JP2002508845A

JP2002508845A - 転移性腫瘍および非転移性腫瘍を識別する方法

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Publication number: JP2002508845A
Application number: JP50581199A
Authority: JP
Inventors: シー．マリンズ，ドナルド
Original assignee: パシフィックノースウェストリサーチインスティテュート
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2002-03-19
Also published as: US20010000150A1; AU8172998A; US20040089809A1; CA2294242A1; US6214550B1; EP0991932A1; WO1999000660A1

Abstract

(57)【要約】腫瘍または転移状態への腫瘍の進行についてスクリーニングする方法を開示する。このスクリーニング法は、ＤＮＡサンプルのフーリエ変換−赤外分光によって得られたスペクトルデータの主成分分析によるＤＮＡの特徴付けに基づく。この方法は、広範なＤＮＡサンプルおよびガンタイプに適用可能である。多変量正規分布方程式および弁別分析を使用して開発されたモデルは、原発性ガン性組織を転移性ガン性組織と区別するために特に良好に適切である。

Description

【発明の詳細な説明】転移性腫瘍および非転移性腫瘍を識別する方法技術分野本発明は、一般に、腫瘍の検出および特徴付けを含む、腫瘍の同定に関する。本発明は、より詳細には、腫瘍、または転移状態への腫瘍の進行についてスクリーニングするために、ＤＮＡサンプルのフーリエ変換−赤外分光によって得られるスペクトルデータの主成分分析に基づいて、ＤＮＡを特徴づけることに関する。発明の背景最近の25年以上にわたる財政上および人的資源の両方についての莫大な出費にもかかわらず、新たな腫瘍もしくは腫瘍の再発の検出は、人類の実現されていない目標のままである。特に、初期段階で検出された場合、多くのガンは処置可能であるが、信頼できるスクリーニング手順の欠如のために多くの患者において検出されされないで進行するという事実がいらだたしい。さらに、非転移性原発性腫瘍(または非ガン性疾患状態)を転移性腫瘍と区別するか、または転移性状態への進行を予測する信頼できるスクリーニング手順に対する必要性は、深刻である。腫瘍の転移は、ガン患者における処置不成功の主な原因である。それは、原発性新生物からの細胞の脱離、循環中への侵入、そして局所の離れた組織部位での最終的な定着を含む複雑なプロセスである。しばしば、医師は、どうしても、用心のあまり間違い、そして、転移性状態へ進行する傾向を有する腫瘍として疾患状態を同定することなく、患者のクオリティー・オブ・ライフに劇的な影響を与える外科的手順または他の手順を患者が受けることを求める。例示の目的のために、２つの特定のガン(前立腺ガンおよび乳ガン)が、より詳細に記載され、そして新たなアプローチ(これは、本明細書中で開示される発明が提供する)を必要とするガンの代表である。前立腺ガンは、男性における主な死亡原因である。したがって、この疾患の病因ならびに発ガンの初期にその発生を予測するための技術の開発に熱心な関心が、存在する。前立腺ガン(その最も一般的な形態は、腺ガンである)の病因は、ほとんど知られていない。しかし、いくつかの研究は、可能性のある因子として腫瘍サプレッサー遺伝子TP53の不活化および変化したＤＮＡメチル化パターンに集中している。さらに、フリーラジカル(これは、ホルモンの酸化還元サイクルから発生する)が、最近、前立腺ガンに関連づけられている。これは、水酸基ラジカル(・OH)(例えば、種々の研究で発ガン性に結びつけられてきた、8-ヒドロキシグアニン(8-OH-Gua)および8-ヒドロキシアデニン(8-OH-Ade))が、ＤＮＡに変異原性変化を生じることを示す証拠と一致する。これらの知見にもかかわらず、ＤＮＡの・OH修飾と前立腺ガンとの間の可能性のある関連性の理解は、実質的には存在しない。前立腺組織は、良性の前立腺肥大(ＢＰＨ)の領域を含み得る。それは、しばしば、前立腺ガンを伴うが、悪性前病変として認められていない。ＢＰＨの病因は知られていなし、前立腺ガンとの関係も同じである。前立腺ガンの診断への現時のアプローチにおける困難さに起因して、当該分野で改善された方法に対する必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、そして他の関連する利点をさらに提供する。乳ガンは、女性における主な死亡原因であり、そして女性における最も通常の悪性腫瘍である。乳ガンを発症する発生率は上昇している。９人の女性のうち１人は、この疾患と診断される。乳ガンを処置するための標準的なアプローチは、外科手術、放射線および化学療法の組合せに集中している。特定の悪性腫瘍において、これらのアプローチは成功し、そして治癒を達成している。しかし、診断が特定の段階を過ぎる場合、乳ガンは最も頻繁に不治である。浸潤性腺管ガンは、転移し得る乳ガンの通常の形態である。早期の検出のための代替のアプローチが必要とされる。乳ガンの診断への現時のアプローチにおける困難性に起因して、当該分野で改善された方法についての必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして他の関連する利点をさらに提供する。ＤＮＡは微小環境因子によって絶えず改変されており、したがって膨大な数の改変された構造が作成される(参考文献１、２)。例えば、転移状態への原発性乳ガンの進行は、数十億もの多くの新たなＤＮＡ形態を含むと推測された。これらの多くは、ヒドロキシラジカル(・OH)誘導構造変化から生じるようである(参考文献２)。低質量オリゴヌクレオチド(＜１×10³塩基対)の分析において進歩がなされた(参考文献３)。しかし、細胞性ＤＮＡ(約６×10⁶塩基対)の複雑性および高質量が、構造的解明を妨げてきた。結果的に、これらのＤＮＡの理解は、重要な生物学的特性を潜在的に有するインタクトな構造についての情報をほとんど提供しない、破壊的技術(化学的または酵素的)を使用することによって主に得なければならなかった。進歩したコンピュータソフトウェアと組み合わせた赤外顕微鏡分光計の開発( 図１４)により、数マイクログラムの細胞性ＤＮＡ(例えば、生検標本由来)からのフーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ)スペクトルを得ることが可能になった。発明の要旨簡潔に述べると、本発明は、組織の状態を規定する方法、および環境の遺伝子毒性を評価する方法を提供する。本発明の方法は、T-1(原発性非転移性)腫瘍を転移性腫瘍と区別するために、特に良好に適切である。本発明は、広範な種々のＤＮＡサンプルおよびガンに、ならびに広範な種々の遺伝子毒性環境に適用可能である。一つの局面において、本発明は、いわゆる「重心」モデル(「Ｓ字曲線モデル」とも呼ばれ得る；これを用いて組織サンプルが分析される)を用いる。重心モデルに従って、以下の工程：(ａ)ＤＮＡサンプルをフーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ) 分光に供し、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程；(ｂ)主成分分析(ＰＣＡ)によって工程(ａ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを分析する工程；および( ｃ)工程(ｂ)のＰＣＡを、非ガン性、非転移性腫瘍もしくは転移性腫瘍サンプル由来のＤＮＡサンプルのＦＴ−ＩＲスペクトルのＰＣＡと比較する工程、を包含する、腫瘍または転移性状態への腫瘍進行についてスクリーニングする方法が提供される。別の局面において、本発明は、組織の状態を特徴付けるためのいわゆる「楕円モデル」を提供する。この局面において、本発明は、目的の組織の種々の規定された状態に対応する数学的記載(すなわち、モデル)を提供する。組織の規定された状態は、例えば、正常な前立腺組織、良性前立腺肥大、および転移性前立腺ガンを含む。ここで、「正常」、「良性肥大」および「転移性」は、３つの「規定された状態」であり、そして前立腺組織が「目的の組織」である。簡潔には、楕円モデルによれば、本発明は、組織の状態(例えば、生理学的状態)を規定するための方法を提供し、この方法は、 (ａ)第１の複数の組織サンプルからのＤＮＡをフーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ) 分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｂ)工程(ａ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを主成分分析(ＰＣＡ)により分析して、主要成分(ＰＣ)スコアを提供する工程； (ｃ)クラスター分析を工程(ｂ)のＰＣスコアに適用して、域外値および非域外値の組織サンプルを識別する工程；および (ｄ)非域外値組織サンプルからのＰＣ値に最良に適合する多変量型の正規ベル型曲線を規定する、第１の方程式と呼ばれる方程式を作成する工程であって、第１の方程式が第１の複数の組織サンプルの状態を規定する、工程を包含する。別の実施態様において、本方法は、第２の複数の組織サンプルを用いて、上記工程(ａ)から(ｄ)を繰り返して、第２の方程式を提供する工程であって、第２の方程式が、第２の複数の組織サンプルの状態を規定する、工程をさらに包含する。別の実施態様において、本方法は、多変量弁別分析を第１および第２の方程式に適用して、それぞれ第１および第２の確率方程式を提供する工程をさらに包含する。別の実施態様において、本方法は、(ｅ)目的の状態を有する組織からのＤＮＡサンプルをＦＴ−ＩＲ分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程；(ｆ)工程(ｅ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータをＰＣＡにより分析して、ＰＣスコアのセットを提供する工程；および(ｇ)工程(ｆ)のＰＣスコアを、第１および第２の確率方程式のそれぞれと組み合わせて、それぞれ第１および第２の確率スコアを提供する工程をさらに包含する。好ましい実施態様において、本発明の方法は、組織由来のＤＮＡを規定し(特徴付け)、したがって組織自体を規定するための手段を提供する。ここで、本方法は、以下の工程： (ａ)目的の組織の「ｎ」個の規定された状態のうちの第１の状態からの複数 (「ｍ」個)のＤＮＡサンプル(例えば、「ｍ」個の異なる個体からの正常前立腺組織のサンプル)それぞれを、フーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ)分光にかけて、ＦＴ −ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｂ)工程(ａ)の各サンプル由来のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを、主要成分分析(ＰＣＡ)により独立して分析して、「ｍ」個のＦＴ−ＩＲスペクトルのそれぞれからの複数(「ｏ」個)の主要成分(ＰＣ)スコア(すなわち、ＰＣ１スコア、ＰＣ２スコア、ＰＣ３スコア．．．ＰＣｏスコア)を提供して、「ｍ」セットのＰＣスコアを提供する工程であって、すべてのサンプルが、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータの同一処理により得られるような、同数のＰＣスコアにより特徴付けられ、そして各セットは、「ｏ」個の値を含む、工程； (ｃ)クラスター分析を、サンプルのすべてから得られるような、目的の組織の「ｎ」個の規定された状態からのＰＣスコアのセット(すなわち、「ｍ」個のＤＮＡサンプルのＦＴ−ＩＲスペクトルから得られるＰＣ１スコア〜ＰＣｏスコアのすべて)に適用して、域外値および非域外値の組織サンプルを同定する工程； (ｄ)第１の規定された状態にあるすべてのサンプルについて非域外値ＰＣ１.. ＰＣｏ値に最良に適合する多変量型の正規ベル型曲線を規定する方程式を作成する工程； (ｅ)工程(ｂ)から得られたＰＣスコアのセットそれぞれについて工程(ｃ)および(ｄ)を繰り返して、「ｎ」個の方程式のセットを規定する工程であって、「ｎ」個の方程式それぞれが、「ｎ」個のセットのＰＣスコアのそれぞれに対応する多変量型の正規ベル型曲線を規定する、工程；および (ｆ)多変量弁別分析を、工程(ｅ)の多変量型の正規ベル型曲線を規定する「ｎ」個の方程式に適用して、目的の組織の「ｎ」個の規定された状態のそれぞれについての確率方程式を規定する工程を包含する。上記に概説される手順(工程(ａ)〜(ｆ))に従って、目的の特定の組織についての目的の規定された状態それぞれに対応する確率方程式が作成される。ここで、これら「ｎ」個の確率方程式が、組み合わせで、モデルを規定する。次いで、未知の規定された状態を有する目的の組織のサンプルは、ＦＴ−ＩＲにより分析され、これによって得られるスペクトルデータを主要成分分析にかけて、「ｏ」個のＰＣスコアを規定する。次いで、これら「ｏ」個のＰＣスコアは、目的の同じ組織についてのモデル内の種々の規定された状態に対応する「ｎ」個の確率方程式のそれぞれに「挿入され」て、規定された状態の数に対応する複数(「ｎ」個)の確率スコア(これから、モデルが構築された)を提供する。したがって、確率スコアは、このモデルの規定された状態のそれぞれについて得られる。より高い確率スコアは、目的の組織が、確率方程式に対応する規定された状態によって適切に特徴づけられるより高い可能性を示す。例えば、ＰＣスコアを正常組織に対応する確率方程式に挿入することにより、「ｗ」の確率スコアが提供され、その同じＰＣスコアを転移性ガンに対応する確率方程式に挿入することにより、「ｘ」の確率スコアが提供され、そして「ｘ」＜「ｗ」である場合、そのサンプルは転移性ガンより正常組織である可能性が高い。したがって、本発明は、以下の工程を包含する方法をさらに提供する： (１)上記工程(ａ)〜(ｆ)を実施して、目的の特定の組織について多く(「ｎ」個) の規定された状態に対応する多く(「ｎ」個)の確率方程式を包含するモデルを提供する工程； (２)工程(ｇ)〜(ｊ)を以下のとおりに実施する工程： (ｇ)未知の規定された状態を有する目的の組織からのＤＮＡサンプルを、フーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ)分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｈ)工程(ｇ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを主要成分分析(ＰＣＡ)により分析して、複数(「ｏ」個)の主要成分(ＰＣ)スコア(すなわち、ＰＣ１スコア、ＰＣ２スコア、ＰＣ３スコア．．．ＰＣｏスコア)を提供して、「ｏ」個のＰＣスコアのセットを提供する工程； (ｉ)工程「ｈ」の「ｏ」個のＰＣスコアのセットを、工程「ｆ」のモデルを構成する「ｎ」個の確率方程式のそれぞれに「挿入し」、「ｎ」個の規定された状態のそれぞれに対応する確率スコアを得る工程；および (ｊ)未知の規定された状態を有する組織がメンバーである可能性が最も高い規定された状態を決定するために、工程(ｉ)からの「ｎ」個の確率スコアを互いに比較する工程。上記方法の任意のものにおいて、組織は、乳房、泌尿生殖器、肝臓、腎臓、膵臓、肺、血液、脳、または結腸直腸組織であり得る。１つの実施態様において、組織はガン性、例えば、ガン性の乳房、前立腺、卵巣または子宮内膜組織である。別の実施態様において、本発明は、環境の遺伝子毒性を評価する方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する； (ａ)第１の環境中の複数の第１の生物からのＤＮＡを、フーリエ変換−赤外( ＦＴ−ＩＲ)分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｂ)工程(ａ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを主要成分分析(ＰＣＡ)により分析して、主要成分(ＰＣ)スコアを提供する工程； (ｃ)クラスター分析を工程(ｂ)のＰＣスコアに適用して、域外値生物および非域外値生物を識別する工程；および (ｄ)非域外値生物からのＰＣ値に最良に適合する多変量型の正規ベル型曲線を規定する第１の方程式と呼ばれる方程式を作成する工程であって、この第１の方程式が、第１の環境中の第１の生物を規定する、工程。１つの実施態様において、本発明は、第２の環境から採取した第２の生物由来のＤＮＡサンプルを用いて上記工程(ａ)〜(ｄ)を繰り返して、第２の方程式を提供する工程をさらに包含する。ここで、第２の方程式は、第２の環境中の第２の生物の状態を規定する。別の実施態様において、本発明は、多変量弁別分析を、第１および第２の方程式に適用して、それぞれ第１および第２の確率方程式を提供する工程をさらに包含する。別の実施態様において、本発明は、以下の工程をさらに包含する方法を提供する：(ｅ)目的の環境からの目的の生物のＤＮＡサンプルをＦＴ−ＩＲ分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｆ)工程(ｅ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータをＰＣＡにより分析して、ＰＣスコアのセットを提供する工程；および(ｇ)工程(ｆ)のＰＣスコアを、第１および第２の確率方程式のそれぞれと組み合わせて、それぞれ第１および第２の確率スコアを提供する工程。随意の実施態様において、第１および第２の環境のうちの少なくとも１つは、汚染された環境である。別の随意の実施態様において、第１および第２の生物は、非同一であるが、第１および第２の環境は同一である。別の随意の実施態様において、第１および第２の生物は同一であるが、第１および第２の環境が非同一である。したがって、好ましい実施態様において、本発明は、環境の遺伝子毒性を評価する方法を提供する。この方法は、本質的には上記に記載された通りであり、すなわち、重心または楕円モデルを使用するが、ＤＮＡサンプルは種々の環境から採取された生物由来である。一例として、環境は、種々の程度の汚染に冒されていてもよい。いずれにしても、重心モデルによれば、本方法は、以下の工程を包含する：(ａ)環境中の第１の生物のＤＮＡサンプルを、フーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ)分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程；(ｂ)工程(ａ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを主要成分分析(ＰＣＡ)により分析する工程；および(ｃ)工程(ｂ)のＰＣＡを、(１)工程(ａ)の環境中に導入前の第１の生物、または(２)非汚染環境中の第２の生物のＤＮＡサンプルについてのＦＴ−ＩＲスペクトルのＰＣＡと比較する工程。楕円モデルも同様に、環境の遺伝子毒性を評価する方法に使用され得る。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、明らかになる。図面の簡単な説明図１は、ＰＣＡ/ＦＴ−ＩＲスペクトル分析によって導出された二次元ＰＣプロットを示す。これは、正常点、良性前立腺肥大(「ＢＰＨ」)点、および前立腺ガン点の異なるクラスター化を示す。明らかに、前立腺病変の両群が、正常前立腺のＤＮＡの点の右側に現れる。図２は、前立腺ガン対正常組織(図２Ａ)、ＢＰＨ対正常組織(図２Ｂ)および前立腺ガン対ＢＰＨ(図２Ｃ)の平均スペクトルの比較を示す。各パネル(Ａ〜Ｃ)の下側のプロットは、不等分散ｔ検定に基づく、各波数における平均吸光度の差の統計的有意性を示す。Ｐ値はｌｏｇ₁₀スケールにプロットされている。図３は、ＤＮＡが、正常組織対前立腺ガン(図３Ａ)、正常組織対ＢＰＨ(図３Ｂ)、およびＢＰＨ対前立腺ガン(図３Ｃ)として分類される確率を示すＳ字曲線を示す。この曲線は、下記の表２に示されるロジスティック回帰モデルに基づく。予測される確率は、狭い範囲で非常に急激に上昇する。これは、群間の高度の識別を反映し、そして正常からＢＰＨへの進行、および正常から前立腺ガンへの進行に関連するＤＮＡ構造における急激な変化を反映する。各サンプルをその予測される確率にプロットする。図４は、ＰＣ１、２、３の三次元プロットである。ここで各球は、ＤＮＡ吸光度スペクトルを表し、そして球の位置は、スペクトルの「形状」(これは、吸光度ピータの高さ、幅、および位置を含む)によって決定される。プロットの上部の乳房の非浸潤性腺管ガン(「ＩＤＣ」）球(内側に点)のコアクラスターは、より分散的であり、かつより大きなＩＤＣ_mクラスター(球の内側に縦線)より有意に小さく、そして乳房縮小形成組織(「ＲＭＴ」)クラスターおよび転移性浸潤性腺管ガン(「ＩＤＣ_m」)クラスターは実質的に重なり、そしてサイズには統計学的に差はない。図５Ａは、２つの空間的に近位のＩＤＣスペクトル(三次元ＰＣＡプロット上のＡおよびＢを示す矢印を参照)を示す。ここで、図５Ｂにおいて示される２つの重ね書きされたスペクトルは、規格化吸光度が平均でわずか３％異なる。このことは、ＰＣＡの高い特異性、および、空間的に近位の球がほとんど同一のスペクトルプロフィールを有するという事実を示す。図６Ａおよび６Ｂは、平均ＩＤＣコアクラスターのスペクトルプロフィールと比較した２つのＩＤＣ域外値(図５で同定された)のスペクトルプロフィールを示す；「１」は、多病巣性ガンを示し(一つの病巣は、高度な悪性印環細胞ガンである)、そして「２」は、両側性乳ガンを示す。各症例において、平均スペクトルと域外値スペクトルとの間の劇的な差は、ＰＣ分析に関連する顕著な構造的特異性を示すスペクトル領域のほとんどにわたって明らかである(波数−構造の関係については本文を参照)。図７は、ＰＣ２対ＰＣ１をプロットするグラフでＲＭＴ、ＩＤＣ、およびＩＤＣ_m標本についてのスペクトルの重心計算を示し、そしてＲＭＴ重心からＩＤＣ重心への方向ベクトルおよびＩＤＣ重心からＩＤＣ_m重心への方向ベクトルを示す。図８は、平均ＲＭＴ、ＩＤＣ、およびＩＤＣ_m種についての重心スペクトルの重ね書きを示す。図９は、平均を引いた後の平均ＲＭＴ、ＩＤＣ、およびＩＤＣ_m種についての重心スペクトルの重ね書きを示す。従って、これは、種間のスペクトル差を強調する。図１０は、ＦＴ−ＩＲ方法論に基づくガンの予測確率を示す。図１１は、最初の３つのＰＣスコア導出される点のクラスターの三次元投射を示す。これは、本質的に清潔なコントロール環境に住むイギリス人の一人(ＱＭＨ群)または化学的に汚染された都会の環境に住むイギリス人の一人(ＤＵＷ群) からのＤＮＡのスペクトルの特徴をまとめる。図１２Ａ〜１２Ｃは、ＱＭＨ群およびＤＵＷ群の各々についての平均スペクトルの比較を示す。各パネルの下側のプロットは、不等分散ｔ検定に基づく、各波数での平均吸光度の差の統計学的有意性を示す。Ｐ値を、ｌｏｇ₁₀スケールでプロットする。図１３は、ＱＭＨ群およびＤＵＷ群の個々のスペクトルのオーバーレイを示す。図１４は、ＦＴ−ＩＲ微小分光計の写真および模式図を提供する。図１４Ａは、２つの重ね書きされた総平均スペクトル(grand mean spectra)を示し、他方、図１４Ｂは、不等分散ｔ検定を使用して各波数について得られたＰ値を提供する。図１５Ａは、「ａ」および「ｂ」と名付けられた、非常に類似するＰＣスコアを有する２つの標本を含む、乳ガン(ＩＤＣ)クラスターの三次元ＰＣプロットを示す。２つの域外値もまた存在する：「ｃ」は、両側に乳ガンを有する患者からのＩＤＣ組織のＤＮＡを表し、そして「ｄ」は、１つの病巣が高度な悪性印環細胞ガンである、多病巣性ガンのＤＮＡを表す。図１５Ｂは、スペクトル「ａ」および「ｂ」が平均規格化吸光度の僅か３％しか異ならないことを示す。２つのスペクトルは実質的に同一であるが、対応するＰＣ点は空間的に異なり、しがたって、高いスペクトル特異性がＰＣＡを用いて達成されたことを実証する。図１５Ｃは、ＩＤＣコアクラスター(域外値を有さない)の平均スペクトルと比較した、(図１５Ａからの)域外値「ｃ」のスペクトルを提供する。図１５Ｄは、ＩＤＣコアクラスター(域外値を有さない)の平均スペクトルと比較した、(図１５Ａからの)域外値「ｄ」のスペクトルを示す。平均スペクトルと域外値スペクトルとの間の劇的な差は、ほとんどのスペクトル領域にわたって明らかであり、主要なクラスターから大きく離れた２つの対応するＰＣ点を生じる。図１６Ａは、正常乳房組織(ｎ＝２１)および乳ガン組織(ＩＤＣ；ｎ＝３７)に由来するＤＮＡのＰＣスコアの三次元プロットである。これは、図１５Ａに示される２つの域外値(ｃおよびｄ)と共に、各群の異なるクラスター化を示す。図１６Ｂは、正常乳房および乳ガンについて、危険度スコアとガンの確率のプロットである。ガンサンプルは、ガンの確率が＞６１.５％である、Ｓ字曲線の上部に主に位置する。他方、正常乳房サンプルはより下方の部分に主に位置する。ＰＣスコアは、群間を識別しないという帰無仮説は、Ｐ＜０．０００１で棄却される。図１６Ｃは、正常前立腺(ｎ＝５)、ＢＰＨ(ｎ＝１８)、および前立腺ガン(腺ガン；ｎ＝８)に由来するＤＮＡのＰＣスコアの二次元プロットである。ここで、クラスター化は異なる(４)。図１６Ｄは、正常前立腺および前立腺ガンについての、ガンの確率対危険度スコアのプロットである。ＰＣスコアは、群間を識別しないという帰無仮説は、Ｐ＝０.０４で棄却される。図１６Ｃのプロットの右側のガン域外値は、確率曲線において、正常からガンへの進行と同じ方向である。このことは、この域外値により表されるＤＮＡが、高度の構造的改変を有することを示唆する。図１７は、ＩＤＣおよびＩＤＣＭについてのＤＮＡスペクトルの三次元図である(図１６Ａと同様に、正常乳房組織および乳ガンについての類似の三次元図を提供する)。図１８は、転移性乳ガン(ＩＤＣ_M)および乳房縮小形成組織(ＲＭＴ)を識別するための二成分楕円モデルから得られたプロットである。図１９は、原発性乳ガン(ＩＤＣ)および転移性乳ガン(ＩＤＣ_M)を識別するための二成分楕円モデルから得られたプロットである。図２０は、ＩＤＣ、ＩＤＣ_M、およびＲＭＴ組織を識別するための三成分楕円モデルから得られたプロットである。図２１は、正常(ＲＭＴ)、原発性(ＩＤＣ)、と転移性(ＩＤＣ_M)乳ガンの間を識別するための三成分楕円モデルから得られたプロットである。図２２は、多変量正規モデル(すなわち、楕円モデル)に基づく、１００のシミュレーションされた正常、ＩＤＣおよびＩＤＣ_M症例のプロットを示す。発明の詳細な説明上記のように、本発明は、ある局面において、腫瘍または転移状態への腫瘍進行についてスクリーニングする方法に関する。この方法はＤＮＡの分析に基づく。ＤＮＡはすべての生物において遍在しているので、本発明の方法は、特定のＤＮＡサンプルの使用に限定されない。したがって、広範なガンがスクリーニングされ得る。ガンの代表例には、乳ガン、泌尿生殖器ガン、メラノーマ、肝臓ガン、腎臓ガン、膵臓ガン、肺ガン、循環系ガン、神経系ガン、または結腸直腸ガンが含まれる。泌尿生殖器ガンには、前立腺ガン、子宮頸部ガン、卵巣ガン、膀胱ガンまたは子宮内膜ガンが含まれる。循環系ガンにはリンパ腫が含まれる。神経系ガンには脳ガンが含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「〜についてスクリーニング」には、検出すること、モニターすること、診断すること、または予知すること(予想すること) が含まれる。ＤＮＡは、本明細書に記載のとおりに分析され、腫瘍についてスクリーニングされる。本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は、初めて存在してもよいし、または再発でもよく、あるいは発生もしくは再発の過程にあってもよい。最後のシナリオ(すなわち、過程)は、臨床的発現の前に、ガンの危険の評価およびガンの危険への洞察の機会を表わす。本発明は、たとえ、ガン細胞が、なお現在利用可能な方法論に基づいて出現しなければならなくても、それが形成される可能性を予測するために使用され得る。ＤＮＡはまた、本明細書に記載のとおりに、分析され、転移状態への腫瘍の進行についてスクリーニングされる。転移状態への腫瘍の進行とは、終点(すなわち、転移状態)および終点への途上の任意の中間点をいう。用語「スクリーニング」はさらに、転移性腫瘍および非転移性腫瘍を区別することを包含する。本明細書中に記載されるような、いわゆる楕円モデルは、スクリーニングのこの局面に特に好ましい。事実、楕円モデルを使用して、正常組織を８９％(１８サンプル中１６)で正確に同定し、他方、ガン組織を、９７％(３２サンプル中３１)で正確に同定した。さらに、楕円モデルを使用して、原発性(ＩＤＣ)ガンを１００％(１０サンプル中１０)で正確に同定し、他方、転移性(ＩＤＣ_M)ガンを８２％で同定した。「ＤＮＡサンプル」は、任意の供給源中のＤＮＡまたは任意の供給源に由来するＤＮＡである。ＤＮＡは、種々の供給源(組織供給源または液体供給源を含む)から取り出され得る。組織供給源には、器官または膜あるいは皮膚からの組織が含まれる。液体供給源には、全血、血清、血漿、尿、滑液、唾液、喀痰、脳脊髄液、またはそれらの画分が含まれる。組織サンプルに関して、例えば、組織は、生検(例えば、細針生検)により生物から取り出され得、そしてＤＮＡが抽出され得る（すべて当業者に周知の技術による）。同様に、ＤＮＡは、公知の技術を使用して液体供給源から抽出され得る。ＤＮＡの抽出/単離が好ましくあり得るが、ＤＮＡは、本発明を実施するために、抽出/単離される必要はない。フーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ)分光を使用してＤＮＡを直接調べることが可能である。例えば、ＩＲスキャンを細胞核に特異的に限定することによって、高濃度のスペクトルプロフィールを作成し得る。したがって、ＤＮＡサンプルは抽出/単離されたＤＮＡであってもよいし、またはサンプルがＤＮＡを含んでもよい。ＤＮＡの後の分析のために組織を保存することが可能である。例えば、摘出された組織は、液体窒素中で直ぐに凍結され、そして−80℃に維持され得る。このような組織からのＤＮＡの単離後、ＤＮＡは、通常、脱イオン水に溶解され、そしてＦＴ−ＩＲ分光のために部分に分注される。代表的には、アリコートを、凍結乾燥により完全に乾燥させ、純粋窒素でパージし、そして真空密封ガラスバイアルに保存する。本発明において、ＤＮＡサンプルをＦＴ−ＩＲ分光にかけ、そしてＦＴ−ＩＲスペクトルデータを主成分分析により分析する。サンプル中のＤＮＡの特徴付けの出発点は、１セットのＩＲスペクトルである。各スペクトルは、それぞれの整数波数(すなわち、一般には、４０００〜７００ｃｍ^-1、そして代表的には、２０００〜７００ｃｍ^-1)における数値的吸光度を示す。ＤＮＡサンプルの赤外(ＩＲ)スペクトルを、ＩＲ顕微鏡および広範囲水銀−テルル化カドミウム−検出器を備えたフーリエ変換−ＩＲ分光計(例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＳｙｓｔｅｍ２０００（ＴｈｅＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ))を用いて得る。ＤＮＡを、一般に、相対湿度約６０％未満の雰囲気下のフッ化バリウム上に置き、平坦化して透明フィルムを作製する。ＩＲ顕微鏡を肉眼観察モードで使用して、サンプルの均一で透明な部分を選択して、透過スペクトルを得る際の散乱またはウェッジ効果を避ける。一般に、各分析を、３〜５μｇのＤＮＡについて３連で実行し、そしてスペクトルをコンピュータで平均する。一般に、４ｃｍ^-1の分解能での２５６スキャンを、各分析について実行し、４０００〜７００ｃｍ^-1の周波数範囲でスペクトルを得る。代表的には、ガラスバイアルを破壊してから各ＩＲスペクトルを得るまで３〜５分が経過する。代表的には、ＤＮＡ標本は、厚さが変化し、多様なセットの吸光度またはスペクトル強度を生じる。どのＩＲスペクトルも、特異的な塩基対合を暗示する１７０３ｃｍ^-1バンドを示さない。この事実は、サンプルが異常形態であるＤ形状を獲得したことを示す。ＩＲスペクトルを透過単位で得、そしてデータ処理のために吸光度単位に変換する。例えば、分光計を制御しＩＲスペクトルを得るために、ＩｎｆｒａｒｅｄＤａｔａＭａｎａｇｅｒソフトウエアパッケージ(ＴｈｅＰｅｒｋｉｎ− ＥｌｍｅｒＣｏｒｐ．)を使用し得る。さらに、運転後のスペクトログラフデータ分析を実行するために、ＧＲＡＭＳ／２０００ソフトウエアパッケージ(ＧａｌａｃｔｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＣｏｒｐ．，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ)を使用し得る。各スペクトルを、４０００〜７００ｃｍ^-1のすべての波数についての特異的吸光度を含むスプレッドシート形式に変換する。ＩＲデータを処理する際に、一般に、バックグランドの吸光度の影響を除去するために、すべてのスペクトルについてベースライン調整を使用する。これをなすために、(例えば、範囲２０００〜７００ｃｍ^-1について)最低点を中心にした１１波数にわたる平均吸光度を、すべての周波数の吸光度から差し引く。さらに、一般に、ＩＲデータを規格化する。規格化に有用な周波数範囲２０００〜７００ｃｍ^-1における十分に確立した参照ピークが存在しないので、一般には、規格化は、すべての吸光度を、目的の範囲での一定の平均強度に変換することによって達成される。例えば、１７５０〜７００ｃｍ^-1の領域(１０５１波数のスパン)は、代表的には、分析のための主要領域として、本発明において選択される。なぜなら、それが広範囲に変化する吸光度を含むからである。上記のベースラインの除去後、スペクトル中のすべての波数における吸光度を、そのスペクトルについての１７５０〜７００ｃｍ^-1の範囲の平均吸光度で割り、すべての標本について平均スペクトル強度１.０を得る。一般に、すべてのさらなる分析を、これらのベースラインとされた規格化スペクトルについて実行される(しかし、平均が除去されていない分析もまた可能である)。本発明では、スペクトル間の変動およびこの変動のサブグループ(例えば、ガン対非ガン)に対する関係を研究するために、因子分析が使用される。特に、ＦＴ−ＩＲ分光により獲得されたスペクトルデータを、主成分分析(ＰＣＡ)統計学的アプローチを使用して分析する。ＰＣＡは、互いに独立し、そして元の長い変数リスト中のほとんどの情報を捕捉する数個の変数(主成分スコアまたはＰＣ)を明らかにする目的で単一セットの変数に適用される統計学的手順である(例えば、Ｔｉｍｍ，Ｎ．Ｈ．，ＭｕｌｔｉｖａｌｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｉｍｍ，Ｎ．Ｈ．編、１９７５，Ｂｒｏｏｋｓ/Ｃｏｌｅ，Ｍｏｎｔｅｒｅｙ，ＣＡ，５２８〜５７０頁)。ＰＣＡは、スペクトルを通じて変化する主要な特徴をまとめる数個のＰＣを生じる。ＰＣＡは、赤外スペクトル全体にわたる、吸光度−波数値間の百万を超える相関に基づき得る。複雑なスペクトル関係を含む多くの変数を、数個のＰＣスコアに減らす。各ＰＣスコアは、総平均スペクトルからのあるスペクトルの波数毎の偏差の重み付けした総和である。各ＰＣスコアは、二次元および三次元のＰＣプロットで点として出現し、異なりそして高度に識別力のあるＤＮＡの構造的特性の１群を表す。例えば、５個の主成分(すなわち、五次元)は、ＦＴ−ＩＲスペクトルの１０５１次元(すべてのスペクトルの総平均が各スペクトルから差し引かれている)を記述するに十分であり得、そして二次元または三次元の視覚的図表で足りる。ＰＣＡは、多くの基本的で進歩した統計学的プログラム(例えば、ＳＡＳおよびＳ− Ｐｌｕｓ)において利用可能である。全体分析は、一般に、３群(非ガン性サンプル、非転移性腫瘍サンプル、および転移性腫瘍サンプル由来のＤＮＡ)のそれぞれからのコアクラスターを用いて実施されるが、３群すべてを使用しない可能性も３群以外の群も使用する可能性がある(例えば、３群のうちの２群、または非ガン性サンプル対すべての腫瘍サンプル(転移性か否かにかかわらず))。クラスター分析を使用して、コア群において他のものとは離れて位置する特定の群のメンバーを同定する。この隔離された群のメンバーはすべて、一般的に、平均規格化吸光度で少なくとも１２％の差を表すユークリッド距離で、その群中の他のものから離れて位置する。この差は、スペクトルを従来の方法でプロットした場合、肉眼で気づく差である。コアクラスターは、より通常に遭遇するＤＮＡの構造的表現型であると考えられ得る。一方、隔離された群のメンバー(「域外値」)は、そのサンプルを用いて研究するに十分大きな数では存在しないが、含まれる場合には分析に過剰に影響する、頻繁でない表現型を表す。コアクラスター分析を使用して、ＰＣスコアは、「域外値」および「域内値」に関してこのように特徴付けられる。「域内値」であるＰＣスコアは、次いで、重心モデルまたは楕円モデルのいずれかに従って操作され得る。重心モデルを下記において最初に議論し、続いて楕円モデルを議論する。非ガン性手法(ＮＣ)が非転移性腫瘍(ＮＭＴ)へ進行するためのＤＮＡ構造変化が非転移性腫瘍(ＮＭＴ)が、転移性腫瘍(ＭＴ)へ進行するための変化と同一であるかどうかの決定を、点の群から統計学的に導出される重心に基づいて検定する。この重心は、１７５０から７００ｃｍ^-1までの１０５１の個々の波数の平均吸光度のベクトルである。２つの進行が同様である場合、３群の重心は、二次元空間および三次元空間において一列にならぶ。公式には、ｃｏｓ(θ)＝１.０という仮説を検定する。ここで、θは、ＮＣの重心からＮＭＴの重心までを示すベクトルｘと、ＮＭＴの重心からＭＴの重心までを示すベクトルｙとの間の角度である。ｃｏｓ(θ)は、ｃｏｓ(θ)＝ｘｙ/(| ｘ|・|ｙ|)によって規定される。ベクトルｘは波数によって示され、そして各波数でＮＭＴスペクトルの平均規格化吸光度とＮＣスペクトルの平均規格化吸光度との間の差を含む。ベクトルｙは、ＭＴスペクトル−ＮＭＴスペクトルについての対応する差を示す。角度θ＝０[これはｃｏｓ(θ)＝１.０と等価である]は、ＭＴが、ＮＣ→ＮＭＴ進行の「実質的に一直線に前進する」持続であること、および重心が一直線にならぶことを示す。一方、θ≠０は、ＮＭＴ→ＭＴ進行が、異なる組のスペクトル(構造)変化を含むことを示す。ｃｏｓ(θ)＝１.０という仮説を、ブートストラップ法(ＥｆｒｏｎおよびＧｏｎｇ，Ａｍ．Ｓｔａｔ．３７：３６−４８，１９８３)を使用して検定した。ブートストラップ法は、ＮＣ、ＮＭＴ、およびＭＴのコアクラスターからの置換を伴う再サンプリングおよび各再サンプリングについてのｃｏｓ(θ)の計算を包含する。ＮＣおよびＮＭＴコアクラスターが引き出される集団が、異なる重心(すなわち、異なる平均吸光度スペクトル)を有するかどうかを決定するために、ＮＣ重心とＮＭＴ重心との間の距離について、ＮＣサンプルとＮＭＴサンプルとの間で標識をランダムに置換し、そして重心間の距離を再計算して置換検定を実行する。同様な置換検定を、ＮＭＴ重心とＭＴ重心との間の距離について実行する。最後に、３つのコアクラスターのサイズを、各スペクトルからそのクラスター重心までの距離についてＫｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓＡＮＯＶＡ検定およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ(ＭＷ)検定を使用して比較する。（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定およびＭＷ検定のＰ値は、サンプル値がそれらのサンプル平均と比較される場合に導入されるいくらかの統計学的依存性のために、概算である。）主成分分析により分析したＤＮＡの赤外スペクトルの波数−吸光度関係(すなわち、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータのＰＣＡ)を、空間中の点として表現し得る。各点は、ＤＮＡ構造の高度に識別可能な尺度を表わす。これらのＰＣスコアを２次元プロットおよび３次元プロットにプロットし得る。プロット中のスペクトルの位置は、そのスペクトルが、いかにそのプロット中の他のスペクトルと異なるかまたは同様であるかを記述する。異なる群のスペクトルについての異なるプロット記号またはクラスターは、スペクトルのクラスター化を強調するのを助ける。さらに、２群のスペクトルを分析する場合、ロジスティック回帰を使用して、それらのＰＣスコアに基づいてスペクトルを分類するためのモデルを開発し得る。ロジスティック回帰は、分類のために通常使用される方法であり、多くの統計学的ソフトウエアパッケージ(例えば、ＳＡＳおよびＳ−Ｐｌｕｓ)において利用可能である。ＰＣスコアは予測子であり、その結果は標本を分類するために使用され得る方程式(モデル)である。各標本を、(例えば)非ガン群に対してガン群である数値確率でタグする。この分析の結果を、予測方程式を使用して、ガンの危険スコア(推定確率のロジット(ｌｏｇｉｔ))がＸ軸上で、推定確率がＹ軸上であるＳ字状曲線としてプロットし得る。新たな標本についての確率もまた計算し得る。カット点(例えば、０.５以上の確率)を選択することによって、すべての標本を、(例えば)ガンまたは非ガンとして分類し得る。分類の感度および特異性もまた標準的な方法を使用して計算し得る。ＦＴ−ＩＲ分光と統計学との組合せＦＴ−ＩＲスペクトルはＤＮＡ構造の高感度な表現である(参考文献２、４〜６)。微妙な変化、例えば、フリーラジカルにより誘導される酸化還元状態における微妙な変化(参考文献１、５、６)は、振動運動および回転運動に影響し、したがって波数−吸光度関係を変化させる可能性が高い。２群のＤＮＡの間の構造的差異を、(例えば、図１４Ａに示される)総平均スペクトルについてｔ検定を使用して同定し得る。得られるＰ値が図１４Ｂに与えられる(参考文献１４)。ｔ検定は、各波数の平均吸光度の差異についてのＰ値を提供する。対照的に、ＰＣＡは、スペクトル全体にわたる吸光度−波数値間の百万を超える相関に基づく(参考文献２)。複雑なスペクトル関係を含む多くの変数が考慮され、互いに独立した数個のＰＣスコアに減らされる。各ＰＣスコアは、総平均スペクトルからのあるスペクトルの波数ごとの偏位の重み付けられた総和である。本質的には、ＰＣスコアは、ＤＮＡの異なるスペクトル(したがって、構造的)特性の一群を表す。通常、最初の２つまたは３つのＰＣスコアが、分散全体の約８０％を含む。三次元プロット(図１５Ａ、１６Ａ)または二次元プロット(図１６Ｃ)は、これらスコアに基づいて構築され得、各スペクトルは、その空間的配向がＤＮＡ構造の高度に識別可能な尺度である単一の点によって表される。実質的に同一のスペクトル(図１５Ｂ)が、ＰＣプロット(図１５Ａ、ａおよびｂ)中の点として分離され得る。さらに、平均スペクトル(図１５Ｃ、Ｄ)とは顕著に異なるスペクトルを表す２つの域外点(図１５Ａ、ｃおよびｄ)は、主要なクラスターから十分に離れて位置する。ロジスティック回帰または識別分析は、標本の「ガン確率」を、そのＰＣスコアに基づいて、０.０(非ガン)と１.０(ガン)との間で推定する。ＰＣスコアを使用してモデルから導出された、予想されたガン確率を、計算した危険度スコアに対してプロットする(図１６Ｂ、Ｄ)。正常組織のものと形質転換組織のものとの間の確率値は、種々の程度のガン危険度を表す(参考文献２、４〜６)。確率−危険度関係は、スクリーニングおよび予知試行についての見込みのある基礎を構成する。ＦＴＩＲ/統計学的技術の適用乳ガンの研究において（参考文献2、5、6）、主要なスペクトルの差異が、正常乳房→乳ガンへの進行について見出された（浸潤腺管ガン；IDC）。三次元PC プロットは、各群のDNAを表す点の異なる明確なクラスターを明らかにした(図16 Ａ)。IDC群のPC点が選択され、図15Aに提供された。両側性乳ガンを有する患者のＤＮＡを表すＣ点は、単一の乳ガンを有する患者のDNAを示す主要クラスターから完全に分離された（参考文献２）。組織の病変における差異が、PC点の位置を著しくシフトすることが見出された。印環細胞ガンの第二の病巣、高度に悪性の病変を含む標本を示すｄ点は、主要クラスターから十分に分離される。これらの例は、FT-IR/統計学的技術が、種々の生物学的状態との関連においてDNAの構造変化を解明するための潜在的に高度な能力を有することを証明する。全54サンプルについて正常および乳ガンPCスコアが、ロジスティック回帰を使用して分析し、得られるガンの確率対危険性スコアS字曲線（図16B）は、非ガンとガンとの間に多くの移行値を示した。サンプル（４つのさらなる明確な域外値を含む）の分類において、予測モデルは、カット点として61.5％の確率を使用して、86％の感受性（正確に分類されたガンを有する患者のパーセント）および81 ％の特異性（正確に分類されたガンを有さない患者のパーセント）を有した。（このカット点は、感受性と特異性を共に最高にするように選択され、そして疾患および群の間で変わり得る。）モデルの能力は、独立した試験によって実証された。11人の女性（予測モデルに含まれない）の乳ガン近傍からの分光学的に正常な組織(MNT)のスペクトルを分析し、そして対応するPCスコアを計算した。スコアをモデルで使用した場合、11のうちの10（91%）は、75％を超える予測されるガン可能性を有した。従って、DNA構造に基づいて、MNTは、「非常に危険」と分類された。これは、乳ガン付近の組織が、第二の病変を発現する高い危険性を有することを示すデータによって支持される（参考文献６）。原発性乳ガン→転移性乳ガンへの進行についての総平均スペクトルの比較は、ヌクレオチド塩基およびデオキシリボースに割り当てられたスペクトル領域における明白な差異によって示唆されるように、DNAの構造が、著しく変化する（参考文献2）ことを示した。DNAとの・OHの反応の増加に主に起因する、これらの変化は、構造上の多様性（これは、以前に記載される（参考文献２）ようなPCスコアに基づいて計算された）における実質的な増加を生じた。多様性の決定は、フリーラジカルによって生じるような、DNAへの構造的損傷の有用な尺度を提供する。正常前立腺→前立腺ガンへの進行（図14A）および正常前立腺→良性前立腺肥大(BPH)への進行における総平均スペクトルの比較は、形質転換がDNAにおける有意な構造的変化に関連するということを初めて示した（参考文献４）。最初の２つのPCスコア（全分散の76%）を、２次元プロットのために使用した（図16C）。この群は、明らかなクラスター化を示した。前立腺病変クラスターは、正常前立腺のクラスターの右に位置し、そしてBPHクラスターは、ガンクラスターの右に位置した。空間的配置は、仮定の進行BPH→前立腺ガン（参考文献７）がありそうにないことを示唆する。なぜならこれは、正常→BPH形質転換と比較して構造的な逆行を必要とするからである（参考文献４）。これは、病変のそれぞれの型が、独立して生物学的に誘導されるか、またはガンへの進行において逆転を模倣するBPHのDNAにおけるさらなる変化が存在することを意味する。弁別分析を介して得られた前立腺ガンの可能性を、危険性スコア（確率のロジット(logit)）に対してプロットし、そしてこれは群の分離付近を明らかにした（図16D）。弁別モデル（合計12のガンおよび非ガンサンプルを使用して計算した）は、多変量正規分布としてクラスターを表した。サンプル（１つのさらなるガン域外値を含む）の分類において、予測モデルは、カット点として50%の確率を使用して、88%の感受性および80%の特異性を有した。この技術は、前立腺ガンのさらなる研究のために、前立腺上皮内腫瘍形成(PIN)と腺ガンとの推定の病因学的関係および前立腺特異的抗原（PSA）試験結果とガン確率値との関連性を含む、見込みのある機会をもたらす（参考文献７）。楕円モデル（これはまた、「多変数正規モデル」または「MNM」とも呼ばれ得る）に従って、PCスコアは、FT-IRスペクトルにおける変動のパターンを捕捉する。ここで各PCスコアは、上記のように、波数により吸光度の重み付けられた総和である。各PCスコアは、特定のスペクトル領域を強調し、ここでPCスコアのセット（約６スコアが通常十分であるが、より少ない数のスコアもまた、満足し得る）は、非常に良好に、各スペクトルを表す。PCスコアは、スペクトルを横切って変化し、そしてスペクトル間の差異を強調する。一般に、6PCスコアは、スペクトル間の総変動の少なくとも約90%を捕捉するに十分である。クラスター（例えば、IDC_M）についてのPCスコアのセットは、統計学的モデルによって近似され得る。各PCスコア（例えば、PC1）は、「ベル型曲線」（すなわち、ガウス分布）によって近似され得る。従って、（６つのPCスコアが存在する場合）PC1、PC2、....、PC6の各々は、ベル型曲線によって、別々に近似され得る。いくつかの状熊が、一緒に分析される場合、PC1、PC2などは、通常、所定の状態（例えば、IDC_M）内で相関付けられる。完全モデルは、多変数正規分布（これは数式である）である。このモデルは、PC1、PC2、....、PC6などの無限に多くの組合わせとして見なされ得るが、いくつかの組合わせは、他のものよりもさらに可能である。このモデルから無作為のサンプルを引き出すことは可能であり、そしてこれを実施するために本来のデータを有することは必要でない（モデルは十分である）。サンプルをプロトする場合（例えば、PC2対PC1）、プロットは、高密度（ここで数学的モデルは、スペクトルがより高い可能性で生じることを示す）を示す。モデルはまた、モデルから、９０％以上（または任意の所望のパーセンテージ）の無限確率を捕捉する楕円の構築を可能にする。数学的には、数値的方法を使用して、モデル関数を積分する。ここで、90％楕円の内側を積分することにより、-∞から+∞にわたって積分することによって得られる値の９０％を得る。この楕円は、確率の90%を含む。例えば、無作為に選択されたIDC_Mスペクトルは、 IDC_Mデータから作成された楕円の内側へ入る可能性が９０％を超える。３次元楕円の長さ、幅、高さは、このクラスター（例えばIDC_M）について、各々PCスコア１、PCスコア２、PCスコア３の標準偏差に比例する。実際の計算は、カイ二乗分布を使用して計算される。まとめると、楕円モデルに従って、本発明は、以下の工程からなる方法を提供する： (ａ)目的の組織の「ｎ」個の規定された状態のうちの第１の状態からの複数(「ｍ」個)のＤＮＡサンプル(例えば、「ｍ」個の異なる個体からの正常前立腺組織のサンプル)それぞれを、フーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ)分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｂ)工程(ａ)の各サンプル由来のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを、主要成分分析(ＰＣＡ)により独立して分析して、「ｍ」個のＦＴ−ＩＲスペクトルのそれぞれからの複数(「ｏ」個)の主要成分(ＰＣ)スコア(すなわち、ＰＣ１スコア、ＰＣ２スコア、ＰＣ３スコア．．．ＰＣｏスコア)を提供して、「ｍ」セットのＰＣスコアを提供する工程であって、すべてのサンプルが、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータの同一処理により得られるような、同数のＰＣスコアにより特徴付けられ、そして各セットは、「ｏ」個の値を含む、工程； (ｃ)クラスター分析を、サンプルのすべてから得られるような、目的の組織の「ｎ」個の規定された状態からのＰＣスコアのセット(すなわち、「ｍ」個のＤＮＡサンプルのＦＴ−ＩＲスペクトルから得られるＰＣ１スコア〜ＰＣｏスコアのすべて)に適用して、域外値および非域外値の組織サンプルを同定する工程； (ｄ)第１の規定された状態にあるすべてのサンプルについて非域外値ＰＣ１.. ＰＣｏ値に最良に適合する多変量型の正規ベル型曲線を規定する方程式を作成する工程； (ｅ)工程(ｂ)から得られたＰＣスコアのセットそれぞれについて工程(ｃ)および(ｄ)を繰り返して、「ｎ」個の方程式のセットを規定する工程であって、「ｎ」個の方程式それぞれが、「ｎ」個のセットのＰＣスコアのそれぞれに対応する多変量型の正規ベル型曲線を規定する、工程；および (ｆ)多変量弁別分析を、工程(ｅ)の多変量型の正規ベル型曲線を規定する「ｎ」個の方程式に適用して、目的の組織の「ｎ」個の規定された状態のそれぞれについての確率方程式を規定する工程を包含する。上記に概説される手順(工程(ａ)〜(ｆ))に従って、目的の特定の組織についての目的の規定された状態それぞれに対応する確率方程式が作成される。ここで、これら「ｎ」個の確率方程式が、組み合わせで、モデルを規定する。次いで、未知の規定された状態を有する目的の組織のサンプルは、ＦＴ−ＩＲにより分析され、これによって得られるスペクトルデータを主要成分分析にかけて、「ｏ」個のＰＣスコアを規定する。次いで、これら「ｏ」個のＰＣスコアは、目的の同じ組織についてのモデル内の種々の規定された状態に対応する「ｎ」個の確率方程式のそれぞれに「挿入され」て、規定された状態の数に対応する複数(「ｎ」個)の確率スコア(これから、モデルが構築された)を提供する。したがって、確率スコアは、このモデルの規定された状熊のそれぞれについて得られる。より高い確率スコアは、目的の組織が、確率方程式に対応する規定された状態によって適切に特徴づけられるより高い可能性を示す。例えば、ＰＣスコアを正常組織に対応する確率方程式に挿入することにより、「ｗ」の確率スコアが提供され、その同じＰＣスコアを転移性ガンに対応する確率方程式に挿入することにより、「ｘ」の確率スコアが提供され、そして「ｘ」＜「ｗ」である場合、そのサンプルは転移性ガンより正常組織である可能性が高い。したがって、本発明は、以下の工程を包含する方法をさらに提供する： (１)上記工程(ａ)〜(ｆ)を実施して、目的の特定の組織について多く(「ｎ」個) の規定された状態に対応する多く(「ｎ」個)の確率方程式を包含するモデルを提供する工程； (２)工程(ｇ)〜(ｊ)を以下のとおりに実施する工程： (ｇ)未知の規定された状態を有する目的の組織からのＤＮＡサンプルを、フーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ)分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｈ)工程(ｇ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを主要成分分析(ＰＣＡ)により分析して、複数(「ｏ」個)の主要成分(ＰＣ)スコア(すなわち、ＰＣ１スコア、ＰＣ２スコア、ＰＣ３スコア．．．ＰＣｏスコア)を提供して、「ｏ」個のＰＣスコアのセットを提供する工程； (ｉ)工程「ｈ」の「ｏ」個のＰＣスコアのセットを、工程「ｆ」のモデルを構成する「ｎ」個の確率方程式のそれぞれに「挿入し」、「ｎ」個の規定された状態のそれぞれに対応する確率スコアを得る工程；および (ｊ)未知の規定された状態を有する組織がメンバーである可能性が最も高い規定された状態を決定するために、工程(ｉ)からの「ｎ」個の確率スコアを互いに比較する工程。図18、19、20および21に見られるように、楕円は重複する。実際、これら２つまたは３つのクラスターのための完全なモデルは、至る所で重複する。言い換えると、三次元空間の任意の所定の位置について、この点のためのスペクトルが、例えばRMTに属する可能性、これがIDCに属する別の可能性、そしてこれがIDC_Mに属する別の可能性が存在する。しかし、各群（IDC、IDC_M、およびRMT）は、いくつかの位置で、他の群よりも高い密度を有する。所定のサンプルについて、これは、そのサンプルの位置(PCスコア)で最も高い密度を有する群に割り当てられる。それゆえ、９０％のIDC楕円が９０％IDC_M楕円の内側に埋もれる場合でさえ、I DCは、これらの内部点の多くのまたはほとんどで、より高い密度を有する可能性がある。従って、この重複空間内に生じるPCデータを提供するサンプルは、IDC である可能性がより高い。一般に、本発明の楕円モデルは、正常、IDC、およびIDC_Mのスペクトル/組織を表すためのモデルの構築を可能にする。上記のようにPCスコアを得た後、PCスコアの相関関係および多様性が決定される。次いで、選択されたデータは、多変数性型のベル型曲線に基づいて、同じ相関関係および多様性を有する統計学的モデルに適合される。このモデルは、各群の集合推定90％を含む楕円によって表され得る。本発明は、乳房組織の形質転換の予測を可能にする。楕円モデルに従って、乳房組織のサンプルからのPCスコアが使用され、３つの可能性が計算され得る：組織が正常である可能性、組織がIDCである可能性、および組織がIDC_Mである可能性。組織は、最も高い可能性を与える群に割り当てられる。事実、楕円モデルを使用して、正常組織を８９％(１８サンプル中１６)で正確に同定し、他方、ガン組織を、９７％(３２サンプル中３１)で正確に同定した。さらに、楕円モデルを使用して、原発性(ＩＤＣ)ガンを１００％(１０サンプル中１０)で正確に同定し他方、転移性(ＩＤＣ_M)ガンを８２％で同定した。従って、楕円モデルは、原発性ガン組織（97％で正確に同定された）および転移性ガン（82％で正確に同定された）を正確に分類および識別するために特に良好に適合している。本発明は、FT-IRスペクトルデータのPCAによってDNAサンプルを分析し、そして驚くべきことに、非転移性腫瘍（「原発性腫瘍」）DNAへの非ガン性（「正常」）DNAの進行の方向が、転移性腫瘍への原発性腫瘍の進行の方向とは有意に異なるということを示す。既知の非ガン性腫瘍、非転移性腫瘍および転移性腫瘍サンプル由来のDNAサンプルのFT-IRスペクトルのPCAと、目的のDNAサンプルのFT-I RスペクトルのPCAとの比較によって、目的のサンプルが、これら３つの状態の１つであるか、または腫瘍状態の１つへ向けて進行中であるかどうかを決定し得る。例えば、本発明は、前立腺ガンの検出のための方法を提供する。本発明は、正常前立腺、良性前立腺肥大(BPH)および腺ガン由来のDNAに対して、フーリエ変換 -赤外(FT-IR)分光の主成分分析(ＰＣＡ)(PCA/FT-IR技術)を使用する技術を適用する。以下に詳細に記載されるように、これらの組織のそれぞれに由来するDNA を表す点のクラスターは、主成分(PC)スコアの二次元プロットにおいて、ほぼ完全に分離された。これは、DNA中の有意なそして特異的な構造的改変が、正常組織のBPHへの進行、および正常組織の前立腺ガンへの進行において生じ、そしてこの改変は２つの進行のそれぞれに特有であることを示す。構造的変化は、主に、核酸、ホスホジエステルおよびデオキシリボース構造の振動を表すスペクトル領域に反映される。BPHまたは腺ガンに対する正常前立腺の分離および分類は、赤外スペクトルのロジスティック回帰モデルを使用して、示される。同様に、DN Aスペクトルのロジスティック回帰モデルを本明細書中で使用して、BPHと前立腺ガンとの間の関係を評価する。前立腺組織由来のDNAの本特徴付けにおいて、主成分分析(PCA)により分析される赤外スペクトルの波数−吸光度関係を、空間中の点として表わす。各点は、DN Aの機能的な群の振動運動および回転運動を変化させ、したがってこの点の空間的配向を変化させる、DNAの構造的改変の高度に識別可能な尺度を表わす。前立腺組織へのPCA/FT-IR技術の適用は、正常な前立腺組織、BPHおよび腺ガン(前立腺ガン)由来のDNAを表す点のクラスターの実質的に完全な分離を提供する。BPH および前立腺ガンへの正常な前立腺組織の進行は、明確に異なるDNAにおける構造的変化を包含するようである。赤外スペクトルデータのロジスティック回帰に基づくモデルを使用して、組織がBPHまたは腺ガンである確率を計算する。驚くべきことに、このモデルは、正常対ガンおよび正常対BPHの分類に関しては100％の感受性および特異性を、そしてBPH対ガンに関しては100％近い感度および特異性を有する。したがって、本発明は、PCA／FT-IR技術が、危険予知および臨床適用についての適用可能性を有する、正常な前立腺組織、BPHおよび前立腺ガンの間を識別するに強力な手段であることを示す。本発明の最もポピュラーな使用は、ガンに関して個々の生物の健康を評価することであり得るようであるが、他の使用も存在することは種々の分野の当業者に明らかである。例えば、本発明は、環境災害(environmental hazard)の分析を可能にする。遺伝子毒性が未知である環境へ曝された後の生物のDNAを(本明細書に記載のとおりに)分析し、そしてそのプロフィールを、その環境への導入前のその生物のDNAから得られるプロフィールと比較すること(または、非汚染環境中の生物と比較すること)によって、その環境の遺伝子毒性の評価を行い得る。好ましい実施態様において、非汚染環境中の生物の種は、遺伝子毒性が未知である環境中の生物の種と同一である。本明細書中で使用する場合、用語「非汚染環境」には、化学的に汚染されていないかまたは特定の汚染物質が存在しないことを包含する。重要なことに、実施例は、FT-IR/統計学的技術の使用が、形質転換された細胞の出現前に、DNAにおける構造的変化を同定することについて、かなりの見込みを有することを示す。これらの変化が使用され、生物学および医学における潜在的に広範な適用を有する疾患確率モデルを確立し得る。他の適用本明細書中に記載されるFT-IR/統計学的技術は、生物学的システム（ここでは、 DNA構造における変化が、疾患の進展において重要な役割を果すことが知られるかまたはそのように疑われる）に集中している。本発明の方法が向けられ得る注目すべき例は、種々の形態のガン（参考文献２、４-６、８、９）、アルツハイマー病（参考文献10）、糖尿病（参考文献11）心臓病（参考文献12）およびパーキンソン病ならびに他の神経変性疾患（参考文献13）を含む。DNA変化はまた、電磁場とガンとの間の推定上の関係（参考文献14）、不妊症（参考文献15）、放射能の影響（参考文献16）、老齢化（参考文献17）、薬物の薬物動態学的評価（参考文献18）、および培養細胞における遺伝的変異（参考文献14）において潜在的に重要である。さらに、異なる塩基配置を有するオリゴヌクレオチドをその対応するスペクトル特性（統計学的モデルによって明らかにされるような）に関連付けする研究は、遺伝的変化の理解における技術の範囲を広げるために使用され得る。限定のためでなく例示のために以下の実施例を提供する。実施例実施例において、データの分析を、重心（「S字型」とも称される）モデルに従った。しかし、PCスコアに関するデータ取得および特徴付け、ならびにクラスター分析は、楕円モデルと同じである。楕円モデルにおいて、「域内値」PCスコア（クラスター分析によって同定されるような）を多変数正規分布（これは、本質的に、正規（ガウス）ベル型曲線の多変数一般化である）に適合させ、次いで特定の組織型から得られるベル型曲線を記載する種々の方程式を、判別分析にかけ、確率方程式を提供する。市販の統計学プログラム（例えば、SAS）は、適切なモデルを作成し得、そして生データ（PCスコア）が提供される場合、必要な弁別分析を実施し得る。より多くのデータが利用可能になるにつれて、SASプログラムはより正確な確率方程式を生成する。SASプログラムはまた、未知の定義された状態を有するサンプルからPCスコアを受け取り得、そして次いでこれらの値を、確率方程式に「挿入して」、そのサンプルのスコアが所定の定義された状態を有する確率を提供する。多くの統計学の教科書もまた、弁別分析および多変量正規ベル型曲線の構築の説明を提供する。図14は、顕微鏡分光計（System 2000、Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT）の FT-IRの写真および模式図、ならびにDNA構造を解明するためのその使用を提供する。引き裂いた組織から抽出したDNA（10〜15μg）を凍結乾燥する。乾燥してフワフワしたDNAを、メスで剥離される薄く、透明なフィルムを形成するように顕微鏡スライド上に圧延し、そしてBaF₂ウィンドー上に置く。可視ビームが光路上に導入される場合、顕微鏡を、フィルムへ焦点を合わせる。開口部へ挿入して、直径＞100μmの10の均一な領域を選択する。赤外ビームを光路上で切り換えそして各領域を通して焦点を合わせ、BaF₂ウィンドー上のバックグラウンドスキャン後、2000と700cm^-1との間でスキャンする。検出器中に記録された干渉写真は、吸光度スペクトルヘフーリエ変換されている。各スペクトルに基準線を引き（20 00と1700cm^-1との間の最小吸光度を中心とする、11の波数に亘る平均吸光度が、全吸光度から減算される）、そして次いでサンプルの光学特性（例えば、フィルム厚に関連する）について調整するために規格化する（基準線を引いたスペクトル吸光度全体は、1750と700cm^-1との間の平均で除算される）。これらの手順は、S-PLUS統計学的パッケージ(Mathsoft Corp.，Analysis Products Division，S eattle，WA)における単純な機能によって実施され得る。究極的に、総平均は、1 つの型の組織（例えば、健康な前立腺）のDNAについて得られる。これは、別の型の組織（例えば、前立腺ガン）の総平均と統計学的に比較され得る（４）。（図14A）2つの重ねられた総平均スペクトル。1700と1450cm^-1との間の吸光度値を、ヌクレオチド塩基のC-O伸び振動およびNH₂曲げ振動に割り当て、そして、1450 〜1300cm^-1を、NH振動およびCH平面内変形に割り当てる。PO₂ ^-構造の非対称伸び振動は、約1240cm^-1で生じ、デオキシリボースの振動は、一般に1150と950cm^-1 との間の吸光度値に割り当てられる（６）；（図14B）P値を不等分散t検定を使用して各波数について得た。P値≦0.05（1590〜1510cm^-1および1060〜1010cm^-1 の領域に示される）は、DNAサンプル間のスペクトル上／構造上の差異について明らかである。実施例１前立腺ガンＡ．組織入手、DNA単離およびPCA/FT-IRスペクトル分析：摘出後、各組織を液体窒素中で素早く冷凍した(flash frozen)。全ての組織を、使用に先立って−80 ℃に保ち、そして酸化を防ぐために抽出手順の間、純窒素雰囲気下でDNAを保持した。DNAをこの組織から単離し、そしてFT-IR分光用にアリコート(約20μl)に分割した。各DNAサンプルを、凍結乾燥により完全に乾燥し、純窒素でパージし、そして真空密閉ガラスバイアル中に−80℃で貯蔵した。合計31の組織サンプルを使用した。事故死した個体から得た前立腺組織の５つのサンプルを、組織学的に検査し、そして正常であることを確認した。これらはコントロールとして用いた。良性の前立腺肥大(BPH)の18のサンプルと、腺ガン(ガン)の８つのサンプルを試験サンプルとして用い、各サンプルは組織学的に同定された病変の部分を含む。全てのサンプルを、Cooperative Human Tissue Network，Cleveland，OH、から関連の病理データとともに得た。 I-series顕微鏡を備えるPerkin-Elmer System 2000(The Perkin-Elmer Corp. ，Norwalk，CT)を用いてIRスペクトルを得た。PCA/FT-IRスペクトル分析に関して、各スペクトルを、上記のように1750〜700cm^-1の範囲にわたって規格化した。これにより、平均が1.0である各波数に関する相対吸光度値を得た。ユークリッド距離を、全体のスペクトルに関してか、または準領域(sub-region)かどちらかの１対のスペクトル間の差を定義するために用いた。この基準距離測定を、考慮した波数(例えば、全体のスペクトル領域1750〜700cm^-1に関して1051)それぞれにおけるスペクトル間の吸光度の差の平方和の平方根として定義する。ユークリッド距離はまた、パーセントとしてより記述的な形式で表現され得る。このパーセントの分子は、所定の領域に関する波数の数の平方根で除されたユークリッド距離である。任意の領域について、このパーセントに関してここで用いられる分母は、1750〜700cm^-1の間の平均規格化吸光度であり、これはどの場合においても1. 0である。主成分(PC)分析(PCA)を、変数(各波数におけるスペクトル吸光度)の元の長いリスト中のほとんどの情報を捕捉する数個の変数(成分)を同定するために用いた。この変数の数の減少は、多くの個人のテストの点数(例えば、読解と算術)が単一の学業成績に統合される、教育の試験方法に類似している。４つのPCスコア( 例えば、４次元)は、規格化されたスペクトルの1051次元を記述するのに十分であることが見出された。PCスコアは、各スペクトルから減算された全てのスペクトルの総平均を用いて計算された。ノンパラメトリックSpearman相関係数は、患者の年齢およびGleasonスコアとのPCスコアの関連を評価するために用いられた。ノンパラメトリック分析は、いくつかの分布が歪んでいるか、または正規分布「ベル型」ではないために使用され、この歪みはPearson相関係数から推定される場合、統計学的有意性に偏りを導き得る。２つの症例(これは域外値であった)を、これらの分析から除外し、29の症例を残した。除外されたBPHサンプルおよび除外されたガンサンプルは、含まれた症例とは大きく異なるスペクトルを有していた。最も類似するスペクトルからのそれらのユークリッド距離は、それぞれ52％および41％であった。他のスペクトルの全ては、それらの「最近傍の」スペクトルと、せいぜい21％異なり、スペクトルの大半は11%未満だけ異なっていた。２つの域外値スペクトルは、1650cm^-1の付近の領域に劇的に減少した吸光度を示し、核酸の振動を表していた。 Kruskal-Wallis検定およびMann-Whitney検定を、３群が類似の多様性を有するかどうかを決定するために用いた。多様性を、その群の重心までのスペクトルの平均距離として定義した。順列検定を、３群が別々にクラスターを形成する(群におけるスペクトル特性の内部類似性を表す)傾向があるかどうかを決定するために用いた。自身の群(正常、BPHまたはガンのいずれか)内で、その最近傍のものまでの各スペクトルの距離を計算し、そして全てのスペクトルに関して、これらの最近傍距離の平均を検定統計量とした。この検定を、群のメンバーとしての標識を10²回ランダムに並べ替えて、各回ごとに検定統計量を再計算することにより実行した。群のランダムな再標識によって得られたものより小さな最近傍スペクトルまでの測定距離は、クラスター形成の指標である。この検定のノンパラメトリックな順位をベースとするものを、順位として各距離を表現することにより実行した。各スペクトルに関して、他のスペクトルまでの距離を順位付けし、そして順列検定を、距離を順位に置き換えたこと以外は上記のように行った。この検定統計量は平均順位である。再度、ランダムな並び換えから得られた平均より小さな観察された平均順位は、クラスター形成の指標である。距離を用いた検定および順位を用いた検定の両方を全体のスペクトル(1750〜700cm^-1)およびいくつかの準領域に関して実行した。最終的に、ロジスティック回帰分析を、PCスコアがDNA群の対(正常対BPH、正常対ガン、およびBPH対ガン)の間で識別するために用いられ得るかどうかを決定するためのモデルとして用いた。ロジスティック回帰分析は危険スコア（これは PCスコアの線形結合である）、およびサンプルが、想定された２群のうちの１つである予想確率(例えば、BPHが正常と比較された場合にBPHである確率)を与える。これらの予想確率は、選択された確率カット点とともに、サンプルを分類するために使用され得、そして感度および特異性、または正確に分類されたサンプルの割合の推定値を提供し得る。各分析に関して、カット点は感度および特異性を共に最大にするように選択された。Ｂ．PCプロットにおけるクラスター形成：PCA/FT-IRスペクトル分析は、1051 の波数にわたってスペクトル変動の合計90％を説明する４つの成分(１症例当たり４つのPCスコア)を与えた。すなわち、29のスペクトルの特徴の大半は、４つのPCスコア(PC1、PC2、PC3、PC4と称される)で記述され得る。最初の２つのPCスコアは変動の76％を説明し、そして２次元表示(図１)に関して適切であった。図１は、３群が異なってクラスター形成されたことを示す。この分析から除外された２つの域外値もまたこのプロットに表示され、そして主要なクラスターの右に現れる。域外値点から他の点までの実際の距離は、他の次元によって表される差のために、この２次元プロットに示される距離よりも大きい。群のクラスター形成の順列検定(1750〜700cm^-1)は、距離計測に基づて、P＝0.1を与え、そしてノンパラメトリック順位技法を用いた場合、P＝0.01を与えた(表１)。順位法によって得られたより大きな有意性は、それらの群のコアから１つまたは２つの症例の相対的分離(順位計測以上に距離計測に影響する配置)に起因する(図１)。これらの技法を用いて、有意なクラスター形成が２つのスペクトル領域に関して得られる： 1174〜l000cm^-1(ホスホジエステル-デオキシリボース構造のPO₂ ^-およびC-O基の強い伸張振動に割り当てられる)および1499〜1310cm^-1(核酸の弱いNH振動および CH面内変形に割り当てられる)。これらの領域に関する平均距離および平均順位のＰ値は、0.02〜＜0.001の範囲であった(表１)。得られた有意水準は、３群の観測されたクラスター形成が偶然起こったという帰無仮説を強く棄却する。全体として、この発見は、DNAがクラスター形成を生じるように変化し、そして結果的に正常な前立腺、BPHおよび前立腺ガンDNAの間の識別を示す(図１；表１および２)。詳細な比較は以下の対の群のスペクトル間でなされた：正常対ガン、正常対BP H、およびBPH対ガン。群間での平均規格化吸光度における差の統計学的有意性は、不等分散ｔ検定を用いて、1750〜700cm^-1間の各波数に関して評価された(図２；A〜C)。このプロットは２群のそれぞれに関する平均スペクトルの比較およびｔ検定からのＰ値を示す。P≦0.05である領域は、P＞0.05である領域より、偶然に起因する可能性がさらに少ない群間(例えば、正常対ガン)の差を表す。群間のスペクトル比較のそれぞれは、ホスホジエステル-デオキシリボース構造および核酸の振動に割り当てられるスペクトル領域における統計学的有意差を示す。ホスホジエステル-デオキシリボース構造に関する吸光度に有意差を有するスペクトル領域は類似している(約1050〜1000cm^-1)；しかし、核酸に関連する吸光度は群間で変化する。すなわち、正常−ガン比較に関して、有意差の領域は主に約14 75〜1400cm^-1(C=O伸張およびNH屈曲振動)であるが、一方、正常−BPH比較に関しては、それは約1600〜1500cm^-1である。BPH−ガンに関する比較は約1500cm^-1に集中する。正常−BPH比較およびBPH−ガン比較に関して、有意差は約1175〜1120 cm^-1の間に見られ、この領域はPO₂基の対称伸張振動を恐らく含む。これらのスペクトル領域の全ての平均の差は、図２の群当たりの平均スペクトルのプロットから明らかである。構造的な改変は、PCプロット(図１)およびクラスター間の明確な識別(表１)における、点の空間的な分布の中心である。表１同じ群の最近傍までの平均距離および非ランダムクラスター形成に関する順列検定。距離はスペクトル間の％差として表される；10²の順列が各スペクトル準領域に関して行われた。 ¹同じ群の最近傍までの平均ユークリッド距離を、パーセントとして表した。² 同じ群の最近傍までの各スペクトルのユークリッド距離の平均順位。Ｃ．クラスターの多様性：群の重心までの平均距離として表される３群の多様性は、有意には異なっていなかった(p＝0.8)。しかし、正常前立腺群は、BPH群( 平均距離＝14.5％)または前立腺ガン群(平均距離＝13.9％)よりわずかに多様ではなかった(平均距離＝11.7％)。原発性腫瘍に生じた増加した構造的多様性は、おそらく悪性の細胞集団を潜在的に引き起こすDNA形態を選択することにおいて重要な要因である。Ｄ．群の分類：PCスコアは、ロジスティック回帰を用いて群の対を比較する場合に、患者を数群に分類するために容易に用いられ得る。ロジスティック回帰モデル(表２)は、PCスコアの値をこの方程式に代入した場合に、危険スコア「R」を与える方程式である。Rは以下の標準統計方程式によって確率に変換される：確率＝exp(R)/[1+exp(R)]。カット点が選択され、そして確率がこのカット点を上回った場合、この症例はBPHとして分類される。実際のカット点を以下に記す。表２に示されるように、正常対ガンおよび正常対BPHに関するモデルは、各群を1 00％および全体として100％正確に分類する(各症例のＰ値は＜0.001であった)。 0.1以上の予想確率について「ガン」と指摘することに基づけば、ガン対BPHに関する正確な分類率は、90％に近かった。（0.15〜0.41の確率カット点は、BPH対ガンの比較において同様の正確な分類率を達成する。）表２のモデルに基づいた予想確率を図３に示す。個々の危険スコアは適切なPCモデル(表２)を基にし、そして上記のように、予想確率は危険スコアの数学的関数である。全てのBPHおよびガンの症例は1.0に極めて近い予想確率を有し、そして全ての正常症例は、BPHまたはガンを正常症例に比較した場合、0.002以下の予想確率を有する。予想確率におけるこれらの顕著な識別は、図１に示すように、群の明確な分離を確認する。ガンをBPHと比較する場合、予想されるガン確率は0.42〜1.00の範囲であり、そして予想されるBPH確率は0.00〜0.65の範囲であった。分析から省略された２つの域外値は、この発見を支持する傾向にある。域外値 BPHおよびガン点はPCプロットの右にある(図１)。これは、正常からBPHおよび正常からガンへの進行で見られる同じ方向であり、域外値DNAがより高い構造改変を有することを示唆する。表２に示されるモデルが２つの域外値を分類するための用いられる場合、BPH域外値は、正常対BPHのモデルを用いて、1.0に近い予想B PH確率で正確に分類される。ガン域外値もまた、1.0に近い予想BPH確率で正常対ガンのモデルにおいて正確に分類される。BPH対ガンのモデルにおいて、BPH域外値は０に近い予想ガン確率で正確に分類される；しかし、ガン域外値は０に近いガン確率でBPHとして誤って分類される。表２ BPH(対正常)、ガン(対正常)およびガン(対BPH)の確率に関するロジスティック回帰モデル。正常、n＝５。BPH、n＝17。Ｐ値は、各モデルが群メンバーを予測しないという帰無仮説に基づく。Ｐ値は、偏差値の変化に基づいてカイ２乗検定から計算される。 ^*症例の確率が特定の群に分けられるという帰無仮説に関するＰ値は、PCスコアに無関係である。Ｅ．年齢とGleasonスコアとの関係：年齢は、これらの群間の顕著な識別の生成に関する因子ではないようである。しかし、前立腺ガンの発生は、50歳を超えると顕著に増加する。これらの３群の年齢の範囲は、正常について16〜73歳(ｎ＝５)；BHD、58〜73(ｎ＝17)；およびガン、61〜76(ｎ＝７)であった。年齢と４つのPCスコアの各々とのSpearman相関の間には、統計的有意性はなかった(Ｐ＜0 .05)。全てにおいて、これら３群の各々において、ならびにこれらの群の全ての対(例えば、正常とBPH組織との組み合せにおける各PCスコアに相関する年齢)において、および29症例のプールされたセット全体において、各PCスコアに相関する年齢からなる28の相関が考慮された。Spearman相関は、大きさが0.01〜0.59の範囲(Ｐ＝0.09〜Ｐ＝1.0)であった。最も有意な相関は、正常とガンとを組み合わせた群における年齢とPC4との間でｒ＝−0.51であった(Ｐ＝0.09)。PC4がロジスティック回帰分析から除外され、そしてモデルがPC1〜PC3に基づく場合、表２のＰ値に対応するＰ値は、上から下へ、Ｐ＜0.001、Ｐ＜0.001およびＰ＝0.005 であり、これは、これらの群間の非ランダムな識別を再度支持した。PC4に基づくこれらの結果、および年齢と他のPCスコアとの間の弱いまたは有意でない相関は、これらの群間を識別するためのスペクトルの使用可能性における、年齢のいかなる役割も支持しない。腫瘍の状態を分類するための微視的に表される構成的変化を使用するGleason スコアは、PCスコアとほとんど関連性を有さなかった。しかし、ｎ＝７のガン症例に基づけば、強い関連性以外を検出する制限された力が存在した。PCスコア１〜４とGleasonスコアとのSpearman相関は、−0.49〜＋0.26の範囲(Ｐ＝0.2〜0.8 )であった。Ｆ．確率のロジスティック回帰モデル：前立腺についてのＳ字状曲線(図３)は、正常状態およびガン状態と正常状態およびBPH状態との間で急激な移行を示す。これらの移行は、中間的確率の症例の欠如により特徴づけられ、これは、図１におけるこれらの群の明確な分離に対応する。従って、DNAの修飾におけるいくつかの点で、ガン確率の急速な増加を導く重要な構造変化が、明らかに起きる。 BPHは、前立腺ガンに病因学的に関連することは知られていない。しかし、BPH 対前立腺ガン曲線(図３Ｃ)が中間的確率を有するいくつかの場合を示すことは興味深い。図１における症例の相対的配置はまた、BPHが前立腺ガンの直接の前兆であるという議論のある見解に対するいくつかの洞察を提供する。この知見は、正常群から始まり、BPH群がガン群を「超えて」位置するというこのコンセプトを支持しない。この位置付けは、BPHからガンへの移行が、ガンと関連することが示されているいくつかのスペクトル遷移の逆転を伴うこと、またはガンへの進行における逆転を模倣するBPH DNAのさらなる変化が存在することを示唆する。あるいは、修飾により、種々の非新生物病変(BPHを含む)を導くDNA構造をもたらし得る。BPHは、前立腺ガンの直接の前兆であり得ないが、PCA/FT-IRスペクトル分析は、BPH DNAの構造的状態に基づいて、前立腺ガンの発生を予期する有望な手段を提供し得る。正常対ガンの曲線および正常対BPHの曲線における移行状態の不在は、興味深い。これは、０％と100％確率との間のDNA値を有する「移行」組織(図３、Ａ〜Ｃ) が本研究の部分でなかった事実のためのようである。前立腺での証拠は、DNA構造が、微環境における因子(特に・OH)に応答して進行的に変化することを示唆し、この因子は、議論上、細胞病変、前立腺腫瘍(腺ガン)およびBPHの発達に病因学的に関連するようである。これらの組織の遺伝的不安定性または同様にガンの危険性の増加を未然に防ぐか治すための介入は、細胞のレドックス状態および・OH濃度を制御することに焦点を当てるべきである。これらのアプローチは、H₂O₂から・OHへの鉄触媒転化の制御(Imlayら、Science 2 40:640-642，1998)；ホルモンのレドックスサイクルによる・OH生成の調節(HanおよびLiehr carcinogenesis 16:2571-2574，1995)および環境的生体異物(Bagchi ら、Toxicology 104:129-140，1995)；ならびに抗酸化剤／還元剤治療(Amesら,P roc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7915-7922，1993;Bastら、Am．J．Med．91(Supp l．3C):2S-13S，1991)を含み得る。実施例２乳ガンＡ．組織獲得、DNA単離、およびPCA/FT-IRスペクトル分析：組織を、Seattle 病院およびCooperative Human Tissue Network(Cleveland，OH)から得た。胸部の侵襲性腺管ガンを有するがリンパ節の関与を有さない(IDC)12人の患者から計1 2の組織を得た。これらのうち、１つは多巣性(第２の病巣は、印環細胞ガンであり、これは評価されなかった)であり、そして１つは、両側性の乳ガン(その一方を評価した)。侵襲性腺管ガンを有し、転移性ガンに関して陽性の１以上のリンパ節を有する(IDC_m)25人の患者から計25の組織を得た。記載された２つのIDCを除いて、非転移性群および転移性群には、異常な組織学は起こらなかった。腫瘍サイズは、病理学報告で記録したように、腫瘍の最大寸法を基準とした。ガンでない乳組織(RMT)を、乳腺肥大手術(乳房縮小形成術)を経験した21人の患者から得た。ルーティン的な病理学は、これらの組織にところどころの非新生物(例えば、線維性嚢胞)病変以外の細胞変化を示さなかった。摘出後、各組織を液体窒素中でフラッシュ凍結(flash frozen)し、そして−8 0℃で保存した。この組織からDNAを単離し、脱イオン水に溶解し、そしてFT-IR 分光用のアリコートとした(約20μg)。各DNAサンプルを、凍結乾燥により完全に乾燥し、純粋な窒素でパージし、そして−80℃で、脱気され密封されたガラスバイアル中に保存した。全てのサンプルを、FT-IR分析で分析した。 IRスペクトルを、1-シリーズ顕微鏡を備えるPerkin-Elmer System 2000(The P erkin-Elmer Corp.，Norwalk CT)を用いて得た。各スペクトルを、2000〜700cm^- ¹ の各整数波数での吸収により特定した。1750から700cm^-1までの間隔(これは、スペクトルの中の主要な変化を全て含む)のみを、この分析に含ませた。ベースライン調整および規格化を行った。１つのRMTを２つのセクションで表した。これらの２つの調整され規格化されたスペクトルの平均をこれらの分析において使用した。乗法規格化因子を、1750〜700cm^-1での吸光度に適用した。重水素交換を用いても、吸湿性がDNAのスペクトル特性に寄与することの示唆は見出されなかった。Ｂ．統計的分析：FT-IR分析を用いる全DNA構造の分析のために、主成分分析(P CA)を用いた。PCA方法論は、互いに独立であり、かつ変数のオリジナルの長いリスト中の大部分の情報を捕捉するいくつかの変数(成分)を発見する目的で、１セットの変数に適用される統計的手順である。この方法論は、関係する変数の数を著しく減少させ得る。PCは、全母集団に対する分散の最大量を占める第１のPC( 変数の一次結合)を見出すことにより総分散を分配する。次いで、PCA方法論は、第１のPCに依存しない二次結合を見出し、それによってそれは分散の次に大きな量を占める。この手順は、多くの独立するPCAが、総分散の重要な部分を説明することが見出されるまで続けられる。この文脈内で、PCAは、スペクトルの集合にわたる吸光度−波数変化の主要な特徴を同定し、そしてその変化を簡潔に記述するための方法であった。 PCAを用いると、スペクトルに対して「構築ブロック(building block)」として作用するいくつかの成分を同定し得る。PCAの後、各スペクトルは、いくつかのP Cスコアにより表され得る。PCAを、個々のスペクトルから減じられる総平均スペクトルを用いて行った。分析の前に、データセットの(平均値付近の)総変化の少なくとも90％を説明するのに十分な成分を保つことを決定した。スペクトル間の差のいくらかが年齢によるものであるかどうかを決定するために、年齢と各PCスコアとの間の相関を計算した。ガン群および非ガン群(IDCm、IDCおよびRMT)のスペクトルの関係を視覚化するために、最初の３つのPCスコアに基づいてプロットを構築した。これらの２次元および３次元プロットは、任意の単一の標本データセットの最も有意な成分のうちの２または３を同時に試験することを可能し、そして、互いの各データセットの意義ある比較を可能にする。Ｃ．スペクトルプロフィールの主成分分析：スペクトルプロフィールは、IDC_m 群のかなりの多様性およびIDC群の同質性を明らかにした。図４は、PCAに基づくスペクトルの３次元表記を示す。このプロットにおける位置は、主にピークの高さ、幅、および位置として表される吸収スペクトルにより決定される。このプロットの上部にはIDCのコアクラスターが存在する(黄色の丸で示される)。このプロットの左下部には２つのIDCがコアクラスターから十分に離れた域外値である。特に、１)印環細胞ガンの第２の病巣を有するIDC、および２)両側性の乳ガンが存在する。このプロットから明らかなように、IDC_mクラスター(マゼンタ)およびRTMクラスター(青)は、コアIDCクラスターよりかなり大きく、これは、かなりのスペクトル多様性を示す。クラスターのサイズは測定され得、そしてそのスペクトルの多様性は、クラスターの重心からのメンバーまでの平均距離により表され得る。この距離は、クラスターメンバーと、そのクラスターの平均スペクトル(その重心に位置する)との間の、波数当たりの規格化された吸光度におけるおよその％差として表され得る。％差として表される距離は、以下のように計算される：ａ)1750〜700cm^-1の波数にわたる規格化された吸光度における差の二乗平均を100％に合わせ、次いでこれを、ｂ)1.0(大部分のスペクトルに対する近似平均規格化吸光度)で割る。クラスターサイズの比較のために、各群の重心から異常に離れた距離に位置する３つのRMT、３つのIDC_mおよび２つのIDCを、RTM、IDC_mおよびIDCのコアクラスターを規定するために除いた。全ての域外値は、これらのクラスターの任意のメンバーとは少なくとも20％の差を有した。残りの症例の重心および距離に基づいて、スペクトル多様性(重心からの平均距離)は、IDC_m群について12.4％、IDC群について7.3％、およびRMT群について9.2％であった。群間の多様性の差についてのおよそのＰ値は、域外値を除いた中心までの距離を比較するMann-Whitney検定に基づいた：IDC対IDC_mについてＰ＝0.003、RMT対IDC_mについてＰ＝0.04、およびR MT対IDCについてＰ＝0.4。(これらのＰ値は、距離間の依存性が、共有重心の計算により導入されるので近似値である。） 58サンプル(RMT、Ｎ＝21；IDCm、Ｎ＝25；IDC、Ｎ＝12)の初期PCAに基づいて、４つの域外値を検出した。すなわち、FT-IRスペクトルが群の残りのものから著しく離れ、かつ域外値のPCスコアを有した標本を検出した。PCAを繰り返して、まずこれらの４つの域外値を除去した。次いで、PCスコアを、他と同様の方法でこれらの域外値について計算した(54サンプルの総平均スペクトルを減じ、次いで各々の残余のスペクトルをPC固有ベクトルに投影する)。54サンプルの吸光度における変化の91％が最初の５つの成分により説明されることが見出された。これは、スペクトル間の変化が高度に体系化されることを意味する。1750から70 0cm^-1までの1051の波数は、1051次元の変化を潜在的に構成する。この変化の90 ％超が、わずか５次元により表され得る。 PCスコアと年齢との弱い相関のみが存在したが、いくつかの相関は、組合わされた全てのサンプルについて統計的に有意であった。年齢とPCスコアとの間の相関は、以下の通りであった：成分および年齢についてｒ=0.21(Ｐ＝0.1)、成分２についてｒ＝0.29(Ｐ＝0.003)、成分３についてｒ＝0.03(Ｐ＝0.8)、成分４についてｒ＝0.25(Ｐ＝0.06)、および成分５についてｒ＝0.30(Ｐ＝0.02)。これらの相関の小ささは、年齢によるスペクトル構造への影響は非常に小さいことを示唆する。さらに、統計的に有意な相関(PC-2およびPC-5)でさえ、人為的結果であるようである。なぜなら、ガン群および非ガン群それぞれにおけるPCスコアと年齢との間の相関は、非常に弱く(大きさが0.18未満)、そして有意でない(最小Ｐ＝0 .4)からである。実質的に真の相関の検出を可能にするべく全ての群について年齢の範囲が広い：全てのサンプルについて17〜89、ガン(IDC_mおよびIDC)について26〜89、およびRMTについて17〜63。PCスコアと陽性のリンパ節の数または割合との統計的に有意な相関もなかった。図５Ａは、図５Ｂに示される３次元PCAプロット上にて近接して位置する２つの「域外値」(図４における「Ａ」および「Ｂ」）の重ねたスペクトルを示す。実際のスペクトルは、規格化された吸光度平均でわずか３％異なり、スペクトル表現型の特徴付けにおいて高い精度を示唆する。前述の２つのIDC域外値はまた、スペクトルプロフィールがコアIDCクラスターとは異なる。図６Ａおよび６Ｂは、IDCコアクラスターの平均規格化スペクトル上に重ね書きされたこれら２つのスペクトルを示す。スペクトル領域の大部分にわたって差異が著しいが、特に以下の領域において差異が著しい：1700〜1350cm^-1、約1240cm^-1でのピーク、および約1180 〜900cm^-1。これらの領域は、一般的にその塩基のN-HおよびC-O振動、ホスホジエステル基のPO₂非対称伸縮振動、およびデオキシリボースのC-O振動を表す。関連するデータセット(例えば、IDC標本)の重心が計算され得、ここで、その重心は特定の種の標本に関連するスペクトルの加重平均とみなされることは、上記された。このような活量は、分析された３つのタイプの標本のPC1およびおよびPC2値について図７に示される。この図において、RMT標本の重心からIDC標本の重心へのベクトルが、このグラフの左側に示され、そしてRMT状態からIDC状態へのスペクトルプロフィールのシフトを表す。この方向は、初期の方向を継続し、そしてIDC重心からIDC_m重心へのベクトルとの比較のための参照を確立する。ベクトル回転の程度(RMT-IDCベクトルと比較して)を表３に示す。表３従って、IDC状態からIDC_m状態へのDNAへの効果が、分析されたスペクトルにわたって広がるだけでなく、比較的一貫性があることが理解され得る。さらに、この方向の変化の暗示は、DNAへの攻撃が続くにつれて、明確な、定量可能な、そして予想可能なDNAスペクトルプロフィールの、１つの状態から別の状態への動きがあるという主張に支持を与える。図８および９は、標本の３つの種の間におけるスペクトルの区別を強調するために提供されている。図８において、それぞれの種についてのそれぞれの重心に対するスペクトルが示される。これらの曲線から総平均を引算した後、図９において最もよく示されるように、それぞれの種についての平均の偏差が、種の間で特徴的な固有のスペクトルを容易に識別可能にする。図１０においては、FT-IRで得られたデータセットを用いて、一般的にＳ字形の曲線が確立される。非ガンからガンへの移行はシャープであり、このことは、曲線上のサンプルの「位置」に依存して、ガンの発現は、究極的には比較的小さい刺激により開始され得ることを示している。Ｄ．組織獲得および長期間貯蔵のための別の手段：FT-IR分析のための種を得るためおよび保存するための上記の方法に対する代替的手段としては、獲得および初期の調製の後に、種をパラフィンブロックに包埋することが望ましい場合がある。標本の分析が望ましい場合、パラフィンに包埋された組織(PET)は、脱ワックスされ、そして通常の技術(例えば、フェノールおよび／またはクロロホルム溶液の適用)を用いることにより、DNAが単離される。標本の純度を測定した後、FT-IRによる分析のために、DNAは、水溶液中に配置され、真空下で乾燥され、そしてフッ化バリウムウインドウに塗布される。スペクトル分析のためのPET標本の使用は、DNA分析のために利用可能なサンプルの数を非常に増大させる。なぜならそれは、分析のための特殊なバイオプシーを待ち、そして得ることを必要とせず(標本は、最近においては、容易に貯蔵され得そして取り出され得る)、そして同一組織標本の遡及的なフォローアップ研究が迅速かつ経済的に行われることを可能にするからである。実施例３肝臓ガンＡ．材料および方法：比較的清浄な田舎の環境[Quartermaster Harbor、WA]および化学的に汚染された都会的な環境[Duwamish River、Seattle、WA]から、イングリッシュソウル(English sole)を得た。それらの肝臓を組織学的に試験し、そしてガンがないことが分かった。しかしそれらは、汚染された環境由来の魚に特徴的な様々な非腫瘍性の病変を含んでいた。 Duwamish Riverは、重工業地帯を通って、Puget Soundに流れ込む。沈殿物は様々な発ガン物質および他の生体異物(例えば、多核芳香族炭化水素および塩素化除草剤残留物)を含む。しかし、修復プログラムは、沈殿物汚染を減少させるように進行中である。２つのソウルの群(DUW93、n=8；およびDUW95、n=10)を、Duwamish Riverから得た。修復プログラムのために、DUW95サンプルは、DUW93サンプルよりも顕著に少ないが、QMHサンプルよりは多い沈殿物汚染を反映することが予想される。Qua rtermaster Harbor、WAからの魚は、コントロールとしての役割をした(QMH、n=7 )。QMH、DUW95およびDUW93の魚の長さ±SDは、それぞれ、29.5±4.2cm、23.6±1 .6cm、および24.1±0.8cmであった。重量は、254.3±115.0g、125.6±16.2g、および125.0±22.5gであった。肝臓組織からのDNAの単離およびFT-IRスペクトルのPCA分析を、上記のように行った。それぞれのFT-IRスペクトルを、1750〜700cm^-1の範囲にわたって規格化した。PCAを使用して、オリジナルの、長いリストの変数(1750から700cm^-1までの1051の波数のそれぞれでのスペクトル吸収)のほとんどの情報を捕捉するいくつかの変数(成分)を同定した。PCスコアは、それぞれのスペクトルから引き算された全てのスペクトルの総平均で計算された。従って、PCスコアは、総平均スペクトルから異なるにつれて、スペクトルの(構造的な)特徴の変動を示す。Kruska l-Wallis(KW)検定およびMann-Whitney(MW)検定を使用して、PCスコアの群間の相違の統計的な有意性を計算した。同じ手順を用いてスペクトル多様性の相違について検定し、これは、群について、スペクトルから群重心までの平均距離として規定された。不等分散ｔ検定を用いて群間の平均規格化吸収を比較した。ｔ検定は、1750から700cm^-1までの1051の波数のそれぞれにおいて行われた。長さおよび質量に反映される魚の年齢は、強力に交絡する変数であり、そしてこの可能性は、分析にアドレスされた。Ｂ．結果：図１１は、汚染されていないことがわかっている場所から得た標本 (青い球−PC2ラインの左の暗い球)；汚染されていることがわかっている領域から得た標本(黄色い球−PC2ラインの左の明るい球)；および汚染沈殿物を除去するための有意な清掃および／または環境運動の前の汚染されていることがわかっている同一の領域から得た標本(えび茶色の球−PC2ラインの右の中程度の濃さの球)を用いた、最初の３つのPCスコアについてのPCAを示す。図の精査により理解され得るように、胸組織において遭遇する分布に似た分布が、魚の肝臓のDNAに存在する。最初の３つのPCスコアに由来する点のクラスターは、QMHおよびDUW群からのDN Aのスペクトルの特徴を要約し、３次元投影図に示される(図11)。すべての群がP Cスコアの同一の平均値(従って、同様のスペクトル)を有するという仮説は、棄却され(KW P値＜0.001)、そして任意の２群がPCスコアの同一の平均値を有するという仮説も棄却される(MW P値0.04〜＜0.001)。３群は、重なることなく別々である(図11)。PC1およびPC2は、合わされて、スペクトル変動の94％の割合を占め、従って遭遇するスペクトルの多様性を示すための良好な手段を提供する。PC 3は、表示目的のために使用される(図11)が、それは、スペクトル変動の３％を説明するに過ぎない。群間の相違は、多くの頻度で発生する。図12の各パネルの上部は、２群(QMH-D UW93；QMH-DUW95；およびDUW95-DUW93)のそれぞれについての平均スペクトルを示す。パネルの底部は、１波数につき１つのＰ値で、各スペクトル比較についてのＰ値を示す。比較は、1051の波数の78〜87％で、Ｐ<0.05を得、従って、DUW93 およびDUW95群からのDNAの構造が、互いに、そしてQMH群から顕著に異なることを実証している。従って、この発見は、実質的に、平均の、規格化されたスペクトルが群間で同じである、という帰無仮説を無効にする。スペクトル相違は、PO₂ 構造の非対称伸縮振動(≒1240cm^-1)に関して顕著である。このスペクトル領域におけるバンドは、QMH群に存在するが、DUW93およびDUW95群でのスペクトルでは実質的に失われている。他の主要な相違は、核酸(≒1700〜1450cm^-1)およびデオキシリボース(≒1150cm〜950cm^-1)に関する振動を示すスペクトル領域において明らかである。 PCスコアを基にして、サンプルが100％正確に群に分類され得る(分離される) ことが自明である(図11、表４)。表４群による主成分のスコアおよび群間相違の統計的有意性図11は、QMH群と比較して、DUW93およびDUW95の群において、スペクトルの多様性(点の広がりに注意)が実質的に大きいことを示す。群間で変動する多様性およびそれらを分離するスペクトル相違はまた、図13において明らかである。図13 では、個々のスペクトルまたはそれぞれの群が重ね書きされている。QMHスペクトルの密接性(tightness)およびQMHからDuwamish River群へのスペクトル多様性の増加は、およそ1700〜1450cm^-1の領域で顕著であり、これは、核酸の強力なC- O伸縮およびNH₂屈折振動を含む。また、DUW93群において、他の群と比較して、核酸の弱いNH振動およびCH平面内変形に帰属される、1400cm^-1領域での吸収およびスペクトル多様性の明白な増加がある。およそ1150〜950cm^-1の領域は、デオキシリボースに関する強力な伸縮振動を含み、QMHからDUW95に、スペクトル多様性が増加するが、DUW93群では、密接している(tighten)。スペクトル特性間の相違は、表４に示される群間の区別およびおよび図11における増加するクラスターの多様性と一致する。多様性相違に関する形式的な検定(すべての群が群重心からの同じ平均距離を有するという帰無仮説についてのKW検定)は、Ｐ＝0.002を得、群間の等しくない多様性を強力に示唆している。重心までのこれらの平均距離は、多様性を測定する尺度を提供する。より大きな平均距離は、群がより広がっていること(図11)；すなわち、スペクトルがより多様性であることを示す。DUW95群は、QMH群の平均距離の４倍の平均距離を有し、４倍大きい多様性を示す(表５)。３つのうち２つのペア(pairwise)の多様性の比較は有意である(p<0.05)；しかしながら、DUW95 およびDUW93の群間の比較は、有意ではない(MW P値=0.2)が、DUW93群(最も変更された塩基構造を有するDNAを表す)は、DUW95群よりも多様性である。表５３群についてのスペクトル多様性Ｐ値についての帰無仮説：(1)３群はすべて、同じ平均多様性、KW P値＝0.0 02を有する；(2)平均QMH＝平均DUW95、MW P値＝0.003；(3)平均QMH＝平均DU W95、MW P値＝0.2 群の多様性が変化することは、年齢の変数によるものではないようである。QM H群は、長さおよび質量において最も多様性であったが、最小のスペクトル多様性を示す。QMH群は、DUW95およびDUW93群のそれよりも２〜５倍長い、長さSD、および５〜７倍大きい、質量SDを示す。しかし、QMHスペクトルからそれらの重心までの平均距離は、Duwarmish群のそれよりも２〜４倍小さい。年齢がスペクトル多様性の有意な因子であるならば、これらの結果は、非常に矛盾する。長さおよび質量もまた、場所によりもたらされるスペクトルの相違における影響をほとんど有さないようである(図11)。回帰分析において、長さおよび質量の組合せは、PC1の変動の７％およびPC2の変動の40％を説明するだけである。スペクトルの多様性を説明する際に、PC1は、非常に、より重要な成分である。長さおよび質量は、全体のスペクトル変動の約９％を説明するに過ぎないが、場所は、77％を説明する。 QMH、DUW95およびDUW93の魚から単離されたDNA構造は、PCプロットが完全なクラスターの分離を明らかにする(図11)ということにおいてそれぞれ独特である。さらに、露出された群からのDNAは、実質的に、コントロール群のものよりも多様性であり、そしてDUW93群は、DUW95群よりも多様性である(表５、図11)。これらの区別は、有意に年齢関連ではないが、異なる環境因子によりDNA中に誘導される構造的特徴から起こり易い。環境因子の中で、クラスター分離および多様性の相違に寄与しやすいのは、沈殿物の毒性化学物質への露出のタイプ、程度および期間である。スペクトルの領域において３群間に発生する著しい相違は、核酸およびホスホジエステル-デオキシリボース構造に帰属され(図12および13)、これらの構造の変化がクラスターの分離および群間の多様性の相違に実質的に寄与したことを示唆している。２つのDuwamish River群を代表するクラスターの多様性には、参照群の密な(t ight)クラスターと比較して、統計的に有意な増加があった(図11、表５)。増加した多様性は、それが悪性の細胞表現型を生じるDNA形態の選択のためのステージを設定するという点で、発ガンにおいて特に重要であり得る。露出された魚群の高度の多様性は、同じ機能を果たし得る。 PCプロットのクラスター分離は、上記、前立腺ガン(実施例１)および乳ガン( 実施例２)の研究で記載された。例えば、前立腺において、正常組織からのDNAおよび腺ガン組織からのDNAの間で完全な区別が達成された。同様に、本実施例においてもクラスター間での完全な区別が得られ、これによりDNA構造が、DNAの新しい形態を示す独特な特性を有することが実証された。Duwamish Riverの魚が肝臓腫瘍になり易いことを考慮すると、DUW95およびDUW93群に見いだされたDNAの明確に異なる形態は、ガンの進行において、重要なステージを構築するようである。本実施例は、環境化学物質に露出されたイングリッシュソウルのDNAへの損傷が、DNAの新たな、多様な形態を導くことを示している。これらの新たな形態は、発ガンにおいて中心的な役割を果たし得、そして究極的には、魚の集団における肝臓ガンの発生に寄与し得る。さらに、この結果は、環境化学物質が、上記の、乳ガンおよび前立腺ガンに見いだされるDNAの新たな形態を生成する役割を果たすかどうかの問題を提起する。本明細書中に記載されたすべての刊行物および特許出願は、本明細書中において、同じ範囲において、それぞれの個々の刊行物または特許出願が特別にそして個々に参考として援用されるかのように、参考として援用される。前述したことから、説明の目的のために、本発明の特定の実施態様が本明細書中に記載されたが、様々な改変が、本発明の精神および範囲から離れることなくなされ得ることが明らかである。

Claims

【特許請求の範囲】１．組織の状態を規定する方法であって： (ａ)第１の複数の組織サンプル由来のＤＮＡをフーリエ変換−赤外(ＦＴ−ＩＲ)分光にかけてＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｂ)工程(ａ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを主成分分析(ＰＣＡ)により分析して、主成分(ＰＣ)スコアを提供する工程； (ｃ)クラスター分析を工程(ｂ)のＰＣスコアに適用して、域外値および非域外値の組織サンプルを識別する工程；および (ｄ)非域外値組織サンプルからのＰＣ値と最良に適合する多変量型の正規ベル型曲線を規定する、第１の方程式と呼ばれる、方程式を作成する工程であって、該第１の方程式は、該第１の複数の組織サンプルの状態を規定するを包含する、方法。２．第２の複数の組織サンプルを用いて工程(ａ)〜(ｄ)を繰り返して、第２の方程式を提供する工程をさらに包含し、該第２の方程式が、該第２の複数の組織サンプルの状態を規定する、請求項１に記載の方法。３．多変量弁別分析を前記第１および第２の方程式に適用して、それぞれ第１および第２の確率方程式を提供する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。４．請求項３に記載の方法であって、 (ｅ)目的の状態を有する組織からのＤＮＡサンプルを、ＦＴ−ＩＲ分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｆ)工程(ｅ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータをＰＣＡによって分析して、１セットのＰＣスコアを提供する工程；および (ｇ)工程(ｆ)のＰＣスコアを、前記第１および第２の確率方程式のそれぞれと組み合わせて、それぞれ第１および第２の確率スコアを提供する工程をさらに包含する、方法。５．前記組織が、乳房、泌尿生殖器、肝臓、腎臓、膵臓、肺、血液、脳または結腸直腸の組織である、請求項１に記載の方法。６．前記組織がガン性組織である、請求項１に記載の方法。７．前記組織が、ガン性の乳房、前立腺、卵巣、または子宮内膜組織である、請求項６に記載の方法。８．環境の遺伝子毒性を評価する方法であって： (ａ)第１の環境における複数の第１の生物に由来するＤＮＡを、フーリエ変換 −赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｂ)工程(ａ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを主成分分析(ＰＣＡ)により分析して、主要成分(ＰＣ)スコアを提供する工程； (ｃ)クラスター分析を工程(ｂ)のＰＣスコアに適用して、域外値および非域外値の生物を識別する工程；および (ｄ)非域外値生物からのＰＣ値に最良に適合する多変量型の正規ベル型曲線を規定する、第１の方程式と呼ばれる方程式を作成する工程であって、該第１の方程式が該第１の環境中の該第１の生物を規定する、工程を包含する、方法。９．請求項８に記載の方法であって、第２の環境からの第２の生物を用いて、工程(ａ)〜(ｄ)を繰り返して、第２の方程式を提供する工程であって、該第２の方程式が該第２の環境中の該第２の生物の状態を規定する、工程をさらに包含する、方法。１０．請求項９に記載の方法であって、多変量弁別分析を、前記第１および第２の方程式に適用して、それぞれ第１および第２の確率方程式を提供する工程をさらに包含する、方法。１１．請求項１０に記載の方法であって、 (ｅ)目的の環境に由来する目的の生物のＤＮＡサンプルを、ＦＴ−ＩＲ分光にかけて、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを作成する工程； (ｆ)工程(ｅ)のＦＴ−ＩＲスペクトルデータをＰＣＡにより分析して、１セットのＰＣスコアを提供する工程；および (ｇ)工程(ｆ)のＰＣスコアを、前記第１および第２の確率方程式のそれぞれと組み合わせて、それぞれ第１および第２の確率スコアを提供する工程をさらに包含する、方法。１２．前記第１および第２の環境のうちの少なくとも一方が、汚染された環境である、請求項９に記載の方法。１３．前記第１および第２の生物は非同一であるが、前記第１および第２の環境が同一である、請求項９に記載の方法。１４．前記第１および第２の生物は同一であるが、前記第１および第２の環境が非同一である、請求項９に記載の方法。