분광기(2108), 및 고체촬상소자(CCD)(2110)를 구비한다. 에지 장파장 투과 필터(2112)는 상기 탐침(2102)과 상기 분광기(2108) 사이에 위치하고, 대역 통과 필터(2114)는 상기 탐침(2102)과 상기 근적외선 레이저(2106) 사이에 위치한다. 개인용컴퓨터(PC)(2116) 및 관련 소프트웨어는 시스템을 제어하는데 사용된다. 상기 조직은 광원(2118)으로부터 출사 되어 핫 미러 저역 통과 필터(2120)를 통과한 광에 의해 조사된다. 상기 시스템은, 이 실시예가 적용되는 응용분야에 따라, 시스템을 구성하는 구성요소들 및 이러한 구성요소들의 배향 및 위치가 달라진다.
기구 표준화는 임상 라만 분광학의 발전 속도보다 훨씬 뒤떨어진 것으로 알려져 있다. 조직 라만 분광법은 본질적으로 약하고 분해능이 높은 피크를 기반으로 하기 때문에, 이 기술은 기구적인 변화에 매우 민감하다. 따라서 인간 환자의 임상 측정에 앞서 라만 내시경 장비를 검사/교정/표준화하는 기술을 개발하고 사용하는 것이 필수적이다. 또한 다양한 라만 시스템간에 일관성이 유지되어야 하고 신뢰성이 높은 생체 내 진단이 보증되어야 한다.
도 32는 환자에게 적용하기 전에 라만 내시경을 시험하는 기본 원리를 도시하며, 이것은 (i) 시스템의 기동, (ii) 라만 내시경 시스템의 시험, (iii) 환자에게 라만 내시경의 적용의 단계를 포함한다. 광섬유 라만 내시경 시스템을 시험하고 교정하기 위한 새로운 장치, 기법 또는 방법이 제안되어 있다. 상기 시험 및 교정 장치는, 광학 기계 장치 및, 광섬유 라만 진단 응용 프로그램 중에서, 자동적인 시스템 시험 및 교정을 위해 라만 소프트웨어 내에 구현되어 있는 일련의 프로그램 명령 루틴을 포함한다. 상기 교정 장치는 스펙트럼 교정 방사선 광원 (예, 수은 및 아르곤 램프, NIR 스펙트럼 방사기, 레이저 광 등), 광 강도 방사선 광원, 레이저 파워 미터(laser power meter), 조직 팬텀(tissue phantom), 라만 내시경 검사 시스템의 표준화를 위한 자동화된 광학 기계 부품(즉, 스테퍼 모터) 및 제어기들을 구비한다. 상기 교정 장치는 임상 라만 내시경 플랫폼의 필수적인 구성 요소이지만, 광섬유의 일반 검사 및 교정을 위한 독립형 장치로도 사용될 수 있다. 상기 교정장치는 FW102C (미국, 뉴저지주 뉴톤에 소재한 Thorlabs Inc. 에 의해 제조)와 같이, 상이한 샘플들(2304)과 결합되어 있는, 폐쇄 형 스테퍼 모터 구동 필터 휠 (2012)를 구비한다. 도 33에 도시된 바와 같이, 상기 가요성 광섬유 라만 탐침(2306)은 상기 교정 장치에 탑재 될 수 있다.
상기 필터 휠의 회전은 레이저 여기 및 임상 라만 소프트웨어에서의 신호 획득과 동기화되어 있다. 스펙트럼은 필터 휠에 수용된 각 샘플로부터 수집되어 저장된다. 교정/시험 루틴에서 수행되는 단계는 고체촬상소자(CCD)의 특성(즉, 온도 및 암전류), 레이저 여기 출력, 용융 실리카 섬유 배경, 시스템 응답 교정/시험용 형광 물질, 파장 교정/시험용 재료, 및 조직 팬텀의 측정 단계를 포함한다. 측정 된 신호는 라만 내시경 시스템의 파라미터(예를 들어, 강도 응답, 파장 정확도, 배경 잡음 등)를 재교정하는데 사용될 수 있다.
상기 교정 장치의 필터 휠에 통합되어 있는 루틴들 및 표준 샘플들을, 획득된 신호의 예와 함께 기술한다. 도 34는 라만 내시경을 환자에게 사용하기 전에, 교정장치를 이용하여 시험하는 절차 (2400)를 도시 한다. 신호 분석(즉, 고장 탐지 또는 교정)은 (특정예에서 보여준 바와 같이) 개별적 측정 또는 모든 측정이 완료된 후에 수행 될 수 있다.
제 1 경우에, 상기 고체촬상소자(CCD)의 검출 신호가 측정되고 온도가 기록된다(2402). 이 단계는 레이저 여기가 없을 때의 신호 강도의 다중 스펙트럼(즉, 0 내지 1 초의 노출 시간)을 측정하는 단계를 포함 할 수 있다. 다음으로, 상기 시스템은, 암전류가 상기 공장 구성 파일(factory configuration file)에 미리 저장된 최대 값보다 작은지를 확인한다. 이 실시예에서는, 일련의 스펙트럼에 대해, 암전류 변동 계수가 상기 구성 파일(configuration file)에 저장되어 있는 최대 값보다 작은지를 확인하는 단계가 더 포함된다.
광섬유 라만 탐침의 팁(tip)에서의 출력되는 레이저 여기 출력을 통합 레이저 파워 미터를 사용하여 측정하고(2402), 측정된 레이저 여기 출력이 미국 국립 표준 협회(ANSI)에서 정한 최대 허용 피부 노출 제한치 (785 nm레이저 빔으로 설정됨) 보다 낮은 범위 내에 있는지 확인한다. 이 실시예는 레이저 출력이 상기 구성 파일(factory configuration file)에 사전에 저장된 최대 값보다 작은지를 확인하는 단계를 포함한다.
용융 실리카 섬유 탐침의 배경 신호를 측정하기 위해 (2402), 상기 필터 휠은 어두운 환경을 가진 빈 슬롯을 구비하고 있다. 광섬유 탐침 배경의 다중 스펙트럼을, 레이저 여기 상태에서 노광시간을 변화시키면서 (예컨대, 0.1 초 내지 1.0초) 측정한다. 이 스펙트럼은 광섬유 탐침의 상태에 대한 정보를 갖고 있다. 예를 들어 섬유가 손상되거나 탐침의 팁이 오염되면, 이것은 라만이나 형광 강도의 증가의 형태로 반영 된다.
광대역 라만 내시경 탐침의 배경 신호의 예로서, 두 개의 상이한 광섬유 탐침의 배경 신호가 도 35에 도시되어있다. 이 실시예는 일련의 스펙트럼에 대해, 변동 계수가 상기 구성 파일(configuration file)에 미리 저장되어 있는 최대 값 보다 작다는 것을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 측정된 광섬유 탐침 배경은, 실시간 처리 수행 중에, 생체 내 조직 라만 스펙트럼에 대한 처리(즉, 감산 처리)에 이용하기 위해 메모리에 저장된다.
라만 내시경 시스템의 응답 및 수집 효율을 시험 및/또는 교정하기 위해, 광범위하고 안정된 형광 스펙트럼(예를 들어, 크롬 도핑된 붕소규산(borosilicate) 유리, 녹색 유리, kopp2412 등)을 나타내는 형광 유리의 스펙트럼을 측정하고 저장한다(2406). 표준 형광 유리는 미국 국립 표준 기술 연구소(NIST)에서 표준램프로 지정한 텅스텐 램프를 사용하여 도 36에 설명된 절차에 따라 미리 공장에서 교정 된다. 상기 측정된 시스템의 응답성은 상기 구성 파일(configuration file)에 사전에 저장되어 있는 응답성과 비교될 수 있다. 이 실시예는 일련의 스펙트럼에 대한 변동 계수가 상기 구성 파일(configuration file)에 미리 저장된 최대 값보다 작은지를 확인하는 단계를 더 포함한다. 응답 표준 샘플의 스펙트럼을 사용하여 시스템을 공장 교정 상태로 재조정 할 수 있다. 도 37은 2 개의 상이한 광섬유 탐침을 사용하여, 형광 표준 유리(즉, kopp2412)를 교정하는 기능의 예를 도시한다.
또렷하고 좁은 라만 피크를 갖는 물질도 측정된다(2408). 그 일예가 도 38에 도시된 폴리스티렌이다. 표준 파장은 광학 오정렬로 인한 파장 축의 변동 (drift in the wavelength axis)이 있는지 평가하기 위해 사용된다. 상기 스펙트럼은 (예를 들어, 상관 계수 또는 피크 식별을 이용하여) 상기 구성 파일(configuration file)에 미리 저장된 스펙트럼과 비교된다. 이러한 비교는 분해능 테스트(즉, 반측폭 (full width of half maximum (FWHM)) 및 피크 위치 확인을 포함한다. 또렷하고 좁은 라만 피크를 갖는 재료의 스펙트럼을 사용하여, 상기 시스템을 상기 구성 파일(configuration file)에 저장된 공장 정렬 상태로 재정렬 할 수 있다. 재교정은, 공장에서 교정 된 파장 축에 대해 미리 정의 해 둔 피크와 오정렬 된 스펙트럼의 대응하는 피크 사이의 다항식 맵핑(예를 들어, 3 내지 5 차수) 과정을 포함한다. 재교정 이후의 피크의 다항식 매핑을 보여주는 예가 도 39에 도시되어 있다.
상기 필터 휠에는 층상의 조직 팬텀이 구비되어 있다. 상기 조직 팬텀은, 잘 알려진 측정 라만 피크를 나타내는 확산 성질 및/또는 층상 조직 팬텀을 갖는 물질로 구성된다(2410). 이 실시예는 일련의 스펙트럼에 대한 변동 계수가 상기 구성 파일(configuration file)에 미리 저장된 최대 값 보다 작다는 것을 확인하는 단계를 포함한다. 도 40A 및 도 40B의 예에서는, 상이한 라만 탐침을 사용하여 폴리스티렌과 폴리에틸렌의 2 층 팬텀 샌드위치로부터 얻은, 라만 스펙트럼을 비교하여 도시한다. 상기 층상 조직 팬텀의 라만 스펙트럼은 스펙트럼 품질뿐만 아니라 광섬유 라만 탐침의 깊이 선택성를 검증하는 데 사용된다. 상층 대 하층의 신호비(즉, 각각 1002 cm-1 및 1296 cm- 1)는 주어진 광섬유 공초점 탐침의 깊이 선택성의 질적 및 양적 지시자로서 사용된다. 이 실시예는 깊이 선택성이 상기 구성 파일(configuration file)에 이미 저장된 최대 값보다 작은지를 확인하는 단계를 포함한다.
다양한 측정을 수행한 후에, 신호의 분석이 수행된다(2412). 이는 고장 탐지, 교정 문제 등과 같은 문제점을 찾아내기 위한 것이다. 문제점이 탐지되면, 상기 시스템은 통과하지 못하는 것으로 정의된다(2414). 한편 문제가 발생하지 않으면 시스템이 통과된 것으로 정의된다(2416).
또 다른 실시예는, 라만 내시경 진단이 수행될 때, 사용자의 선택/입력에 응답하여 스펙트럼 및 병변 별로 라만 데이터를 표시 및 저장 할 수 있는 GUI와 통합되거나 GUI로서 통합되는, 프로그램 명령 세트 또는 소프트웨어 프레임워크를 포함한다. 예를 들어, 제1 선택이 수행되거나 제1 버튼이 눌러지면, 제1 병변으로 부터 측정된 라만 데이터가 저장된다. 제 2 선택이 수행되거나 제2 버튼이 눌러지면, 제 2 병변으로부터 측정된 라만 데이터가 저장된다. 이러한 시스템은 환자 정보, 노출 시간, 레이저 여기 출력, 시간, 날짜, 진단, 탐침 배경 신호, 시스템 교정 기능, 내시경 비디오, 및 측정 세부 정보가 포함된 로그 파일(logging file)을 저장하는 저장 단계를 포함한다. 임상의가 데이터를 인터페이싱하고 저장하기 위해 사용하는 통합형 풋 페달 장치(integrated foot pedal device)가 제공될 수 있다. 풋 스위치를 1회 누르면, 획득된 데이터가 제1 병변으로 저장된다. 풋 스위치를 1회 누르면, 상기 데이터가 제2 병변으로 저장된다. 풋 스위치에는 레이저를 시동하거나 끌 수 있는 안전 페달이 구비될 수 있다.
또 다른 실시예는 기록된 광시야(wide-field) 비디오 영상과 함께 임상 라만 진단을 표시하기 위한 프로그램 명령 세트 또는 소프트웨어 프레임워크를 포함한다. 내시경 비디오 이미징(즉, WLR/NBI/AFI) 및 비디오 레코딩 기능은 라만 내시경 소프트웨어에 통합되어 있다. 상기 광시야 내시경 비디오 및 영상 처리 된 조직의 생체 내 진단 결과는 컴퓨터 화면과 같은 표시 장치에 표시될 수 있다. 내시경 비디오는 측정된 조직 라만 스펙트럼과 동기화된다. 따라서 라만 스펙트럼 진단 결과는 비디오 재생과 동시에 표시될 수 있다. 따라서 임상의는 각 환자에 대해 라만 내시경 진단과 샘플링된 의심스러운 조직 부위 간의 정확한 상관 관계를 추적할 수 있다. 이 영상기술 및 라만 내시경 소프트웨어의 결합은 임상 시스템에 있어서 실질적인 개선이며, 과거 임상 데이터를 검토할 수 있도록 해준다.
생체 내 조직들의 자가형광의 정도가 다르기 때문에, 라만 내시경 응용분야에 있어서, 고체촬상소자(CCD)의 제한된 동적 범위와 조직의 약한 라만 신호는 여전히 문제점으로 남아 있다. 일부 조직(즉, 위, 폐, 등, 혀, 간)의 경우, 자가형광도가 높아, 0.1 초 또는 0.05 초 이내에 검출기가 포화될 수 있다. 이러한 조직의 라만 신호는 다른 조직 유형(즉, 식도, 비인두, 후두, 자궁 경부 등)에 비해 현저한 노이즈를 포함할 수 있다. 일반적으로 조직의 라만 신호 강도는 레이저 여기 출력 및 노출 시간에 따라 선형적으로 변한다. 신호대 잡음비(S / N)는 노출 시간의 제곱근에 비례한다. 현재로서는, 사용자가 라만 내시경 검사 기법을 사용하여 얻는 모든 스펙트럼에 대해 노출 시간 또는 레이저 여기 출력을 수동으로 조정하고 있다.
이러한 수동적인 조작은, 라만 분광 기술을 실시간 진단에 응용하기에는 매우 비실용적이다. 고체촬상소자(CCD)의 포화를 방지하면서 임상적으로 허용되는 시간 내에 최적의 S/N 비로 라만 스펙트럼을 얻기 위해서는 자동화된 방법을 정의하는 것이 중요하다. 라만 내시경 검사 기술이 임상 의학에서 널리 받아 들여지기 위해서는 실시간 진단이 가능해야 한다. 임상 라만 측정 중에, 높은 S/N 비로 실시간 진단을 실현하기 위해서는 레이저 여기 출력, 노출 시간 및 스펙트럼 누적을 자동으로 조정하기 위한 새로운 방법을 모색하는 것이 매우 중요 한다. 대표적인 예로서 두 가지 자동화 기법 또는 방법이 제시된다.
도 41에 도시한 제1 기술 또는 방법에서, 노광 시간은 고정되고(예컨대 0.1 초)(3102), 레이저 여기 출력은 변수로서 필요에 따라 조정된다(3104). 라만 스펙트럼이 측정되고(3106), 신호 대 잡음비가 결정된다(3108). 스펙트럼의 소음 추정은 푸리에 변환(Fourier transform), 미분, 또는 잡음 레벨을 정량화하는 다른 방법을 기반으로 수행된다. 라만 스펙트럼의 S/N 비가 나쁘면(3110) 후속 측정에서 판독 전에 여러 개의 라만 스펙트럼(예를 들어, n = 2 ... 3)을 축적한다(3112). 만일 고체촬상소자(CCD)가 획득된 스펙트럼으로 인해 포화되면(3114), 후속 라만 측정에서, 레이저 여기 출력을 포화도에 따라 줄인다 (3116). 스펙트럼이 포화 상태가 아니면, 그 스펙트럼은 진단을 위해 사용된다(3118). 포화도는 포화 된 픽셀의 백분율 "%"로 정의된다. 강도의 카운트 (intensity counts)로 스펙트럼을 판독하는 경우 (< 70% 또는 > 90%) (3120), 후속하는 라만 측정에서, 레이저 여기 출력은 신호 강도가 동적 범위의 70 내지 90% 이내에 들도록 상향 조정 된다 (3122). 일 실시예는 레이저 여기 출력의 상한치(즉, 25 mW)를 부과한다. 다른 실시예에서는, 몇개의 스펙트럼(예를들면, 2개)을 일관되게 축적한다. 배경 감산, 전처리, 특이치 검출, 질병 예측, 및 표시 등의 단계가 모두 수행된다 (3124).
도 42에 도시되어 있는 제2 기술 또는 방법에서, 레이저 여기 출력은 고정되고(즉, 25 mW에서)(3202), 노출 시간은 변수로서 필요에 따라 조정된다( 3204). 라만 스펙트럼이 측정되고(3206), 잡음대신호비 (S/N ratio)가 결정된다(3208). 잡음 추정은 푸리에 변환, 미분, 또는 잡음 레벨을 정량화하는 다른 방법을 기반으로 수행된다. 라만 스펙트럼의 S/N비가 나쁘면(3210), 후속 측정에서, 판독 전에 여러 개의 라만 스펙트럼(예를 들어, n = 2 내지 3)(3212)을 축적한다. 축적된 스펙트럼으로 인해 고체촬상소자(CCD)가 포화되면(3214), 후속 라만 측정에서, 노출 시간은 포화 정도에 따라 감소 된다(3216). 스펙트럼이 포화 상태가 아니면, 스펙트럼은 진단을 위해 사용된다(3218). 포화도는 포화 된 픽셀의 백분율 "%"로 정의된다. 스펙트럼의 강도 카운트 수가 적으면(예: 동적 범위의 < 70% 또는 > 90%)(3220), 후속 라만 측정에서, 노출 시간은 신호 강도가 동적 범위의 70 내지 90% 이내에 들도록 상향 조정된다. 일 실시예는 노출 시간의 상한치(즉, 0,5초)를 부과한다. 또 다른 실시예에서, 노출시간이 너무 짧으면(예를 들어, 0.1초 이하), 여러 개의 스펙트럼을 계속 누적한다. 배경 차감, 전처리, 특이치 검출, 질병 예측 및 표시 등의 단계가 모두 수행 된다(3224).
도 36 및 37을 참조하여 설명된 상기 두 기능은 운영 소프트웨어에 통합되어 있다. 레이저 출력만을 조정하는 경우, 노광 시간이 짧으며 일정하게 유지되는 이점이 있다(예를 들어, 0.1 초). 상기 방법은 임상적 라만 내시경 검사에서 높은 S/N 비를 갖는 중단 없는 실시간 진단을 실현하는 데 중요한 가치가 있지만, 표면 증강 라만 내시경 검사(SERS), 반사 및 형광 분광기와 같은 다른 방식에도 보편적으로 이용될 수 있다. 신호 품질을 향상시키고, 고체촬상소자(CCD) 포화를 방지하고, 실시간 진단을 실현하는데 있어서, 노광 시간, 레이저 여기 출력 및 스펙트럼 축적의 자동 조절이라는 개념은 본 발명의 실시예의 중요한 특징 중 하나이다. 다른 실시예는, 레이저 여기와 신호 획득의 동기화 개념을 포함한다. 즉, 신호 획득 전에 레이저 여기 동작이 수행되고, 신호 획득 후에 레이저 여기 동작이 중지된다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예는 여러 개의 상이한 광섬유 탐침과 여러 인체 기관 사이의 전환(switching) 기능을 포함한다. 각 유형의 광섬유 탐침(즉, 공초점 또는 체적형 탐침)별로, 각 기관(즉, 후두, 결장, 비인두, 위, 식도, 구강, 피부, 자궁 경부, 방광 등)에 특수화된 진단 모델을 가진 데이터베이스가 존재 한다. 예를 들어, 사용자가 비인두를 검사 대상 기관으로 선택하면, 비인두에 관련 된 하나 이상의 모델이 시스템에 로딩 된다(loaded). 도 43은 대표적인 데이터베이스의 구조를 도시하고 있다. 이러한 모델들에는 다변량 진단 알고리즘(multivariate diagnostic algorithms) 및/또는 다변량 특이치 탐지 모델(multivariate outlier detection models)이 포함된다.
전술 한 다양한 실시예는 제한적인 해석을 위해 제공된 것이 아님을 이해할 수 있을 것이다. 상기 실시예 들은 조합될 수 있으며, 상세한 설명에 기재되어 개시된 특정 예들로부터의 하나 이상의 변형 예들을 도출할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 상기 프로세스는 하드웨어, 소프트웨어 또는 이들의 임의의 조합으로 구현 될 수 있다.
Claims (19)
- 광을 조직에 조사하도록 구성된 제 1 광원;
상기 조직으로부터 산란 된 산란광으로부터 지문(FP) 영역 및 고파수(HW) 영역의 라만 스펙트럼을 동시에 검출하도록 구성된 라만 분광기; 및
적어도 하나의 프로세싱 유닛과 상기 적어도 하나의 프로세싱 유닛에 의해 실행 가능한 프로그램 명령어를 저장하고 있는 메모리를 포함하는 컴퓨터 제어 및 분석 모듈;을 구비하여 구성되고,
상기 프로그램 명령어는 FP 및 HW 파장 영역에서 검출된 라만 스펙트럼의 이산 스펙트럼 서브 구간들을 분석하여, 하나 또는 두 파장 영역 내의 하나 이상의 기준 지표와의 매칭을 확인하기 위한 프로그램 명령어들인 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 1 항에있어서,
상기 라만 분광기는 단일 광대역 회절 격자(single broadband diffraction grating)를 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 2 항에 있어서,
상기 제 1 광원은 상기 조직에 인가될 여기 에너지를 발생시키는 시준광 광원을 포함하고, 상기 라만 분광 장치는 시준광을 상기 조직에 방사하고 상기 검출된 라만 스펙트럼을 상기 조직으로부터 상기 분광기로 복귀시키도록 구성된 탐침을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 3 항에 있어서,
상기 하나 이상의 기준 지표는 상기 검출된 라만 스펙트럼 내의 특정 피크를 포함하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 3 항에 있어서,
상기 컴퓨터 제어 및 분석 모듈은, 상기 적어도 하나 이상의 프로세싱 유닛에 의해 실행 가능하며, 상기 매칭에 기초하여 비정상인 종양(abnormal growth)을 진단하기 위한 프로그램 명령들을 포함하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 3 항에 있어서,
상기 탐침은 공초점 광섬유 탐침을 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 6 항에 있어서,
상기 탐침을 내부에 수용하기 위한 기구 채널을 구비한 가늘고 긴 샤프트를 갖춘 내시경을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 3 항에 있어서,
상기 컴퓨터 제어 및 분석 모듈은, 상기 적어도 하나의 프로세싱 유닛에 의해 실행 가능하며, 상기 시준광의 출력을 동적으로 조정하기 위한 프로그램 명령들을 포함하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 3 항에 있어서,
상기 컴퓨터 제어 및 분석 모듈은, 상기 적어도 하나의 프로세싱 유닛에 의해 실행 가능하며, 상기 조직이 상기 시준광에 노출되는 노출 시간을 동적으로 조정하기 위한 프로그램 명령들을 포함하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 3 항에 있어서,
적어도 하나의 교정 기준에 맞추도록, 상기 탐침 또는 상기 전체 라만 분광 장치를 표준화하는 교정 장치를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 제 3 항에 있어서,
추가 광을 조직 내부에 조사하도록 구성된 추가 광원;과
상기 제 1 광원에 의에 출사된 광과 상기 추가 광원에 의해 출사된 추가 광 사이의 광 간섭을 보상하도록 구성된 핫 미러 필터;를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 장치. - 라만 분광 장치에 의해 수행되는 라만 분광 방법에 있어서,
제1 광원에 의해 출사된 광을 조직 내부로 조사하는 단계;
탐침을 이용하여, 상기 조직에 의해 산란 된 산란광으로부터 지문(FP) 및 고파수(HW) 영역의 라만 스펙트럼을 동시에 검출하는 단계; 및
하나 또는 두 개의 파장 영역 내의, 하나 이상의 기준 지표와의 매칭을 식별하기 위해, FP 및 HW 파장 영역 모두에서 검출된 라만 스펙트럼 내의 이산 스펙트럼 서브 구간들을 분석하는 단계;를 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 FP 및 HW 영역의 라만 스펙트럼을 동시에 검출하는 단계는,
단일 광대역 회절 격자를 사용하여 FP 및 HW 파장 영역 모두에서 광을 회절 시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 매칭에 기초하여 비정상적인 종양(abnormal growth)의 성질을 진단하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 하나 이상의 기준 지표는 상기 검출된 라만 스펙트럼 내의 특정 피크인 것을 특징으로 하는 라만 분광 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 광의 출력을 동적으로 조절하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 조직이 상기 광에 노출되는 노출시간을 동적으로 조절하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 광을 상기 조직에 조사하기 전에, 상기 탐침 또는 상기 전체 라만 분광 장치를 적어도 하나의 교정 기준에 맞추어 표준화하는 교정 절차 또는 표준화 절차를 수행하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 제 1 광원에 의해 출사된 상기 광을 상기 조직 내에 조사하면서, 추가 광원을 사용하여 추가 광을 상기 조직에 조사하는 단계; 와
핫 미러 필터를 사용하여, 상기 제 1 광원에 의해 출사된 상기 광과 상기 추가 광원에 의해 출사된 상기 추가 광 사이의 광 간섭을 보상하는 단계;를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 비정상적 성장하는 표본 또는 조식의 유형 또는 특성을 분석하는 라만 분광 방법.
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