KR20170032490A

KR20170032490A - 키토산 유래 조성물

Info

Publication number: KR20170032490A
Application number: KR1020177007047A
Authority: KR
Inventors: 토마스 호드; 로버트 노드퀴스트; 웨이 첸; 라울 카루벨리; 루치아노 알레루쪼; 피터 젠킨스; 크리스토퍼 웨이넌트; 조셉 라커
Original assignee: 임무노포토닉스 인코퍼레이티드
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2017-03-22
Also published as: MY191932A; MX2014008702A; PE20142325A1; BR112014017426A2; PT2804611T; KR20180123727A; CN104619310A; CA2861367A1; JP2015513522A; SI2804611T1; CL2014001880A1; EP2804611A4; NZ628433A; JP6180436B2; HK1210019A1; DK2804611T3; AU2013209716B2; KR20220028153A; KR20140117487A; KR20200139254A

Abstract

본 발명은 일반적으로 종양(예로 악성 폐, 갑상선, 신장 종양 및 다른 의학적 장애)의 치료를 위한 방법과 연계해서 사용되는 키토산 유래 조성물로 이루어진 치료적 조성물에 관한 것이다.

Description

키토산 유래 조성물{CHITOSAN-DERIVED COMPOSITIONS}

우선권 주장

본원에서 이 PCT 국제 특허 출원은2012년 1월 20일에 신청된 "키토산 유래 생체 물질과 이의 응용"으로 명명된 미국 임시 특허 출원 일련 번호 61/588,783에 대하여 우선권을 주장한다. 그리고 그 전체 내용이 참고로 인용되었다.

본 발명은 일반적으로 악성 폐, 유방, 전립선, 피부, 갑상선, 신장 등의 종양, 다른 악성 종양 또는 다른 종류의 의료 질환등과 같은 종양에 대한 치료를 위한 수단과 연계하여 사용되는 키토산 유래 조성물로 이루어진 치료용 조성물에 관한 것이다.

키토산은 키틴의 유도체로 게, 가재, 새우 등의 갑각류로부터 추출된 물질이다. 키틴은 14개의 글리코시드 결합으로 연결된 N- 글루코스아민 단위로 이루어진 선형 단일 중합체다. 키토산(부분적 탈 아세틸화된 키틴)과 그 유도체는 수 많은 산업적 및 의료적 응용을 이끌어낸 흥미로운 화학적, 생물학적 특성을 가지고 있다. 본원에서 인용된 미국 특허 5,747,465("키토산 유래 생물질")에 기술된 글리케이션(glycation)된 키토산은 이런 키토산 유도체의 하나이다.

암은 아무 나이에 어떤 기관의 조직에서나 발생할 수 있다. 일반 암의 확진이 이루어지면 치료의 결정이 가장 중요하다. 비록 모든 암에 대해 적용할 수 있는 단일한 치료법은 없으나, 성공적인 치료법은 일차 종양과 그 전이 둘다에 대하여 집중되어야 한다.

역사적으로 수술이나 방사선 같은 국부/지역적 치료법은 화학약물 요법 같은 체계적 치료법과 함께 사용되어 왔다. 일부 성공에도 불구하고 기존의 치료법들은 원하는 만큼 효과적이지 않아 더 효과적인 치료법들을 계속 찾아왔다. 더 효과적인 암 치료법에 대한 아직 상당부분 충족되지 않은 필요성이 확실하게 존재한다.

미국 특허 5,747,475("키토산 유래 생물질")에 기술된 기존의 글리케이션(glycation)된 키토산 제제는 동물 전이성 종양 모델의 치료에 면역항원 증강제(immunoadjuvant)로서 상당한 효과를 보여 주었다.

하지만, 기존의 글리케이션(glycation)된 키토산 제제는 수용액에서 분산, 현탁 또는 용해되었을 때 이를 이용한 생의학적 적용에서 주입이나 분사가 가끔 매우 어렵다. 또한 미국 특허 5,747,475("키토산 유래 생물질")에 기술된 기존의 글리케이션(glycation)된 키토산 제제는 살균여과가 거의 불가능하여, 현재의 우수 제조 관리기준(cGMP)에 따른 산업적 생산에 적합하지 못하며, 이에 따라 사람에게 사용하기에도 적합하지 못하다. 그러므로, 앞서 언급된 단점들에 훨씬 더 적게 노출되어 개선된 점탄성 글리케이션(glycation)된 키토산제제 를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

일 실시예에 따르면, 본 발명은 종양과 다른 의료 질환을 치료하기 위한 방법과 연관되어 사용되는 키토산 유래 조성물로 이루어진 치료 제형에 관한 것이다. 이 발명의 추가적인 관점 및/또는 장점은 다음에 기술될 것이고 부분적으로는 본 발명의 예시에 의해 알 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

본 발명의 여러 관점과 이점은 도표와 함께 첨부된 다음의 실시예에 대한 설명으로부터 분명해지고 바로 이해 될 것이다:

도 1은 예로 갈락토키토산(galactochitosan)이 있는 글리케이션된 키토산에 대한 기존의 한 본 보기를 묘사한다.

도 2는 점탄성 글리케이션된 키토산의 모 키토산 탈아세틸화가 80%이고 전체 가능한 탈아세틸화 아미노기의 글리케이션이 12.5%인 본 발명의 한 전형적인 구조를 묘사한다.

본 발명에서 바람직한 실시예의 다른 목적과 장점은 다음의 상세한 설명에 의해 이 분야의 기술자에게 바로 명백해 질 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예와 설명 목적의 예들이 묘사된다.

본 발명은 일반적으로 종양과 다른 의료 질환을 치료하기 위한 방법과 연관되어 사용되는 키토산 유래 조성물로 이루어진 치료 제형에 관한 것이다. 여기에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 인용되는 것으로 이해되어야 한다.

이제 본 발명의 예시에 대한 참조가 상세히 만들어질 것이고 이에 대한 예가 동반된 그림에 묘사되어 있다. 여기서 동일한 참조번호는 항상 동일한 요소를 언급한다. 본 발명은 발명의 사상과 범위를 모두 벗어나지 않고 다양하고 명백한 관점에서 수정될 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 따라서 설명은 자연히 한정적이지 않고 서술적이다.

글리케이션(glycation)된 키토산

글리케이션(glycation)된 키토산은 환원 반응에 의한 안정화가 수반되는 키토산의 자유 아미노기의 글리케이션(glycation), 즉 비효소적 당화(glycosylation) 반응의 산물이다. 글리케이션은 레이저를 이용하는 면역치료에 같이 쓰이는 유도체의 사용이나 다른 유도체의 응용을 촉진하는 기대하지 않았던 유리한 용해도, 점도 등의 특성을 키토산에 부여한다. 키토산의 글리케이션은 또한 키토산을 유리하게 더 친수성으로 만들어 그렇지 않을 때 보다 더 많은 물이 중합체에 흡수되고 유지된다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 키토산 유래 생물질은 탈아세틸화된 선형 단일 중합체(키토산)로 이루어진다. 여기서 탈아세틸화된 키틴은 글리케이션된 키토산을 형성하기 위해 환원성 단당류나 다당류의 카르보닐기에 결합되는 여러 자유 아미노기를 가지고 있다. 그래서 글리케이션된 키토산은 환원성 단당류나 다당류의 카르보닐기와 탈아세틸화된 키틴의 자유 아미노기 사이의 반응 산물로 얻어진다. 따라서, 본원에서 사용되는 글리케이션된 키토산은 환원 반응에 의한 안정화가 수반되는 키토산의 자유 아미노기가 글리케이션된 즉 비효소적 당화(non- enzymatic glycosylation) 반응의 산물을 의미한다. 일반적으로 말하자면 글리케이션(즉 비 효소적 당화)은 효소의 기여 활동이 없이 프럭토스나, 글루코스 같은 당 분자가 단백질이나 지방같은 기질에 결합할 때 일어나는 과정을 의미한다. 하나의 이러한 예는 당단백질을 형성하기 위한 당과 단백질 아민기의 비효소적 반응이다.

그러므로, 글리케이션된 키토산은 키토산의 자유 아미노기와 환원 단당 및/또는 다당의 카르보닐기 사이의 반응으로부터 생성된 제품을 포함한다. 주로 쉬프염기(Shiff base; 카르보닐기의 탄소 원자가 물 한 분자를 방출하면서 자유 아민기의 질소에 이중결합된)와 아마도리(Amadori; 인접한 탄소원자는 산소원자에 이중결합하는 반면, 상기 카르보닐기의 탄소 원자는 상기 아미노기의 질소분자에 단일결합된) 제품의 혼합물인 이 반응의 생성물은 이 상태로나, 예로 NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)3등의 붕소수소화물 환원제 같은 수소화물과의 환원반응 또는 적절한 촉매제와 함께 수소에 대한 노출시키는 과정에의한 안정화 후에 사용될 수 있다.

키토산의 일차, 이차 알콜기와 일차 아미노기의 존재는, 주로 용해화을 이루기 위해서 그리고 특정한 응용을 위한 특성을 주기 위한 화학적 변형에 대하여 여러 접근성을 용이하게 한다.

키틴과 키토산의 용해화는 다당사슬의 가수분해로 부분적으로 얻어질 수 있다. 키토산에 유기물이나 무기물의 다양한 종류의 산 처리는 자유 아미노기의 프로톤화(protonation)에 의해 수용성 키토소늄 염(chitosonium salt)의 형성을 이끈다. 아미노기의 추가적인 변형은 카르복시메틸, 글리세릴, N-하이드로뷰틸 등과 같은 화학 그룹의 도입을 포함한다. 본 발명에서 사용된 글리케이션(glycation), 즉 키토산의 자유 아미노기에 비효소적 당화는 환원에 의한 안정화를 거쳐 다양한 제약적 제형의 제조를 위해 선호된 방법을 제공한다.

설명의 목적으로 글리케이션된 키토산의 한 기존 예로 미국 특허 5,747,475에도 묘사, 설명된 갈락토키토산이 아래 도 1에 보여진다:

도 1. 기존의 글리케이션된 키토산의 예시적인 구조. 분자량은 1,500,000 Daltons이고 모든 아미노기는 글리케션되어 있다.

미국 특허 5,747,475는 그 설n명이 매우 한정되어 있고 분자량적 측면에서 오직 하나의 특정 갈락토키토산 만 기술한다. 구체적으로 미국 특허 5,747,475는 오직 갈락토키토산를 1500 kDa으로 만 기술한다.

미국 특허 5,747,475에 기술된 기존의 1500 kDa의 갈락토키토산과 다르게, 본원에 기술된 본 발명의 글리케이션된 키토산은 분자량 1500 kDa이하의 글리케이션된 키토산을 포함하도록 의도되어 있다는 것을 명심해야한다. 또한 종래의 키토산과 달리, 본 발명의 글리케이션된 키토산은 의외의 유익한 점탄성을 포함한 수 많은 놀랍고도 예상치 못한 특성, 이점, 장점을 지닌 완전히 다르고 새로운 조성물이다.

본 발명의 글리케이션된 키토산은 쉬프 염기, 아마도리 생성물, 또는 더 선호되는 환원된 이차 아민 이나 알콜의 형태로 있다. 다른 실시예로, 글리케이션된 키토산은 카르보닐 반응성기를 포함한다. 본 발명의 글리케이션된 키토산은 바림직하게는 산성화제의 존재하에서, 약 0.1%에서 30% 정도(대부분 바람직하게 2%이상)까지 키토산 중합체의 아미노기가 글리케이션이 달성되는 정도로 당의 카르보닐기와 키토산의 일차 아미노기 사이에 쉬프염기의 생성(본원에서 아미노기의 글리케이션으로도 설명된)을 위한 충분한 시간을 가지고, 키토산을 단당 및/또는 다당과 반응시켜 얻어지는 것을 선호한다. 이어서 바람직하게는 쉬프염기와 이차 아민이나 알콜기에 재배열된 유도체(아마도리 생성물)사이의 환원에 의한 안정화를 따른다.

본 발명은 약 0.1%에서 30% (대부분 바람직하게 2%이상)까지 키토산 중합체의 글리케이션이 달성된 첫 실증이다. 본 발명과는 달리, 다른 이들은 이 중요한 결과를 달성하거나 인식하지 못했다. 따라서 바람직한 실시예에 의하면, 본 발명은 분자량이 약 50,000 Daltons에서 1,500,00 Daltons에 이르고, 더 나아가 글리케이션된 키토산 중합체가 그렇지 않으면 자유 아미노기로 존재하지만 약 0.01에서 30퍼센트의 글리케이션을 가지고있는, 기본적으로 글리케이션된 키토산 중합체로 이루어진 점탄성 글리케이션된 키토산의 제제를 제공한다.

그러므로 키토산 자유 아미노기의 비효소적 당화로부터 유래된 생성물은 주로 쉬프염기(예로 이민 (imine) 작용기로도 알려진 아미노기의 질소원자에 이중결합한 초기 카르보닐기의 탄소 원자)와 아마도리 생성물(예로 인접한 탄소 원자는 산소원자에 이중결합하여 키톤기를 형성하고 상기 아미노기의 질소원자에 단일결합으로 결합된 초기 카르보닐기의 탄소원자)의 혼합물이다. 비효소적 당화 과정에서 유래된 생성물은 이 상태로나, 예로 NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)3등의 붕소수소화물 환원제 같은 수소화물과의 환원반응 또는 적절한 촉매제와 함께 수소에 대해 노출시키는 과정에 의한 안정화 후에 사용될 수 있다.

아질산을 이용한 키토산의 탈아민화는 키토산의 글리케이션에에 적합한 환원 알도스(aldose)와 다당류을 생성하는데 이용될 수 있다. 아질산으로 탈아세틸화된 글루코스아민(glucosaminly) 잔기의 탈아민화는2,5-비수 만노스(anhydro-mannose) 기의 형성과 함께 글리코시딕 결합의 선택적 절단을 초래한다. 키토산 사슬의 특정 부위의 조성에 따라, 비수 육탄당(anhydro hexose)이 단당으로 방출되거나 다당의 환원말단을 차지할 수 있다. 또한, 자유 아세틸글루코스아민의 방출은 키토산 사슬의 일 부분에서도 일어날 수 있다. N-탈아세틸화된 당단백질이나 당지질에 대한 비슷한 처리는 글리케이션된 키토산의 특정 제제를 위해 정의된 화학적 조성과 생물학적 활성의 다당류를 얻기위해서도 이용될 수 있다.

키토산의 글리케이션에 의해 얻어진 다양한 생성물들은 그대로 쓰이거나, 다른 천연 또는 합성 물질과 반응시켜서 쓰일 것이다 (예로 글리케이션된 키토산의 알데하이드를 포함하고 있는 유도체와 콜라젠(collagen)에서와 같이 라이신기가 풍부한 아미노산의 측 사슬, 키토산이나 탈아세틸화된 당복합체에서와 같은 헥소아민기, 천연이나 합성 디아민(diamine)과 폴리아민(polyamine) 등에 존재하는 두 개나 그 이상의 자유 아미노기와의 반응). 이것은 쉬프 염기 형성과 이어지는 재배열, 응축, 탈수 등을 거쳐 가교결합을 생성할 것으로 기대된다. 변형된 글리케이션된 키토산 물질의 안정화는 화학적 환원이나, 재배열, 응축, 탈수를 포함한 경화, 또는 다양한 조건의 온도, 습도, 압력에서 자연적으로나 배양을 통해 이루어질수 있다. 본원에 참고로 인용된 것과 동일한 아마도리 재배열의 화학, 쉬프 염기와 루카르트 월러크(Leukart-Wallach)반응은 머크 색인 아홉째 판 (1976) ONR-55, ONR-80 쪽과 미의회도서관 카드번호 76-27231에 자세히 설명되어 있다. 본 발명에 적용되는 친핵성 첨가반응의 화학은Morrison 와 Boyd의 유기화학, 2판(8번째 인쇄본, 1970)의 제 19장과 미의회도서관 카드번호 66-25695에 자세히 설명되어있고 본원에 참고로 인용된 것과 동일하다.

본원에 더 기술되어 있듯이, 환원당의 특정형태 등과 같은 특정형태와 글리케이션 정도는 놀랍게도 키토산에 레이저를 이용하는 면역치료에 같이 쓰이는 유도체의 사용이나 다른 유도체의 응용을 촉진하는 기대하지 않았던 유리한 용해도, 점도 등의 특성을 키토산에 부여한다. 키토산의 글리케이션은 또한 키토산을 유리하게 더 친수성으로 만들어 그렇지 않을 때 보다 더 많은 물이 중합체에 흡수되고 유지된다. D-갈락토스는 열린사슬형태가 비교적 많이 자연적으로 발생하기 때문에, 키토산의 D-갈락토스 유도체는 지금까지 더 선호되어져 왔다. 글리케이션된 키토산은 분말형, 점성제제형이나, 다른 적당한 형태 등을 포함하는 여러 적당한 제형으로 제조 될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예에 의하면, 키토산은 동일하거나 다른 환원성 당(예로 동일하거나 다른 단당류 및/또는 다당류) 여러 개를 이용하여 비효소적으로 글리케이션될 수 있다. 이런 단당류 당화제의 예들은 더 자연적으로 발생하는D-삼탄당(D-), D-사탄당(D-s), D-오탄당(D-s), D-육탄당(D-s), D-칠탄당(D-s), 그리고D-글루코스(D-glucose ), D-갈락토스(D-galactose ), D-프럭토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), D-알로스(D-allose), D-알트로스(D-altrose), D-이도스(idose), D-탈로스(D-talose), D-푸코스(D-fucose), D-아라비노스(D-arabinose), D-구로스(D-gulose), D-하메로스(D-hammelose), D-릭소오스(D-lyxose), D-라이보스(D-ribose), D-람노스(D-rhamnose), D-쓰레오스(D-threose), D-자이로스(D-xylose), D-프시코스 (D-), D-소르보스(D-), D-(D-), D-글리세르알데하이드(D- ), 디하이스록시아세톤( ), D-에리쓰로스(D-), D-쓰레오스(D-), D-에리쓰루로스(D-), D-만노헵튜로스(D-), D-세도헵튜로스(D-) 등이 있다. 적당한 다당류에는 프럭토-올리고사카라이드(fructo-oligosaccharides, FOS), 갈락토-올리고사카라이드(galacto-oligosaccharides, GOS), 만난-올리고사카라이드(mannan-oligosaccharides, MOS) 등이 있다.

선호되는 점탄성의 특성

기존에 제조되는 키토산 제품은 수용액에서 분산, 현탁, 또는 용해되면 GMP 기준에 따라 생산하기가 매우 어렵고, 투여나 다른 사용의 관점에서 여러 단점을 가지고 있다.

본 발명의 바람직한 실시예는, 종래의 접근 방법이 지닌 단점이 없는 개선된 점탄성 글리케이션된 키토산 제형을 제공함으써 오래 동안 충족되지 못한 향상된 치료 키토산 제품에 대한 요구를 극복한다.

본원에 사용되는 "점탄성" 이라는 용어는 특정 조성물, 제제 또는 제형의 점도를 말한다. 점도는 유체의 전단응력이나 인장응력에 의해 변형되는 저항 척도로 잘 이해 되어진다. 즉, 점성은 흐름에 대한 유체의 내부 저항을 묘사하고 유체의 마찰력 척도로 생각될 수도 있다.

a. GC 제제의 주사 사용성에서 예기치 못한 개선

글리케이션된 키토산(GC)의 주사 사용성(예로 용액이나 현탁액으로)이 점도 및 GC의 유변학적 특성에 자명하지 않게(nonobviously) 종속되어 있음이 놀랍고도 의외적으로 발견 되었다. 이러한 특성들은 차례로 GC의 분자량, 모 키틴의 키토산으로의 중합화 정도, 키토산의 글리케이션 정도 등에 크게 의존한다. 이런 후자의 특성들은 GC분자에 존재하는 치환체(예로 아세틸 및 당류)의 수와 성질에 의해 일어나는 분자내 수소 결합 정도뿐만 아니라, GC의 중합체 사슬의 얽힘 정도를 결정한다. 이 둘다 그로부터 제조된 용액의 점도와 다른 유동학적 특성에 크게 기여한다.

본 발명의 개선된 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는 여러가지 장점을 가지고 있음이 놀랍고도 의외적으로 발견되었다. 예로, (i) 환자의 종양치료를 위한 비독성 제제의 투여, (ii) 기존의 치료에 비해 훨씬 임상환경에서 훨씬 뛰어난 주사 사용성(예로 다른 게이지의 바늘사용을 통해), (iii) 점탄성 제제의 향상된 멸균여과 (iv) 덜 고통스러워, 환자에게 향상된 치료 선택권 등이 있다. 여기서 "주사 사용성'이란 용어는 제형이나 제제(예로 글리케이션된 키토산(GC)으로 이루어진 제형)로 대상에 주사될 때의 용이성을 의미한다.

바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명은 주사가능한 상기 언급된 수용액에 분산, 현탁, 용해된 상기의 글리케이션된 키토산의 무게를 기준으로 약 1퍼센트로 이루어진 점탄성 제제를 제공한다.

바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명은 제제를 바로 비교적 큰 게이지(G)의 주사바늘을 통해 쉽게 주사할 수 있어서 대상의 고통과 불쾌감을 감소시키는 제제을 만들수 있게 하는 점성을 가진 즉각적 용액이나 현탁액을 포함한 글리케이션된 키토산의 제제를 포함한다. 비교적 큰 게이지 바늘의 선호된 예는 다음의 치수를 가진 바늘이다: 약 0.337 mm(23 G)에서 0.210 mm(27 G).

일 실시예에 따르면, 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는 직경이 약 20G에서 22 G 사이이고, 주사바늘 튜브의 유효길이가 약 1,000 mm이거나 이상이여서 약 두, 세 배의 대기압에 주입되었을 때 주사제제의 유입속도가 약 0.05-0.1 ml/초인 주사로 주입된다. 다른 실시예에 따르면, 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는직경이 약 25 G에서 27 G 인 주사바늘을 통한 주사를 통해 주입이 또한 가능하다. 본 발명에 따르면 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는 다른 적합한 게이지의 바늘이나 기구를 통해서도 주입될 수 있다고 생각되어진다.

본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는(예로 용액, 현탁액 등) 비교적 넓은 범위의 농도에서 카테터나 가장 흔히 쓰이는 게이지의 바늘을 통하여 주사가 가능하다.

이런 향상된 점탄성 글리케이션된 키토산 제제(예로 점탄성 글리케이션된 키토산의 점도와 유변학적 특성을 향상시킴으로써)는 또한 기대하지 않게 대상에 대한 제제의 주입용이성(예로 간호사, 의사, 다른 의료 종사자 등에 의한 각각의 제형 주입효율)을 향상시키고, 글리케이션된 키토산의 적합성과 유효성도 또한 향상 될 수 있다.

b. 제조 및 여과에 관한 예기치 못한 개선

본 발명의 향상된 점탄성 글리케이션된 키토산 제제를 사용하면 살균여과가 예기치 못하게 향상된다 것이 놀랍게도 발견되었다. 미국 특허 5,747,475("키토산 유래 생물질")에 기술된 기존의 글리케이션된 키토산 제제는 0.22 um 살균 필터를 통한 살균이 매우 어렵다고 나타나서 상업적 cGMP 제조에 적합지 못하다. 반면에 자명하지 않은 유변학적 특성을 가졌다고 발견된 향상된 점탄성 글리케이션된 키토산은 살균여과, cGMP 제조, 인체 사용 등에 매우 적합하다고 나타났다.

더 나아가, 본 발명의 향상된 점탄성 글리케이션된 키토산 제제를 이용할 때 투석여과(diafiltration) 와 초여과(ultrafiltration)가 예상치 않게 향상되는 것이 놀랍게도 발견되었다. 기존의 글리케이션된 키토산 제제는 투석여과와 초여과가 매우 어려워서, 필터 막힘을 초래하기에 상업적cGMP 제조에 부적합하다. 반면에 향상된 점탄성 글리케이션된 키토산은 투석여과와 초여과에 매우 적합해서 제조과정을 상당히 향상시켰다.

점도 결정에 대한 예시적 방법

화학 분야에서 임의의 수의 적합한 기술은 글리케이션된 키토산 제형의 점도를 확실하고 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다.

점도는 또한 다양한 종류의 기기(예로 점도계나 유량계)로도 확실하게 측정될 수 있다고 이해 된다. 유량계는 점도의 하나의 값으로 정의 될수 없어, 점도계 보다 더 많은 변수가 설정되고 측정되어야 하는 이런 유체에 대하여 사용된다. 유체에 대한 정밀한 온도의 제어는, 특히 단 5 ㅀC의 변화에 의해 점도가 두 배가 되는 윤활제 같은 재료에서 정확한 측정에 필수적이다.

본원의 발명에 따르면, 글리케이션된 키토산 제제의 점도는 당 기술분야에서 알려진 임의의 적당한 방법에 의해서 결정될 수 있다.

예로, 점도는 센티포이즈(centipoise) 단위로 정확하게 측정될 수 있다. 포이즈는 센티미터 그램 초 단위 시스템 (centimeter gram second system of units) 의 역동적인 점도의 단위이다. 1 센티포이즈는 100분의 1 포이즈이고, SI 단위 (1 cP = 10^-2 P = 10^-3 Pa·s)에서는 1 밀리파스칼-초 (mPa·s) 이다. 센티포이즈는 cP로 적당히 단축 되어지지만 다른 약어cps, cp, cPs 등도 일반적으로 볼 수 있다. 센티포이즈를 측정하기 위해 점도계가 사용될 수 있다. 센티포이즈를 결정할 때, 모든 다른 유체는 전형적으로 물의 점도에 교정되어있다.

글리케이션된 키토산 제제의 예시적 점도 결정

용액의 점도에 영향을 미치는 수 많은 요소(특히 분자량보다 중합체의 용액) 가 있다. 글리케이션된 키토산(GC) 의 경우에 GC수용액의 주사용이성이 용액속에서GC의 점도나 유동학적 특성에 매우 의존적이다. 이런 후자의 특성들은 GC분자에 존재하는 치환체(예로 아세틸 및 당류) 의 수와 성질에 의해 일어나는 분자내 수소 결합 정도뿐만 아니라, GC의 중합체 사슬의 얽힘 정도를 결정한다. 이 둘다 그로부터 제조된 용액의 점도에 크게 기여한다.

글리케이션된 키토산 제제의 개선된 점도와 유변학적 특성은 차례로 글리케이션된 키토산의 특별한 물리화학적 특성에 크게 의존한다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 본원에서 사용되는 "물리화학적 특성'이란 용어는 글리케이션된 키토산 분자 구조의 어떤 물리적, 화학적, 물리화학적 특성을 포함하려고 의도 되지만 이에 한정되지 않는다. 본원에 더 기술된 바와같이 이들 몇 가지 물리화학적 특성은 다음과 같다:

(i) 글리케이션된 키토산의 분자량;

(ii) 모키틴의 키토산으로의 중합 정도;

(iii) 모키틴의 탈아세틸화 정도;

(iv) 키토산의 글리케이션 정도

도 2는 분자량이 약 250 kDa, 모키틴의 탈아세틸화 정도가 약 80%, 키토산의 자유 아미노기의 글리케이션 정도가 약 12.5%인, 본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산의 한 예를 보여준다.

도 2. 모키틴의 탈아세틸화 정도가 약 80%, 키토산의 총 가능한 탈아세틸화 아미노기의 글리케이션 정도가 약 12.5%인, 본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산의 한 예시 구조.

(i) 글리케이션된 키토산의 분자량

화학 분야에서 임의의 수의 적합한 기술은 글리케이션된 키토산의 분자량을 확실하고 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다.

글리케이션된 키토산의 제제는, 분자량이 약 1500 kDa 작은 글리케이션된 키토산으로 이루어진 주사 가능한 제형으로 제제되는 것이 선호되어진다. 선호된 점탄성 글리케이션된 키토산 제제의 예는 분자량이 약 50 kDa에서 1500 kDa인 글리케이션된 키토산으로 이루어진다.

특정 실시예에서 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는 분자량이 약100 kDa에서 1000 kDa인, 더욱 바람직하게는100 kDa에서 300 kDa인, 글리케이션된 키토산으로 이루어진다. 분자량을 정확하게 결정하기위해 다양한 기술이 사용될 수 있다.

본 발명은 수용성이거나 수용액에 분산될 수 있는 키토산 유도체를 포함하는 치토란 유래 조성믈을 포함한다. 본 발명에 따르면, 놀라웁게도, 특정한 실시에에서는, 분자량(MW) 증가에 따라, 글리케이션된 키토산(GC)을 용해하는데 더 많은 물이 필요하다는 것도 발견하였다. 한편으로, 이것은, (추가적인 물이 용액에 추가되지 않은 것으로 가정하면) 더 적은 양의 물이 "자유롭다는 것(free)", 즉 GC에 수소 결합되지 않은 것을 의미하는데, 이것은 그 자체가 더 높은 점도에 기여한다. 이하의 실시예 3에 나타낸 것과 같이, 이 결과는 예기치 않게도 분자의 크기 증가에 의해 주어지는 점도 증가에 부가되어, (농도가 보상될 때) 점도와 MW 사이에 선형 관계가 아니라, 지수적인(또는 이와 유사한 것) 관계를 제공하는 것으로 밝혀졌다.

(ii) 모키틴의 키토산으로의 중합 정도 (DP)

모키틴의 키토산으로의 중합 정도(DP)는 화학분야에 알려진 여러 적당한 방법이나 기술로 확실하고 정확하게 결정될 수 있다.

한 방법에서는, 중합 정도(DP)가 글루코스아민 연결고리의 분자량을 키토산의 분자량으로 나누어 결정되는 것이 선호된다.

(iii) 모키틴의 탈아세틸화 정도

또 다른 물리화학적 특성은 모키틴의 탈아세틸화 정도이다. 화학분야에서 임의의 수의 적합한 기술은 모키틴의 탈아세틸화 정도를 확실하고 정확하게 결정할 수 있다.

NMR은 키틴이나 키토산의 탈아세틸화 정도를 측정하는데 사용되는 하나의 기술이다.

(iv) 키토산의 글리케이션 정도

화학분야에서 임의의 수의 적합한 기술은 키토산의 글리케이션 정도를 확실하고 정확하게 결정할 수 있다.

NMR은 키토산 중합체에 단당류 및/또는 다당류의 결합을 검출하고 측정하는 데 사용될 수 있는 하나의 기술이다.

C/N 원소 연소 분석은 글리케이션된 키토산 대 모키토산의 C/N비을 비교함으로써 글리케이션된 키토산의 글리케이션 정도 퍼센트를 결정하는데 사용되는 또 다른 하나의 기술이다.

HPLC와 결합한 효소적 분해는 글리케이션의 퍼센트를 결정하는데 사용될 수 있는 또 다른 기술이다.

다른 적당한 분석 방법과 계측도 샘플에서 동시에 여러 요소를 검출, 측정, 동정하기(예로, 샘플에서 동시에 글리케이션된 키토산과 안된 키토산의 검출, 측정, 동정 등을) 위하여 사용될 수 있다고 알려져있다.

닌히드린(ninhydrin) 반응 같은 남아있는 자유 아미노기에 결합한 화학물질의 발색측정법(colorimetric measurment)은 글리케이션 정도를 평가하는데 사용될 수 있다.

그리하여 선호적인 분자량, 모키틴의 키토산으로의 중합 정도, 모키틴의 탈아세틸화 정도, 비교적 넓은 범위의 농도에서 카테터나 가장 흔히 쓰이는 게이지의 바늘을 통하여 주사가 가능한 글리케이션된 키토산 용액의 개선된 제제를 가능하게 하는 글리케이션 정도 등을 가진 글리케이션된 키토산이 발견되었다.

글리케이션된 키토산를 제제하는데 선호되는 방법

본 발명의 또 다른 실시예는 글리케이션된 키토산 제형의 제제를 위한 방법에 관한 것이다. 글리케이션된 키토산는 바림직하게는 산성화제의 존재하에서, 약 0.1%에서 30% 정도(대부분 바람직하게 2%이상)까지 키토산 중합체의 아미노기가 글리케이션이 달성되는 정도로 당의 카르보닐기와 키토산의 일차 아미노기 사이에 쉬프염기의 생성(본원에서 아미노기의 글리케이션으로도 설명된)을 위한 충분한 시간을 가지고, 키토산을 단당 및/또는 다당과 반응시켜 얻어지는 것을 선호한다. 이어서 바람직하게는 쉬프염기와 이차 아민이나 알콜기에 재배열된 유도체(아마도리 생성물)사이의 환원에 의한 안정화를 따른다. 닌히드린 반응 등을 통해 남아 있는 자유 아미노기의 화학적 측정은 글리케이션 정도를 분석하기 위하여 사용될 수 있고, NMR 트레이싱(tracing)은 단당 및/또는 다당의 키토산으로의 결합을 확인하는데 사용될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 글리케이션된 키토산의 제조과정중 원하는 결과를 개선하기 위한 필요에 따라 조건이 조절 될 수 있다. 예로, 본 발명에 따르면 글리케이션된 키토산의 제조 개선이 pH 조건을 조절함으로써 달성 될 수 있음이, 예시 4에 기술 된 것과 같이 예상치 못하게 발견되었다.

본 발명에 사용된 글리케이션된 키토산의 제제의 한 예에 따르면, 약 3 그램의 환원 단당류(예로, 글루코스, 갈락토스, 리보스)나 동일양의 환원 다당류가 부드러운 자기교반하에 삼각 플라스크안에서100 ml 의 증류수에 용해 되어진다. 여기에 약 1 그램의 키토산이 첨가되고, 원하는 점탄성 특성과 순도 특성을 가진 글리케이션된 키토산의 제제를 생산하기 위해 적절한 과정 단계가 수행된다.

산업적 규모의 키토산 생산을 위한 한 예시적 방법은 다음과 같은 네 단계를 포함한다: 탈회(demineralization, DM), 탈단백질(deproteinization, DP), 탈색(DC), 탈아세틸화 (DA). 예로 갑각류 껍질로부터 키틴의 추출은 알칼리-산 처리에 의해 수행된다. 샘플은 알칼리 제형으로 처리되어 탈단백질화, 아세톤 같은 유기용매로 탈회된 다음 염소산 나트륨으로 표백된다. 키틴의 탈아세틸화는 수산화 나트륨 같은 제형을 이용하여 수행된다. 키토산의 중합도는 해중합(depolymerization)에 의해 조절된다; 가장 간편한 절차는 (1) 중수(deuterated water)에서 아질산의 분해. 이 반응은 GlcN에 관하여 선택적, 화학양론 적이고, 빠르고, 쉽게 제어된다, (2) 산 가수분해에 의한 해중합, 또는 (3) 상업적 제제를 이용한 효소적 분해 (Pectinex Ultra Spl). 효소적 방법은 더 많은 양의 완전히 탈아세틸화된 키토올리고머(chitooligomer)를 가진 더 작은 단편을 생산한다.

중합 글리케이션된 아미노 당류

본원에 기술된 바와 같이, 키토산(부분적으로 탈아셀틸화된 키틴)은 키틴(β 1→4 글리코시딕 결합에 의해 연결된N-아세틸글루코스아민 유닛으로 이루어진 선형 단일 중합체 )의 유도체이다. 따라서 키토산 유래 조성물은 부분적으로 탈아세틸화된 단일 중합체로 이루져있다. 여기서 부분적으로 탈아세틸화된 키틴은 환원 단당이나 다당류의 카르보닐 그룹에 결합되는 얼마간의 자유 아미노기를 가지고 있고, 이민 결합(Schiff Base)이나 관련된 생성물(아마도리 재배열)을 생성하면서 물 한 분자를 방출한다.

키틴과 키토산은 글루코스아민의 중합체이므로, 본 발명은 비 효소적으로 글리케이션된 글루코스아민(예로, 글리케이션된 글루코스아민 단량체나 글리케이션된 글루코스아민 단위)도 고려한다. 즉, 본 발명은 아미노-당의 비효소적 글리케이션도 일반적으로 고려한다.

가령 한 예는N-치환체가 글루코스인 글리케이션된 글루코스아민이다. 글루코스아민 단량체의 글리케이션은 적어도 일 퍼센트의 글루코스아민 단량체가 초기에 탈아세틸화된 후에 수행되는 것이 선호된다.

더욱이, 본 발명은 다음과 같은 점도 고려한다 (1) 글리케이션된 글루코스아민 단위의 중합체(중합 글리케이션된 아미노-당) (2) 글리케이션되거나 안된 글루코스아민의 배합 중합체 (3) 다음에 있는 글리케이션되거나 안된 글루코스아민의 배합 중합체:

i) 탈아세틸화가 안된 글루코스아민의 퍼센트는약 1%에서 30%이다.;

(ii) 중합도(탈아세틸화된, 탈아세틸화 안된, 글리케이션된, 글리케이션 안된 단위의 다양한 배합에서)는 약 xn= 300에서 xn=8000 가장 선호적으로 약 xn=1500이다;

(iii) 탈아세틸 중합화된 글루코스아민에서 자유 아미노기의 글리케이션 퍼센트는 약 0.1%에서 30%이다.

본 발명은 글리케이션된 키토산의 사용과 동일하거나 유사한 중합 글리케이션된 글루코스아민의 사용도 고려한다. 예로, 여기에는 면역항원 증강제 특성과, 맥락에서 레이저를 이용한 면역요법(LIT)같은 생체(in situ) 암 백신(inCVAX)의 사용을 포함한다.

예시 제형과 응용

다양한 종류의 약제학적으로 허용가능한 본 발명에 따라 사용될 수 있는 제형, 제제의 예는 점탄성 글리케이션된 키토산 제제의 주사 용이성을 위한 용액, 현탁액, 다른 종류의 액체나 반액체 제제를 포함한다. 예로 약제학적으로 허용가능한 제형, 제제는 분산, 현탁, 수성 제형에 상당히 용해된 글리케이션된 키토산을 포함한다. "상당히 용해"란 용어의 사용에 의해, 어떤 예에서 제형이나 제제는 하나나 일정 퍼센트까지 그 이상의 비수성 성분이나 약제학적으로 허용된 첨가제(excipient)를 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 점탄성 제제는 pH가 약 5.0에서 7사이를 가진 수용액으로 선호적으로 제형된다.

점탄성 제제는 기본적으로 글리케이션된 키토산으로 이루어진 완충 생리 식염수 용액을 포함하는 수용액으로 제형될 수 있다.

점탄성 제제는 기본적으로 글리케이션된 키토산 중합체로 이루어져 제형될 수도 있다. 여기서 글리케이션된 키토산 중합체는 0.1에서 30퍼센트의 글리케이션(그렇지 않으면 자유 아미노기인)을 보유한다.

다른 실시예에서, 점탄성 제제는 기본적으로 글리케이션된 키토산(GC) 중합체로 제형될 수 있다. 여기서 글리케이션된 키토산 중합체는 약 2퍼센트의 글리케이션(그렇지 않으면 자유 아미노기인)을 보유한다.

다른 실시예에서, 점탄성 제제는 기본적으로 글리케이션된 키토산 중합체로 제형될 수 있다. 여기서 글리케이션된 키토산 중합체는 50,000에서 1,500,000 Daltons의 분자량을 가지고 있다.

또 다른 예는, 가령 25도에서 측정되었을 때 약 (1)에서 (100)까지의 센티스토크(centistoke)의 점도을 가진 수용액에 분산되어지고 글리케이션된 키토산 중합체가 약 (1) 퍼센트 무게를 이루는 점탄성 GC제제를 포함한다.

또 다른 예는, 글리케이션된 키토산이 자유 아미노기의 약 0.1에서 30 퍼센트의 글리케이션으로 약 1퍼센트의 무게를 이루는 수용액을 포함한다. 여기서 수용액은 약 (1)에서 (100)까지의 센티스트로크의 점도을 가지고 있다.

또 다른 실시예에서, 점탄성 제제는 수용액에서 글리케이션된 키토산 중합체의 무게가 약 1퍼센트나 그 이상으로 이루어진, 기본적으로 글리케이션된 키토산 중합체로 이루어져 제형될 수 있다. 여기서 글리케이션된 키토산 중합체는 자유 아미노기의 약 (2)퍼센트의 글리케이션를 보유하고, 수용액은 대상의 주사 용이성과 주입이 용이하게 적정한 점도를 가지고 있다.

또 다른 실시예에서, 점탄성 제제는 추가적으로 수용액에서 섞일수 있는 하나나 그 이상의 다른 점탄성 물질을 함유하는, 기본적으로 글리케이션된 키토산 중합체로 이루어져 제형될 수 있다. 적당한 점탄성 물질의 예로는 히알루론산(hyaluronic acid, 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate), 카복시메실셀루로스(carboxymethylcellulose) 등이 있지만 여기에 한정되지 않는다.

점탄성 제제는 자유아미노기에 결합한 단당류로 이루어진 글리케이션된 키토산 중합체를 포함한다. 글리케이션된 키토산 중합체는 쉬프 염, 아마도리 생성물, 이들의 혼합물 등과 같은 적정한 형태를 가질 수 있다. 글리케이션된 키토산 중합체는 환원된 쉬프 염(이차 아민)이나 환원된 아마도리 생성물(알콜) 또는 이들의 혼합물과 같은 형태일 수도 있다.

점탄성 제제는 글리케이션된 키토산 중합체가 일정 수의 화학적으로 변형된 단당류나 다당류 치환체를 보유하고있게도 제형될 수 있다. 일 실시예로, 갈락토스로 이루어진 단당.

본 발명의 제형과 제제는 또한 선호적으로 생리적으로 호환 가능한 수송체상의 글리케이션된 키토산을 포함한다. 여기서 "생리적으로 호환 가능한" 이란 신체 조직과 접촉할 때 유해하지 않은 물질을 설명하기위해 사용된다. 이 문맥에서 그 용어는 관심있는 생리적 환경과 거의 등장성을 가진 수성 제형(예로, 수용액)을 포함하고 여기에 한정되지는 않는다. 비 등장성 제형(예로, 수용액)은 탈수제 등과 같이 종종 임상적으로도 사용될 수도 있다. 본 발명 용액의 추가적인 요소는NaCl, KCl, CaCl₂,MgCl₂,Na기반 완충제 등 각종 염을 포함한다.

상기 및 다른 목적은 예기치 못하고 놀라운 유리한 특징을 부여하는 특정한 물리화학적 특성을 가진 글리케이션된 키토산 제제를 설명하는 특정의 바람직한 실시예에서 본 발명에 의해 실현된다.

본 발명은 예로, 본원에서 기술된 것처럼 암에 대한 레이저를 이용한 면역요법같은 생체 자가 암 백신과 연계해서 면역항원 증강제로 놀랍고 예기치 못한 특성을 가진 점탄성 글리케이션된 키토산 제제의 광범위한 사용을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예는 주사가능한 점탄성 제제로 구성된 면역항원 증강제를 제공한다. 면역항원 증강제나 면역조절제로서 치료적 사용을 포함한 다른 치료적 사용을 위해 개선된 점탄성 글리케이션된 키토산 제제를 제공하는 것은 본 발명의 또 다른 목적이다.

본 발명은 주사같은 점탄성 글리케이션된 키토산 면역항원 증강제 제형의 다양한 주입 경로도 포괄한다. 선호된 접근법에서, 면역항원 증강제는 종양 덩어리나 주변으로 주사를 위한 제형으로 선호적으로 제제된다. 그러나 다른 방법도 종양 부위에 면역항원 증강제를 국부전달(localizing)하기에 충분함은 인식되어야 한다. 그런 대안 전달 방법은 종양 부위에 전달이 향상되도록 면역항원 증강제의 조직특이 항체나 조직특이 항원과 결합이다. 전달 메커니즘이 종양에 면역항원 증강제의 충분한 농도를 보장하는 한, 면역항원 증강제를 종양 부위에 위치 전달하기 위해 어떤 하나의 방법이나, 다양한 방법의 조합은 받아 들여진다.

특정 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 본원에 더 상세히 기술된 레이저를 이용한 면역요법, 광역학적 암 치료 (phododynamic cancer therapy, PDT) 및/또는 다른 면역치료 방법 등과 같은, 생체 자가 암 백신(inCVAX)과 연계하여 사용되는 점탄성 글리케이션된 키토산으로 된 다양한 약제학적 제형을 제공한다. 적당한 점도을 가져 사용시 주사주입이나, inCVAX, PDT및/또는 종양의 면역치료 방법 등과 같은 적용법에서 면역항원 증강제로써 다른 제형으로 사용이 용이한 글리케이션된 키토산 제제를 사용하는 것이 바람직하다는 것은 관찰되어져왔다. 이러한 응용법은 일반적으로 환자의 신체에 점탄성 글리케이션된 키토산 제형의 주사를 포함한다. 본원에서 "면역항원 증강제"라는 용어는 항체에 반응하는 면역시스템를 향상시키는 어떤 분자, 조성물, 물질을 의미하며, 예로 글리케이션된 키토산는 종양 항원에 반응하는 면역시스템를 향상시키는 작용을 한다.

면역항원 증강제조성물은 더 나아가 글리케이션된 키토산에 접합된 종양 특이성 항체를 포함할 수 있다. 면역항원 증강제 조성물은 글리케이션된 키토산에 접합된 종양 특이성 항원을 포함할 수도 있다. 글리케이션된 키토산은 더 나아가 카보닐 반응 그룹을 포함한다.

하나의 바람직한 실시예에 따르면 , 본 발명은 점탄성 글리케이션된 키토산의 현탁액 또는 용액을 포함하는 면역항원 증강제 제형을 제공한다. 점탄성 글리케이션된 키토산은 이 바람직한 실시예에서 발색단(chromophore) 사용없이 종양의 치료에서 빛 에너지가 종양에 직접 전달된는 광열(photothermal) 치료와 연계해서 사용된다. 만약 종양이 피부암같이 조직 표면에서 접근이 가능하거나 수술에 의해 노출되면, 빛 에너지는 국소 전달 될 수 있다. 유방암 같이 종양이 피부조직 아래 존재하거나 수술을 통해 노출이 안되었을 경우에, 빛 에너지는 광섬유를 이용하여서도 종양에 전달 될 수 있다.

또 다른 실시예에 따르고 여기에 더 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 면역항원 증강제 제제는 더 나아가 적당한 발색단을 포함할 수 있다. 적절한 발색단의 선택은 주로 방사선의 허용 가능한 레이저 파장의 배위(coordination) 문제이다. 사용되는 방사선의 파장은 물론, 발색단의 광특성(photoproperties) (즉, 흡수 피크)에 상보되어야 한다. 다른 발색단의 선택 기준은 열 에너지를 생성하거나, 일중항 산소(singlet oxygem)나 다른 활성 분자를 생성하기 위하거나, 시스 플라티닌(cis-platinin)같이 그 자체적으로 유해하거나 하는 능력을 포함한다. 본 발명에서, 선호된 방사선 파장은 805.+/-.10nm이다. 원하는 발색단은 조직이 상대적으로 투명한 적색과 원적외선 스펙트럼 영역에서 강한 흡수력을 가지고 있다. 이 파장의 또 다른 장점은 UV여기 증감제(excited sensitizer) 사용으로 생기는 잠재적 돌연변이 효과를 피할 수 있다는 것이다. 그럼에도, 150에서 2000nm의 파장은 각각의 경우에 효과적임이 증명될 수 있다. 선호된 발색단은 인도사이안인 그린(indocyanine green)이다. 그러나 광증감이나 광세포독성이 의존하는 원하는 광물리적, 광화학적 특성에 기초하여 선택된 다른 발색단이 사용될 수도 있다. 다른 대체 발색단의 예로는 단일벽 탄소 나노 튜브(SWNT), buckminsterfullerenes (C₆₀),인도사이아닌 그린, 메틸렌 블루, DHE (polyhaematoporphrin ester/ether), mm-THPP (tetra(meta-hydroxyphenyl)porphyrin), AlPcS₄(aluminiumphthalocyaninetetrasulphonate),ZnET2(zincaetio-purpurin),Bchla(bacterio-chlorophyll.alpha.)등이 있고 여기에 한정되지 않는다.

일 실시예에서, 면역항원 증강제 조성물은 용액이나 현탁액으로 제형된다. 용액이나 현탁액은 예로 무게로 약0.25% 인 발색단과 무게로 약 1%인 글리케이션된 키토산을 포함할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 직렬적(tandem) 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절(conditioning)에서 사용을 위해 면역항원 증강제로 이루어진 조성물을 제공한다. 여기서 면역항원 증강제는 종양 특이 항원에 접합되어 있고, 면역항원 증강제는 글리케이션된 키토산이다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 직렬적 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절에서 사용을 위해 발색단과 면역항원 증강제의 혼합으로 이루어진 조성물을 제공한다. 여기서 발색단과 면역항원 증강제는 종양 특이 항원에 접합되어 있고, 면역항원 증강제는 글리케이션된 키토산이다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 직렬적 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절에서 사용을 위해 면역항원 증강제로 이루어진 조성물을 제공한다. 여기서 면역항원 증강제는 종양 특이 항체에 접합되어 있고, 면역항원 증강제는 글리케이션된 키토산이다. 어떤 경우에는면역항원 증강제가 본질적으로 글리케이션된 키토산으로 이루어진다. 글리케이션된 키토산은 더 나아가 카르보닐 반응 그룹을 포함한다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 직렬적 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절에서 사용을 위해 발색단과 면역항원 증강제의 혼합으로 이루어진 조성물을 제공한다. 여기서 발색단과 면역항원 증강제는 종양 특이 항체에 접합되어 있고, 면역항원 증강제는 글리케이션된 키토산이다. 어떤 경우에는 면역항원 증강제는 본질적으로 글리케이션된 키토산으로 이루어진다. 글리케이션된 키토산은 더 나아가 카르보닐 반응 그룹을 포함한다.

그리하여 본 발명은 직렬적 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절을 위한, 어떤 경우에는 발색단과 면역항원 증강제의 조합이나 혼합을 포함할 수 있는 주사용이성 제형을 제공한다. 여기서 면역항원 증강제는 글리케이션된 키토산이다.

면역항원 증강제로 이루어진 조성물은 더 나아가 직렬적 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절에서 사용을 위해 제제 될 수 있다. 여기서 면역항원 증강제는 종양 특이 항원에 접합되어 있고, 면역항원 증강제는 분자량이 약 100 kDa에서1000 kDa인 (더욱 바람직하게는 약 100 kDa에서300 kDa인) 점탄성 글리케이션된 키토산이다.

*발색단과 면역항원 증강제의 혼합으로 이루어진 조성물은 또한 직렬적 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절에서 사용을 위해 제제될 수 있다. 여기서 발색단과 면역항원 증강제는 종양 특이 항원에 접합되어 있고, 면역항원 증강제는 분자량이 약 100 kDa에서1000 kDa인 (더욱 바람직하게는 약 100 kDa에서300 kDa인) 점탄성 글리케이션된 키토산이다.

더 나아가, 면역항원 증강제로 이루어진 주사제는 직렬적 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절에서 사용을 위해 제제될 수 있다. 여기서 면역항원 증강제는 분자량이 약 100 kDa에서1000 kDa인 (더욱 바람직하게는 약 100 kDa에서300 kDa인) 점탄성 글리케이션된 키토산이다.

발색단과 면역항원 증강제의 혼합으로 이루어진 주사제는 직렬적 광물리, 면역학적 치료를 위한 종양 조절에서 사용을 위해 제제 될 수 있다. 여기서 면역항원 증강제는 분자량이 약 100 kDa에서1000 kDa인 (더욱 바람직하게는 약 100 kDa에서300 kDa인) 점탄성 글리케이션된 키토산이다.

일 실시예에서, 본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산 혼합물은 신규 암 치료법에 면역항원 증강제로 사용된다. 광열 및 면역학적 요법은 발색단 없이 종양에 직접 방사선조사를 하고, 이어서 키토산 유래의 면역항원 증강제를 조사된 종양이나 그 부위에 도입함으로써 결합된다. 종양세포의 파괴, 종양 항체에 반응하여 방출되는세포성, 체액성 면역반응을 야기하기에 충분한 조도(irradiance)를 가진 다음의 레이저 사용은 면역항원 증강제 요소에 의해 자극(향상)된다.

또 다른 예에서는, 광역학 및 면연학적 요법이 발색단과 키토산에서 유래된 면역항원 증강제(면역조절제나 면역 강화제로도 불리는)를 둘 다 종양으로 도입함로써 결합된다. 종양세포의 파괴 야기하기에 충분한 조도(irradiance)를 가진 레이저 사용시, 방출되는 종양 항체에 반응하여 세포성과 체액성 면역반응이 면역항원 증강제 요소에 의해 자극(향상)된다.

발색단과 면역항원 증강제는 종양 덩어리의 중심으로 주사하기 위한 용액으로 결합될 수 있고, 각기 따로 종양 덩어리로 주사될 수 있다. 그러나 다른 방법들도 충분히 발색단과 면역항원 증강제를 종양위치에 전달 하기에 충분하다는 것을 인식해야 한다. 이런 대체 전달 수단의 하나는 발색단, 면역항원 증강제, 또는 둘다 조직 특이성 항체에 결합하는 것이다. 그리하여 종양 위치에 전달이 향상된다. 전달 메커니즘이 종양에 충분한 농도을 보장하는 한, 암의 위치에 발색단과 면역항원 증강제를 위치전달 하는 어떤 한 방법이나 다양한 방법의 조합은 받아 들여질 수 있다.

또 다른 실시예에 따르면, 사람이나 다른 동물 숙주에서 종양을 치료하는 방법은: (a) 면역항원 증강제 선택, 여기서 면역항원 증강제는 점탄성 글리케이션된 키토산으로 이루어져 있다; (b) 조절된 종양에 방사선 조사, 여기서 조절된 종양의 종양 세포 파괴는 단편화된 종양 조직과 세포 분자를 생성함으로써 유도된다; (c) 면역항원 증강제의 종양과 그 주변으로의 도입, 이 것은 가령 종양 항체같은 단편화된 종양 조직과 세포 분자를 처리하기 위해 숙주의 자가 면역 방어 시스템을 자극하고 종양 세포의 증식을 막는 면역력를 만든다.

또 다른 실시예에 따르면, 사람이나 다른 동물 숙주에서 종양을 치료하는 방법은: (a) 발색단과 면역항원 증강제의 선택, 여기서 면역항원 증강제는 점탄성 글리케이션된 키토산으로 이루어져 있다; (b) 조절된 종양를 얻기 위해 발색단과 면역항원 증강제의 종양으로의 도입; (c) 조절된 종양에 방사선 조사, 여기서 조절된 종양의 종양 세포 파괴는 종양 세포의 증식을 막는 숙주의 자가 면역 방어 시스템을 자극하는 면역항원 증강제의 존재하에 단편화된 종양 조직과 세포 분자를 생성함으로써 유도된다.

또 다른 실시예에서는, 종양을 가지고 있는 숙주에서 종양 특이성 항체을 생산하는 방법은 종양 세포 파괴와 단편화된 종양 조직과 세포 분자 생성을 유도할 수 있는 충분한 정도까지의 가시광선, 근적외선, 적외선 범위의 파장 레이저로 종양을 주사하는 것을 포함한다. 단편화된 종양 조직, 세포 분자와 반응하고 이를 처리하기 위한 숙주의 면역 시스템 자극을 위해 종양이나 그 주변으로의 면역항원 증강제의 도입이 따라온다.

또 다른 실시예에서는, 종양을 가지고 있는 숙주에서 종양 특이성 항체을 생산하는 방법은 조절된 종양을 얻기 위해 동시에 발색단과 면역항원 증강제를 종양내 주사를 통하여 주입하는 것을 포함한다. 발색단은 적외선이나 근적외선 파장 범위에서 열 에너지를 생산하기에 적당해야 한다; 종양 세포 파괴 유도, 단편 종양조직과 세포 분자을 생성시키는 광열 반응을 생산하기 위해 발색단을 활성화 시키기에 충분한 정도까지의 적외선이나 근적외선 파장 범위에서의 레이저로 발색단을 활성화시킨다.

종양을 가진 숙주에서 광물리적으로 종양을 파괴하고 동시에 생체 자가백신을 생성하는 예시적 방법은 포함한다.; (a) 면역항원 증강제 선택; (b) 종양 세포 파괴와 단편화된 종양 조직과 세포 분자 생성을 유도할 수 있는 광열 반응을 생산하기에 충분한 힘과 기간에 가시광선, 근적외선, 적외선 범위의 파장을 가지고 조사; (c) 종양내 주사를 통한 종양으로의 면역항원 증강제 주입을 통한 생체 백신 형성. 여기서 생체 백신은 단편화된 조직, 세포 분자, 면역항원 증강제 등의 아말감으로 이루어져 있다; (d) 숙주 내에서 항암 반응을 체계적으로 유도하기위한 백신을 국부적으로 줌으로써 종양적 세포의 증식을 억제하는 자가 면역 방역 시스템의 자극.

종양을 가진 숙주에서 광물리적으로 종양을 파괴하고 동시에 생체 자가백신을 생성하는 또 다른 예시적 방법은 다음을 포함한다.; (a) 발색단과 면역항원 증강제 선택, 발색단은 근적외선이나 적외선 파장 범위 내에서 활성화되었을 때 열 에너지를 생성하기에 적합한; (b) 종양내 주사를 통해 종양으로 발색단의 주입; (c) 종양 세포 파괴와 단편화된 종양 조직과 세포 분자 생성을 유도할 수 있는, 발색단 활성화을 통한 광열 반응을 생산하기에 충분한 힘과 기간에 가시광선, 근적외선, 적외선 범위의 파장을 가지고 조사; (d) 종양내 주사를 통한 종양으로의 면역항원 증강제 주입을 통한 생체 백신 형성. 여기서 생체 백신은 단편화된 조직, 세포 분자, 면역항원 증강제 등의 아말감으로 이루어져 있다; (e) 숙주 내에서 항암 반응을 체계적으로 유도하기위한 백신을 국부적으로 제공함으로써 종양적 세포의 증식을 억제하는 자가 면역 방역 시스템의 자극.

종양을 가진 숙주에서 광물리적으로 종양을 파괴하고 동시에 생체 자가백신을 생성하는 또 다른 예시적 방법은 다음을 포함한다; (a) 발색단과 면역항원 증강제 선택, 여기서 발색단은 근적외선이나 적외선 파장 범위 내에서 활성화되었을 때 열 에너지를 생성하기에 적합함; (b) 조절된 종양을 얻기 위해 종양내 주사를 통해 발색단과 면역항원 증강제을 동시에 또는 각각 주입; (c) 종양 세포 파괴와 단편화된 종양 조직과 세포 분자 생성을 유도할 수 있는, 발색단 활성화을 통한 광열 반응을 생산하기에 충분한 힘과 기간에 근적외선, 적외선 범위의 파장을 가지고 조절된 종양에 레이저를 조사함으로써 생체 백신을 생성. 여기서 생체 백신은 단편화된 조직, 세포 분자, 면역항원 증강제 등의 아말감으로 이루어짐; (d) 백신을 국부적으로 제공하고 백신이 숙주내에서 체계적으로 분산되게 함으로써 종양 세포 증식을 억제하는 자가면역방어 시스템을 자극.

본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 방법은 더 나아가 종양 특이성 항체에 면역항원 증강제를 접합한 것과 이에 따라 접합체 형성과 숙주로의 접합체 주입을 포함한다. 대안 적으로, 방법은 다 나아가 종양 특이성 항원에 면역항원 증강제를 접합한 것과 이에 따라 접합체 형성과 숙주로의 접합체 주입을 포함한다. 예로 인도시아인 그린, DHE, m-THPP, AlPcS₄,ZnET2,Bchla등의 임의의 수의 적당한 발색단이 쓰일 수 있다.

더 나아가, 방법은 종양 특이적 항체에 발색단과 면역항원 증강제의 혼합물을 접합하는 것과 이에 따라 접합체 형성과 숙주로의 접합체 주입을 포함한다. 대안 적으로, 방법은 다 나아가 종양 특이성 항체에 발색단과 면역항원 증강제를 접합한 것과 이에 따라 접합체 형성과 숙주로의 접합체 주입을 포함한다. 예로 인도시아인 그린, DHE, m-THPP, AlPcS₄,ZnET2,Bchla등의 임의의 수의 적당한 발색단이 쓰일 수 있다.

점탄성 글리케이션된 키토산(GC) 제제를 포함한 본 발명의 제제와 제형은 광역학적 요법(PDT)과 함께도 사용될 수 있다. 감광(photosensitizing) 화합물은 빛에 노출 되었을 때 광화학 반응를 보인다. 광역학적 요법(PDT)은 종양 괴사를 일으키기 위해 이런 감광(photosensitizing) 화합물과 레이저를 이용한다. PDT에 의한 고형 종양의 치료는 일반적으로 종양 국부적 감광 화합물의 체계적 주입과 뒤이어 레이저에 의한 활성화를 포함한다. 적절한 파장의 빛을 흡수하면, 증감제는 안정된 원자 구조에서 흥분상태로 변화된다. 독성 일중항 산소를 생성하는 치료된 조직내에서, 세포 독성과 긍극적으로 종양 파괴는 증감제와 산소 분자사이의 상호작용에 의해 매개된다.

빛의 전달과 용량 변수를 포함하며 PDT, 생물 의학적 레이저, 감광 화합물 등에 관한 두 개의 좋은 참고 문헌이 있다. 감광 화합물: 이들의 화학, 생물, 임상적 사용, 1989년에 인쇄, John Wiley and Sons Ltd., Chichester, U.K., ISBN 0 471 92308 7, 과 광역학적 요법과 생물 의학적 레이저: Proceedings of the International Conference on Photodynamic Therapy and Medical Laser Applications, Milan, 1992년 7월 24-27일 인쇄, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, The Netherlands, ISBN 0 444 81430 2, 등이 있고 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.

PDT에 관련된 미국의 특허는Levy 등의U.S. Pat. Nos. 5,095,030 과 5,283,225; Pandey 등의 U.S.Pat. No. 5,314,905.; Allison 등의U.S. Pat. No. 5,214,036; Kopecek 등의 U.S. Pat. No. 5,258,453 가 있고 본원에 모두 참고문헌으로 포함되어 있다. Levy의 특허는 수용체 특이성 리간드(ligand)나 항체, 항체의 면역 특이성 부위 등의 종양 특이성 항체에 접합되어 670-780 nm사이의 파장에서 영향을 받는 감광제의 사용을 공시한다. Pandey의 특허는표준 광역학적 요법에서의 사용을 위한 파이로피오포비드(pyropheophorbide) 화합물에 대한 것이다. 목표로 하는 종양 세포에 대한 포르피린(porphyrin) 화합물의 특이성을 증가시키기 위해서 그린 포르피린이 지질화합물에 접합되어 있다는 점에서, Allison의 특허는Levy의 특허와 비슷하다. Kopecek의 특허도 암 조직을 치료하기 위한 조성물을 공시한다. 이 조성물은 공중합(copolymeric) 수송체에 붙여진 항암제와 광활성 약물 등 두 개의 약물로 이루어져 있다. 조성물은 피노사이토시스(pinocytosis)에 의해 표적 세포에 들어간다. 항암 약물은 표적 세포가 침략된 후에 작용한다. 일정기간 동안 광원이 감광 치환체를 활성화하기 위해 사용된다.

암 면역요법에 대한 더 많은 응용법

점탄성 글리케이션된 키토산(GC) 제제를 포함한 본 발명의 제제와 제형은 면역항원 증강제 등으로 암 면역요법의 맥락에서 사용될 수 있다.

면역시스템의 주요 기능은 "자기"개념을 발달시키고 "비자기"를 제거하는 것이다. 매일 마주치는 미생물이 주요 비자기의 실체이지만, 면역시스템은 종양과 이식을 제거하는데도 작용한다.

면역의 여러 가지 유형이 있다. 비특이적, 선천성 면역은 이 전의 주사나 백신으로 면역화(증감 또는 알레그기화)되지 않은 종(species)에서 나타나는 타고난 저항성을 의미한다. 이의 주요 세포 요소는 주요 기능이 침입하는 미생물을 섭취하고 분해하는 식세포(phagocytic) 시스템이다. 식세포는 조직에서 중성 백혈구(neutrophil) 와 모노사이트(monocyte)를 포함한다. 보체 단백질은 비특이성 면역의 주요 가용성 요소이다. 급성기 반응물질과 인터페론 같은 사이토카인도 선천성 면역의 일부이다.

특이성 면역은 자극된 후 오직 (감염원이나 기타) 항원 결정 인자에 대해서만 변경된 반응성을 지닌 면역 상태이다. 이는 종종 획득 면역이라고도 한다. 이는 (분명하게나 불분명하게) 자연적으로 획득된 감염이나 의도적 백신의 결과로 활성화되고 특이적일 수 있다; 이는 다른 사람이나 동물로부터 이송 획득되어, 수동적 일 수있다. 특이성 면역은 학습, 적응성, 기억의 특징을 가지고 있다. 세포요소는 림프구(예로, T세포, B 세포, NK세포)와 면역글로불린이 가용성 요소이다.

기생 또는 외부 세포를 인식하고 파괴하는 T세포와 NK세포의 작용은 세포 매개 면역으로 불린다. 세포 매개 면역에 대조적으로 체액성 면역은 복합체 인식 과정을 거쳐 B세포에 의해 생성돤 순환 항체와 관련이 있다.

종양 면역과 관련하여, 종양 면역에서 림프세포의 중요성은 반복적으로 도시되었다. 암에 대한 세포 매개 숙주 반응은 세포 매개 면역과 연관된 세포의 메커니즘이 암과 관련된 항체(정상 세포에는 나타나지 않는 종양 세포와 관련된 항체)를 인식한 후에 새로 형성된 종양 세포를 파괴하는 면역적 감시의 개념을 포함한다. 이는 동일하지 않은 공여자로부터 이식된 조직의 거부 반응과 유사하다. 사람에게서 종양 결절의 성장은 환자의 말초 혈액 림프구와 종양 세포 현탁액을 혼합함으로써 생체내에서 저해되며 이는 종양에 대한 세포 매개 반응을 암시한다. 시험관 연구는 종양을 가진 환자로부터의 림프 세포가 배양된 인간 종양 세포에 대하여 세포 독성을 보임을 보여준다. 보통 T세포인, 이러한 세포 독성 세포들은 신경모세포종, 악성 피부암, 육종, 대장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 고환암, 인두암, 신장암 등과 함께 발견된다. 종양관련 항체, 림포카인 또는 인터페론 등의 존재하에 대 식세포도 세포 매개 숙주 반응에 관련되어 있다.

시험관 내에서 종양 세포와 반응하는 액성 항체는 화학적 발암 물질 또는 바이러스에 의해 유발된 다양한 종류의 종양에 반응하여 생성된다. 실험관 내 하이브리도마(hydridoma) 기술은 다양한 동물이나 사람의 종양에 대한 단일항원 항종양 항체의검출과 생산을 가능하게 한다. 그러나, 생체 내에서 종양 성장에 대한 항체 매개 방어는 오직 특정 동물의 백혈병 및 림프종에서 입증되었다. 반면에, 생체 내 림프 세포 매개 방어는 수 많은 동물 종양 시스템에서 일어나다.

암에 대한 면역 요법은 폭 넓은 주제의 한 부분 즉 생물학적 요법 또는 생물학적 반응 변경제(modifier)의 투입으로 가장 잘 생각되어 진다. 이들 제제는 하나나 그 이상의 다양한 메커니즘을 통하여 작용한다 (1) 효과기(effector) 세포의 수를 증가시키거나 하나나 그 이상의 수용성 매개체를 생성하는 숙주의 항 종양 반응을 자극하기; (2) 효과기나 매개체로 역할 하기 (3) 숙주의 억제 메카니즘을 감소 시키기; (4) 면역원성을 증가시키거나 면역학적 과정을 통해 종양 세포에 손상을 입혀서 종양 세포를 변형시키기; (5) 숙주의 세포독성물이나 방사선 요법에 대한 내성을 향상 시키기. 종래에는 세포 매개 종양 면역치료의 초점은 실험관에서 인터루킨-2에 노출시켜 팽창시킨 후 환자의 임파구를 재주입(reinfusion)하는데 있어왔다. 하나의 다른 점은 생체내에서 종양에 침투한 소위 종양 침투 림프구라 불리는 림프구의 분리와 팽창을 포함한다. 또 다른 하나는 종양세포에 조직 적합성 항원과 종양 관련 항원의 발현를 향상 시키는 것으로 여겨지는 인터페론의 병용이고 그럼으로써 수혈된 효과기 세포에 의한 종양 세포의 살해를 증가 시킨다.

숙주 자체의 면역 시스템의 활발한 자극에 비해, 액성(humoral) 요법은 수동적 면역요법의 형태로 항종양 항체의 사용에 오랜동안 집중해 왔다. 다른 변형 예는 단클론 항종양 항체에 라이신이나 디프테리아 등의 독소나 방사선 동위원소와 접합이다. 이리하여, 항체는 이런 독성 제제를 종양에 특정하게 전달 할 것이다. 방사선 조사, 뉴로아미네이즈 (neuromainase)처리, 합텐(hapten) 접합 또는 혼성화(hybridization)후에 숙주의 자체 종양 세포를 이용한 능동 면역요법도 시도되어 왔다. 이렇게 치료된 소수의 환자들에게서 임상적 향상을 볼 수있다. 급성 림프성 백혈병과 급성 골수성 백혈병에 대하여 항체 증강제와 병용해서 방사선 조사된 다른 사람으로부터의 종양세포가 이용되어져 왔다. 대다수는 아니지만 얼마간의 경우에서 지속적 경감이나 향상된 재관해치료(reinduction)율이 보고되었다. 인터페론, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 림포탁신(lymphotoxin) 등도 면역학적으로 매개된 매커니즘에 영향을 미치기 위해 사용되어 왔다. 세포성과 액성 메커니즘을 둘다 이용한 최근의 접근 방식은 세포 독성 효과기 세포와 반응하는 두 번째 항체에 연결된 종양 세포에 반응하는 첫 번째 항체를 포함해서 후자를 더욱 특정하게 종양에 표적될 수 있게하는 "이성교차 연결 항체"(heterocross-linked antibodies)의 발달이다. PDT 치료된 쥐의 종양으로의 숙주 면역 세포의 침투가 보고되었다.

PDT와 면역 요법의 결합

본 발명에 따르면, 광역학적 암 요법(PDT)이나 종양 면역 요법의 방법 같은 추가적인 응용법에서 주사 가능한 물질로 사용될 수 있게 하는 적당한 점성을 가진 글리케이션된 키토산(GC) 제제를 이용하는 것이 바람직하다.

Korbelik, Krosl, Dougherty, Chaplin 등에 의해PDT와 면역요법의 결합 가능성이 탐구되었다. 상기 문헌, 광역학적 요법과 생물의학적 레이저에서 518-520 쪽을 참조 하시요. 그들의 연구에서, 그들은 PDT에 대한 면역 반응의 증폭 가능성과 치료받은 종양의 더 전반적인 파괴에 대하여 조사하였다. 종양, 편평 세포 암종 SCCVII을 암컷 C3H마우스에서 성장시켰다. 면역 활성화제 SPG (식세포와 림프세포를 사이토카인이나 다른 면역 신호로부터의 더 반응하게 자극시키는 큰 분자량의B-glucan) 가 근육내로 7일 복용량으로PDT 하루 전에 끝나거나 PDT 후에 바로 개시되게 주입되었다. 따라서 포토프린(photofrin) 기반의 PDT가 사용되었다; 포토프린은 정맥으로 빛 치료24 시간 전에 주입되었다. SPG 면역요법은PDT의 직접적 살해 효과를 향상시키는 것으로 보여졌다. 그러나 간접적 살해 효과(생체에 남아있는 종양세포의 생존의 감소로 나타나는)는SPG를 받지않은 동물 종양에서 더욱 더 뚜렷했다. PDT의 바로 전 후에 수행되는 SPG 면역요법의 효과 차이는면역 활성화가 빛의 배달 시점이나 바로 그후에 최고치에 도달할 때 최대의 반응이 얻어짐을 최대의 반응이 암시한다. PDT(최적의 면역활성화가 5-7일 후에 달성되는)후에 SPG 을 시작 하는 것은 유익한 반응을 위해서는 확실히 너무 늦다.

또 다른 연구에서, 저 산소 조건하에 세포 독성을 보이는 생반응성 약물의 효과를 강화하기 위해PDT를 이용한 연구가 조사 되었다. 상기 문헌, 광역학적 요법과 생물의학적 레이저에서 698-701 쪽을 참조 하시요. 종양의 저산소증을 증가시키는 치료와 함께 사용했을 때, 이런 약제의 항종양 활성은 생체 내에서 향상될 수 있음이 나타났다.

면역항체 증강제와 병용한 광역학적 암 치료

본 발명에 따르면, 암 치료의 사용을 위한 주사가능 물질로써 적당한 점도를 가진, 글리케이션돤 키토산(GC) 제제를 사용하는 것이 바람직하다. 이 것은 예로 광열 또는 광역학적 암 요법과 종양 면역 요법의 혼합된 적용법과 함께 임의의 적절한 방식으로 달성 될 수 있다. 본 원에서, 암이란 용어는 대부분 주변 조직을 침투하거나, 제거 시도 후에도 재발하는, 적절히 치료되지 않으면 죽음을 일으킬 수있는, 임의의 수의 다양한 종류의 종양을 포함하려 의도된 일반적 용어이다. 본원에서 사용된, 종양은 정상 보다 더 빨리 세포 성장하는 비정상적 조직을 의미한다. 이 것은 성장을 개시한 자극이 없어진 후에도 계속 자란다. 종양은 부분적 또는 완전한 구조조직, 정상 세포와의 기능적 조화의 결핍을 보이며 양성이나 악성인 별개의 덩어리를 형성한다.

본 발명에 따르면, 주사 물질로써 적당한 점도를 가진 글리케이션된 키토산 (GC)제제로 치료될 수 있는 특정 암의 예는 자궁 경부암, 유방암, 방광암, 대장암, 전립선암, 후두암, 자궁 내막암, 난소암, 구강암, 신장암, 고환암(비생식 세포종양성), 폐암(비 소세포성) 등이 있고, 이에 한정되지 않는다.

또한 본 발명에 따르면, 치료는 다른 종류의 암 치료법 예로 방사선 조사와 적절한 방식으로 함께 투여될 수 있다. 예로 방사선은 호지킨병, 결절 미만성 비호지킨병, 머리와 목의 편평 상피 세포 암종, 고환종, 전립선암, 초기 유방암, 초기 비소세포 폐암, 수모세포종 등의 치료에 중요한 역할을 한다. 방사선은 뼈 전이가 다발성 골수종, 진전 단계의 폐 및 식도인두(esophagopharyngeal) 암, 위암, 육종, 뇌 전이에 존재할 때 전립선암이나 유방암에 고시적 요법으로도 쓰일 수 있다. 예로, 치료될 수 있는 암은 호지킨병, 초기단계 비호지킨병, 고환 암(seminomal), 전립선암, 후두, 자궁경부 그리고 정도는 덜하지만, 인두, 코와 부비동, 유방, 식도, 폐 등의 암을 포함한다.

치료는 다른 종류의 항종양 약물과 적절한 방식으로 함께 투여될 수 있다. 항종양 약물은 세포분열, 발달, 성숙, 종양세포의 확산 등을 막는 것들을 포함한다. 이상적인 항종양 약물은 정상세포에 부작용이나 독성이 없이 암 세포를 파괴 할 것이나 이런 약은 존재하지 않는다. 많은 약물의 좁은 치료 지수에도 불구하고, 일부 환자에서는 치료 또는 심지여 치유가 가능하다. 고환암(비생식 세포종양성)과 폐암(비 소세포성) 등에서 밝혀진 것처럼, 융모막 암종, 호지킨 병, 미만성 대세포 림프종, 버킷 림프종과 백혈병의 특정 단계는 항종양 약물에 민감한 것으로 밝혀졌다. 항종양 약물의 일반 클래스는 아킬호제, 항 대사 물질, 식물 알칼로이드, 항생제, 니트로소우레아, 무기 이온, 효소, 호르몬 등을 포함하고, 이에 국한되지 않는다.

레이저을 이용한 면역 요법같은 생체 자가 암 백신

키토산 유래의 조성물 및, 특히, 본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는 종양 및 기타 의학적 장애를 치료하는데 효과적이다. 단독으로나 다른 약물과 함께 사용하는 추가적인 글리케이션된 키토산의 사용은 암이나 후천성 면역 결핍 신드롬을 포함한 면역 결핍 환자에서 면역 자극제로서의 사용을 포함하고 이에 국한 되지 않는다.

그러므로 본 발명의 키토산 유래 조성물은 예로 본원에 기술된 것처럼 면역항체 증강제나 면역항체 증강제의 요소를 포함한 수 많은 응용에 유용하다. 다른 용도에도 불구하고, 키토산 유래 조성물의 주요 사용은 레이저를 이용한 면역요법(LIT) 같은 생체자가 암백신(inCVAX), 과 함께 연계한 면역항체 증강제로서의 사용이고 본원에 상세히 기술된 키토산 유래 조성물은 이런 맥락에 있다.

본원에 더 기술된 바와 같이, 본 발명의 추가적인 예시는 일반적으로inCVAX나 특히 암 치료를 위해서는 LIT와 함께 면역항체 증강제로써 본 발명의 글리케이션된 키토산 제제의 사용에 관한 것이다. 본 발명을 사용하는 레이저를 이용한 면역요법은 종양이나 그 주위로 점탄성 키토산 유래 조성물로 이루어진 면역항체 증강제를 주입하는 것을 포함하고 그 종양에 광열 조사가 뒤 따른다. 광열 작용은 종양세포 파괴을 위한 충분한 조도에서 수행되고 발색단의 세포내 주사나 주사없이 또는 다른 수단에 의해 전달되어, 본 발명의 글리케이션된 키토산 제제의 주사와 병합해서 또는 다른 수단에 의해 전달되어 수행될 수 있고 세포 매개와 체액성 항 종양 면역 반응이 유도된다.

바람직한 실시예에서, 개선된 LIT가 제공되었다. 여기서 개선은 본원에 기술된 주사가능한 본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산 제제의 사용으로 이루어진다. 본 발명은 또한 생체내에서inCVAX와 함께 면역 시스템의 특정 요소를 활성화하는 방법을 고려한다.

본원에 더 기술된 바와 같이, LIT가 현재 면역요법과 암 백신의 한계를 극복하는 생체 자가 암 백신(inCVAX)을 제공하는 것이 결정되었다. 일반적으로LIT를 구성하는 두 원리는 (1) 종양의 생명력을 없애고 종양 항체를 해방시키기 위해 레이저를 이용한 국부적인 일차 종양의 가열 (2) 강력하고 무해한 글리케이션된 키토산으로 이루어진 면역항체 증강제의 국부적 주사, 이 것은 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 해방된 종양 항체와 반응한다. 따라서, LIT는종양 항체의 예비 선택이나 생체밖(ex vivo) 준비없이 각 환자로부터 종양 항체의 소스로서 전체 종양 세포를 이용하는 생체자가면역 암백신으로 효과적으로 작용한다.

본 발명에 따르면, 본원에 기술된 본 발명의 주사 가능한 점탄성 글리케이션된 키토산 제제를LIT와 함께 사용한 또 다른 장점은LIT 접근법을 사용함으로써 수지상 세포(DC)의 활성화, 연이어 생체내에서 종양 항원에 활성화된 수지상 세포의 노출 등이 있다. 그래서 LIT는 생체밖 준비과정의 필요성을 없애고, 면역항체 증강제로 점탄성 글리케이션된 키토산 제제와 함께LIT 를 사용함으로써 다른 전체 세포 암 백신에 유리한 접근법을 나타낸다.

하나의 글리케이션된 키토산 제제의 예시적 제형은 PROTECTIN이라는 이름 아래 제조되었다. LIT 과 함께 PROTECTIN은 1) 수지상 세포를 활성화시켜서 2) 종양 세포와 수지상 세포의 반응을 증가 시켜서 3) 면역 시스템에 종양 항체 제시를 증가 시켜서, 면역 시스템을 자극하고 종양 특이성 면역을 유도하는 것이 관찰되었다.

다른 본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는1) 수지상 세포를 활성화시켜서 2) 종양 세포와 수지상 세포의 반응을 증가 시켜서 3) 면역 시스템에 종양 항체 제시를 증가 시켜서, 면역 시스템을 자극하고 종양 특이성 면역을 유도하는 기능도 한다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형은 원하는 치료효과을 매개하는 하나나 그 이상의 면역시스템의 요소을 활성화 시킨다.

본원에 더 기술된 바와 같이, 활성화되는 특정 면역시스템의 요소는 이름하여 식세포 시스템인 비특이성, 또는 선천성 면역을 포함한다. 여기에는 혈액내에 호중구세포와 단세포, 조직에서 대식세포; 비특이성 면역의 주요 수용성 요소인 보체 단백질, 급성기 반응 물질, 선천성 면역의 한 부분이기도 한 인터페론 같은 사이토카인 등이 있다. 특이성 면역의 예로 림프구 (예, T세포, B세포, NK세포) 와 면역글로불린 등 여러 요소들이 있다. 본 발명의 글리케이션된 키토산은 종양 면역을 향상 시키기 위하여 제형 림프 세포와도 작용한다. 대식세포는 종양 관련 항체, 림포카인 또는 인터페론의 존재하에서 세포 매개의 숙주 반응에 관련될 수도 있다.

[00143] 면역 시스템의 특정 요소는 "광열" 치료후 활성화 된다. 광열 파괴가 일어날 때, 단편화된 조직과 세포 분자는 키토산 같은 면역 증강 물질의 존재 하에서 숙주내에서 출납된다. 사실상, 생체내에서 백신은 형성된다. 이 물질의 혼합물은 숙주에서 순환하고, 면역 감시 시스템에 의해 검색된다. NK세포, 모집된 살해T세포를 포함한 세포 매개 면역의 즉각적인 동원이 따라온다. 이들 세포들은 유사한 항원이나 화학물질이 있는 곳으로 이동한다. 때가 되면, 세포독성 항체의 생산과 함께 세포 매개 면역은 체액성 면역으로 이행된다. 이 항체는 자유롭게 몸 주위를 순환하고, 이들이 부호화(encode)하고 있는 세포나 물질에 붙는다. 만약 이 부착이 보체 인자의 존재 하에 일어나면 그 결과는 세포 사망이다.

본 발명의 주사가능한 점탄성 글리케이션된 키토산은 수지상 세포나 대식세포 같은 항원 제시 세포의 생체내 활성화와 뒤따르는 종양항체의 항체 제시 세포로의 노출에 기반한 "생체 암 백신"으로 예상치 못한 용도를 가지고 있다. 본 발명의 주사가능한 점탄성 글리케이션된 키토산제제는 치료 효과에 기여하는 암 괴사 인자(예, TNFa), 산화 질소 등 다른 세포매개체도 활성화 시킬 수 있고, 여기에 국한되지 않는다.

본원에 기술된 본 발명의 주사가능한 점탄성 글리케이션된 키토산을LIT와 함께 이용한 또 다른 장점은 이 접근법을 이용함으로써, 이 방법은 독립적으로 각 개인의 면역반응를 유발하는 것, 숙주 사이의 종양 특이성 항체의 발현에서(기존의 항원 면역요법 과 백신에서 요구 되는) 교차 반응에 의존하지 않는 것이다. 조직화학적 연구는LIT 치유된 종양 보유 쥐의 혈청은 살아있거나 보존된 종양 세포의 세포막에 결합한 항체를 가지고 있다는 것을 밝혔다. LIT에 의해 성공적으로 치료된 쥐의 혈청을 일차 항체의 소스로 이용한 종양 세포 단백질의 웨스턴 블롯(western blot) 분석은 종양 선택적 항체의 유도를 가르키는 특정 밴드(band)를 나타냈다. 또한 성공적으로 치료된 쥐는 종양의 재 도전에 장기간 저항성을 획득할 수 있다는 것과 양자(adoptive)면역이 성공적으로 치료된 쥐의 비장세포를 이용해 전송 될 수 있음이 보여졌다.

따라서 본원에 기술된 주사가능한 점탄성 글리케이션된 키토산 제제의 사용시, 효과적인 암 치료를 위한 중요한 요구를 만족시키는 몇 가지 장점이 있다. 본 발명은 주사 투약이 쉽고, 그리하여 규정준수도를 증가시키고, (1)효과적, (2) 비 독성, (3) 말기 전이성 암의 실질적 치료등을 제공하지 못하는 기존의 접근법에 대안적인 효과적 치료법을 제공하는 놀랍고 예상치 못한 유익한 제제를 제공하기 때문에, 이 것은 특히 암 환자에게 유리하다. 유방암 치료의 중요한 문제는 모든 환자가 현재, 기존의 방법으로 치료할 수 없고 말기에 진단된 환자는 심지어 더 적은 유효한 치료 선택권으로 나쁜 예후를 가지고있다. 최근 수 년간 유방암 치료에 많은 진전과 발전에 있어 왔으나, 중요한 문제들이 남아있다. 본원에 기술된 본 발명의 주사가능한 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는 효과적인 암 치료에 중요한 요구를 충족시키는 몇 가지 장점을 제공한다.

LIT는 수지상 세포의 (CD80의 발현의로 평가된) 성숙 유도, T세포 증식 강화, INF- γ 의 분비 증가, HSP70 발현 증가 등을 하는것으로 알려졌다. 더 나아가, LIT 의 혼용(예로, 레이저에 의한 종양 가열과 본 발명에 따른 글리케이션된 키토산 제제) 효과는 치료 후에 종양 특이성 세포독성 CD4와 CD8세포의 종양으로의 침임을 가진 종양 특이성 면역을 유도하는 것으로 알려졌다.

본원에 더 상세히 기술된 바와 같이, 그래서 LIT는 다음과 같은 수 많은 장점을 제공하며 여기에 국한되지 않는다.

· 치료된 일차 종양을 제거한다

· 치료안된 전이를 제거한다

· 장기간성 면역과 생존을 유도한다

· 종량의 재도전에 저항성을 만든다

· 치료 복용이 사람에게 무독성이고 안전하다

본 발명의 한 양상에 따르면, 악성 종양같은 종양은 종양 세포 파괴를 유도, 종양 세포 증식을 억제하는 자가 면역 시스템을 자극하기 위한 수준까지 종양의 온도를 상승 시키기에 충분한 세기와 기간을 가진 가시광선, 근적외선, 적외선 등으로 조사(radiation)된다. 종양의 가열을 촉진하기 위하여, 흡수피크가 적용된 빛의 파장에 일치하는 발색단이 빛 치료전에 주사될 수 있다. 광 조사후, 점탄성 글리케이션된 키토산 유래 면역항원 증강제가 종양이나 종양을 바로 둘러싼 조직에 투약(예로 주사에 의해) 된다.

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 인도시아닌 그린(ICG)과 글리케이션된 키토산의 용액은 키토산에 0.1에서 2%의 ICG농도에서 제제된다. 이 용액은 종양으로 주사되고, 그리고 종양은 상당한 파괴없이 바로 정상 세포 조직을 관통 할 수 있는약 5왓트의 세기와 조사 파장을 가진 레이저로 조사(irradiation)된다. 조사는 종양 세포 파괴 유도와 세포 매개나 체액성 면역 반응을 자극하는 수준까지 종양의 온도를 높이기에 충분한 약 일 분에서 십 분 동안 지속 된다.

본원에 기술 된 바와 같이, 본 발명은 다른 기존이나 틀에 박히지 않은 양태(modalities)에 비해 몇 가지 장점을 가지고 있다. 종양 파괴와 면역 자극 증강제의 결합이 중요한다. 가장 중요한 장점은 결합된 급성과 만성 종양 파괴이다. 급성 종양 손실은 종양 부담과 증식 기반을 감소 시켜 자가 방어 시스템이 약해진 "적"과 싸울 수 있게하는 크고 조절된 규묘에서 종양 조직의 광증발, 광제거, 열 살해 등을 발생한다. 지역적 종양 파괴가 일어날 때, 단편화된 조직과 세포 분자는 글리케이션된 키토산 같은 면역 강화 물질의 존재하에 숙주에서 지역적으로 분배된다. 사실상, 생체 백신이 생성된다. NK세포, 모집된 살해T세포를 포함한 세포 매개 면역의 즉각적인 동원이 뒤 따른다. 이들 세포들은 비슷한 항체나 화학물질이 있는 자리로 이동한다. 때가 되면, 세포 매개 면역은 세포 독성 항체의 생성과 함께 체액성 면역으로 교대된다. 이 항체는 자유롭게 몸 주위를 순환하고, 이들이 부호화(encode)하고 있는 세포나 물질에 붙는다. 만약 이 부착이 보체 인자의 존재 하에 일어나면 그 결과는 세포 사망이다. 활동에 대한 이 두 면역적 모드의 시간 틀은 체액성 무장은 약 30일경에 성숙하고 숙주의 일생 동안까지 긴 기간 동안 지속되는 반면, 세포 매개 반응에 대해서는 0에서 2 주이다.

요약하면, 전체 암 퇴치를 통한 장기 생존은 본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산을 사용해서 이루어질 수 있다. 이는 예로 광열같은 제거 상호작용과 글리케이션된 키토산이나 다른 면역 조절제의 존재에 의한 강화된 면역 시스템의에 의한 감소된 종양 부담의 결합된 결과이다.

다른 실시예에 따르면, 본 발명의 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는 항미생물 및/또는 지혈 적용법에도 사용 될 수 있다. 글리케이션된 키토산(GC) 제제는 예로 항미생물 지혈 분무기로 제형 될 수 있다. 여기서GC 제형은 재래의 용기로부터 분무 될 수 있는 점도와 유변학적 특징을 가지고 있다. 또한, GC는 항미생물 및/또는 지혈 효과 적인 농도와 목적에 적당한 용기로부터 분배 될 수있는 점도/유변학적인 성질을 가지고 적용된 다른 제형에 포함 될 수 있다.

본 발명은 다음과 같은 예에서 더 예시 되어있다. 이들 예는 예시로 제공되고 본 발명의 범위를 제한하는 목적은 아니다. 그러므로 예들은 본 발명의 범위의 제한으로 해석되어서는 안되고, 오히려 이들의 바람직한 실시예의 표본으로 간주 되어야 한다. 많은 다른 변형이 가능하다.

[실시예]

실시예 1.

글리케이션된 키토산(GC) 제제을 위한 예시적 과정

글리케이션된 키토산은 바림직하게는 산성화제의 존재하에서 키토산 중합체의 이미 정해진 글리케이션 퍼센트가 이미 정해진 정도까지 키토산 중합체의 아미노기가 글리케이션이 달성되는 정도로 당의 카르보닐기와 키토산의 일차 아미노기 사이에 쉬프염기의 생성(본원에서 아미노기의 글리케이션으로도 설명된)을 위한 충분한 시간을 가지고, 키토산을 단당 및/또는 다당과 반응시켜 얻어진다. 이어서 쉬프염기와 이들의 재배열된 유도체(아마도리 생성물)사이의 환원에 의한 안정화가 따른다. 남아있는 자유 아미노기의 측정은 예로 닌하이드린 반응 같은 화학적 측정이 글리케이션 정도를 분석하기 위해 사용되는 반면, NMR 트레이싱이 단당 및/또는 다당의 키토산 중합체에 결합을 확인하기 위해 사용된다.

실시예 2.

살균 여과

*미국 특허 5,747,475에 기술 된 기존의 1500 kDa 갈락토키토산은 비교적 합성하기는 간단한 반면, 필터의 본전성을 손상시키지 않고서는 예로 0.22 마이크론 필터로 살균하기가 불가능하여 GMP 생산과 사람에 대한 사용에 부적합하게 된다. 반면에 본원에 기술된 새로운 점탄성 글리케이션된 키토산은 예상하지 못한 유익한 물리화학적 특성에 따라 GMP 생산과 살균여과에 관하여 중요한 이점을 가지고 있다. 예로 분자량 250,000 Da (250 kDa)의 살균 여과는0.22 마이크론 필터를 가지고 여과동안 재료의 손상없이 지극히 가능하다.

실시예 3.

글리케이션된 키토산(GC)의 점도

높은 분자량을 가진 GC 제제는 높은 점도를 나타낸다(cP로 측정):

GC의 kda Cp

100 0.914

250 7.68

500 20.79

1500 84.7

아래의 그래프는 분자량 100 kDa에서1,500 kDa범위의GC샘플에서의 점도( Cp로; y 축) 대 분자량(kDa으로; x 축)를 보여준다. 이 실험에서 수용액 속의GC농도는0.6% (100 kDa) 에서 0.11% (1,500 kDa)의 범위의, 증가하는 무게에 따라 감소하였다.

아주 놀랍게도, 오직 증가하는 분자량을 가지고 샘플에서 GC농도가 감소할 경우에만, 점도가 증가하는 분자량에 따라 선형적으로 증가함에 발견되었다. 아래 도표와 그래프는 위의 점도 실험에서 사용된 샘플 용액에서의 GC 퍼센트를 보여준다.

크기 kDa 샘플에서 GC 퍼센트

100 0.6

250 0.3

500 0.14

1500 0.11

결과는 명확하게 1) 높은 분자량의 GC 제제는 높은 점도(cP로 측정된)와 상관하고 2) 점도와 분자량의 상관관계는 농도가 일정하게 유지되면 선형적이지 않다. 즉, 점도는 증가하는 분자량에 비례하지 않게 증가한다. 이 것은 높은 분자량의 글리케이션된 키토산(예로 미국 특허 5,747,475에 공개 된)을 주사나 살균 여과에 부적합하게 만든다.

따라서, 작은 분자량(예, ~400 kDa이하)으로 이루어진 점탄성 글리케이션된 키토산 제제는 향상된 주사용이성를 제공한다; 이런 제제는 예로 종양 세포 파괴의 유도와 종양에 대한 자가 면역 방어 시스템의 자극을 위한 광역학적 요법, 레이저를 이용한 면역 요법 등을 이용하는 암 치료에 유용하다.

실시예 4.

제조 개선

이 예시적인 연구에서, 글리케이션된 키토산 제조동안 전체적 수율을 향상 시키기 위한 필요에 따라 실험조건이 변형될 수 있음이 결정되었다. GC의 제조는 pH조건을 조절해서, 글리케이션 퍼센트를 조절함으로써 향상될 수 있음이 예상하지 못하게 발견되었다. 구체적으로는, 수소화 붕소 나트륨(NaBH4)의 반감기가 pH에 비례하기(낮은 pH 에서 수소화 붕소 나트륨의 반감기는 매우 짧고, 오직 높은 pH에서만 NaBH4가 어느 정도 안정적임을 의미 )때문 임이 결정되었다. NaBH4는 낮은pH에서 쉬프 염기와 아마도리 생성물의 환원에 의한 글리케이션된 키토산 안정화에 그리 효과적이지 않은 것이 결정되었다. 예로, pH 가 5이하(< pH)로 유지되었을 때, NaBH4의 반감기는 매우 짧아서 쉬프 염기와 아마도리 생성물의 환원이 덜 효과적이고 GC의 글리케이션 퍼센트가 떨어졌다.

그러나, 더 높은 pH에서는 제형이 "젤(gel)화"되고 비뉴턴화(non-newtonian)되는 것이 결정되었다. 예로, pH가 6이상(pH >6)에 유지되었을 때, 제형은 젤화되고 그 일군(batch)은 버려져야 했다. 즉 효율적인 GC의 제조 목적을 달성하기 위해서는 제형이 젤화될 정도로 pH가 그렇게 높게 유지 되지 않아야 하고, 글리케이션 퍼센트가NaBH4의 짧은 반감기 때문에 최소화 될 정도로 낮게 유지 되지도 않아야 한다.

실시예 5.

인체 실험에서 레이저를 이용한 면역 요법 (LIT) 치료

연구자 주도의 유방암 실험이 진행된 유방암을 가진 10명의 환자(4 단계 5, 3단계 5)를 대상으로 수행 되었다. 대부분의 환자는 기존의 양태(modelities)에 약하게 아니면 전혀 반응하지 않았고 적어도 한 번의 점탄성 글리케이션된 키토산이 면역항체 증강제로 사용된 레이저를 이용한 면역요법(LIT)를 받았다. 두(2) 환자는 관련이 없는 이유로 조기에 철회했고, 8명의 평가 가능한 환자가 남았다. 독립적인 연구자는 실험 전에 IRB(임상시험심사위원회)와 정부 승인을 취득하였다. 생검과 의료 영상(CT 스캔 등)은 일차 병변과 전이의 평가를 위해 사용되었다.

일차 효능 매개변수는 고형암 반응 평가 기준(RECIST)을 사용한 연구자에 의해 평가된 최상의 전체적 반응이였다. 완전 관해(complete response, CR)는 전체 대상 병변의 소멸이나 적격 대사활동의 부족으로 정의된다. 부분적 반응(partial response, PR)은 활성이나 대상 병변의 가장 긴 직경의 합에서 기준선으로부터 30% 이상 감소로 정의된다. 진행성 질환(progressive disease, PD)은 대상 병변의 가장 긴 직경의 합에서부터 20%이상 증가나, 하나 이상의 새로운 병변의 출현으로 정의된다. 안정적인 질병(stable disease, SD)는 PR 자격을 부여하기에는 불충분한 감소나 PD자격을 부여하기에는 불충분한 증가로 정의된다.

평가에 사용할 수 있는 8명의 유방암 환자 중, CR은 1 명, PR은 4명, SD는 1명의 환자에서 관찰되었다. 평가 가능 환자에서, 객관적 반응율(CR+PR)은 62.5%였고, 임상적 유익 반응율(CR+PR+SD)은 75% 였다. PD는 2 환자에서 관찰되었다. 레이저에 의해 조사된 모든 국부 병변은 LIT에 반응하였다. 또한, 이런 환자들의 대부분의 원격 전이는 LIT에 반응하였다. 림프절, 폐. 간 등에서 전이의 직경과 활동은 극적으로 감소하였다.

국부나 전신 독성은 국립암 연구소 일반 독성 기준(National Cancer Institute Common Toxicity Criteria, 3.0 버전에 따라 매겨졌다. 실험 평가 및 신체 검사는 주기적으로 수행되었다. 전체 연구 기간에 걸쳐 부작용(adverse effect, AE)은 면밀히 검사되었고 기록되었다. LIT는 유방암 환자의 치료 영역 내에서 오직 국부적인 반응만 유도했고 대부분은 국소 레이저 치료의 열 효과와 관련있다. 치료 부위의 홍조, 고통, 부종, 궤양 등은 일반적인 부작용(AEs)이였다. 3, 4 급의 부작용이 관찰되었다. 이 전에 방사선 치료를 받지 않았던 환자에게서 붓기은 사소했다. 이 전에 방사선 치료를 받았던 환자에게서, 붓기는 더 긴 기간에 심했다.

실시예 6.

*글리케이션된 키토산과 함께 레이저를 이용한 면역요법은 마우스에서 B16 흑색종 종양에 대해서 항종양 면역을 나타낸다

암 컷C57BC/6 마우스(8주 나이; 12 마우스/그룹)에 B16 F1 흑색종 종양(살아있는10⁶개 종양 세포)를 등 부위에 피하 접종하였다. 종양은 이식 후 7일경에 직경 7-8mm의 치료 크기에 도달했다. 다섯 치료 그룹 (12 암컷 마우스/그룹)이 이 연구에 포함되었다: 치료받지 않은 대조군; 레이저를 이용한 면역요법 치료; 1% 글리케이션된 키토산0.2mL를 종양주변에 레이저 치료 24시간 전에, 바로, 24시간 후에. 805nm 다이오드(diode) 레이저가 2W, 10분의 매개 변수 설정을 가지고, 레이저 조사를 위해 사용되었다. 레이저는 치료 부위 끝에 확산 렌즈를 가진 광섬유을 통하여 전달 되었고 레이저 끝부위는 피부로부터 4mm거리를 유지하였다.

동물의 생존율이 평가되었다. 레이저 치료 후, 치료 부위에 마우스 피부의 검은 얼룩 및 경화가 관찰되었다. 종양의 재발은 일반적으로 치료 수일 후 발생했다. 글리케이션된 키토산 적용과 함께한 열 처리는 글리케이션된 키토산이 레이저 조사 24시간 전에 투약 되었을 때 가장 큰 개선 효과를 보이며 동물 생존율의 중요한 개선 효과를 나타냈다(아래 도표 참조).

실시예 7.

805nm 레이저와 글리케이션된 키토산을 사용한 전이성 유방 모델에서 간질성 레이저를 이용한 면역요법

최적의 간질성 레이저 양과 최적의 글리케이션된 키토산의 복용량을 결정하기 위한 연구가 수행되었다. 암컷 위스타 푸르트 쥐에 이식 가능한, 전이성 유방종양, DMBA-4, (살아있는10⁵개 종양 세포)를 등 부위에 피하 주사하였다. 원래 화학적으로 유도된 DMBA-4 종양은 매우 전이성이 높고, 약한 면역원성이다. 종양은 임파선을 따라 전이되고, 원 거리 지역에 빠르게 다수의 전이를 형성하며, 종양 이식 후 30-40일 내에 모든 쥐를 죽인다. 일차 종양이0.2 - 0.5 cm³이였을 때, 종양을 덮고 있는 털은 잘라지고 레이저를 이용한 면역 요법이 마취된(2% 이소 플루오란) 쥐에 수행되었다. 805nm 다이오드 레이저가 근적외선을 표적 종양에 전달하기 위하여 사용되었다. 연속적 레이저 세기는 원통형 끝을 가진 광섬유를 통하여 전달 되었다. 활성 끝을 보호하기 위해 투명한 플라스틱 외장을 가진 1.0 cm 활성 끝이 사용되었다. 활성 섬유 끝의 주입은 바늘로 안내되거나 천자 보조 삽입(puncture assisted insertion) 방법이 사용되었다. 섬유의 종양내 위치는 805nm 레이저로부터 나온 적외선을 포착할 수 있는 디지털 카메라로 확인되었다. 최소 100일 동안 쥐는 매일 관찰되었고 종양은 일 주일에 두번 측정되었다. 성공적인 치료에 대한 기준은 종양 이식 후 100일간 생존이었다. 최적의 간질 레이저 용량은 대조군(9마리 쥐, 비치료)에서; 간질 레이저 세기 1, 1.5, 2,5에서 3W/cm²,10분(14 마리 쥐/그룹); 간질 레이저 세기 2W/cm²,30분(14 마리 쥐/그룹)에서 효과를 평가해서 결정되었다. 3W/cm²,10분과2W/cm²,30분 쥐에서 다른 그룹보다 높은 평균 생종율이 나타났다. 최적의 글리케이션된 키토산 복용량은 2.5W에 20분간 간질 레이저를 이용한 면역 요법 후에 0.1% 글리케이션된 키토산을 각 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 mL 주입 후 생존율을 평가해서 결정되었다. 치료를 받지 않은 쥐 그룹은 대조군으로 포함되었다. 가장 최고의 생존율은, 0.2 mL의 글리케이션된 키토산 복용량 후에 42%로 관찰되었다(아래 그림 참조).

실시예 8.

레이저를 이용한 면역요법을 사용한 쥐에서 DMBA-4 전이성 유방 종양에 대한 유도 항종양 면역

암컷 위스타푸르트 쥐 (6-7주 나이, 110-130g) 에 DMBA-4 전이성 유방 종양 (살아있는 10⁵개 세포) 가 서혜부(inguinal area)로 접종되었다. 일차 종양은 일발적으로 접종 7-10일 후에 나타났고 3주내에 약 1-5g 이었다. 종양은 림프관을 통하여 서혜부와 부림프절에 전이되었다. 일차 종양이 0.2-0.5 cm³일때, 일반적으로 10-15일 후, 치료가 시작되었다. 쥐에 0.25%의 인도시아닌 그린이 투여되었고, 0.1%의 글리케이션된 키토산(0.20mL)이 직접적으로 조사전에 종양의 중심에 주사되었다. 80nm 다이오드 레이저가 매개변수 2W, 10분간의 조건으로 레이저 조사를 위해 사용되었다. 레이저는 광섬유를 통하여 치료 부위에 전달되었다. 조사 후, 동물은 개별적으로 보관되고, 관찰과 종양 측정은 일주에 두 번씩 기록되었다. 성공적으로 치료된(치유된) 쥐는 쥐당 살아있는 10⁵-10⁷개 종양 세포의 종양 용량에 같은 종양 세포로 반복적으로 재도전되었고 동물은 4개월 동안 종양 발달에 대하여 관찰되었다. 레이저를 이용한 면역요법에 의해 처리된 32마리의 쥐 중, 8마리의 쥐가 성공적으로 치료되었고, 접종 후 120일 동안 종양이 없었다. 모든 치유된 쥐에서, 전이는 치료 후에도 계속되었다가, 점차 감소하고 결국 추가적인 치료없이 사라졌다. 일곱 마리의 성공적으로 치료된 쥐는 주사당 10⁵-10⁷개 범위의 살아있는 종양세포 양으로 최대 세 번까지 재도전 되었다. 치료하지 않은 대조군 쥐는 일차와 전이성 종양이 발달하고 평균 30일의 생존 기간을 가진 반면, 이들 동물에서 일차나 전이성 종양의 재발생은 없었고 동물은 120일 이상 생존하였다.

실시예 9.

키토산 유래 면역항체 증강제에 의한 레이저 암 치료의 향상

레이저를 이용한 면역요법 치료 동안 면역항원 증강제의 효과는 네 종류의 다른 면역항원 증강제를 사용해서 쥐에서 평가되었다. 암 컷 위스타푸르트 쥐 (6-8주 나이, 150-200g)가DMBA-4 전이성 유방 종양 (살아있는 10⁵개 세포)으로 치료 7-10일 전에 서혜부 지방 패드에 피하 접종되었다. 일차 종양은 일반적으로 5-7일에 만져서 알 수 있게 되고 원격 서혜부와 겨드랑이 전이는 접종 15-20 후에 나타났다. 레이저를 이용한 면역요법 치료는 일차 종양이 0.2-0.3cm³에 달했을 때 시작되었다. 레이저 치료는 일반적으로 10일 째에 수행되었다. 면역항원 증강제는 1%의 수성 점탄성 글리케이션된 키토산 용액(0.2 ml 복용량; n= 48쥐, 두번 실험에서), 50%의 완전 프로인트(Freund's) 항원 증강제(0.2 ml 복용량; n= 33 쥐), 50%의 불완전 프로인트 항원 증강제(0.2 ml 복용량; n= 30 쥐), 코리네박테리움 포자충(corynebacterium parvum, C.parvum; 35ug/쥐 복용량; n= 32 쥐). 면역항원 증강제는 0.25% 인도시아닌 그린과 섞어졌고, 805nm 다이오드 레이저로 조사하기 2시간 전에 직접 종양의 중심으로 주사되었다. 동물은 조사 전에 마취되었고 일차 종양을 덮고 있는 털은 잘라냈다. 레이저 매개변수는 2W, 10분, 3mm 직경 레이저 치료 부위 등이였고, 1cm 직경 종양에 대하여 96 J/cm의 조사량이 만들어 진다. 동물들은 개별적으로 보관되고, 매일 관찰되었고, 종양 부담 측정은 일 주일에 두 번 수집되었다.

본 연구의 데이터는 몇몇 다른 실험에서 종양을 가진 대조군 쥐(n=38 쥐)와 비교되었다. 면역항원 증강제는 대조군 데이터에 비해 통계학적으로 중요한 생존율의 증가를 가졌다(p<0.05). 1% 글리케이션된 키토산은 29% 장기 생존율(아래 표 참조)을 가지고 가장 효과적인 면역항원 증강제로 나타났다. 통계학적 중요성은 글리케이션된 키토산 항원 증강제가 코리네박테리움 포자충(p=0.09), 불완전 프로인트 항원 증강제(p=0.03)와 비교되었을 때 관찰되었다. 비록 중요하지는 않지만, 완전 프로인트 항원 증강제(18%)와 비교했을 때 상당한 치유율을 가진 주목할 만한 생존율 개선이 관찰되었다. 비교적 약한 생종율이 불완전 프로인트 항원 증강제와 코리네박테리움 포자충으로 치료한 후에 관찰되었다.

실시예 10.

키토산 유래 면역항원 증강제에 의한 광역학적 면역요법의 향상

글리케이션된 키토산과 조합해서 직접적 종양 파괴를 위한 방법으로 광역학적 요법을 평가하기 위하여, 포토르린(photofrin)과 메소치환된 테트라(meta hydroxy phenyl) 클로린(mTHPC) 기반의 광역학적 요법과 글리케이션된 키토산의 주사가 각각 EMT6유방 육종과 세포주 1 페 선암 마우스 모델에서 연구되었다. 각 모델에서, BALB/c 마우스는 등 쪽 하부에 10⁶개의 살아있는 조양 세포가 피하 접종되었다. 종양은 7일 후에 치료 크기였다(7-8mm).

EMT6유방 육종의 모델에서, 평가된 치료 그룹은 아래 표에 상세히 설명되었다. 포토프린(Mont-Saint-Hilaire, 퀴벡, 캐나다) SMS 5% 멸균 덱스트로스에 1mg/mL의 농도로 제제되었다. 5mg/kg 양의 포토프린이 조사 24시간 전에 정맥으로 투입되었다. 동물들은 광증감제 주사 후 광역학 치료 후 3일 째가 될 때까지 바로 직접적인 빛으로부터 보호되었다. 마우스는 빛 치료동안 등이 노출되게 마취없이 집게로 고정되었다. 빛(630nm)은 8mm 직경의 액체 광 가이드를 통하여 전달되었다. 전체 광량 60 J/cm²를 위해 전력 밀도는 100mW/cm²에 맞춰졌다.해당되는 경우 빛 조사 후 즉시, 동물들에 종양 주변용량 0.5또는 1.5% 글리케이션된 키토산으로 투입되었다. 동물들은 광역학적 치료 후의 종양 출현에 대해 매 2일 마다 최대 90일까지 관찰되었고 종양 부피의 변화는 일 주일에 세 번씩 측정되었다.

모든 광역학적 그리고 광역학적 글리케이션된 키토산 치료된 쥐는 치료 후 하루 뒤에 완전한 종양의 회귀를 가졌다. 종양의 재발은 일반적으로 치료 후 2 주 안에 검출되었다. 표준 광역학적 요법의 효과는 37.5%였고, 0.5와 1.5%의 글리케이션된 키토산 투입 후 62.5%와 75%로 각각 증가하였다. 글리케이션된 키토산은 광역학적 치료만에 비교해서 종양 보유 마우스의 생존율을 크게 증가 시켰다(p<0.05). 세포주 1 페 선암 모델에서, 치료 그룹은 아래 표에 제시된 것과 같다. mTHPC는최종 농도 0.2 mg/mL을 위해 2:3:5(v/v/v)로 에탄올, 폴리에틸글리콜(PEG) 400, 물의 혼합으로 제제되었다. 0.1 mg/kg 용량의 mTHPC 가 조사 24시간 전에 정맥으로 투입되었다. 동물들은 광증감제 주사 후 광역학 치료 후 3일 째가 될 때까지 바로 직접적인 빛으로부터 보호되었다. 마우스는 빛 치료동안 등이 노출되게 마취없이 집게로 고정되었다. 0.25W 다이오드 레이저로부터 652nm 빛이 8nm직경의 액체 광 가이드를 통하여 전달되었다. 전체 광량 30 J/cm²를 위해 전력 밀도는 110mW/cm²에 맞춰졌다.해당되는 경우 빛 조사 후 즉시, 동물들에 종양 주변용량1.67% 글리케이션된 키토산으로 투입되었다. 동물들은 광역학적 치료 후의 종양 출현에 대해 매 2일 마다 최대 90일까지 관찰되었고 종양 부피의 변화는 일 주일에 세 번씩 측정되었다.

모든 마우스에서 종양 재발은 3주내에 관찰되었다. mTHPC 기반의 광역학적 요법 후, 1.67% 글리케이션된 키토산의 투입은 37.5% 생존율을 나타낸 반면 다른 조합은 효과적이지 않았다. 세포주 1 폐 종암 모델은 빈약한 면역원성 종양 모델로 여겨진다. 국부처리된mTHPC기반의 광역학적 요법에 대한 마우스 세포주 1 종양의 반응에 관한, 글리케이션된 키토산의 종양에 대한 효과는 아래의 그림에 제시된다.

마우스 세포주 1 종양에서 mTHPC 기반의 PDT에 대한 반응에서 종양에 국부처리된 글리케이션된 키토산 처리의 효과

GC = 글리케이션된 키토단(Glycated chitosan)

mTHPC = 메소치환된 테트라 클로린(meso-substituted tetra(meta-hydroxy-phenyl) chlorine)

PDT = 광역학적 요법(Photodynamic therapy)

이 연구의 결과는 활성 면역 자극이 광요법의 효율을 강화하기위해 필요하다는 것을 나타낸다.

실시예 11.

쥐에서 전이성 종양의 치료시 레이저를 이용한 면역요법에 대한 다른 요소들의 영향

각각 전이성 유방종양과 전립성종양를 가진 암컷 쥐와 숫컷 쥐을 사용한 이 실험에서, 레이저를 이용한 면역요법 시스템의 세 가지 요소에 대한 다양한 조합이 평가되었다. 레이저를 이용한 면역요법 시스템은 최대 출력 25W의 근적외선 레이저 다이오드로; 레이저 흡수 염료, 인도시아닌 그린; 면역 항체증강제, 글리케이션된 키토산 등으로 이루어졌다. 일차 종양이 0.2-0.3cm³일 때, 종양 보유 쥐의 치료가 개시되었다. 모든 그룹에서0.2mL의 GC 및/또는 ICG의 용액이 모든 그룹에서 일차 종양의 중심으로 주사되었다. 레이저 치료를 받은 쥐에서, 동물은 마취되고 종양을 덮고 있는 털은 잘라 진 상태로, 주사는 조사의 24시간 전에 일어났다. 레이저의 설정은, 레이저 섬유 끝은 덮고있는 피부로부터 4mm 거리, 레이저 에너지는 광섬유를 통하여 치료부위로 지도된 상태로, 2W, 10분 이었다. 동물들은 치료 후에 개별적으로 보관 되었다. 생존율 연구에서, 유방종양과 전립선 종양을 보유한 쥐는 매일 관찰되었고, 각 종양의 부피는 매주 측정되었다. 암컷 위스타푸르트 쥐(5-6주 나이, 100-125g)에 DMBA4 이식가능한 전이성 유방 종양(살아있는 10⁵개 세포)을 각 쥐의 서혜부 지방패드로 피하접종하였다. 일차 종양은 접종 7-10일 후에 출현했다. 림프관 주변과 원거리의 전이성 종양은 약 2주 후에 만져서 확인할 수 있게되었다. 치료없는 종양 보유 쥐는 평균 생존 시간이 35일 이였다. 아래 표에 상세히 설명된 바와 같이, 여덟 그룹의 전이성 유방암을 보유한 쥐가 레이저를 이용한 면역요법 시스템의 다른 요소를 가지고 치료되었다. 생종율과 일차 그리고 전이성 종양 프로파일은 각 요소와 다양한 요소의 조합에 대하여 결정 되었다. 또한, 쥐 생존율에 관한 면역항원 증강제의 영향을 평가하기 위하여, 세 그룹의 암컷 쥐들이 0.5, 1.0, 2.0%의 글리케이션된 키토산으로 처리되었다.

전이성 유방암 보유 쥐에서, 하나의 요소만의 치료는 평균 생존율이 대조군과 비슷하며, 인도시아닌 그린만이나 레이저만 처리한 모든 쥐에서 죽음이 초래되었다. 글리케이션된 키토산 그룹에서 한 마리는 장기 생존자로 간주되어지고, 다른 하나는 연장 생존자로 간주된다(>120일). 두 마리의 쥐는 생존하였다. 두 요소로 된 치료후, 각각 레이저와 글리케이션된 키토산을 더한 그리고 인도시안닌 그린과 글리케이션된 키토산을 더한 그룹 1, 2에서 장기 생존자가 관찰되었다. 하나나 두 요소로의 치료 그룹이 대조군과 비교했을 때, 생존 시간의 통계학적으로 중요한 의미는 없다. 아홉 마리는 세 요소로의 레이저를 이용한 면역요법 (예로, 글리케이션된 키토산과 합쳐진 광열 응용법) 치료 후에 장기 생존율을 보였고 31마리의 별도의 두 실험에서 30%의 치유율을 나타냈다. 대조군과 비교해서 치료된 쥐에서 평균 생존 시간의 의미있는 차이(p<0.0001)가 관찰되었다. 레이저를 이용한 면역요법 시스템의 하나, 둘, 또는 세 요소를 이용한 치료후에 쥐의 생존율은 아래 그림에서 제시되었다. 전이성 종양은 보통 일차 종양의 접종 후 2주 차에 출현하고 회귀전에 최대 크기에 도달한다.

레이저를 이용한 면역요법 시스템의 하나, 둘, 또는 세 요소로 치료된 후 쥐 생존율

GC = 1.0% 글리케이션된 키토산(glycated chitosan).

ICG = 0.25% 인도시아닌 그린(indocyanine green).

*실시예 12.

레이저를 이용한 면역요법에 의해 유도된 향종양 면역성과 이의 입양 전송

레이저를 이용한 면역요법에 의해 유도된 향종양 면역성의 메커니즘을 연구하기 위해, 면역 비장 세포를 이용한 입양 전송이 수행되었다. 암컷 위스타푸르트 쥐에 DMBA4 이식가능한, 전이성 유방 종양(살아있는 10⁵종양 세포)이 레이저를 이용한 면역요법 치료 전에, 각 쥐의 서혜부 지방 패드로 피하 접종되었다. 치료없이, 종양 보유 쥐는 평균 약 30일 간 생존하였다. 레이저 치료된 쥐는 0.25% 인도시아닌 그린과 1%의 글리케이션된 키토산을 함유한 0.2mL의 용액을 레이저 치료전에 직접적으로 일차 종양에 투입받았다. 2W, 10분 설정의 805nm 레이저가 조사를 위해 사용되었다. 유도된 면역성의 방어 능력은 살아있는 종양세포의 증가하는 접종량을 가지고 반복해서 도전된, 성공적으로 처리된 종양 보유 쥐의 몇 그룹에서 평가되었다. 또한, 레이저를 이용한 면역요법 후에 종양 도전에 대한 저항과 종양 성장 저해는 자연(naive) 쥐에서 평가되었다.

레이저를 이용한 면역요법으로 성공적으로 치료된 15 마리의 쥐가 최초 접종 후 120일 뒤에 살아있는10⁶개의 종양 세포로 재도전되었다. 18마리의 자연(naive) 나이 일치 쥐(25주 나이)는 비교 목적으로 10⁶개의 살아있는 종양 세포로 접종되었다. 모든 성공적으로 치료된 쥐들은 도전에 대해 일차 종양 이나 전이의 관찰이 없는 완전한 저항을 보여 주었으나, 나이 일치 대조군 쥐들은 일차 종양과 전이성 종양이 발달하여 접종 30일 내에 사망하였다. 어린 쥐(약 8주 나이)의 별도 그룹은10⁵개의 살아있는 종양 세포로 접종되었다. 10⁵나 10⁶의 살아있는 종양 세포로 접종된 대조군 쥐가 각각 평균 33일 과 28일을 생존하므로, 생존율은 종양량에 의존하는 것으로 보인다.

첫 번째 재도전 후, 몇 실험 그룹으로부터 쥐는 1-5달 사이 간격으로10⁵개의 살아있는 종양세포를 가지고 두 번의 연이은 도전을 받았다. 레이저를 이용한 면역요법에 의해 성공적으로 치료된 쥐들은 세 번의 재도전에 완전한 불응(refractory)을 보였다. 이 데이터는 아래 표에 제시되어 있다. 반면에, 나이 일치 대조군 종양 보유 쥐는 원격 서혜부와 겨드랑이 부위에 여러 전이가 발달했고 35일 내에 사망했다. 여러 전이는10⁵개의 살아있는 종양세포로 접종된 모든 20마리의 대조군 쥐에서 발달하였다; 그러나 이들 쥐는 더 많은10⁶개의 살아있는 종양세포량으로 접종된 나이 일치 대조군 쥐와 비교해서 약간의 생존시간 증가를 가졌다.

입양 면역 실험을 위해서, 살아있는DMBA-4 종양 보유 쥐에서 수확된 살아있는 종양 조직은 헐렁한 그라운드 글래스 호모지나이저(ground glass homogenizer)로 분산되어 단 세포의 현탁액으로 분산되었다. 장기생존 쥐는10⁶개의 살아있는 종양 세포로 재도전 받은 후 28일 후에 희생되었고, 이들의 비장은 지방없이 절개되었다. 대조군 종양 보유 쥐의 비장세포를 이용한 두 개별적 실험이 수행되었다. 비장세포는 첫 번째와 두 번째 실험에서 가각 종양 접종 22과 39일 후에 수확되었다. 세포 현탁액은 10% 소 태아 혈청을 가진 배지에 기계적 파괴에 의해 준비되었다. 비장 세포는 또한 종양 세포에 이전 노출이 없는 자연 쥐로부터 수집되었다. 비장 세포와 살아있는 종양 세포는 400:1의 비장:종양 세포 비로 섞기전에 헤모사이토미터에서 세어졌다. 자연 쥐는 4x10⁷개의 비장세포와10⁶개의 살아있는 종양 세포의 혼합물로 0.2mL부피로 접종되었다. 입양 면역 전이 실험을 위하여, 4 그룹의 자연 암컷 위스타푸르트 쥐가 종양 세포로 접종되었다. 치료 그룹은10⁶개의 살아있는 종양 세포로 접종된 종양 보유 대조군 그룹 A쥐; 종양 보유 대조군 쥐의 비장 세포와 종양 세포의 혼합물로 접종된 그룹 B쥐; 종양 재도전 28일 후, 레이저를 이용한 면역요법으로 성공적인 치료를 받은 종양 보유 쥐의 비장 세포와 혼합된 종양 세포로 접종된 그룹 C쥐; 이전 종양에 노출이 없는 자연 쥐의 비장 세포와 혼합된 종양 세포로 접종된 그룹 D쥐. 실험은 두 번씩 수행되었고, 두 실험으로부터의 쥐 생존율은 병합되어서 아래 그림에 제시되었다. 그룹 C쥐에는 일차나 전이성 종양이 관찰되지 않았고 이는 레이저를 이용한 면역요법이 수여자에게100% 방어를 제공하여, 성공적으로 쥐를 치료하였음을 나타낸다. 종양 접종 35일 내에, 여러 전이와 사망이 그룹A 종양 보유 대조군 쥐에서 관찰되었다. 그룹D 건강한 쥐의 비장 세포에 의해서는 방어가 제공되지 않았다. 그룹 B 의 쥐에서는 10 마리 중에서 1마리의 쥐가 생존하였다; 그러나, 이 쥐에서는 나중에 일차와 전이성 종양이 발달하였다. 모든 그룹C 쥐는 입양 면역 전송 60일 후에 재도전되었고, 모두 도전을 견디어 냈다. 그룹 C 쥐의 면역 비장 세포는 수집되어서, 이 혼합물로 접종된 일단의 정상 위스타푸르트 수여 쥐(n=6)를 방어한 이들 동물 비장 세포의 능력을 평가하기 위해 첫 입양 전송에서처럼, 같은 비율로 종양 세포와 섞였다. 일차나 전이성 종양이 관찰되지 않은 것으로 보아, 그룹 C 쥐의 면역 세포는 여섯 마리 중 다섯 마리의 자연 쥐를 방어하였다. 사망한 쥐는 대조군과 비교하여 연장된 생존 시간(60 vs 30 일)과 접종 후 지연된 종양의 출현(37 대 7-10일)을 가졌다. 종양이 재도전 되었을 때 성공적으로 치료된 쥐의 저항성은 종양 선택적 면역성이 장기간 지속되는 효과를 가지고 있음를 시사한다.

면역 세포로 비장세포를 이용한 입양 면역 전달 실험에서 쥐 생존 곡성

그룹 A = 종양 대조군 쥐의 결과

그룹 B = 치료하지 않은 종양 보유 쥐의 비장세포와 섞인 종양세포로 주사된 쥐의 결과

그룹 C = 레이저를 이용한 면역요법으로 성공적으로 치료된 쥐의 비장세포와 섞인 종양세포로 주사된 쥐의 결과

그룹 D = 자연 쥐의 비장세포를 사용한 결과

참고: 데이터는 두 개의 개별 실험에서 수집되어 합친 후 같이 그려졌다.

실시예 13.

레이저를 이용한 면역요법과 저용량의 화학 요법의 결합

하나의 예시적인 임상 연구에서, 두 유방암 환자는 150-200 mg/m²의 양으로 사이클로포스프아마이드(cyclophosphamide)를 주 마다 수여받았다. 환자는 처음에 종양 수축과 최소한의 부작용을 가지고 치료에 잘 반응하였다. 몇 달 뒤에 반응이 느려져서, 종양의는 저용량 화학 요법을 주 처방 75 mg/m²의파크리탁셀(Paclitaxel)로 전환하였고 다시 매우 좋은 종양 축소 반응을 보였다. 새로운 전이는 나타나지 않았다. 환자는 저용량의 화학 요법을 받기를 계속하였다. 세 번 째 환자는 저용량 화학요법 후에 수술을 받을 수 있게 되었고, 유방절제술을 수행받았다. 그러므로 수술과의 결합은 하나의 또한 선택이다.

Claims

살균여과되고 글리케이션된 키토산 중합체 수용액으로 구성되는, 대상(subject) 내에서 종양을 치료하기 위한 점탄성 글리케이션된 키토산 제형으로서,
상기 글리케이션된 키토산 중합체는 50,000 달톤 내지 1,500,000 달톤의 분자량을 갖고,
상기 키토산 중합체의 탈아세틸화 아미노기의 글리케이션 정도가 0.1 내지 30퍼센트의 범위이고,
상기 제형은 살균여과되고 글리케이션된 키토산 중합체 및 상기 수용액으로 구성되고, 상기 대상 내에서 종양을 치료하기 위해 대상에 주사로 투여되도록 제형화된 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제 1항에 있어서,
상기 점탄성 글리케이션된 키토산의 분자량은 250,000 달톤이고, 상기 점탄성 글리케이션된 키토산의 모 키틴의 탈아세틸화 정도는 80퍼센트이고, 상기 키토산의 탈아세틸화 아미노기의 글리케이션 정도가 5퍼센트인, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제 1항에 있어서,
상기 글리케이션된 키토산 중합체는 탈아세틸화 아미노기의 2퍼센트의 글리케이션을 갖는, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제 1항에 있어서,
상기 수용액은 5 내지 7의 pH를 갖는, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제 1항에 있어서,
상기 점탄성 글리케이션된 키토산 제형은 수용액에 용해된 1 중량 퍼센트의 글리케이션된 키토산 중합체를 함유하고, 상기 수용액은 25℃에서 측정된 1 내지 100 센티스토크의 점도를 갖는, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제 1항에 있어서,
상기 점탄성 글리케이션된 키토산 제형은 수용액에 용해된 1 중량 퍼센트의 상기 글리케이션된 키토산 중합체를 함유하고, 상기 글리케이션된 키토산 중합체는 탈아세틸화 아미노기의 0.1 내지 30퍼센트의 글리케이션을 갖고, 상기 수용액은 1 내지 100 센티스토크의 점도를 갖는, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제 1항에 있어서,
상기 점탄성 글리케이션된 키토산 제형은 수용액에 용해된 적어도 1 중량 퍼센트의 상기 글리케이션된 키토산 중합체를 함유하고, 상기 글리케이션된 키토산 중합체는 탈아세틸화 아미노기의 5 퍼센트의 글리케이션을 갖고, 상기 수용액은 대상에 주사로 투여가능한 점도를 갖는, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
면역항원 증강제를 함유하는 직렬적(tandem) 광물리, 열 및 면역학적 치료를 위한 종양 조절용 조성물로서, 상기 면역항원 증강제는 제1항에 따른 점탄성 글리케이션된 키토산 제형을 함유하는, 종양 조절용 조성물.
면역항원 증강제를 함유하는 직렬적 광물리 및 면역학적 치료를 위한 종양 조절용 조성물로서, 상기 면역항원 증강제는 제1항에 따른 점탄성 글리케이션된 키토산 제형을 함유하고, 상기 면역항원 증강제는 종양 특이성 항체에 접합된, 종양 조절용 조성물.
제1항에 따른 점탄성 글리케이션된 키토산 제형을 함유하는, 면역항원 증강제.
살균여과되고 글리케이션된 키토산 중합체 및 수용액으로 구성되는, 대상(subject) 내에서 종양을 치료하기 위한 점탄성 글리케이션된 키토산 제형으로서,
상기 글리케이션된 키토산 중합체는 50,000 달톤 내지 1,500,000 달톤의 분자량을 갖고,
상기 점탄성 글리케이션된 키토산 제형의 점탄성 글리케이션된 키토산의 모 키틴의 탈아세틸화 정도가 80퍼센트이고,
상기 키토산 중합체의 탈아세틸화 아미노기의 글리케이션 정도가 0.1 내지 12.5퍼센트의 범위이고,
상기 제형은 살균여과되고 글리케이션된 키토산 중합체 및 상기 수용액으로 구성되고, 상기 대상 내에서 종양을 치료하기 위해 대상에 주사로 투여되도록 제형화된 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제 11항에 있어서,
상기 수용액은 5 내지 7의 pH를 갖는 용액을 포함하는, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제 11항에 있어서,
상기 점탄성 글리케이션된 키토산 제형은 수용액에 분산된 1 중량 퍼센트의 글리케이션된 키토산 중합체를 함유하고, 상기 수용액은 제형이 대상에 주사 및 투여 가능한 점도를 갖고, 상기 점도가 25℃에서 1 내지 100 센티스토크로 측정되는, 점탄성 글리케이션된 키토산 제형.
제11항에 따른 점탄성 글리케이션된 키토산 제형을 함유하는, 면역항원 증강제.
제14항에 따른 면역항원 증강제를 함유하는 직렬적(tandem) 광물리, 열 및 면역학적 치료를 위한 종양 조절용 조성물로서, 상기 면역항원 증강제는 단독으로 또는 종양 특이성 항원에 접합되는, 종양 조절용 조성물.