KR20170034438A - 통증 치료에서의 cyp2j2 길항제 - Google Patents

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pain
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antagonist
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cyp2j2
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마르코 시시크나노
크리스티안 브렌나이스
클라우스 숄리히
게르트 가이쓰링거
세바스티안 진
미하엘 존 파른함
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프라운호퍼-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 안게반텐 포르슝에.파우.
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Abstract

본 발명은 신경병증성 통증, 특히 화학치료-유도 말초 신경병증성 통증(CIPNP)의 신규한 치료에 관한 것이다. 본 발명은 신경병증성 통증, 예컨대, CIPNP의 치료에 사용하기 위한 치료제로서 사이토크롬 P450 에폭시게나제(CYP) 길항제, 더욱 구체적으로 CYP2J2의 길항제를 제공한다. CYP2J2 길항제는 생체내 CIPNP를 개선하는 것으로 확인되었고, 따라서 질병, 예컨대, 암 또는 다른 증식성 질환의 치료를 위한 화학치료제와 조합하여 추가적으로 제공된다. CYP2J2 길항제는 화학치료-유도 통증을 감소시키고, 이에 따라 암 치료 동안 많은 양의 화학치료제를 허용한다. 또한, 본 발명은 TRPV1을 민감하기 위한 CYP2J2 작용제, 또는 CYP2J2의 대사물의 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 TRPV1 작용제에 반응하는 질환, 예컨대, 신경병증성 통증을 치료하기 위해 CYP2J2 작용제 또는 대사물과 일시적 수용체 전위 바닐로이드 1(TRPV1) 작용제의 조합을 사용함을 제안한다.

Description

통증 치료에서의 CYP2J2 길항제{CYP2J2 ANTAGONISTS IN THE TREATMENT OF PAIN}
본 발명은 신경병증성 통증, 특히 화학치료-유도 말초 신경병증성 통증(CIPNP)의 신규한 치료에 관한 것이다. 본 발명은 신경병증성 통증, 예컨대, CIPNP의 치료에 사용하기 위한 치료제로서 사이토크롬 P450 에폭시게나제(CYP) 길항제, 더욱 구체적으로 CYP2J2의 길항제를 제공한다. CYP2J2 길항제는 생체내 CIPNP를 완화하는 것으로 확인되었고, 따라서 암 또는 다른 증식성 질환과 같은 질병의 치료를 위한 화학치료제와 조합하여 추가적으로 제공된다. 상기 CYP2J2 길항제는 화학치료-유도 통증을 줄이고, 이에 따라 암 치료 동안 보다 많은 양의 화학치료제를 허용한다. 또한, 본 발명은 TRPV1을 민감하기 위한 CYP2J2 작용제, 또는 CYP2J2의 대사물의 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 TRPV1 작용제에 반응하는 질환, 예컨대, 신경병증성 통증을 치료하기 위해 CYP2J2 작용제 또는 대사물과 일시적 수용체 전위 바닐로이드 1(TRPV1) 작용제의 조합을 사용함을 제안한다.
신경병증성 통증은 신경계, 말초 신경, 후근 신경절, 후근, 또는 중추신경계의 손상으로부터 야기할 수 있는 지속적 또는 만성적 통증 증후군이다. 신경병증성 통증 증후군은 이질통증, 다양한 신경통, 예컨대, 대상포진 후 신경통 및 삼차 신경통, 환상 통증, 및 복합 부위 통증 증후군, 예컨대, 반사 교감신경 이상증 및 작열통을 포함한다. 작열통은 종종 통각과민증과 이질통증이 혼합된 자발적인 작열 통증을 특징으로 한다. 비극적이게도 경험한 통증을 감소시키거나 제거하는 것보다 심리 치료 또는 작업 치료를 통해 환자 대응을 돕기 위한 노력만으로 이루어진 신경병증성 통증에 대한 현재 치료 방법과 같이 수립된 신경병증성 통증을 적절하게 예상대로 구체적으로 치료하기 위한 방법은 존재하지 않는다. 신경성 또는 만성 통증의 치료는, 질환을 구체적으로 표적하는 약물이 없고, 현재 사용된 약물은 약간의 완화만을 야기하므로 의사 및 환자에게 과제이고 급성 통증 상태에서 이의 효능 또는 불안 및 우울증과 같은 2차 효과를 완화하는 이의 효능에 기초한다. 만성 통증의 발생률은 사회에서 증가하고 있고 건강 관리 및 생산성 저하 모두에서 사회적 부담이 크다. 현재, 만성 통증을 완화하는 과학적으로 입증된 치료법은 없다. 결과적으로, 건강 공동체는 삶의 질을 약간 향상시키기 위해 멀티 모달(multi-modal) 치료법을 동시에 사용하는 경우 "통증 관리"를 목표로 하고 있다. 따라서, 만성 통증을 완화시킬 수 있는 약물에 대한 시급한 필요성이 존재한다.
화학치료-유도 말초 신경병증성 통증(CIPNP)은 탁산, 백금 유도체, 빈카 알카로이드 등과 같이 세포증식억제제의 심각한 용량 제한 부작용이다. 상기 증상은 보통 따끔거림으로 시작하고, 화끈거리고 찌르는 듯하고 아픈 통증, 및 저온 및 기계적 이질통증을 유발할 수 있다. CIPNP로 인해 일부 환자는 세포증식억제로의 항암 치료를 너무 초기에 중단하여 종양 진행의 더 큰 위험을 초래한다. 불행하게도, 상이한 종류의 신경병증성 통증의 치료를 위해 이미 승인된 많은 유망한 물질, 예컨대, 가바펜틴 또는 아미트리프탈린은 CIPNP의 단일요법에서 진통 효과가 거의 없거나 전혀 없을 수 있다. 세포 및 분자 기전을 이해하는 것은 CIPNP를 치료하거나 심지어 예방하기 위해 필요하고 세포증식억제 치료의 일반적인 성공률을 향상시킬 수 있다.
최근 연구는 옥살리플라틴 및 파클리탁셀-유도 신경병증 동안 기계적 및 저온 이질통증 둘 다에 대한 기여자로서 이온 채널의 일시적 수용체 전위 계열의 구성원(TRPV1, TRPA1 및 TRPV4)을 동정하였다. TRPV1 및 TRPA1의 활성화 또는 민감화는 신경성 염증 및 T 세포 점증을 둘 다 야기할 수 있는 CGRP 및 물질 P의 개선된 배출을 야기할 수 있다.
그러나, 세포증식억제제가 TRP 채널을 직접 활성화시킬 수 없으므로, 내인성 매개체는 TRP 채널의 세포증식억제-의존적 활성화 또는 민감화에 수반됨이 불분명하게 남아있다. 흥미롭게도, 파클리탁셀 및 옥살리플라틴은 둘 다 CYP-에포게나제(파클리탁셀: CYP2C8, CYP2C9; 옥살리플라틴: CYP2E1, CYP1B1)의 유도체이다. 사이토크롬 P450(CYP)-에폭시게나제는 지질 에폭사이드, 예컨대, EET(에폭시에이코사트리에노이드산) 또는 ω-하이드록사이드, 예컨대, 20-HETE를 생성하는 ω-6 지방산, 예컨대, 아라키돈산(AA) 및 리놀레산(LA)을 대사작용할 수 있다.
사이토크롬 P450 모노옥시게나제에 의한 아라키돈산의 대사작용은 다양한 생물학적으로 활성인 에이코사노이드의 형성을 야기한다. 3가지 유형의 산화성 반응이 발생하는 것으로 알려져 있다. 첫번째로, 올레핀 에폭시화(에폭시게나제에 의해 촉매화됨)는 에폭시에이코사트리에노산(EET)을 발생시킨다. 4개의 중요한 EET 구조이성질체는 [5,6]-EET, [8,9]-EET, [11,12]-EET 및 [14,15]-EET이다. EET는 에폭사이드 하이드롤라제에 의해 가수분해되어 상응하는 디하이드록시에이코사트리에노산(DHET)을 형성한다. 2차로, ω-말단 산화는 ω-말단 하이드록시에이코사테트라에노산(HETE)의 형성을 야기한다. 세번째로, 알릴계 산화는 중쇄 HETE의 형성을 야기한다.
CYP1A, CYP2B, CYP2C, CYP2E 및 CYP2J 하위계열의 구성원을 비롯한 여러 사이토크롬 P450 에폭시게나제가 동정되었다. 최근에 CYP2J 하위계열의 단백질에 주목하고 있다. 한가지 특정한 이소폼(isoform)인 CYP2J2는 아라키돈산이 대사작용하여 EET를 생성하는 경우, 인간 심장 근세포에서 주로 발현된다. 또한, CYP2J2 단백질은 기도 및 소화관의 상피 세포에서 발견된다. 다른 P450 효소와 대조적으로, CYP2J2 단백질은 상피 세포 및 비상피 세포에서 소화관의 길이에 따라 균일하게 분포되어 있다. 높은 수준의 CYP2J2 단백질은 자율 신경절의 세포, 상피 세포 및 평활근 세포에서 발견된다. 여러 CYP2J 동족체는 래트 CYP2J3, 래트 CYP2J4, 마우스 CYP2J5 및 마우스 CYP2J6을 비롯한 동물에서 동정되고 있다.
캡사이신은 작은 직경의 감각 뉴런, 특히 고통스럽거나 유해한 감각의 검출에 특화된 C-섬유에서 우선적으로 발현된 리간드-게이트형 비선택적 양이온 채널인 일시적 수용체 전위 바닐로이드 1 수용체(TRPV1; 이전에 바닐로이드 수용체 1(VR1)로서 공지됨)에 대한 매우 선택적인 작용제이다. TRPV1은 캡사이신, 열 및 세포외 산성화를 비롯한 유해한 자극에 반응하고, 이러한 자극에 대한 동시 노출을 통합시킬 것이다. TRPV1-발현(캡사이신-민감성) 통각수용기의 활성화의 초기 효과는 작열감, 통각과민증, 이질통증 및 홍반이다. 그러나, 낮은 농도의 캡사이신에 장기간 노출 또는 고농도 캡사이신 또는 다른 TRPV1 작용제에 단일 노출 후, 작은 직경의 감각 축삭은 캡사이신 또는 열 자극을 비롯한 다양한 자극에 덜 민감하게 된다. 이러한 장기간 노출은 또한 감소된 통증 반응을 특징으로 한다. 캡사이신의 이러한 진행된 병기 효과는 종종 "탈민감화"로서 언급되고 다양한 통증 증상 및 다른 상태의 치료를 위한 국소 캡사이신 제형의 발달을 위한 근거이다.
따라서, 캡사이신, 카프사이시노이드 및 TRPV1 작용제는 수많은 질병의 개선에 유용할 수 있다. 예를 들면, 이들은 신경병증성 통증(당뇨병성 신경병증과 관련된 통증, 대상포진 후 신경통, HIV/AIDS, 외상성 손상, 복합 부위 통증 증후군, 삼차 신경통, 홍색사지통증 및 환상 통증을 포함), 혼합성 통각 및/또는 신경병증성 혼합성 병인학(예를 들면, 암)에 의해 생성된 통증; 골관절염, 섬유근통, 하부 요통, 염증성 통각과민증, 외음부 전정염 또는 외음부통, 부비강 폴립 간질성 방광염, 신경성 또는 과활성 방광, 전립선 과다형성, 비염, 수술, 외상, 직장 과민증, 구강 작열감 증후군, 경구 점막염, 포진(또는 다른 바이러스 감염), 전립선 비대증, 피부염, 소양증, 가려움, 이명, 건선, 사마귀, 암(특히 피부암), 두통 및 주름을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
이로 인해, 오늘날까지 암 치료 동안 화학치료제의 최대 용량을 제한하고 화학치료 중인 환자의 삶의 질을 심각하게 손상시킬 수 있는 이용가능한 신경병증성 통증, 특히, 화학치료-유도 말초 신경병증성 통증(CIPNP)을 위한 특정한 치료법은 없다. 따라서, 본 발명의 목적은 신경병증성 통증, 구체적으로 CIPNP와 맞붙기 위한 신규한 치료 옵션을 제공하는 것이다.
상기 문제는 제 1 양상에서 대상체에서 통증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 사이토크롬 P450 에폭시게나제(CYP) 길항제에 의해 해결된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, CYP 길항제는 CYP1A-, CYP2B-, CYP2C-, CYP2E-, 및 바람직하게 CYP2J 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게, CYP 길항제는 CYP2J2의 포유동물 동족체, 바람직하게 인간 CYP2J2의 길항제(CYP2J2 길항제), 예컨대, 텔미사르탄, 아리피프라졸, 가장 바람직하게 테르페나딘이다.
임의의 CYP2J2 길항제, 바람직하게 선택적인 CYP2J2 길항제의 용도가 본 발명에 포괄된다. 용어 "선택적인 CYP2J2 길항제"는 CYP2J2의 활성, 기능 또는 발현을 선택적으로 억제하지만, 다른 관련된 효소, 예컨대, CYP3A 분자의 활성, 기능 또는 발현을 선택적으로 억제하지 않는 CYP2J2의 길항제와 관련된다. 후보 길항제가 CYP2J2 길항제인지를 확인하기 위해, 발광성 사이토크롬 P450 성장 어세이(glow assay)가 이용될 수 있다. CYP 단백질은 아라키돈산 대사물의 형성을 촉매작용한다. 발광성 CYP 어세이는 루시퍼라제 발광성 반응을 위해 전구기질(prosubstrate)을 사용한다. CYP는 전구기질을 루시페린 또는 루시페린 에스터로 전환하고, 이는 제 2 반응에서 루시페린 검출 시약(LDR)으로 불리는 루시퍼라제 반응 믹스로 광을 생성한다. 제 2 반응에서 생성된 광의 양은 CYP 활성에 비례한다.
후보 CY2J2 길항제의 선택성을 시험하기 위해, 다른 CYP 효소, 예컨대, CYP3A4에 특이적인 발광성 CYP 어세이를 이용할 수 있다. 따라서, CYP2J2에 대한 후보 길항제의 억제 활성을 또 다른 CYP 단백질, 예컨대, CYP3A4에 대한 동일한 길항제의 억제 활성과 비교하여 후보 길항제의 선택성에 관한 정보를 제공한다.
본 발명과 관련하여 바람직한 선택적인 CYP2J2 길항제는 에스트라디올, 페녹시벤즈아민-HCl, 로라타딘, 클로베타솔 프로피오네이트, 독사조신 메실레이트, 페노피브레이트, 레보노르게스트렐, 아리피프라졸, 할시노나이드, 텔미사르탄, 클로파지민, 레보타이록신-Na, 알로세트론-HCl, 플루오시노나이드, 리오타이로닌-Na, 메클리진 디하이드로클로라이드 및 테르페나딘, 및 이들의 유도체로 이루어진 본원에 새롭게 개시된 CYP2J2 길항제의 군으로부터 선택된다.
본 발명과 관련하여, 치료되는 통증은 바람직하게 신경병증성 통증(당뇨병성 신경병증과 관련된 통증, 대상포진 후 신경통, HIV/AIDS 유도된 신경병증성 통증, 외상성 손상, 복합 부위 통증 증후군, 삼차 신경통, 홍색사지통증 및 환상 통증을 포함), 혼합성 통각 및/또는 신경병증성 혼합성 병인학(예를 들면, 암)에 의해 생성된 통증; 골관절염, 섬유근통, 하부 요통, 염증성 통각과민증, 외음부 전정염 또는 외음부통, 부비강 폴립 간질성 방광염, 신경성 또는 과활성 방광, 전립선 과다형성, 비염, 수술, 외상, 직장 과민증, 구강 작열감 증후군, 경구 점막염, 포진(또는 다른 바이러스 감염), 전립선 비대증, 피부염, 소양증, 가려움, 이명, 건선, 사마귀, 암, 두통, 및 주름에 의해 생성된 통증, 종괴 병변, 척수 손상 또는 다발성 경화증으로 이한 중추 통증이다. 그러나, 가장 바람직한 실시양태는 화학치료-유도 말초 신경병증성 통증(CIPNP)과 관련된다.
본 발명은 이하에서 이온 채널 매개된 통증 지각의 민감제, 특히 본 발명에 따른 CYP2J2(이는 대사성 화합물 9,10-EpOME를 생성함)의 활성의 억제를 포함하는 통증 치료법을 제공한다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 CYP2J2의 억제는 마우스 모델에서 파클리탁셀에 의해 유도된 신경병증성 통증을 생체내 완화하는데 효과적임이 입증되었고, 이는 신경병증성 통증, 특히 CIPNP에 대한 진통제로서 CYP2J2 길항제의 용도를 나타낸다.
본 발명의 하나의 추가 실시양태는 통증을 겪고 있는 대상체에게 본 발명의 CYP 길항제의 투여를 포함하는, 통증의 예방 또는 치료에 관한 것이고, 상기 대상체는 화학치료를 받았거나, 받고 있거나, 받을 예정이다. 따라서, 대상체는 바람직한 실시양태에서 암 질병을 겪고 있거나 이로 진단된다.
화학치료는 본 발명과 관련하여 바람직하게 피리미디논-계 항종양제, 예컨대, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 또는 백금제, 예컨대, 시스플라틴, 또는 탁산, 예컨대, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 카바지탁셀, 및 이들의 유도체로부터 선택된 화학치료제를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 수반한다. 상기 화학치료제는 신경병증성 통증을 유도하는 것으로 알려져 있고, 특히 탁산으로 알려져 있고, 이에 따라 본 발명과 관련하여 바람직하다. 파클리탁셀이 가장 바람직하다.
추가로, 본 발명에 따른 통증의 예방 또는 치료는 상기 CYP 길항제 및 상기 화학치료제의 동시적 또는 순차적 투여를 포함한다. 이 실시양태를 위해 또한 본 발명의 조합에 대한 하기 설명을 참조한다.
본 발명의 문제는 또 하나의 양상에서 대상체에서 통증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 9,10-에폭시-12Z-옥타데센산(9,10-EpOME) 길항제에 의해 해결된다. 9,10-EpOME는 CYP 활성에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, CYP를 길항화하는 대신에, 본 발명의 결과는 다르게는 통증 매개 뉴런의 민감화를 피하기 위해 9,10-EpOME를 직접 길항화하여 달성될 수 있다. 본 발명의 상기 9,10-EpOME 길항제는 바람직하게 소분자일 뿐만 아니라 9,10-EpOME에 결합하고 TRPV1의 민감화를 억제하는 단백질 또는 펩티드(예를 들면, 항체 또는 이의 단편)이다.
이 양상을 위해, CYP 길항제의 사용을 위해 전술된 특정 실시양태, 특히 상기 예방 또는 치료 및 화학치료에 관련한 실시양태는 본 발명의 9,10-EpOME 길항제에 대하여 또한 적용된다.
상기 문제는 추가적으로 (i) CYP 길항제 또는 9,10-EpOME 길항제, 및 (ii) 암과 같은 증식성 질환 및 CIPNP와 같은 통증으로부터 선택된 질병의 예방 또는 치료에서 동시적 또는 순차적 사용을 위한 화학치료제를 포함하는 조합에 의해 해결된다.
본원에 사용된 용어 "증식성 질환"은 넓은 의미에서 세포 주기의 제어가 필요한 임의의 질환, 예를 들면, 심혈관 질환, 예컨대, 재발협착증 및 심근증, 자가면역 질환, 예컨대, 사구체신염 및 류마티스 관절염, 피부과 질환, 예컨대, 건선, 항염증, 항진균, 항기생충 질환, 예컨대, 말라리아, 공기증 및 탈모증을 포함한다. 이러한 질환에서, 본 발명의 화합물은 세포자멸을 유도하거나 필요한 만큼 목적한 세포 내에 정체를 유지할 수 있다. 바람직하게, 증식성 질환은 암 또는 백혈병, 가장 바람직하게 유방암, 폐암, 전립선암, 방광암, 두경부암, 결장암, 난소암, 자궁암, 육종 또는 림프종이다.
또한, 본 실시양태는 통증에 시달리는 대상체 군의 치료에 관한 것이고, 상기 대상체는 화학치료제로 치료 중이다. 따라서, 본 발명의 CYP 길항제는 암 치료와 같은 기간 동안 투여될 수 있거나, 다르게는 암 치료 이전 또는 이후에 투여될 수 있고, 이는 부작용의 축적을 피하기 위해 바람직할 수 있다. 본 발명의 결과는 본 발명의 CYP-길항체의 생리학적 효과 및 화학치료제의 통증 유도가 상기 치료를 필요로 하는 대상체에서 조합될 때 달성된다. 약제의 마지막 투여량이 치료 동안 투여된 후, 약제에 의해 유도된 생리학적 효과는 즉시 감소하지 않지만, 나중에는 감소할 가능성이 크다. 따라서, 순차적 치료 주기에서 본 발명의 길항제를 사용하여, 예를 들면, 본 발명의 길항제를 동시에 대신에 화학 요법에 앞서 투여하여, 환자에서 두 화합물의 임상 효과의 조합을 계속해서 야기하고, 이에 따라 본 발명의 조합 요법의 의미에 해당한다.
본원과 관련하여 용어 "조합"은 제형에서 2개 이상의 활성 물질의 활성 물질 조합 및 또한 치유적 치료에서 서로로부터 명시된 간격으로 투여된 활성 물질의 개별 제형이란 뜻의 조합을 의미한다. 따라서, 용어 "조합"은 본 발명과 관련하여 기술되어 2개 이상의 치료 효과적인 화합물의 공동-투여의 임상적 사실을 포함할 것이다.
공동-투여: 본원과 관련하여, 2개 이상의 화합물의 공동-투여는, 각각이 2개 이상의 화합물 중 1개를 함유하는 2개 이상의 약제의 별도 투여, 뿐만 아니라 2개 이상의 화합물이 1개 제형에서 조합되는지 여부 또는 2개 이상의 별도 제형에서 존재하는지 여부에 관계없이 동시 투여를 비롯하여, 1년 이내에 환자에게 2개 이상의 화합물의 투여로서 정의된다.
본 발명의 조합은 하나의 실시양태에서 작용제(i) 및 화학치료제(ii)가 질병의 예방 또는 치료 동안 대상체에게 순차적 또는 동시적 투여에 의해 조합됨을 포함하고, 바람직하게 상기 길항제 및 화학치료제는 질병의 예방 또는 치료 동안 동시적으로 투여된다.
화학치료제는 바람직하게 피리미디논-계 항종양제, 예컨대, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 또는 백금제, 예컨대, 시스플라틴, 또는 탁산, 예컨대, 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 및 이들의 유도체로부터 선택된다. 가장 바람직하게, 화학치료제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀이다.
본 발명에 기재된 길항제는 바람직하게 억제 RNA, 억제 항체 또는 이의 단편, 및/또는 소분자로 이루어진 화합물의 군으로부터 선택된다. 바람직한 CYP 길항제는 본원에서 하기의 상세한 설명에 기재된다.
본 발명과 관련하여, 통증에 대하여 효과적인 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 모르핀, 오피오이드 또는 비오피오이드 진통제, 또는 다른 진통제가 상기 대상체에게 투여됨이 또한 바람직하다.
본 발명의 또 하나의 양상에서, 대상체에서 통증의 예방 또는 치료 방법이 제공되고, 상기 방법은 대상체에게 본 발명에 따른 CYP 길항제 또는 9,10-EpOME 길항제를 치료 효과량으로 투여하는 단계를 포함한다. CYP 길항제는 바람직하게 CYP1A-, CYP2B-, CYP2C-, CYP2E- 및 CYP2J 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다. CYP2J 길항제는 바람직하게 CYP2J2의 포유동물 동족체, 바람직하게, 인간 CYP2J2의 길항제(CYP2J2 길항제), 예컨대, 테르페나딘 또는 텔미사르탄, 및 바이오시밀러 또는 이들의 유도체이다.
다른 바람직한 CYP 길항제는 에스트라디올, 페녹시벤즈아민-HCl, 로라타딘, 클로베타솔 프로피오네이트, 독사조신 메실레이트, 페노피브레이트, 레보노르게스트렐, 아리피프라졸, 할시노나이드, 텔미사르탄, 클로파지민, 레보타이록신-Na, 알로세트론-HCl, 플루오시노나이드, 리오타이로닌-Na, 메클리진 디하이드로클로라이드 및 테르페나딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
전술된 방법과 관련하여 치료가능한 질병은 본원에 기재된다.
치료 또는 예방 동안, 통증에 대하여 효과적인 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 다른 진통제, 예컨대 오피오이드 또는 오피오이드 진통제를 환자에게 투여함이 바람직하다.
이어서, 본 발명의 추가의 양상은 치료 효과량의 9,10-EpOME 또는 CYP2J2 작용제를 대상체에게 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 일시적 수용체 전위 바닐로이드 1(TRPV1)의 민감성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, 놀랍게도 9,10-EpOME가 통증 자각의 주요 매개체인 TRPV1 채널 단백질을 민감하게 만듦이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시양태에서 의약에서 특히 유용한 TRPV1 작용제로서 9,10-EpOME를 제공한다. 9,10-EpOME 및 TRPV1 작용제 캡사이신의 조합은 캡사이신 활성을 유의미하게 강화시킨다. 예를 들면, 하나의 실시양태는 통증의 병리적 억제된 민감성 또는 통증의 비민감성을 특징으로 하는 질병의 치료에 관한 것이다.
또 하나의 실시양태에서, 9,10-EpOME는 TRPV1 작용제, 예컨대, 캡사이신의 활성을 강화하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 캡사이신은 통증 완화를 위해 국소 연고, 비강 스프레이 및 피부 패치에서 진통제로서 사용된다. 이는 관절염, 요통, 좌상 및 염좌와 관련된 근육 및 관절의 약간의 아픔 및 통증의 일시적인 완화를 위해 종종 다른 발적제를 갖는 화합물에서 크림 형태로 적용될 수 있다. 또한, 말초 신경병증의 증상, 예컨대 대상포진에 의해 야기된 대상포진 후 신경통을 줄이기 위해 사용된다.
캡사이신의 진통 및/또는 소염 효과가 발생하는 기전은 작열감을 모방하고, 칼슘 유입에 의해 신경을 압도하여 통각수용기의 탈민감 및/또는 세포자멸을 야기하고 이로 인해 신경이 통증을 오랜 시간 동안 전할 수 없게 만드는 것으로 알려졌다. 캡사이신에 만성 노출되면, 뉴런의 통각수용기는 세포자멸을 겪어 통증의 민감 감소 및 신경성 염증의 차단으로 이어진다. 캡사이신이 제거되는 경우, 통각 뉴런은 시간에 지남에 따라 회복된다. 따라서, 본 발명의 9,10-EpOME의 사용은 캡사이신 및 관련된 화합물의 의학적 효과를 매우 증가시킬 수 있거나, 다르게는 캡사이신 투여량을 줄이는데 도움이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 대상체에서 질병을 치료하기 위해 방법이 제공되고, 상기 방법은 치료 효과량의 (i) 9,10-EpOME 또는 CYP2J2 작용제, 및 (ii) TRPV1 작용제의 투여를 포함한다. 치료제의 순차적 또는 동시적 사용과 관련하여, 본 발명의 이러한 양상에 동일하게 적용되는 상기 설명을 참조한다.
질병은 바람직하게 신경병증성 통증(당뇨병성 신경병증, 대상포진 후 신경통, HIV/AIDS, 외상성 손상, 복합 부위 통증 증후군, 삼차 신경통, 홍색사지통증 및 환상 통증과 관련된 통증 포함), 혼합성 통각 및/또는 신경병증성 혼합성 병인학, 예를 들면, 암)에 의해 생성된 통증; 골관절염, 섬유근통, 하부 요통, 염증성 통각과민증, 외음부 전정염 또는 외음부통, 부비강 폴립 간질성 방광염, 신경성 또는 과활성 방광, 전립선 과다형성, 비염, 수술, 외상, 직장 과민증, 구강 작열감 증후군, 경구 점막염, 포진(또는 다른 바이러스 감염), 전립선 비대증, 피부염, 소양증, 가려움, 이명, 건선, 사마귀, 암, 두통, 및 주름으로부터 선택된다. 일반적으로 임의의 질병은 TRPV1 작용제에 의해 치료가능한 것이 포함된다.
예시적이고 바람직한 본 발명의 TRPV1 작용제는 캡사이신, 피페린, 6-진저롤, 6-쇼가올, α-산쇼올, β-산쇼올, γ-산쇼올, δ-산쇼올, 하이드록실 α-산쇼올 및 하이드록실 β-산쇼올로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이어서, 또 하나의 양상은 전술된 방법에 사용하기 위한 9,10-EpOME 또는 CYP2J2 작용제에 관한 것이다.
추가의 또 하나의 양상은 의약, 바람직하게 신경병증성 통증(당뇨병성 신경병증, 대상포진 후 신경통, HIV/AIDS, 외상성 손상, 복합 부위 통증 증후군, 삼차 신경통, 홍색사지통증 및 환상 통증과 관련된 통증 포함), 혼합성 통각 및/또는 신경병증성 혼합성 병인학(예를 들면, 암)에 의해 생성된 통증; 골관절염, 섬유근통, 하부 요통, 염증성 통각과민증, 외음부 전정염 또는 외음부통, 부비강 폴립 간질성 방광염, 신경성 또는 과활성 방광, 전립선 과다형성, 비염, 수술, 외상, 직장 과민증, 구강 작열감 증후군, 경구 점막염, 포진(또는 다른 바이러스 감염), 전립선 비대증, 피부염, 소양증, 가려움, 이명, 건선, 사마귀, 암(특히 피부암), 두통 및 주름에 의해 생성된 통증으로부터 선택된 질병의 치료에 사용하기 위한 (i) 9,10-EpOME 또는 CYP2J2 작용제, 및 (ii) TRPV1 작용제의 조합에 관한 것이다.
TRPV1 작용제는 바람직하게 캡사이신, 피페린, 6-진저롤, 6-쇼가올, α-산쇼올, β-산쇼올, γ-산쇼올, δ-산쇼올, 하이드록실 α-산쇼올 및 하이드록실 β-산쇼올로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 대상체는 바람직하게 포유 동물, 바람직하게 인간, 가장 바람직하게 화학치료제로 치료받은 인간, 예컨대, 암 환자이다.
CYP 길항제
본 발명과 관련하여 "CYP 길항제"는 바람직하게 CYP1A-, CYP2B-, CYP2C-, CYP2E-, 및 더욱 바람직하게 CYP2J 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게, CYP 길항제는 CYP2J2의 포유동물 동족체, 바람직하게 인간 CYP2J2의 길항제(CYP2J2 길항제)이다. 따라서, 본원에 기재된 가장 바람직한 실시양태 및 양상에서, 용어 "CYP 길항제"는 CYP2J2 길항제, 또는 인간 CYP2J2의 포유동물 동족체의 길항제이다.
본원에 사용된 용어 "CYP 길항제"는 CYP 발현 또는 활성의 양 또는 비율의 감소에 영향을 끼치는 물질을 의미한다. 상기 물질은 예를 들면, CYP에 결합하고 CYP 발현 또는 활성의 양 또는 비율을 감소시켜 직접 작용할 수 있다. 또한, CYP 길항제는 예를 들면, CYP와 CYP 수용체의 상호작용을 감소시키거나 방지하도록 CYP에 결합하고; CYP에 결합하고 잔기를 제거하거나 첨가하는 것처럼 이를 변형시키고; CYP에 결합하고 이의 안정성을 감소시켜 CYP 발현 또는 활성의 양 또는 비율을 감소시킬 수 있다. 또한, CYP 길항제는 조절 단백질 또는 유전자 영역 기능을 조절하고 CYP 발현 또는 활성의 양 또는 비율의 감소에 영향을 끼치기 위해 조절 분자 또는 유전자 영역에 결합하여 간접적으로 작용할 수 있다. 따라서, CYP 길항제는 CYP 발현 또는 활성의 양 또는 비율의 감소를 야기하는 임의의 기전에 의해 작용할 수 있다.
CYP 길항제는 예를 들면, 자연적으로 또는 비자연적으로 발생하는 거대분자, 예컨대, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드 모방체, 핵산, 탄수화물 또는 지질일 수 있다. 또한, CYP 길항제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 단클론 항체, 인간화 또는 인간 항체, 키메라 항체, 미니바디, 이작용성 항체, 단일쇄 항체(scFv), 가변 영역 단편(Fv 또는 Fd), Fab 또는 F(ab)2일 수 있다. 또한, CYP 길항제는 CYP에 특이적인 다중클론 항체일 수 있다. 또한, CYP 길항제는 부분적으로 또는 전체적으로 합성 유도체, 자연적으로 발생하는 거대분자의 유사체 또는 모방체, 또는 작은 유기 또는 무기 분자일 수 있다.
항체인 CYP 길항제는 예를 들면 CYP 발현 또는 활성의 양 또는 비율이 감소되도록, CYP에 결합하고 CYP 수용체에 대한 결합을 억제하거나, CYP 발현 또는 활성을 조절하는 분자의 활성을 변경시키는 항체일 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 항체는 단클론 또는 다중클론 항체 또는 이의 단편을 비롯한 자연적으로 발생하는 항체, 또는 비제한적으로 단일쇄 항체, 키메라 항체, 이작용성 항체, 상보성 결정 영역 그래프트된(CDR-그래프트된) 항체 및 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 비롯한 비자연적으로 발생하는 항체일 수 있다.
핵산인 CYP 길항제는 예를 들면, 안티센스 뉴클레오티드 서열, RNA 분자, 또는 앱타머 서열일 수 있다. 안티센스 뉴클레오티드 서열은 세포 내의 뉴클레오티드 서열에 결합하고 CYP의 발현 수준을 조절할 수 있거나, CYP의 발현 또는 활성을 조절하는 또 다른 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 유사하게, RNA 분자, 예컨대, 촉매 리보자임은 CYP 유전자, 또는 CYP의 발현 또는 활성을 조절하는 다른 유전자에 결합하고 이의 발현을 변경시킬 수 있다. 앱타머는 분자 표적에 결합할 수 있는 3차원 구조를 갖는 핵산 서열이다.
또한, 핵산인 CYP 길항제는 RNA 간섭 방법에 사용하기 위한 이중 가닥 RNA 분자일 수 있다. RNA 간섭(RNAi)은 침묵 유전자에 대한 서열에서 상동인 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 개시된 전사후 RNA 분해에 의한 서열-특이적 유전자 침묵 과정이다. RNAi에 적합한 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 19개 RNA 염기 쌍을 형성하여 각각의 3' 말단에서 2개 뉴클레오티드의 돌출을 남기는 표적된 유전자에 상응하는 약 21개 연속 뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥을 함유한다(문헌[Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001)]; 문헌[Bass, Nature 411:428-429 (2001)]; 문헌[Zamore, Nat. Struct. Biol. 8:746-750 (2001)]). 또한, 약 25 내지 30개 뉴클레오티드의 dsRNA는 RNAi를 위해 성공적으로 사용되었다(문헌[Karabinos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7863-7868 (2001)]. dsRNA는 시험관내 합성되고 당해 분야에 공지된 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다.
바람직한 CYP2J2 길항제는 에스트라디올, 페녹시벤즈아민-HCl, 로라타딘, 클로베타솔 프로피오네이트, 독사조신 메실레이트, 페노피브레이트, 레보노르게스트렐, 아리피프라졸, 할시노나이드, 텔미사르탄, 클로파지민, 레보타이록신-Na, 알로세트론-HCl, 플루오시노나이드, 리오타이로닌-Na, 메클리진 디하이드로클로라이드 및 테르페나딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
통증 또는 다른 신경성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 조성물 및 키트
본원의 또 하나의 양상은 본 발명의 화합물 또는 조합을 사용하여 통증 또는 증식성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 조성물은 전술된 화합물을 포함하고, 상기 화합물은 바람직하게 항체, 항체 단편, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 앱타머, 신바디(synbody), 결합제, 펩티드, 앱타머-siRNA 키메라, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중 형성 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 외부 지침 서열, 제제-암호화 발현 벡터, 소분자 및 약학적으로 허용되는 담체로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학 투여와 양립할 수 있는 임의의 및 모든 용매, 용해제, 충전제, 안정화제, 결합제, 흡수제, 기제, 완충제, 윤활제, 제어 방출 비히클, 희석제, 유화제, 습윤제, 분산 매질, 코팅제, 항균제 또는 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 매질 및 약학적으로 활성인 물질에 대한 약제의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 조성물에서 이의 용도가 고려된다. 또한, 보충제가 조성물에 혼입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 혈청 알부민을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들면, 척추강내, 동맥내, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 경피(국소) 및 경점막 투여를 포함한다.
비경구, 피내 또는 피하 적용을 위해 사용된 용액 및 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 그릴콜, 글리세린; 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설페이트; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성의 조절을 위한 약제, 예컨대 나트륨 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 나트륨 하이드록사이드로 조정될 수 있다. 비경구 제조는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다중 투여 용기에 동봉될 수 있다.
주사용 용도에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 세균발육저지수, 크레모포르 EL(상표)[바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시패니 소재] 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 주사용 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사가능성으로 존재하는 정도까지 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에 안정적이어야 하고 미생물, 예컨대 세균 또는 진균의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 보상된 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 보존은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당, 다가알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 나트륨 클로라이드를 조성물 중에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함함으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적합한 용매 중에 필요한 양의 활성 화합물(예를 들면, 뉴레굴린)을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 필요한 만큼 결합한 후 여과 살균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 이전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터 임의의 추가의 목적한 성분을 합한 분말을 수득하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 동봉되거나 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료제 투여를 목적하는 경우, 활성 화합물은 부형제와 결합되고 정제, 트로키 또는 캡슐 형태로 사용될 수 있다. 또한, 경구 조성물은 구강 청결제와 같은 용도를 위한 유동 담체를 사용하여 제조될 수 있고, 유동 담체 중 화합물은 경구로 적용되고 닦여지고 뱉거나 삼킨다. 약학적으로 양립할 수 있는 결합제 및/또는 어쥬번트 물질은 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 임의의 하기 성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 미세결정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대, 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테르트; 활택제, 예컨대, 콜로이드성 실리콘 다이옥사이드; 감미제, 예컨대, 수크로스 또는 사카린; 또는 방향제, 예컨대, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료.
흡입에 의해 투여하는 경우, 화합물은 적합한 추진체, 예를 들면, 가스, 예컨대 이산화탄소, 또는 네뷸라이저(nebulizer)를 함유하는 압축된 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
또한, 전신 투여는 경점막 또는 경피 방식에 의해 수행될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투되는 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 상기 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 경점막 투여를 위해 예를 들면, 세제, 담즙산염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 약학 조성물은 일반적으로 당해 분야에 공지된 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 제형화된다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 활성 성분의 지속 방출 또는 제어 방출을 위해 제형화된다. 생분해성, 생체접합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제형의 제조 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 상기 물질은 예를 들면, 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파바슈티칼스 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc)로부터 상업적으로 수득할 수 있다. 또한 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 단클론 항체로 감염된 세포에 표적된 피로솜 포함)이 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 일관성을 위해 투여 단위 형태의 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체를 위해 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 포함하고, 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 함께 목적한 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 상세한 설명은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성될 특정한 치료 효과, 및 개인의 치료 동안 상기 활성 화합물을 배합하는 당해 분야에 내재된 임계치에 의해 및 이에 따라 직접 판단된다.
상기 화합물의 독성 및 치료 효능은 예를 들면, LD50(집단의 50%까지 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 측정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 비 LD50/ED50으로 표시될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 손상 가능성을 최소화하여 부작용을 줄이기 위해 감염된 조직의 부위에 상기 화합물을 표적하는 전달 시스템을 설계하는데 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하기 위해 사용될 수 있다. 상기 화합물의 투여량은 바람직하게 독성이 거의 없거나 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 놓인다. 상기 투여량은 사용된 투여 형태 및 이용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명에 방법에 사용된 임의의 화합물의 경우, 치료 효과량은 세포 배양 어세이로부터 초기에 측정될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 제형화되어 세포 배양물에서 측정된 IC50(즉, 증상의 최대 절반 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성할 수 있다. 상기 정보는 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 측정하기 위해 사용될 수 있다. 약학 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 발명은 이하에서 첨부된 도면 및 서열을 참조하여 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이지만, 그럼에도 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 언급된 모든 참고 문헌은 이의 전체가 참조로 혼입된다.
도 1: 파클리탁셀 CIPNP 또는 염증 동안 산화된 리놀레산 대사물의 농도. C57Bl6/N 마우스에서 비히클(흑색) 또는 파클리탁셀(회색, 6 mg/kg)의 i.p. 주사 24 시간 후 좌골 신경, DRG 및 척수 배면 각에서 9,10-EpOME(a) 및 12,13-EpOME(b)의 농도를 나타낸다(n.d.: 측정되지 않음). C57Bl6/N 마우스에서 비히클(흑색) 또는 파클리탁셀(회색)의 i.p. 주사 24 시간 후 좌골 신경, L4-L6-DRG 및 척수 배면 각의 상응하는 부분에서 9-HODE(c) 및 13-HODE(d)의 농도. (e) 자이모산(12.5 mg/ml, 20 ㎕)의 발바닥내 주사 24 시간 후 L4-L6-DRG 및 척수 배면 각의 상응하는 부분에서 9,10-EpOME-농도의 관계. 데이타는 군당 8 내지 10 마리 동물의 평균±SEM을 나타낸다; ***p<0.001, 스튜던츠 t-검정.
도 2: DRG-뉴런에서 9,10-EpOME의 직접 효과. (a) 9,10-EpOME[10 μM, 30 초]의 적용은 고 칼륨(50 mM KCl, 30 초)에 반응하는 DRG 뉴런에서 칼슘 과도를 야기한다. 대표적인 흔적이 표시된다. (b) 9,10-EpOME 의존적 칼슘의 용량 반응 관계는 다수의 응답하는 뉴런에 관련된 DRG 뉴런에서 증가한다. 데이타는 농도당 5개 측정값의 평균±SEM을 나타낸다. (c) 및 (d) 9,10-EpOME[10 μM, 30 초]에 의해 야기된 칼슘 과도는 9,10-EpOME 자극 전 및 후 2 분 이내에 세척된 EGTA(2 mM)를 함유하는 칼슘 무함유 배지를 사용하여 중단될 수 있다. 데이타는 24개(칼슘 무함유) 또는 16개(대조군) 뉴런의 평균±SEM을 나타낸다. (e) 및 (f) 9,10-EpOME[10 μM, 30 초]의 칼슘 과도는 2차 9,10-EpOME 자극 전 2 분 동안 이내에 세척된 선택적인 TRPA1 길항제(HC-030031, 20 μM)에 의해서가 아니라 선택적인 TRPV1 길항제(AMG 9810, 1 μM)에 의해 차단될 수 있다. 데이타는 16개(대조군), 31개(AMG 9810) 또는 18개(HC-030031) 뉴런의 평균±SEM을 나타낸다; **p<0.01, 스튜던츠 t-검정.
도 3: 9,10-EpOME 용량-의존성은 DRG 뉴런에서 TRPV1을 민감화하고 척수 슬라이스의 라미나 II 뉴런에서 자발적인 EPSC 주파수에서 증가하는 캡사이신-유도를 가능하게 한다. (a) DRG 뉴런을 캡사이신(200 nM, 15 초, 각각)으로 이중 자극하고 비히클 또는 9,10-EpOME[1 μM]로 2차 캡사이신 자극 전에 2분 동안 비히클 또는 9,10-EpOME[1 μM]으로 항온처리하였다. (b) (a)에 기재된 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 1차 및 2차 캡사이신 반응 사이의 비의 용량-의존 차이. 데이타는 하기 수의 뉴런의 평균±SEM을 나타낸다: 27개(대조군), 26개(250 nM 9,10-EpOME), 21개(500 nM 9,10-EpOME), 19개(750 nM 9,10-EpOME), 41개(1 μM 9,10-EpOME), 18개(2 μM 9,10-EpOME) 또는 28개(캡사이신 대신에 20 초 동안 50 μM AITC 사용); *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001, 스튜던츠 t-검정. (c) 라미나 II 뉴런에서 자발적인 EPSC(sEPSC)의 흔적. 밑의 패널, 흔적 1, 2, 3 및 4는 확대한 것이고 각각 기준선, 1차 캡사이신(1 mM), 9,10-EpOME(1 mM), 및 2차 캡사이신(1 mM) + 9,10-EpOME의 기록을 나타낸다. (d) sEPSC의 주파수. sEPSC의 기준선과 비교하여, 캡사이신은 sEPSC 주파수(6.9±0.4 Hz 내지 13.7±0.4 Hz)에서 완전한 증가를 유도한다. 9,10-EpOME 단독 처리는 sEPSC의 주파수(8.2±0.8 Hz)를 약간 증가시키고 캡사이신에 의한 sEPSC 주파수 증가(18.7±1.1 Hz)는 유의미하게 상승된다. *P<0.05, 처리하지 않은 기준선과 비교하여; #P<0.05, 1차 캡사이신 처리(1 mM)와 비교하여. n = 5개 뉴런/군. (E) sEPSC의 진폭. 캡사이신 및 9,10-EpOME는 sEPSC 진폭에서 유의미한 효과가 없다. n = 5개 뉴런/군.
도 4: DRG 뉴런에서 9,10-EpOME에 의한 TRPV1-민감화는 Gs-커플링된 수용체 및 cAMP-PKA 경로에 의해 매개된다. (a) 9,10-EpOME는 래트 DRG의 막 분획에서 [γ-35S]-GTP 결합을 촉매화시킨다. 실험은 30 μM GDP 및 비히클(메틸 아세테이트. 0.7%(v/v)), 아데노신[10 μM] 또는 9,10-EpOME[1 μM]의 존재 하에 30 분 동안 래트 DRG의 막 분획을 사용하여 수행하였다. 데이타는 총 15마리 동물로부터 막 분획을 3회 측정하여 수득하였다. 5마리 동물의 DRG를 각각의 측정을 위해 모았다; *p<0.05, **p<0.01, 크루스칼-발리스(Kruskal-Wallis) 시험 및 듀넷(Dunnet) 다중 비교 사후 시험. (b) 9,10-EpOME, 시카프로스트 또는 포르스콜린(각각 1 μM)으로 15 분 동안 자극 후 뉴런-풍부 DRG 배양물에서 cAMP의 농도. 데이타는 5마리 마우스의 DRG 배양물의 평균±SEM을 나타낸다. (c) 및 (d) 9,10-EpOME[1 μM]에 의한 TRPV1 민감화는 PKA-억제제(H89-디하이드로클로라이드, 1 시간 동안 10 μM)로 예비배양에 의해 감소될 수 있다. 데이타는 15개(비히클), 19개(EpOME) 또는 33개 뉴런(H89 예비배양된 EpOME)의 평균±SEM을 나타낸다. (e) 및 (f) 9,10-EpOME[1 μM]에 의한 TRPV1 민감화는 PKC-억제제(GF 109203X, 1 시간 동안 10 μM)로 예비배양에 의해 영향을 받지 않는다. 데이타는 18개(비히클), 23개(EpOME) 또는 39개 뉴런(GFX 예비배양된 EpOME)의 평균±SEM을 나타낸다; *p<0.05, **p<0.01, 스튜던츠 t-검정; n.s. 유의미하지 않음.
도 5: 9,10-EpOME의 발바닥내 또는 척추강내 주사는 야생형 마우스에서 통증 임계치를 감소시키고 캡사이신 유도된 기계적 임계치를 민감화한다. (a) 및 (b) C57Bl/6N 마우스는 9,10-EpOME(10 μM) 또는 비히클(염수 중 DMSO 0.3%(v/v))로 발바닥내 주사를 받았다. 열(a) 또는 기계적(b) 임계치를 주사 후 5 시간 동안 모니터하였다. 데이타는 8마리 마우스의 평균±SEM을 나타낸다. (c) 및 (d) 야생형 BL/6N 마우스에 9,10-EpOME(10 μM) 또는 비히클(염수 중 DMSO 0.3%(v/v))을 척추강내 주사하였다. 열(c) 또는 기계적(d) 임계치는 2 시간(열) 동안 15분 간격 및 3 시간(기계적) 동안 30분 간격으로 주사 후 모니터하였다. 데이타는 8마리 마우스의 평균±SEM을 나타낸다. 이미지는 포함되지 않았다.
도 6: 9,10-EpOME 자극 후 단리된 좌골 신경 또는 뉴런 풍부한 DRG 배양물로부터 iCGRP의 방출. (a) 야생형 BL/6N 마우스의 단리된 좌골 신경으로부터 iCGRP를 방출하고, 각각 5 분 동안 하기 용액으로 자극하였다: 합성 장액(SIF), SIF + EpOME(1 μM) 또는 비히클(DMSO 0.03%(v/v)), SIF + EpOME(또는 비히클) + 캡사이신(500 nM), SIF. 데이타는 6개의 개별 좌골 신경의 평균±SEM을 나타낸다. (b) PBS, 9,10-EpOME, 캡사이신 또는 9,10-EpOME + 캡사이신으로 15 분 동안 자극 후 뉴런 풍부한 DRG 배양물로부터 iCGRP의 방출; a: 9,10-EpOME 1 μM, b: 캡사이신 400 nM, c: 9,10-EpOME 2.5 μM. 데이타는 6마리 마우스의 DRG 배양물의 평균±SEM을 나타낸다; #,*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 스튜던츠 t-검정. 파선은 어세이 민감성을 나타낸다.
도 7: CYP2J6은 파클리탁셀-유도 신경병증성 통증 동안 상향조절된다. (a) 파클리탁셀(6 mg/kg i.p.)의 주사 후 야생형 C57Bl/6N 마우스의 기계적 임계치의 시간 경로. bl: 기준선, 데이타는 군당 10마리 마우스의 평균±SEM을 나타낸다. 8일 후, 좌골 신경, DRG 및 척수 배면 각을 절개하였다. (b) 파클리탁셀(6 mg/kg i.p.) 주사 8일 후 뮤린 CYP-에폭시게나제-전사체의 발현. 데이타는 군당 4마리 마우스의 DRG의 평균±SEM을 나타낸다, *p<0.05, **p<0.01, 스튜던츠 t-검정. (c) C57Bl6/N 마우스에 비히클(흑색) 또는 파클리탁셀(회색, 6 mg/kg)의 i.p. 주사 8일 후 좌골 신경, DRG 및 척수 배면 각에서 9,10-EpOME의 농도; **p<0.01, 스튜던츠 t-검정. (d) LC-MS/MS 분석에 의해 입증된 파클리탁셀 처리 8 내지 9일 후 뮤린 DRG에서 에이코사노이드- 및 레놀레산 대사물-합성의 도식. 구조는 lipidmaps.org로부터 수득하였다.
도 8: 테르페나딘에 의한 CYP2J6의 억제는 지질 농도를 감소시키고 생체내 파클리탁셀-유도 CIPNP를 개선시킨다. (a) 9,10-EpOME의 수준은 파클리탁셀(6 mg/kg i.p.) 및 1 mg/kg 테르페나딘(회색) 또는 비히클(2% DMSO v/v, 흑색)로 처리 8일 후 좌골 신경, DRG 및 척수의 배면 각에서 LC-MS/MS에 의해 측정된 대조군(%)을 나타낸다. 데이타는 군당 5마리 마우스의 DRG의 평균±SEM을 나타낸다; *p<0.05, **p<0.01, 스튜던츠 t-검정. (b) 테르페나딘(1 mg/kg)의 투여 후 좌골 신경, DRG, 척수의 배면 각 및 혈장에서 모두 측정된 에폭시지질 및 다이하이드로-대사물(9,10-EpOME, 12,13-EpOME, 9,10-DiHOME, 12,13-DiHOME 및 14,15-EET)의 잔여 농도. (c) 테르페나딘(1 또는 2 mg/kg) 또는 비히클(DMSO 2.5 또는 5%(v/v))의 정맥내 주사를 받은 마우스를 8일 동안 파클리탁셀(6 mg/kg i.p.)로 처리한 기계적 임계치. 상기 기계적 임계치는 테르페나딘 또는 비히클 주사 후 5 시간까지 모니터하였다. 데이타는 군당 8 내지 9마리 마우스의 평균±SEM을 나타낸다; #,*p<0.05, 본페로니 사후 검정과 함께 이-방향 아노바(*1 mg/kg, # 2 mg/kg 테르페나딘). (d) 로라타딘(1 mg/kg) 또는 비히클(DMSO(2.5%(v/v))의 정맥내 주사를 받은 마우스의 파클리탁셀(6 mg/kg i.p.) 주사 8일 후 기계적 임계치. 데이타는 군당 6 내지 9마리 마우스의 평균±SEM을 나타낸다.
도 9: CYP2J2 및 CYP3A4의 계산된 억제 값의 연관성. 상부 좌측 사분면에 위치된 길항제는 CYP2J2에 대하여 선택적이다. 발광성 CYP2J2 어세이는 제조자의 프로토콜(https://www.promega.de/resources/pubhub/enotes/cytochrome-p450-2j2-enzyme-assay-using-a-novel-bioluminescent-probe-substrate/)에 따라 수행되었다. 후보 CY2J2 길항제의 선택성을 시험하기 위해, CYP3A4에 대하여 특이적인 추가의 발광성 CYP 어세이를 이용하고, 후보 CY2J2 길항제의 억제 활성을 CYP3A4에 대한 동일한 길항제의 억제 활성과 비교하였다.
서열번호 1 내지 14: 프라이머 서열
실시예
재료 및 방법
동물
모든 동물 실험은 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 지침의 권고에 따라 수행하고 허용 번호 F95/42의 동물 연구를 위한 지역 윤리 위원회(독일 다름슈타트 소재)에 의해 승인되었다. 모든 행동 실험을 위해, 발명자들은 상업적 사육 회사[찰스 리버(Charles River), 독일 슐츠펠트 소재; 야비에(Janvier), 프랑스 르 지네-생-일레(Le Geneset-Saint-Isle) 소재]로부터 구입한 6 내지 12주령 수컷 C57BL/6N 마우스만을 사용하였다. 기계적 임계치를 비교하기 위해, 발명자들은 대조군으로서 연령 및 성별이 일치하는 한배 새끼를 사용하였다.
프로스타노이드-수용체 결핍 마우스(DP1-/-, IP-/-, EP2-/- 및 EP4-/-)를 전술된 바와 같이 임상 약리 연구소에서 채혈하였다.
화학치료-유도 신경병증성 통증의 파클리탁셀 모델
파클리탁셀을 1:1의 크레모포르 EL/에탄올에 용해하고 염수로 희석하였다. 복강내 주사를 위한 용량은 전술된 바와 같이 6 mg/kg으로 설정하였다.
행동 시험
역학적 이질통증 또는 열 과민감성의 측정을 위해, 마우스를 2 시간 이상 동안 상승된 그리드 위의 시험 우리에서 유지하여 순응시켰다. 기준선 측정은 역학적 발바닥 촉각계(Dynamic Plantar Aesthesiometer) 또는 하그리브즈(Hargreaves) 장치[우고 바실(Ugo Basile), 이탈리아 바레세 코멜리오 소재]를 사용하여 수행하고 기계적 자극 후 뒷발의 움추림 잠재성을 검출하였다. 기계적 임계치를 추정하기 위해, 신속한 움추림 반응이 발생할 때까지 철골을 선형 상승력(10 초에 걸쳐서 0 내지 5 g, 0.5 g/초로 증가)으로 뒷발의 발바닥 중간에 밀었다. 발의 느린 움직임은 카운트하지 않았다. 발 움추림 잠재성(PWL)을 20 초의 컷-오프 시간으로 초±0.1로 측정하였다. 주사되지 않은 발 및 주사된 발을 5 내지 10 분의 간격에서 교대로 측정하였다. 열 임계치를 측정하기 위해, 마우스를 첫날에 2 시간 이상 동안 고온 유리 플레이트(324℃) 위의 시험 우리에서 유지하여 순응시켰다. 이어서, 움추림이 발생할 때까지, 발의 발바닥 중간 부위를 고강도 프로젝터 램프로 이루어진 복사열 장치로 자극하였다. 주사되지 않은 발 및 주사된 발을 5 내지 10 분의 간격에서 교대로 측정하였다. 모든 행동 시험을 위해, 조사자는 마우스의 치료 또는 유전형에 대하여 맹검하였다.
처리: 말초 주사를 위해, 20 ㎕의 9,10-EpOME[5 μM](카이만(Cayman), 미국 미시간주 앤 아버 소재)를 뒷발의 발바닥 중간 부분에 피하로(s.c.) 주사하였다. 대조군 동물에게 상응하는 양의 DMSO(시그마(Sigma), 독일 다이센호펜 소; 염수 중 1.6%(v/v))를 주사하였다. 척추강내 주사를 위해, 3.2% DMSO/염수(v/v) 중 5 ㎕의 9,10-EpOME[10 μM]를 전술된 바와 같이 깨어있는 지각이 있는 마우스에 직접 요추 천자에 의해 주사하였다. 테르페나딘 또는 로라타딘(둘 다 토크리스(Tocris)로부터 입수, 영국 브리스톨 소재)을 꼬리 혈관에 정맥내로 주사하였다.
1차 후근 신경절( DRG ) 배양물
뮤린 DRG를 척수 분절로부터 절개하고 CaCl2 및 MgCl2[인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재]를 함유하는 빙냉 HBSS에 직접 옮겼다. 이어서, 단리된 DRG를 L-글루타민[2 mM], 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 μg/ml), B-27 및 젠타마이신(50 μg/ml)(모두 인비트로겐으로부터 구입, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 함유하는 신경기저 배지에서 37℃에서 75 분 동안 콜라게나제/디스파제(500 U/ml 콜라게나제; 2.5 U/ml 디스파제)와 함께 배양하였다. 콜라게나제/디스파제-용액을 제거한 후, 세포를 10% FCS를 함유하는 신경기저 배지로 2회 세척하고 10 분 동안 0.05% 트립신(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)과 함께 배양하였다. 세척 단계를 반복하고, 세포를 1 ml 길슨(Gilson) 피펫을 사용하여 기계적으로 분해하였다. 최종적으로, 뉴런을 폴리-L-리신(Sigma, 독일 다이센호펜) 코팅된 유리 커버 슬립 위에 플레이팅하고 칼슘 이미징에 의해 추정될 때까지 L-글루타민[2 mM], 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 μg/ml), B-27 및 젠타마이신(50 μg/ml)을 함유하는 신경기저 배지로 밤새 배양하였다.
칼슘 이미징 실험
칼슘 이미징 실험을 2개의 상이한 설정으로 수행하였다. 먼저, 발명자들은 10x 아크로플랜(Achroplan) 수침 대물렌즈(제이스)가 장착된 악시오스코프(Axioscope) 2 업라이트 현미경[제이스(Zeiss), 독일 예나 소재]를 사용하였다. 상기 현미경은 이마고(Imago) CCD 카메라 및 폴리크롬(Polychrome) IV 단색기[모두 티아이엘엘 포토닉스(TILL Photonics), 독일 그라펠핑 소재]가 장착되어 있다. 이미지를 2가지 파장(340 nm 및 380 nm)에서 2초 마다 획득하고 틸비젼(Tillvision) 소프트웨어 23을 사용하여 처리하였다. 후에, DFC360 FX(CCD-) 카메라, 푸라(Fura)-2 필터 및 N-Plan 10x/0.25 Ph1 대물렌즈[모두 레이카 마이크로시스템스(Leica Microsystems), 독일 베츨라어 소재]가 장착된 레이카(Leica) DMI 4000 b 반위 현미경으로 구성된 레이카 칼슘 이미징 설정을 사용하였다. 이미지를 2초 마다 획득하고 LAS AF-소프트웨어로 처리하였다. 각각의 실험을 위해, 발명자들은 세포 수가 많은 영역을 선택하고 동시에 40 내지 110개 세포를 모니터하였다. 제주 24 내지 48시간 후 DRG-뉴런을 사용하여 칼슘 이미징 실험을 수행하였다. 세포를 5 μM 푸라-2-AM-에스터 및 0.02% 플루로닉(Pluronic) F-127[둘 다 바이오튬(Biotium), 미국 캘리포니아주 하이와드 소재]과 함께 로딩하고 37℃에서 30 내지 60분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 외부 용액(145 mM NaCl, 1.25 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 10 mM D-글루코스, 10mM HEPES를 함유함; pH 7.3으로 조정됨)으로 세척하였다. 기준선 측정을 1 내지 2 ml/분의 유속으로 외부 용액에서 수행하였다. CaCl2를 제거하고 2 mM EGTA를 첨가하여 칼슘 무함유 용액을 생성하고 NaCl 농도를 150 mM 까지 증가시켜 삼투성을 제어하였다. HC-030031(시그마, 독일 다이센호펜 소재), AMG 9810, H89-디하이드로클로라이드, 8-브로모-cAMP, GF 109203X[모두 토크리스(Tocris), 영국 브리스톨 소재] 및 NGF[메르크 밀리포어(Merck Millipore), 독일 다름슈타트 소재]의 스톡 용액을 이의 최종 농도까지 외부 용액 중에 희석하였다.
정량적 실시간 PCR
허리 DRG를 지시된 시간에 마우스로부터 절개하고 미르바나(mirVana: 상표) miRNA 단리 키트[암미온(Ambion), 라이프 테크놀로지즈(Life technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재]를 사용하여 RNA를 추출하였다. 역전사 및 실시간 PCR을 택맨(TaqMan: 등록상표) 시스템(라이프 테크놀로지즈, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 수행하고 전술된 ΔΔC(T)-방법으로 평가하였다. cDNA의 증폭을 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
뮤린 조직으로부터 정량적 실시간 PCR을 위해 사용된 프라이머 서열, a = MGH 프라이머 뱅크, ID: 160948617c2.
유전자 정방향 역방향
CYP2C29 5'GCCTCAAAGCCTACTGTCA-3'(서열번호 1) 5'-AACGCCAAAACCTTTAATC-3'(서열번호 2)
CYP2C37 5'-ATACTCTATATTTGGGCAGG-3'(서열번호 3) 5'-GTTCCTCCACAAGGCAAC-3'(서열번호 4)
CYP2C38 5'-TTGCCTTCTGTAATCCCCC-3'(서열번호 5) 5'-TCTAACGCAGGAATGGATAAAC-3'(서열번호 6)
CYP2C39 5'-GGAGACAGAGCTGTGGC-3'(서열번호 7) 5'-TAAAAACAATGCCAAGGCCG-3'(서열번호 8)
CYP2C44 5'-CTTTCCAACGAGCGATTCCC-3'(서열번호 9) 5'-TGTTTCTCCTCCTCGATCTTGC-3'(서열번호 10)
CYP2J6 5'-GGCCTCCCACCTAGTGGAA-3'(서열번호 11) 5'-ATAACCTCGTCCAGTAACCTCA-3'(서열번호 12)
CYP3A11 5'-GACAAACAAGCAGGGATGGAC-3'(서열번호 13) 5'-CCAAGCTGATTGCTAGGAGCA-3'(서열번호 14)
액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광( LC - MS / MS )에 의한 EET 의 측정
샘플 추출 및 기준: 샘플 추출을 전술된 바와 같이 수행하였다. 간단히, 2500 ng/ml의 모든 분석물을 갖는 스톡 용액을 메탄올 중에 제조하였다. 작동 기준을 EET, EpOME, DiHOME 및 HODE에 대하여 0.1 내지 250 ng/ml의 농도 범위로 추가 희석하여 수득하였다. 샘플 추출을 액체-액체-추출로 수행하였다. 이에 따라, 조직 또는 세포 배양 배지를 에틸 아세테이트(600 ㎕)로 2회 추출하였다. 합한 유기 상을 온화한 질소의 스트림 하에 45℃의 온도에서 제거하였다. 잔사를 메탄올/물/(50:50, v/v)(50 ㎕)로 재구성하고, 2 분 동안 10,000xg에서 원심분리한 후 유리 바이알[매커레이-나겔(Macherey-Nagel), 독일 뒤렌 소재]로 옮긴 후 LC-MS/MS 시스템에 주입하였다.
에폭시지질 및 HODE를 측정하기 위한 장치: LC-MS/MS 시스템은 음성 ESI 모드에서 작동하는 터보-V-공급원, 아질런트(Agilent) 1100 연성 HPLC 펌프 및 탈기기[아질런트(Agilent), 독일 발트브론 소재] 및 25 ㎕의 LEAP 주사기[악셀 셈라우 게엠베하(Axel Semrau GmbH), 독일 스프로크회벨 소재]로 맞춰진 HTC Pal 자동샘플러[크롬테크(Chromtech), 독일 이드스타인 소재]가 장착된 API 4000 삼중 4중극 질량 분석계[어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 독일 다름슈타트 소재]로 구성된다. 질량 분석계를 위한 고순도 질소는 NGM 22-LC-MS 질소 발생기[씨엠씨 인스트루먼츠(cmc Instruments), 독일 에쉬본 소재]에 의해 생성된다. 크로마토그래피 분리를 위해, 게미니(Gemini) NX C18 컬럼 및 예비컬럼을 사용하였다[150 mm x 2 mm i. d., 5 μm 입자 크기 및 110Å 공극 크기; 페노메넥스(Phenomenex), 독일 아샤펜부르크 소재]. 선형 구배는 0.5 ml/분의 유속으로 17.5 분의 총 실행 시간을 갖는 이동상을 이용하였다. 이동상 A는 물/암모니아(100:0.05, v/v)이고 이동상 B는 아세토니트릴/암모니아(100:0.05, v/v)였다. 구배는 85% A로부터 10%까지 12 분 이내에 출발하였다. 이를 1 분 동안 10% A에서 보유하였다. 0.5 분 이내에, 이동상은 다시 85% A로 이동하고 3.5 분 동안 보유하여 다음 샘플을 위해 컬럼을 평형시켰다. 샘플의 주입 용량은 20 ㎕였다. 정량화는 내부 기준 방법(동위원소-희석 질량 분석계)을 이용하여 애날리스트 소프트웨어(Analyst Software) V 1.4.2(어플라이드 바이오시스템스, 독일 다름슈타트)로 수행하였다. 분석물 피크 면적과 내부 표준 면적(y-축)의 비율은 농도(x-축)에 대하여 플롯하고, 보정 곡선은 1/농도2 가중치를 갖는 최소 제곱 회귀에 의해 계산하였다.
[35S] GTP γS 결합 에세이
추정되는 G-단백질 커플링 수용체의 활성화를 측정하기 위해, GTPγS 결합 어세이를 1 μM 9,10-EpOME[카이만, 미국 미시간주 앤 아버 소재) 및 신선한 [35S] GTPγS(1250 Ci/mmol, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 월섬 소재]를 사용하여 성체 래트로부터 DRG의 막 제조를 수행하였다.
iCGRP 의 측정
CGRP 측정은 CGRP-효소 면역 어세이 키트[스피바이오(SpiBio), 베르틴 파마(Bertin pharma), 프랑스 소재)를 사용하여 전술된 바와 같이 수행하였다. DRG 배양물로부터 CGRP 측정을 위해, 야생형 BL/6N 마우스의 DRG를 절개하고 전술된 바와 같이 처리하고 48-웰 플레이트에서 밤새 배양하였다.
데이타 분석 및 통계
모든 데이타는 평균±s.e.m으로 제시하였다. 모든 행동 실험에서 통계적으로 유의미한 차이를 확인하기 위해, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 사후 본페로니(Bonferroni) 보정을 한 후 반복 측정에 대한 분산 분석(아노바)을 사용하였다. 2개 군만을 포함하는 시험관내 실험을 위해, 스튜던츠 t-검정을 수행하였다. P <0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주된다.
사이토크롬 P450 루시퍼라제 어세이
CYP2J2 및 CYP3A4 글로 어세이를 제조 설명서[P450-Glo(상표), 프로메가(Promega)]에 따라 수행하였다.
CYP2J2 어세이의 프로토콜:
- 멀티드롭(MultiDrop) 사용하여 CYP2J2-효소(2 nM)/루시페린-2J2/4F12 기질(2 μM)을 웰당 5 ㎕씩 혼합하여 제조한다.
- 에코(Echo)를 사용하여 화합물(10 μM 최종 농도)/DMSO(0.5% 최종 농도)를 웰당 50 nl 첨가한다.
- 30 분 동안 37℃에서 배양한다.
- 멀티드롭을 사용하여 NADPH 재생 용액을 웰당 5 ㎕ 첨가한다.
- 30 분 동안 37℃에서 배양한다.
- 멀티드롭을 사용하여 LDR-에스터라제 용액을 웰당 10 ㎕ 첨가한다.
- 30 분 동안 37℃에서 배양하고, 엔스파이어(EnSpire)에서 발광을 판독한다.
CYP3A4-어세이의 프로토콜:
- 멀티드롭을 사용하여 CYP3A4-효소(2 nM)/루시페린-IPA 기질(7 μM)을 웰당 5 ㎕씩 혼합하여 제조한다.
- 에코를 사용하여 화합물(10 μM 최종 농도)/DMSO(0.5% 최종 농도)을 웰당 50 ㎕ 첨가한다.
- 30 분 동안 37℃에서 배양한다.
- 멀티드롭을 사용하여 NADPH 재생 용액을 웰당 5 ㎕ 첨가한다.
- 30 분 동안 37℃에서 배양한다.
- 멀티드롭을 사용하여 LDR-에스터라제 용액을 웰당 10 ㎕ 첨가한다.
- 30 분 동안 37℃에서 배양하고 엔스파이어에서 발광을 판독한다.
실시예 1: 화학치료-유도 신경병증성 통증에서의 CYP -유도된 지질
CYP-유도된 지질이 화학치료-유도 신경병증성 통증에서 역할을 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 발명자들은 야생형 BL/6N 마우스에 파클리탁셀 또는 비히클을 주사하고 24 시간 후 좌골 신경, DRG 및 척수 배면 각을 절개하였다. 지질 농도는 LC-MS/MS를 사용하여 측정하였다. 산화된 리놀레산 대사물 9,10-EpOME의 농도(도 1a)는 DRG에서 매우 높지만, 이의 자매 지질 12,13-EpOME(도 1b) 또는 이들의 다이하이드로-대사물 9,10- 및 12,13-DiHOME(보충 도 1 참조)의 농도는 DRG에서 높지 않음이 밝혀졌다(도 1a). 또한, 염증 통증 동안 생성되고 TRPV1 33의 내생성 활성인자인 9- 및 13-HODE의 수준은 정량화되었다(도 1c, 1d). 그러나, 발명자들은 파크리탁셀 치료 후 이들의 수준에서 어떠한 차이도 검출할 수 없었다. DRG에서 증가된 9,10-EpOME0-농도가 파클리탁셀 치료에 특이적인지 여부를 조사하기 위해, 자이모산을 염증 통증을 유발하기 위해 야생형 BL/6N 마우스의 뒷발에 주사하였다. L4-L6-DRG 및 배면 각의 상응하는 부분을 염증의 피크에서 주사 24 시간 후 절개하였다. LC-MS/MS에 의한 지질 정량화는 염증 통증 동안 9,10-EpOME 수준에서 어떠한 차이도 입증하지 않았다(도 1e).
다음으로, 발명자들은 칼슘 이미징 실험에서 DRG-뉴런에서 이의 효과에 관한 9,10-EpOME를 특성규명하였다. 발명자들은 10 μM의 9,10-EpOME으로 30초의 짧은 자극이 DRG 뉴런에서 칼슘 과도를 야기한다는 것을 발견하였다(도 2a). 발명자들은 용량 반응 분석을 수행하여 칼슘 과도 유발시 9,10-EpOME의 효능을 조사하고, 더 좋은 농도에 상응하는 뉴런의 퍼센트의 유의미한 증가 없이 25 μM의 9,10-EpOME에 상응하는 최대 10.3%의 DRG 뉴런을 밝혔다(도 2b). 9,10-EpOME 유발 칼슘 과도가 세포외 칼슘의 유입으로부터 세포내 칼슘 저장의 방출을 야기하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 2 mM EGTA를 함유하는 칼슘 무함유 외부 용액을 사용하고 10 μM의 9,10-EpOME로 30초 동안 DRG 뉴런을 2회 자극하였다. 2차 자극 2분 후, 칼슘 무함유 외부 용액을 세척하였고, 뉴런은 더이상 9,10-EpOME에 반응하지 않았으며, 이에 따라 9,10-EpOME에 의해 야기된 외부 칼슘의 유입을 나타낸다(도 2c, 2d). 뉴런에 대한 양성 대조군을 50 mM KCl로 30 초 동안 최종 자극하였다.
수반된 이온 채널을 확인하기 위해, TRPV1(AMG 9810, 1 μM) 및 TRPA1(HC-030031, 20 μM)의 선택적인 길항제를 9,10-EpOME에 의해 야기된 칼슘 유동을 차단하기 위해 사용하였다. DRG 뉴런을 9,10-EpOME(10 μM, 30초)로 3회 자극하고, 세포를 TRP 채널 길항제로 2분 동안 예비-배양한 후 2차 9,10-EpOME로 자극하였다. 본 발명자들은, TRPA1 길항제 HC-030031이 아니라 선택적인 TRPV1 길항제 AMG 9810이 2차 9,10-EpOME-유발 칼슘 과도를 차단할 수 있음을 관찰하였고, 9,10-EpOME에 의해 표적된 채널로서 TRPV1을 나타낸다(도 2e, 2f).
실시예 2: 9,10- EpOME 는 TRPV1 을 민감화한다
이어서, 본 발명자들은, 9,10-EpOME가 또한 낮거나 높은 생리학적 농도(1 μM)에서 TRPV1 또는 TRPA1을 민감할 수 있는 경우 분석하였다. 이에 따라, 본 발명자들은 DRG 뉴런을 캡사이신(200 nM, 15 초)으로 2회 자극하고 세포를 2분 동안 9,10-EpOME[1 μM] 또는 비히클과 함께 배양한 후 2차 캡사이신으로 자극하고 9,10-EpOME와 함께 배양된 캡사이신에 대한 DRG 뉴런의 유의미하게 강한 반응을 관찰함으로써 9,10-EpOME에 의한 TRPV1의 민감화를 나타내었다(도 3a). 9,10-EpOME 의존적 TRPV1 민감화의 효능을 조사하기 위해, 250 nM 내지 2 μM의 9,10-EpOME 농도를 사용하여 용량 반응 분석을 수행하였다. 비히클과 비교하여 2차 캡사이신 반응의 진폭에서 용량 의존성이 증가함을 관찰하였다. 이러한 효과는 겨자 오일-의존적 TRPA1-반응이 9,10-EpOME[1 μM]에 의해 민감될 수 없기 때문에 TRPV1에 대하여 특이적으로 보인다(도 2b).
전기생리학적 방식을 사용하여 9,10-EpOME에 의한 TRPV1 민감화의 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 2개의 캡사이신 자극[1 μM]을 사용한 후 9,10-EpOME[1 μM]를 사용하여 2차 캡사이신 자극 전에 세포를 배양하여 척수 슬라이스의 라미나 II 뉴런으로부터 sEPSC를 측정하였다(도 3c). 9,10-EpOME 단독 처리는 sEPSC의 주파수를 약간 증가시켰다. 그러나, 캡사이신과 조합하여, sEPSC 주파수는 강력하게 강화되었다(도 3d). 그러나, sEPSC의 진폭의 차이는 9,10-EpOME, TRPV1, 또는 상기 2개 물질의 조합으로 관찰할 수 없었다(도 3e).
지질 매개된 TRPV1-민감화는 대부분 G-단백질 커플링된 수용체의 활성화를 수반하는 것으로 공지되어 있으므로, 본 발명자들은 GTPγS 어세이를 수행하여 9,10-EpOME가 DRG에서 GPCR을 활성화할 수 있는지 여부를 분석하고, 1 μM 9,10-EpOME로 배양 후 GTPγS의 유의미하게 증가된 신호를 관찰하였다(도 4A). 이어서, 9,10-EpOME 매개된 TRPV1 민감화의 기전을 확인하기 위해, 본 발명자들은 비히클, 9,10-EpOME, IP-수용체 작용제 시카프로스트 또는 포르스콜린[각각 1 μM]으로 15분 동안 자극된 뉴런 풍부한 DRG 배양물에서 cAMP를 측정하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 9,10-EpOME가 이의 비히클과 비교하여 cAMP 농도에서 유의미한 증가를 야기함을 관찰하였다(도 4B). 이러한 결과는 9,10-EpOME에 의한 갈파스(Galphas) 커플링된 수용체의 활성화를 나타낸다.
TRPV1은 채널 35의 증가된 활성화 및 민감화를 야기하는 PKA 및 PKC에 의해 인산화될 수 있으므로, 본 발명자들은 PKA 또는 PKC의 억제제가 야생형 BL/6N 마우스로부터 배양된 DRG 뉴런으로 칼슘 이미징 실험에서 9,10-EpOME-유발 TRPV1-민감화를 줄일 수 있는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 이중 캡사이신 자극으로 전술된 바와 동일한 프로토콜 및 9,10-EpOME로 중간 배양을 사용하여 캡사이신-의존 TRPV1 민감화를 재생할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 PKA-억제제(H89 디하이드로클로라이드, 1 시간 동안 10 μM)로 예비-배양이 9,10-EpOME-유발 TRPV1 민감화의 유의미한 감소를 야기함을 관찰하였다(도 4C, 4D). 동일한 조건 하에(10 μM, 1 시간 동안 예비-배양) PKC-억제제 GF 109203X(GFX)의 사용은 9,10-EpOME 유도 TRPV1 민감화에서 어떠한 효과도 없고(도 4E, 4F), 따라서 9,10-EpOME에 의한 PKC-매개된 TRPV1 민감화가 아닌 PKA-매개된 TRPV1 민감화를 가리킨다.
이어서, 본 발명자들은 칼슘 이미징 실험에서 9,10-EpOME 의존적 TRPV1 민감화의 잠재적인 관련을 위한 갈파스-커플링된 프로스타노이드 수용체를 시험하였다. 프로스타노이드 수용체는 이들의 리간드 프로스타노이드에 대해 변하는 특이성을 갖고 또한 다른 지질에 의해 활성화될 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 프로스타글란딘 E 수용체 EP2 및 EP4 또는 프로스타글란딘 D- 또는 I-수용체(DP- 및 IP-수용체) 결핍 마우스(도시되지 않음)의 DRG에서 9,10-EpOME 유발 TRPV1-민감화의 어떠한 감소도 관찰할 수 없었다. 9,10-EpOME의 생체내 효과를 특성규명하기 위해, 본 발명자들은 야생형 BL/6N 마우스의 뒷발에 지질을 주사하고 주사 후 5 시간까지 열(도 5a) 및 기계적 임계치(도 5b)를 측정하였다. 둘 다의 경우에, 9,10-EpOME는 주사 후 1 시간(열) 또는 2 시간(기계적) 지속하는 통증 역치의 유의미한 감소를 야기하였다(도 1a, 1b). 이어서, 본 발명자들은 9,10-EpOME를 척추강내로 주사하고 짧은 시간 간격에서 열 및 기계적 임계치를 측정하였다. 척추강내 주사 30 분 후 열 임계치의 유의미하지만 다소 약한 감소를 관찰하였다(도 5c). 그러나, 임계치는 9,10-EpOME의 척추강내 주사 후 1.5 시간까지 감소하였다(도 5d).
TRPV1의 증가된 활성은 신경성 염증 37을 촉진하는 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)의 증가된 방출을 야기하므로, 본 발명자들은 9,10-EpOME가 TRPV1 의존 CGRP 방출을 증가시킬 수 있는지 여부를 분석하였다. 본 발명자들은 야생형 BL/6N 마우스로부터 좌골 신경을 절개하고 이를 9,10-EpOME 단독[1 μM] 또는 캡사이신[500 nM]과 함께 배양하여 캡사이신 및 9,10-EpOME의 공동-자극으로 CGRP 방출의 큰 증가를 관찰하였다. CGRP-방출은 캡사이신 또는 9,10-EpOME 단독을 사용하는 것보다 현저하게 더 컸다(도 6a). 이러한 효과가 또한 세포 소마에서 가시적인 경우를 조사하기 위해, 9,10-EpOME, 캡사이신을 갖는 뉴런 풍부한 DRG-배양물, 또는 두 기질을 2가지 상이한 EpOME-농도[1 및 2.5 μM]를 사용하여 자극하였다. 다시, iCGRP의 방출은 EpOME 및 캡사이신 중 하나보다 상기 기질을 둘 다 사용하여 현저하게 증가하였다. 그러나, 2.5 μM의 9,10-EpOME를 사용하는 CGRP-방출에서 유의미한 증가는 없었다(도 6b).
실시예 3: CYP2J2 는 9,10- EpOME 를 조절한다
다음으로, 9,10-EpOME 합성이 파클리탁셀 CIPNP 동안 어떻게 조절되는지를 조사하였다. 9,10-EpOME는 하위패밀리 2C 및 2J 16, 38의 CYP-에폭시게나제에 의해 합성되는 것으로 추정되므로, 본 발명자들은 이러한 하위패밀리의 뮤린 CYP-에폭시게나제의 발현을 입증하였다. 파클리탁셀 처리 8일 후, 본 발명자들은 파클리탁셀 처리된 마우스의 기계적 임계치에서 안정한 정체기를 관찰하였다(도 7a).
이어서, 본 발명자들은 비히클 및 파클리탁셀 처리된 마우스의 DRG를 절개하고 뮤린 CYP2C29, CYP2C37, CYP2C38, CYP2C39, CYP2C44, CYP2J6 및 CYP3A11의 발현을 조사하였다. 그러나, CYP 이소폼 2C29 및 2C44는 뮤린 DRG에서 검출할 수 없었다. 본 발명자들은 CYP2J6이 비히클 처리된 마우스에 비해 파클리탁셀 처리된 마우스의 DRG에서 가장 강력한 발현을 나타냄을 관찰하였다(도 7b). CYP2J6에서 증가된 발현은 좌골 신경, 요추 DRG 및 척수의 LC-MS/MS의 측정에 의해 분석된 바와 같이 파클리탁셀 처리 8일 후 9,10-EpOME의 증가된 수준과 관련된다.
실시예 4: CYP2J2 길항제는 9,10- EpOME 합성을 억제하고 CIPNP 를 감소시킨다
뮤린 CYP2J6과 유사한 단백질인 인간 CYP2J2의 강력한 억제제인 테르페나딘을 길항제로서 사용하였다. 테르페나돈 및 인간 CYP2J2의 상호작용 부위가 이미 기술되었으므로, 본 발명자들은 뮤린 CYP2J6 및 인간 CYP2J2의 아미노산을 정렬하고 글루타민으로 교환된 Arg117을 제외한 2개 단백질의 동일한 위치에서 테르페나돈(Leu83, Met116, Ile127, Phe30, Thr315, Ile376, Leu378, Val380, Leu402 및 Thr488)을 갖는 모든 가능한 상호작용 부위를 밝혔다. CYP2J2와 CYP2J6 사이의 놀라운 아미노산 서열 유사성에 기초하여, 테르페나딘은 또한 CYP2J6과 상호작용하고 단백질을 억제한다. 지질 수준에서 테르페나딘의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 8일 전에 파클리탁셀을 투여한 마우스에 1 mg/kg 테르페나딘을 i.v. 주사하였다. 2 시간 후, 본 발명자들은 좌골 신경, DRG 및 척수 배면 각을 절개하고 이러한 조직에서 에폭시지질을 정량화하였다. 본 발명자들은 모든 조사된 조직에서 9,10-EpOME 농도의 유의미한 감소를 관찰할 수 있다(도 8a). 또한, 본 발명자들은 모든 측정된 에폭시 지질 및 이들(9,10-EpOME, 12,13-EpOME, 9,10-DiHOME, 12,13-DiHOME and 14,15-EET)의 잔여 농도가 DRG, 척수 배면 각 및 혈장에서 유의미하게 감소하지만 각각 처리된 동물의 좌골 신경에서 그렇지 않음을 관찰하였다(도 8b).
이어서, 본 발명자들은 테르페나딘으로 처리가 마우스에서 파클리탁셀-유도 CIPNP를 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 따라서, 본 발명자들은 테르페나딘(1 또는 2 mg/kg) 또는 비히클(DMSO)을 이미 8일 전에 파클리탁셀을 주사한 마우스에 정맥내로 주사하였다. 본 발명자들은 테르페나딘 주사 1, 2, 4 및 5 시간 후 마우스의 기계적 임계치를 측정하고 2 시간 동안 지속되는 테르페나딘으로 처리된 마우스의 기계적 임계치에서 유의미한 증가를 관찰할 수 있었다. 그러나, 2가지 투여량 사이에 유의미한 차이는 관찰할 수 없었다(도 8c). 테르페나딘은 히스타민-1-수용체 길항제이므로, 본 발명자들은 항통각 효과가 실제로 CYP2J2의 억제에 의해 야기되는 경우를 조사하기 위해 로라타딘, CYP2J2를 억제하지 않는 또 다른 H1-수용체 길항제, 또는 히스타민-1-수용체를 사용하였다. 그러나, 로라타딘으로 처리는 비히클과 비교하여 파클리탁셀-유도 CIPNP를 감소시키지 않았다(도 8d).
실시예 5: 신규한 선택적인 CYP2J2 길항제의 선별
스크린스-웰(Screens-Well: 등록상표) FDA 승인 약물 라이브러리 v2는 본 발명에 기재된 것과 관련하여 사용하기 위한 CYP2J2의 신규한 선택적인 길항제를 선별하였다. 효소에 의한 CYP-글로 루시퍼라제 기반 반응을 사용하여 CYP2J2 및 비선택적 대조군 CYP3A4의 활성을 분석하였다. 테페나딘을 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다. 2가지 선별 결과를 도 9에 도시하였다. CYP2J2에 대하여 60% 이상 억제 및 CYP3A4의 약 0% 억제를 나타낸 길항제를 선택적인 CYP2J2 길항제로서 간주하고, 이는 본원에 기재된 방법 및 용도에 유용하고, 하기 표 2에 열거하였다.
화합물 ID CYP2J2 평균 억제율(%) CYP3A4 평균 억제율(%) 명칭
c054 84.4 12.1 에스트라디올
c089 75.0 17.9 페녹시벤즈아민·HCl
c124 80.8 -23.5 로라타딘
c146 78.2 -4.3 클로베타솔 프로피오네이트
c244 73.7 -43.3 독사조신 메실레이트
c246 78.0 -26.2 페노피브레이트
c314 64.0 5.1 레보노르게스트렐
c337 92.8 15.5 아리피프라졸
c440 76.8 -18.5 할시노나이드
c485 89.5 7.6 텔미사르탄
c516 79.1 -82.9 클로파지민
c542 87.6 12.9 레보타이록신·Na
c595 81.8 14.0 알로세트론·HCl
c596 75.9 10.7 플루오시노나이드
c606 93.6 -6.8 리오타이로닌·Na
c608 71.5 17.4 메클리진 디하이드로클로라이드
의견
9,10-EpOME는 서브마이크로몰 농도에서 cAMP-PKA 의존적 기작을 통해 DRG 뉴런에서 TRPV1을 민감할 수 있고, 이후 DRG로부터 iCGRP의 후속 방출을 야기한다. 다른 산화된 리놀레산 대사물(OLAM), 예컨대, 9- 및 13-HODE(이는 피부의 과잉 가열 동안 생성됨)는 이미 직접적인 TRPV1 작용제으로 나타났고 염증성 통각과민증에 기여한다. 또한, 본 발명자들은 뮤린 조직, 가장 우세하게 말초 조직에서 9- 및 13-HODE를 검출할 수 있다.
본 발명자들은 9,10-EpOME의 합성을 감소시키기 위해 CYP2J2-억제제 테르페나딘을 사용하고 에폭시지질의 수준을 약 50%로 감소시킬 수 있다. 테르페나딘으로 처리는 파클리탁셀 CIPNP 동안 마우스에서 감소된 역학적 과민감성을 야기하였다. 따라서, CYP2J2 및 이의 동족체의 길항제는 CIPNP를 치료하거나 예방하는데 유용하고, 이는 CYP2J2에 영향을 미치지 않는 선택적인 H1-수용체 길항제인 로라타딘으로 치료된 동물은 파클리탁셀 CIPNP에서 개선을 나타내지 않으므로, 테르페나딘으로 관찰된 효과는 히스타민 1-수용체의 억제가 아니라 CYP2J2의 억제로 인함을 확인하였다.
화학치료-유도 신경병증성 통증 및 후속 감각 기능 장애는 세포증식억제의 가장 심각한 부작용이 여전히 남아 있다. 특히 파클리탁셀 처리 동안, 초기 급성 통증 증후군은 통각 뉴련의 민감화에 의해 매개되는 것처럼 관찰될 수 있다. 그러나, 이러한 병리생리학 상태에 기여할 수 있는 내인성 매개체에서 이용할 수 있는 정보는 없다. 따라서, 본 발명자들의 데이타에 따라, 9,10-EpOME-의존적 TRPV1 민감화 및 통각 뉴런의 증가된 활성은 파클리탁셀 급성 통증 증후군(P-APS)에 기여할 수 있다.
현재, CIPNP 치료제에 대하여 충족되지 않은 의학적 요구가 있다. 산화방지제 또는 신경보호 물질, 예컨대, 아미포스틴 또는 글루타티온으로 환자의 치료는 대규모 무작위화되고 위약 제어된 임상 시험에서 CIPNP를 개선하는데 실패하였고, 최근 코크란(Cochrane) 검토는 이러한 물질을 사용하는 기능적인 CIPNP 요법에 대하여 현재 증거가 없음으로 결론내렸다. 또한, 산화방지제는 세포증식억제의 항종양성 효과를 방해할 수 있다. 최근에, N-아세틸 시스테인(NAC) 및 비타민 E로 처리가 DNA 손상을 줄여 마우스에서 폐 종양 세포 증식 및 종양 성장을 증가시킴이 보고되었다. 이와 관련하여, 캐스파제-3, Bax 및 Bcl-2를 활성화시키고 종양 세포 이동 및 부착을 감소시켜 시험관내 및 생체내 암 성장을 심지어 감소시키는 것으로 보고되었기 때문에, CYP2J2-억제제는 산화방지제를 사용하는 것보다 뛰어날 수 있다.
<110> Fraunhofer-Gesellschaft zur Foerderung der angewandten Forschung e.V. <120> CYP2J2 ANTAGONISTS IN THE TREATMENT OF PAIN <130> F30742WO <140> PCT/EP2015/068767 <141> 2015-08-14 <150> EP14181086.1 <151> 2014-08-14 <150> EP14186624.4 <151> 2014-09-26 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 1 gcctcaaagc ctactgtca 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 2 aacgccaaaa cctttaatc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 3 atactctata tttgggcagg 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 4 gttcctccac aaggcaac 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 5 ttgccttctg taatccccc 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 6 tctaacgcag gaatggataa ac 22 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 7 ggagacagag ctgtggc 17 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 8 taaaaacaat gccaaggccg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 9 ctttccaacg agcgattccc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 10 tgtttctcct cctcgatctt gc 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 11 ggcctcccac ctagtggaa 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Primer sequence <400> 12 ataacctcgt ccagtaacct ca 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 13 gacaaacaag cagggatgga c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 14 ccaagctgat tgctaggagc a 21

Claims (15)

  1. 대상체에서 신경병증성 통증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, CYP2J 길항제인 사이토크롬 P450 에폭시게나제(CYP) 길항제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    신경병증성 통증이 대상포진 후 신경통, 삼차 신경통, 중심 말초 신경 손상, 및 무지각성 동통; 뇌졸중 또는 종괴 병변, 척수 손상, 또는 다발성 경화증으로 인한 중추 통증; 및 당뇨병, HIV 또는 화학치료로 인한 말초 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CYP 길항제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    통증이 화학치료-유도 말초 신경병증성 통증(CIPNP)인 CYP 길항제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CYP 길항제가 에스트라디올, 페녹시벤즈아민-HCl, 로라타딘, 클로베타솔 프로피오네이트, 독사조신 메실레이트, 페노피브레이트, 레보노르게스트렐, 아리피프라졸, 할시노나이드, 텔미사르탄, 클로파지민, 레보타이록신-Na, 알로세트론-HCl, 플루오시노나이드, 리오타이로닌-Na, 메클리진 디하이드로클로라이드 및 테르페나딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CYP2J2 길항제인 CYP 길항제.
  5. 대상체에서 신경병증성 통증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 9,10-에폭시-12Z-옥타데센산(9,10-EpOME) 길항제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통증이 화학치료-유도 말초 신경병증성 통증(CIPNP)인 9,10-EpOME 길항제.
  7. (i) CYP 길항제 또는 9,10-EpOME 길항제, 및
    (ii) 암과 같은 증식성 질환 및 CIPNP와 같은 통증으로부터 선택되는 질병의 예방 또는 치료에 동시적 또는 순차적 사용을 위한 화학치료제
    를 포함하는 조합.
  8. 제 6 항에 있어서,
    길항제(i) 및 화학치료제(ii)가 질병의 예방 또는 치료 동안 대상체에게 순차적 또는 동시적 투여에 의해 조합되고, 바람직하게는 길항제들이 질병의 예방 또는 치료 동안 동시적으로 투여되는 조합.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    길항제가 억제 RNA, 억제 항체 및/또는 소분자로 이루어진 화합물의 군으로부터 선택되는, CYP 길항제, 9,10-EpOME 길항제 또는 조합.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통증에 효과적인 하나 이상의 추가 치료제를 대상체에게 투여하는, CYP 길항제, 9,10-EpOME 길항제 또는 조합.
  11. 대상체에서 질병의 치료에 사용하기 위한 9,10-EpOME 또는 CYP2J 작용제.
  12. 제 11 항에 있어서,
    일시적 수용체 전위 바닐로이드 1(TRPV1) 작용제로 치료받았거나, 치료받고 있거나, 치료받을 예정인, 9,10-EpOME 또는 CYP2J 작용제.
  13. (i) 9,10-EpOME 또는 CYP2J 작용제, 및
    (ii) TRPV1 작용제
    를 포함하는, 의약에서 사용하기 위한 조합.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질병이 당뇨병성 신경병증, 대상포진 후 신경통, HIV/AIDS, 외상성 손상, 복합 부위 통증 증후군, 삼차 신경통, 홍색사지통증 및 환상 통증과 관련된 통증을 비롯한 신경병증성 통증; 혼합성 통각 및/또는 신경병증성 혼합성 병인학(예를 들면, 암)에 의해 생성된 통증; 골관절염, 섬유근통, 하부 요통, 염증성 통각과민증, 외음부 전정염 또는 외음부통, 부비강 폴립 간질성 방광염, 신경성 또는 과활성 방광, 전립선 과다형성, 비염, 수술, 외상, 직장 과민증, 구강 작열감 증후군, 경구 점막염, 포진(또는 다른 바이러스 감염), 전립선 비대증, 피부염, 소양증, 가려움, 이명, 건선, 사마귀, 암(특히 피부암), 두통 및 주름에 의해 생성된 통증으로부터 선택되는 9,10-EpOME 또는 CYP2J 작용제.
  15. 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TRPV1 작용제가 캡사이신, 피페린, 6-진저롤, 6-쇼가올, α-산쇼올, β-산쇼올, γ-산쇼올, δ-산쇼올, 하이드록실 α-산쇼올 및 하이드록실 β-산쇼올로 이루어진 군으로부터 선택되는 9,10-EpOME 또는 CYP2J 작용제.
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