ES2829899T3 - Composiciones derivadas del quitosano - Google Patents

Abstract

Una formulacion de quitosano glicado viscoelastico, que consiste en el polimero de quitosano glicado como una solucion acuosa, en donde el polimero de quitosano glicado tiene un peso molecular entre 50 000 Dalton y 250 000 Dalton, en donde el grado de glicacion de los grupos amino libres del polimero de quitosano varia de un decimo del uno por ciento al siete por ciento, en donde el grado de desacetilacion de una quitina original del quitosano glicado viscoelastico es del ochenta por ciento, y en donde la formulacion tiene un pH de 5 a 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones derivadas del quitosano

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a las formulaciones de quitosano glicado viscoelástico, un inmunoadyuvante que comprende la formulación de quitosano glicado viscoelástico de la invención y la formulación de quitosano glicado viscoelástico de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la invención

El quitosano es un derivado de la quitina, un compuesto generalmente aislado de las cáscaras de algunos crustáceos, tales como el cangrejo, la langosta y el camarón. La quitina es un homopolímero lineal compuesto por unidades de N-acetilglucosamina unidas por enlaces glucosídicos p 1 ^4. La quitina, el quitosano (quitina parcialmente desacetilada) y sus derivados están dotados de interesantes propiedades químicas y biológicas que han dado lugar a un número variado y creciente de aplicaciones industriales y médicas. El quitosano glicado, descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 5,747,475 ("Chitosan-Derived Biomaterials") es uno de tales derivados del quitosano.

El cáncer puede desarrollarse en cualquier tejido de cualquier órgano a cualquier edad. Una vez que se hace un diagnóstico inequívoco de cáncer, las decisiones de tratamiento se vuelven primordiales. Aunque no hay un enfoque de tratamiento único aplicable a todos los cánceres, las terapias exitosas deben centrarse tanto en el tumor primario como en sus metástasis. Históricamente, la terapia local y regional, tal como la cirugía o la radiación, se ha usado en el tratamiento del cáncer, junto con la terapia sistémica, por ejemplo, los fármacos de quimioterapia. A pesar de cierto éxito, los tratamientos convencionales no son eficaces en el grado deseado y se ha continuado la búsqueda de terapias más eficaces. Es evidente que existe una importante necesidad insatisfecha de terapias más eficaces contra el cáncer.

Las preparaciones de quitosano glicado convencionales, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm.

5,747,475 ("Chitosan-Derived Biomaterials"), han mostrado una eficacia significativa como inmunoadyuvante en el tratamiento de modelos de tumores metastásicos en animales.

El documento núm. US 2006/189573 A1 describe las preparaciones de quitosano glicado. Mi y otros (2006), Polymer, 47(12):4348-4358, describen la síntesis y la caracterización de un quitosano glicado. El documento núm. US 2010/152430 A1 describe un proceso para preparar los compuestos de quitosano sacarificado con aminoazúcar. Chen y otros (2004), Proceedings of SPIE, 5319:80-86, describen la mejora del quitosano glicado en el tratamiento del cáncer con láser. Zhou y otros (2011), Journal of X-Ray Science and Technology, 19(2):285-292, describen las propiedades inmunoestimuladoras del quitosano glicado. El documento núm. US 591200A describe los métodos y las composiciones para potenciar una respuesta inmunitaria, que incorporan el quitosano como un adyuvante potenciador del sistema inmunitario. Tommeraas y otros (2011), Carhohydrate Polymers 83(4): 1558-1564, describen la preparación y la caracterización de los quitosanos ramificados. El documento núm. EP 1152013 A1 describe un derivado funcional del quitosano. Song y otros (2009), Immunopharmacology and Immunotoxicology, 31(2):202-208, describen el quitosano glicado como estimulante inmunológico no tóxico. Ruel-Gariepy y otros (2004), European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 57(1):53-63, describen un hidrogel termosensible a base de quitosano para la administración local de paclitaxel. Jeon y otros (2002), Journal of Microbiology and Biotechnology, 12(3):503-507, describen la actividad antitumoral de los oligosacáridos de quitosano producidos en un sistema de reactor con membrana de ultrafiltración. Chen y otros (1997), Cancer Letters, 115(1 ):25-30, describen una inmunoterapia asistida por fotosensibilizador y láser. Ta y otros (2008), Journal of Controlled Release, 126(3):205-216, describen los hidrogeles de quitosano inyectables para la terapia localizada del cáncer.

Sin embargo, las preparaciones de quitosano glicado convencionales, cuando se dispersan, se suspenden o se disuelven en soluciones acuosas, a menudo son muy difíciles de inyectar o dispensar en las aplicaciones biomédicas a las que se destinan. Además, las preparaciones de quitosano glicado convencionales, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,747,475 ("Chitosan-Derived Biomaterials"), son casi imposibles de esterilizar por filtración, lo que las hace inadecuadas para la fabricación industrial de acuerdo con las Buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) y, por lo tanto, inadecuadas para el uso humano. Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico mejoradas que estén mucho menos sujetas a las desventajas indicadas anteriormente.

Resumen de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas y las siguientes modalidades.

En una modalidad, la presente invención se refiere a una formulación de quitosano glicado viscoelástico, que consiste en el polímero de quitosano glicado como una solución acuosa, en donde el polímero de quitosano glicado tiene un peso molecular entre 50000 Dalton y 250000 Dalton, en donde el grado de glicación de los grupos amino libres del polímero de quitosano varía desde una décima parte del uno por ciento hasta el siete por ciento, en donde el grado de desacetilación de una quitina original del quitosano glicado viscoelástico es del ochenta por ciento, y en donde la formulación tiene un pH de 5 a 6.

En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a una formulación de quitosano glicado viscoelástico de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.

En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a un inmunoadyuvante que comprende la formulación de quitosano glicado viscoelástico de la invención.

Breve descripción de las figuras

Estos y/u otros aspectos y ventajas de la invención resultarán evidentes y se apreciarán más fácilmente a partir de la siguiente descripción de las modalidades, junto con los dibujos adjuntos de los cuales:

La Figura 1 representa un ejemplo convencional del quitosano glicado, por ejemplo, el galactoquitosano.

La Figura 2 representa una estructura ilustrativa del quitosano glicado viscoelástico de la presente descripción, donde la desacetilación del quitosano original es del 80 % y la glicación de los grupos amino desacetilados totales disponibles es del 12,5 %.

Descripción detallada

La descripción se refiere en general a las formulaciones terapéuticas que comprenden las composiciones derivadas del quitosano usadas en relación con los métodos para tratar las neoplasias y otros trastornos médicos.

Ahora se hará referencia en detalle a determinadas modalidades de la presente invención, cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos adjuntos, en donde los mismos números de referencia se refieren a los mismos elementos en todas partes.

Quitosano glicado

El quitosano glicado es un producto de la glicación (es decir, la glucosilación no enzimática) de los grupos amino libres del quitosano, seguida de la estabilización por reducción. La glicación le confiere al quitosano características favorables de solubilidad y viscosidad que facilitan el uso del derivado junto con la inmunoterapia asistida por láser y otras aplicaciones del derivado. La glicación del quitosano también hace que el quitosano sea más hidrófilo, por lo que el polímero absorbe y retiene más agua de lo que sería en otro caso.

De acuerdo con las modalidades preferidas de la presente invención, un biomaterial derivado del quitosano comprende un homopolímero lineal de quitina desacetilada (quitosano), en donde la quitina desacetilada tiene varios grupos amino libres unidos a un grupo carbonilo de un monosacárido u oligosacárido reductor para formar el quitosano glicado. Por tanto, el quitosano glicado puede obtenerse como producto de la reacción entre el grupo carbonilo de un monosacárido u oligosacárido reductor y los grupos amino libres de la quitina desacetilada. Por tanto, el término "quitosano glicado", como se usa en la presente descripción, se refiere a un producto de la glicación, es decir, la glucosilación no enzimática, de los grupos amino libres del quitosano, seguida de la estabilización por reducción. En términos generales, la glicación (o la glucosilación no enzimática) se refiere a un proceso que ocurre cuando una molécula de azúcar, tal como la fructosa o la glucosa, se une a un sustrato, tal como una proteína o una molécula lipídica, sin la acción contribuyente de una enzima. Un ejemplo de ello es la reacción no enzimática de un azúcar y un grupo amina de una proteína para formar una glucoproteína.

Por tanto, el quitosano glicado incluye generalmente los productos resultantes de la reacción entre los grupos amino libres del quitosano y los grupos carbonilo de los monosacáridos y/o los oligosacáridos reductores. Los productos de esta reacción, que son principalmente una mezcla de bases de Schiff (es decir, el átomo de carbono del grupo carbonilo ahora está doblemente unido al nitrógeno de la amina libre liberando una molécula de agua) y los productos de Amadori (es decir, el átomo de carbono de dicho grupo carbonilo está unido individualmente al átomo de nitrógeno de dicho grupo amino, mientras que un átomo de carbono adyacente está unido por dos enlaces a un átomo de oxígeno) pueden usarse como tales, o después de la estabilización por reducción con hidruros, tales como los agentes reductores de hidruro de boro, por ejemplo NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)³ , etc., o por la exposición al hidrógeno en presencia de catalizadores adecuados.

La presencia de grupos alcohólicos primarios y secundarios, y de grupos amino primarios en el quitosano, facilita una serie de enfoques para las modificaciones químicas diseñadas principalmente para lograr su solubilización y para impartir propiedades especiales para las aplicaciones específicas.

La solubilización de la quitina y el quitosano puede lograrse mediante la hidrólisis parcial a los oligosacáridos. Para el quitosano, el tratamiento con una variedad de ácidos, tanto orgánicos como inorgánicos, conduce a la formación de sales de quitosonio solubles en agua mediante la protonación de los grupos amino libres. Las modificaciones adicionales de los grupos amino incluyen la introducción de grupos químicos tales como el carboximetilo, el glicerilo, el N-hidroxibutilo y otros. La glicación, es decir, la glucosilación no enzimática de los grupos amino libres del quitosano, seguida de la estabilización por reducción, ofrece un enfoque preferido para la preparación de diversas formulaciones farmacéuticas usadas en la presente invención.

Con fines ilustrativos, en la Figura 1 se muestra un ejemplo convencional del quitosano glicado, por ejemplo, el galactoquitosano, que también se describe e ilustra en la patente de los Estados Unidos núm. 5,747,475.

Estructura

fabricacion

La Figura 1 es una estructura ilustrativa del quitosano glicado convencional, donde el peso molecular es aproximadamente 1500000 Dalton y todos los grupos amino están glicados.

La patente de los Estados Unidos núm. 5,747,475 es muy limitada en su descripción y describe solo un galactoquitosano específico en términos de peso molecular; específicamente, la patente de los Estados Unidos núm.

5,747,475 solo describe el galactoquitosano con un peso molecular de 1500 kDa.

A diferencia del galactoquitosano convencional de 1500 kDa descrito en la patente de los Estados Unidos núm.

5,747,475, debe entenderse claramente que el quitosano glicado de la presente descripción como se describe en la presente descripción pretende incluir el quitosano glicado que tiene un peso molecular in fe rio r a 1500 kDa. Además, a diferencia de los quitosanos convencionales, el quitosano glicado de la presente invención es una composición de materia completamente diferente y novedosa con una serie de propiedades, beneficios y ventajas sorprendentemente inesperados, que incluyen propiedades viscoelásticas inesperadamente beneficiosas.

El quitosano glicado de la presente invención está en la forma de una base de Schiff, un producto de Amadori, o preferentemente, en su amina secundaria reducida o alcohol, respectivamente. En otra modalidad, el quitosano glicado incluye un grupo reactivo carbonilo. Se prefiere que el quitosano glicado de la presente invención se obtenga al hacer reaccionar el quitosano con un monosacárido y/u oligosacárido, preferentemente en presencia de un agente acidificante, durante un tiempo suficiente para lograr la formación de la base de Schiff entre el grupo carbonilo del azúcar y el grupos amino primarios del quitosano (también denominados en la presente descripción como la glicación del grupo amino) hasta un grado en el que se logra de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 30 % (y con la máxima preferencia por encima del 2 %) de la glicación de los grupos amino del polímero de quitosano. A esto le sigue preferentemente la estabilización por reducción de las bases de Schiff y de sus derivados reordenados (productos de Amadori) a las aminas secundarias o los alcoholes.

La presente descripción es la primera demostración mediante la cual se logra de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 30 % (y con la máxima preferencia por encima del 2 %) de la glicación del polímero de quitosano. Al contrario de la presente invención, otros no han logrado ni han reconocido este resultado significativo. Por tanto, de acuerdo con un aspecto, la presente descripción proporciona una formulación de quitosano glicado viscoelástico, que consiste esencialmente en el polímero de quitosano glicado, en donde el polímero de quitosano glicado tiene un peso molecular entre aproximadamente 50 000 Dalton y aproximadamente 1 500 000 Dalton, y además en donde el polímero de quitosano glicado posee de aproximadamente una décima parte del uno por ciento a aproximadamente el treinta por ciento de glicación de sus grupos amino libres.

Los productos resultantes de la glucosilación no enzimática de los grupos amino libres del quitosano son, por tanto, principalmente una mezcla de bases de Schiff, es decir, el átomo de carbono del grupo carbonilo inicial unido por dos enlaces al átomo de nitrógeno del grupo amino (también conocido como grupo imina funcional), y los productos de Amadori, es decir, el átomo de carbono del grupo carbonilo inicial unido al átomo de nitrógeno de dicho grupo amino por un enlace sencillo mientras que un átomo de carbono adyacente está unido por dos enlaces a un átomo de oxígeno formando un grupo cetona. Estos productos (resultantes del proceso de glucosilación no enzimática) pueden usarse como tales, o después de la estabilización por reducción con hidruros, tales como los agentes reductores de hidruro de boro, por ejemplo NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)³ , etc., o por la exposición al hidrógeno en presencia de catalizadores adecuados.

La desaminación del quitosano con el ácido nitroso puede usarse para generar aldosas reductoras y oligosacáridos adecuados para la glicación del quitosano. La desaminación de los residuos del glucosaminilo desacetilado por el ácido nitroso da como resultado la ruptura selectiva de sus enlaces glucosídicos con la formación de residuos de 2,5-anhidro-D-manosa. Dependiendo de la composición de áreas específicas de la cadena del quitosano, la hexosa anhidra podría liberarse como el monosacárido u ocupar el extremo reductor de un oligosacárido. La liberación de la N-acetilglucosamina libre también podría ocurrir en algunas regiones de la cadena del quitosano. Puede usarse un tratamiento similar de glucoproteínas y glucolípidos N-desacetilados para obtener los oligosacáridos de composición química y actividad biológica definidas para las preparaciones especiales de quitosano glicado.

Varios productos obtenidos por la glicación del quitosano se usarán como tales o se harán reaccionar con otros materiales naturales o sintéticos, por ejemplo, la reacción de derivados del quitosano glicado que contienen aldehído con sustancias que contienen dos o más grupos amino libres, tales como en las cadenas laterales de los aminoácidos ricos en residuos de lisina como en el colágeno, en los residuos de hexosamina como en el quitosano y los glucoconjugados desacetilados, o en las diaminas y las poliaminas naturales y sintéticas. Se espera que esto genere la reticulación a través de la formación de la base de Schiff y posteriores reordenamientos, condensación, deshidratación, etc. La estabilización de los materiales de quitosano glicado modificado puede realizarse mediante la reducción química o el curado que implica los reordenamientos, la condensación o la deshidratación, ya sea espontánea o por incubación en diversas condiciones de temperatura, humedad y presión. La química de los reordenamientos de Amadori, las bases de Schiff y la reacción de Leukart-Wallach se detallan en The Merck Index, Novena edición (1976) págs. ONR-3, ONR-55 y ONR-80, Library of Congress Card No. 76-27231. La química de las reacciones de adición nucleófila aplicables a la presente invención se detalla en el Capítulo 19 de Morrison y Boyd, Organic Chemistry, Segunda Edición (octava impresión 1970), Library of Congress Card No. 66-25695.

Como se describe adicionalmente en la presente descripción, se ha descubierto de forma sorprendente los tipos particulares (por ejemplo, tipos particulares de azúcares reductores) y los grados de glicación que dotan al quitosano de características de solubilidad inesperadas y favorables que facilitan el uso del quitosano glicado junto con la inmunoterapia asistida por láser y otras aplicaciones terapéuticas. La glicación del quitosano también hace que el quitosano sea favorablemente más hidrófilo, por lo que el polímero absorbe y retiene más agua de lo que sería en otro caso. El derivado de D-galactosa del quitosano es particularmente preferido en la medida en que la D-galactosa tiene una incidencia natural relativamente mayor de su forma de cadena abierta. El quitosano glicado puede prepararse en cualquier número de formulaciones adecuadas que incluyen, por ejemplo, una forma de polvo, una formulación viscosa o cualquier otra forma adecuada.

De acuerdo con otras modalidades preferidas de la invención, el quitosano puede glicarse no enzimáticamente mediante el uso de cualquiera de varios azúcares reductores iguales o diferentes, por ejemplo, los mismos o diferentes monosacáridos y/u oligosacáridos. Ejemplos de tales agentes de glucosilación de monosacáridos son las D-triosas, D-tetrosas, D-pentosas, D-hexosas, D-heptosas de origen más natural y similares, como D-glucosa, D-galactosa, D-fructosa, D-manosa, D-alosa, D-altrosa, D-idosa, D-talosa, D-fucosa, D-arabinosa, D-gulosa, D-hamelosa, D-lixosa, D-ribosa, D-ramnosa, D-treosa, D-xilosa, D-psicosa, D-sorbosa, D-tagatosa, D-gliceraldehído, dihidroxiacetona, D-eritrosa, D-treosa, D-eritrulosa, D-manoheptulosa, D-sedoheptulosa y similares. Los oligosacáridos adecuados incluyen los fructooligosacáridos (FOS), los galactooligosacáridos (GOS), los mananooligosacáridos (MOS) y similares.

Propiedades viscoelásticas preferidas

Los productos de quitosano producidos convencionalmente, cuando se dispersan, se suspenden o se disuelven en soluciones acuosas, son muy difíciles de producir de acuerdo con las GMP estándares y tienen una serie de desventajas en términos de la administración y otros usos.

Las modalidades preferidas de la presente invención superan las necesidades no satisfechas durante mucho tiempo de los productos de quitosano terapéuticos mejorados al proporcionar preparaciones de quitosano glicado viscoelástico mejoradas que no están sujetas a las desventajas de los enfoques convencionales.

El término "viscoelástico", como se usa en la presente descripción, se refiere a la viscosidad de una composición, preparación o formulación particular. La viscosidad se entiende bien como una medida de la resistencia de un fluido que se deforma por tensión de cizallamiento o por tensión de tracción. En otras palabras, la viscosidad describe la resistencia interna de un fluido al flujo y puede considerarse como una medida de la fricción del fluido.

a. Mejoras inesperadas en la inyectabilidad de las preparaciones de GC

Se ha descubierto de forma sorprendente e inesperada que la inyectabilidad de las formulaciones de quitosano glicado (GC), por ejemplo, las soluciones o las suspensiones, depende de manera no obvia de la viscosidad y las propiedades reológicas del GC. Estas propiedades, a su vez, dependen en gran medida del peso molecular del GC, el grado de polimerización de la quitina original al quitosano, el grado de desacetilación de la quitina original y el grado de glicación del quitosano. Estas últimas propiedades determinan el grado de entrelazamiento de las cadenas poliméricas del GC, así como también el grado de enlace del hidrógeno intramolecular ocasionado por el número y la naturaleza de los sustituyentes presentes en la molécula del GC (es decir, acetilo y sacárido), los cuales contribuyen significativamente a la viscosidad y otras propiedades reológicas de las soluciones preparadas a partir de este.

Se ha descubierto de forma sorprendente e inesperada que las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico mejoradas de la presente invención poseen numerosas ventajas, por ejemplo, (i) la administración de una preparación no tóxica para el tratamiento de las neoplasias en un paciente; (ii) una inyectabilidad muy superior (por ejemplo, a través de agujas de diferente calibre) en un entorno clínico en comparación con los tratamientos convencionales; (iii) la filtración estéril mejorada de las preparaciones viscoelásticas; y (iv) una opción de tratamiento menos dolorosa y, por tanto, mejorada para los pacientes. El término "inyectabilidad", como se usa en la presente descripción, se refiere a la facilidad con la que una formulación o preparación, por ejemplo, una formulación que comprende el quitosano glicado (GC), se inyecta en un sujeto.

De acuerdo con una modalidad preferida, la invención proporciona una preparación viscoelástica inyectable que comprende aproximadamente un 1 por ciento en peso del quitosano glicado anteriormente descrito disperso, suspendido o disuelto en una solución acuosa.

Las modalidades preferidas de la invención incluyen las preparaciones de quitosano glicado, que incluyen, por ejemplo, las soluciones o las suspensiones, que tienen una viscosidad que hace que las preparaciones sean fácilmente inyectables mediante una aguja con un calibre de aguja relativamente grande (G), lo que reduce de este modo el dolor y la incomodidad del sujeto. Los ejemplos preferidos de las agujas de calibre relativamente grande incluyen las agujas que tienen las siguientes dimensiones: un diámetro interior nominal de aproximadamente 0,337 mm (23 G) a aproximadamente 0,210 mm (27 G).

De acuerdo con un ejemplo, una preparación de quitosano glicado viscoelástico se administra por inyección mediante el uso de una aguja de inyección que tiene un diámetro de aproximadamente 20 G a aproximadamente 22 G, y una longitud eficaz de un tubo de la aguja de inyección de aproximadamente 1000 mm o más, de modo que la tasa de flujo de entrada de la preparación inyectable, cuando se inyecta a una presión de aproximadamente dos a aproximadamente tres atmósferas a través de dicha aguja de inyección, varía de aproximadamente 0,05 ml/segundo a 0,1 ml/segundo. De acuerdo con otro ejemplo, también puede administrarse una preparación de quitosano glicado viscoelástico por inyección mediante el uso de una aguja de inyección que tiene un diámetro de aproximadamente 25 G a aproximadamente 27 G. Debe entenderse que también puede administrarse una preparación de quitosano glicado viscoelástico de acuerdo con la presente invención mediante el uso de cualquier otro instrumento o aguja de calibre adecuado.

Se ha descubierto de forma sorprendente que las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico de la presente invención, por ejemplo, las soluciones o las suspensiones, son inyectables en un intervalo relativamente amplio de concentraciones a través de catéteres o agujas de los calibres más comúnmente usados.

También se ha descubierto que estas preparaciones de quitosano glicado viscoelástico mejoradas (es decir, mediante la mejora de la viscosidad y las propiedades reológicas de las composiciones de quitosano glicado) también mejoran inesperadamente la facilidad general de la administración de la preparación a un sujeto; también pueden mejorarse la eficacia de la administración por parte del individuo que administra la formulación (por ejemplo, la enfermera, el médico u otro profesional sanitario) y la conformidad y la eficacia de las formulaciones de quitosano glicado.

b. Mejoras inesperadas en la fabricación y la filtración

También se ha descubierto de forma sorprendente que la filtración estéril se mejora inesperadamente mediante el uso de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico mejoradas de la presente invención. Se demostró que las preparaciones de quitosano glicado convencionales, como se describen en la patente de los Estados Unidos núm.

5,747,475 ("Chitosan-Derived Biomaterials"), son muy difíciles de esterilizar por filtración a través de un filtro estéril de 0,22 um, lo que las hace inadecuadas para la fabricación comercial de acuerdo con las cGMP. Por el contrario, el quitosano glicado viscoelástico mejorado, que se descubrió que tiene propiedades reológicas no evidentes, demostró ser muy adecuado para la filtración estéril, la fabricación de acuerdo con las cGMP y el uso humano.

Además, se ha descubierto de forma sorprendente que la diafiltración y la ultrafiltración se mejoran inesperadamente mediante el uso de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico mejoradas de la presente invención. Las preparaciones de quitosano glicado convencionales eran difíciles de diafiltrar y ultrafiltrar, lo que provocaba que el filtro se obstruyera, lo que las hacía inadecuadas para la fabricación comercial de acuerdo con las cGMP. El quitosano glicado viscoelástico mejorado, por otro lado, era muy adecuado para la diafiltración y la ultrafiltración, lo que mejoró de este modo significativamente el proceso de fabricación.

Métodos ilustrativos para la determinación de la viscosidad

Puede usarse cualquier número de técnicas adecuadas en las técnicas químicas para determinar de forma confiable y precisa la viscosidad de una formulación de quitosano glicado.

Debe entenderse que la viscosidad puede medirse de forma confiable con varios tipos de instrumentos, por ejemplo, los viscosímetros y los reómetros. Un reómetro se usa para aquellos fluidos que no pueden definirse por un solo valor de viscosidad y, por lo tanto, requieren que se establezcan y midan más parámetros que en el caso de un viscosímetro. El control estricto de la temperatura del fluido es esencial para obtener mediciones precisas, particularmente en materiales como los lubricantes, cuya viscosidad puede duplicarse con un cambio de solo 5 °C.

De acuerdo con la presente invención, la viscosidad de una preparación de quitosano glicado puede determinarse de acuerdo con cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Por ejemplo, la viscosidad puede medirse de forma confiable en unidades de centipoise. El poise es una unidad de viscosidad dinámica en el sistema cegesimal de unidades. Un centipoise es la centésima parte de un poise y un milipascal-segundo (mPas) en las unidades del SI (1 cP = 10-2 P = 10-3 Pas). El centipoise se abrevia correctamente cP, pero también se ven comúnmente las abreviaturas alternativas cps, cp y cPs. Puede usarse un viscosímetro para medir el centipoise. Al determinar el centipoise, es típico que todos los demás fluidos se calibren a la viscosidad del agua.

Determinación ilustrativa de la viscosidad de las preparaciones de quitosano glicado

Existen numerosos factores que afectan la viscosidad de las soluciones y, en particular, las soluciones de polímeros, distintos del peso molecular. En el caso del quitosano glicado (GC), la inyectabilidad de las soluciones de GC depende en gran medida de la viscosidad y las propiedades reológicas del GC en solución. Estas propiedades, a su vez, dependen en gran medida del peso molecular del GC, el grado de polimerización de la quitina original al quitosano, el grado de desacetilación de la quitina original y el grado de glicación del quitosano. Estas últimas propiedades determinan el grado de entrelazamiento de las cadenas poliméricas del GC, así como también el grado de enlace del hidrógeno intramolecular ocasionado por el número y la naturaleza de los sustituyentes presentes en la molécula del GC (es decir, acetilo y sacárido), los cuales contribuyen significativamente a la viscosidad de las soluciones preparadas a partir de este.

Se ha descubierto de forma sorprendente que la viscosidad mejorada y las propiedades reológicas de las preparaciones de quitosano glicado son, a su vez, muy dependientes de las propiedades fisicoquímicas particulares del quitosano glicado. El término "propiedad fisicoquímica", como se usa en la presente descripción, pretende incluir, pero no se limita a, cualquier propiedad física, química o fisicoquímica de una estructura molecular, tal como el quitosano glicado. Como se describe más adelante en la presente descripción, algunos ejemplos de estas propiedades fisicoquímicas son:

(i) el peso molecular del quitosano glicado;

(ii) el grado de polimerización de la quitina original al quitosano;

(iii) el grado de desacetilación de la quitina original; y

(iv) el grado de glicación del quitosano.

La Figura 2 muestra un ejemplo de un quitosano glicado viscoelástico de la presente descripción, donde el peso molecular es aproximadamente 250 kDa, el grado de desacetilación de la quitina original es aproximadamente el 80 % y el grado de glicación de los grupos amino libres en el quitosano es aproximadamente el 12,5 %.

La Figura 2 es una estructura ilustrativa del quitosano glicado viscoelástico de la presente descripción, donde la desacetilación del quitosano original es aproximadamente el 80 % y la glicación de los grupos amino desacetilados totales disponibles es aproximadamente el 12,5 %.

(i) Peso molecular del quitosano glicado

Puede usarse cualquier número de técnicas adecuadas en las técnicas químicas para determinar de forma confiable y precisa el peso molecular (MW) del quitosano glicado.

En aspectos de la descripción, se prefiere que una preparación de quitosano glicado viscoelástico se prepare como una formulación inyectable que comprenda el quitosano glicado con un peso molecular (MW) inferior a aproximadamente 1500 kDa. Los ejemplos de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico comprenden el quitosano glicado con un peso molecular (MW) de entre aproximadamente 50 kilodalton (kDa) y aproximadamente 1500 kDa.

En determinados aspectos de la descripción, una preparación de quitosano glicado viscoelástico comprende el quitosano glicado con un peso molecular (MW) de entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 1000 kDa; y con mayor preferencia, entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 300 kDa. Pueden usarse varias técnicas para determinar con precisión el peso molecular.

La invención abarca las composiciones derivadas del quitosano que comprenden los derivados del quitosano que son solubles o dispersables en agua. De acuerdo con la presente invención, también se ha descubierto de forma sorprendente que, en determinadas modalidades, con el aumento del peso molecular (MW), se requiere más agua para solubilizar el quitosano glicado (GC). Esto, a su vez, significa que hay menos cantidad de agua "libre", es decir, no unida por enlaces de hidrógeno al GC (asumiendo que no se agrega agua adicional a la solución), lo que en sí mismo contribuye a una mayor viscosidad. Como se muestra en el Ejemplo 3 a continuación, se ha encontrado inesperadamente que este resultado se suma al aumento de la viscosidad que viene dado por el tamaño creciente de la molécula, dando una relación exponencial (o algo similar), en lugar de una relación lineal entre la viscosidad y el MW (cuando se compensa la concentración).

(ii) Grado de polimerización (DP) de la quitina original al quitosano

El grado de polimerización (DP) de la quitina original al quitosano puede determinarse de forma confiable y precisa de acuerdo con cualquier número de métodos o técnicas adecuados conocidos en las técnicas químicas.

En un enfoque, se prefiere que el grado de polimerización (DP) se determine dividiendo el peso molecular del quitosano por el peso molecular del enlace glucosamina.

(iii) Grado de desacetilación de la quitina original

Otra propiedad fisicoquímica es el grado de desacetilación de la quitina original. Puede usarse cualquier número de técnicas adecuadas en las técnicas químicas para determinar de forma confiable y precisa el grado de desacetilación de la quitina original.

La RMN es una técnica que puede usarse para determinar el grado de desacetilación de la quitina o el quitosano.

(iv) Grado de glicación del quitosano

Puede usarse cualquier número de técnicas adecuadas en las técnicas químicas para determinar de forma confiable y precisa el grado de glicación del quitosano.

La RMN es una técnica que puede usarse para detectar y medir la unión de monosacáridos y/u oligosacáridos al polímero de quitosano.

El análisis de combustión elemental C/N es otra técnica que puede usarse para determinar el porcentaje de glicación del quitosano glicado mediante la comparación de la relación C/N del quitosano glicado frente al quitosano original.

La digestión enzimática acoplada con la HPLC es otra técnica que puede usarse para determinar el porcentaje de glicación.

Debe entenderse que también pueden usarse otros métodos analíticos e instrumentación adecuados para la detección, la medición y la identificación simultáneas de múltiples componentes en una muestra, por ejemplo, para la detección, la medición y la identificación simultáneas del quitosano glicado y no glicado en una muestra.

La medición colorimétrica de los productos químicos unidos a los grupos amino libres restantes, tal como mediante una reacción con ninhidrina, puede usarse para evaluar el grado de glicación.

Por tanto, se ha encontrado que los quitosanos glicados que tienen pesos moleculares, grados de polimerización de la quitina original al quitosano, grados de desacetilación de la quitina original y grados de glicación del quitosano preferidos permiten una preparación mejorada de las soluciones de quitosano glicado que son inyectables en un intervalo relativamente amplio de concentraciones del quitosano glicado a través de catéteres o agujas de calibres de uso común.

Métodos preferidos para preparar el quitosano glicado

Otros aspectos más de la descripción se refieren a los métodos para la preparación de las formulaciones de quitosano glicado. El quitosano glicado se obtiene preferentemente al hacer reaccionar el quitosano con un monosacárido y/u oligosacárido, preferentemente en presencia de un agente acidificante, durante un tiempo suficiente para lograr la formación de la base de Schiff entre el grupo carbonilo del azúcar y los grupos amino primarios del quitosano (también denominada en la presente descripción como la glicación del grupo amino) en un grado en el que se logra al menos algún porcentaje (por ejemplo, dos por ciento o más) de glicación del polímero de quitosano. A esto le sigue preferentemente la estabilización por reducción de las bases de Schiff y de sus derivados reorganizados (productos de Amadori) a sus aminas secundarias o alcoholes, respectivamente. Pueden usarse los registros de la RMN para verificar la unión de los monosacáridos y/o los oligosacáridos al polímero de quitosano, mientras que la medición química de los grupos amino libres restantes, tal como mediante una reacción con ninhidrina, puede usarse para evaluar el grado de glicación.

En modalidades preferidas, las condiciones pueden ajustarse según sea necesario para mejorar los resultados deseados durante la fabricación del quitosano glicado. Por ejemplo, se ha descubierto inesperadamente, de acuerdo con la presente invención, que pueden lograrse mejoras en la fabricación del quitosano glicado mediante el control de las condiciones de pH, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 4.

De acuerdo con un ejemplo de la preparación de quitosano glicado para su uso en la presente invención, se disuelven aproximadamente tres gramos de un monosacárido reductor (por ejemplo, glucosa, galactosa, ribosa), o una cantidad equivalente de un oligosacárido reductor, en 100 ml de agua destilada bajo agitación magnética suave en un matraz Erlenmeyer. A continuación, se añade aproximadamente un gramo de quitosano y, posteriormente, pueden realizarse las etapas del proceso adecuadas para producir la preparación de quitosano glicado con las propiedades viscoelásticas deseadas y las características de pureza deseadas.

Un método ilustrativo para la producción del quitosano a escala industrial implica las siguientes cuatro etapas: la ^{desmineralización (DM), la desproteinización} (Dp), ^{la decoloración (DC) y la desacetilación (DA). La extracción de} quitina de, por ejemplo, las conchas de crustáceos se llevan a cabo mediante un tratamiento con ácido alcalino. Las muestras se desproteinizan tratándolas con una formulación alcalina, se desmineralizan con ácido y se decoloran con un disolvente orgánico (por ejemplo, acetona), seguido de blanqueo (con, por ejemplo, hipoclorito de sodio). La desacetilación de la quitina se lleva a cabo mediante el uso de, por ejemplo, una formulación de hidróxido de sodio. El grado de polimerización del quitosano se ajusta mediante la despolimerización; siendo los procedimientos más convenientes (1) la degradación con ácido nitroso en agua deuterada. La reacción es selectiva, estequiométrica con respecto a GlcN, rápida y fácilmente controlada, (2) la despolimerización por hidrólisis ácida o (3) la degradación enzimática con una preparación comercial (Pectinex Ultra Spl). El método enzimático produce fragmentos más cortos con una mayor proporción de quitooligómeros completamente desacetilados. Por el contrario, la hidrólisis ácida del quitosano de partida da como resultado fragmentos con grados de polimerización de hasta dieciséis y más residuos monoacetilados que con el procedimiento enzimático.

Aminoazúcares glicados polimerizados

Como se describe en la presente descripción, el quitosano (quitina parcialmente desacetilada) es un derivado de la quitina (un homopolímero lineal compuesto por unidades de N-acetilglucosamina unidas por enlaces p 1 ^4 glucosídicos). Por tanto, las composiciones derivadas del quitosano comprenden un homopolímero de quitina parcialmente desacetilada, en donde la quitina parcialmente desacetilada tiene varios grupos amino libres unidos a un grupo carbonilo de un monosacárido u oligosacárido reductor que genera un enlace imina (base de Schiff) o un producto relacionado (Reordenamiento de Amadori) y libera una molécula de agua.

Dado que la quitina y el quitosano son polímeros de glucosamina, la presente invención también contempla la glucosamina glicada no enzimáticamente, por ejemplo, los monómeros de glucosamina glicada o las unidades de glucosamina glicada. En otras palabras, la presente invención también contempla la glicación no enzimática de los monómeros de aminoazúcares en general.

Por ejemplo, un ejemplo es una glucosamina glicada en donde el sustituyente N es una galactosa. Se prefiere que la glicación de los monómeros de glucosamina se realice después de que al menos un porcentaje de los monómeros de glucosamina se haya desacetilado inicialmente.

Además, la presente descripción también contempla (1) los polímeros de las unidades de glucosamina glicada (aminoazúcares glicados polimerizados), (2) los polímeros de la combinación de glucosaminas glicadas y no glicadas y (3) las combinaciones de los polímeros de glucosamina glicada y no glicada en donde:

(i) el porcentaje de los monómeros de glucosamina no desacetilada es de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 %;

(ii) el grado de polimerización (de las diversas combinaciones de las unidades de glucosamina desacetilada, no desacetilada, glicada y no glicada) es de aproximadamente xn=300 a aproximadamente xn=8000, con la máxima preferencia de aproximadamente xn=1500; y/o

(iii) el porcentaje de glicación de los grupos amino libres de la glucosamina polimerizada desacetilada es de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 30 %.

La presente invención también contempla los usos de los polímeros de glucosamina glicada polimerizada que son iguales o similares a los usos del quitosano glicado. Estos incluyen, por ejemplo, las propiedades y los usos inmunoadyuvantes, por ejemplo, en el contexto de las vacunas contra el cáncer in situ (inCVAX), tales como la inmunoterapia asistida por láser (LIT).

Formulaciones y aplicaciones ilustrativas

Los ejemplos de varios tipos de formulaciones o preparaciones farmacéuticamente aceptables que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, las soluciones, las suspensiones y otros tipos de formulaciones líquidas o semilíquidas para la inyectabilidad de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico. Por ejemplo, las formulaciones o las preparaciones farmacéuticamente aceptables pueden incluir el quitosano glicado disperso, suspendido o disuelto en formulaciones sustancialmente acuosas. Mediante el uso del término "sustancialmente acuosa" debe entenderse que las formulaciones o las preparaciones, en determinadas modalidades, pueden incluir algún porcentaje de uno o más componentes no acuosos y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

De acuerdo con un ejemplo, una preparación viscoelástica se formula preferentemente como una solución acuosa que posee un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 7.

También puede formularse una preparación viscoelástica como una solución acuosa que comprende una solución salina fisiológica amortiguada que consiste esencialmente en el quitosano glicado.

También puede formularse una preparación viscoelástica que consiste esencialmente en el polímero de quitosano glicado, en donde el polímero de quitosano glicado posee de aproximadamente un décimo (0,1) del uno por ciento a aproximadamente el treinta (30) por ciento de glicación de sus grupos amino libres.

En otra modalidad, puede formularse una preparación viscoelástica que consiste esencialmente en el polímero de quitosano glicado (GC), en donde el polímero de quitosano glicado posee aproximadamente el dos (2) por ciento de glicación de sus grupos amino libres.

En otro aspecto de la descripción, puede formularse una preparación viscoelástica que consiste esencialmente en el polímero de quitosano glicado, en donde el polímero de quitosano glicado tiene un peso molecular entre aproximadamente 50000 y aproximadamente 1500000 Dalton.

Otro ejemplo incluye una preparación de GC viscoelástico que comprende aproximadamente el uno (1) por ciento en peso de un polímero de quitosano glicado disperso en una solución acuosa, teniendo dicha solución acuosa una viscosidad de entre aproximadamente uno (1) y aproximadamente cien (100) centistokes medidos a unos 25 grados Celsius.

Otro ejemplo más incluye una solución acuosa que tiene aproximadamente el uno por ciento en peso del quitosano glicado y de aproximadamente un décimo (0,1) del uno por ciento a aproximadamente el treinta (30) por ciento de glicación de grupos amino libres de dicho quitosano glicado, en donde la solución acuosa tiene una viscosidad de aproximadamente un (1) centistokes a aproximadamente cien (100) centistokes.

En otra modalidad más, puede formularse una preparación viscoelástica que consiste esencialmente en el polímero de quitosano glicado como una solución acuosa, que comprende aproximadamente o más del uno por ciento en peso del polímero de quitosano glicado disperso en una solución acuosa, en donde el polímero de quitosano glicado posee aproximadamente el dos (2) por ciento de glicación de sus grupos amino libres, y en donde la solución acuosa tiene una viscosidad adecuada para facilitar la inyectabilidad y la administración a un sujeto.

En otra modalidad más, puede formularse una preparación viscoelástica que consiste esencialmente en el polímero de quitosano glicado como una solución acuosa, que además contiene uno o más materiales viscoelásticos diferentes miscibles en una solución acuosa. Los ejemplos de los materiales viscoelásticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, el ácido hialurónico, el condroitín sulfato y la carboximetilcelulosa.

La preparación viscoelástica puede incluir un polímero de quitosano glicado que comprende un monosacárido unido a un grupo amino libre. El polímero de quitosano glicado puede tomar cualquier forma adecuada, tal como una base de Schiff, un producto de Amadori o las mezclas de estos. El polímero de quitosano glicado también puede estar en la forma de una base de Schiff reducida (amina secundaria), un producto de Amadori reducido (alcohol) o las mezclas de estos.

La preparación viscoelástica también puede formularse en donde el polímero de quitosano glicado posee varios sustituyentes de monosacáridos u oligosacáridos químicamente modificados. En una modalidad, el monosacárido comprende la galactosa.

Las formulaciones o las preparaciones de la invención preferentemente también contienen el quitosano glicado en un portador fisiológicamente compatible. "Fisiológicamente compatible", como se usa en la presente descripción, debe entenderse que se refiere a los materiales que, cuando están en contacto con los tejidos del cuerpo, no son dañinos para los mismos. En este contexto, se pretende que el término incluya, pero no se limite a, las formulaciones acuosas (por ejemplo, las soluciones) que son aproximadamente isotónicas con el entorno fisiológico de interés. Algunas veces, las formulaciones no isotónicas (por ejemplo, las soluciones) también pueden ser clínicamente útiles, tales como por ejemplo los agentes deshidratantes. Los componentes adicionales de las soluciones de la invención pueden incluir diversas sales, tales como, por ejemplo, NaCl, KCl, CaCl² , MgCl² y amortiguadores a base de Na.

Los objetos anteriores y otros se realizan mediante la presente invención, de las cuales determinadas modalidades preferidas se refieren a las preparaciones de quitosano glicado que tienen propiedades fisicoquímicas particulares que confieren propiedades inesperadas y sorprendentemente beneficiosas.

La presente descripción también abarca una amplia gama de usos de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico que tienen propiedades sorprendentes e inesperadas como inmunoadyuvantes, por ejemplo, en relación con las vacunas autólogas contra el cáncer in situ, tales como la inmunoterapia asistida por láser para el cáncer, como se describe más adelante en la presente descripción.

Las modalidades preferidas de la invención proporcionan los inmunoadyuvantes que comprenden una formulación viscoelástica inyectable de la invención. Por tanto, otro objetivo de la presente invención es proporcionar las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico mejoradas para otras aplicaciones terapéuticas, incluido el uso terapéutico como un inmunoadyuvante e inmunomodulador.

La presente invención también abarca varias vías de administración de las formulaciones inmunoadyuvantes de quitosano glicado viscoelástico, como por ejemplo mediante inyección. En un enfoque preferido, el inmunoadyuvante se prepara preferentemente como una formulación para inyección dentro o alrededor de la masa tumoral. Sin embargo, debe reconocerse que otros métodos pueden ser suficientes para localizar el inmunoadyuvante en el sitio del tumor. Uno de dichos medios de administración alternativos es la conjugación del inmunoadyuvante con un anticuerpo específico del tejido o un antígeno específico del tejido, de manera que se potencia la administración al sitio del tumor. Cualquier método, o una combinación de varios métodos, para localizar el inmunoadyuvante en el sitio del tumor es aceptable siempre que el mecanismo de administración asegure una concentración suficiente del inmunoadyuvante en la neoplasia.

De acuerdo con determinadas modalidades preferidas, la presente descripción proporciona diversas formulaciones farmacéuticas que comprenden el quitosano glicado viscoelástico usado en relación con las vacunas autólogas contra el cáncer in situ (inCVAX), tales como la inmunoterapia asistida por láser, la terapia fotodinámica (PDT) contra el cáncer y/u otros métodos de inmunoterapia tumoral, como se describe con más detalle en la presente descripción. Se ha observado que es conveniente usar las preparaciones de quitosano glicado que tengan una viscosidad adecuada que permita su uso como una formulación inyectable u otra como un inmunoadyuvante en aplicaciones, tales como las inCVAX y/o la PDT y/o los métodos de inmunoterapia tumoral. Tales aplicaciones típicamente implican la inyección de la formulación de quitosano glicado viscoelástico en el cuerpo de un paciente. El término "inmunoadyuvante", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier molécula, composición o sustancia que actúa para mejorar la respuesta del sistema inmunitario a un antígeno; por ejemplo, el quitosano glicado que actúa para mejorar la respuesta del sistema inmunitario a un antígeno tumoral.

La composición inmunoadyuvante puede incluir además un anticuerpo específico del tumor conjugado con el quitosano glicado. La composición inmunoadyuvante también puede incluir un antígeno específico del tumor conjugado con el quitosano glicado. El quitosano glicado puede incluir además un grupo reactivo carbonilo.

De acuerdo con una modalidad preferida, la presente invención proporciona un inmunoadyuvante que incluye una suspensión o una solución de la formulación de quitosano glicado viscoelástico de la invención. En esta modalidad preferida, el quitosano glicado viscoelástico se usa en relación con el tratamiento fototérmico de una neoplasia sin el uso de un cromóforo, en el que la energía luminosa se suministra directamente a la neoplasia. La energía luminosa puede administrarse por vía tópica si la neoplasia es accesible en la superficie del tejido (por ejemplo, el melanoma) 0 si se expone mediante la cirugía. La energía luminosa también puede suministrarse a la neoplasia por medio de fibras ópticas, por ejemplo, si la neoplasia está presente debajo de la superficie del tejido (por ejemplo, el cáncer de mama) y no se expone mediante la cirugía.

De acuerdo con otra modalidad, y como se describe con más detalle en la presente descripción, las formulaciones inmunoadyuvantes de la presente invención pueden incluir además un cromóforo adecuado. La selección de un cromóforo apropiado es en gran parte una cuestión de coordinación con una longitud de onda de radiación láser aceptable. La longitud de onda de la radiación usada debe, por supuesto, ser complementaria a las fotopropiedades (es decir, el pico de absorción) del cromóforo. Otros criterios de selección de los cromóforos incluyen la capacidad para generar energía térmica, para desarrollar oxígeno singlete y otras moléculas activas, o para ser tóxicos por derecho propio como el cisplatino. En la presente invención, una longitud de onda de radiación preferida es 805 ± 10 nm. Los cromóforos deseados tienen una fuerte absorción en la región espectral del infrarrojo cercano o el rojo para la cual el tejido es relativamente transparente. Otra ventaja de esta longitud de onda es que se evitan los efectos mutagénicos potenciales encontrados con los sensibilizadores excitados en el UV. No obstante, las longitudes de onda entre 150 y 2000 nm pueden resultar eficaces en los casos individuales. El cromóforo preferido es el verde de indocianina. Pueden usarse otros cromóforos, sin embargo, su selección se basa en las propiedades fotofísicas y fotoquímicas deseadas de las que dependen la eficacia de la fotosensibilización y la fotocitotoxicidad. Los ejemplos de los cromóforos alternativos incluyen, pero no se limitan a, los nanotubos de carbono de pared simple (SWNT), los buckminsterfullerenos (C⁶⁰), el verde de indocianina, el azul de metileno, el DHE (éster/éter de polihematoporfirina), la mm-THPP (tetra(metahidroxifenil)porfirina), el AlPcS⁴ (tetrasulfonato de ftalocianina de aluminio), la ZnET2 (etiopurpurina de zinc) y la Bchla (bacterioclorofila alfa).

En una modalidad, la composición inmunoadyuvante se formula como una solución o suspensión. La solución o la suspensión pueden incluir, por ejemplo, aproximadamente el 0,25 % en peso de un cromóforo y aproximadamente el 1 % en peso del quitosano glicado.

De acuerdo con otra modalidad preferida, la presente invención proporciona una composición para su uso en el acondicionamiento de una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem, que comprende un inmunoadyuvante, en donde el inmunoadyuvante se conjuga con un antígeno específico del tumor y en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado.

De acuerdo con otra modalidad más, la presente invención proporciona una composición para su uso en el acondicionamiento de una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem, que comprende una combinación de un cromóforo y un inmunoadyuvante, en donde el cromóforo y el inmunoadyuvante se conjugan con un antígeno específico del tumor, y en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado.

De acuerdo con otra modalidad preferida, la presente invención proporciona una composición para su uso en el acondicionamiento de una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem, que comprende un inmunoadyuvante, en donde el inmunoadyuvante se conjuga con un anticuerpo específico del tumor y en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado. El inmunoadyuvante puede, en determinados casos, consistir esencialmente en el quitosano glicado. El quitosano glicado también puede incluir además un grupo reactivo carbonilo.

De acuerdo con otra modalidad, la presente invención proporciona una composición para su uso en el acondicionamiento de una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem, que comprende una combinación de un cromóforo y un inmunoadyuvante, en donde el cromóforo y el inmunoadyuvante se conjugan con un anticuerpo específico del tumor, y en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado. El inmunoadyuvante puede, en determinados casos, consistir esencialmente en el quitosano glicado. El quitosano glicado también puede incluir además un grupo reactivo carbonilo.

Por tanto, la presente invención proporciona las formulaciones inyectables para acondicionar una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem, que en determinados casos pueden incluir una combinación de, o una mezcla de, un cromóforo y un inmunoadyuvante, en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado.

Además, puede prepararse una composición para su uso en el acondicionamiento de una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem, que comprende un inmunoadyuvante, en donde el inmunoadyuvante se conjuga con un antígeno específico del tumor, y en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado viscoelástico con un peso molecular (MW) de entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 1000 kDa; y con mayor preferencia, entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 300 kDa.

También puede prepararse una composición para su uso en el acondicionamiento de una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem, que comprende una combinación de un cromóforo y un inmunoadyuvante, en donde el cromóforo y el inmunoadyuvante se conjugan con un antígeno específico del tumor, y en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado viscoelástico con un peso molecular (MW) de entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 1000 kDa; y con mayor preferencia, entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 300 kDa.

Además, puede prepararse una solución inyectable para acondicionar una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem que comprende un inmunoadyuvante en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado viscoelástico con un peso molecular (MW) de entre aproximadamente 100 KDa y aproximadamente 1000 kDa; y con mayor preferencia, entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 300 kDa.

También puede prepararse una solución inyectable para acondicionar una neoplasia para el tratamiento fotofísico e inmunológico en tándem que comprende una mezcla de un cromóforo y un inmunoadyuvante en donde el inmunoadyuvante es el quitosano glicado viscoelástico con un peso molecular (MW) de entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 1000 kDa; y con mayor preferencia, entre aproximadamente 100 kDa y aproximadamente 300 kDa.

En un ejemplo, las composiciones de quitosano glicado viscoelástico de la presente invención se usan como un inmunoadyuvante en un tratamiento nuevo contra el cáncer. Las terapias fototérmicas e inmunológicas se combinan irradiando la neoplasia directamente al tumor sin el uso de un cromóforo y posteriormente mediante la introducción del inmunoadyuvante derivado del quitosano en, o alrededor de, la neoplasia irradiada. Tras la aplicación de un láser con irradiancia suficiente para inducir la destrucción celular neoplásica, las respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células hacia los antígenos neoplásicos así liberados se estimulan (potencian) por el componente inmunoadyuvante.

En otro ejemplo, las terapias fotodinámicas e inmunológicas se combinan mediante la introducción tanto de un cromóforo como de un inmunoadyuvante derivado del quitosano (también llamado inmunomodulador o inmunopotenciador) en una neoplasia. Tras la aplicación de un láser con irradiancia suficiente para inducir la destrucción celular neoplásica, las respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células hacia los antígenos neoplásicos así liberados se estimulan (potencian) por el componente inmunoadyuvante.

El cromóforo y el inmunoadyuvante pueden combinarse en una solución para la inyección en el centro de la masa tumoral o inyectarse por separado en la masa tumoral. Sin embargo, debe reconocerse que otros métodos pueden ser suficientes para localizar el cromóforo y el inmunoadyuvante en el sitio del tumor. Uno de dichos medios de administración alternativos es la conjugación del cromóforo o el inmunoadyuvante o ambos a un anticuerpo específico del tejido o antígeno específico del tejido, de manera que se potencia la administración al sitio del tumor. Cualquier método, o una combinación de varios métodos, de localización del cromóforo y el inmunoadyuvante en el sitio del tumor es aceptable siempre que el mecanismo de administración asegure una concentración suficiente de los componentes en la neoplasia.

De acuerdo con otro aspecto de la descripción, un método para tratar una neoplasia en un huésped humano u otro animal, comprende: (a) seleccionar un inmunoadyuvante, en donde el inmunoadyuvante comprende el quitosano glicado viscoelástico; (b) irradiar la neoplasia acondicionada mediante la cual se induce la destrucción celular neoplásica de la neoplasia acondicionada, lo que produce un tejido neoplásico fragmentado y moléculas celulares; e (c) introducir el inmunoadyuvante en, o alrededor de, la neoplasia, que estimula el sistema de autodefensa inmunológico del huésped para procesar el tejido neoplásico fragmentado y las moléculas celulares, como los antígenos tumorales, y así generar una inmunidad contra la multiplicación celular neoplásica.

De acuerdo con otro aspecto más de la descripción, un método para tratar una neoplasia en un huésped humano u otro animal comprende: (a) seleccionar un cromóforo y un inmunoadyuvante, en donde el inmunoadyuvante comprende el quitosano glicado viscoelástico; (b) introducir el cromóforo y el inmunoadyuvante en la neoplasia para obtener una neoplasia acondicionada; e (c) irradiar la neoplasia acondicionada mediante la cual se induce la destrucción celular neoplásica de la neoplasia acondicionada, lo que produce un tejido neoplásico fragmentado y moléculas celulares en presencia del inmunoadyuvante que estimula el sistema de autodefensa inmunológico del huésped contra la multiplicación celular neoplásica.

En otro aspecto más de la descripción, un método de producción de anticuerpos específicos del tumor en un huésped con tumor, incluye irradiar un tumor con un láser de una longitud de onda en el intervalo visible, el infrarrojo cercano o el infrarrojo, en un grado suficiente para inducir la destrucción celular neoplásica y la generación del tejido neoplásico fragmentado y las moléculas celulares, seguido de la introducción de un inmunoadyuvante en, o alrededor de, una neoplasia por medio de la inyección para que el sistema inmunitario del huésped se estimule para interactuar y procesar el tejido neoplásico fragmentado y las moléculas celulares, sobre lo cual se induce una respuesta antitumoral sistémica.

En otro aspecto de la descripción, un método de producción de anticuerpos específicos del tumor en un huésped con tumor incluye la introducción simultánea de un cromóforo y un inmunoadyuvante en una neoplasia mediante la inyección intratumoral para obtener una neoplasia acondicionada, siendo el cromóforo adecuado para generar energía térmica sobre la activación en el intervalo de longitud de onda en el infrarrojo cercano o el infrarrojo; y activar el cromóforo con un láser de una longitud de onda en el intervalo del infrarrojo cercano o el infrarrojo hasta un grado suficiente para activar el cromóforo para producir una reacción fototérmica que induce la destrucción celular neoplásica y genera el tejido neoplásico fragmentado y las moléculas celulares.

Un método ilustrativo para destruir fotofísicamente una neoplasia y generar simultáneamente una vacuna autóloga in situ en un huésped con tumor, incluye: (a) seleccionar un inmunoadyuvante; (b) irradiar la neoplasia con un láser de una longitud de onda en el intervalo visible, el infrarrojo cercano o el infrarrojo, a una potencia y durante una duración suficiente para producir una reacción fototérmica que induzca la destrucción celular neoplásica y genere el tejido neoplásico fragmentado y las moléculas celulares; (c) formar la vacuna in situ mediante la introducción del inmunoadyuvante en la neoplasia mediante la inyección intratumoral, en donde la vacuna in situ comprende una amalgama del tejido fragmentado y las moléculas celulares y el inmunoadyuvante; y (d) estimular el sistema de autodefensa inmunológico contra la multiplicación celular neoplásica haciendo que la vacuna se presente localmente para inducir una respuesta antitumoral sistémica dentro del huésped.

Otro método ilustrativo para destruir fotofísicamente una neoplasia y generar simultáneamente una vacuna autóloga in situ en un huésped con tumor, incluye: (a) seleccionar un cromóforo y un inmunoadyuvante, siendo el cromóforo adecuado para generar energía térmica tras la activación en el intervalo de longitud de onda en el infrarrojo cercano o el infrarrojo; (b) introducir el cromóforo en la neoplasia mediante la inyección intratumoral; (c) irradiar la neoplasia con un láser de una longitud de onda en el intervalo visible, el infrarrojo cercano o el infrarrojo, a una potencia y durante una duración suficiente para activar el cromóforo para producir una reacción fototérmica que induce la destrucción celular neoplásica y genera el tejido neoplásico fragmentado y las moléculas celulares; (d) formar la vacuna in situ mediante la introducción del inmunoadyuvante en la neoplasia mediante la inyección intratumoral en donde la vacuna in situ comprende una amalgama del tejido fragmentado y las moléculas celulares y el inmunoadyuvante; y (e) estimular el sistema de autodefensa inmunológico contra la multiplicación celular neoplásica haciendo que la vacuna se presente localmente para inducir una respuesta antitumoral sistémica dentro del huésped.

Otro método ilustrativo más para destruir fotofísicamente una neoplasia y generar simultáneamente una vacuna autóloga in situ en un huésped con tumor, incluye: (a) seleccionar un cromóforo y un inmunoadyuvante, siendo el cromóforo adecuado para generar energía térmica tras la activación en el intervalo de longitud de onda en el infrarrojo cercano o el infrarrojo; (b) introducir simultáneamente o por separado el cromóforo y el inmunoadyuvante en la neoplasia mediante la inyección intratumoral para obtener una neoplasia acondicionada; (c) formar la vacuna in situ mediante la irradiación de la neoplasia acondicionada con un láser de una longitud de onda en el intervalo del infrarrojo cercano o el infrarrojo a una potencia y durante una duración suficiente para activar el cromóforo para producir una reacción fototérmica que induce la destrucción celular neoplásica y genera el tejido neoplásico fragmentado y las moléculas celulares, en donde la vacuna in situ comprende una amalgama del tejido fragmentado y las moléculas celulares y el inmunoadyuvante; y (d) estimular el sistema de autodefensa inmunológico contra la multiplicación celular neoplásica haciendo que la vacuna se presente localmente y permitiendo que la vacuna se disperse sistémicamente dentro del huésped.

Como se describe en otra parte en la presente descripción, el método puede incluir además conjugar el inmunoadyuvante con un anticuerpo específico del tumor, formando de este modo un conjugado y administrar el conjugado al huésped. Alternativamente, el método puede incluir además conjugar el inmunoadyuvante con un antígeno específico del tumor, formando de este modo un conjugado y administrar el conjugado al huésped. Puede usarse cualquier número de cromóforos adecuados, por ejemplo, verde de indocianina, DHE, m-THPP, AlPcS⁴ , ZnET2 y Bchla.

Además, el método puede incluir conjugar una combinación del cromóforo y el inmunoadyuvante a un anticuerpo específico del tumor, formando de este modo un conjugado y administrar el conjugado al huésped. Alternativamente, el método puede incluir además conjugar el cromóforo y el inmunoadyuvante con un antígeno específico del tumor, formando de este modo un conjugado y administrar el conjugado al huésped. Puede usarse cualquier número de cromóforos adecuados, por ejemplo, verde de indocianina, DHE, m-THPP, AlPcS⁴ , ZnET2 y Bchla.

Las preparaciones y las formulaciones de la presente invención, que incluyen las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico (GC), también pueden usarse junto con la terapia fotodinámica (PDT). Los compuestos fotosensibilizadores muestran una reacción fotoquímica cuando se exponen a la luz. La terapia fotodinámica (PDT) usa tales compuestos fotosensibilizadores y láseres para producir la necrosis tumoral. El tratamiento de los tumores sólidos mediante la PDT generalmente implica la administración sistémica de los compuestos fotosensibilizadores localizadores de tumores y su posterior activación por láser. Al absorber la luz de longitud de onda apropiada, el sensibilizador se convierte de una estructura atómica estable a un estado excitado. La citotoxicidad y la eventual destrucción del tumor están mediadas por la interacción entre el sensibilizador y el oxígeno molecular dentro del tejido tratado para generar oxígeno singlete citotóxico.

Dos buenas referencias generales relacionadas con la PDT, los láseres biomédicos y los compuestos fotosensibilizadores, incluidos los parámetros de suministro de luz y dosificación, son Photosensitizing Compounds: Their Chemistry, Biology and Clinical Use, publicado en 1989 por John Wiley and Sons Ltd., Chichester, Reino Unido, ISBN 0471 92308 7, y Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers: Proceedings of the International Conference on Photodynamic Therapy and Medical Laser Applications, Milán, 24-27 de junio de 1992, publicado por Elsevier Science Publishers B.V, Ámsterdam, Países Bajos, ISBN 0444814302.

Las patentes de los Estados Unidos relacionadas con la PDT incluyen las patentes de los Estados Unidos núm.

5,095,030 y 5,283,225 de Levy y otros; la patente de los Estados Unidos núm. 5,314,905 de Pandey y otros; la patente de los Estados Unidos núm. 5,214,036 de Allison y otros; y la patente de los Estados Unidos núm. 5,258,453 de Kopecek y otros. Las patentes de Levy describen el uso de los fotosensibilizadores afectados por una longitud de onda entre 670-780 nm conjugados con anticuerpos específicos del tumor, tales como los ligandos específicos del receptor, las inmunoglobulinas o las porciones inmunoespecíficas de las inmunoglobulinas. Las patentes de Pandey se dirigen a los compuestos de pirofeoforbido para su uso en la terapia fotodinámica estándar. Pandey también describe la conjugación de sus composiciones con ligandos y anticuerpos. La patente de Allison es similar a las patentes de Levy en que las porfirinas verdes se conjugan con lipocomplejos para aumentar la especificidad de los compuestos de porfirina por las células tumorales diana. La patente de Kopecek también describe las composiciones para tratar los tejidos cancerosos. Estas composiciones consisten en dos fármacos, un fármaco anticancerígeno y un fármaco fotoactivable, unidos a un portador copolimérico. Las composiciones entran en las células diana por pinocitosis. El fármaco anticancerígeno actúa después de que se ha invadido la célula diana. Después de un período de tiempo, se usa una fuente de luz para activar el sustituyente fotosensibilizado.

Otras aplicaciones para la inmunoterapia tumoral

Las preparaciones y las formulaciones de la presente invención, que incluyen las preparaciones de quitosano glicado (GC) viscoelástico, pueden usarse, por ejemplo, como inmunoadyuvantes, en el contexto de la inmunoterapia tumoral.

Las principales funciones del sistema inmunitario son desarrollar el concepto de "propio" y eliminar lo que es "no propio". Si bien los microorganismos son las principales entidades no propias que se encuentran todos los días, el sistema inmunitario también trabaja para eliminar las neoplasias y los trasplantes.

Hay varios tipos distintos de inmunidad. La inmunidad no específica o innata se refiere a la resistencia inherente manifestada por una especie que no se ha inmunizado (sensibilizado o alergizado) por una infección previa o la vacunación. Su principal componente celular es el sistema fagocítico, cuya función es ingerir y digerir los microorganismos invasores. Los fagocitos incluyen los neutrófilos y los monocitos en la sangre y los macrófagos en los tejidos. Las proteínas del complemento son el principal componente soluble de la inmunidad no específica. Los reactantes de la fase aguda y las citocinas, como el interferón, también forman parte de la inmunidad innata.

La inmunidad específica es un estado inmunitario en el que hay una reactividad alterada dirigida únicamente contra los determinantes antigénicos (agente infeccioso u otro) que la estimularon. A veces se le denomina inmunidad adquirida. Puede ser activa y específica, como resultado de una infección natural adquirida (aparente o no aparente) o la vacunación intencional; o puede ser pasiva, adquirida a partir de una transferencia de los anticuerpos de otra persona o animal. La inmunidad específica tiene las características del aprendizaje, la adaptabilidad y la memoria. El componente celular es el linfocito (por ejemplo, las células T, las células B, las células asesinas naturales (NK)) y las inmunoglobulinas son el componente soluble.

La acción de las células T y las células NK en el reconocimiento y la destrucción de células parasitadas o extrañas se denomina inmunidad mediada por células. A diferencia de la inmunidad mediada por células, la inmunidad humoral se asocia con los anticuerpos circulantes producidos, después de un complejo proceso de reconocimiento por las células B.

En cuanto a la inmunología tumoral, se ha demostrado repetidamente la importancia de las células linfoides en la inmunidad tumoral. Una respuesta del huésped a los tumores mediada por células incluye el concepto de vigilancia inmunológica, mediante el cual los mecanismos celulares asociados con la inmunidad mediada por células destruyen las células tumorales recién transformadas después de reconocer los antígenos asociados a tumores (antígenos asociados con las células tumorales que no son evidentes en las células normales). Esto es análogo al proceso de rechazo de los tejidos trasplantados de un donante no idéntico. En seres humanos, el crecimiento de los nódulos tumorales se ha inhibido in vivo mediante la mezcla de suspensiones de linfocitos de sangre periférica de un paciente y de células tumorales, lo que sugiere una reacción mediada por células al tumor. Los estudios in vitro han demostrado que las células linfoides de los pacientes con determinadas neoplasias muestran citotoxicidad frente a las correspondientes células tumorales humanas en cultivo. Estas células citotóxicas, que generalmente son células T, se han encontrado con el neuroblastoma, los melanomas malignos, los sarcomas y los carcinomas de colon, mama, cuello uterino, endometrio, ovario, testículo, nasofaringe y riñón. Los macrófagos también pueden estar implicados en la respuesta del huésped a los tumores mediada por células cuando están en presencia de antígenos, linfocinas o interferón asociados a tumores.

Se han producido anticuerpos humorales que reaccionan con células tumorales in vitro en respuesta a una variedad de tumores animales inducidos por carcinógenos químicos o virus. La tecnología de hibridomas in vitro permite la detección y la producción de anticuerpos antitumorales monoclonales dirigidos contra una variedad de neoplasias animales y humanas. Sin embargo, la protección mediada por anticuerpos contra el crecimiento tumoral in vivo sólo se ha demostrado en determinadas leucemias y linfomas animales. Por el contrario, la protección mediada por células linfoides in vivo se produce en una amplia variedad de sistemas de tumores animales.

La inmunoterapia para el cáncer se considera mejor como parte de un tema más amplio, específicamente, la terapia biológica o la administración de modificadores de la respuesta biológica. Estos agentes actúan a través de uno o más de una variedad de mecanismos (1) para estimular la respuesta antitumoral del huésped mediante el aumento del número de células efectoras o la producción de uno o más mediadores solubles; (2) servir como efector o mediador; (3) disminuir los mecanismos supresores del huésped; (4) alterar las células tumorales para aumentar su inmunogenicidad o hacerlas más propensas a ser dañadas por procesos inmunológicos; o (5) para mejorar la tolerancia del huésped a los citotóxicos o la radioterapia. Hasta ahora, el foco de la inmunoterapia tumoral mediada por células se ha centrado en la reinfusión de los linfocitos del paciente después de la expansión in vitro por exposición a la interleucina-2. Una variación incluye aislar y expandir las poblaciones de linfocitos que han infiltrado tumores in vivo, los denominados linfocitos infiltrantes de tumores. Otro es el uso concurrente del interferón, que se cree que mejora la expresión de los antígenos de histocompatibilidad y los antígenos asociados a tumores en las células tumorales, aumentando de este modo la destrucción de las células tumorales por las células efectoras infundidas.

La terapia humoral se ha concentrado durante mucho tiempo en el uso de anticuerpos antitumorales como una forma de inmunoterapia pasiva, en contraste con la estimulación activa del propio sistema inmunitario del huésped. Otra variación es la conjugación de anticuerpos antitumorales monoclonales con toxinas, como la ricina o la difteria, o con radioisótopos, por lo que los anticuerpos entregarán estos agentes tóxicos específicamente a las células tumorales. También se ha probado la inmunización activa con las propias células tumorales del huésped, después de la irradiación, el tratamiento con neuraminidasa, la conjugación de haptenos o la hibridación. Se ha observado una mejoría clínica en una minoría de pacientes tratados de esta manera. Se han usado las células tumorales de otros después de su irradiación junto con adyuvantes en la leucemia linfoblástica aguda y la leucemia mieloblástica aguda después de la remisión. En algunas series se ha informado la prolongación de las remisiones o la mejora de las tasas de reinducción, pero no en la mayoría. Los interferones, el factor de necrosis tumoral y las linfotoxinas también se han usado para afectar los mecanismos mediados inmunológicamente. Un enfoque reciente, que usa los mecanismos celulares y humorales, es el desarrollo de los "anticuerpos entrecruzados", que incluyen un anticuerpo que reacciona con la célula tumoral unido a un segundo anticuerpo que reacciona con una célula efectora citotóxica, lo que hace que este último se dirija más específicamente al tumor. Se ha informado de la infiltración de células inmunitarias del huésped en un tumor murino tratado con la PDT.

PDT combinada e inmunoterapia

De acuerdo con la presente invención, es conveniente usar las preparaciones de quitosano glicado (GC) que tengan una viscosidad adecuada que permita su uso como un material inyectable en aplicaciones adicionales, tales como la terapia fotodinámica combinada contra el cáncer (PDT) y los métodos de inmunoterapia tumoral.

Korbelik, Krosl, Dougherty y Chaplin exploraron el potencial de combinar la PDT con la inmunoterapia. Ver Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers, arriba, págs. 518-520. En su estudio, investigaron la posibilidad de la amplificación de una reacción inmunitaria a la PDT y su dirección hacia una destrucción más generalizada de los tumores tratados. El tumor, un carcinoma de células escamosas SCCVII, se cultivó en ratones C3H hembra. Se administró un agente inmunoactivador SPG (un B-glucano de alto peso molecular que estimula a los macrófagos y las células linfoides para que respondan mucho más a los estímulos de las citocinas y otras señales inmunitarias) por vía intramuscular en 7 dosis diarias, terminando un día antes de la PDT o comenzando inmediatamente después de la PDT. Se empleó la PDT basada en Photofrin; el Photofrin administrado por vía intravenosa 24 horas antes del tratamiento con luz. Se demostró que la inmunoterapia SPG mejora el efecto destructor directo de la PDT. Sin embargo, el efecto destructor indirecto (visto como una disminución en la supervivencia de las células tumorales dejadas in situ) fue mucho más pronunciado en los tumores de animales que no recibieron SPG. La diferencia en la eficacia de la inmunoterapia SPG cuando se realizó antes y después de la PDT sugirió que la interacción máxima se logra cuando la activación inmunitaria alcanza su punto máximo en el momento del suministro de luz o inmediatamente después. El comienzo con SPG después de la PDT (y logrando una activación inmunitaria óptima 5-7 días después), evidentemente es demasiado tarde para una reacción beneficiosa.

En otro estudio se investigó el uso de la PDT para potenciar el efecto de los fármacos biorreactivos que son citotóxicos en condiciones hipóxicas. Ver Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers, arriba, págs. 698-701. Se encontró que la actividad antitumoral de tales fármacos podría potenciarse in vivo cuando se usaban en combinación con los tratamientos que aumentan la hipoxia tumoral.

Tratamiento del cáncer mediante la terapia fotodinámica en combinación con un inmunoadyuvante

De acuerdo con la presente invención, es conveniente usar las formulaciones de quitosano glicado (GC) viscoelástico de la invención que tengan una viscosidad adecuada como materiales inyectables para su uso en el tratamiento del cáncer. Esto puede lograrse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, junto con aplicaciones tales como la terapia fototérmica o fotodinámica combinada contra el cáncer (PDT) y los métodos de inmunoterapia tumoral. El término cáncer, como se usa en la presente descripción, es un término general que pretende incluir cualquiera de varios tipos de neoplasias malignas, la mayoría de las cuales invaden los tejidos circundantes, pueden hacer metástasis en varios sitios y es probable que reaparezcan después de intentar la extracción y provocar la muerte del paciente a menos que se trate adecuadamente. Una neoplasia, como se usa en la presente descripción, se refiere a un tejido anormal que crece por proliferación celular más rápidamente de lo normal. Continúa creciendo incluso después de que el estímulo que inició su crecimiento se disipa. Las neoplasias muestran una falta parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal y generalmente forman una masa distinta que puede ser benigna o maligna.

De acuerdo con la presente invención, determinados ejemplos de cánceres que pueden tratarse con las preparaciones de quitosano glicado (GC) que tienen una viscosidad adecuada como materiales inyectables incluyen, pero no se limitan a, los de cuello uterino, mama, vejiga, colon, próstata, laringe, endometrio, ovario, cavidad oral, riñón, testículos (no seminomatosos) y pulmón (células no pequeñas).

Además, de acuerdo con la presente invención, el tratamiento también puede administrarse de una manera adecuada junto con otros tipos de tratamiento del cáncer, por ejemplo, el tratamiento con radiación. La radiación juega un papel clave, por ejemplo, en el remedio de la enfermedad de Hodgkin, los linfomas no Hodgkin nodulares y difusos, el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, los tumores de células germinales del mediastino, el seminoma, el cáncer de próstata, el cáncer de mama en estadio temprano, el cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio temprano y el meduloblastoma. La radiación también puede usarse como terapia paliativa en el cáncer de próstata y el cáncer de mama cuando hay metástasis óseas, en el mieloma múltiple, el cáncer de pulmón y esofagofaríngeo en estadio avanzado, el cáncer gástrico y los sarcomas, y en las metástasis cerebrales. Los cánceres que pueden tratarse incluyen, por ejemplo, la enfermedad de Hodgkin, los linfomas no Hodgkin en estadio temprano, los cánceres de testículo (seminomal), próstata, laringe, cuello uterino y, en menor medida, los cánceres de nasofaringe, senos nasales, mama, esófago y pulmón.

El tratamiento también puede administrarse de una manera adecuada junto con otros tipos de fármacos antineoplásicos. Los fármacos antineoplásicos incluyen aquellos que previenen la división celular (mitosis), el desarrollo, la maduración o la diseminación de las células neoplásicas. El fármaco antineoplásico ideal destruiría las células cancerosas sin efectos adversos o toxicidades en las células normales, pero no existe tal fármaco. Sin embargo, a pesar del estrecho índice terapéutico de muchos fármacos, en algunos pacientes es posible el tratamiento e incluso la curación. Se ha descubierto que determinados estadios del coriocarcinoma, la enfermedad de Hodgkin, el linfoma difuso de células grandes, el linfoma de Burkitt y la leucemia son susceptibles a los antineoplásicos, al igual que los cánceres de testículo (no seminomatosos) y pulmón (células pequeñas). Las clases comunes de fármacos antineoplásicos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides vegetales, antibióticos, nitrosoureas, iones inorgánicos, enzimas y hormonas.

Vacunas autólogas contra el cáncer in situ, tales como la inmunoterapia asistida por láser

Las composiciones derivadas del quitosano y, en particular, las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico de la presente invención, son eficaces en el tratamiento de las neoplasias y otros trastornos médicos. Los usos adicionales del quitosano glicado, solo o en combinación con otros fármacos, incluyen el uso como inmunoestimulante en el tratamiento de pacientes inmunodeprimidos que incluyen, pero no se limitan a, el cáncer y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida.

Por tanto, las composiciones derivadas del quitosano de la presente invención son útiles en una miríada de aplicaciones, que incluyen, por ejemplo, como inmunoadyuvante o como componente de un inmunoadyuvante, como se describe en detalle en la presente descripción. A pesar de otros usos, un uso principal de las composiciones derivadas del quitosano es como inmunoadyuvante en relación con las vacunas autólogas contra el cáncer in situ (inCVAX), como la inmunoterapia asistida por láser (LIT), y es en este contexto que las composiciones derivadas del quitosano se describen en detalle en la presente descripción.

Como se describe adicionalmente en la presente descripción, las modalidades adicionales de la presente invención se dirigen a los usos de las preparaciones de quitosano glicado de la presente invención como inmunoadyuvantes junto con las inCVAX en general, y la LIT en particular, para el tratamiento del cáncer. La inmunoterapia asistida por láser que usa la presente invención abarca preferentemente la introducción en, o alrededor de, una neoplasia de un inmunoadyuvante que comprende las composiciones derivadas del quitosano viscoelástico después de la irradiación fototérmica del mismo tumor. La acción fototérmica se realiza a una irradiancia suficiente para inducir la destrucción celular neoplásica que puede realizarse con o sin inyección intratumoral, o por otros medios de administración, de un cromóforo, y combinada con la inyección, o por otros medios de administración, de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico de la presente invención, se inducen respuestas inmunitarias antitumorales humorales y mediadas por células.

En modalidades preferidas, se proporciona una LIT mejorada en donde la mejora comprende el uso de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico inyectable de la presente invención descritas en la presente descripción. La presente descripción también contempla los métodos de activación in vivo de los componentes específicos del sistema inmunitario junto con las inCVAX en general, o la LIT en particular, que comprenden el tratamiento con una preparación de quitosano glicado viscoelástico.

Como se describe adicionalmente en la presente descripción, se ha determinado que la LIT proporciona una vacuna autóloga contra el cáncer in situ (inCVAX) que supera las limitaciones de las actuales inmunoterapias y vacunas contra el cáncer. En general, los dos principios que subyacen a la LIT son (1) el calentamiento local del tumor primario con un láser para desvitalizar el tumor y liberar los antígenos tumorales, y (2) la inyección local de un inmunoadyuvante potente y no tóxico que comprende el quitosano glicado (GC), que interactúa con los antígenos tumorales liberados para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer. Por tanto, la LIT funciona eficazmente como una vacuna autóloga contra el cáncer in situ que usa las células tumorales completas como fuentes de antígenos tumorales de cada paciente individual sin la preselección de antígenos tumorales o la preparación ex vivo.

De acuerdo con la presente invención, otra ventaja de usar las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico inyectable de la presente invención descritas en la presente descripción, junto con la LIT, es que mediante el uso de este enfoque LIT, hay activación de las células dendríticas (DC), y posteriormente la exposición de las DC activadas a los antígenos tumorales in vivo. Por tanto, la LIT representa un enfoque favorable para otras vacunaciones contra el cáncer de células completas, al eliminar la necesidad de las preparaciones ex vivo y mediante el uso de la LIT junto con las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico como inmunoadyuvantes.

Se fabricó una formulación ilustrativa de una preparación de quitosano glicado con el nombre PROTECTIN. Se ha observado que PROTECTIN junto con la LIT estimula el sistema inmunitario e induce la inmunidad específica del tumor mediante 1) la activación de las células dendríticas, 2) el aumento de la interacción entre las células tumorales y las células dendríticas, y 3) el aumento de la presentación del antígeno tumoral al sistema inmunitario.

Otras preparaciones de quitosano glicado viscoelástico de la presente invención también funcionan para estimular el sistema inmunitario e inducir inmunidad específica del tumor mediante 1) la activación de las células dendríticas, 2) el aumento de la interacción entre las células tumorales y las células dendríticas, y 3) el aumento de la presentación del antígeno tumoral al sistema inmunitario.

Por tanto, de acuerdo con una modalidad preferida de la invención, las formulaciones de quitosano glicado viscoelástico activan uno o más componentes del sistema inmunitario, mediando los efectos terapéuticos deseados.

Como se describe adicionalmente en la presente descripción, determinados componentes del sistema inmunitario que se activan incluyen los componentes de inmunidad no específica o innata, específicamente, el sistema fagocítico que incluye los neutrófilos y los monocitos en la sangre y los macrófagos en los tejidos; las proteínas del complemento, el principal componente soluble de la inmunidad no específica; y los reactantes de la fase aguda y las citocinas, tales como el interferón, también forman parte de la inmunidad innata. Hay muchos componentes diferentes de la inmunidad específica, por ejemplo, los linfocitos (por ejemplo, las células T, las células B, las células asesinas naturales (NK)) y las inmunoglobulinas. Las formulaciones de quitosano glicado de la invención también interactúan con las células linfoides para promover la inmunidad tumoral. Los macrófagos también pueden estar implicados en la respuesta del huésped a los tumores mediada por células cuando están en presencia de antígenos, linfocinas o interferón asociados a tumores.

Los componentes específicos del sistema inmunitario se activan después del tratamiento "fototérmico". Cuando ocurre la destrucción fototérmica, el tejido fragmentado y las moléculas celulares se distribuyen dentro del huésped en presencia del material potenciador inmunológico, como el quitosano. En efecto, se forma una vacuna in situ. Esta mezcla de materiales circula luego en el huésped y se detecta por el sistema de vigilancia inmunológica. Le sigue una movilización inmediata de la inmunidad mediada por células que abarca las células NK y las células T asesinas reclutadas. Estas células migran a los sitios de los antígenos o las sustancias químicas similares. Con el tiempo, la inmunidad mediada por células cambia a una inmunidad humoral con la producción de anticuerpos citotóxicos. Estos anticuerpos circulan libremente por el cuerpo y se adhieren a las células y los materiales para los que se han codificado. Si esta unión se produce en presencia de los factores del complemento, el resultado es la muerte celular.

Las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico inyectable de la presente invención tienen una utilidad inesperada en las "vacunas contra el cáncer in situ", que se basan en una activación in situ de las células presentadoras de antígenos (por ejemplo, las células dendríticas y los macrófagos) y la exposición posterior de los antígenos tumorales a las células presentadoras de antígeno. Las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico inyectable de la presente invención también activan otros mediadores celulares que incluyen, pero no se limitan a, el factor de necrosis tumoral (por ejemplo, TNFa) y el óxido nítrico que contribuyen a los efectos terapéuticos.

Otra ventaja del uso de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico inyectable de la presente invención descritas en la presente descripción, junto con la LIT, es que, mediante el uso de este enfoque, este método desencadena independientemente la respuesta inmunitaria en cada individuo, y esta no depende de la reactividad cruzada en la expresión del antígeno específico del tumor entre los huéspedes (como se requiere en la vacunación y la inmunoterapia con anticuerpos convencionales). Los estudios histoquímicos han revelado que los sueros de ratas con tumores curadas con la LIT contenían anticuerpos que se unían a la membrana plasmática de las células tumorales vivas y conservadas. El análisis de la electrotransferencia de las proteínas de las células tumorales mediante el uso de sueros (de ratas tratadas con éxito con la LIT) como fuente de anticuerpos primarios mostró bandas distintas, lo que indica la inducción de anticuerpos selectivos de tumores. También se demostró que las ratas tratadas con éxito podían adquirir resistencia a largo plazo a la reexposición al tumor y la inmunidad adoptiva podía transferirse mediante el uso de las células del bazo de las ratas tratadas con éxito, lo que indica una inmunidad específica del tumor.

Por tanto, mediante el uso de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico inyectable de la presente invención descritas en la presente descripción, existen varias ventajas que satisfacen las necesidades críticas para proporcionar un tratamiento eficaz contra el cáncer. Esto es particularmente favorable para los pacientes con cáncer, ya que la presente invención también proporciona preparaciones sorprendente e inesperadamente beneficiosas que son fáciles de administrar por inyección y, por lo tanto, aumentan la conformidad y proporcionan alternativas de tratamiento eficaces a los enfoques convencionales que no proporcionan tratamientos (1) eficaces, (2) no tóxicos y (3) prácticos para el cáncer metastásico en estadio tardío. Un tema crítico en la terapia del cáncer de mama es que no todos los pacientes son tratables con las metodologías convencionales actuales y aquellos diagnosticados en estadios tardíos tienen un mal pronóstico, con incluso menos opciones válidas de tratamiento. Y, aunque ha habido muchos avances y desarrollos en el tratamiento del cáncer de mama en los últimos años, persisten los problemas cruciales. Las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico inyectable de la presente invención, como se describe en la presente descripción, proporcionan varias ventajas que satisfacen las necesidades críticas para proporcionar un tratamiento eficaz del cáncer.

Se ha demostrado que la LIT induce la maduración de las células dendríticas (evaluada por la expresión de CD80), mejora la proliferación de células T, aumenta la secreción de IFN-y y aumenta la expresión de HSP70. Además, se ha demostrado que los efectos combinados de la LIT (por ejemplo, el calentamiento del tumor con un láser y la inyección de las preparaciones de quitosano glicado de acuerdo con la presente invención) inducen inmunidad específica del tumor, con una infiltración de las células CD4 y CD8 citotóxicas específicas del tumor en los tumores después del tratamiento.

Como se describe con más detalle en la presente descripción, la LIT proporciona numerosas ventajas que incluyen, pero no se limitan a:

Elimina los tumores primarios tratados

Elimina las metástasis sin tratar

Induce inmunidad y supervivencia a largo plazo

Genera resistencia a las reexposiciones al tumor

No es tóxico y es seguro de usar en seres humanos a dosis terapéuticas.

De acuerdo con un aspecto de la invención, una neoplasia, como un tumor maligno, se irradia con luz visible, infrarroja cercana o infrarroja con una potencia y una duración suficientes para elevar la temperatura de la neoplasia a un nivel que induce destrucción celular neoplásica y estimula el sistema de autodefensa inmunológico contra la multiplicación celular neoplásica. Para facilitar el calentamiento del tumor, puede inyectarse un cromóforo con picos de absorción correspondientes a la longitud de onda de la luz aplicada, antes de aplicar el tratamiento con luz. Después de la irradiación de luz, se administra un inmunoadyuvante derivado del quitosano glicado viscoelástico, por ejemplo, mediante la inyección, en el tumor o en el tejido que rodea inmediatamente al tumor.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se prepara una solución de verde de indocianina (ICG) y quitosano glicado a una concentración de 0,1 a 2 % de ICG a quitosano. La solución se inyecta en la neoplasia y la neoplasia luego se irradia mediante el uso de un láser que tiene una potencia de aproximadamente 5 vatios y una longitud de onda de radiación capaz de penetrar fácilmente en los tejidos celulares normales sin una alteración significativa. La irradiación continúa durante una duración de aproximadamente uno a aproximadamente diez minutos, que es suficiente para elevar la temperatura de la neoplasia a un nivel que induce la destrucción celular neoplásica y estimula las respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células.

Como se describe adicionalmente en la presente descripción, la presente invención tiene varias ventajas sobre otras modalidades convencionales y no convencionales de tratamiento. La combinación de la destrucción tumoral y el adyuvante de estimulación inmunitaria es la clave. La ventaja más significativa es la destrucción combinada de tumores agudos y crónicos. La pérdida del tumor agudo se produce por la fotovaporización, la fotoablación o la destrucción térmica del tejido neoplásico, a gran escala y controlada, en el área inmediata, reduciendo la carga tumoral y por ende la base de la multiplicación para que el sistema de autodefensa pueda combatir a un "enemigo" más débil. Cuando se produce la destrucción local del tumor, el tejido fragmentado y las moléculas celulares se distribuyen localmente dentro del huésped en presencia del material potenciador inmunológico, como el quitosano glicado. En efecto, se forma una vacuna in situ. Le sigue una movilización inmediata de la inmunidad mediada por células que abarca las células NK y las células T asesinas reclutadas. Estas células migran a los sitios de los antígenos o las sustancias químicas similares. Con el tiempo, la inmunidad mediada por células cambia a una inmunidad humoral con la producción de anticuerpos citotóxicos. Estos anticuerpos circulan libremente por el cuerpo y se adhieren a las células y los materiales para los que se han codificado. Si esta unión se produce en presencia de los factores del complemento, el resultado es la muerte celular. Los lapsos de tiempo para estos dos modos de acción inmunológicos son de 0 a 2 semanas para la respuesta mediada por células, mientras que el arma humoral madura aproximadamente a los 30 días y debe persistir durante largos períodos, hasta la muerte del huésped.

En resumen, la supervivencia a largo plazo puede lograrse con la erradicación total del cáncer mediante el uso de las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico de la presente invención. Esto es un resultado combinado de una carga tumoral reducida debido a las interacciones ablativas (por ejemplo, las fototérmicas) y una respuesta mejorada del sistema inmunitario debido a la presencia del quitosano glicado u otros inmunomoduladores.

De acuerdo con otros aspectos de la descripción, las preparaciones de quitosano glicado de la presente invención también pueden usarse para aplicaciones antimicrobianas y/o hemostáticas. Por tanto, las preparaciones de quitosano glicado (GC) pueden formularse, por ejemplo, como un aerosol hemostático antimicrobiano, en donde la formulación de GC tiene una viscosidad y exhibe propiedades reológicas que permiten su pulverización desde recipientes convencionales. Además, el GC puede incluirse en otras formulaciones siempre que se aplique en concentraciones antimicrobianas y/o hemostáticas eficaces y con viscosidades/propiedades reológicas que permitan su capacidad para dispensarse desde recipientes adecuados para el propósito.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la invención. Por tanto, los ejemplos no deben interpretarse como limitaciones del alcance de la invención, sino que deben considerarse como ejemplos de las modalidades preferidas de esta.

Ejemplos

Ejemplo 1.

Proceso ilustrativo para la preparación de quitosano glicado (GC)

El quitosano glicado se obtiene al hacer reaccionar el quitosano con un monosacárido y/u oligosacárido, preferentemente en presencia de un agente acidificante, durante un tiempo suficiente para lograr la formación de la base de Schiff entre el grupo carbonilo del azúcar y los grupos amino primarios del quitosano (también denominado en la presente descripción como la glicación del grupo amino) hasta un grado predeterminado mediante el cual se logra un porcentaje predeterminado (%) de glicación del polímero de quitosano. A esto le sigue la estabilización por reducción de las bases de Schiff y de sus derivados reorganizados (productos de Amadori). Los registros de la RMN se usan para verificar la unión de los monosacáridos y/o los oligosacáridos al polímero de quitosano, mientras que la medición química de los grupos amino libres restantes, por ejemplo, mediante una reacción con ninhidrina, se usa para evaluar el grado de glicación.

Ejemplo 2.

Filtración estéril

Si bien el galactoquitosano convencional de 1500 kDa, descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 5,747,475, es relativamente sencillo de sintetizar, la esterilización con, por ejemplo, un filtro de 0,22 micras es imposible sin comprometer la integridad del filtro, lo que hace que el quitosano glicado convencional no sea adecuado para la producción de acuerdo con las GMP y el uso humano. Por el contrario, el nuevo quitosano glicado viscoelástico descrito en la presente descripción tiene ventajas significativas con respecto a la producción de acuerdo con las GMP y la filtración estéril debido a propiedades fisicoquímicas inesperadas y beneficiosas. Por ejemplo, a un peso molecular (MW) de 250 000 Da (250 kDa), la filtración estéril con un filtro de 0,22 micras es muy factible, con una tasa de flujo de 100 ml/min sin la pérdida del material durante la filtración.

Ejemplo 3.

Viscosidad del quitosano glicado (GC)

Las preparaciones de GC de mayor peso molecular presentan viscosidades más altas (medidas en Cp):

100 0,914

250 7,68

500 20,79

1500 84,7

El siguiente gráfico muestra la viscosidad (en Cp; eje y) frente al peso molecular (en kDa; eje x) en muestras de GC con pesos moleculares que varían entre 100 kDa y 1500 kDa. La concentración del GC en solución en este experimento disminuyó al aumentar el peso molecular, variando entre el 0,6 % (100 kDa) y el 0,11 % (1500 kDa).

De forma muy sorprendente, se encontró que la viscosidad aumenta linealmente al aumentar el peso molecular solo si la concentración de GC en la muestra se reduce al aumentar el peso molecular. La tabla y el gráfico a continuación muestran el porcentaje de GC en solución de las muestras usadas en el experimento de viscosidad anterior.

Tamaño Porcentaje de GC en la

100 0,6

250 0,3

500 0,14

1500 0,11

Los resultados muestran claramente que 1) las preparaciones de GC de mayor peso molecular se correlacionan con las viscosidades más altas (medidas en Cp), y 2) la correlación entre la viscosidad y el peso molecular no es lineal si la concentración se mantiene constante. En otras palabras, la viscosidad aumenta de manera desproporcionada con el aumento del peso molecular, lo que hace que los quitosanos glicados de mayor peso molecular (tales como los descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,747,475) no sean adecuados para la inyección o la filtración estéril.

Las preparaciones de quitosano glicado viscoelástico que comprenden el quitosano glicado de menor peso molecular (es decir, por debajo de ~400 kDa) proporcionan de este modo una inyectabilidad mejorada; estas preparaciones son útiles, por ejemplo, para los tratamientos de cáncer que usan la terapia fotodinámica y la inmunoterapia asistida por láser para inducir la destrucción celular neoplásica y estimular el sistema de autodefensa inmunológico contra las células neoplásicas.

Ejemplo 4.

Mejoramiento de la fabricación

En este estudio ilustrativo, se determinó que las condiciones experimentales podrían ajustarse según fuera necesario para mejorar el rendimiento general durante la fabricación del quitosano glicado. Se descubrió inesperadamente que la fabricación del GC podría mejorarse mediante el control de las condiciones de pH y de este modo, el control del porcentaje de glicación. Específicamente, se determinó que la vida media del borohidruro de sodio (NaBH4) es proporcional al pH, lo que significa que a un pH más bajo la vida media del NaBH4 es extremadamente corta, y solo a un pH más alto el NaBH4 es algo más estable. Por tanto, se determinó que el NaBH4 no era tan eficaz para estabilizar el quitosano glicado mediante la reducción de las bases de Schiff y los productos de Amadori a un pH más bajo. Por ejemplo, cuando el pH se mantuvo por debajo de cinco (pH < 5), la vida media del NaBH4 fue extremadamente corta y, por lo tanto, la reducción de las bases de Schiff y los productos de Amadori fue menos eficiente y, por lo tanto, el porcentaje de glicación de GC disminuyó.

Sin embargo, se determinó que, con un pH más alto, la formulación "gelifica" y se vuelve no newtoniana. Por ejemplo, cuando el pH se mantuvo por encima de seis (pH >6), se observó que la formulación gelificaba y, por lo tanto, el lote tuvo que desecharse. En otras palabras, para lograr el objetivo de una fabricación eficiente de GC, el pH no se mantuvo tan alto que la formulación "gelificara", pero el pH tampoco se mantuvo tan bajo como para minimizar el porcentaje de glicación debido a la corta vida media del NaBH4.

Ejemplo 5.

Tratamiento de inmunoterapia asistida por láser (LIT) en un ensayo en humanos

Se realizó un ensayo de cáncer de mama dirigido por investigadores en 10 pacientes con cáncer de mama avanzado (5 en estadio IV, 5 en estadio III). La mayoría de los pacientes habían respondido pobremente, o en lo absoluto, a las modalidades convencionales y recibieron al menos un tratamiento de inmunoterapia asistida por láser (LIT) en el que se usó el quitosano glicado viscoelástico como inmunoadyuvante. Dos (2) pacientes se retiraron prematuramente por motivos no relacionados, quedando 8 pacientes evaluables. Los investigadores independientes obtuvieron las aprobaciones del IRB y del gobierno antes de los ensayos. Se usaron biopsias e imágenes médicas (tomografías computarizadas, etc.) para la evaluación de las lesiones primarias y las metástasis.

El parámetro de eficacia principal fue la mejor respuesta general según las evaluaciones de los investigadores mediante el uso de los Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST). La respuesta completa (CR) se definió como la desaparición o la falta de actividad metabólica calificativa de todas las lesiones diana. La respuesta parcial (PR) se definió como una disminución >30 % de la actividad inicial o en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana. La enfermedad progresiva (PD) se define como un aumento >20 % en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana o la aparición de una o más lesiones nuevas. La enfermedad estable (SD) se definió como ni una reducción suficiente para calificar para PR, ni un aumento suficiente para calificar para PD.

De los 8 pacientes con cáncer de mama disponibles para la evaluación, se observó CR en 1 paciente, PR en 4 pacientes y SD en 1 paciente. En los pacientes disponibles para la evaluación, la tasa de respuesta objetiva (CR PR) fue del 62,5 % y la tasa de respuesta clínicamente beneficiosa (CR PR SD) fue del 75 %. Se observó PD en 2 pacientes. Todas las lesiones locales irradiadas con láser respondieron a la LIT. Además, la mayoría de las metástasis distantes de estos pacientes respondieron a la LIT. Los diámetros y la actividad de las metástasis en los ganglios linfáticos, pulmón e hígado en varios pacientes disminuyeron drásticamente.

La toxicidad local y sistémica se clasificó de acuerdo con los criterios de toxicidad comunes del Instituto Nacional del Cáncer, versión 3.0. Periódicamente se realizaron evaluaciones de laboratorio y exámenes físicos. Los eventos adversos se monitorearon y se registraron de cerca durante todo el período de estudio. La LIT solo indujo reacciones locales dentro del área de tratamiento en los pacientes con cáncer de mama, la mayoría de las cuales se relacionaron con los efectos térmicos del tratamiento tópico con láser. El enrojecimiento, el dolor, el edema y la ulceración del área de tratamiento fueron los eventos adversos (AE) comunes. No se observaron eventos adversos de grado 3 o 4. En los pacientes que no recibieron la radioterapia previa, la hinchazón fue leve. Para los pacientes que recibieron la radioterapia previa, la hinchazón fue más sustancial con una duración más prolongada.

Ejemplo 6.

La inmunoterapia asistida por láser con el quitosano glicado demuestra una inmunidad antitumoral contra los tumores de melanoma B16 en ratones

Se inocularon subcutáneamente ratones hembra C57BC/6 (8 semanas de edad; 12 ratones/grupo) con el tumor de melanoma B16-F1 (106 células tumorales viables) en el área de la espalda. Los tumores alcanzaron el tamaño para el tratamiento (de 7 a 8 mm de diámetro) alrededor de 7 días después de la implantación. Se incluyeron en el estudio cinco grupos de tratamiento (12 ratones hembras/grupo): un control sin tratar; un control del tratamiento de inmunoterapia asistida por láser; y el tratamiento de inmunoterapia asistida por láser con 0,2 ml de quitosano glicado al 1 % inyectado peritumoralmente 24 h antes, inmediatamente después o 24 h después del tratamiento con láser. El láser de diodo de 805 nm se usó para la irradiación con láser, con ajustes de parámetros de 2 W durante 10 minutos de duración. El láser se dirigió a través de una fibra óptica con una lente difusora al final del sitio de tratamiento y la punta del láser se mantuvo a una distancia de 4 mm de la piel.

Se evaluó la supervivencia de los animales. Se observó el oscurecimiento y el endurecimiento de la piel del ratón en el sitio de tratamiento después del tratamiento con láser. La reaparición del tumor suele ocurrir varios días después del tratamiento. El tratamiento térmico en combinación con la aplicación del quitosano glicado dio como resultado una mejora significativa en la supervivencia de los animales con el quitosano glicado administrado 24 h antes de la irradiación con láser, mostrando las mejoras más significativas (ver tabla a continuación).

Ejemplo 7.

Inmunoterapia asistida por láser intersticial en un modelo mamario metastásico mediante el uso de láser de 805 nm y el quitosano glicado

Se realizó un estudio para determinar la dosis óptima del láser intersticial y la dosis óptima del quitosano glicado. Se inyectaron ratas hembra Wistar Furth (de 5 a 6 semanas de edad, 100 a 125 g) por vía subcutánea con el tumor mamario metastásico trasplantable DMBA-4 (105 células tumorales viables) en la zona de la espalda. Los tumores DMBA-4, originalmente inducidos químicamente, son altamente metastásicos y poco inmunogénicos. Los tumores hacen metástasis a través de los vasos linfáticos y rápidamente forman múltiples metástasis en sitios distantes, matando a todas las ratas de 30 a 40 días después de la implantación del tumor. Cuando el tumor primario fue de 0,2 a 0,5 cm3, se cortó el cabello que cubría el tumor y se realizó la inmunoterapia asistida por láser en los animales anestesiados (isofluorano al 2 %). Se usó un láser de diodo de 805 nm para suministrar luz del infrarrojo cercano a los tumores diana. La potencia del láser continua se suministró a través de una fibra óptica con una punta cilíndrica activa. Se usó una punta activa de 1,0 cm, con una funda de plástico transparente para proteger la punta activa. Para la inserción de la punta de fibra activa, se usaron métodos de inserción guiados por aguja o asistidos por punción. La posición intratumoral de la fibra se verificó mediante una cámara digital, que puede capturar la luz infrarroja del láser de 805 nm. Las ratas se observaron diariamente y los tumores se midieron dos veces por semana durante un período de al menos 100 días. El criterio para el éxito del tratamiento fue una supervivencia de 100 días después de la implantación del tumor. La dosis óptima del láser intersticial se determinó mediante la evaluación de los efectos en un control (9 ratas, sin tratamiento); potencias del láser intersticial de 1, 1,5, 2, 2,5 y 3 W/cm2 durante 10 min (14 ratas/grupo); y potencia del láser intersticial de 2 W/cm2 durante 30 min (14 ratas/grupo). Las ratas en el 3 W a los 10 min y 2 W a los 30 min parecieron tener tasas de supervivencia promedio más altas que otros grupos. La dosis óptima del quitosano glicado se determinó mediante la evaluación de la supervivencia tras la administración de 0,1, 0,2, 0,4 y 0,6 ml de quitosano glicado al 1 % tras la inmunoterapia asistida por láser intersticial a 2,5 W durante 20 min. Se incluyó como control un grupo de ratas que no recibieron tratamiento. La mejor supervivencia, al 42 %, se observó después de una dosis del quitosano glicado de 0,2 ml (consulte la figura siguiente).

120

o 20 40 SO 80 100 120

Días después de la implantación del tumor

Ejemplo 8.

Inmunidad antitumoral inducida contra tumores mamarios metastásicos DMBA-4 en ratas mediante el uso de la inmunoterapia asistida por láser

Se inocularon ratas hembra Wistar Furth (de 6 a 7 semanas de edad, 110 a 130 g) con el tumor mamario metastásico trasplantable DMBA-4 (105 células tumorales viables) en el área inguinal. El tumor primario apareció generalmente de 7 a 10 días después de la inoculación y fue de aproximadamente 1 a 5 g en 3 semanas. El tumor hizo metástasis a través de los vasos linfáticos hasta los ganglios linfáticos inguinales y axilares. El tratamiento se inició cuando el tumor primario fue de 0,2 a 0,5 cm3, generalmente de 10 a 15 días después de la inoculación. A las ratas se les administró el verde de indocianina al 0,25 % y la solución de quitosano glicado al 1 % (0,20 ml) inyectada directamente en el centro del tumor antes de la irradiación. Se usó un láser de diodo de 805 nm para la irradiación con láser, con ajustes de parámetros de 2 W durante 10 minutos de duración. El láser se dirigió a través de una fibra óptica al sitio de tratamiento. Después de la irradiación, los animales se alojaron individualmente y las observaciones y las mediciones del tumor se registraron dos veces por semana. Las ratas que se trataron con éxito (ratas curadas) se reexpusieron repetidamente con las mismas células tumorales a niveles de dosis del tumor de 105 a 107 células tumorales viables por rata y los animales se observaron durante 4 meses para el desarrollo del tumor. De las 32 ratas tratadas con la inmunoterapia asistida por láser, ocho ratas se trataron con éxito y estuvieron sin tumores durante >120 días después de la inoculación. En todas las ratas curadas, las metástasis continuaron desarrollándose después del tratamiento, luego disminuyeron gradualmente, y finalmente desaparecieron sin tratamiento adicional. Siete ratas tratadas con éxito se reexpusieron hasta tres veces con niveles de dosis que varían de 105 a 107 células tumorales viables por inyección. No hubo resurgimiento tumoral primario o metastásico en ninguno de estos animales y los animales sobrevivieron >120 días, mientras que las ratas de control sin tratar desarrollaron tumores primarios y metastásicos y tuvieron una supervivencia promedio de 30 días.

Ejemplo 9.

Mejora del tratamiento del cáncer con láser mediante un inmunoadyuvante derivado del quitosano

Se evaluó el efecto del inmunoadyuvante durante el tratamiento de inmunoterapia asistida por láser en ratas mediante el uso de cuatro inmunoadyuvantes diferentes. Se inocularon ratas hembra Wistar Furth (de 6 a 8 semanas de edad, 150 a 200 g) por vía subcutánea con el tumor mamario metastásico trasplantable DMBA-4 (105 células tumorales viables) en la almohadilla de grasa inguinal, de 7 a 10 días antes del tratamiento. El tumor primario generalmente se hizo palpable en 5 a 7 días y las metástasis inguinales y axilares remotas aparecieron de 15 a 20 días después de la inoculación. El tratamiento con la inmunoterapia asistida por láser se inició cuando el tumor primario alcanzó de 0,2 a 0,5 cm3. El tratamiento con láser se realizó generalmente el día 10. Los inmunoadyuvantes incluyeron la solución acuosa de quitosano glicado al 1 % (dosis de 0,2 ml; n = 48 ratas en dos experimentos), el adyuvante completo de Freund al 50 % (dosis de 0,2 ml; n = 33 ratas), el adyuvante incompleto de Freund al 50 % (dosis de 0,2 ml; n = 30 ratas) y Corynebacterium parvum (C. parvum; 35 pg/dosis de rata; n = 32 ratas). Los inmunoadyuvantes se mezclaron con el verde de indocianina al 0,25 % y se inyectaron directamente en el centro del tumor 2 h antes de la irradiación con el láser de diodo de 805 nm. Los animales se anestesiaron antes de la irradiación y se cortó el pelo que recubría el tumor primario. Los parámetros del láser fueron 2 W durante 10 min con un sitio de tratamiento con láser de 3 mm de diámetro, lo que resultó en una fluencia de 96 J/cm2 para un tumor de 1 cm de diámetro. Los animales se alojaron individualmente, se observaron diariamente y las mediciones de la carga tumoral se recopilaron dos veces por semana.

Los datos de este estudio se compararon con los datos de las ratas de control con tumores (n = 38 ratas) en varios experimentos diferentes. Todos los inmunoadyuvantes tuvieron un aumento estadísticamente significativo en la tasa de supervivencia en comparación con los datos de control (p < 0,05). El quitosano glicado al 1 % pareció ser el inmunoadyuvante más eficaz con una tasa de supervivencia a largo plazo del 29 % (ver tabla a continuación). Se observó una significación estadística cuando se comparó el adyuvante de quitosano glicado con C. parvum (p = 0,009) y el adyuvante incompleto de Freund (p = 0,03). Aunque no fue significativa, se observó una mejora notable en la supervivencia en comparación con el adyuvante completo de Freund que tenía una tasa de curación comparable (18 %). Se observó una tasa de supervivencia relativamente débil después del tratamiento con el adyuvante incompleto de Freund y C. parvum.

Ejemplo 10.

Mejora de la terapia fotodinámica mediante un inmunoadyuvante derivado del quitosano

Para evaluar la terapia fotodinámica como un método para la destrucción directa de tumores en combinación con el quitosano glicado, se estudió una combinación de la terapia fotodinámica basada en tetra(meta-hidroxifenil)clorina meso-sustituida (mTHPC) y Photofrin y la inyección del quitosano glicado en los modelos de ratón con sarcoma mamario EMT6 y adenocarcinoma de pulmón de línea 1, respectivamente. En cada modelo, los ratones BALB/c se inocularon por vía subcutánea con 106 células tumorales viables en la zona dorsal inferior. Los tumores tenían el tamaño para el tratamiento (de 7 a 8 mm) después de 7 días.

En el modelo de sarcoma mamario EMT6, los grupos de tratamiento evaluados se detallan en la siguiente tabla. Se preparó el Photofrin (Mont-Saint-Hilaire, Quebec, Canadá) en dextrosa estéril al 5 % a una concentración de 1 mg/ml. Se administró por vía intravenosa una dosis de 5 mg/kg de Photofrin 24 h antes de la irradiación. Se protegieron a los animales de la luz directa inmediatamente después de la inyección del fotosensibilizador hasta 3 días después del tratamiento fotodinámico. Los ratones se inmovilizaron sin anestesiar en soportes exponiendo sus espaldas durante el tratamiento con luz. Se suministró la luz (630 nm) a través de una guía de luz líquida de 8 mm de diámetro. La densidad de potencia se fijó en 100 mW/cm2, para una dosis de luz total de 60 J/cm2. Inmediatamente después de la irradiación de luz, si corresponde, a los animales se les administró una dosis peritumoral de quitosano glicado al 0,5 o 1,5 %. Se observó la aparición de tumores en los animales cada 2 días hasta 90 días después del tratamiento fotodinámico y se determinaron los cambios en el volumen del tumor 3 veces por semana.

Todas las ratas tratadas con quitosano glicado fotodinámico tuvieron una regresión tumoral completa al día siguiente del tratamiento. La reaparición del tumor se detectó generalmente dentro de las 2 semanas posteriores al tratamiento. La eficacia de la terapia fotodinámica estándar fue del 37,5 %, que aumentó tras la administración del quitosano glicado al 0,5 y 1,5 % con valores de 62,5 y 75 %, respectivamente. El quitosano glicado aumentó significativamente las tasas de supervivencia en ratones con tumores en comparación con el tratamiento fotodinámico solo (p <0,05).

En el modelo de tumor de pulmón de la Línea 1, los grupos de tratamiento fueron los que se presentan en la tabla siguiente. Se preparó mTHPC en una mezcla 2:3:5 (v/v/v) de etanol, polietilenglicol 400 y agua para una concentración final de 0,02 mg/ml. Se administró por vía intravenosa una dosis de 0,1 mg/kg de mTHPC 24 h antes de la irradiación. Se protegieron a los animales de la luz directa inmediatamente después de la inyección del fotosensibilizador hasta 3 días después del tratamiento fotodinámico. Los ratones se inmovilizaron sin anestesiar en soportes exponiendo sus espaldas durante el tratamiento con luz. Se suministró una luz de 652 nm de un láser de diodo de 0,25 W a través de una guía de luz líquida de 8 mm de diámetro. La densidad de potencia se fijó en 110 mW/cm2, para una dosis de luz total de 30 J/cm2. Inmediatamente después de la irradiación de luz, si corresponde, a los animales se les administró una dosis peritumoral de quitosano glicado al 1,67 %. Se observó la aparición de tumores en los animales cada 2 días hasta 90 días después del tratamiento fotodinámico y se determinaron los cambios en el tamaño del tumor 3 veces por semana.

Se observaron las reapariciones de tumores en todos los ratones dentro de 3 semanas. Después de la terapia fotodinámica basada en mTHPC, la administración del quitosano glicado al 1,67 % dio como resultado una tasa de supervivencia del 37,5 %, mientras que otras combinaciones no fueron eficaces. El modelo de tumor de pulmón de la Línea 1 se consideró un modelo de tumor poco inmunogénico. El efecto del tratamiento con el quitosano glicado localizado en el tumor sobre la respuesta de los tumores de la Línea 1 de ratón a la terapia fotodinámica basada en mTHPC se presenta en la siguiente figura.

Los resultados de estos estudios indican que se necesita una estimulación inmunológica activa para aumentar la eficacia de la fototerapia.

Ejemplo 11.

Efecto de diferentes componentes de la inmunoterapia asistida por láser en el tratamiento de tumores metastásicos en ratas

En este estudio se evaluaron varias combinaciones de tres componentes del sistema de inmunoterapia asistida por láser mediante el uso de ratas hembras y machos con tumores metastásicos de mama y próstata, respectivamente. El sistema de inmunoterapia asistida por láser consistió en un láser de diodo de láser infrarrojo cercano con una potencia máxima de 25 W; el tinte que absorbe el láser, el verde de indocianina; y el inmunoadyuvante, el quitosano glicado. Cuando el tumor primario fue de 0,2 a 0,5 cm3, se inició el tratamiento en las ratas con tumores. Se inyectó una solución de 0,2 ml de GC y/o ICG en el centro del tumor primario en todos los grupos. En las ratas que recibieron el tratamiento con láser, las inyecciones ocurrieron 2 h antes de la irradiación, con los animales anestesiados y se cortó el pelo que recubre el tumor. Los ajustes del láser fueron de 2 W y 10 min, con la punta de la fibra láser mantenida a una distancia de 4 mm de la piel suprayacente y la energía del láser dirigida a los sitios de tratamiento a través de fibras ópticas.

Los animales se alojaron individualmente después del tratamiento. En los estudios de supervivencia, los animales se alojaron individualmente después del tratamiento. En los estudios de supervivencia, las ratas con tumores de mama o próstata se observaron diariamente y se midieron semanalmente las tres dimensiones de cada tumor. Se inocularon ratas hembra Wistar Furth (de 5 a 6 semanas de edad, 100 a 125 g) por vía subcutánea con el tumor mamario metastásico trasplantable DMBA-4 (105 células tumorales viables) en una almohadilla de grasa inguinal de cada rata. El tumor primario emergió de 7 a 10 días después de la inoculación. Los tumores hacen metástasis a través de los vasos linfáticos y en sitios remotos generalmente se vuelven palpables en aproximadamente 2 semanas. Sin tratamiento, las ratas con tumores tienen un tiempo de supervivencia promedio de 35 días. Se trataron ocho grupos de ratas con tumores metastásicos con los diferentes componentes del sistema de inmunoterapia asistida por láser, como se detalla en la tabla siguiente. Se determinaron la tasa de supervivencia y los perfiles de los tumores primarios y metastásicos para los componentes individuales y varias combinaciones de los componentes. Además, tres grupos de ratas hembra (n = 16/grupo) se trataron con el quitosano glicado al 0,5, 1,0 y 2,0 % para evaluar el impacto de la concentración de inmunoadyuvante en la supervivencia de las ratas.

En las ratas con tumores de mama metastásicos, el tratamiento de un solo componente dio como resultado la muerte de todas las ratas en los grupos del verde de indocianina y solo láser, con tiempos de supervivencia promedio similares al grupo de control. Sobrevivieron dos ratas del grupo del quitosano glicado, una rata considerada como superviviente a largo plazo y la otra rata como superviviente prolongada (>120 días). Después del tratamiento con dos componentes, se observaron 1 y 2 supervivientes a largo plazo en los grupos del láser más el quitosano glicado y el verde de indocianina más el quitosano glicado, respectivamente. No hubo significación estadística en el tiempo de supervivencia cuando se compararon los grupos de tratamiento de uno o dos componentes con el grupo de control. Nueve ratas tuvieron una supervivencia a largo plazo después del tratamiento de inmunoterapia asistida por láser con tres componentes (es decir, la aplicación fototérmica combinada con el quitosano glicado), lo que resultó en una tasa de curación aproximada del 30 % en dos experimentos separados de 31 ratas. Se observó una diferencia significativa (p <0,0001) en el tiempo de supervivencia promedio de las ratas tratadas en comparación con las ratas de control. La tasa de supervivencia de las ratas después del tratamiento con uno, dos o tres componentes del sistema de inmunoterapia asistida por láser se presenta en la figura siguiente. Los tumores metastásicos generalmente emergen 2 semanas después de la inoculación del tumor primario y alcanzan un tamaño máximo antes de la regresión.

Días desde la implantación del tumor

Tasas de supervivencia de las ratas después del tratamiento con uno. dos o tres componentes del sistema de inmunoterapia asistida por láser.

Quitosano glicado al 1,0 %

ICG = Verde de indocianina al 0,25 %

Ejemplo 12.

Inmunidad antitumoral inducida por la inmunoterapia asistida por láser y su transferencia adoptiva

Para investigar el mecanismo de la inmunidad antitumoral inducida por la inmunoterapia asistida por láser, se realizó una transferencia adoptiva mediante el uso de células inmunitarias del bazo. Se inocularon ratas hembra Wistar Furth por vía subcutánea con el tumor mamario metastásico trasplantable DMBA-4 (105 células tumorales viables) en una almohadilla de grasa inguinal de cada rata, de 7 a 10 días antes del tratamiento de inmunoterapia asistida por láser. Sin tratamiento, las ratas con tumores sobrevivieron un promedio de aproximadamente 30 días. A las ratas tratadas con láser se les administraron 0,2 ml de una solución que contenía tanto el verde de indocianina al 0,25 % como el quitosano glicado al 1 % directamente en el tumor primario antes del tratamiento con láser. Se usó un láser de 805 nm a 2 W durante 10 min para la irradiación. La capacidad protectora de la inmunidad inducida se evaluó en varios grupos de ratas con tumores tratadas con éxito que se expusieron repetidamente con dosis de inoculación incrementadas de células tumorales viables. Además, se evaluó la resistencia a las exposiciones al tumor después de la inmunoterapia asistida por láser y la inhibición del crecimiento tumoral en ratas sin tratamiento.

Quince ratas que se habían tratado con éxito mediante inmunoterapia asistida por láser se reexpusieron con 106 células tumorales viables 120 días después de la inoculación inicial. Dieciocho ratas de la misma edad sin tratamiento previo (25 semanas de edad) se inocularon con 106 células tumorales viables para fines comparativos. Todas las ratas tratadas con éxito mostraron una resistencia total a la exposición, sin que se observaran tumores primarios ni metástasis; sin embargo, las ratas de control de la misma edad desarrollaron tumores primarios y metastásicos y murieron dentro de los 30 días posteriores a la inoculación. Un grupo separado de ratas jóvenes (de aproximadamente 8 semanas de edad) se inocularon con 105 células tumorales viables. La supervivencia parecía ser dependiente de la dosis del tumor, las ratas de control se inocularon con 105 y 106 células tumorales viables que sobrevivieron en promedio 33 y 28 días, respectivamente. Las ratas tratadas con éxito normalmente experimentaron una regresión gradual tanto en el tumor primario tratado como en la metástasis sin tratar.

Después de la primera reexposición, las ratas de varios grupos experimentales se siguieron por dos exposiciones posteriores en un intervalo de tiempo de 1 a 5 meses, con 106 células tumorales viables. Las ratas tratadas con éxito mediante la inmunoterapia asistida por láser fueron totalmente resistentes a las tres exposiciones al tumor. Estos datos se presentan en la siguiente tabla. Por el contrario, las ratas con tumores de control de la misma edad desarrollaron múltiples metástasis en áreas inguinales y axilares remotas y murieron en 35 días. Se desarrollaron múltiples metástasis en todas las 20 ratas de control inoculadas con 105 células tumorales viables; sin embargo, estas ratas tuvieron un tiempo de supervivencia ligeramente mayor en comparación con las ratas de control de la misma edad que se inocularon con la dosis más alta de 106 células tumorales viables. La resistencia a la reexposición al tumor en ratas tratadas con éxito sugiere fuertemente una inmunidad selectiva para el tumor.

Para el experimento de inmunización adoptiva, el tejido tumoral viable recogido de las ratas con tumores DMBA-4 vivas se dispersó en una suspensión unicelular mediante trituración en un homogeneizador de vidrio esmerilado suelto. Las ratas que sobrevivieron durante mucho tiempo se sacrificaron 28 días después de la reexposición al tumor con 106 células tumorales viables y se diseccionaron los bazos sin grasa. Se llevaron a cabo dos experimentos separados mediante el uso de los esplenocitos de las ratas con tumores de control. Las células del bazo se recolectaron 22 y 39 días después de la inoculación del tumor en el primer y segundo experimento, respectivamente. Las suspensiones celulares se prepararon mediante la rotura mecánica en medio con suero de ternero fetal al 10 %. También se recopilaron las células del bazo de una rata sin tratamiento sin exposición previa a las células tumorales. Se contaron las células del bazo y las células tumorales viables en un hemocitómetro antes de mezclarlas hasta una relación células del bazo:células tumorales de 400:1. Las ratas sin tratamiento se inocularon con la mezcla que contiene 4 x 107 células del bazo y 105 células tumorales viables en un volumen de 0,2 ml. Para los experimentos de transferencia de inmunidad adoptiva, se inocularon 4 grupos de ratas Wistar Furth hembras sin tratamiento con células tumorales. Los grupos de tratamiento fueron Grupo A: ratas de control con tumores inoculadas con 105 células tumorales viables sin tratamiento; Grupo B: ratas inoculadas con las células tumorales mezcladas con las células del bazo de una rata con tumor de control; Grupo C: ratas inoculadas con las células tumorales mezcladas con las células del bazo de una rata con tumor tratada con éxito mediante inmunoterapia asistida por láser, 28 días después de la reexposición al tumor; y Grupo D: ratas inoculadas con las células tumorales mezcladas con las células del bazo de una rata sin tratamiento sin exposición previa al tumor. El experimento se realizó por duplicado y la supervivencia de las ratas de ambos experimentos se combinó y se presenta en la figura siguiente. No se observaron tumores primarios o metastásicos en las ratas del Grupo C, lo que indica que las células del bazo de las ratas tratadas con éxito con inmunoterapia asistida por láser proporcionan una protección del 100 % a los receptores. Se observaron múltiples metástasis y la muerte dentro de los 35 días posteriores a la inoculación del tumor en todas las ratas de control con tumores del Grupo A. No se proporcionó protección por parte de las células del bazo de una rata sana en el Grupo D. Sobrevivió una sola rata de las 10 ratas del Grupo B; sin embargo, esta rata desarrolló posteriormente tanto un tumor primario como metástasis. Todas las ratas del Grupo C se reexpusieron 60 días después de la transferencia de inmunidad adoptiva y todas resistieron a la exposición. Las células inmunitarias del bazo de las ratas del Grupo C se recopilaron y se mezclaron con células tumorales en la misma relación que en la primera transferencia adoptiva para evaluar la capacidad de las células del bazo de estos animales para proteger una cohorte posterior de ratas receptoras Wistar Furth normales (n = 6) que se inocularon con esta mezcla. Las células inmunitarias de las ratas del Grupo C protegieron a 5 de las 6 ratas sin tratamiento previo, ya que no se observaron tumores primarios ni metastásicos. La rata que murió tuvo un tiempo de supervivencia prolongado (60 frente a 30 días) y una aparición tardía del tumor después de la inoculación (37 frente a de 7 a 10 días), en comparación con el grupo de control.

La resistencia de las ratas tratadas con éxito cuando se reexpusieron al tumor sugiere fuertemente que la inmunidad selectiva del tumor tiene un efecto duradero.

Curvas de supervivencia de las ratas en los experimentos de transferencia de inmunidad adoptiva mediante el uso de esplenocitos de rata como células inmunitarias.

Grupo A = Resultados de las ratas de control con tumores.

Grupo B = Resultados de las ratas inyectadas con las células tumorales mezcladas con las células del bazo de una rata con tumores sin tratar.

Grupo C = Resultados de las ratas inyectadas con las células tumorales mezcladas con las células del bazo de la rata tratada con éxito con inmunoterapia asistida por láser.

Grupo D = Resultados mediante el uso de las células del bazo de una rata sin tratamiento.

NOTA: Los datos recopilados de 2 experimentos separados se combinaron y se representaron juntos.

Ejemplo 13.

Combinación de la inmunoterapia asistida por láser y la quimioterapia de dosis baja

En un estudio clínico ilustrativo, dos pacientes con cáncer de mama recibieron la ciclofosfamida semanalmente (después del tratamiento con las inCVAX) a una dosis de entre 150 y 200 mg/m2. Los pacientes respondieron inicialmente bien al tratamiento con una reducción del tumor y reacciones adversas mínimas. Después de unos meses, la respuesta se desaceleró, por lo que el oncólogo cambió la quimioterapia de dosis baja a un régimen semanal de paclitaxel a 75 mg/m2, y nuevamente la respuesta fue muy buena con reducción de los tumores. No aparecieron nuevas metástasis. Los pacientes continuaron recibiendo quimioterapia de dosis baja. Un tercer paciente se volvió operable después de la quimioterapia de dosis baja y se realizó una mastectomía, por lo que una combinación con la cirugía también fue una opción.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de quitosano glicado viscoelástico, que consiste en el polímero de quitosano glicado como una solución acuosa, en donde el polímero de quitosano glicado tiene un peso molecular entre 50000 Dalton y 250 000 Dalton, en donde el grado de glicación de los grupos amino libres del polímero de quitosano varía de un décimo del uno por ciento al siete por ciento, en donde el grado de desacetilación de una quitina original del quitosano glicado viscoelástico es del ochenta por ciento, y en donde la formulación tiene un pH de 5 a 6.

2. La formulación de quitosano glicado viscoelástico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero de quitosano glicado posee el dos por ciento de glicación de sus grupos amino de otro modo libres.

3. La formulación de quitosano glicado viscoelástico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la solución acuosa comprende una solución salina fisiológica amortiguada.

4. La formulación de quitosano glicado viscoelástico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la formulación viscoelástica comprende el uno por ciento en peso del polímero de quitosano glicado disperso en la solución acuosa, dicha solución acuosa tiene una viscosidad de entre uno y cien mm2/s medida a 25 grados Celsius.

5. La formulación de quitosano glicado viscoelástico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos el uno por ciento en peso del polímero de quitosano glicado disperso en la solución acuosa, en donde el polímero de quitosano glicado posee el cinco por ciento de glicación de sus grupos amino de otro modo libres.

6. Una formulación de quitosano glicado viscoelástico como se define en la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer.

7. Un inmunoadyuvante que comprende la formulación de quitosano glicado viscoelástico de acuerdo con la reivindicación 1.