JP2018534587A - 細胞それぞれが産生するｆｔｉｒスペクトルによって細胞を同定又は分類することから成る、サンプルを分析するための方法、コンピュータプログラム、及びシステム - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、組織学的サンプル、特に癌及び前癌細胞、又は他の疾患状態を有する細胞を含み得るサンプルのスクリーニングを改善する方法に関する。
【解決手段】本方法は、対象から得られたサンプルの分析に関し、ＦＴＩＲ分光光度計を用いたサンプルのスキャンにより生じるスペクトルの出力ステップ、及び、各々が生じるスペクトルによるサンプルの細胞の同定又は分類を含む。
【選択図】なし

Description

発明は組織学サンプル、特に癌細胞、前癌細胞、又は他の疾患状態を有する細胞のスクリーニングの改良方法に関するものである。

癌及び癌化しそうな組織のスクリーニングとモニタリングに利用できる方法の改良が継続的に必要である。早期診断は、生存の可能性を大幅に向上させる。
特定の癌（出発点としての食道腺癌（ＥＡＣ））を用いて、本発明者らは、癌及び前癌の組織の改良された同定及び診断の技術を開発した。そして、当該技術は、様々な癌（特に癌腫）に適用可能である。

食道腺癌（ＥＡＣ）の予後は悪く、５年生存率はわずか１７％¹であり、１９９９年から２００８年での西洋人²での発症率は年間約２％ずつ上昇している。
バレット食道(ＢＥ)は、ＥＡＣの前駆的病変と認識されており、慢性胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）患者で見られる。ＥＡＣへの癌化は連続的な生理学的段階を経て起こる。
まず未変性の扁平（ＳＱ）上皮の円柱状仮形成が起こる。これは、非異形成バレット食道（ＮＤＢＥ）と呼ばれ、軽度異形成（ＬＧＤ）、高度異形成（ＨＧＤ）を経てＥＡＣになる。円柱上皮仮形成／ＮＤＢＥからＥＡＣへの進行の危険度は、0.3―0.5％^3,4の間にある。
しかしながら、一旦、高度異形成（ＨＧＤ）が発現すると、未治療の場合、食道腺癌（ＥＡＣ）へ進行する危険度は５年以内で４０―６０％程度に高まり得る。ＬＧＤ又は初期の高度異形成（ＨＧＤ）患者の治療は、過去５年間で劇的に変わった。これらの前進を以て、胃腸病学協会（ＢＳＧ）は、ＢＥと診断された患者は内視鏡観察を２―５年毎⁵に受けるべきであると推奨している。高周波アブレーション（ＲＦＡ）^６及び内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）のような新らしい最小限侵襲内視鏡的治療法は、軽度異形成ＬＧＤ／高度異形成ＨＧＤ患者⁷において８０―９０％の治癒的療法を提供することができる。

ＢＥの監視はシアトルプロトコール⁸に従う。これは、食道の可視円柱上皮に沿って１―２ｃｍ毎に行う２次生検（quadratic biopsies）のサンプリングを含む。その後、これらの生検材料は、質的な組織病理学的分析のために送られる。しかしながら、このプロセスは時間がかかり高価である。そして、異形成の診断において専門の病理学者^9,10の間でさえ有意な程度のばらつきがある。診断法の正確さと容易さを増す様々な方法が研究されてきた。例えば、生検分析^１１におけるバイオマーカーの同定の試みがなされている。生体内広視野内視鏡的イメージング法の進歩は、可視光線^{１２―１４}又は光干渉断層撮影^１５の使用を含む。別の方法が、弾性散乱分光光度計^１６，^１７や共焦点顕微鏡検査^{１８，１９}を用いた位置測定技術によって提供されている。しかしながら、全ての場合で、器材及び／又は運転費が高価なことと、結果の不十分な整合性とにより、通常の臨床使用^{２０，２１}への採用が阻まれている。それ故、臨床において実施できる、十分な正確さを有する現実的なさらなる診断／スクリーニング法が依然として高く優先される。

フーリエ変換赤外分光光度計(ＦＴＩＲ)及びラマン振動性分光光度計は、これらがＤＮＡ、タンパク質、炭水化物及び他の代謝物^{２２，２３}についての細胞変化に関する情報を提供できることから、疾患の範囲のための可能な診断ツールとして、ますます研究が進んでいる。
フーリエ変換赤外分光光度計ＦＴＩＲ^24-27,28及びラマン振動性分光光度計^{２９，３０―３４}分光法はともに、ＢＥの診断にも適用されている。ＦＴＩＲの研究は、組織^２５の、又はＢＥや食道腺癌ＥＡＣ細胞株²⁶由来の幹細胞の顕微分光分析、そして、ＢＥ²⁴やＥＡＣ^{２７，２８}から扁平上皮（ＳＱ）を識別するためのマクロ―ＡＴＲ―ＦＴＩＲイメージング^３５を含む。疾患進行の様々なステージ^{２９，３２}で採取されたＢＥ組織切片のラマンイメージの多変量解析は、個々の細胞型³³とその特徴的な生化学的変化³⁰の同定につながる。ごく最近、生体外組織サンプルのスペクトルがラマンプローブで得られた。そして、それは、生体内での将来の使用可能性^{３４，３６，３７}を目的としている。

本発明者らは、シングルエレメント（シングル素子）ＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計（スペクトロスコープ）を用いて、比較的単純な方法で、組織学分析の前の異形成ＢＥ生検でのポイント・オブ・ケア（臨床現場即時）スクリーニングの、臨床上実行可能な方法を提供する技術を開発した。その方法は、臨床医の意思決定のために用いられ、その結果、サンプルの詳細な組織学再調査の必要性を減らし、よって、最終的にはＢＥ調査のコスト低下をもたらし、異形成BEと同定されたものの、迅速な治療を可能にし得るであろう。これらの方法は、他の潜在性の癌及び前癌組織、これらのうち特に上皮組織にあるものの生検に適用することもできる。
具体的には、ＦＴＩＲイメージングを用いて見出された異なる組織型の分光特性を用いることにより、生検材料の平均化された表面を現在有力な組織型に分けることができるということを本発明者らは発見した。

本発明者らは、その分析法が、癌及び前癌組織に適用できることを確認し、そして、その方法を他の細胞型に適用し、様々な細胞型を容易にかつ正確に分類するために用いることができると確認した。

本発明の第１の態様によれば、対象（被験体）から得られたサンプルを分析する方法が提供される。これは、次のステップを含む。
ａ）ＦＴＩＲ分光光度計を用いてサンプルをスキャンすることにより生じたスペクトルを提供する
ｂ）各々が生じるスペクトルに従ってサンプル細胞を分類する

それらが生じるＦＴＩＲスペクトルによって（特にサンプルの表面に、又は表面近くで見つかる）細胞を分類できることを、本発明者らは発見した。
サンプルは、対象から得られ、ＦＴＩＲ（特にＡＴＲ―ＦＴＩＲ）を用いてスクリーニングされ得るいかなる適当なサンプルであってもよい。特に、サンプルは、組織生検材料、特に上皮組織のサンプルでもよい。
本技術分野で周知のように、上皮組織は、上皮から採取した組織を意味する。それは、例えば、循環器系、食道、胃腸などの消化器系、内分泌系、外皮系、生殖系、呼吸器系及び泌尿器系の上皮組織を含み得る。
ある特定の例では、サンプルは、食道から得られる。食道サンプルの場合、例えば、扁平上皮の、及び／又は粘膜固有層の細胞を含むことがある。
サンプルは、生検や切除術のような組織サンプルであってもよいし、又は、唾液、尿、血液、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、水性又は硝子体液、胆汁又はその他の分泌液のような、体液サンプルのような細胞を含む、他のいかなるサンプルでもあってもよい。
サンプルは、いかなる適当な方法によっても得られる（例えば、擦ること、削ること、生検又は針サンプリングによって）。
サンプルは、スライド上への固定の前に回転処理（遠心分離）してもよい。
サンプルは、体から取り除かれても、又は体内にあるままでもよく、すなわち、適当な分光計によって測定できるならば、サンプルは生体外でも生体内でもよい。

サンプルは、患者から直接得られた新鮮な組織サンプルか、又は保存されたサンプルでもよい。調査サンプルに応じて、新鮮な組織サンプルは、数分、又は数時間まで保存されてもよい。又は、サンプルは処理を施されてもよい。サンプルは、例えば、（瞬間）冷凍されたものや氷上に置いたサンプルでもよく、あるいは例えば室温でのホルマリン固定による固定サンプルでもよい。また、ホルマリンに固定される検体は、パラフィンに包埋してもよく、必要に応じ、任意に脱パラフィンしてもよい。本方法は、以下に示す一つ以上のステップを含む。サンプルの保管、冷凍、瞬間冷凍、解凍、乾燥、再水和、水和、固定、包埋（パラフィン中）、又は脱パラフィンステップ。本方法は、水和（ハイドレーション）レベルの修正のように、サンプルの処理によってもたらされるいかなる変化をも修正するために、サンプルのキャリブレーションのステップを含めてもよい。 本方法は、いかなる薬剤や他の医薬品のための、又は、サンプリング前に対象に加えられたかもしれない他のいかなる作用剤（例えば染料のような物質）のためのキャリブレーションのステップをも含めてよい。薬剤又は他の医薬品は、外用剤（例えば酢酸、アドレナリン、ＮＡＣ（Ｎアセチル・システイン）を含むもの、又は喉スプレー）でもよい。染料は、メチルブルー又は他のいかなる適切な染料であってもよい。

サンプルは、癌細胞あるいは前癌細胞を含むことが予想される、又は含むことが既に分かっている組織のサンプルであってもよい。あるいは、他の細胞型、特に病気にかかった細胞型を含むことが予想される、又は含むことが既に分かっている組織のサンプルであってもよい。

本方法はサンプルを得るステップを含むことができ、前記サンプルは事前に得られたものでもよく、また、前記方法は、完全には生体外で行われたものであってもよい。

本方法は、サンプルを赤外分光光度計でスキャンした結果を提供するステップを含む。
いかなる適当な分光光度計（例えばベンチ・ベースの分光光度計又はプローブ）を使ってもよい。分光光度計は、好ましくはＦＴＩＲ分光光度計（より好ましくは、ＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計）である。
本方法は、サンプルをスキャンするステップを含んでもよく、又は単にスキャン結果を解析するステップを含むか、若しくは解析するステップからなるものであってもよい。

本方法は、生じるスペクトルに従って細胞を分類するステップを含む。細胞によってできるスペクトルの範囲は、典型的には、１８００―６００ｃｍ^―１領域に入る。分類ステップは、サンプル中の細胞によるスペクトルと既知の細胞によるスペクトルとの比較により行われる。別法として、又は、それに加えて、サンプルによってできるスペクトルは予想スペクトルピークと比較される。既知の細胞のスペクトルで見つかると予想されるピークを意味するために、予想スペクトルピークという用語が用いられる。本発明者らは、既知の細胞サンプル由来スペクトルのライブラリを作成した。そして、それらの細胞が標準組織学技術によって同定された。このようなライブラリは、スペクトルを、又はサンプルスペクトルが比較される予想スペクトルピークを出力するために用いることができる。
本方法は既知の細胞からスペクトルを得るステップを含むか、又は、これは別途実施することができる。既知の細胞のスペクトルとサンプルのスペクトルは、同一タイプの分光計により得られなければならない。

本方法は、細胞をそれらの様々なタイプ又はクラスに分類するステップを含む。特に、本方法は、細胞を正常細胞と非正常細胞に分類するステップ、すなわち、正常細胞、特に非癌化細胞に関連付けられたスペクトルを生じる細胞と、異なるスペクトルを生じる細胞とを識別、又は分類するステップを含んでもよい。非正常細胞は、正常（健康）な細胞スペクトルを生じないいかなる細胞であってもよい。それらは、異常（病的）細胞でもよいし、単に正常（健康）な細胞スペクトルを生じない細胞でもよい。特に、非正常細胞は以下を含み得る。例えば、扁平上皮癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌などで見つかるような癌細胞及び前癌細胞、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又は炎症性腸症候群（ＩＢＳ）で見られるような炎症の存在を伴う細胞。また、非正常細胞は、他の疾患又はヘリコバクター・ピロリ感染、胃潰瘍、クローン病、セリアック病、潰瘍性大腸炎などのような疾患状態からの細胞を含むこともできる。正常細胞だけを含んでいるサンプルは、正常であると宣言でき、更なる組織学分析は必要としないので、正常細胞と非正常細胞を区別できることは有用である。

あるいは、本方法は、サンプルが生細胞を含むかどうか確認するためのものでもよい。
例えば、本方法は、サンプルが正しい場所から採られたことを確認すること、例えば、その場所にあるべき特定の細胞型の存在を確認するのに有用である。サンプルが特定の細胞を含むか含まないかの同定、又は生細胞、死細胞あるいは死にゆく細胞を含むのか、又はこれらの細胞の混合なのか、又は全く細胞を含まないのかどうかの同定のために、スペクトルによってサンプルを分類することができる。
したがって、サンプルの中で細胞の存在を確認する方法が提供されるが、その方法は、ＦＴＩＲ分光光度計を用いてサンプルをスキャンすることによって生じるスペクトルを提供するステップ、そして、各々が生じるスペクトルに従ってサンプル中の細胞を同定するステップを含む。
別法として、又は、既に言及されたいかなるステップに加えても、本方法は、異なる細胞型を分類するステップを含むことができる。サンプルは、通常一つ以上の細胞型を含む。
例えば、食道上皮のサンプルは、通常少なくとも若干の扁平上皮細胞及び若干の粘膜固有層細胞を含む。特にサンプルが特定の細胞型の疾患のために調査されている場合、細胞型を識別することが可能であることは特に有用である。その細胞型が存在しない場合、そのサンプルは廃棄できる。

別法として、又は、既に言及されたいかなるステップに加えても、本方法は、疾患又は疾患状態によって細胞を分類別するステップを含むことができる。例えば、本方法は、癌細胞及び前癌細胞を互いに及び／又はサンプルの他の細胞から分類するステップを含むことができる。
本方法は、正常細胞と体内の他の部分での発癌（遠隔発癌）のマーカーを含むか、又は発癌マーカーとして働く細胞とを分類するステップを含むことができる。例えば、検査されているサンプルが食道上皮である場合、本方法は非異形成バレット食道（ＮＤＢＥ）細胞を軽度異形成（ＬＧＤ）、高度異形成（ＨＧＤ）そして食道腺癌（ＥＡＣ）を有する細胞から分類することを含む。細胞は以下を含む他の疾患、又は疾患状態によって、分類することもできる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又は炎症性腸症候群（ＩＢＳ）でみられるような炎症又は炎症の徴候を伴うか又は示す細胞を含む他の疾患や疾患状態、扁平上皮癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌などを含む他の癌タイプ。細胞は、ヘリコバクター・ピロリ感染、胃潰瘍、クローン病、セリアック病、潰瘍性大腸炎などを含む他の疾患又は疾患状態によって分類することもできる。細胞は、例えば、種別（タイプ）によっても分類できる。

細胞は、上記記載のとおりタイプ又はクラスによって分類することができる。各分類ステップは、それ単独、又は、他のステップと連動して、行われてもよい。分類ステップは、繰り返されてもよい。ある実施例においては、正常細胞及び非正常細胞を分類するステップは、他の分類ステップより前に実行される。ある実施例においては、タイプによる細胞分類ステップは、疾患状態によって細胞を分類する前に実行される。ある実施例においては、分類ステップは、以下の順番で実施される：正常であるか非正常か；細胞型；疾患状態。

本方法は、サンプルのイメージを生成することを含むこともできる。

細胞を異なるクラス又はタイプに分類するいかなるステップの後も、一つ以上のクラス又はタイプを、分光計によって生じるサンプルのイメージから取り除くことができる。従って、イメージから取り除かれていない、選択された、細胞型若しくは細胞クラス、又は細胞型若しくは細胞クラスの群（グループ）の、存在又は非存在を示すイメージを提供することができる。

本方法は、サンプルの水和を考慮するため、スペクトルのシフト又はキャリブレーションのステップを含むこともできる。乾燥したサンプルは湿潤したサンプルとは異なるスペクトルを生じることがある。サンプルの水和の影響が予測されるが、考慮に入れることができる。本方法は、いかなる薬剤、他の医薬品、例えば染料のような、サンプリングの前に対象に与えられる他の作用剤のためのキャリブレーションのステップを含むこともできる。酢酸、アドレナリン、ＮＡＣ（Ｎアセチル・システイン）、又は喉スプレーを含むような、いかなる薬剤又は医薬品も、局所的に投与することができる。染料は、メチルブルー又は他のいかなる適切な染料でもよい。

スペクトルに影響を及ぼす他のいかなる要素も、同様の方法で扱われる。

方法における分類、シフト及び／又は画像生成のステップは、これらのステップの一部もしくは全部を、実行するようにプログラム化されたコンピュータ、又は、実行するためにインストールされたプログラムを有するコンピュータを経由して実行できる。

本方法は、分光光度計によるサンプルのスクリーニングとスキャニング（走査）のステップを含む。サンプルは、、可能な限り最高の画像を得られるように、一回、又は二回以上スキャンすることができる。サンプルは、しばしば組織の切片であり、上部と底部とを有する。この場合、それは両面、又は、一面のみをスキャンすることができる。他のサンプルは、それらの形状とサイズに依存して、異なったスキャンをすることができる。例えば、サンプル（又はサンプルのどの側面も）がプリズム（３ｍｍ／３ｍｍ）より大きい場合、同じ側面で二か所以上の場所をスキャンすることが必要となるかもしれない。好都合にも、スキャンされた領域が罹患していなくても、試料中の離れた疾患を検出することも可能である。
当業者であれば、離れた疾患を発見することに適したサンプルの適切なサイズ（例えば、面積及び厚み）及び形状の範囲を決定することができる。

最善のスキャンのために、サンプルは、スライド上に平らにするか又は固定することができる。サンプルはスキャンの前に、湿潤させるか乾燥させる処理もできる。

本発明の第二態様によれば、本発明における分類、シフト、及び画像生成のステップの少なくとも１つを実行するためのコード手段を備えたコンピュータプログラムが提供される。
更にこの種のコンピュータプログラムを含むコンピュータ可読媒体が提供される。
更には、コンピュータプログラム（例えばコンピュータやコンピュータが接続されるサーバーにインストールされているプログラム）を実行可能なコンピュータを含むシステムが提供される。本システムは、分光光度計を備えることもできる。また、本システムは、分類ステップ用にコンピュータによってアクセスされることができる、既知の細胞からのスペクトルのライブラリを含むこともできる。

本発明の第３の態様は、対象の疾患状態を診断するための方法を提供する。その方法は、サンプルの赤外分光光度計のスキャン結果の解析、及び細胞によるスペクトルに従った、サンプル中の細胞の同定、又は分類を含む。
疾患状態は、同種の正常細胞と異なるスペクトルを生じさせる、いかなる疾患状態でもあってもよい。特に、疾患状態は、癌又は前癌状態であっても良く、更に上皮組織の癌であっても良く、とりわけＢＥやＥＡＣであってもよい。

本発明について、図面を参照し、ほんの例示として説明される。

（Ａ）厚さ８μmのＳＱ組織切片の１５７０及び１４８５ｃｍ^―１でのアミドＩＩバンドの高さで擬似的に色付けされた２×４のＦＴＩＲイメージ。四角形は、既知の上皮及び粘膜固有層組織型から選択された領域を表す。（Ｂ）既知の組織型領域から加算、平均化された吸光度（上部）及び２次導関数（下部）スペクトル。４１８の平均化スペクトルを含んだ上皮（青い部分）と１７７７の平均化スペクトルを含む粘膜固有層。（Ｃ）４×４のビニングされたイメージの１２００―１１００ｃｍ^―１スペクトル領域のＨＣＡ（階層的クラスター分析）の最初の２つの群に色付けされるピクセル。青いピクセルは上皮に、赤いピクセルは粘膜固有層に対応する。黒いピクセルは、０．０５未満の吸光度を有するアミドＩＩのピクセルで、ＨＣＡに含まれなかった。 （Ａ）青線でマークされた領域によって示されるＬＧＤの小領域を有するＮＤＢＥ生検サンプルの、厚さ３μｍのＨ＆Ｅで染色した横断面。（Ｂ）厚さ８μｍの切片の、１６１０―１５３０ｃｍ^―１スペクトル領域のＨＣＡの最初の２つの群で色づけされた、隣接するＦＴＩＲイメージ。上皮は、青色に色付けされ、１４９４ピクセルを含み、粘膜固有層は赤色に色付けされ、1２６６ピクセルを含む。黒いピクセルは、吸光度０．０５未満を有するアミドＩＩのピクセルであり、これらのデータはＨＣＡに含まれなかった。（Ｃ）平均吸光度（上部）及びＨＣＡクラスからの２次導関数（下部）スペクトル。 （Ａ)Ｈ＆Ｅで染色した厚さ３μｍのＨＧＤ生検サンプルの横断面であり、青線でマークされた領域は、組織病理学者によって定義されたＨＧＤの特徴を示す。（Ｂ）厚さ８μｍの切片の、１６１０―１５３０ｃｍ^―１スペクトル領域のＨＣＡの最初の２つの群で色づけされた、隣接するＦＴＩＲイメージ。上皮は、青色に色付けされ１２７１ピクセルを、粘膜固有層は赤色に色付けされ１８８２ピクセルを含む。黒いピクセルは吸光度０．０５未満を有するアミドＩＩのピクセルである。（Ｃ）平均吸光度（上部）及びＨＣＡクラスからの２次導関数（下部）スペクトル。 （Ａ）Ｈ＆Ｅで染色した厚さ３μｍのＨＧＤ生検サンプルの横断面。（Ｂ）厚さ８μｍの切片の、１６１０―１５３０ｃｍ^―１スペクトル領域のＨＣＡの最初の２つの群で色づけされた、隣接するＦＴＩＲイメージ。青色は１２４７ピクセルを、赤色は１９０１ピクセルを含む。黒いピクセルは吸光度０．０５未満を有するアミドＩＩのピクセルである。（Ｃ）平均吸光度（上部）及びＨＣＡクラスからの２次導関数（下部）スペクトル。 平均吸光度（上部）及び２次導関数（下部）スペクトルであり、以下の（Ａ）と（Ｂ）を比較するものである。（Ａ）ＳＱ上皮 対 他のすべてのバレット食道ステージ、（Ｂ）(Ａ）のＮＤＢＥ、ＬＧＤ、ＨＧＤ＋及びＥＡＣの領域から手動で選択された、１８００―１０００ｃｍ^―１の領域、そして、Ｂ）１３００―１０００ｃｍ^―１のスペクトル領域。 平均吸光度（上部）及び２次導関数（下部）スペクトルであり、以下の（Ａ）と（Ｂ）を比較するものである。（Ａ）ＳＱ粘膜固有層 対 ＮＤＢＥ／ＬＧＤ／ＨＧＤ＋粘膜固有層及びＥＡＣの他の全ての平均、（Ｂ）(Ａ）のＮＤＢＥ、ＬＧＤ、ＨＧＤ＋粘膜固有層及びＥＡＣの領域から手動で選択された１８００―１０００ｃｍ^―１の領域、そして、Ｂ）１３００―１０００ｃｍ^―１のスペクトル領域。 シングルエレメント（シングル素子）ＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルがどのように分別されるかを示す系統図。最初にＳＱとＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ群へ（i）、次いで、それらが存在する支配的な組織型、上皮又は粘膜固有層へ（ii）、それぞれの疾患クラスへの分類の前に：ＮＤＢＥ ＥＰ（上皮）若しくはＨＧＤ ＥＰ（上皮）／ＥＡＣへ（ｉｉｉ a）；又は、ＮＤＢＥ ＬＰ（粘膜固有層）若しくはＨＧＤ ＬＰ（粘膜固有層）／ＥＡＣへ（ｉｉｉ ｂ）。 （Ａ）１８００―８５０ｃｍ^―１領域の平均吸光度（上部）及び２次導関数（下部）のスペクトルについて、６１のＳＱ（緑色）、１０６のＳＱ粘膜固有層（青色）、６１６のＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ（黒色）の、生検スペクトルの違い。（Ｂ）ＳＱ対ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣモデルに対して、１３８５―１２３５及び１１９２―１１３０ｃｍ^―１のＰＬＳＤＡで使用する３つの潜在変数（ＬＶ）のスコアプロット。各ポイントは、１６７のＳＱ又は５４３のＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣの、生検スペクトルの１つを意味する。 吸光度（上部）及び２次導関数（下部）のスペクトルにおける、存在する優勢な組織型への分類の後の、３６８のＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ上皮スペクトル（青色）及び１７５のＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ粘膜固有層スペクトル（赤色）の平均の違い。 （Ａ）１３００−８７０ｃｍ^−１領域での平均吸光度（上部）及び２次導関数（下部）のスペクトルにおける、２７１のＮＤＢＥ（青色）、１１５のＨＧＤ上皮／ＥＡＣ（赤色）の、生検スペクトルの違い。（Ｂ）１１００―９００ｃｍ^―１のＰＬＳＤＡモデルにおいて使用する４つの潜在変数（ＬＶ）のうちの最初の２つのＬＶのスコアプロット。 各ポイントは、１９８のＮＤＢＥ上皮生検材料又は６６のＨＧＤ上皮／ＥＡＣ生検材料の１つを示す。１つの生検材料に対して二つ以上のスペクトルが存在する場合、スコアは平均値である。 （Ａ）１３００―８７０ｃｍ^―１領域での平均吸光度（上部）及び２次導関数（下部）のスペクトルにおける、１４１のＮＤＢＥ粘膜固有層（青色）、８９のＨＧＤ粘膜固有層／ＥＡＣ（赤色）の、生検スペクトルの違い。（Ｂ）１２９０―１２１０ｃｍ^―１及び１１３０―８７０ｃｍ^―１のＰＬＳＤＡモデルにおいて使用する４つの潜在変数（ＬＶ）のうちの最初の２つのＬＶのスコアプロット。各ポイントは、２０７のＳＱ／ＮＤＢＥ粘膜固有層生検材料又は５３のＨＧＤ粘膜固有層／ＥＡＣ生検材料の１つを意味する。１つの生検材料に対して二つ以上のスペクトルが存在する場合、スコアは平均値である。 気管支生検切片の、細胞型及び疾患ステージ（病期）を示す。（Ａ）気管支サンプルのＨ＆Ｅ染色切片の組織病理学的分析。（Ｂ）ＥＰ及び粘膜固有層の吸光度（上部）と２次導関数（下部）を示す抽出スペクトルであり、(Ｅ）のＨＣＡ定義の領域の平均によって導出される。グレーの色の領域は、パラフィンが吸収する領域を示す。（Ｃ）ＥＰ（青色）及びＬＰ（黄色／赤色）を示すヒートマップであり、１５９１ｃｍ^−１のトラフの積分サイズで分離。（Ｄ）ＥＰ（赤色）及びＬＰ（黄色／緑色）を示すヒートマップであり、１３３４ｃｍ^−１のトラフの積分サイズで分離。（Ｅ）１６１４―１４６５ｃｍ^−１領域のＨＣＡにおいて同定した２つの主要な群の図表示は、ＥＰ（赤）及び粘膜固有層（緑）を示す。（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ）に存在する「破損データ」としたボックスは、記録されたデータが破損し、使用不可能だったＦＴＩＲイメージの２つの隣接する部分を示す。 気管支生検材料の細胞型を分類する樹形図である。１６１４―１４６５ｃｍ^−１領域のＨＣＡ。 異なる疾患ステージでの気管支上皮からのＦＴＩＲスペクトルを示す。１５か所の領域は、以下の疾患ステージによって選択された：領域１―３（正常）；領域４―６（軽度異形成）、領域７―９（中度異形成）及び領域１０―１５（重度異形成／上皮内癌）。領域は、以下のサイズに従って、色で符号化される：（Ａ）１０３６ｃｍ^−１のトラフの積分の２次導関、及び（Ｂ）１１６３ｃｍ^−１のトラフの積分の２次導関のサイズ。（Ａ）と（Ｂ）に存在する「破損データ」としたボックスは、記録されたデータが破損し、使用不可だったＦＴＩＲイメージの２つの隣接する部分を示す。（Ｃ）は、１８００―１０００ｃｍ^−１のスペクトル領域での吸光度（上部）と２次導関数（下部）スペクトルを示し、正常から重度異形成／上皮内癌にわたる１５カ所の選択されたＥＰ領域の平均値になる。（Ｄ)１２５０―１０００ｃｍ^−１のスペクトル領域。 手動で選択された気管支上皮領域からのスペクトルのＰＣＡ（主成分分析（principal component analysis））である。（Ａ）１１００―１０３０ｃｍ^−１のスペクトル領域を使用して実行されたＰＣＡの３つの成分からのＰＣＡスコアの散布図。各データポイントは、それに対応する領域番号によってラベル化されている：緑色は正常；オレンジ色は軽度異形成；赤色は中異形成；黒色、重度異形成／上皮内癌。(Ｂ）対応するＰＣＡのローディング（主成分負荷量）。 気管支粘膜固有層の手動で選択された領域からの、スペクトルの特徴のピークの積分を示す。ＬＰ色の領域は、それらの特性の積分について符号化されている；（Ａ）１３３４ｃｍ^−１；（Ｂ）１２７９ｃｍ^−１；（Ｃ）１０６６ｃｍ^−１；（Ｄ）１２１５ｃｍ^−１当該領域は、以下のＥＰと隣接している：領域１―３、正常；領域４―６、軽度異形成；領域７―９、中度異形成、及び領域１０―１５、重度異形成／上皮内癌。 気管支粘膜固有層の手動で選択された領域のＦＴＩＲスペクトルを示す。（Ａ）１８００―１０００ｃｍ^−１のスペクトル領域での吸光度（上部）及び２次導関数（下部）スペクトルを示し、正常（青色）から重度の異形成／上皮内癌（赤色）の範囲の１５か所の領域からの平均値である。（Ｂ）同じスペクトルの１２５０―１０００ｃｍ^−１のスペクトル領域。ＬＰから手動で選択された領域の位置は、図１６に見られる。 病気にかかった上皮に隣接する気管支粘膜固有層領域からのスペクトルのＰＣＡを示す。（Ａ）ＰＣＡの散布図は、１３５０―１１９６ｃｍ^−１及び１０９７―１０４１ｃｍ^−１のスペクトル領域のＰＣＡの最初の３つのＰＣＡ成分から得点（スコア）を付ける。各データポイントは、それに対応する領域番号によってラベル化されている：緑色は正常；オレンジ色は軽度異形成；赤色は中度異形成；黒色、重度異形成／上皮内癌。（Ｂ）対応するＰＣＡローディング（主成分負荷量）。 １５８５―１５２７ｃｍ^−１の領域でのＨＣＡ後の３つの主要クラスタを、アミドＩＩの高さで規格化して示す。ＥＰ（赤）及び粘膜固有層（青）シグネチャー（特徴）の平均値は黒色で表示され、混合細胞の生理機能を示す生検材料の平均ＩＲシグネチャー（特徴）は緑色で示されている。 細気管支生検材料の上皮のシングルエレメント（シングル素子）ＡＴＲ―ＦＴＩＲ比較を示す。４１の正常ＥＰ（緑色）スペクトル（１８人の患者、３２の生検材料）、５つのＬＧＤ ＥＰ（青色）スペクトル（３人の患者、４つの生検材料）、８つのＨＧＤ ＥＰ（赤色）スペクトル（３人の患者、６つの生検材料）及び１１の癌 ＥＰ（黒色）スペクトル（３人の患者、７つの生検材料）からの、平均２次導関数ＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルである。すべてのスペクトルは、凝縮水及び水蒸気を形態は無条件で除き、アミドＩＩの高さで標準化されている。 細気管支生検材料の粘膜固有層のシングルエレメント（シングル素子）ＡＴＲ―ＦＴＩＲ比較を示す。(A)１６の正常ＬＰスペクトル（１２人の患者、１４の生検材料）、２つのＬＧＤ ＬＰ（青色）スペクトル（２人の患者、３つの生検材料）、６つのＨＧＤ ＬＰ（赤色）スペクトル（４人の患者、４つの生検材料）及び１７の癌ＬＰ（黒色）スペクトル（３人の患者、１０の生検材料）からの平均２次導関数ＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルである。すべてのスペクトルは、凝縮水及び水蒸気を形態は無条件で除き、２次導関数において、アミドＩＩの領域で標準化されている。(B）成分組成の電位変化を示している１１９０―１１４０ ｃｍ^−１領域。 豚の組織サンプルへの酢酸の影響を示す。各スペクトルは、組織サンプルの上皮群からのすべてのスペクトルの平均である：蒸留水だけによって洗浄した組織からの４つのスペクトル（黒色）；蒸留水で洗浄後、２．５％の酢酸により洗浄した組織からの４つのスペクトル（青色）；蒸留水で洗浄後、５％の酢酸により洗浄した組織からの５つのスペクトル（赤色）；５％の酢酸の単一スペクトル（緑色）。 ヒト組織への酢酸のスペクトル上の影響を示す。 ヒト組織への１：１００,０００のアドレナリンのスペクトル上の影響を示す。 ヒト組織へのＮＡＣのスペクトル上の影響を示す。 ヒト組織への喉スプレーのスペクトル上の影響を示す。

方法
ＦＴＩＲ分光イメージング
ＦＴＩＲ分光イメージは、１５×０．４ＮＡの対物レンズを備えたＨｙｐｅｒｉｏｎＩＲスコープＩＩ顕微鏡と連結されたＢｒｕｋｅｒ ＩＦＳ６６スペクトロメータ及び１２８×１２８ピクセルのテルル化カドミウム水銀焦点面アレイ（ＦＰＡフォーカルプレーンアレイ）検出器を用いて測定された。
アレイ検出器を使用することにより、サンプルの異なる空間領域から同時にスペクトルを取得することができ、１つの検知素子^{３４，３８}を用いて同じ領域をマッピングするより非常に速くなる。
ＮＤＢＥ／ＬＧＤ及びＳＱサンプルは、厚さ８μｍまでミクロトームで薄く切断され、そして、厚さ２ｍｍのフッ化カルシウム・ウインドウ上に取り付け、規格化されたキシレン・プロトコルによって脱パラフィンする［リファレンス］。

分光イメージは９６×９６ピクセル・ウインドウを有するＦＰＡを使用して記録され、それは２５６×２５６μｍ^２の視野を有する。社内開発されたマクロを用いて、スペクトルイメージは、組織の異なる部分から取得され、Ｍａｔｌａｂに連結して、大きいデータセットを作る。各サンプルは、事前に組織病理学者によって等級分けされた様々な段階の異形成の領域を含むエリアと同様に、上皮及び粘膜固有層細胞型をカバーしてマッピングされる。そのＦＴＩＲイメージは、雑音に対する信号を増加させるため、４×４マトリックスにビニングされた。１５７１―１４９０ｃｍ^―１の間の０．５未満のアミドＩＩ積分を含んだいかなるピクセルも、更なる解析から除外された。他の全てのスペクトルは、アミドＩＩピークの高さ及び１５５５と１４７５ｃｍ^―１の間のトラフに規格化された。
イメージは、ＳＮ比（信号対雑音比）改善のために、４×４マトリックスでビニングされた。水蒸気の影響は、予め記録してある水蒸気のリファレンススペクトルを差し引くことで取り除かれた。処理後、異なる細胞型の違いが明らかにされた。

ＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトル記録
６０００―８００ｃｍ^―１領域で記録するブルカー・オプティクス（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ）ＩＦＳ６６／ｓＦＴＩＲスペクトロメータがスペクトルの記録のために用いられたが、４０００―９００ｃｍ^―１の領域だけが集められ、２２００―９００ｃｍ^―１の領域だけが分析された。
本装置は、ＺｎＳｅオプティクスを有する減衰全反射（ＡＴＲ）３反射シリコン・プリズムを備えた、液体窒素で冷却されたＭＣＴ―Ａ検出器を装備している。スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＯＰＵＳ ６．５ソフトウェアを使用して記録された。

すべての測定は、４ｃｍ^―１の分解能で記録され、ほぼ±１ｃｍ^―１のピークの精度がある。
きれいなプリズム面の１０００のバックグランド干渉図形が平均化され（水及び１００％のエタノールでプリズムを慎重に清浄後に）、そして、生検サンプルを正しく配置した後に、５００の干渉図形が平均化され、単一の生検吸光度スペクトルを生成する。

データ処理
全てのデータは、ソフトウェア内で、Ｂｒｕｋｅｒ ＯＰＵＳ ６．５ファイル形式からＡＳＣＩＩファイル形式まで変換された。
その後データは前処理され、ＭＡＴＬＡＢ＿Ｒ２０１２ｂ及び／又はＰＬＳツールボックスｖ７．０．３で開発された社内スクリプトを使用して解析された。

解析の前に、４つのデータ前処理ステップが、各スペクトルに以下の順序で適用された。
リファレンスの水スペクトルを使用した水のスペクトルの除去（サブストラクション）、予め記録してあるリファレンススペクトルを使用して水蒸気のスペクトルの除去（サブストラクション）、アミドＩＩバンドの高さによる標準化、及び２次導関数の算出。

組織病理学
ＵＣＬＨの胃腸管系部門は、２人の担当組織学者を有している。
正しい診断を確実にするために、両組織学者は、異形成の診断を有するいかなるサンプルも個別に検査した。
サンプルは、４％のホルマリン溶液に格納され、包埋カセットに置かれ、次に示すエタノール溶液の中に、２時間配置され脱水された：各々１時間後に交換される７０％、８０％、９５％及び１００％エタノール溶液。
その後、生検材料はキシレンの中に３時間置かれ、毎時、溶液は交換された。
その後、生検材料は、１．５時間、パラフィンワックス（〜５７℃）中に置かれ、パラフィン・ブロック包埋されるまで繰り返された。
その後、ブロックは４０―４５℃の水浴中でミクロトームにより４μｍにスライスされ、ガラススライド上に置かれ、オーブンで乾燥させた。
その後、サンプルは、５分間、キシレン中で再水和された；溶液は、変更されて、それから水和の工程が３回繰り返された。その後、サンプルは、１００％エタノール中で３分間すすがれ、それが繰り返され、そのあと、９５％エタノール中で３分すすがれ、その後、サンプルは蒸留水で洗浄され、検査のために着色された。

その後、サンプルは、正常ＳＱ上皮細胞か、あるいはＢＥの３つのクラス；ＮＤＢＥ、ＨＧＤ又はＥＡＣの中のどれか一つ、のどちらかに分類された。
インターセプトマッチ（intercepted-matched）されたデータセットの場合、ＮＤＢＥ―ＩＭの群（クラス）が追加で含まれた。
ＵＣＬＨの専門家の病理学者が各生検材料を診断し、そして、生検材料がＨＧＤ又はＥＡＣと診断された場合、さらに別の組織学者がその診断を独立に検証した。
ＬＧＤと分類された生検材料は、モデルのトレーニングデータから除外された。

統計分析
部分的最小自乗判別分析
部分的最小自乗判別分析（ＰＬＳＤＡ）が、説明変数、相関変数（波数）及び分類変数（疾患ステージ）の間の共分散を最大にするために、次数の低減に適用された。
このモデルが多段階プロセスを使用して構築されたので、変数（波数）のサブセットは細胞型によって変わる。ＳＱ分類のために、１３８５―１２３５^―１ｃｍ^―１と１１９２―１１３０ｃｍ^―１領域が使用され、上皮診断用モデルのために１２００―９００ｃｍ^―１が使用され、粘膜固有層診断用に１２９０―１２１０ｃｍ^―１と１１３０―８７０ｃｍ^―１の領域が使用された。
そして、これらの領域は、潜在変数と呼ばれる無相関変数の、より低次元空間に縮小され、使用する潜在変数の数は、結果の章で示される。
ＰＬＳモデルを作成して迅速に正確に算出するために、我々は、Ｄｅ Ｊｏｈｎｇ、Ｓｉｊｍｅｎ^３９のアプローチに従う。

ロジスティック回帰
疾患ステージを識別するために、我々は、ロジスティック回帰分析を用いてＰＬＳＤＡから生成されたスコアに基づいて、各ステージに確率を割り当てた。ロジスティック回帰モデルは、次式で与えられる。

この式において、Ｙ_iは二成分反応（疾患ステージ）を、β_０は切片を示し、βは係数のベクトルであり、Ｘ^＊は潜在変数のマトリックスである。
この方程式から、我々は疾患ステージごとに確率を算出することができ、そして、ひとつの分類規則が２つの群の間での閾値の同定のために適用されなければならない。

誤分類コストの適用
分類性能の最適化のために、我々は決定問題に誤分類コストを適用した。
Ｘ^＊というデータが与えられて、２つの可能な決定があったとする。：未知の生検スペクトルを「治療不要」（ＳＱ／ＮＤＢＥ）として分類することに対応する「ノートリート」、そして、未知の生検スペクトルを「治療」（ＨＧＤ／ＥＡＣ）として分類することに対応する「トリート」 である。正しく分類された生検スペクトルに、損失はなかった。
もし、決定はノートリートであるが、真の群はトリートであった場合、コストλtreatが存在し、それは１に固定される。同様に、トリート生検のノートリートとする誤分類の決定は、値が変化するλ_no-treatが割り当てられることになり、λ_no-treatの結果の章を参照。下記参照：

条件つきリスク（予想損失）は

及び

である。
もし、

又は

の等価である場合、決定はノートリートであり、それ以外では、決定はトリートである。

閾値（ｔ）に非常に近い状態にあるサンプルに対応する、『不確定』な予測のクラスをさらに含めることにより、評価測定の性能を最適化する。もし、

ならば、サンプルは『不確定』であると特徴づけられる。ここで、実際には、ｔは絶対値でのこれらの差のｑ％分位数で選択される。
一方、

ならば、１００％−ｑ％の信頼度でトリート又はノートリートの決定がなされる。

交差検証
最も正確に臨床環境を表すために、各患者から採取される生検材料の数に関係なく、トレーニング・データセット及びテストデータセットは同じ患者を決して含まない。その方法は以下の通りである。ここで、Ｎは患者数であり、：i）生検材料はランダムにＮ個のサブサンプル、必ずしも同じサイズである必要はない、に分けられ、同じ患者の生検材料は同じサブサンプルに属するようにする。ii) Ｎ−１個の患者のサブサンプルをトレーニングデータとして、そしてＮ人の患者からの１個のサブサンプルをテストデータとして使う。iii)最初の二つのステップを各患者一人ずつＮ回繰り返す。この方法は患者数が生検材料数より非常に少ないためそれほど計算コストは高くない。

結果
細胞及び疾患状態分光特性のライブラリ構築のためのＦＴＩＲイメージング
シングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ法は高速で、簡単、そして、高い信号／ノイズ比を有するが、いくつかの固有の限界を有する。
これらの中の一つは、視野が大きい（数ｍｍ^２）ことで、その結果、サンプル全体で、すべての細胞型及び疾患ステージのスペクトルが平均化される。これは、病気にかかった細胞と正常細胞のスペクトルの違いを解析するのが困難であることを意味する。
特に、病気にかかった少数の細胞からの信号は、多数の正常サンプルの中において平均化されて見えなくなってしまうことがある。
この限界の克服のため、ＦＴＩＲイメージングが、細胞及び疾患ステージ特徴のライブラリを構築するために用いられた。
既知の疾患ステージ、ＳＱ、ＬＧＤ領域を有するＮＤＢＥ、ＨＧＤ及びＥＡＣ、を含む厚さ８μｍの組織切片のＦＴＩＲマイクロ分光学イメージが記録されている。
それから、細胞型及び疾患ステージの特徴（フィーチャー）が、これらのイメージから選択され、ＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルの特定の細胞型のスペクトルのシグネチャーをより良く同定するために用いることができる。

ＳＱ生検材料切片の細胞型のスペクトル特性
ＳＱサンプルは２つの組織型を含むと思われる：表面の上皮（ＥＰ）及び深層の粘膜固有層（ＬＰ）。
図１Ａは、アミドＩＩバンドの高さに対して擬似的に色付けされたＳＱサンプルの厚さ８μｍの組織切片のＦＴＩＲイメージを示す。図１Ａ中の四角形は、ＥＰ及びＬＰの既知領域を示す。
これらの２つの領域からのスペクトルは、加算され、平均化された（図１Ｂ）。
これらの平均化スペクトルの間の主な違いは、１２００―１０００ｃｍ^―１領域に起こる。
階層的クラスター分析（ＨＣＡ）が、２次導関スペクトルのこのスペクトル領域を使用して実行された。これは、扁平上皮及び ?粘膜固有層に明らかに対応する２つの優勢な群を生成した（図１Ｃ）。

NＤＢＥ／ＬＧＤ生検材料切片の細胞型のスペクトル特性
図２Ａは、組織学分析のためにＨ＆Ｅ染色された厚さ３μｍの組織切片を示す。このサンプルはＬＧＤの領域を有し、優勢的にＮＤＢＥとして組織学的に定義された。このサンプルには、主に２つの組織型が存在する。：円柱上皮（ＣＥＰ）細胞及びＬＰ。
ＣＥＰ及びＬＰの既知領域からのスペクトルは手動で検査され、そして、それらの最大の違いは１６００ｃｍ^―１領域周辺で生じている。
イメージからの全てのピクセルをＣＥＰ又はＬＰのどちらかに分類するために、ＨＣＡが、２次導関数スペクトルの１６１０―１５３０ｃｍ^―１領域を使用して実行された。これは、ＣＥＰ及びＬＰの領域に明らかに対応した２つの優勢な群を生成した（図２Ｂ）。
これらの２つのＨＣＡクラスからの平均化スペクトルが図２Ｃに示される。２次導関数スペクトルにおいて最も顕著に見られるいくつかの特徴があり、それが、このＮＤＢＥ／ＬＧＤサンプルの中でＣＥＰとＬＰの間の分類を示す：
ＬＰのスペクトルには存在しない１５７０ｃｍ^―１近傍のＣＥＰピーク；
ＣＥＰの１５４１ｃｍ^―１からＬＰの１５４５ｃｍ^―１への、アミドＩＩのトラフ（溝）の４ｃｍ^―１シフト；
アミドＩバンドの肩形状の１６３３ｃｍ^―１の大きさの変化について、１６３３ｃｍ^―１のＣＥＰのアミドＩの肩は、ＬＰに比べてより顕著である；
そして、アミドＩ／アミドＩＩ強度比は、ＣＥＰからＬＰへ、０．２７増加している。

ＨＧＤ生検材料切片の細胞型のスペクトル特性
図３Ａは組織学的に少なくともＨＧＤ（ＨＧＤ＋）と定義された厚さ３μmの組織切片を示す。
ＳＱ及びＮＤＢＥ／ＬＧＤでのＦＴＩＲイメージにおけるものとな同じ組織型の分類方法に続いて、同定可能なＣＥＰ及びＬＰの既知領域からのスペクトルが手動で検査され、そして、１６００ｃｍ^―１近傍領域で同様の差が見られた。
イメージの中の全てのピクセルをＣＥＰ又はＬＰに分類するために、１６１０―１５３０ｃｍ^―１領域のＨＣＡが実行された。ＮＤＢＥ／ＬＧＤサンプルと同様に、ＣＥＰ及びＬＰに対応する２つの優勢なＨＣＡ群が見られる（図３Ｂ）。
しかしながら、それらの平均化スペクトル（図３Ｃ）間の違いは、ＮＤＢＥ／ＬＧＤサンプルほどは明白でなかった。
１５７０ｃｍ^―１において、ＣＥＰとＬＰの間にほんの小さいピークの違いがある；
１５４２ｃｍ^―１からＬＰにおける１５４４ｃｍ^―１へのＣＥＰのアミドＩＩバンドの２ｃｍ^―１シフト、；
ＣＥＰスペクトルでの１６３３ｃｍ^―１の小さいアミドＩの肩形状；
そして、ＣＥＰからＬＰへの０．１８のアミドＩ／アミドＩＩ強度比のより小さい増加。

ＥＡＣの大きな組織切片の細胞型のスペクトル特性
図４Ａは、組織学的にＥＡＣと定義された大きな組織（直径１ｃｍ）の厚さ３μｍの切片を示す。
このサンプルは切除片であり、生検サンプルの典型的な直径（１―２ｍｍ）より大きい。
このサイズのＥＡＣサンプルは、サンプル表面に細胞の線維層を、そして、その下部にはＣＥＰとＬＰの、不規則に間隔が空いた陥入を含む。
この研究はＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計を用いた生検材料の診断に焦点を置いたものであり、もし、生検材料が、１―２ｍｍの典型的サイズ以内で、ＥＡＣ領域からとられた場合には、それが線維層の組織型以外のものを含む可能性は少ない。従って、ＥＡＣサンプルの外側端部だけがイメージングされたことになる（図４Ａの黒い四角形で示される）。ＣＥＰもＬＰ組織型も線維層に存在しなかったと予測される。
ＮＤＢＥ／ＬＧＤ及びＨＧＤサンプルにおける特徴と同じ特徴を有するこれらの組織型が、この層において同定可能だったかどうか調べるために、同じ１６１０―１５３０ｃｍ^―１スペクトル領域を用いたＨＣＡが行われた。２つの優勢な群への明白な分類は成し遂げられなかった。
図４Ｂで、最初の２つの群のカラーマップが示されているが、同定可能な組織型への明白な識別はなく、これらの２つの群の平均化スペクトル（図４Ｃ）は、弱い、有意でないスペクトルの違いを示すだけであった。

上皮組織の疾患ステージスペクトル特性の比較
ＮＤＢＥ、ＬＧＤ及びＨＧＤ＋ＣＥＰ及びＳＱ ＥＰは、すべて上皮細胞型であるにもかかわらず、それらは異なる細胞構造を有する。
従って、ＣＥＰとＳＱ ＥＰのスペクトルの違いは、ＣＥＰの疾患ステージ間のスペクトルの違いより大きいと思われる。
図５Ａは、図１ＣからのＳＱ ＥＰスペクトルと図２Ｃ及び３ＣからのＮＤＢＥ／ＬＧＤ／ＨＧＤ＋ＣＥＰの平均との比較である。
ＳＱ ＥＰとＣＥＰの間の最も有意な差は、それらの２次導関数スペクトルの１３００―１０００ｃｍ^―１領域において最も明らかに見られる（図５Ａ）。
ＳＱ ＥＰからＣＥＰまでに発生する最も顕著な変化は以下の通りである：
１２９２ｃｍ^―１バンドの強度の増大；
１２１２及び１２０１ｃｍ^―１のバンドの強度の減少；
１１６８ｃｍ^―１の強度の減少及び１１５４ｃｍ^―１ピークの強度の増大；
１１１６ｃｍ^―１近傍のバンド組成の変化；及び
１０６６ｃｍ^―１ピークと１０３４ｃｍ^―１トラフ間の明瞭な変化。

図５Ｂは、ＣＥＰ（ＮＤＢＥ、ＬＧＤ及びＨＧＤ＋）及びＥＡＣ線維領域の中で発生している平均化された疾患ステージを比較する。
スペクトルの最も有意な違いはＮＤＢＥ／ＬＧＤとＨＧＤ＋／ＥＡＣの間にあり、図５Ｂの２次導関数１３００―１０００ｃｍ^―１スペクトル領域で最も顕著である。
ＮＤＢＥからＥＡＣへの移行を示すスペクトルの特徴は第２導関数スペクトルにおいて以下を含む。：
１２８３ｃｍ^―１のトラフの強度の増大；
１１５８ｃｍ^―１のトラフの強度の減少；
１１５４ｃｍ^―１と１１６７ｃｍ^―１バンド間の大きさの比率の変化、１１６７ｃｍ^―１のトラフもＨＧＤ＋／ＥＡＣステージの１１７０ｃｍ^―１へのシフト；
１１１６ｃｍ^―１のＮＤＢＥトラフからＬＧＤ／ＨＧＤ＋ステージでの１１１９ｃｍ^―１へのシフト及びＥＡＣステージでの１１２３ｃｍ^―１へのシフト

粘膜固有層の疾患ステージスペクトル特性の比較
ＢＥサンプル（ＮＤＢＥ／ＬＧＤ／ＨＧＤ＋）の中に存在するＳＱＬＰとＬＰは、同じ組織成分を含み、それゆえ類似のスペクトルを有すると予想される。
図６Ａでは、ＳＱＬＰを、ＮＤＢＥ、ＬＧＤ及びＨＧＤ＋そしてＥＡＣのＬＰのスペクトルの平均と比較している。
予想したように、ＳＱ ＬＰ及びＢＥ ＬＰスペクトルは類似であるが、それらを区別するために用いることができる特徴がある。
これらは、２次導関数中ではっきりと見える：
強度の増大及び１１５７ｃｍ^―１のトラフの１１５３ｃｍ^―１へのシフト；
１１１４ｃｍ^―１のＢＥ ?粘膜固有層の追加の構成要素（トラフ）；及び
１１２２ｃｍ^―１のトラフの減少。

図６Ｂは、ＥＡＣ線維領域と同様にＢＥ ＬＰ（ＮＤＢＥ、ＬＧＤ及びＨＧＤ＋）にも起こっている平均化された疾患ステージを比較する。ＮＤＢＥからＥＡＣへの進行の間に変化する、２次導関数の１３００―１０００ｃｍ^―１領域に顕著に見られる、いくつかのスペクトルの特徴があり、以下を含む：
ＮＤＢＥの１２３３ｃｍ^―１のトラフがまずＬＧＤで１２３２ｃｍ^―１にシフトし、そしてＨＧＤ＋で強度が減少する。そして、ＥＡＣで１２３０ｃｍ^―１への更にシフトする；
ＢＥの進行に伴い、１２１５ｃｍ^―１及び１０５３ｃｍ^―１のバンドの強度が減少する；
ＮＤＢＥの１１１４ｃｍ^―１のトラフがＨＧＤ＋ステージの１１１９ｃｍ^―１を経て、ＥＡＣステージの１１２２ｃｍ^―１にシフトする；
１０８０ｃｍ^―１のＮＤＢＥバンドの強度は減少し、ＬＧＤステージで１０７９ｃｍ^―１を経てＨＧＤ＋／ＥＡＣステージで１０７７ｃｍ^―１にシフトする；そして、１０４５ｃｍ^―１近傍のバンドの強度が減少する。

新鮮な生検材料のシングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計
全体で、患者１３１人からの４１４の生検材料の７９０の生検スペクトルが、シングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計を用いて測定された。可能な限り、少なくとも一つのスペクトルが、生検材料の各面で記録された。小さい生検材料の場合、１つのスペクトルだけが記録された；逆に、生検材料が大きい場合、それぞれの側で複数のスペクトルが記録された。スペクトルは、水及び水蒸気の寄与が修正され、アミドＩＩバンドの高さに標準化され、更なる分析の前にそれらの２次導関数の形式に変換された。これらの７９０のスペクトルのうち、８０は異常値として除外され、３７９の生検材料及び１２２人の患者から合計７１０の生検スペクトルが残った（表１）。処理後、スペクトルが、１８００―８５０ｃｍ^―１スペクトル領域の７５％以上において、平均±標準偏差から逸脱する場合、それは異常であると判断された。

生検スペクトルの優勢な細胞型によるグループ化
シングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計の更なる制限は、エバネセント波^３７が侵入する深さが限られていること（数ミクロン）である。それは細胞の表層だけが分析されることを意味する。
生検サンプルは、おおよそディスク形で、一方の面が露出面（ＳＱ ＥＰ又はＣＥＰ）に由来し、他方の面が下層の組織（ＬＰ）に由来する。侵入の深さの制限を克服するため、そして、これら２つの表面が異なる細胞型を含むので、疾患ステージによる分析の前に、常に生検材料の両面からのスペクトルが記録され、それらの優勢な細胞型に従って識別された。

以下の優勢な細胞型が存在すると推測された：
ＳＱに対するＥＰ又はＬＰ、ＮＤＢＥ及びＨＧＤ；及び
完全に癌化したサンプルに対するＥＡＣ。
ここで記載されたモデルのトレーニングデータから、ＬＧＤサンプルは意図的に取り除かれた。
これは、組織学者間のＬＧＤ診断の観察者間合意が低いためであり、ここでは、κ―値が０．２７^８の低さであることが報告され、これらの患者が切除治療法による治療をすべきか否かの議論もある^４。これらの理由でＬＧＤ患者は、分析の主要部分から除外された。しかし、これらの患者を予測するモデルの能力について後述する。

分類モデルの性能を最適化するために、スペクトルは、図７に図示したルートによって分類された：
(i)スペクトルは、まずＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ、又はＳＱに、割り当てられた；
(ii)その後、ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣのスペクトルは、ＥＰ又はＬＰ組織型に分類された；
それから（ｉｉｉa）上皮又は（ｉｉｉｂ）ＬＰ群は、付加的な誤分類コストを使用してＮＤＢＥ又はＨＧＤ／ＥＡＣ疾患ステージに更に分類された。
最終ステップにおいて、生検の両側面のスペクトルが組み合わされ、
ＳＱ／ＮＤＢＥ （臨床的に治療を必要でない群）、ＨＧＤ／ＥＡＣ（治療が必要な患者の群）、又は、疾患等級を決定するに十分なデータのない不確定の群、のいずれであるかの全体的な生検予測を得る。

(i) ＳＱ生検材料からのＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣの分類
ＳＱ（ＳＱ ＥＰ及びＳＱ ＬＰ）組織を他の全ての疾患ステージ（ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ）から効果的に分類するために、一個（患者）抜き交差検証（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｐａｔｉｅｎｔ−ｏｕｔ交差検証）を用いたＰＬＳＤＡを、７１０の個々のスペクトルの１３８５―１２３５及び１１９２―１１３０ｃｍ^―１スペクトル領域に適用した。
このスペクトル領域は、図５Ａ及び６ＡのＳＱ ＥＰとＳＱ ＬＰとの比較の差異に基づいて選択した。
ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣの生検材料を正しく識別することが、より重要であるので、３のＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ誤分類コストがこのクラスに割り当てられた。
対応する混同行列（ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ）は表２に示され、そして、ＳＱとＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣの間のスペクトルの違いが、図８Ａの平均化スペクトルで見られる。
図８Ｂは、このモデルの潜在変数（ＬＶ）スコアプロットを示し、２つの良好な分類が見られる。ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣの生検材料の検出感度は、９９％（５３６／５４３）であり、無病正診率は６４％（１０７／１６７）であった。

ＳＱ検出モデルの無病正診率は６４％で低かった。次のステップへ進む前に、ＦＴＩＲイメージの調査による情報が、モデルの性能の改善を支援するために用いられた。
ＳＱ ＥＰが、１１５３ｃｍ^―１で固有のバンドを備えているとわかった。
この群の平均積分は―５．６４８３×１０^―５±０．１５９８７×１０^―５であった、そして、他の全ての組織型／疾患ステージの平均積分は―０．００１５±６．４３６７×１０^―４であった。従って、この成分の積分が―８．５６３３×１０^―４以下である場合、それはＳＱ ＥＰと分類された。生検材料が、ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ及びＳＱ群に存在するスペクトルを有する場合、ＳＱスペクトルは固有のＳＱ ＥＰピークの存在が調査された。もしピークが存在する場合、先に誤分類されたＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣスペクトルはＳＱとして再分類された。この付加的なチェックにより、結果的に、誤分類された６０のＳＱのうちの２８が正しく再分類された。そして、ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣの生検材料のいずれも誤分類することなく、ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣ 対 ＳＱモデルの無病正診率を８１％（１３５／１６０）まで改善した。

(ii) ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣスペクトルにおける上皮と粘膜固有層の分類
その後、ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣスペクトルが、それらが主にＥＰ細胞型を表すのかＬＰ細胞型を表すのかに関して分析された。
ＦＴＩＲイメージングは、ＥＰからのスペクトルが、１５７０ｃｍ^―１の２次導関数ピークの存在及びアミドＩＩバンドのシフトにより、ＮＤＢＥ及びＨＧＤのＬＰから区別され得ることを明らかにした。
これに基づき、ｋは（クラスター分析を意味し、ここではｋ＝２（２つの群））、ＮＤＢＥ及びＨＧＤのシングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ測定の１６１０―１４６５ｃｍ^―１領域で行われた。
偏側性を予測する一個（患者）抜きの（leave-one-patient out）ＰＬＳＤＡモデルを構築するために、ＮＤＢＥ及びＨＧＤサンプルのＥＰとＬＰとの間の、１６１０―１４６５ｃｍ^―１スペクトルの違いを用いた。
図９は、モデル適用後のＮＤＢＥ、ＨＧＤ及びＥＡＣ群からのすべてのスペクトルのＥＰとＬＰの予測の平均を示す。

（ｉｉｉ a）上皮スペクトルにおける疾患ステージ分類
ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣスペクトルのＥＰ及びＬＰへの分類の後、これらのカテゴリは、ＮＤＢＥ又はＨＧＤ／ＥＡＣ疾患ステージに更に分類された。
図１０Ａは、ＮＤＢＥ又はＨＧＤ／ＥＡＣとして組織学的に分類されたＥＰサンプルからの平均的スペクトルを示す。ＮＤＢＥとＨＧＤ／ＥＡＣのスペクトルの違いは小さい。
１２００―９００ｃｍ^―１スペクトル領域（特に１０８２、１０４３及び９７４ｃｍ^―１のバンド）は、これらの疾患ステージの最大の違いを呈した。しかしながら、それらの標準偏差はオーバーラップするため、これらのバンドを単独で分類特性として使用することはできない。
そのかわりに４つの潜在変数である１１００―９００ｃｍ^―１スペクトル領域の一個（患者）抜き交差検証ＰＬＳモデルが構築された。図１０Ｂは、ＮＤＢＥ及びＨＧＤ／ＥＡＣの生検材料の分類に用いる最初の２つの潜在変数からのＰＬＳスコアを示す。ＰＬＳＤＡとその後のロジスティック回帰が、これらのＰＬＳスコアに実行され、誤分類コスト３が割り当てられた。なぜならＨＧＤ／ＥＡＣの生検材料の正しい分類がより重要であるからである。これらのコスト適用により、ＨＧＤ／ＥＡＣの感度８６％（７１／８３）及び無病正診率７２％（２２１／３０８）が達成された。これらのモデル性能の指標は、ステップ（ｉ）からの２８（３２中）の誤分類ＳＱスペクトルを含み、その後、本モデルのこのステップに入れた。但し、これらのスペクトルは、この群に分類されてはならなかったので、トレーニングデータから除外された点に注意することが重要である。ＳＱスペクトルは、もしＨＧＤ／ＥＡＣと同定された場合、誤って分類されており、もしＮＤＢＥであると同定された場合、正しく分類される。これは、我々があらかじめ定めた予測クラスが、ＳＱ／ＮＤＢＥ（治療が不要）対 ＨＧＤ／ＥＡＣ（治療が必要）だからである。

（ｉｉｉ ｂ）粘膜固有層スペクトルにおける疾患ステージ分類
図１１Ａは、ＮＤＢＥ又はＨＧＤ／ＥＡＣとして組織学的に分類された、ＬＰサンプルからの平均化スペクトルを示す。主なスペクトルの違いは１２９０―１２１０及び１１３０―８７０ｃｍ^―１領域に見られ、最大の違いを示す１２２１及び１０４７ｃｍ^―１のバンドをもつ。
ピーク位置の組合せ及び積分では疾患ステージを十分に識別できなかったため、１２９０―１２１０及び１１３０―８７０ｃｍ^―１領域の２群（ＮＤＢＥ対ＨＧＤ／ＥＡＣ）４潜在変数ＰＬＳモデル、ＨＧＤ／ＥＡＣ誤分類コスト３、が構築された。
図１１Ｂは、最初の２つの潜在変数からのＰＬＳスコアを示す。その後、ＰＬＳＤＡが、ＰＬＳ結果の分類のために用いられた。
２つの群の完全な分類が達成されなかったにもかかわらず、ＨＧＤ／ＥＡＣの同定は９３％（４１／４３）の感度及び７１％（９５／１３３）の無病正診率を有した。
これらのモデル性能の指標は、ステップ（ｉ）からの７（３２中）の誤分類を含み、その後、これは本モデルのこのステップに入れた。（ｉｉｉ ａ）のように、これらのスペクトルは、トレーニングデータから除外された。ＳＱスペクトルは、もしＨＧＤ／ＥＡＣと同定された場合は誤分類であり、もしＮＤＢＥとして同定された場合は正しい分類である。

分類の組み合わせは、生検材料の各側面に起因
前述のように、可能な限り、各々の生検では生検材料の各側面から一つずつ、合計２つのスペクトルが記録された。
ＢＥ ＥＰ及びＢＥ ＬＰ（ＥＡＣを含まない）の３４０の全ての生検材料のＡＴＲ―ＦＴＩＲ測定のうちの１５８が１つのＥＰ及び１つのＬＰスペクトルを有し、９６が２つのＥＰ表示を有し、４０が２つのＬＰ表示を有し、２３が単一のＥＰスペクトルだけを有し、そして、２３が単一のＬＰスペクトルだけを有した。
記録された複数のスペクトルのうち、様々なモデルの結果が、平均８７％の確率で一致した。予測スコアの平均化の後のＳＱ／ＮＤＢＥ対ＨＧＤ／ＥＡＣの感度は９０％、無病正診率は７１％であり、ＨＧＤ／ＥＡＣ誤分類コストは３であった。

臨床適用へのモデルの最適化
上記モデルの感度及び無病正診率は、臨床医の意志決定過程の補助のための、異形成ＢＥ生検スクリーニング装置として使えるように、臨床ニーズを満たすように更に最適化され得る。スクリーニング装置は、最小９５％の感度を要し、明白な臨床的利益がある限り、無病正診率は考慮されなくてもよい。このモデルの感度を高めるために、『不確定』な分類結果が含められた。このステップは、単一ステップ中の偽陰性及び偽陽性の数を減らすことにより、２つのクラスの確実性を改善するために用いられた。
以下の記載のいずれかでも真であった場合、不確定な結果が与えられた。第１に、生検材料のいずれの側からの分類予測も一致しなかった場合。
第２に、ｐ値に調整されたコストの両方が閾値を超えた場合、あるいは、両方のスペクトルが０．８の閾値より下の場合、つまり、そのモデルで、両方のスペクトルが互いに反対の分類群に分類される確信があった場合、あるいは、そのモデルで、両方のスペクトルが互いに反対の分類群に分類される確信がなかった場合、生検は不確定とされるべきである。
一方のスペクトルが閾値を超えて、他方のスペクトルが閾値より下にあった場合、生検は与えられた閾値を超えたスペクトルの分類を採用するだろう。
これらの規則を含めると、ＨＧＤ／ＥＡＣの全体の感度は９７％、無病正診率は８３％及び不確定率は１８％となった。

診断用モデルがどのようにＬＧＤ患者のために作動するかについて検査するため、１０人のＬＧＤ患者からの１４の生検材料の２７のスペクトルがテストされた。
上記の通りにスペクトルの両面からの予測を結合した後に、７つの生検材料は、ＳＱ／ＮＤＢＥ（２つがＳＱであった）と分類された；
２つはＨＧＤ／ＥＡＣであり、そして、５つは不確定であった。
ＬＧＤ生検の不確定率は３６％で他のクラスの不確定率１８％より高かった。

考察
ここで、我々は、シングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計がＨＧＤ／ＥＡＣ生検のためのリアルタイムのポイントオブケアスクリーニング装置として使われることを可能にする技術を解説する。
他の振動分光法の様に、ＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計は、その生化学的プロファイルに基づいて臨床組織診断を提供することができる。
他の方法が初期コストが高く、専門オペレータを必要とする生体内診断を提供しようとする中で、我々は看護師によって操作され得るより単純化された方法を提案する。
シングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計の大きな利点の１つは単一のサンプル・タイプに限られていないことと、サンプルに損傷が引き起こされないことである。従って、それが固体又は液体の分析に使われ得るし、そして、同じサンプルは必要に応じて従来の診断のために回すことができる。よって、用途の広いツールとなり、様々な臨床現場に適用できる。

ＳＱ、ＮＤＢＥ及びＨＧＤ／ＥＡＣ組織の間での生化学変化は、１２００―９００ｃｍ^―１スペクトル領域で、特にＥＰでの１０８２、１０４３及び９７４ｃｍ^―１のバンド、及びＬＰでの１２９０―１２１０及び１１３０―８７０ｃｍ^―１領域で見られる。１２２人の患者からの３７９の新鮮な生検材料の７１０のＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルによって構築された一個（患者）抜き交差検証を用いたＰＬＳＤＡを介して、これらの生化学変化がモデル化された。３つの可能な結果が得られた：
ＳＱ／ＮＤＢＥ、すなわち治療を必要としない；
ＨＧＤ／ＥＡＣ、つまり直ちに手当が必要；
不確定、つまり結果の信頼性がそれを分類するのに十分高くない。
各結果は関連する信頼性レベル（ｐ値）を有し、臨床意志決定の過程の補助のために臨床医に示され得る。このモデルは、９０％の総合的な精度（正確度）、９７％の感度、８３％の無病正診率（不確定結果を含まない）及び１８％の不確定率を有する。モデルがＬＧＤ患者で検査された場合、患者１０人からの１４の生検材料の５０％がＳＱ／ＮＤＢＥに分類され、１４％はＨＧＤ／ＥＡＣに、そして３６％が不確定に分類された。
理想的には、ＬＧＤ生検材料であればすべて、不確定、又はＨＧＤ／ＥＡＣに分類されるだろう。
但し、このモデルは、ＬＧＤ診断で観察者間合意が５０％未満だった組織学結果を使用して調整された。従って、モデルがＬＧＤ生検材料を一貫して単一の群に分類しないことが予期された。
しかしながら、ＬＧＤは、ＮＤＢＥと、ＨＧＤ／ＥＡＣのクラスの間にある異形成のステージであるため、結果の３６％が不確定であったことは見込みがある。
より多くのサンプルがあれば、追加のＬＧＤ群をモデルに含めることが可能であろう。

分光光度計が、我々がここで示したモデルをインストールされることになっている場合、予測不確かな生検材料を更なる分析に送るだけで、組織学サンプルの量の少なくとも５０％が軽減され得る。これは、組織病理学に送られるすべてのバレットの追跡調査の生検材料の９０％以上が正常であるという事実に基づく。この規模の組織学サンプルの量の軽減は、医療提供者にとってかなりのコスト削減となる。さらに、このモデルには、ＨＧＤ／ＥＡＣと予測される患者にとって有益である可能性がある。患者がＨＧＤ／ＥＡＣと予測される場合、これが正しいことは、このモデルでは８３％で確かである。臨床医がこのｐ値を評価し、内視鏡検査で見えた物及び患者の病歴に基づいたこの予測に同意する場合、患者は直ちに治療され得る可能性がある。

研究は、臨床使用には適さない、液体窒素で冷却されたシングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計を用いて実施された。
しかし、１０秒未満で研究室レベルの機器と同様のデータ品質を提示できると主張するポータブルな室温装置が利用可能である。
この装置を臨床適用するには、これらのより小さいベンチトップ型シングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計の１つについて、より多くの研究を行う必要がある。

ＦＴＩＲイメージングとＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計の肺癌診断への適用
ＦＴＩＲイメージング及びＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計は、上記の通り、肺癌にも適用された。
肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）の細胞及び疾患進行を特徴づけるために、単一の、脱パラフィンされた、組織学的に疾患の進行が明らかにされた領域を含んだ、厚さ８μｍの生検切片において、伝送モードのＦＴＩＲ分光学イメージングが使用された。
この生検材料に存在する疾患ステージは、正常、軽度／中度／重度の異形成及び上皮内の肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含んでいた。この種のサンプルの使用は、発癌に無関係に起り得る、サンプル間と患者間のスペクトルの違いを排除することが期待されていた。そのことによって、単一のサンプルがその位置のままで（in situ）正常から上皮内癌へ完全な疾患移行を示すことはまれとなる。本研究は、この種のサンプルのＦＴＩＲ分光イメージングを初めて示すものである。ＦＴＩＲイメージから得られた細胞型の情報は、患者２１人の新鮮な肺生検材料の小さいデータセットを分類するためのアルゴリズムの開発に使用された。そして、それらの疾患ステージの違いが評価された。

気管支生検材料のスペクトル特性を特徴づけるためのＦＴＩＲイメージングの使用
細胞型の違い
スペクトルの最大の違いは、組織内の細胞型の間に見つかるように思われる。従って、この研究では、細胞型の中で疾患ステージの違いを評価する前に、細胞型が、まず分類された。図１２は、気管支生検切片の細胞型と疾患ステージを同定する。図１２Ａは、上皮性疾患ステージ進行の領域を含む、ＥＰ及びＬＰの組織学的に定義済みの領域を伴う、Ｈ＆Ｅ染色された厚さ３μｍの肺サンプルの切片を示す。疾患の進行は、ＬＧＤ及びＨＧＤに相対するものとして、軽度、中度及び重度の異形成の構成によって特徴づけられている。軽度の異形成はＬＧＤ（低度異形成）に相当し、重度の異形成はＨＧＤ（高度異形成）に相当した。

図１３は、気管支生検材料の細胞型を分類する樹形図を示す。１６１４―１４６５ｃｍ^−１領域のＨＣＡ。気管支表層ＥＰと下層にあるＬＰのスペクトルの違いは図１２Ｂに示される。
細胞型の間で違いを示したスペクトルの全体を通していくつかの特性があった。ＦＴＩＲイメージのピクセルが１５９１、１３３４、１２１５及び１２７５ｃｍ^−１バンドの積分に色でコードされたときに、細胞型は容易に分類され得る。例えば、図１２Ｃ及びＤは、各々１５９１及び１３３４ｃｍ^−１バンドの積分を示す。細胞型を２つの異なる群に分類するために、１６１４―１４６５ｃｍ^−１領域でＨＣＡが実行された、そして、樹形図（図１３）からの２つの優勢な群が選択され、区別するため、ＥＰを赤色に、ＬＰを緑に、ピクセル色がコード化された（図１２Ｅ）。細胞型の間でスペクトルの違いが全部のスペクトル全体に見られたが、１６１４―１４６５ｃｍ^−１の領域が選択された。なぜなら、この領域でのスペクトルの違いは、主に疾患ステージの変化によってよりも、むしろ細胞型の変化に主に起因しているように見えたためである。

疾患タイプの違い
細胞型から生じるスペクトルの違いを疾患ステージの違いとして誤解することを排除するために、ＥＰ及びＬＰの疾患ステージは、別々に分析された。

ＳＮＲを向上させるために、イメージは４×４マトリックスにビニングされ、そこにおいて、各ピクセルは約１０．８×１０．８ ｍのサイズを有した。
しかしながら、疾患ステージの区別に用いることができる小さい信号の差を正確にデコンボリューションするためには、これは、まだ不十分だった。
ＳＮＲ向上のためにイメージの広域からのスペクトルが選択され、平均化された。

上皮の分析
イメージの合計１５の領域が、ＥＰに沿って手動で選択された（図１４Ａ及びＢ）。
オリジナルの解像度において投影されたピクセルサイズが２．７×２．７ ｍである領域１―１５は以下のピクセル数を含む。
領域１、２２２４；領域２、９９２；領域３、１３９２；領域４、１３４４；領域５、８８０；領域６、２１４４；領域７、３７４４；領域８、３３７６；領域９、２９９２；領域１０、４７２０；領域１１、５０５６；領域１２、２４１６；領域１３、２７２０；領域１４、２３５２及び領域１５、３２８０。

Ｈ＆Ｅ染色した切片の組織学分析によると（図１２ Ａ）、領域１―３は正常、領域４―６は軽度異形成、領域７―９が中度異形成、領域１０―１５は重度異形成／上皮内癌を示した。
これらの各領域の中のスペクトルは、平均化され、それらのアミドＩＩ強度の標準化の後、比較された（図１４Ｃ及びＤ）。
１１６３、１０７４及び１０３６ｃｍ^−１のトラフと１０９３ｃｍ^−１のピークを含むいくつかのスペクトルの違いがあった：これらの違いは、２次導関数スペクトルにおいて、はっきりと見えている。
上述したすべてのバンドは、正常ＥＰ（赤色：領域１―３）からＥＰの患部組織（黄色／青色：領域４―１５）にいくにつれて強度が減少した。
１１６３及び１０３６ｃｍ^−１の両方の積分において、正常と異形成／上皮内癌との間のマン―ホウィットニーＵ検定でのｐ値は０．００４４であり、正常と異形成／上皮内癌との間の差は有意であった。但し、軽度／中度／重度異形成と上皮内癌との間には有意なスペクトルの違いがなかった（領域４―１５）。

単一のピークに相対するものとして、一つのスペクトル領域を選択することが、疾患ステージの解明に役立ったかどうか判断するために、３つの成分のＰＣＡが、１１００―１０３０ｃｍ^−１のスペクトル領域で実行された（図１５）。ＰＣ１は他の異形成の領域から正常を分類し、ＰＣ３は中度異形成を重度異形成から分類する。しかしながら、軽度異形成と他の異形成領域の間には明らかな分類はなかった（図１５Ａ）。手動で選択されたＥＰの各領域を２つに細分割した後にスペクトルを平均化することによって、疾患進行の良好な分類を保持することが、まだ可能であった。しかしながら、より小さな区画ではＳＮＲの低下のため、鮮明な分類は失われる。

粘膜固有層の分析
ＳＣＣは表層の上皮で生じるので、スペクトルの主な違いは細胞のこの層で起こると考えられる。
異形成の進行が下層の組織のスペクトル特性にも影響を及ぼしたかどうか調査するために、１５のＬＰの領域が、マッピングされたＦＴＩＲイメージ（図１６）から手動で選択された。
図１７は、これら１５の領域から平均化された絶対スペクトル（上部）と２次導関数スペクトル（下部）を示す。
オリジナルの解像度において投影されたピクセルサイズが２．７×２．７ ｍである領域１―１５は以下のピクセル数を含む：領域１、９３６０；領域２、５２３２；領域３、５２６４；領域４、５００８；領域５、３３７６；領域６、４８９６；領域７、５５３６；領域８、６５４４；領域９、６２８８；領域１０、７８７２；領域１１、６５７６；領域１２、９０７２；領域１３、９２９６；領域１４、１０７０４及び領域１５、４２８８。

ＬＰの疾患ステージは、ＥＰの隣接領域の組織病理学に従って定められた：
領域１―３、正常；
領域４―６、軽度異形成；
領域７―９、中度異形成；及び
領域１０―１５、重度異形成／上皮内癌。

スペクトルの違いは、２次導関数における１３３４及び１２７９ｃｍ^−１のトラフ、及び１２１５及び１０６６ｃｍ^−１でのピークで明らかであった。疾患の進行とともに、これらのバンド強度は減少した。疾患が進行すると、１２７９ｃｍ^−１のバンドと１０８０―１０５０ｃｍ^−１のスペクトル領域もいくらかシフトを呈した（図１７Ａと図１７Ｂ）。図１６Ａ―Ｄは、各々１３３４、１２７９、１０６６及び１２１５ｃｍ^−１バンドの積分の２次導関数を示す。１３３４、１２７９及び１０６６ｃｍ^−１バンドの積分は、正常から重度の異形成／上皮内癌まで徐々に強度の低下を示した。１２１５ｃｍ^−１の積分（図１６Ｄ）も正常と異形成状態の間で強度の減少を示した。但し、異形成のステージの間に有意差はなかった。

ＬＰの疾患ステージ間で最大の違いを呈したのは、１３５０―１１９６ｃｍ^−１と１０９７―１０４１ｃｍ^−１のスペクトル領域である。図１８Ａは、１５の選択領域の３つの主成分スコアの散布図を示す。ＦＴＩＲイメージの領域が４つのファクターで細分割されると、疾患ステージ間で同じ分類が見られることができた。しかしながら、更に細分すると、この分類は失われた。ＬＰの単一ピーク積分の分析では、ＥＰの場合より、正常から上皮内癌までの移行がより緩やかであった。これは、より多くのピクセルが平均化されたことにより、ＬＰにおいて、ノイズ比がより高くなったことに起因すると考えられる。

新鮮な気管支生検材料のシングルエレメントＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計
ＡＴＲ―ＦＴＩＲ気管支生検材料の偏側性の評価
脱パラフィンした厚さ８μｍの気管支生検材料のＦＴＩＲイメージの上記分析に基づき、２つの細胞型が、典型的な大きさの生検材料（直径１―２ｍｍ及び厚さ最高１ｍｍ）で予測された。生検材料は概ねディスク形であり、ＥＰ細胞が表面に、ＬＰ細胞がその下部の側にあると予測される。

ＡＴＲプリズム上での生検材料の方向付けはわかっておらず、もし生検材料がねじられるか又は折り畳まれていた場合、表面及び下位の層の両方がプリズムと接触するように、生検材料が方向付けられた可能性がある。従って、ＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計だけの使用では、生検材料の偏側性は、決定され得ない。

ＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計に記録された新鮮な生検材料のスペクトルを、優勢な細胞型（すなわち表層ＥＰ又は下層のＬＰ）に基づいた群に分類するために、ＨＣＡでは、１６１４―１４６５ｃｍ^−１のスペクトル領域が使われた。このスペクトル領域が、主に細胞型の違いから生じる違いを含むとわかった。３つの主要クラスタがＨＣＡから作り出され、これらのクラスタからの２次導関数スペクトルの平均が図１９に見られる。ＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルからのスペクトル情報を用い、３つのスペクトルを細胞型の異なる群に割り当てることができた。１つのスペクトルは、１５７０ｃｍ^−１のピークと１６３３ｃｍ^−１のより顕著なアミドＩの肩形状があったので、ＥＰ細胞（図１９の赤色スペクトル）から生じると考えられた。
これは、ＦＴＩＲイメージングの調査（図１２Ｂ）の所見と一致した。第２の主要な細胞型はＬＰ（図１９の青色スペクトル）由来であった。これは、１５７０ｃｍ^−１の２次導関数のピークの欠如、１６３３ｃｍ^−１での不明瞭なアミドＩの肩形状により、主にＬＰに割り当てられた。スペクトルの最終的なクラスは、そのＬＰ／ＥＰの平均化スペクトル（図１９の黒色スペクトル）との類似性に基づき、ＥＰとＬＰの混成であると予測された（図１９の緑色スペクトル）。

表４は、図１９の３つの考えられるクラス全体のスペクトルの分布を示す。単一の生検材料からの２つのスペクトルが、生検材料のどちらかの側からのスペクトルを含んだかどうかを、表４Ｂは示す。
全体で、２２の生検材料は２つの細胞型を含むシグネチャーを示した、そのうち、わずか２つが下部にあるＬＰ側からのスペクトルを示した。
直径１―２ｍｍサイズの生検材料の作成に小さな鉗子が使われた。しかし、生検材料の厚さは、計測が困難であり、この生検材料は１ｍｍ未満であると考えられた。この厚さの生検材料にさえ、ＥＰ及びＬＰの両方が存在すると思われる。
なお、生検材料がＥＰスペクトル、ＬＰスペクトルのどちらかひとつだけを有した所では、生検材料の両面が測定され、同じ側が二回測定されるように生検材料の方向が向いていた可能性がある。

肺の疾患ステージにおけるＡＴＲ―ＦＴＩＲの違いの評価
疾患状態の正確な識別のために。異なる群の疾患ステージが評価される前に、３つの優勢なＥＰ及びＬＰ群が、まずＨＣＡ（上を参照）からつくられた。

上皮からのスペクトルの疾患ステージ比較
図２０は、主にＥＰを含む生検材料の正常なＳＱ、ＬＧＤ、ＨＧＤ、及び癌の疾患状態における平均化された２次導関数スペクトル間の違い示す。
疾患状態の主要な違いは、１１３０と９００ｃｍ^−１の間に発生していたが、そこでの主な寄与因子はＤＮＡ／ＲＮＡ及びグリコーゲン／糖タンパク質の違いであると考えられる。そして、それは、ＢＥ組織の疾患変化についての以前の研究に基づいて、疾患ステージ間の大部分の変化が予想されるところであった。１２７３ｃｍ^−１のピークは、正常組織では、他の病気にかかったＥＰシグネチャーと比較して大きかった。そして、癌組織の１７３８ｃｍ^−１のトラフは他の全ての疾患ステージより顕著だった。１７３８ｃｍ^−１は、１５で示される脂質スペクトルに基づいた脂質に暫定的に起因するものである。

粘膜固有層からのスペクトルの疾患ステージ比較
気管支異形成はＥＰにおいて発生するので、ＬＰ組織での変化はわずかであることが予想された。しかしながら、単一生検材料のＦＴＩＲイメージングの調査が、ＬＰが、隣接するＥＰの疾患ステージ特有の特徴も示す可能性を示唆した。図２１は、正常なＳＱ、ＬＧＤ、ＨＧＤ及び癌ＬＰ組織に分類された生検材料のＬＰスペクトルにおいて、実際にスペクトルの違いが存在していたことを示す。但し、含まれるスペクトル、患者及び生検材料の数が少なかった点に注意されなければならない。

通常のＬＰは、１７４３ｃｍ^−１で２次導関数の脂質のトラフを示す。そこでは、ＬＧＤ、ＨＧＤ及び癌が１７３８ｃｍ^−１でシフトするトラフを有し、癌サンプルのトラフは、他の疾患ステージより非常に大きい。それゆえ、正常から癌へと、１３６０ｃｍ^−１の２次導関数のピークが減少し、低い周波数への合計２ｃｍ^−１シフトしていくことが見られる。１１６３―１１７１ｃｍ^−１間のスペクトル領域の変化も観察された。通常のＬＰは、１１６３ｃｍ^−１で単一の幅広いピークを有した。そこでは、ＬＧＤ及びＨＧＤが１１６３と１１７１ｃｍ^−１のバンドの組合せを有し、癌は、１１７１ｃｍ^−１の非常に大きなトラフ（図２１Ｂ）を有する。これは疾患ステージの進行に伴う付加的な生化学成分の出現を示唆する。

混合細胞型からのスペクトルの疾患ステージ比較
混合細胞型の群は、各疾患群内での変化が多すぎるため、それらを区別するために使用され得るいかなる重大なスペクトルの違いをも抽出することができなかった。プリズム上での生検材料の方向付けの不確実性により、細胞型が混合する可能性がある。例えば、生検材料がねじれた場合、結果として生じるスペクトルが表層のＥＰと下層にあるＥＰを含む。ＢＥ及び肺癌を調査する際に、新鮮な生検材料の臨床診断のためのＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計を使用する主な欠点の１つは、プリズム上へのその方向付けであった。新鮮な肺生検材料が記録されたのは、偏側性の問題が知られる前であった。従って、将来、収集されたデータが記録される場合、生検材料がねじれていないことや折り畳まれていないことを確認するのを助けるためのプロトコールが重要になるであろう。これは、複数の細胞型がプリズムに接触している、というようなことを防止する。

結果
ＢＥの主要な研究と同様に、ＦＴＩＲイメージングは、典型的な細胞型のスペクトル及び疾患タイプ・スペクトルのライブラリ構築のために用いられた。分析には、脱パラフィンした厚さ８μｍの、正常からＳＣＣ ｉｎｓｉｔｕ（扁平上皮内癌）までの疾患の完全な段階的変化を含む、一つの肺生検材料を用いた。細胞型は有意に異なり、１５９１、１３３４、１２１５及び１２７５ｃｍ^−１バンドの積分により、又は１６１４―１４６５ｃｍ^−１領域のＨＣＡ（スペクトルを異なる２つの細胞型群に分離するため用いられる）により容易に識別された。肺組織のスペクトルによる細胞型の識別に関する文献情報は殆ど存在しない。Ｂｉｒｄらは、単一サンプルの中での異なる細胞型の識別のためにＦＴＩＲイメージングを用いた一例を示している。これは１０のクラスのＨＣＡを用いて行われた。そして、それは細胞／組織型（例えば線維芽細胞を有するＬＰ、多数のリンパ球、血管、マクロファージ及び粘液性腺を有するＬＰ）に割り当てられた。しかし、彼らは、これらの細胞型から生じており、そしてここのデータと比較され得ないスペクトルの特徴を特定しなかった。しかし、ここで見つかる細胞型の違いは、ＢＥ中のＥＰとＬＰの間で見つかる細胞型の違いと類似性を持つ。この類似性は、２次導関数の１６３３ｃｍ^−１のスペクトル領域にあり、そこには、ＢＥ ＣＥＰと肺ＥＰに存在し、ＢＥ ＬＰと肺ＬＰには存在しないアミドＩの肩形状があった。但し、肺ＥＰのアミドＩの肩形状は、ＢＥのＦＴＩＲイメージデータほど顕著でなかった。ＢＥのＦＴＩＲイメージ情報の１６１４―１４６５ｃｍ^−１スペクトル領域での偏側性の決定に使用できる他の顕著な特徴は、１５７０ｃｍ^−１の２次導関数のピークであった。肺ＥＰと肺ＬＰの間の、この領域でのＦＴＩＲイメージングデータの違いは顕著ではなかった。
にもかかわらず、新鮮な肺のＥＰやＬＰの生検材料のＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルにおける１５７０ｃｍ^−１のバンドの違いは、新鮮なＢＥ生検材料のＥＰやＬＰのＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルの間で見いだされた違いに、更に類似していた。ＦＴＩＲイメージデータにおいてこの違いが明らかでなかった理由は不明である。しかし、それはＩＲスペクトルに影響を及ぼす脱水の効果がイメージング・サンプル・スペクトル上で現れたのかもしれない。しかしながら、画像全体のスペクトルの整合性が原因で、１６１４―１４６５ｃｍ^−１での違いが、タンパク質タイプの実質的な違いから生じた可能性が最も高い。ＬＰは、上皮より多くのコラーゲンと血管を含む線維組織のネットワークから成る構造組織である。正常なＥＰは、上皮細胞の薄層で、ＬＰより多くの細胞を含む。１５６０―１１９０ｃｍ^−１スペクトル領域でのＥＰとＬＰのスペクトルの違いは、この領域に影響しそうな要因が複雑に重なり合うため、いかなる個別の要因にも割り当てられなかった。しかし、これらの違いは、より多くの、炭水化物のような代謝産物を含むＥＰ細胞の層と比較して、ＬＰ中の線維結合組織の相違に関連がありそうである。

ＥＰ及びＬＰの中の疾患ステージの違いは、主に１３５０―１０００ｃｍ^−１のスペクトル領域にあった。ＥＰは、正常と異形成／組織内癌の間で、１１６３、１０９５、１０７４及び１０３６ｃｍ^−１におけるバンドの積分に違いを示した。しかし、中間の異形成ステージの間では、これらの成分の積分強度を比較するとき、有意差は見つからなかった。但し、疾患ステージ間のなんらかの差異は、１１００―１０３０ｃｍ^−１のスペクトル領域のＰＣＡにより更に分析され得る。しかしながら、これらのスペクトル変化の有意差を確認するには、研究においてより多くのサンプルが必要である。ここで報告されたスペクトルでの変化とモデル化合物の比較は、１０７４及び１０３６ｃｍ^−１における変化がグリコーゲン関連化合物の変化に起因している可能性を示唆する。Ｃｈａｕｄｈｒｉらによる肺癌細胞株 対 正常細胞株に関する最近の生化学研究は、正常細胞から癌細胞への変化に伴い、グルコースを含む代謝産物が減少することを示唆する。そしてこれは上記の所見をサポートしている。

疾患ステージ間のスペクトルの違いは、ＬＰにおいて、より顕著だった。主要な違いは、１３３４、１２７９、１２１５及び１０６６ｃｍ^−１バンドで起こった。１３５０―１１９６及び１０９７―１０４１ｃｍ^−１のスペクトル領域を用いたＰＣＡによって疾患ステージ間の違いが更に分析された。１０６６ｃｍ^−１周辺のバンド形の変化で、１つ又は複数の生化学成分の導入及び／又は変化を示したことは特に興味深い。癌の進行が炎症反応を引き起こすことが知られている。添加されたこのような成分は、炎症プロセスに応答してその領域に集められた白血球や他の細胞／タンパク質によって生じた可能性がある。１０６６ｃｍ^−１領域での変化は、炎症反応により増加した細胞由来のタンパク質と関連したＤＮＡの量の増加に起因している可能性があった。しかしながら、他のDNAバンドにおいては、比例変化は見られなかった。

Ｂｉｒｄらは、１２３５、１０９０、１０６５及び９６５ｃｍ^−１での、ＳＣＣと正常組織の間の変化を述べ、その変化はＤＮＡの変化に因る。これらは、現在の研究で見られる１０９５及び１０６６ｃｍ^−１のバンド変化と部分的に類似している。しかし、Ｂｉｒｄらの研究においてＥＰ及びＬＰが識別されたかどうか明らかでなかったので、直接比較をすることは困難である。ＹａｎｏらによるＳＣＣと正常肺組織についての別のＦＴＩＲイメージング研究は、アミドＩＩバンドで標準化した時の、１０４５ｃｍ^−１のバンドの高さに基づいた識別を報告した。彼らは、FTIRトランスミッションモードにおける、すり潰された新鮮な生検材料を用いた以前の研究に基づいてこの変化をコラーゲンに起因するとした。１０４５ｃｍ^−１のバンドがここでは見つからなかったが、同じ成分との関連性が示唆される１０３６ｃｍ^−１のバンドは見られた。しかし、この確認には、より多くの詳細な分析が必要である。上述した、グリコーゲンにおいて可能な変化と同様に、ＤＮＡ／ＲＮＡは、１１００―９００ｃｍ^−１のスペクトル領域で、投稿者達によく知られている。ＥＰがより多くの細胞、よって、より多くの核を含むため、ここで報告されるこの１１００―９００ｃｍ^−１領域のいくつかの変化がＤＮＡの変化に起因していた可能性がある。

主にＥＰ群からの新鮮な生検材料のＡＴＲ―ＦＴＩＲ測定の間の疾患ステージの違いは、１２７３と１７３８ｃｍ^−１のバンドで見られた。しかし、これらのバンドは、正常組織と癌組織の違いを示すだけだった。しかしながら、１２７３ｃｍ^−１のこのピークは、正常組織において、他の、病気のＥＰシグネチャーと比べ、より大きく、このバンドは、ＦＴＩＲイメージングで裏付けられなかった。癌組織の１７３８ｃｍ^−１のトラフは、他の全ての疾患ステージより顕著だった。スペクトルのこの一部は、脂質に暫定的に割り当てられた。しかし、このバンドはＦＴＩＲイメージングデータで観察されなかった。そして、それはイメージング・サンプルが脱パラフィンされていること、そして、このプロセスが脂質成分を洗い流したであろうという事実に起因する可能性がある。脂質変化があったかどうかの判断には、より詳細な分析を要する。

結論として、厚さ８μｍの肺生検材料切片のＥＰとＬＰ間のスペクトルの違いが２次導関数のスペクトルの１６１４―１４６５ｃｍ^−１領域に見え；それらは、ＢＥ生検のＣＥＰとＬＰの間にも観察された違いである。その組織切片の上皮ＥＰにおける疾患の進行（ＳＱから上皮内癌まで）を示すスペクトルのシグネチャーは、ＥＰ、ＬＰ両方の１３５０―１０００ｃｍ^−１領域に見られた。１１６３、１０９５、１０７４及び１０３６ ｃｍ^−１でのＥＰの特徴は、積分され、ＳＱ ＥＰ組織と、異形成／上皮内癌組織の間で明白な差異を示した。但し、ノイズ比は、積分のみで異形成の疾患ステージ間を識別するに十分な高さはなかった。１１００―１０３０ｃｍ^−１スペクトル領域のＰＣＡは、異形成のステージの更なる識別ができたことを示した。１３３４、１２７９、１２１５及び１０６６ｃｍ^−１におけるＬＰの特性（フィーチャー）の積分は、ＳＱから上皮内癌への明白な進行を示した。この進行は、１３５０―１１９６と１０９７―１０４１ｃｍ^−１スペクトル領域のＰＣＡを使用して、更に解析できる。

ＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光光度計で記録される新鮮な肺生検材料データセットの疾患クラスごとのサンプルの数は少なかった。生検スペクトルは、それらの優勢な細胞型（ＥＰ、ＬＰ、及びその混合のクラス）に分類できた。細胞型の間の違いは、１６１４―１４６５ｃｍ^−１スペクトル領域で見られ、ＦＴＩＲイメージデータにおける細胞型の違いと整合する。
主にＥＰスペクトルを含んだスペクトルが、２次導関数のスペクトルの１２７３及び１７３８ｃｍ−１のバンドで、ＳＱと癌の間の違いを示した。しかしながら、これらのバンドは、ＬＧＤとＨＧＤの疾患クラスの識別に用いることができない。

酢酸の影響
２つの実験が行われた：
１．酢酸が、制御環境にある組織に及ぼす可能性のある影響を試験するために、２つの濃度の酢酸が、豚の食道に吹き付けられた。その後、食道の小さい部分が切除され、ＩＲ分光光度計で測定された。
２． ヒト組織上への、酢酸、喉スプレー、１／１００，０００のアドレナリン、ＮＡＣ及び喉スプレーの影響が、これらの薬剤を使用した患者と、使用しない患者のヒト生検組織のＩＲ測定の比較によって分析された。
その後、ヒト及び豚の組織における酢酸と関連したスペクトル変化が比較された。

（ｉ）豚のサンプル
方法
２匹の異なるブタからの食道が使われ、そして、実験はブタが屠殺されたほぼ３時間後に行われた。食道は、屠殺場から氷上で研究室まで運ばれ、それから解剖され、食道に残っている食べ物すべてを取り除くために蒸留水で洗浄された。

表５は、各条件において記録されるサンプルの組数及び測定の数を示す。すべてのサンプルはピンセットで扱われ、そして、測定の合間にサンプルは持ち上げられ、このプリズムは蒸留水で洗浄後、乾燥させた。

蒸留水で食道を完全に洗浄した後、２つのサンプルが各々から切り出され、測定された。
その後、食道の一部は２．５％の酢酸で洗浄された；組織は切られて直ちに測定された。
５％の酢酸を用い、食道の新しい領域で、これが繰り返された。

測定パラメータ
１回反射型ダイヤモンドＡＴＲプリズム（シングルバウンスダイヤモンドＡＴＲプリズム）を取り付けたパーキン・エルマー・Ｓｐｅｃｔｒｕｍ２とＤＴＧＳ検出器が用いられた。スペクトルは、スキャンで１ｃｍ^―１の分解能で、４０００と４００ｃｍ^―１の間の吸光度モードで１０回の同時加算及び平均化スキャンで記録した。その後、ＳＮ比を改善し、ヒトでの酢酸実験に用いられた分光計のＳＮ比と等しくするために、スペクトルの分解は、後に４ｃｍ^―１まで減らされた。

分析
図２２は、豚の組織上への酢酸の影響を示す。
その組織では、酢酸濃度の増加に伴い、明瞭で一貫したバンド強度の変化があり、５％酢酸の標準スペクトルに直接対応する。
この強度変化をたどるバンドは、１７０９、１７７４４、１３９７、１３６６、１３６６、１３１２、１２７９、１０５０及び１０１３ｃｍ^―１である。

蒸留水で洗浄された組織の１３９９ｃｍ^―１のバンドが、２．５％と５％の酢酸で洗浄された組織サンプルでは１４１２ｃｍ^―１へシフトされて見える。
このバンドは、標準スペクトルに一致していないが、これは、おそらく立体構造変化に起因する。このバンドの主成分はタンパク質のアミドＩＩＩ結合であり、このことは、タンパク質の立体構造変化の仮説を支持するものである。

酢酸がもたらされた組織から測定されたスペクトルは補正することができ、これは、サンプルスペクトルから酢酸のスペクトルを単純に差し引き、その後、アミドＩＩＩバンドの補正シフトを行うことにより可能である。従って、ここで示される証拠は、酢酸使用の有無による我々のアルゴリズムの活用を支持する。

ヒト組織
方法
通常の内視鏡検査の際、サンプルはＵＣＬでＢＯＯＳＴ研究に同意した患者から切除された。
サンプルは氷上で保湿密封された環境で、測定される研究室に運ばれた。ある患者については、処理の間中、食道表面にはいかなる局所用薬物も吹き付けられなかった。これらの患者は、この分析の『薬剤なし』に該当する。
ある患者については、以下の薬の１つが食道上に吹き付けられた：
２．５％の酢酸、１：１００,０００のアドレナリン、ＮＡＣ又は喉スプレー。
表６は、患者、サンプル及びスペクトル数の内訳を示す。

測定パラメーター
スペクトルは、Bruker Optics IFS 66/sＦＴＩＲ分光計を用いて４０００と４００ｃｍ^―１の間の吸光度モードで記録された。液体窒素で冷却したＭＣＴ―Ａ検出器、臭化カリウムビームスプリッタ、そして、炭素グローバーが使われた。開口部は１．５ｍｍにセットされ、４０ｋＨｚのスキャナ速度が使われた。分光計は、乾燥空気によってパージされた。すべての測定値は、４ｃｍ^―１の分解能で記録され、ほぼ±１ｃｍ^―１のピークの精度を与えた。スペクトルはＺｎＳｅオプティクスを有するＳｅｎｓＩＲ ３―反射シリコン・プリズムのＡＴＲモードで記録され、清浄なプリズム面の１０００のバックグラウンドの干渉図形は平均化された（水と１００％エタノールでプリズムの慎重な洗浄後に取得）。そして、プリズム上でのサンプルの方向付けの後、５００の干渉図形が平均化され、単一のサンプル吸収スペクトルが合成された。すべてのＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルは、ＢｒｕｋｅｒＯＰＵＳ６．５ソフトウェアを使用して記録された。

酢酸の影響の分析
図２３は、酢酸スプレーの有無によるヒト組織での比較を示す。酢酸がスペクトルに影響を及ぼすという証拠がないことが見られる。若干の小さいスペクトルの違いが１０５１と１０３０ｃｍ^―１周辺にある。これらのバンドの違いが、スペクトルの酢酸吸収領域において見られるが、スペクトルでは他に酢酸によると思われる変化は全くない。これらの変化は、両群のデータの標準偏差範囲内にあり、統計上差はない。

この実験での豚の組織の酢酸の影響は、ヒトのサンプルで示される影響よりはるかに大きかった。これは、豚のサンプルが、食道が水平状態に保たれ、酢酸を長時間、組織の上に留めることができる制御された環境において、調製され、分析されたため、予想されていたものである。
実際は、酢酸がヒトの生体内に適用される場合、それは急速に胃の中に流出して、唾液により更に洗い流される。

１：１００,０００のアドレナリンの影響の分析
その影響は図２４に示される通りであり、アドレナリンが用いられたヒト組織と薬が使われなかったヒト組織の間でわずかな変化しかなかった。これらの変化で、統計的な有意差はない。

ＮＡＣの影響の分析

その影響は図２５に示される通りであり、ＮＡＣが使われたヒト組織と薬が使われなかったヒト組織の間で、わずかな変化しかなかった。これらの変化で、統計的な有意差はない。

喉スプレーの影響の分析
その影響は図２６に示される通りであり、組織の喉スプレーの有無の間でスペクトルの違いが示される。１２９４と１２１３ｃｍ^―１間の変化は、統計的に有意な変化である。しかしながら、これらは、アルゴリズムで一般的に使われないスペクトル領域で見られるので、アルゴリズム・パフォーマンスへ影響はしそうでない。１１１０ｃｍ^―１より下の軽微なスペクトル変化は、統計的に有意でない。

表
表１．外れ値の除去の後、組織学的診断により、各疾患ステージで記録した、患者、生検材料及びＡＴＲ―ＦＴＩＲスペクトルの総数。

表２．ＳＱスペクトル 対 ＮＤＢＥ／ＨＧＤ／ＥＡＣスペクトルのＰＬＳＤＡ予測のためのコンフュージョン（混同）マトリックスで、ＰＬＳＤＡは１３８５―１２３５及び１１９２―１１３０ｃｍ^―１領域に適用した一個（患者）抜き交差検証を有する

表３．生検の基礎毎に不確定群を含む場合の、ＳＱ／ＮＤＢＥ又はＨＧＤ／ＥＡＣの予測のためのコンフュージョンマトリックス。

表４．正常の細気管支生検材料の偏側性の分布。
Ａ）可能なＩＲ細胞型全体での全てのスペクトルの分布
Ｂ）同じ生検材料からのスペクトルのペアの分布：
それらが同じ細胞型、異なる細胞型を有したかどうか、又は、生検材料が１つのスペクトルだけを有したかどうか。

表５．記録された豚データ（各条件で記録されるサンプル数及び測定数）。

表６．ヒト組織データ（患者、サンプル及びスペクトルの数の分析を示す）。

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３７． Ｇａｊｊａｒ，Ｋ．ら フーリエ変換赤外分光法及び／又は判別分析に連結するラマン分光法を使用したヒトの脳腫瘍の診断の分離。Ａｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５，８９（２０１２）
３８． Ｄｏｒｌｉｎｇ，Ｋ．Ｍ．＆ Ｂａｋｅｒ、Ｍ．Ｊ．急速なＦＴＩＲ化学的イメージング）：ＦＰＡ検出器の強調。Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，４３７−４３８ （２０１３）
３９． Ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｓ．ＳＩＭＰＬＳ：部分的最小二乗回帰に代わるアプローチ。Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ１８，２５１−２６３（１９９３）

Claims (17)

1. 対象から得られたサンプルを分析する方法であって、
   ａ）ＦＴＩＲ分光光度計を用いて前記サンプルをスキャンすることによって生成されたスペクトルを提供するステップと、
   ｂ）各生成された前記スペクトルに従って前記サンプルの細胞を同定、又は分類するステップと、を備える方法。
2. 前記スペクトルがＡＴＲ―ＦＴＩＲ分光計から得られたものであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 前記サンプルが上皮組織のサンプルであることを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 前記上皮組織が食道から得られたものであることを特徴とする、請求項３記載の方法。
5. 前記サンプルを得るステップを含むことを特徴とする、請求項１乃至請求項４のいずれか一項記載の方法。
6. 前記スペクトルを得るステップを含むことを特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれか一項記載の方法。
7. 前記細胞の分類ステップが、細胞の正常細胞と非正常細胞への分類を含むこと特徴とする、請求項１乃至請求項６のいずれか一項記載の方法。
8. 前記細胞の分類ステップが、細胞型による細胞の分類を含むことを特徴とする、請求項１乃至請求項７のいずれか一項記載の方法。
9. 前記細胞の分類ステップが、疾患状態への細胞の分類を含むことを特徴とする、請求項１乃至請求項８のいずれか一項記載の方法。
10. サンプル、又はサンプル由来のスペクトルの画像を作り出すステップをも含むことを特徴とする、請求項１乃至請求項９のいずれか一項記載の方法。
11. 前記サンプルの水和や、いかなる薬剤、他の医薬品、又はサンプリングの前に前記対象に与えられたかもしれない、他のいかなる作用剤をも考慮に入れための前記スペクトルのシフト、又はキャリブレーションのステップも含むことを特徴とする、請求項１乃至請求項１０のいずれか一項記載の方法。
12. 請求項１乃至請求項１１のいずれか一項記載の方法における分類、シフト及び画像生成ステップのうち少なくとも１つを行うためのコード手段を備えたコンピュータプログラム。
13. 請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載のコンピュータプログラムを実行するコンピュータ可読媒体。
14. 請求項１２に記載のコンピュータプログラムを実行させるためのコンピュータを含むシステム。
15. 分光計を更に含む、請求項１４記載のシステム。
16. 更に既知の細胞からのスペクトルのライブラリを含む、請求項１４又は請求項１５に記載のシステム。
17. 対象の疾患状態を診断するための方法であって、
    請求項１乃至１１のいずれか一項記載の方法を使用してサンプルを分析することを含み、
    非正常細胞、又は特定の疾患状態を有する細胞の存在が疾患状態を有する対象を示すことを特徴とする、対象の疾患状態を診断するための方法。

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