BR112014017426B1

BR112014017426B1 - Formulação de quitosana glicada viscoelástica, composição farmacêutica, composição e imunoadjuvante

Info

Publication number: BR112014017426B1
Application number: BR112014017426-1A
Authority: BR
Inventors: Tomas Hode; Robert Nordquist; Wei Chen; Raoul Carubelli; Luciano Alleruzzo; Peter Jenkins; Kristopher Waynant; Joseph Raker
Original assignee: Immunophotonics, Inc.
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2021-12-28
Also published as: WO2013109732A3; AU2013209716B2; EP2804611A4; SG11201403943TA; AU2013209716A1; KR20200139254A; IL233649B; KR20180123727A; CL2014001880A1; EP2804611B1; JP2015513522A; DK2804611T3; KR20140117487A; HRP20201647T1; NZ628433A; CN104619310A; CO7101239A2; MX371275B; EP3831393A1; KR20170032490A

Abstract

formulação de quitosana glicada viscoelástica, método para o tratamento do câncer, composição, imunoadjuvante, e, método para destruir a neoplasia de forma fotofísica, e ao mesmo tempo gerar uma vacina autóloga in situ. o presente invento refere-se genericamente a composições terapêuticas compreendendo composições de derivados de quitosana, sio usadas em conexão com métodos para o tratamento de neoplasmas, como é o caso dos neoplasmas malignos do pulmão, tiróide e rim, de outros tipos de tumores malignos, e de outras desordens médicas.

Description

DIREITO DE PRIORIDADE

[0001] O presente Pedido de Patente Internacional PCT (Tratado de Cooperação de Patente) reivindica prioridade para o Pedido da Patente Provisória dos EUA, com o Número Serial 61/588, 783, intitulada “Biomateriais derivados da quitosana e suas aplicações”, apresentada no dia 20 de janeiro de 2012, e de todos os seus conteúdos, incorporados por referência em sua plenitude.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] O presente invento refere-se genericamente a composições terapêuticas contendo composições de derivados de quitosana, usadas em conexão com métodos para o tratamento de neoplasmas malignos, como o do pulmão, mama, próstata, pele, tiróide, rim, e de outros tipos de neoplasmas malignos, e outras desordens médicas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] Quitosana é um derivado da quitina, um composto geralmente isolado a partir das cascas de alguns crustáceos, como caranguejo, lagosta e camarão. Quitina é um homopolímero linear composto por unidades de N- acetilglucosamina unidas por meio de ligações β 1^4 glicosídicas. Quitina, quitosana (quitina parcialmente desacetilada) e seus derivados são dotados de propriedades biológicas e químicas interessantes, que levaram a um número variado e crescente de aplicações industriais e médicas. Quitosana glicada, descrita na Patente dos EUA. 5.747.475 ("Biomateriais derivados de quitosana"), aqui incorporada por referência, é um desses derivados de quitosana.

[0004] O câncer pode desenvolver-se em qualquer tecido, em qualquer órgão, em qualquer idade. Uma vez feito o diagnóstico inequívoco de câncer, decidir o tratamento é primordial. Embora nenhuma abordagem de tratamento seja aplicável a todos os tipos de câncer, terapias que apresentam resultados precisam ser focadas tanto no tumor primário como em suas metástases. Historicamente, a terapia local e regional, como cirurgia ou radioterapia, vem sendo usada no tratamento do câncer, junto com terapias sistêmicas, por ex., fármacos quimioterápicos. Apesar de algum sucesso, os tratamentos convencionais não são eficazes na medida desejável, prosseguindo a busca de terapias mais eficazes. Há claramente uma necessidade não satisfeita e significativa de terapias do câncer mais eficientes.

[0005] Preparações de quitosana glicada convencionais, como descrito na Patente dos EUA 5.747.475 ("Biomateriais derivados de quitosana"), demonstraram significativa eficácia como imunoadjuvantes no tratamento de modelos tumorais metastáticos em animais.

[0006] Porém, os preparos de quitosana glicada convencionais, quando dispersos, suspensos ou dissolvidos em soluções aquosas, são freqüentemente muito difíceis de injetar ou dispensar nas respectivas aplicações biomédicas. Além disso, as preparações de quitosana glicada convencionais, como descrito na Patente dos EUA 5.747.475 ("Biomateriais derivados de quitosana"), são quase impossíveis como filtro estéril, tornando- as inadequadas para a fabricação industrial de acordo com as Boas Práticas de Fabrico (cGMP) atuais, e, portanto, inadequadas para usar em humanos. É, assim, um objeto do presente invento fornecer preparações de quitosana glicada viscoelástica melhoradas, que estão menos sujeitas às desvantagens acima mencionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] De acordo com uma configuração, o presente invento refere-se genericamente a formulações de composições terapêuticas contendo derivados de quitosana, usadas em conexão com os métodos de tratamento de neoplasmas e outras doenças médicas. Aspectos adicionais e/ou vantagens do invento serão apresentados em parte na descrição abaixo e, podem ser aprendidos através da prática do invento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0008] Estes e/ou outros aspectos e vantagens do invento irão se tornar evidentes e mais prontamente apreciados a partir da seguinte descrição das modalidades, feita em conjunto com os desenhos que a acompanham, onde:

[0009] A Figura 1 representa um exemplo convencional de quitosana glicada, por ex., galactoquitosana.

[00010] A Figura 2 representa uma estrutura exemplificativa da quitosana glicada viscoelástica do presente invento, onde a desacetilação da quitosana-pai é de 80%, e a glicação total dos grupos amino desacetilados disponíveis é de 12,5%.

[00011] Ainda outros objetos e vantagens das configurações preferidas do presente invento irão tornar-se prontamente evidentes para os especialistas nesta técnica na seguinte descrição pormenorizada, onde certas configurações preferidas do invento são descritas, e exemplos para fins ilustrativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00012] O invento refere-se genericamente a formulações terapêuticas contendo composições derivadas de quitosana, usadas em conexão com métodos para o tratamento de neoplasmas e outras desordens médicas. É para ser entendido que todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência em sua plenitude.

[00013] Será feita agora referência detalhada a certas configurações do presente invento, cujos exemplos estão ilustrados nos desenhos anexos, onde os números correspondem aos respectivos elementos. É para ser entendido que o presente invento é capaz de modificações em vários aspectos óbvios, que não se afastam do espírito e âmbito da invenção. Portanto, a descrição precisa ser considerada como ilustrativa, e não restritiva.

QUITOSANA GLICADA

[00014] Quitosana glicada é um produto da glicação (por ex., glicosilação não-enzimática) de grupos de quitosana livres de amino, seguida da estabilização por meio de redução. A glicação atribui para a quitosana características vantajosas de solubilidade e viscosidade, que facilitam o uso do derivado em conjunto com a imunoterapia assistida por laser e outras aplicações do derivado. A glicação da quitosana também torna a quitosana mais hidrofílica, pelo que o polímero absorve e retém mais água do que seria o caso.

[00015] De acordo com as configurações preferidas do presente invento, um biomaterial derivado de quitosana contém um homopolímero linear de quitina desacetilada (quitosana), onde a quitina desacetilada possui um número de grupos amino de outro modo livres, ligados a um grupo carbonilo de um monossacarídeo ou oligossacarídeo reduzido, para formar quitosana glicada. Quitosana glicada pode, assim, ser obtida como produto da reação entre o grupo carbonilo de um monossacarídeo reduzido ou oligossacarídeo e os grupos amino livres da quitina desacetilada. Assim, o termo "quitosana glicada", como usado aqui, pretende referir-se a um produto da glicação, ou seja, a glicosilação não-enzimática de grupos amino livres da quitosana, seguido por estabilização por redução. De um modo geral, a glicação (ou glicosilação não-enzimática) é usada para referir um processo que ocorre quando uma molécula de açúcar, como frutose ou glicose, se conecta a um substrato, como uma proteína ou molécula de lípido, sem a ação contributiva de uma enzima. Um exemplo é a reação não-enzimática de um açúcar e um grupo amino de uma proteína para formar uma glicoproteína.

[00016] A quitosana glicada, inclui assim, geralmente, os produtos que resultam da reação entre os grupos amino livres da quitosana e os grupos carbonilo de monossacarídeos reduzidos e/ou oligossacarídeos. Os produtos desta reação, que são essencialmente uma mistura de bases de Schiff (ou seja, o átomo de carbono do grupo carbonilo está agora duplamente ligado ao nitrogênio da amina livre, liberando uma molécula de água) e produtos de Amadori (ou seja, o átomo de carbono do referido grupo carbonilo está individualmente ligado ao átomo de nitrogênio do referido grupo amino, enquanto que um átomo de carbono adjacente está duplamente ligado a um átomo de oxigênio), podem usar-se como estão, ou após estabilização, por redução com hidretos, como agentes redutores de boro-hidreto, por exemplo NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)3, etc., ou por exposição a hidrogênio na presença de catalisadores adequados.

[00017] A presença de grupos de alcoóis primários e secundários, e de grupos amino primários na quitosana, permite várias abordagens para obter modificações químicas que se destinam, principalmente, a atingir a sua solubilização e conferir propriedades especiais para aplicações específicas.

[00018] A solubilização de quitina e quitosana pode obter-se por meio da hidrólise parcial de oligossacarídeos. Para a quitosana, o tratamento com uma variedade de ácidos, orgânicos e inorgânicos, leva à formação de sais de quitosónio hidrossolúveis por protonação dos grupos amino livres. Modificações adicionais dos grupos amino incluem a introdução de grupos químicos, como o carboximetilo, glicerilo, N-hidroxibutil, e outros. Glicação, ou seja, a glicosilação não-enzimática dos grupos amino livres de quitosana, seguida da estabilização por redução, oferece a abordagem preferida para o preparo de várias formulações farmacêuticas usadas no presente invenção.

[00019] Para fins ilustrativos, um exemplo convencional da quitosana glicada, a galactoquitosana, é apresentado abaixo na Figura 1, que também está descrita e ilustrada na Patente 5.747.475 dos EUA:

Figura 1. Estrutura exemplificativa da quitosana glicada convencional, onde o peso molecular é de aproximadamente 1,5 milhões de Daltons e todos os grupos amino são glicados.

[00020] A patente dos EUA 5.747.475 é muito limitada em sua descrição e descreve uma galactoquitosana específica apenas em termos de peso molecular; especificamente, a patente EUA 5.747.475 descreve apenas a galactoquitosana com um peso molecular de 1500 kDa.

[00021] Contrariamente à galactoquitosana de 1500 kDa convencional, descrita na Patente dos EUA 5.747.475, é para ser claramente entendido que a quitosana glicada do presente invento, conforme descrito aqui, se destina a incluir quitosana glicada com um peso molecular menor que 1500 kDa. Além disso, ao contrário das quitosanas convencionais, a quitosana glicada do presente invento é uma composição nova e completamente diferente, com um número surpreendente e inesperado de propriedades, benefícios e vantagens, incluindo propriedades viscoelásticas inesperadamente benéficas.

[00022] A quitosana glicada do presente invento está na forma de uma base de Schiff, de um produto de Amadori, ou, preferivelmente, em sua amina secundária reduzida ou álcool, respectivamente. Em outra configuração, a quitosana glicada inclui um grupo carbonilo reativo. Prefere-se que a quitosana glicada do presente invento seja obtida, fazendo reagir a quitosana com um monossacarídeo e/ou oligossacarídeo, preferivelmente na presença de um agente acidificante, por tempo suficiente para obter a formação da base de Schiff entre o grupo carbonilo do açúcar e os grupos amino primários de quitosana (também referido aqui como glicação do grupo amino), até que seja alcançada glicação entre cerca de 0% e 30% (preferencialmente acima de 2%) dos grupos amino do polímero de quitosana. Esta é, de preferência, seguida de estabilização por meio da redução das bases de Schiff e de seus derivados rearranjados (produtos de Amadori) para as aminas secundárias ou alcoóis.

[00023] O presente invento é a primeira demonstração onde entre cerca de 0,1% e 30% (preferivelmente acima de 2%) de glicação do polímero de quitosana é alcançada. Ao contrário do presente invento, outros falharam em alcançar ou reconhecer este resultado significativo. Assim, de acordo com uma configuração preferida, o presente invento providencia uma formulação de quitosana glicada viscoelástica, que consiste essencialmente de polímero de quitosana glicada, onde o polímero de quitosana glicada possui um peso molecular entre cerca de 50.000 e 1,5 milhões de Daltons, e ainda entre cerca de um décimo de um por cento e trinta por cento de glicação de seus grupos amino de outra forma livres.

[00024] Os produtos resultantes da glicosilação não-enzimática de grupos amino livres da quitosana são essencialmente uma mistura de bases de Schiff, ou seja, o átomo de carbono do grupo carbonilo inicial, duplamente ligado ao átomo de nitrogênio do grupo amino (também conhecido por grupo imina funcional), e produtos de Amadori, ou seja, o átomo de carbono do grupo carbonilo inicial ligado ao átomo de nitrogênio do referido grupo amino por uma ligação simples, enquanto um átomo de carbono adjacente está duplamente ligado a um átomo de oxigênio, formando um grupo cetona. Esses produtos (resultantes do processo de glicosilação não-enzimática) poderão ser usados como tal, ou após estabilização, pela redução com hidretos, como agentes redutores de boro-hidreto, por exemplo NaBH4, NaBH3CN, NaBH(OAc)3, etc., ou pela exposição a hidrogênio na presença de catalisadores adequados.

[00025] É possível usar a desaminação de quitosana com ácido nitroso para gerar aldoses e oligossacarídeos redutores, adequados para a glicação de quitosana. A desaminação dos resíduos de glucosaminil desacetilado, por meio de ácido nitroso, resulta na clivagem seletiva de suas ligações glicosídicas, com a formação de resíduos de 2,5-anidro-D-manose. Dependendo da composição de áreas específicas da cadeia de quitosana, a hexose de anidro pode ser liberada como monossacarídeo, ou ocupar a extremidade redutora de um oligossacarídeo. Liberação de N-acetil- glucosamina livre também pode ocorrer a partir de algumas regiões da cadeia da quitosana. Tratamento similar das glicoproteínas N-desacetiladas e glicolipídeos pode se usar para obter oligossacarídeos de composição química e atividade biológica definida para preparos especiais de quitosana glicada.

[00026] Vários produtos obtidos por glicação da quitosana serão usados tal qual, ou em reação com outros materiais naturais ou sintéticos, por ex., a reação de derivativos de quitosana glicada contendo aldeído, com substâncias que possuem dois ou mais grupos amino livres, como as cadeias laterais de aminoácidos ricas em resíduos de lisina, como o colágeno, em resíduos de hexosamina, como a quitosana e glicoconjugados desacetilados, ou em diaminas e poliaminas naturais e sintéticas. Isso deverá gerar reticulação através da formação da base de Schiff e rearranjos posteriores, condensação, desidratação, etc. A estabilização de materiais de quitosana glicada modificada pode ser feita por redução química ou cura envolvendo rearranjos, condensação ou desidratação, quer espontânea ou por incubação, sob várias condições de temperatura, umidade e pressão. A química dos rearranjos Amadori, bases de Schiff e reação Leukart-Wallach se encontra detalhada em “The Merck Index”, Nona Edição (1976) páginas ONR-3, ONR-55 e ONR-80, Cartão n.° 76-27231 da Biblioteca do Congresso, aqui incorporada por referência. A química das reações de adição nucleofílicas, como aplicável no presente invento, é detalhada no Capítulo 19 da Segunda Edição de “Organic Chemistry”, por Morrison e Boyd, (oitava impressão de 1970), Cartão N.° 66-25695 da Biblioteca do Congresso, aqui incorporada por referência.

[00027] Como adicionalmente descrito no presente documento, verificou-se, surpreendentemente, que certos tipos (por ex., determinados tipos de açúcares redutores) e graus de glicação dotam a quitosana de características de solubilidade inesperadas e vantajosas, que facilita o uso conjunto da quitosana glicada com a imunoterapia assistida por laser e outras aplicações terapêuticas. A glicação da quitosana também torna a quitosana mais hidrofílica, pelo que mais água é absorvida e retida pelo polímero do que seria esperado em outras circunstâncias. A D-galactose derivativa da quitosana é particularmente preferida, na medida em que a forma de cadeia aberta da D-galactose apresenta uma incidência natural relativamente mais alta. A quitosana glicada pode ser preparada de diversas formas adequadas incluindo, por exemplo, pó, viscosa, ou outra igualmente apropriada.

[00028] De acordo com outras configurações preferidas do invento, a quitosana pode ser glicada não-enzimaticamente, usando qualquer um ou distintos açúcares redutores, por ex., os mesmos monossacarídeos e/ou oligossacarídeos ou distintos. Exemplos de agentes de glicosilação de monossacarídeos que ocorrem mais naturalmente: D-triose, D-tetrose, D- pentose, D-hexose, D-heptose, e outros afins, como a D-glucose, D-galactose, D-frutose, D-manose, D-alose, D-altrose, D-idose, D-talose, D-fucose, D- arabinose, D-gulose, D-hamelose, D-lixose, D-ribose, D-ramnose, D-xilose, D-psicose, D-sorbose, D-tagatose, D-gliceraldeído, dihidroxiacetona, D- eritrose, D-treose, D-eritrulose, D-manoeptulose, D-sedoheptulose e afins. Oligossacarídeos adequados incluem fruto-oligossacarídeos (FOS), galacto- oligossacarídeos (GOS), manano-oligossacarídeos (MOS) e afins.

Propriedades Viscoelásticas Preferidas

[00029] Produtos de quitosana produzidos convencionalmente, quando dispersos, suspensos ou dissolvidos em soluções aquosas são muito difíceis de produzir conforme os padrões BPF, e apresentam algumas desvantagens em termos de administração e outros usos.

[00030] As configurações preferidas do presente invento atendem necessidades prolongadas não satisfeitas de produtos terapêuticos de quitosana melhorados, providenciando preparos melhorados de quitosana glicada viscoelástica, que não foram sujeitos aos inconvenientes das abordagens convencionais.

[00031] O termo "viscoelástico", conforme usado aqui, refere-se à viscosidade de uma determinada composição, preparação ou formulação. A viscosidade é amplamente reconhecida como uma medida da resistência de um fluido, que está sendo deformado por forças de cisalhamento ou tensão de tração. Em outras palavras, a viscosidade descreve a resistência interna da fluidez de um fluido e pode ser considerada como uma medida de atrito do fluido.

a. Melhorias inesperadas na injetabilidade de preparos de GC

[00032] Descobriu-se, surpreendentemente e inesperadamente, que a injetabilidade das formulações de quitosana glicada (GC), por exemplo, soluções ou suspensões, depende da viscosidade e das propriedades reológicas da GC. Estas propriedades são, por sua vez, altamente dependentes do peso molecular da GC, do grau de polimerização da quitina-pai para a quitosana, do grau de desacetilação da quitina-pai, e do grau de glicação da quitosana. Estas últimas propriedades determinam o grau de entrelaçamento das cadeias de polímero da GC, bem como o grau da ligação de hidrogênio intramolecular ocasionada pelo número e natureza dos substituintes presentes na molécula de GC (ou seja, acetilo e sacarídeo), que contribuem significativamente para a viscosidade e outras propriedades reológicas das soluções preparadas a partir deles.

[00033] Verificou-se, surpreendentemente e inesperadamente, que os preparos melhorados de quitosana glicada viscoelástica do presente invento possuem numerosas vantagens, por exemplo, (i) administração de um preparo não-tóxico para o tratamento de neoplasma em um paciente; (ii) injetabilidade bem superior (por ex., através de agulhas de distintos calibres) em um ambiente clínico, com relação aos tratamentos convencionais; (iii) melhoria da filtração estéril de preparos viscoelásticos; e (iv) menos dor e, portanto, uma melhor opção de tratamento para os pacientes. O termo "injetabilidade", como se usa aqui, refere-se à facilidade com que uma formulação ou preparo, por exemplo, uma formulação contendo quitosana glicada (GC), é injetada em um sujeito.

[00034] De acordo com uma configuração preferida, a invenção fornece um preparo viscoelástico injetável contendo cerca de 1 por cento do peso da quitosana glicada dispersa, suspensa ou dissolvida em uma solução aquosa mencionada acima.

[00035] As configurações preferidas do invento incluem preparos de quitosana glicada, incluindo, por exemplo, soluções ou suspensões, com uma viscosidade que torna os preparos facilmente injetáveis por meio de uma agulha de calibre relativamente grande (G), reduzindo, assim, a dor e desconforto do sujeito. Exemplos preferidos de agulhas de calibre relativamente grandes incluem agulhas com as seguintes dimensões: diâmetro interior nominal de cerca de 0,337 mm (23 G) a cerca de 0,210 mm (27 G).

[00036] De acordo com um exemplo, é administrado um preparo de quitosana glicada viscoelástica, por injeção, usando uma agulha com um diâmetro entre cerca de 20 a 22 G, e um tubo de comprimento útil de cerca de 1000 mm ou mais, de tal modo que a taxa de influxo do preparo injetável, quando injetado a uma pressão de cerca de duas a três atmosferas por meio da referida agulha de injeção, apresente uma variação entre cerca de 0,05ml/segundo e 0,1 ml/segundo. De acordo com outro exemplo, um preparo de quitosana glicada viscoelástica também pode ser administrado por injeção, usando uma agulha com um diâmetro entre cerca de 25G e 27G. É preciso entender também que um preparo de quitosana glicada viscoelástica, de acordo com o presente invento, também pode ser administrado usando qualquer outra agulha de calibre adequado ou instrumento.

[00037] Descobriu-se, surpreendentemente, que os preparos de quitosana glicada viscoelástica do presente invento, como por exemplo, soluções ou suspensões, são injetáveis em uma relativamente ampla gama de concentrações por meio de cateteres ou agulhas de calibres mais usados.

[00038] Descobriu-se, ainda, que estes preparos melhorados de quitosana glicada viscoelástica (ou seja, melhoria da viscosidade e das propriedades reológicas das composições de quitosana glicada) melhoraram também, inesperadamente, a facilidade geral de administração do preparo em um sujeito; a eficiência da administração pelo indivíduo administrando a formulação (por exemplo, enfermeira, médico ou outro profissional de cuidados de saúde), e a conformidade e eficácia das formulações de quitosana glicada pode ser melhorada também.

b. Melhorias inesperadas na fabricação e filtração

[00039] Verificou-se também, surpreendentemente, que a filtração estéril é inesperadamente melhorada usando os preparos melhorados de quitosana viscoelástica do presente invento. Preparos convencionais de quitosana glicada, como descrito na Patente dos EUA 5.747.475 ("Biomateriais derivados de quitosana"), mostraram ser muito difíceis para a esterilização com um filtro estéril de 0,22 μm, o que os torna inadequados para a fabricação de cGMP comercial. Em contrapartida, a quitosana glicada viscoelástica melhorada, que se descobriu possuir propriedades reológicas não óbvias, mostrou ser altamente adequada para a filtração estéril, fabricação cGMP, e uso humano.

[00040] Além disso, descobriu-se, surpreendentemente, que a diafiltração e a ultrafiltração aumentam inesperadamente com o uso dos preparos melhorados de quitosana glicada do presente invento. Preparos de quitosana glicada convencionais foram difíceis de diafiltrar e ultrafiltrar, causando o entupimento do filtro, tornando-o, assim, inadequado para a fabricação cGMP comercial. Por outro lado, a quitosana glicada viscoelástica melhorada foi altamente adequada para a diafiltração e ultrafiltração, melhorando assim significativamente o processo de fabrico.

Métodos exemplificativos para a determinação da viscosidade

[00041] É possível usar várias técnicas adequadas nas artes químicas para determinar de forma fiável, e com precisão, a viscosidade de uma formulação de quitosana glicada.

[00042] É preciso entender que a viscosidade pode ser mensurada de forma confiável com diversos tipos de instrumentos, por ex., viscosímetros e reômetros. Um reômetro é usado em fluidos que não podem ser definidos por um único valor de viscosidade e, por isso, precisam de mais parâmetros definidos e medidos que em um viscosímetro. O controle da temperatura do fluido é essencial para obter medições precisas, particularmente em materiais como lubrificantes, cuja viscosidade pode dobrar com uma variação de apenas 5 °C.

[00043] De acordo com o presente invento, a viscosidade de uma preparação de quitosana glicada pode ser determinada de acordo com qualquer método adequado e conhecido na área.

[00044] Por exemplo, a viscosidade pode ser mensurada com fiabilidade em unidades de centipoise. Poise é uma unidade de viscosidade dinâmica do sistema centímetro grama segundo das unidades. Um centipoise é uma centésima de um poise, e um milipascal segundo (mPa-s) em unidades SI (1 cP = 10-2 P = 10-3 Pa^s). Centipoise está devidamente abreviado como cP, porém, também é comum ver as abreviaturas alternativas cps, cp, e cPs. Um viscosímetro pode ser usado para medir centipoises. Durante a determinação de centipoises, é típico calibrar todos os fluidos para a viscosidade da água.

Determinação exemplificativa da viscosidade de preparos de quitosana glicada

[00045] Existem inúmeros fatores que afetam a viscosidade de soluções e, em particular, as soluções de polímeros, além do peso molecular. No caso da quitosana glicada (GC), a injetabilidade das soluções de GC é altamente dependente da viscosidade e das propriedades reológicas da quitosana glicada na solução. Por sua vez, essas propriedades são altamente dependentes do peso molecular da quitosana glicada, do grau de polimerização da quitina-pai para a quitosana, o grau de desacetilação da quitina-pai, e o grau de glicação da quitosana. Essas últimas propriedades determinam o grau de entrelaçamento das cadeias de polímeros da quitosana glicada, bem como o grau de ligação de hidrogênio intramolecular ocasionada pelo número e natureza dos substituintes presentes na molécula de quitosana glicada (por ex., acetilo e sacarídeo), que contribuem significativamente para a viscosidade das soluções preparadas a partir delas.

[00046] Descobriu-se, surpreendentemente, que a viscosidade melhorada e as propriedades reológicas dos preparos de quitosana glicada são, por sua vez, altamente dependentes de determinadas propriedades físico- químicas da quitosana glicada. O termo "propriedade físico-química", como usado aqui, destina-se a incluir, mas não está limitado a, qualquer propriedade físico-química, química, e física de uma estrutura molecular, como a quitosana glicada. Como descrito aqui também, alguns exemplos dessas propriedades físico-químicas são: (i) o peso molecular da quitosana glicada; (ii) o grau de polimerização da quitina-pai da quitosana; (iii) o grau de desacetilação da quitina-pai; e (iv) o grau de glicação da quitosana.

[00047] Figura 2 apresenta um exemplo de uma quitosana glicada viscoelástica do presente invento, onde o peso molecular é de aproximadamente 250 kDa, o grau de desacetilação da quitina-pai é de cerca de 80%, e o grau de glicação dos grupos amino livres da quitosana é de cerca 12,5%.

Figura 2. Estrutura exemplificativa da quitosana glicada viscoelástica do presente invento, onde a desacetilação da quitosana-pai é de cerca de 80%, e a glicação do total dos grupos amino-desacetilados disponíveis é de cerca de 12,5%.

(i) Peso molecular da quitosana glicada

[00048] É possível usar várias técnicas das artes químicas para determinar com fiabilidade, e precisão, o peso molecular (MW) da quitosana glicada.

[00049] É preferível que um preparo de quitosana glicada viscoelástica seja preparado como uma formulação injetável contendo quitosana glicada com um peso molecular (MW) menor que 1500 kDa. Exemplos de preparações preferidas de quitosana glicada viscoelástica contendo quitosana glicada com um peso molecular (MW) entre cerca de 50 kDa e 1500 quilodaltons (kDa).

[00050] Em certas configurações, um preparo de quitosana glicada viscoelástica contém quitosana glicada com um peso molecular (MW) entre cerca de 100 e 1000 kDa; preferivelmente entre cerca de 100 e 300 kDa. É possível usar várias técnicas para determinar com precisão o peso molecular.

[00051] O invento abrange composições de derivados de quitosana, contendo derivativos de quitosana que são dispersáveis ou solúveis em água. De acordo com o presente invento, descobriu-se também surpreendentemente, que em certas configurações, com o aumento do peso molecular (MW), é necessária mais água para solubilizar a quitosana glicada (GC).Por sua vez, isso significa menor quantidade de água "livre", ou seja, o hidrogênio não ligou à quitosana glicada (assumindo que não é adicionada mais água à solução), que contribui, ela mesma, para uma maior viscosidade. Como ilustrado no exemplo 3 abaixo, este resultado mostrou inesperadamente o aumento da viscosidade, que é obtida com o aumento do tamanho da molécula, para dar um exponencial (ou algo assim), em vez de uma relação linear entre viscosidade e peso molecular (quando a concentração é compensada).

(ii) Grau de polimerização (DP) da quitina-pai para a quitosana

[00052] O grau de polimerização (DP) da quitina-pai para a quitosana pode ser determinado com precisão e fiabilidade, de acordo com vários métodos e técnicas adequadas e conhecidas nas artes químicas.

[00053] Em uma abordagem, é preferível que o grau de polimerização (DP) seja determinado por meio da divisão do peso molecular da quitosana pelo peso molecular da ligação de glucosamina.

(iii) Grau de desacetilação da quitina-pai

[00054] Uma outra propriedade físico-química é o grau de desacetilação da quitina-pai. É possível usar várias técnicas das artes químicas para determinar com fiabilidade, e precisão, o grau de desacetilação da quitina-pai.

[00055] RMN é uma técnica que pode ser usada para determinar o grau de desacetilação da quitina ou da quitosana.

(iv) Grau de glicação da quitosana

[00056] É possível usar várias técnicas das artes químicas para determinar com fiabilidade, e precisão, o grau de glicação da quitosana.

[00057] RMN é uma técnica que pode ser usada para detectar e medir a ligação de monossacarídeos e/ou oligossacarídeos ao polímero de quitosana.

[00058] A análise de combustão elementar C/N é uma outra técnica que pode ser usada para determinar a porcentagem de glicação da quitosana glicada por meio da comparação da razão C/N da quitosana glicada e da quitosana-pai.

[00059] A digestão enzimática acoplada com HPLC é ainda outra técnica que pode ser usada para determinar a porcentagem de glicação.

[00060] É preciso entender que outros métodos analíticos e instrumentos adequados também podem usar-se para a detecção, medição e identificação simultânea de componentes múltiplos em uma amostra, por ex., para a detecção, medição e identificação simultânea de quitosana glicada e não-glicada em uma amostra.

[00061] A medição colorimétrica dos produtos químicos ligados aos restantes grupos de amino livres, como por meio de uma reação de ninidrina, pode ser usada para avaliar o grau de glicação.

[00062] Foi assim descoberto que, as quitosanas glicadas com pesos moleculares, graus de polimerização da quitina-pai para a quitosana, graus de desacetilação de quitina-pai, e graus de glicação de quitosana preferidos permitem melhorar a preparação de soluções de quitosana glicada, que são injetáveis em uma gama relativamente ampla de concentrações de quitosana glicada, por meio de cateteres ou agulhas dos calibres mais usados.

[00063] Métodos preferidos de preparação da quitosana glicada

[00064] Existem ainda outras configurações do invento que se referem a métodos para a preparação de formulações de quitosana glicada. Quitosana glicada é obtida, de preferência, por meio da reação da quitosana com um monossacarídeo e/ou oligossacarídeo, preferencialmente na presença de um agente acidificante, o tempo suficiente para realizar a formação da base de Schiff entre o grupo carbonilo do açúcar e os grupos amino primários da quitosana (referido aqui também como glicação do grupo amino) até que seja alcançada alguma porcentagem de glicação (preferencialmente 2% ou acima) do polímero de quitosana. Esta é seguida, de preferência, da estabilização por meio da redução das bases de Schiff e de seus derivados rearranjados (produtos de Amadori) em suas aminas ou alcoóis secundários, respectivamente. É possível usar traçados de RMN para verificar a ligação dos monossacarídeos e/ou oligossacarídeos ao polímero de quitosana, enquanto que a medição química dos restantes grupos amino livres, como por meio de uma reação de ninidrina, pode ser usada para avaliar o grau de glicação.

[00065] Em configurações preferidas, as condições podem ser ajustadas, conforme necessário, para melhorar os resultados desejados durante o fabrico de quitosana glicada. Por exemplo, foi inesperadamente descoberto, de acordo com o presente invento, que é possível melhorar o fabrico de quitosana glicada por meio do controle das condições de pH, como descrito aqui no Exemplo 4.

[00066] De acordo com um preparo exemplificativo de quitosana glicada para usar no presente invento, aproximadamente três gramas de um monossacarídeo redutor (por ex., glicose, galactose, ribose), ou uma quantidade equivalente de um oligossacarídeo redutor, é dissolvido em 100 ml de água destilada por agitação magnética suave em um Erlenmeyer. Então, aproximadamente um grama de quitosana é adicionado, e em seguida as etapas do processo adequadas podem ser executadas para obter o preparo de quitosana glicada com as propriedades viscoelásticas e características de pureza desejadas.

[00067] Um método exemplificativo para produção de quitosana à escala industrial envolve as seguintes quatro etapas: desmineralização (DM), desproteinização (DP), descoloração (DC) e desacetilação (DA). A extração de quitina é feita a partir de, por exemplo, cascas de crustáceos, por meio de um alcalino-ácido. As amostras são desproteinizadas por meio de tratamento com formulação alcalina, desmineralizadas com ácido, e descoloradas com solvente orgânico (por ex., acetona), seguindo-se o branqueamento (com, por ex., hipoclorito de sódio). A desacetilação de quitina é feita usando, por exemplo, uma formulação de hidróxido de sódio. O grau de polimerização da quitosana é ajustado por despolimerização; sendo os procedimentos mais convenientes (1) a degradação do ácido nitroso em água deuterada. A reação é seletiva, estequiométrica com relação ao GlcN, rápida e facilmente controlada, (2) a despolimerização por hidrólise ácida, ou (3) degradação enzimática com um preparo comercial (Pectinex Ultra SPL). O método enzimático produz fragmentos mais curtos, com uma maior proporção de quitoligómeros totalmente desacetilados. Por outro lado, a hidrólise ácida dos resultados da quitosana inicial resulta em fragmentos com graus de polimerização até dezesseis, e mais, resíduos monoacetilados que com o processo enzimático.

Amino-açúcares glicados polimerizados

[00068] Como descrito aqui, quitosana (quitina parcialmente desacetilada) é um derivado da quitina (um homopolímero linear composto por unidades de N-acetilglucosamina ligados por β 1 ^ 4 ligações glicosídicas).Composições de derivados de quitosana compreendem, assim um homopolímero de quitina parcialmente desacetilada, onde a quitina parcialmente desacetilada possui um número de grupos amino livres de outro modo ligados a um grupo carbonilo de um monossacarídeo reduzido ou oligossacarídeo, criando uma ligação imina (base de Schiff) ou produto relacionado (Rearranjo Amadori) e liberando uma molécula de água.

[00069] Uma vez que a quitina e a quitosana são polímeros de glucosamina, o presente invento contempla também glucosamina glicada não- enzimaticamente, por ex., monômeros de glucosamina glicada, ou unidades de glucosamina glicada. Em outras palavras, o presente invento contempla também a glicação não-enzimática de monômeros de amino-açúcar em geral.

[00070] Um exemplo é uma glucosamina glicada, onde o N- substituinte é uma galactose. Prefere-se que a glicação de monômeros de glucosamina seja realizada, após uma porcentagem dos monômeros de glucosamina ter sido inicialmente desacetilada.

[00071] Além disso, o presente invento contempla ainda (1) polímeros de unidades de glucosamina glicada (amino-açúcares glicados polimerizados), (2) combinação de polímeros de glucosaminas não-glicadas e glicadas, e (3) combinações de polímeros de glucosamina glicada e não-glicadas, onde: (i) a porcentagem de monômeros de glucosamina não- desacetilada é de aproximadamente 1% a cerca de 30%; (ii) o grau de polimerização (de várias combinações de unidades de glucosamina glicada e não-glicada, desacetilada e não- desacetilada) é de aproximadamente xn=300 a cerca de xn=8000, preferencialmente cerca de xn=1500; e/ou (iii) a porcentagem de glicação dos grupos amino livres da glucosamina polimerizada desacetilada é de cerca de 0,1% a cerca de 30%.

[00072] O presente invento também contempla o uso de polímeros de glucosamina glicada polimerizados que são iguais ou semelhantes às utilizações de quitosana glicada. Estes incluem, por exemplo, usos e propriedades imunoadjuvantes, por exemplo, no contexto de vacinas contra o câncer in situ (inCVAX), como a imunoterapia assistida por laser (LIT).

Formulações exemplificativas e aplicações

[00073] Exemplos de vários tipos de formulações ou preparos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados de acordo com o presente invento incluem, por exemplo, soluções, suspensões, e outros tipos de formulações líquidas ou semilíquidas para a injetabilidade dos preparos de quitosana glicada viscoelástica. Por exemplo, as formulações ou preparos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir quitosana glicada dispersa, suspensa ou dissolvida em formulações substancialmente aquosas. Pelo uso do termo "substancialmente aquoso", deverá entender-se que as formulações ou preparações, em certas configurações, podem incluir alguma porcentagem de um ou mais componentes não-aquosos, e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[00074] De acordo com um exemplo, é preferível formular um preparo viscoelástico em uma solução aquosa possuindo um pH entre cerca de 5,0 e 7.

[00075] É possível formular também um preparo viscoelástico em uma solução aquosa, contendo uma solução salina fisiológica tamponada consistindo essencialmente de quitosana glicada.

[00076] Um preparo viscoelástico também pode ser formulado essencialmente de polímero de quitosana glicada, onde o polímero de quitosana glicada possui entre cerca de um décimo (0,1) de um por cento e trinta (30) por cento de glicação dos seus grupos amino de outra forma livres.

[00077] Em outra configuração, é possível formular um preparo viscoelástico, consistindo essencialmente de polímero de quitosana glicada (GC), onde o polímero de quitosana glicada possui cerca de dois (2) por cento glicação dos seus grupos amino de outra forma livres.

[00078] Em outra configuração, é possível formular um preparo viscoelástico, consistindo essencialmente de polímero de quitosana glicada, onde o polímero de quitosana glicada possui um peso molecular entre cerca de 50.000 e 1.500.000 Daltons.

[00079] Um outro exemplo inclui um preparo de quitosana glicada viscoelástica, compreendendo cerca de um (1) por cento do peso de um polímero de quitosana glicada disperso em uma solução aquosa, tendo a referida solução aquosa uma viscosidade entre cerca de um (1) a cerca de cem (100) centistokes medidos a cerca de 25 graus Celsius.

[00080] Outro exemplo ainda inclui uma solução aquosa, tendo cerca de um por cento do peso da quitosana glicada e entre cerca de um décimo (0,1) de um por cento e cerca de trinta (30) por cento de glicação dos grupos amino livres da dita outra forma de quitosana glicada, onde a solução aquosa possui uma viscosidade entre cerca de um (1) e cem (100) centistokes.

[00081] Em ainda outra configuração, é possível formular um preparo viscoelástico consistindo essencialmente de polímero de quitosana glicada, contendo cerca ou acima de um por cento do peso do polímero de quitosana glicada disperso em uma solução aquosa, onde o polímero de quitosana glicada possui cerca de dois (2) por cento de glicação dos seus grupos amino de outra forma livres, e onde a solução aquosa apresenta uma viscosidade adequada para facilitar a injetabilidade e administração em um sujeito.

[00082] Em ainda outra configuração, um preparo viscoelástico pode ser formulado essencialmente de polímero de quitosana glicada, contendo adicionalmente um ou mais materiais viscoelásticos distintos, miscíveis em uma solução aquosa. Exemplos de materiais viscoelásticos adequados incluem, mas não se limitam, ao ácido hialurónico, sulfato de condroitina e carboximetilcelulose.

[00083] O preparo viscoelástico pode incluir polímero de quitosana glicada, compreendendo um monossacarídeo ligado a um grupo amino de outra forma livre.O polímero de quitosana glicada pode tomar qualquer forma adequada, tal como uma base de Schiff, um produto de Amadori, ou uma mistura de ambas. O polímero de quitosana glicada pode tomar ainda a forma de uma base de Schiff reduzida (amina secundária), um produto de Amadori reduzido (álcool), ou uma mistura de ambos.

[00084] O preparo viscoelástico pode ainda ser formulado quando o polímero de quitosana glicada possui um número de substituintes de monossacarídeos ou oligossacarídeos modificados quimicamente. Em uma configuração, o monossacarídeo compreende galactose.

[00085] As formulações ou preparos inventivos também contêm, preferivelmente, quitosana glicada em um veículo fisiologicamente compatível. "Fisiologicamente compatível", como usado aqui, deve ser entendido como materiais que, quando em contato com os tecidos do corpo, não são prejudiciais para o mesmo. O termo pretende incluir, neste contexto, mas não limitado a, formulações aquosas (por ex., soluções), que são aproximadamente isotônicas com o respectivo ambiente fisiológico. Formulações não isotônicas (por ex., soluções), por vezes, também podem ser clinicamente úteis como agentes de desidratação, por exemplo. Componentes adicionais das soluções inventivas podem incluir vários sais, como, por exemplo, NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 e buffers baseados em Na.

[00086] Os objetos acima e outros são realizados pelo presente invento, sendo que determinadas configurações preferidas se referem a preparos de quitosana glicada com propriedades físico-químicas particulares que conferem propriedades inesperadas e surpreendentemente benéficas.

[00087] O presente invento também engloba uma ampla gama de usos para os preparos de quitosana glicada viscoelástica que possuem propriedades surpreendentes e inesperadas como imunoadjuvantes, por exemplo, em conexão com vacinas do câncer autólogas in situ, como a imunoterapia assistida por laser para o câncer, como descrito aqui.

[00088] Configurações preferidas do invento fornecem um preparo viscoelástico injetável compreendendo imunoadjuvantes. É assim um outro objeto do presente invento providenciar preparos melhorados de quitosana glicada viscoelástica para outras aplicações terapêuticas, incluindo o uso terapêutico como imunoadjuvante e imunomodulador.

[00089] O presente invento também engloba várias formas de administração das formulações imunoadjuvantes viscoelásticas de quitosana glicada, como por meio de injeção. Em uma abordagem preferida, o imunoadjuvante é preferencialmente preparado como uma formulação injetável no interior ou em torno da massa tumoral. Deve ser reconhecido, porém, que outros métodos podem ser suficientes para localizar o imunoadjuvante no local do tumor. Um desses meios de entrega alternativos, é a conjugação de imunoadjuvante a um anticorpo ou antigênico específico para o tecido, de tal modo que a entrega no local do tumor é aumentada. É aceitável qualquer método, ou combinação de diferentes métodos, para localizar o imunoadjuvante no local do tumor, desde que o mecanismo de entrega assegure suficiente concentração de imunoadjuvante no neoplasma.

[00090] De acordo com certas configurações preferidas, o presente invento providencia várias formulações farmacêuticas contendo quitosana glicada viscoelástica, usada com vacinas de câncer autólogas in situ (inCVAX), como a imunoterapia assistida por laser, terapia de câncer fotodinâmica (TFD) e/ou métodos de imunoterapia tumoral, como descrito mais detalhadamente aqui. Observou-se que é desejável usar preparos de quitosana glicada com a viscosidade adequada, que habilite a sua injetabilidade, ou outra formulação como um imunoadjuvante em aplicações tais como inCVAX e/ou PDT e/ou métodos de imunoterapia tumoral. Essas aplicações envolvem tipicamente a injeção da formulação de quitosana glicada viscoelástica no corpo de um paciente. O termo "imunoadjuvante", como usado aqui, pretende referir-se a qualquer molécula, composição ou substância que atua para aumentar a resposta do sistema imunológico a um antigênico; por exemplo, a quitosana glicada que atua de modo a aumentar a resposta do sistema imunológico a um antigênico tumoral.

[00091] A composição imunoadjuvante pode ainda incluir um anticorpo específico ao tumor conjugado com a quitosana glicada. A composição imunoadjuvante pode incluir, ainda, um antigênico específico ao tumor conjugado com a quitosana glicada. A quitosana glicada pode ainda incluir um grupo carbonilo reativo.

[00092] De acordo com uma configuração preferida, o presente invento fornece a formulação de um imunoadjuvante que inclui uma suspensão ou solução de quitosana glicada viscoelástica. A quitosana glicada viscoelástica é usada nessa configuração em conexão com o com o tratamento fototérmico de um neoplasma sem o uso de um cromóforo, onde a energia de luz é dirigida diretamente para o neoplasma. A energia de luz pode ser aplicada topicamente, se o neoplasma estiver acessível sobre a superfície do tecido (por exemplo, melanoma), ou exposto por meio de cirurgia. A energia de luz também pode ser aplicada no neoplasma por meio de fibras óticas, por exemplo, se o neoplasma estiver presente sob a superfície do tecido (por exemplo, câncer mamário) e não for exposto por meio de cirurgia.

[00093] De acordo com uma outra configuração, e como descrito aqui em pormenor, as formulações imunoadjuvantes do presente invento podem ainda incluir um cromóforo adequado. A seleção de um cromóforo adequado é, essencialmente, uma questão de coordenação, com um laser cuja radiação do comprimento de onda é aceitável. O comprimento de onda de radiação usada deve, obviamente, complementar as fotopropriedades (ou seja, o pico de absorção) do cromóforo. Outros critérios de seleção do cromóforo incluem a capacidade de gerar energia térmica, evoluir o oxigênio atômico e outras moléculas ativas, ou para ser tóxico, por direito próprio, como a cisplatina. No presente invento, um comprimento de onda de radiação preferido é o de 805.+/-.10 nm. Os cromóforos desejados apresentam uma forte absorção na região espectral vermelha e perto do infravermelho, onde o tecido é relativamente transparente. Outra vantagem deste comprimento de onda é evitar os potenciais efeitos mutagênicos encontrados em sensibilizadores animados por UV. Porém, comprimentos de onda entre 150 e 2000 nm podem ser eficazes em casos individuais. A indocianina verde é o cromóforo preferido. É possível usar outros cromóforos, no entanto, a sua seleção tem por base propriedades fotoquímicas e fotofísicas desejadas, de que dependem a eficiência da fotossensibilização e a fototoxicidade. Exemplos de cromóforos alternativos incluem, mas não se limitam a, nanotubos de carbono de parede simples (SWNT), buckminsterfullerenes (C60), indocianina verde, azul de metileno, DHE (polihematoporfirina ester/éter), mm-THPP (tetraporfirina (meta-hidroxifenil), AlPcS4 (tetrasulfonato ftalocianina de alumínio), ZnET2 (aetio-purpurina de zinco) e Bchla (bacterioclorofila. alfa.).

[00094] Em uma configuração, a composição do imunoadjuvante é formulada como uma solução ou suspensão. A solução ou suspensão pode incluir, por exemplo, cerca de 0,25% de um cromóforo e cerca de 1% de quitosana glicada.

[00095] De acordo com outra configuração preferida, o presente invento providencia uma composição para uso no condicionamento de neoplasmas em tratamentos imunológicos e fotofísicos tandem, contendo um imunoadjuvante, onde o imunoadjuvante é conjugado com um antigênico específico do tumor, e onde o imunoadjuvante é a quitosana glicada.

[00096] De acordo com outra configuração, o presente invento providencia uma composição para uso no condicionamento de um neoplasma em um tratamento imunológico e fotofísico tandem, contendo a combinação de um cromóforo e de um imunoadjuvante, onde o cromóforo e o imunoadjuvante são conjugados com um antigênico específico do tumor, e a quitosana glicada é o imunoadjuvante.

[00097] De acordo com outra configuração preferida, o presente invento providencia uma composição para uso no condicionamento de um neoplasma em um tratamento imunológico e fotofísico tandem, contendo um imunoadjuvante, onde o imunoadjuvante é conjugado com um anticorpo específico do tumor, e onde o imunoadjuvante é a quitosana glicada. O imunoadjuvante pode, em certos casos, consistir essencialmente de quitosana glicada. A quitosana glicada pode incluir ainda mais do que um grupo carbonilo reativo.

[00098] De acordo com outra configuração preferida, o presente invento providencia uma composição para uso no condicionamento de um neoplasma em um tratamento imunológico e fotofísico tandem, contendo uma combinação de um cromóforo e de um imunoadjuvante, onde o cromóforo e o imunoadjuvante são conjugados com um anticorpo específico do tumor, e a quitosana glicada é o imunoadjuvante. O imunoadjuvante pode, em certos casos, consistir essencialmente de quitosana glicada. A quitosana glicada pode incluir ainda mais do que um grupo carbonilo reativo.

[00099] O presente invento fornece, assim, formulações injetáveis para o condicionamento de um neoplasma em um tratamento imunológico e fotofísico tandem, que em certos casos, pode incluir uma combinação de, ou uma mistura de, um cromóforo e um imunoadjuvante, onde a quitosana glicada é o imunoadjuvante.

[000100] É possível, ainda, preparar uma composição para usar no condicionamento de neoplasmas em tratamentos imunológicos e fotofísicos tandem, contendo um imunoadjuvante, onde o imunoadjuvante é conjugado com um antigênico específico do tumor, e onde o imunoadjuvante é a quitosana glicada viscoelástica com um peso molecular (MW) entre cerca de 100 e 1000 kDa; preferivelmente entre cerca de 100 e 300 kDa.

[000101] A composição pode também ser preparada para usar no condicionamento de um neoplasma em tratamentos imunológicos e fotofísicos tandem, contendo a combinação de um cromóforo e de um imunoadjuvante, onde o cromóforo e o imunoadjuvante são conjugados com um antigênico específico do tumor, e onde o imunoadjuvante é a quitosana glicada viscoelástica com um peso molecular (MW) entre cerca de 100 e 1000 kDa; preferivelmente, entre cerca de 100 e 300 kDa.

[000102] Além disso, é possível preparar uma solução injetável para o condicionamento de um neoplasma em um tratamento imunológico e fotofísico tandem contendo um imunoadjuvante, onde o imunoadjuvante é quitosana glicada viscoelástica com um peso molecular (MW) entre cerca de 100 e 1000 kD; preferivelmente, entre cerca de 100 e 300 kDa.

[000103] Uma solução injetável pode também ser preparada para o condicionamento de um neoplasma em um tratamento imunológico e fotofísico tandem, contendo uma mistura de um cromóforo e um imunoadjuvante, onde o imunoadjuvante é quitosana glicada viscoelástica com um peso molecular (MW) entre cerca de 100 e 1000 kDa; e preferivelmente, entre cerca de 100 e 300 kDa.

[000104] Em um exemplo, as composições de quitosana glicada viscoelástica do presente invento são usadas como imunoadjuvante em um novo tratamento de câncer. Terapias fototérmicas e imunológicas e ai são combinados por meio da irradiação do neoplasma, diretamente no tumor, sem o uso de um cromóforo, e introduzindo, subseqüentemente, o imunoadjuvante derivado de quitosana em ou em torno do neoplasma irradiado. Após a aplicação de um laser com irradiação suficiente para induzir a destruição celular neoplástica, as respostas imunológicas humorais e mediadas por células aos antigênicos neoplásticos então liberadas, são estimuladas (aumentadas) pelo componente imunoadjuvante.

[000105] Em outro exemplo, terapias fotodinâmicas e imunológicas são combinadas por introdução simultânea de um cromóforo e um imunoadjuvante derivado de quitosana, (também denominado de imunomodulador ou imunopotenciador) em um neoplasma. Após a aplicação de um laser com irradiação suficiente para induzir a destruição celular neoplástica, as respostas imunológicas humorais e mediadas por células aos antigênicos neoplásticos então liberados, são estimuladas (aumentadas) pelo componente imunoadjuvante.

[000106] O cromóforo e o imunoadjuvante podem ser combinados em uma solução injetável no centro da massa do tumor, ou injetados separadamente na massa do tumor. Porém, é preciso reconhecer que outros métodos podem ser suficientes para localizar cromóforo e o imunoadjuvante no local do tumor. Um desses meios de entrega alternativos, é a conjugação do cromóforo ou imunoadjuvante, ou ambos, com um anticorpo ou antigênico específico do tecido, ou o antigênico específico para o tecido, de modo que a entrega no local do tumor é melhorada. Qualquer método, ou combinação de diferentes métodos, de localização do cromóforo e imunoadjuvante no local do tumor é aceitável, desde que o mecanismo de entrega assegure suficiente concentração dos componentes no neoplasma.

[000107] De acordo com outra configuração, um método para tratar neoplasmas em um hospedeiro humano ou animal, compreende a: (a) seleção de um imunoadjuvante, onde o imunoadjuvante contém quitosana glicada viscoelástica; (b) irradiação do neoplasma condicionado, onde a destruição celular neoplástica do neoplasma condicionado é induzida para produzir tecido neoplástico fragmentado e moléculas celulares; e (c) a introdução do imunoadjuvante no ou em torno do tumor, o qual estimula o sistema de autodefesa imunológica do hospedeiro para processar o tecido neoplástico e moléculas celulares fragmentadas, como antigênicos tumorais, e, assim, criar imunidade contra a multiplicação celular neoplástica.

[000108] De acordo com outra configuração, um método para tratar neoplasmas em um hospedeiro humano ou animal, compreende a: (a) seleção de um cromóforo e de um imunoadjuvante, onde o imunoadjuvante contém quitosana glicada viscoelástica; (b) introdução do cromóforo e do imunoadjuvante no neoplasma, a fim de obter um neoplasma condicionado; e (c) a irradiação do neoplasma condicionado, onde a destruição celular neoplástica do neoplasma condicionado é induzida a produzir tecido neoplástico e moléculas celulares fragmentadas na presença do imunoadjuvante, o qual estimula o sistema de autodefesa imunológica do hospedeiro contra a multiplicação celular neoplástica.

[000109] Em ainda outra configuração, um método de produção de anticorpos tumorais específicos em um hospedeiro portador de tumor, inclui a irradiação de um tumor, com um laser de um comprimento de onda na gama visível de infravermelho ou na região do infravermelho, que seja suficiente para induzir a destruição celular neoplástica, gerando tecido neoplástico e moléculas celulares fragmentadas, seguido pela introdução de um imunoadjuvante no, ou em torno do, neoplasma, por meio de injeção, de modo a que o sistema imunológico do hospedeiro seja estimulado a interagir com, e processar, o tecido neoplástico e as moléculas celulares fragmentadas, induzindo uma resposta antitumoral sistêmica.

[000110] Em outra configuração, um método de produção de anticorpos tumorais específicos em um hospedeiro portador de tumor, inclui a introdução simultânea de um cromóforo e imunoadjuvante em um neoplasma, por meio de injeção intratumoral, para obter um neoplasma condicionado, sendo o cromóforo adequado para gerar energia térmica, após ativação, na faixa dos comprimentos de onda infravermelho ou na região do infravermelho; e a ativação do cromóforo com um laser de um comprimento de onda na faixa do infravermelho ou na região do infravermelho suficiente para ativar e levar o cromóforo a produzir uma reação fototérmica, induzindo a destruição celular neoplástica, e gerando tecido neoplástico fragmentado e moléculas celulares.

[000111] Um método exemplificativo da destruição fotofísica de um neoplasma e da geração, simultânea, de uma vacina autóloga in situ em um hospedeiro portador de tumor, inclui a: (a) seleção de um imunoadjuvante; (b) irradiação do neoplasma com um laser de um comprimento de onda na faixa visível do infravermelho ou na região do infravermelho, com a potência e duração suficientes para produzir uma reação fototérmica, induzindo a destruição celular neoplástica e gerando tecido neoplástico e moléculas celulares fragmentadas; (c) formação da vacina in situatravés da introdução do imunoadjuvante no neoplasma, por meio de injeção intratumoral, onde a vacina in situcontém uma amálgama de tecido e moléculas celulares fragmentadas e o imunoadjuvante; e (d) a estimulação do sistema de autodefesa imunológica contra a multiplicação celular neoplástica, devido à apresentação local da vacina para induzir uma resposta sistêmica antitumoral no hospedeiro.

[000112] Um outro método exemplificativo da destruição fotofísica de um neoplasma e da geração, simultânea, de uma vacina autóloga in situ em um hospedeiro portador de tumor, inclui: (a) a seleção de um cromóforo e de um imunoadjuvante, sendo o cromóforo adequado para gerar energia térmica após ativação na faixa do comprimento de onda infravermelho ou na região do infravermelho; (b) a introdução do cromóforo no neoplasma por meio de injeção intratumoral; (c) a irradiação do neoplasma por meio de um laser com um comprimento de onda na faixa visível do infravermelho ou na região do infravermelho, com a potência e duração suficientes para produzir uma reação fototérmica, induzindo a destruição celular neoplástica e gerando tecido neoplástico e moléculas celulares fragmentadas; (d) formação da vacina in situatravés da introdução do imunoadjuvante no neoplasma, por meio de injeção intratumoral, onde a vacina in situ contém uma amálgama de tecido e moléculas celulares fragmentadas e o imunoadjuvante; e (e) a estimulação do sistema de autodefesa imunológica contra a multiplicação celular neoplástica, devido à apresentação local da vacina para induzir uma resposta antitumoral sistêmica no hospedeiro.

[000113] Um outro método exemplificativo da destruição fotofísica de um neoplasma e da geração, simultânea, de uma vacina autóloga in situ em um hospedeiro portador de tumor, inclui: (a) a seleção de um cromóforo e de um imunoadjuvante, sendo o cromóforo adequado para gerar energia térmica após ativação na faixa do comprimento de onda infravermelho ou na região do infravermelho; (b) a introdução em simultâneo ou separadamente, do cromóforo e do imunoadjuvante no neoplasma, por meio de injeção intratumoral, para obter um neoplasma condicionado; (c) a formação da vacina in situ por meio da irradiação do neoplasma condicionado com um laser de um comprimento de onda na faixa do infravermelho ou na região do infravermelho, com uma potência e tempo suficientes para ativar o cromóforo a produzir uma reação fototérmica, induzindo a destruição celular neoplástica e gerando tecido neoplástico e moléculas celulares fragmentadas, onde a vacina in situ contém uma amálgama de tecido e moléculas celulares fragmentadas e o imunoadjuvante; e (d) a estimulação do sistema de autodefesa imunológica contra a multiplicação celular neoplástica, devido à apresentação local da vacina e por permitir a sua dispersão sistêmica no hospedeiro.

[000114] Como descrito em outro lugar no presente documento, o método pode incluir ainda a conjugação do imunoadjuvante com um anticorpo específico do tumor, formando assim um conjugado, e administrando o conjugado ao hospedeiro. Alternativamente, o método pode ainda incluir a conjugação de cromóforo e o imunoadjuvante em um antigênico específico do tumor, formando assim um conjugado, e administrando o conjugado ao hospedeiro. É possível usar qualquer número de cromóforos adequados, por exemplo, indocianina verde, DHE, m-THPP, AlPcS4, ZnET2, e Bchla.

[000115] Além disso, o método pode incluir a conjugação de uma combinação de cromóforo e imunoadjuvante com um anticorpo específico do tumor, formando assim um conjugado, e administrando o conjugado ao hospedeiro. Alternativamente, o método pode ainda incluir a conjugação de cromóforo e o imunoadjuvante em um antigênico específico do tumor, formando assim um conjugado, e administrando o conjugado ao hospedeiro. É possível usar qualquer número de cromóforos adequados, por exemplo, indocianina verde, DHE, m-THPP, AlPcS4, ZnET2, e Bchla.

[000116] Os preparos e formulações do presente invento, incluindo os preparos de quitosana glicada viscoelástica (GC), também podem ser usados em conjunto com a terapia fotodinâmica (PDT).Compostos fotossensibilizantes apresentam uma reação fotoquímica quando expostos a luz. A terapia fotodinâmica (PDT) usa esses compostos fotossensibilizantes e lasers para produzir necrose tumoral. O tratamento de tumores sólidos por PDT geralmente envolve a administração sistêmica de compostos fotossensibilizantes para localização do tumor e sua ativação posterior por laser. Após absorção da luz com comprimento de onda apropriado, o sensibilizador passa de uma estrutura atômica estável para um estado animado. A citotoxicidade e eventual destruição do tumor são mediadas pela interação do sensibilizador e do oxigênio molecular no tecido tratado para gerar oxigênio atômico citotóxico.

[000117] Duas boas referências gerais referentes à PDT, lasers biomédicos e compostos fotossensibilizantes, incluindo parâmetros de distribuição de luz e de dosagem aqui incorporadas por referência: “Photosensitizing Compounds: Their Chemistry, Biology and Clinical Use”, publicado em 1989, por John Wiley and Sons Ltd., Chichester, Reino Unido, ISBN 0 471 92308 7 e “Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers: Proceedings of the International Conference on Photodynamic Therapy and Medical Laser Applications”, Milão, 24-27 de junho de 1992, publicado pela Elsevier Science Publishers B.V, Amsterdã, Holanda, ISBN 0 444 81430 2.

[000118] Patentes dos Estados Unidos relacionadas com a PDT incluem a Patente dos EUA n.° 5.095.030 e 5.283.225, Levy et al.; Patente dos EUA n.° 5.314.905, Pandey et al.; Patente dos EUA n.° 5.214.036, Allison et al; e Patente dos EUA n.° 5.258.453, Kopecek et ai., aqui incorporadas por referência. As patentes Levy descrevem o uso de fotossensibilizadores afetados por um comprimento de onda entre 670-780 nm, em conjunto com anticorpos tumorais específicos, como ligandos receptores específicos, imunoglobulinas ou porções imunoespecíficas de imunoglobulinas. As patentes Pandey são dirigidas para os compostos de pirofeoforbida a usar na terapia fotodinâmica padrão. Pandey também descreve a conjugação de suas composições com ligandos e anticorpos. A patente Allison é similar às patentes Levy, na medida em que as porfirinas verdes são conjugadas com complexos lipo para aumentar a especificidade dos compostos de porfirina com relação as células tumorais alvos. A patente Kopecek também descreve composições para tratar tecidos cancerosos. Essas composições consistem de dois fármacos, um anticâncer e um fotoativável, ligados a um transportador copolimérico. As composições entram nas células-alvo por pinocitose. O fármaco anticâncer atua depois que a célula-alvo é invadida. Algum tempo depois, uma fonte de luz é usada para ativar o substituinte fotossensível.

Outras aplicações da imunoterapia tumoral

[000119] Os preparos e formulações do presente invento, incluindo preparos de quitosana glicada viscoelástica (GC), podem ser usados, por exemplo, como imunoadjuvantes, no contexto da imunoterapia tumoral.

[000120] A principal função do sistema imunológico é desenvolver o conceito de "eu" e eliminar o que é "não-eu". Apesar das principais entidades que não pertencem ao "eu", microrganismos encontrados diariamente, o sistema imunológico também funciona de modo a eliminar neoplasmas e transplantes.

[000121] Existem diversos tipos distintos de imunidade. Imunidade não específica, ou inata, se refere à resistência inerente manifestada por uma espécie que não tenha sido imunizada (sensibilizada ou alergizada) por infecção ou vacinação prévia. Seu principal componente celular é o sistema fagocitário, cuja função é ingerir e digerir microorganismos invasores. Fagócitos incluem neutrófilos e monócitos no sangue, e macrófagos nos tecidos. Proteínas complementares são o principal componente solúvel da imunidade inespecífica. Reagentes de fase aguda e citocinas, como o interferão, também pertencem à imunidade inata.

[000122] Imunidade específica é um estado imunológico, onde uma reatividade alterada se dirige exclusivamente contra os determinantes antigênicos (agente infeccioso ou outros) que o estimularam. É chamada, por vezes, de imunidade adquirida. Pode ser ativa e específica, como resultado da vacinação intencional ou de uma infecção naturalmente adquirida (aparente ou não); ou pode ser passiva, sendo adquirida a partir de uma transferência de anticorpos de outra pessoa ou animal. A imunidade específica tem características de aprendizagem, adaptabilidade e memória. O componente celular é o linfócito (por ex., células T, células B, células assassinas naturais (NK)), e as imunoglobulinas são o componente solúvel.

[000123] A ação das células T e NK no reconhecimento e destruição de células estranhas ou parasitadas é denominada imunidade mediada por células. Ao contrário da imunidade mediada por células, a imunidade humoral está associada com os anticorpos produzidos em circulação, após um processo de reconhecimento complexo, por células-B.

[000124] Com relação a imunologia tumoral, a importância das células linfóides na imunidade tumoral tem sido repetidamente demonstrada. A resposta mediada por células a tumores do hospedeiro inclui o conceito de vigilância imunológica, pelo que os mecanismos celulares associados com a imunidade mediada por células destroem as células recém-transformadas, depois de reconhecerem os antigênicos associados a tumores (antigênicos associados a células tumorais que não são aparentes em células normais). Isto é análogo ao processo de rejeição de tecidos transplantados de um doador não compatível. Em humanos, o crescimento dos nódulos tumorais foi inibido in vivo por meio da mistura de suspensões de linfócitos sanguíneos periféricos de um paciente e de células tumorais, sugerindo uma reação mediada por células com o tumor. Estudos in vitrotêm demonstrado que as células linfóides de pacientes com certas neoplasias apresentam citotoxicidade com relação às correspondentes células tumorais humanas na cultura. Estas células citotóxicas, que são geralmente células T, foram encontradas em neuroblastomas, melanomas maligno, sarcomas e carcinomas do cólon, mama, colo do útero, endométrio, ovário, testículo, nasofaringe, e rim. Macrófagos podem também estar envolvidos na resposta das células mediadas do hospedeiro aos tumores, quando na presença de antigênicos associados a tumores, linfoquinas ou interferão.

[000125] Anticorpos humorais que reagem com as células tumorais in vitro foram produzidos em resposta a uma variedade de tumores em animais induzidos por cancerígenos químicos, ou vírus. Tecnologia de hibridoma in vitro permite a detecção e a produção de anticorpos antitumorais monoclonais dirigidos contra vários neoplasmas animais e humanos. No entanto, proteção mediada por anticorpos contra o crescimento tumoral in vivo apenas foi demonstrável em certos tipos de leucemia e linfomas em animais. Em contrapartida, a proteção mediada por células linfóides in vivo ocorre em uma ampla variedade de sistemas tumorais em animais.

[000126] A imunoterapia para o câncer é mais bem pensada como parte de uma matéria mais ampla, nomeadamente, a terapia biológica, ou a administração de modificadores de resposta biológica. Estes agentes atuam por meio de um ou mais mecanismos para (1) estimular a resposta antitumoral do hospedeiro, aumentando o número de células efetoras ou produzindo um ou mais mediadores solúveis; (2) servir como um efetor ou mediador; (3) diminuir mecanismos supressores do hospedeiro; (4) alterar as células tumorais para aumentar sua imunogenicidade, ou torná-las mais susceptíveis de serem danificadas por processos imunológicos; ou (5) melhorar a tolerância do hospedeiro aos citotóxicos ou radioterapia. Até hoje, o foco da imunoterapia tumoral mediada por células foi a reinfusão de linfócitos do paciente após expansão in vitro por exposição a interleucina-2. Uma variação inclui o isolamento e expansão das populações de linfócitos infiltradas em tumores in vivo, chamados linfócitos infiltrantes de tumores. Outra é a utilização simultânea de interferão, que se pensa aumentar a expressão dos antigênicos de histocompatibilidade e antigênicos associados a tumores em células tumorais, aumentando assim a morte das células tumorais por meios de células efetoras infundidas.

[000127] A terapia humoral faz muito que se concentra no uso de anticorpos antitumorais, como uma forma de imunoterapia passiva, em contraste com a estimulação ativa do próprio sistema imunológico do hospedeiro. Outra variação é a conjugação de anticorpos antitumorais monoclonais com toxinas, como ricina ou difteria, ou com radioisótopos, de modo que os anticorpos vão fornecer esses agentes tóxicos, especificamente, para as células tumorais. Também foi experimentada imunização ativa com células tumorais do próprio hospedeiro, após a irradiação, tratamento de neuraminidase, conjugação de hapteno, ou hibridização. Observou-se a melhoria clínica em uma minoria de pacientes assim tratados. Células tumorais de outros foram usadas após irradiação, em conjunto com adjuvantes, na leucemia linfoblástica aguda e mieloblástica aguda após a remissão. Foi relatado o prolongamento de remissões ou taxas de reindução melhoradas em algumas séries, mas não na maioria. Interferões, fatores de necrose tumoral e linfotoxinas também vêm sendo usados para afetar mecanismos imunologicamente mediados. Uma abordagem recente, usando ambos os mecanismos celulares e humorais, é o desenvolvimento de "anticorpos ligados em heterocross", incluindo um anticorpo que reage com a célula tumoral ligada a um segundo anticorpo que reage com uma célula efetora citotóxica, tornando essa última especificamente direcionada para o tumor. Foi relatada a infiltração celular imunológica do hospedeiro em um tumor murino tratado por PDT.

PDT combinada e imunoterapia

[000128] De acordo com o presente invento, é desejável usar preparos de quitosana glicada (GC) com a viscosidade adequada, que habilite o seu uso como material injetável em outras aplicações, como a terapia do câncer fotodinâmica (PDT) combinada com métodos de imunoterapia tumoral.

[000129] O potencial da combinação de PDT com imunoterapia foi explorado por Korbelik, Krosl, Dougherty e Chaplin. Ver “Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers” (Terapia Fotodinâmica e Lasers Biomédicos), supra, nas páginas 518-520. Em seu estudo, eles investigaram a possibilidade de ampliação de uma reação imunológica ao PDT, dirigida para a destruição mais generalizada de tumores tratados. O tumor, um carcinoma de células escamosas SCCVII, foi desenvolvido em ratas C3H. Um agente SPG imunoativador (uma B-glucana de alto peso molecular, que estimula macrófagos e células linfóides para se tornar mais sensível ao estímulo das citocinas e de outros sinais do sistema imunológico) foi administrado por via intramuscular em 7 doses diárias, terminando um dia antes da PDT ou começando imediatamente após a PDT. PDT baseada em Photofrin foi empregada; tendo sido administrado Photofrin por via intravenosa, 24 horas antes do tratamento com luz. Demonstrou-se que a imunoterapia SPG aumenta o efeito de morte direta da PDT. O efeito de morte indireta (visto como um decréscimo na sobrevivência das células tumorais deixadas in situ), foi, porém, muito mais pronunciado em tumores de animais que não receberam SPG. A diferença na eficácia da imunoterapia SPG, quando realizada antes e após a PDT, sugeriu que a interação máxima é alcançada quando os picos de ativação do sistema imunológico ocorrem no momento da entrega da luz ou imediatamente após. Com a SPG começando após a PDT (alcançando uma ativação imunológica ideal 5-7 dias mais tarde), é, evidentemente, muito tarde para uma reação benéfica.

[000130] Em outro estudo, foi investigado o uso de PDT para potenciar o efeito de fármacos bioreativos, que são citotóxicos em condições hipóxicas. Ver “Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers Terapia” (Fotodinâmica e Lasers Biomédicos), supra, nas páginas 698-701. Verificou-se que era possível aumentar a atividade antitumoral desses fármacos, quando usados conjuntamente com tratamentos que aumentam a hipóxia tumoral.

Tratamento de câncer por terapia fotodinâmica, combinada com um Imunoadjuvante

[000131] De acordo com o presente invento, é desejável usar preparos de quitosana glicada (GC) de viscosidade adequada como material injetável para uso no tratamento do câncer. Isto é alcançável por qualquer modo adequado, por exemplo, em conjunto com aplicações como a terapia fototérmica ou fotodinâmica (PDT) e métodos de imunoterapia tumoral. O termo câncer, como usado aqui, é um termo geral que se destina a incluir qualquer um de diversos tipos de neoplasmas malignos, a maior parte dos quais invadem os tecidos circundantes, podem metastizar em vários locais, e são susceptíveis de reaparecer após tentativa de remoção, e causar a morte do paciente, a menos que tratados adequadamente. Um neoplasma, como usado aqui, se refere a um tecido anormal que cresce mais rápido que o normal por proliferação celular. Continua a crescer, mesmo após dissipação do estímulo que iniciou seu crescimento. Neoplasmas apresentam uma falta parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e geralmente formam uma massa distinta, que pode ser benigna ou maligna.

[000132] De acordo com o presente invento, alguns exemplos de câncer que podem ser tratados com preparos de quitosana glicada (GC) com a viscosidade apropriada dos materiais injetáveis incluem, mas não se limitam ao câncer do colo do útero, mama, bexiga, cólon, próstata, laringe, endométrio, ovários, cavidade oral, rins, testículos (nonsemino-matous) e pulmão (células não-pequenas).

[000133] Além disso, de acordo com o presente invento, o tratamento pode também ser administrado de um modo apropriado em conjunto com outros tipos de tratamento do câncer, como por exemplo, o tratamento com radiação. A radiação desempenha um papel fundamental, por exemplo, na remediação da doença de Hodgkin, linfomas não-Hodgkin nodulares e difusos, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, tumores de células germinativas do mediastino, seminoma, câncer da próstata, estágio inicial do câncer mamário, estágio inicial do câncer pulmonar de não- pequenas células, e da meduloblastoma. A radiação também pode ser usada como tratamento paliativo no câncer prostático e mamário, quando estão presentes metástases ósseas, no mieloma múltiplo, no estágio avançado do câncer pulmonar, câncer do esôfago-faringe, câncer gástrico, em sarcomas, e em metástases cerebrais. Tipos de câncer que podem ser tratados incluem, por exemplo, doença de Hodgkin, linfomas não-Hodgkin no estágio inicial, do testículo (seminoma), da próstata, da laringe, do colo uterino e, em menor grau, da nasofaringe, dos seios nasais, mama, esôfago, e pulmão.

[000134] O tratamento também pode ser administrado adequadamente, em conjunto com outros tipos de fármacos antineoplásticos. Fármacos antineoplásticos incluem aqueles que impedem a divisão celular (mitose), desenvolvimento, maturação ou proliferação de células neoplásticas. O fármaco antineoplástico ideal destruiria as células cancerosas sem efeitos adversos ou toxicidade sobre as células normais, mas esse fármaco não existe. Apesar do índice terapêutico estreito de muitos fármacos, o tratamento e mesmo a cura são possíveis em alguns pacientes. Verificou-se que certos estágios de coriocarcinoma, doença de Hodgkin, linfoma de célula grande difusa, linfoma de Burkitt e leucemia são susceptíveis a antineoplásticos, como também foram o câncer do testículo (não seminomatoso) e o câncer pulmão (células pequenas).Classes mais comuns de fármacos antineoplásticos incluem, mas não se limitam a, agentes alquilantes, antimetabólitos, plantas alcalóides, antibióticos, nitrosoureias, íons inorgânicos, enzimas, e hormônios.

Vacinas autólogas in situ contra o câncer, como a imunoterapia assistida por laser

[000135] As composições derivadas de quitosana e, em particular, as preparações de quitosana glicada viscoelástica do presente invento, são eficazes no tratamento de neoplasias e outras condições médicas. Usos adicionais da quitosana glicada, só ou em combinação com outros fármacos, incluem o uso como imunoestimulante no tratamento de pacientes com sistema imunológico comprometido, incluindo mas não se limitando a câncer e síndrome da imunodeficiência adquirida.

[000136] As composições de derivados de quitosana do presente invento são, portanto, úteis em várias aplicações, incluindo, por exemplo, como imunoadjuvante ou componente de um imunoadjuvante, como descrito aqui detalhadamente. Sem prejuízo de outras utilizações, o principal uso das composições de derivados de quitosana é como imunoadjuvante em conexão com vacinas autólogas in situ contra o câncer (inCVAX), como a imunoterapia assistida por laser (LIT), e é neste contexto que as composições de derivados de quitosana são descritas aqui detalhadamente.

[000137] Também como descrito aqui, as configurações adicionais do presente invento destinam-se aos usos dos preparos de quitosana glicada do presente invento, como imunoadjuvantes, em conjunto com inCVAX em geral, e LIT em particular, para o tratamento do câncer. Imunoterapia assistida por laser usando o presente invento, compreende, preferivelmente, a introdução de imunoadjuvante, no ou em torno de um neoplasma, contendo composições derivadas da quitosana viscoelástica, no seguimento da irradiação fototérmica do respectivo tumor. A ação fototérmica é realizada com uma irradiação suficiente para induzir a destruição celular neoplástica, que pode ser executada com ou sem injeção intratumoral, ou entregue por outros meios, um cromóforo, e combinada com a injeção de, ou entregue por outros meios, preparos de quitosana glicada viscoelástica do presente invento, induz respostas imunológicas humorais e mediadas por células.

[000138] Nas configurações preferidas, a LIT é melhorada, sendo que essa melhoria compreende o uso dos preparos injetáveis de quitosana glicada viscoelástica descritos no presente invento. O presente invento também contempla métodos de ativação in vivo de componentes específicos do sistema imunológico, em conjunto com inCVAX em geral, ou LIT em particular, compreendendo o tratamento com um preparo de quitosana glicada viscoelástica.

[000139] Como descrito aqui, determinou-se que a LIT fornece uma vacina autóloga in situ contra o câncer (inCVAX) que supera as limitações das atuais imunoterapias e vacinas contra o câncer. Em geral, os dois princípios subjacentes da LIT são: (1) o aquecimento local do tumor primário com laser para desvitalizar o tumor e liberar antigênicos tumorais, e (2) a injeção local de um imunoadjuvante potente e não tóxico contendo quitosana glicada (GC), que interage com os antigênicos tumorais liberados para induzir uma resposta imunológica contra o câncer. Portanto, a LIT funciona efetivamente como uma vacina autóloga in situ contra o câncer, que usa células tumorais completas, como fonte de antigênicos tumorais de cada paciente, sem pré-seleção de antigênicos tumorais ou preparação ex vivo.

[000140] De acordo com o presente invento, uma outra vantagem do uso dos preparos de quitosana glicada viscoelástica injetável descritos no presente invento, em conjunto com LIT, é que, ao usar esta abordagem LIT, ocorre a ativação das células dendríticas (DC), e subseqüentemente exposição de DC ativada ao antigênicos tumorais in vivo. LIT representa, portanto, uma abordagem vantajosa para outras vacinas de câncer de célula inteira, ao eliminar a necessidade de preparos ex vivo, e usando a LIT em conjunto com os preparos de quitosana glicada viscoelástica como imunoadjuvantes.

[000141] Uma formulação exemplificativa de um preparo de quitosana glicada foi fabricada com o nome PROTECTIN. Observou-se que o PROTECTIN, em conjugação com LIT, estimula o sistema imunológico e induz a imunidade especifica ao tumor 1) ativando as células dendríticas, 2) aumentando a interação entre as células tumorais e dendríticas, e 3) aumentando a apresentação de antigênicos tumorais ao sistema imunológico.

[000142] Outros preparos de quitosana glicada viscoelástica do presente invento também estimulam o sistema imunológico e induzem a imunidade especifica ao tumor 1) ativando as células dendríticas, 2) melhorando a interação das células tumorais e dendríticas, e 3) aumentando a apresentação de antigênicos tumorais no sistema imunológico.

[000143] Assim, de acordo com uma configuração preferida do invento, as formulações de quitosana glicada viscoelástica ativam um ou mais componentes do sistema imune, mediando os efeitos terapêuticos desejados.

[000144] Como descrito aqui, alguns dos componentes do sistema imunológico que são ativados, incluem componentes de imunidade inespecífica, ou inata, nomeadamente, o sistema fagocítico, incluindo neutrófilos e monócitos no sangue e macrófagos nos tecidos; proteínas complementares, o principal componente solúvel da imunidade inespecífica; e reagentes de fase aguda e citocinas, como o interferão, que também faz parte da imunidade inata. Existem muitos componentes distintos da imunidade específica, por exemplo, linfócitos (por ex., células T, células B, células naturais assassinas (NK)), e imunoglobulinas. As formulações de quitosana glicada do invento também interagem com as células linfóides para promover a imunidade tumoral. Macrófagos podem também estar envolvidos na resposta das células mediadas do hospedeiro aos tumores, quando na presença de antigênicos associados a tumores, linfoquinas ou interferão.

[000145] Componentes específicos do sistema imunológico são ativados após o tratamento "fototérmico". Quando a destruição fototérmica ocorre, tecidos fragmentados e moléculas celulares são desembolsadas no hospedeiro, na presença de material imunologicamente potenciado, como a quitosana. Com efeito, uma vacina in situé formada. Em seguida, esta mistura de materiais circula pelo hospedeiro e é detectada pelo sistema de vigilância imunológica. Segue-se, então, a mobilização imediata da imunidade mediada por células NK, que engloba as células NK e as células T assassinas recrutadas. Estas células migram para os locais de antigênicos ou substâncias químicas similares. Com o tempo, a imunidade mediada por células, se desloca para uma imunidade humoral com produção de anticorpos citotóxicos. Esses anticorpos circulam livremente sobre o corpo e se ligam às células e materiais para os quais tenham sido codificados. Se esta ligação ocorre na presença de fatores complementares, o resultado é a morte celular.

[000146] Os preparos injetáveis de quitosana glicada viscoelástica do presente invento têm utilidade inesperada em "vacinas in situ contra o câncer", que se baseiam em uma ativação in situ das células apresentadoras de antigênicos (por ex., células dendríticas e macrófagos), e subseqüente exposição dos antigênicos tumorais às células apresentadoras de antigênico. Os preparos injetáveis da quitosana glicada viscoelástica do presente invento ativam, também, outros mediadores celulares, incluindo, mas não se limitando a, limitado a, fatores de necrose tumoral (por ex., TNFa) e óxido nítrico, que contribuem para os efeitos terapêuticos.

[000147] Outra vantagem de usar os preparos injetáveis de quitosana glicada viscoelástica do presente invento, aqui descritas, em conjunto com LIT, é que ao usar essa abordagem, a resposta imunológica é desencadeada, independentemente, em cada indivíduo, e não depende da reatividade cruzada na expressão do antigênico tumoral específico entre os hospedeiros (como é requerido na imunoterapêutica convencional de anticorpos e vacinação). Estudos histoquímicos revelaram que os soros de ratos portadores de tumor curados por meio de LIT continham anticorpos que se ligam à membrana plasmática das células tumorais vivas, e também preservadas. A análise Western blot das proteínas de células tumorais usando soros (de ratos tratados com LIT), como fonte de anticorpos primários, apresentou bandas distintas, indicando a indução de anticorpos tumorais seletivos. Demonstrou-se também, que os ratos tratados com sucesso obtiveram resistência a longo prazo à reexposição tumoral, e a imunidade adotiva pode ser transferida usando células de baço de ratos tratados com sucesso, indicando imunidade específica ao tumor.

[000148] Assim, usando os preparos injetáveis de quitosana glicada viscoelástica do presente invento, aqui descritos, existem diversas vantagens que atendem necessidades críticas do fornecimento de um tratamento efetivo contra o câncer. Isso é particularmente vantajoso para os pacientes com câncer, dado que o presente invento fornece também preparos, surpreendentemente e inesperadamente, benéficos, que são fáceis de administrar por injeção, e, portanto, providenciam alternativas eficazes de tratamento para as abordagens convencionais que não fornecem (1) eficácia, (2) não-toxicidade, e (3) tratamentos práticos para o câncer metastático em estágio avançado. Uma questão crítica na terapia do câncer de mama é que nem todos os pacientes são tratáveis com as metodologias convencionais atuais e aqueles diagnosticados em estágios avançados têm um prognóstico ruim, com ainda menos opções válidas de tratamento. E, apesar dos muitos avanços e desenvolvimentos no tratamento do câncer de mama nos últimos anos, problemas cruciais permanecem. Os preparos injetáveis de quitosana glicada viscoelástica do presente invento, como descrito aqui, oferecem diversas vantagens que atendem necessidades críticas para fornecer um tratamento do câncer eficaz.

[000149] Verificou-se que a LIT induz a maturação de células dendríticas (avaliado pela expressão de CD80), aumenta a proliferação de células T, da secreção de IFN-y e da expressão de HSP70. Além disso, verificou-se que os efeitos combinados da LIT (por exemplo, o aquecimento do tumor com laser e a injeção de preparos de quitosana glicada de acordo com o presente invento) induzem a imunidade tumoral específica, com uma infiltração de células CD4 e CD8 citotóxicas nos tumores, após o tratamento.

[000150] Conforme descrito em detalhes mais adiante, a LIT fornece, portanto, numerosas vantagens, incluindo, mas não se limitando a: • Eliminar tumores primários tratados • Eliminar metástases não tratadas • Induzir a imunidade e sobrevivência a longo prazo • Criar resistência a reintrodução do tumor • Não é tóxica e é segura para usar por humanos, em doses terapêuticas

[000151] De acordo com um aspecto do invento, um neoplasma, do mesmo modo que um tumor maligno, é irradiado com luz infravermelha ou na região do infravermelho visível, com potência e duração suficientes para elevar a temperatura do neoplasma para um nível que induz a destruição celular neoplástica e estimula o sistema de autodefesa imunológica contra a multiplicação celular neoplástica. Para facilitar o aquecimento do tumor, um cromóforo, com picos de absorção correspondendo ao comprimento de onda da luz aplicada, pode ser injetado antes de aplicar o tratamento de luz. Após a irradiação de luz, um imunoadjuvante derivado de quitosana glicada viscoelástica é administrado, por exemplo, por meio de injeção, no tumor ou tecido imediatamente adjacente ao tumor.

[000152] De acordo com um outro aspecto do invento, uma solução de indocianina verde (ICG) e quitosana glicada é preparada com uma concentração de 0,1 a 2% de ICG para quitosana. A solução é injetada no neoplasma, e o neoplasma é então irradiado usando um laser com uma potência de cerca de 5 watts e um comprimento de onda de radiação capaz de penetrar prontamente os tecidos celulares normais, sem perturbações significativas. A irradiação continua por um período de tempo entre cerca de um e dez minutos, o que é suficiente para elevar a temperatura do neoplasma para um nível que induz a destruição celular neoplástica, estimulando as respostas imunitárias humorais e mediadas por células.

[000153] Como descrito adiante, o presente invento possui várias vantagens sobre outras modalidades de tratamento convencionais e não convencionais. A combinação de destruição do tumor com o adjuvante imunoestimulador é a chave. A vantagem mais significativa é a destruição combinada aguda e crônica do tumor. A perda de tumor aguda é causada pela fotovaporização, fotoablação ou morte térmica do tecido neoplástico, em uma escala controlada e ampla, na área imediatamente adjacente, reduzindo a carga tumoral e, conseqüentemente, a base da multiplicação, de modo a que o sistema de autodefesa possa combater um "inimigo" mas frágil. Quando a destruição local do tumor ocorre, tecidos fragmentados e moléculas celulares são desembolsados localmente no hospedeiro, na presença de material imunologicamente potenciado, como a quitosana glicada.Com efeito, uma vacina in situé formada. Segue-se, então, a mobilização imediata da imunidade mediada por células NK, que engloba as células NK e as células T assassinas recrutadas. Estas células migram para os locais de antigênicos ou substâncias químicas similares. Com o tempo, a imunidade mediada por células, se desloca para uma imunidade humoral com produção de anticorpos citotóxicos. Esses anticorpos circulam livremente sobre o corpo e se ligam às células e materiais para os quais tenham sido codificados. Se esta ligação ocorre na presença de fatores complementares, o resultado é a morte celular. Os prazos para estes dois modos de ação imunológica são de 0 a 2 semanas para a resposta mediada por células, enquanto o humoral amadurece em aproximadamente 30 dias, devendo persistir por longos períodos, até ao respectivo tempo de vida do hospedeiro.

[000154] Em resumo, a sobrevivência a longo prazo, com erradicação total do câncer, pode ser conseguida usando os preparos de quitosana glicada viscoelástica do presente invento. É um resultado combinado da carga tumoral reduzida devido a interações ablativas (por exemplo, fototérmica) e uma resposta melhorada do sistema imunológico, devido à presença de quitosana glicada ou de outros imunomoduladores.

[000155] De acordo com outras configurações, os preparos de quitosana glicada do presente invento, podem também ser usados em aplicações antimicrobianas e/ou hemostáticas. Assim, os preparos de quitosana glicada (GC) podem ser formulados, por exemplo, como um pulverizador hemostático antimicrobiano, onde a formulação de GC possui viscosidade e apresenta propriedades reológicas que permitem a sua pulverização a partir de recipientes convencionais. Além disso, a GC pode ser incluída em outras formulações, desde que ela seja aplicada em concentrações antimicrobianas e/ou hemostáticas eficazes, e com viscosidades/propriedades reológicas que habilitem a sua capacidade para ser distribuída a partir de um recipiente adequado para o propósito.

[000156] O presente invento é ainda ilustrado pelos seguintes exemplos. Estes exemplos são fornecidos a título ilustrativo e não pretendem, de modo algum, limitar o âmbito da invenção. Os exemplos não devem, portanto, interpretar-se como limitações do escopo do invento, mas antes devem ser vistos como exemplificações das suas concretizações preferidas. São possíveis muitas outras variações.

EXEMPLOS Exemplo 1. Processo exemplificativo para a preparação de quitosana glicada (CG)

[000157] A quitosana glicada é obtida por meio da reação da quitosana com um monossacarídeo e/ou oligossacarídeo, preferencialmente na presença de um agente acidificante, por um tempo suficiente para obter a formação da base de Schiff entre o grupo carbonilo do açúcar e os grupos amino primários da quitosana (designado aqui como glicação do grupo amino) para um grau pré-determinado, onde um porcentual (%) pré-determinado de glicação do polímero de quitosana é alcançado. Esta é seguida pela estabilização através da redução das bases de Schiff e de seus derivados rearranjados (produtos de Amadori). Os traçados de RMN são usados para verificar a ligação de monossacarídeos e/ou oligossacarídeos ao polímero de quitosana, enquanto que a medição química dos restantes grupos amino livres, como por meio de uma reação de ninidrina, é usada para avaliar o grau de glicação.

Exemplo 2. Filtração estéril

[000158] Enquanto 1500 kDa de galactoquitosana convencional, descrita na Patente dos EUA 5.747.475, é relativamente simples de sintetizar, a esterilização com, por exemplo, um filtro de 0,22 mícrones, é impossível sem comprometer a integridade do filtro, tornando assim a quitosana glicada convencional inadequada para produzir GMP e para uso humano. Em contraste, a novo quitosana glicada viscoelástica aqui descrita apresenta vantagens significativas em relação à produção de GMP e filtração estéril, devido a inesperadas propriedades físico-químicas benéficas. Por exemplo, com um peso molecular (MW) de 250.000 Da (250 kDa), a filtração estéril com um filtro de 0,22 mícron é altamente viável, com uma taxa de fluxo de 100 ml/min., sem perda de materiais durante a filtração.

Exemplo 3. Viscosidade da quitosana glicada (CG)

[000159] Preparações de GC com maior peso molecular apresentam mais viscosidades (medidas em Cp):

[000160] O gráfico abaixo mostra a viscosidade (em Cp; eixo y) versus peso molecular (em kDa; eixo x) em amostras de GC, com pesos moleculares variando entre 100 kDa e 1500 kDa. A concentração de GC na solução desse experimento diminuiu com o aumento do peso molecular, variando entre 0,6% (100 kDa) e 0,11% (1500 kDa).

[000161] Verificou-se, surpreendentemente, que a viscosidade aumenta linearmente com o aumento do peso molecular, apenasse a concentração de GC da amostra reduzir com o aumento do peso molecular. A tabela e gráfico abaixo mostram a porcentagem de GC presente na solução das amostras usadas no experimento de viscosidade acima: kDa % de GC na Amostra

[000162] Os resultados mostram claramente que 1) preparações de GC de peso molecular mais alto se correlacionam com viscosidades superiores (medidas em Cp), e que 2) a correlação entre viscosidade e peso molecular não é linear, se a concentração se mantiver constante. Em outras palavras, a viscosidade aumenta desproporcionalmente com o aumento do peso molecular, tornando as quitosanas glicadas com peso molecular mais alto (como as descritas na Patente dos EUA 5.747.475) inadequadas para injeção ou filtração estéril.

[000163] Preparações de quitosana glicada viscoelástica com quitosana glicada de peso molecular mais baixo (isto é, menor que ~400 kDa), melhoram a injetabilidade; estas preparações são úteis, por exemplo, para tratamentos de câncer usando a terapia fotodinâmica e imunoterapia assistida por laser para induzir a destruição celular neoplástica e estimular o sistema de defesa imunológica para lutar contra as células neoplásicas.

Exemplo 4. Melhoria da Fabricação

[000164] Neste estudo exemplar, determinou-se que as condições experimentais podem ser ajustadas para aumentar o rendimento global, durante o fabrico de quitosana glicada. Descobriu-se inesperadamente que o fabrico de CG pode ser melhorado através do controle das condições de pH, controlando, assim, a porcentagem de glicação. Especificamente, isso foi determinado devido à meia-vida do borohidreto de sódio (NaBH4) ser proporcional ao pH, quer dizer que em um pH mais baixo, a semi-vida da NaBH4 é extremamente curta, e apenas em um pH mais elevado, o NaBH4 é um pouco mais estável. Determinou-se, assim, que o NaBH4 não foi tão eficaz na estabilização da quitosana glicada por meio da redução das bases de Schiff e produtos de Amadori em um pH mais baixo. Por exemplo, quando o pH foi mantido abaixo de cinco (pH <5), a meia-vida do NaBH4 é extremamente curta e, por isso, a redução das bases de Schiff e dos produtos de Amadori foi menos eficiente, e o porcentual de glicação de GC baixou.

[000165] Determinou-se, porém, que em um pH mais elevado, os "géis" da formulação viram não-newtonianos. Por exemplo, quando o pH foi mantido acima de seis (pH> 6), observou-se que a formulação gelificou e, portanto, o lote precisou ser descartado. Em outras palavras, para alcançar a meta de produção de GC eficiente, o pH não foi mantido tão alto para a formulação não "gelificar", mas também não foi mantido tão baixo para não minimizar a porcentagem de glicação, devido à meia-vida curta de NaBH4.

Exemplo 5. Tratamento de Imunoterapia Assistida por Laser (LIT) em um ensaio humano

[000166] Um estudo do câncer de mama liderado por investigadores foi realizado em 10 pacientes com câncer de mama avançado (5 em fase IV, 5 em fase III). A maioria dos pacientes respondeu mal, ou não de todo, a modalidades convencionais, e receberam pelo menos um tratamento de Imunoterapia Assistida por Laser (LIT), onde a quitosana glicada viscoelástica foi usada como imunoadjuvante. Dois (2) pacientes abandonaram prematuramente devido a motivos alheios, deixando 8 pacientes avaliáveis. Investigadores independentes adquiriram o IRB e aprovações governamentais antes dos ensaios. Biopsias e imagens médicas (tomografia computadorizada, etc.) foram usadas para a avaliação de lesões e metástases primárias.

[000167] O parâmetro de eficácia primário foi a melhor resposta global das avaliações dos investigadores, usando Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST). Resposta completa (CR) foi definida como o desaparecimento ou a falta de atividade metabólica qualificadora de todas as lesões alvo. Resposta parcial (RP) foi definida como uma redução de >30% da linha de base em atividade ou na soma do maior diâmetro das lesões alvo. Doença progressiva (PD) foi definida como um aumento de > 20% na soma do maior diâmetro das lesões alvo, ou o aparecimento de uma ou mais novas lesões. Doença estável (SD) foi definida como não tendo nem redução suficiente para se qualificar como PR, nem aumento suficiente para se qualificar como PD.

[000168] Dos 8 pacientes com câncer de mama disponíveis para avaliação, observou-se CR em 1 paciente, PR em 4 pacientes e SD em 1 paciente. Em pacientes disponíveis para avaliação, a taxa de resposta objetiva (CR + PR) foi de 62,5%, e a taxa de resposta clinicamente benéfica (CR + PR + SD) foi de 75%. Observou-se PD em 2 pacientes. Todas as lesões locais irradiadas com laser responderam à LIT. Adicionalmente, a maioria das metástases distantes desses pacientes responderam à LIT. Os diâmetros e a atividade das metástases em linfonodos, pulmão e fígado de vários pacientes diminuíram muito.

[000169] A toxicidade local e sistêmica foi classificada de acordo com o Critérios Comuns de Toxicidade do Instituto Nacional do Câncer, versão 3.0. e foram realizados, periodicamente, exames de avaliação laboratorial e físicos. Os eventos adversos foram monitorados de perto e registrados ao longo do período do estudo. A LIT apenas induziu reações locais na área de tratamento em pacientes com câncer de mama, a maioria dos quais se relacionaram com os efeitos térmicos do tratamento tópico com laser. Vermelhidão, dor, edema e ulceração da área de tratamento foram efeitos adversos comuns (AE). Não foram observados efeitos adversos de grau 3 ou 4. Nos pacientes que não haviam recebido antes terapia de radiação, o inchaço foi menor. Nos pacientes que haviam recebido antes terapia de radiação antes, o inchaço foi mais substancial e prolongado.

Exemplo 6. Imunoterapia assistida por laser com quitosana glicada demonstra imunidade antitumoral contra tumores de melanoma B16 em ratos

[000170] Ratas C57BC/6 (8 semanas de idade, 12 ratos/grupo) foram inoculadas subcutaneamente com o tumor de melanoma B16-F1 (106 células tumorais viáveis) na área posterior. Os tumores atingiram o tamanho de tratamento (7 a 8 mm de diâmetro) em torno do 7° dia após implantação. Cinco grupos de tratamento (12 ratas/grupo) foram incluídos no estudo: um controle não tratado; controle de tratamento imunoterápico assistido por laser; e tratamento imunoterápico assistido por laser, com 0,2 ml de 1% de quitosana glicada injetada peritumoralmente 24 horas antes, imediatamente após, ou 24 h após o tratamento com laser. Foi usado um laser díodo de 805 nm para a irradiação laser, com definições de parâmetros de 2 W ao longo de 10 min. O laser foi dirigido por meio de uma fibra ótica com lente difusora na extremidade para o local de tratamento e a ponta do laser foi mantida a uma distância de 4 mm da pele.

[000171] Avaliou-se a sobrevivência de animais. Observou-se escurecimento e endurecimento da pele do rato no local do tratamento, após o tratamento laser. Ocorreu recidiva tumoral, geralmente, vários dias após o tratamento. Tratamento térmico em combinação com a aplicação de quitosana glicada resultou em uma melhoria significativa da sobrevivência animal, com a quitosana glicada administrada 24 h antes da irradiação laser apresentando os melhoramentos mais significativos (ver a tabela abaixo).

Exemplo 7. Imunoterapia intersticial assistida por laser em um modelo mamário metastático com laser de 805 nm e quitosana glicada

[000172] Realizou-se um estudo para determinar a dose ideal de laser intersticial e quitosana glicada. Ratas Wistar Furth (5 a 6 semanas de idade, de 100 a 125 g) foram injetadas subcutaneamente com o tumor transplantável mamário metastático, DMBA-4, (10 5células tumorais viáveis) na área posterior. Os tumores DMBA-4, originalmente induzidos quimicamente, são altamente metastáticos e pouco imunogênicos. Os tumores metastizam ao longo dos vasos linfáticos e formam rapidamente diversas metástases em locais distantes, matando todos os ratos entre 30 a 40 dias após a implantação do tumor. Quando o tumor primário atingiu 0,2 a 0,5 cm 3, a pelagem sobre o tumor foi cortada e foi realizada imunoterapia assistida por laser em animais anestesiados (2% de isoflurano).Um laser díodo de 805 foi usado para proporcionar uma luz perto do infravermelho para os tumores alvo. Potência laser contínua foi entregue por meio de uma fibra ótica com ponta cilíndrica ativa. Foi usada uma ponta ativa de 1,0 cm, com uma bainha plástica transparente para proteger a ponta ativa. Para a inserção da ponta da fibra ativa, usaram-se métodos de inserção guiados por agulha ou assistidos por punção. A posição intratumoral da fibra foi verificada por meio de uma câmera digital, que pode captar a luz infravermelha do laser de 805 nm. Os ratos foram observados diariamente e os tumores foram medidos duas vezes por semana, por um período de, pelo menos, 100 dias. O critério de sucesso do tratamento era a sobrevivência por 100 dias após implantação do tumor. A dose ideal de laser intersticial foi determinada pela avaliação dos efeitos em um controle (9 ratos, sem tratamento); potências de laser intersticial de 1, 1,5, 2, 2,5, e 3 W/cm 2, por 10 min. (14 ratos/grupo); e potência de laser intersticial de 2 W/cm2 por 30 min. (14 ratos/grupo).Os ratos do controle de 3 W por 10 min. e 2 W por 30 min. pareciam ter taxas médias de sobrevivência mais altas do que outros grupos. A dose ideal de quitosana glicada foi determinada avaliando a sobrevivência após administração de 0,1, 0,2, 0,4, e 0,6 ml de 1% de quitosana glicada, após imunoterapia intersticial assistida por laser de 2,5 W, por 20 min. Um grupo de ratos que não recebeu qualquer tratamento foi incluído como controle. A melhor taxa de sobrevivência, de 42%, foi observada após uma dose de 0,2 ml de quitosana glicada (ver figura abaixo).

Taxas de sobrevivência após imunoterapia intersticial assistida por laser com 0,2 ml de GC.

Exemplo 8. Imunidade antitumoral induzida contra tumores mamários metastáticos em ratos usando imunoterapia assistida por laser

[000173] Ratas Wistar Furth (6 a 7 semanas de idade, 110 a 130 g) foram inoculadas com o tumor transplantável mamário metastático, DMBA-4, (105 células tumorais viáveis) na área inguinal. O tumor primário surge geralmente 7 a 10 dias após a inoculação, e tem aproximadamente 1 a 5 g em 3 semanas. O tumor metastizou através dos vasos linfáticos para os linfonodos axilares e inguinais. O tratamento foi iniciado quando o tumor primário apresentava entre 0,2 e 0,5 cm3, geralmente, 10 a 15 dias após a inoculação. Os ratos foram administrados 0,25% de indocianina verde 0,25% e 1% de Solução de Quitosana Glicada (0,20 ml) injetadas diretamente no centro do tumor antes da irradiação. Um laser díodo de 805 nm foi usado para a irradiação laser, com definições de parâmetros de 2 W ao longo de 10 min. O laser foi dirigido, por meio de uma fibra ótica, para o local de tratamento. Após a irradiação, os animais foram alojados individualmente, e as observações e medições do tumor foram registradas duas vezes por semana. Os ratos que foram tratados com sucesso (ratos curados) foram reexpostos repetidamente às mesmas células tumorais, com doses tumorais entre 105 e 107 de células tumorais viáveis por rato, e observou-se o desenvolvimento do tumor ao longo de 4 meses. Em 32 ratos tratados com imunoterapia assistida por laser, oito foram tratados com sucesso e livres de tumores por> 120 dias após a inoculação. Em todos os ratos curados, continuaram a se desenvolver metástases após o tratamento, para então declinar gradualmente e desaparecer, eventualmente, sem mais tratamentos. Sete ratos tratados com sucesso foram reexpostos até três vezes com doses de células tumorais viáveis injetadas, variando entre 105 e 107. Não ocorreu o ressurgimento do tumor primário ou metastático, em qualquer animal, esses animais sobreviveram> 120 dias, enquanto os ratos de controle não tratados desenvolveram tumores primários e metastáticos e tiveram uma média de sobrevivência de 30 dias.

Exemplo 9. Melhoria do tratamento de câncer com laser por meio de um imunoadjuvante derivado da quitosana.

[000174] O efeito do imunoadjuvante durante o tratamento de imunoterapia assistida por laser foi avaliado em ratos, usando quatro imunoadjuvantes diferentes. Ratas Wistar Furth (6 a 8 semanas de idade, de 150 a 200 g) foram inoculadas subcutaneamente com o tumor transplantável mamário metastático, DMBA-4, (105 células tumorais viáveis) na almofada de gordura inguinal, 7 a 10 dias antes do tratamento. O tumor primário se tornou palpável em 5-7 dias, geralmente, e as metástases inguinais e axilares remotas apareceram 15-20 dias após a inoculação. O tratamento de imunoterapia assistida por laser foi iniciado quando o tumor primário atingiu 0,2 -0,5 cm3. O tratamento com laser realizou-se, geralmente, no Dia 10.Os imunoadjuvantes incluíram 1% de Solução de Quitosana Glicada (dose de 0,2 ml, n = 48 ratos em dois experimentos), 50% de Adjuvante de Freund Completo (dose de 0,2 ml, n = 33 ratos), 50% de Adjuvante de Freund incompleto (dose de 0,2 ml, n = 30 ratos), e Corynebacterium parvum (C. parvum; 35 μg/dose por rato; n = 32 ratos). Os imunoadjuvantes foram misturados com 0,25% de indocianina verde e injetados diretamente no centro do tumor, 2 h antes da irradiação com o laser díodo de 805 nm. Os animais foram anestesiados antes da irradiação e a pelagem sobre o tumor primário foi cortada. Os parâmetros do laser eram de 2 W ao longo de 10 minutos, com um local de tratamento a laser de 3 mm de diâmetro, resultando em uma fluência de 96 J/cm2, para um tumor de 1 cm de diâmetro. Os animais foram alojados individualmente, observados diariamente, e as medições do tumor foram coletadas duas vezes por semana.

[000175] Os dados deste estudo foram comparados com dados de ratos de controle portadores de tumor (n = 38 ratos) em vários experimentos diferentes. Todos os imunoadjuvantes apresentaram um aumento estatisticamente significativo na taxa de sobrevivência, comparativamente com os dados de controle (p<0,05).O 1% de quitosana glicada 1% pareceu ser o imunoadjuvante mais eficaz, apresentando uma taxa de sobrevivência a longo prazo de 29% (ver tabela abaixo).Observou-se significância estatística quando o adjuvante de quitosana glicada foi comparado com o C. parvum (p = 0,009) e o Adjuvante de Freund Incompleto (p = 0,03).Embora não seja significativa, uma notável melhoria da sobrevivência foi observada, comparativamente com o Adjuvante de Freund completo, que obteve uma taxa de cura comparável (18%). Observou-se uma taxa de sobrevivência relativamente fraca após o tratamento seguinte com Adjuvante de Freund incompleto e C. parvum.

Exemplo 10. Aperfeiçoamento da terapia fotodinâmica por meio de imunoadjuvante derivado de quitosana

[000176] Para avaliar a terapia fotodinâmica, combinada com quitosana glicada, como um método de destruição direta de tumores, estudou-se a combinação da terapia fotodinâmica baseada em photofrin-e, clorina meso- tetra-substituída (meta-hidroxi-fenil) (mTHPC) e uma injeção de quitosana glicada em sujeitos ratos com sarcoma mamário EMT6 e adenocarcinoma de pulmão de Linha 1, respectivamente. Em cada modelo, os rato BALB/c foram inoculados subcutaneamente com 106 células tumorais viáveis na área dorsal inferior. Os tumores atingiram o tamanho de tratamento (7-8 mm) após 7 dias.

[000177] No modelo do sarcoma mamário EMT6, os grupos de tratamento avaliados estão detalhados na tabela abaixo. Photofrin (Mont- Saint-Hilaire, Québec, Canadá) foi preparado em uma concentração de 5% de dextrose estéril para 1 mg/ml. Uma dose de 5mg/kg de photofrin foi administrada por via intravenosa, 24 horas antes da irradiação. Os animais foram protegidos da luz direta imediatamente após a injeção fotossensibilizadora, até 3 dias após o tratamento fotodinâmico. Os ratos foram restringidos sem anestesia em suportes, expondo o dorso durante o tratamento de luz. A luz de 630 nm foi aplicada por meio de uma guia de luz líquida, com um diâmetro de 8 mm. A densidade da potência foi estabelecida em 100 mW/ cm2, para uma dose total de luz de 60 J/ cm2. Imediatamente após a irradiação de luz, se aplicável, os animais recebiam uma dose peritumoral de 0,5 ou 1,5% de quitosana glicada. Esses animais foram observados para monitorar o aparecimento do tumor a cada 2 dias, até 90 dias após o tratamento fotodinâmico, e três vezes por semana se determinaram mudanças no volume do tumor.

[000178] Todos os ratos tratados com quitosana glicada e fotodinâmica apresentaram, a cada dia após o tratamento, uma regressão completa do tumor. Detectou-se geralmente a recorrência do tumor, em 2 semanas após o tratamento. A eficácia da terapia fotodinâmica padrão foi de 37,5%, que foi aumentada após administração de 0,5 e 1,5% de quitosana glicada, com valores de 62,5 e 75%, respectivamente. A quitosana glicada aumentou significativamente as taxas de sobrevivência em ratos portadores de tumor em comparação com o tratamento apenas fotodinâmico (p<0,05).

[000179] No modelo de tumor pulmonar de linha 1, os grupos de tratamento foram os apresentados na tabela abaixo. A mTHPC foi preparada em uma mistura de 2:3:5 (v/v/v) de etanol, polietilenoglicol 400 e água para uma concentração final de 0,02 mg/ml. Foi administrado 0,1 mg/kg de mTHPC por via intravenosa, 24 horas antes da irradiação. Os animais foram protegidos da luz direta, imediatamente após a injeção fotossensibilizadora, por 3 dias após o tratamento fotodinâmico. Os ratos foram restringidos sem anestesia em suportes, expondo o dorso durante o tratamento de luz. Uma luz de 652 nm de um laser díodo de 0,25 W foi aplicada por meio de uma guia de luz líquida com um diâmetro de 8 mm. A densidade da potência foi estabelecida em 110 mW/ cm2, para uma dose total de luz de 30 J/ cm2.Imediatamente após a irradiação de luz, se aplicável, os animais recebiam uma dose peritumoral de 1,67% de quitosana glicada. Esses animais foram observados para monitorar o aparecimento do tumor a cada 2 dias, até 90 dias após o tratamento fotodinâmico, e três vezes por semana se determinaram mudanças no volume do tumor.

[000180] A recorrência dos tumores foi observada em todos os ratos em 3 semanas. Após a terapia fotodinâmica com base em mTHPC, a administração de 1,67% de quitosana glicada resultou em uma taxa de sobrevivência de 37,5%, enquanto outras combinações não foram eficazes. O modelo de tumor pulmonar de linha 1 foi considerado um modelo de tumor fracamente imunogênico. O efeito do tratamento de quitosana glicada localizada no tumor, na resposta à terapia fotodinâmica baseada em mTHPC de tumores de Linha 1 em ratos.

Efeito do tratamento de quitosana glicada localizada no tumor, na resposta à terapia fotodinâmica baseada em mTHPC de tumores de Linha 1 em ratos. CG = Quitosana glicada. mTHPC = Clorina meso-tetra-substituída (meta-hidroxi-fenil). PDT = Terapia fotodinâmica.

[000181] Os resultados desses estudos indicam que uma estimulação imunológica ativa é necessária para aumentar a eficiência da fototerapia.

Exemplo 11. Efeito de diferentes componentes da imunoterapia assistida por laser no tratamento de tumores metastáticos em ratos

[000182] Várias combinações de três componentes do sistema de imunoterapia assistida por laser foram avaliadas neste estudo, usando ratas e ratos portadores de tumores mamários e prostáticos metastáticos, respectivamente. O sistema de imunoterapia assistida por laser consistiu de um laser díodo próximo do infravermelho, com uma potência máxima de 25 W; de corante absorvente de laser, indocianina verde; e de imunoadjuvante, quitosana glicada. Quando o tumor primário atingiu 0,2 a 0,5 cm 3, o tratamento foi iniciado em ratos portadores de tumor. Uma solução de 0,2 ml de GC e/ou ICG foi injetado no centro do tumor primário em todos os grupos. Em ratos recebendo tratamento laser, as injeções ocorreram 2 h antes da irradiação, com os animais anestesiados e a pelagem sobrepondo o tumor cortada. Os parâmetros de laser usados foram 2 W e 10 min., com a ponta da fibra do laser mantida uma distância de 4 mm da pele sobreposta, e a energia do laser dirigida para os locais de tratamento por meio de fibras óticas. Os animais foram alojados individualmente após o tratamento. Nos estudos de sobrevivência, os ratos portadores de tumores mamários ou prostáticos foram observados diariamente e as três dimensões de cada tumor foram medidas semanalmente. Ratas Wistar Furth (5 a 6 semanas de idade, 100-125 g) foram inoculadas subcutaneamente com o tumor transplantável mamário metastático, DMBA-4, (10 5células tumorais viáveis) em uma almofada de gordura inguinal de cada uma. O tumor primário emergiu 7 a 10 dias após a inoculação. Tumores metastáticos ao longo dos vasos linfáticos e em locais remotos se tornaram palpáveis, geralmente, em aproximadamente 2 semanas. Sem tratamento, os ratos portadores de tumor têm um tempo médio de sobrevivência de 35 dias. Oito grupos de ratos portadores de tumores mamários metastáticos foram tratados com os diferentes componentes do sistema de imunoterapia assistida por laser, como descrito na tabela abaixo. A taxa de sobrevivência e o perfil dos tumores primários e metastáticos foram determinados em componentes individuais, e em várias combinações dos componentes. Além disso, os três grupos de ratas (n = 16/grupo) foram tratados com 0,5, 1,0, e 2,0% de quitosana glicada para avaliar o impacto da concentração de imunoadjuvante na sobrevivência dos ratos.

[000183] Em ratos portadores de tumores mamários metastáticos, o tratamento de componente único resultou na morte de todos os ratos dos grupos de indocianina verde e apenas laser, com tempos médios de sobrevivência similares aos tempos do grupo de controle. Dois ratos no grupo de quitosana glicada sobreviveram, com um rato considerado sobrevivente a longo prazo e outro sobrevivente prolongado (> 120 dias).Após o tratamento com dois componentes, 1 e 2 sobreviventes a longo prazo foram observados nos grupos de laser e quitosana glicada e de indocianina verde e quitosana glicada, respectivamente. Não houve uma diferença estatística no tempo de sobrevivência quando os grupos de tratamento de 1 e 2 componentes foram comparados ao grupo de controle. Nove ratos sobreviveram a longo prazo após o tratamento de imunoterapia assistida por lar de três componentes (ou seja, a aplicação fototérmica combinada com quitosana glicada), resultando em uma taxa de cura aproximada de 30%, em dois experimentos separados de 31 ratos. Observou-se uma diferença significativa (p<0,0001) no tempo médio de sobrevivência dos ratos tratados, em comparação com os ratos de controle. A taxa de sobrevivência dos ratos após o tratamento com um, dois, ou três componentes do sistema de imunoterapia assistida por laser é apresentada na figura abaixo. Tumores metastáticos surgiram, geralmente, 2 semanas após inoculação do tumor primário, atingindo um tamanho de pico antes da regressão.

Taxas de sobrevivência dos ratos após tratamento com um, dois, ou três componentes do sistema de imunoterapia assistida por laser. CG = 1,0% de quitosana glicada. ICG = 0,25% de indocianina verde.

Exemplo 12. Imunidade antitumoral induzida por imunoterapia assistida por laser e sua transferência adotiva

[000184] Para investigar o mecanismo da imunidade antitumoral induzida por imunoterapia assistida por laser, foi realizada a transferência adotiva de células imunes do baço. Ratas Wistar Furth foram inoculadas por via subcutânea com o tumor transplantável mamário metastático, DMBA-4, (10 5 células tumorais viáveis) em uma almofada de gordura inguinal de cada uma, 7 a 10 dias antes do tratamento de imunoterapia assistida por laser. Sem tratamento, os ratos portadores de tumor sobreviveram, em média, aproximadamente 30 dias. Foram administrados 0,2 ml de uma solução contendo 0,25% de indocianina verde e 1% de quitosana glicada a ratos tratados a laser, diretamente no tumor primário, antes do tratamento a laser. Um laser de 805 nm foi usado a 2 W por 10 min. para a irradiação. A capacidade protetora da imunidade induzida foi avaliada em vários grupos de ratos portadores de tumor tratados com sucesso que foram desafiados, repetidamente, com doses aumentadas de células tumorais viáveis inoculadas. Avaliou-se, ainda, a resistência aos desafios tumorais após imunoterapia assistida por laser e a inibição do crescimento do tumor, em ratos não expostos.

[000185] Quinze ratos que haviam sido tratados com sucesso por meio de imunoterapia assistida por laser foram reexpostos com 106células tumorais viáveis, 120 dias após a inoculação inicial. Dezoito ratos não expostos, da mesma idade (25 semanas de idade) foram inoculados com 10 6células tumorais viáveis para fins comparativos. Todos os ratos tratados com sucesso mostraram total resistência ao desafio, não se observando tumores primários, nem metástases; porém, os ratos do grupo de controle pareados por idade desenvolveram tumores primários e metastáticos e morreram em 30 dias após a inoculação. Um grupo separado de jovens ratos (de aproximadamente 8 semanas de idade) foi inoculado com 10 5células tumorais viáveis. A sobrevivência pareceu depender da dose do tumor, com ratos de controle sendo inoculados com 10 5 e 10 6células tumorais viáveis, sobrevivendo, em média, 33 e 28 dias, respectivamente. Ratos tratados com sucesso geralmente apresentaram regressão gradual tanto do tumor primário tratado, como da metástase não tratada.

[000186] Após a primeira reexposição, os ratos de vários grupos experimentais enfrentaram dois desafios subseqüentes em um intervalo de tempo entre 1-5 meses, com 106células tumorais viáveis. Os ratos tratados com sucesso por meio da imunoterapia assistida por laser foram totalmente refratários em três exposições tumorais. Estes dados são apresentados na tabela abaixo. Em contraste, os ratos de controle portadores de tumor com a mesma idade desenvolveram múltiplas metástases múltiplas em áreas inguinais e axilares remotas, e morreram em 35 dias. Metástases múltiplas desenvolvidas em todos os 20 ratos de controle inoculados com 105células tumorais viáveis; porém, esses ratos apresentaram um ligeiro aumento do tempo de sobrevivência com relação aos ratos de controle pareados por idade, que foram inoculados com a dose mais alta de 106células tumorais viáveis. A resistência à reintrodução do tumor em ratos tratados com sucesso sugere, fortemente, imunidade tumoral seletiva.

[000187] Para o experimento de imunização, tecido tumoral viável coletado de ratos portadores de tumor DMBA-4 vivos foi disperso, por moagem, em uma suspensão de células individuais, em um homogeneizador de vidro esmerilado folgado. Os ratos sobreviventes a longo prazo foram sacrificados 28 dias após a reintrodução tumoral de 106células tumorais viáveis, e seus baços livres de gordura foram dissecados. Dois experimentos separados foram conduzidos, usando esplenócitos dos ratos de controle portadores de tumor. As células do baço foram coletadas 22 e 39 dias após a inoculação do tumor no primeiro e segundo experimento, respectivamente. As suspensões celulares foram preparadas por perturbação mecânica, em um meio com 10% de soro de bezerro fetal. Também foram coletadas células do baço de um rato, sem exposição prévia a células tumorais. Células do baço e células de tumor viáveis foram contadas em um hemocitómetro antes de misturar, com uma razão baço:célula tumoral de 400:1. Ratos não expostos foram inoculados com a mistura contendo 4 x 107células de baço e 105 células tumorais viáveis em um volume de 0,2 ml. Para os experimentos de transferência imunológica adotiva, quatro grupos de ratas Wistar Furth foram inoculadas com células tumorais. Os grupos de tratamento incluíram ratos de controle portadores de tumor do Grupo A; ratos do Grupo B inoculados com células tumorais misturadas com células do baço de um rato de controle portador de tumor; ratos do Grupo C inoculados com células tumorais misturadas com células de baço de um rato portador de tumor tratado com sucesso por meio de imunoterapia assistida por laser, 28 dias após subseqüente reintrodução do tumor; e ratos do grupo D, inoculados com células tumorais misturadas com as células de baço de um rato sem exposição tumoral prévia. O experimento foi realizado em duplicado, e a sobrevivência de ratos de ambos os experimentos foi combinada, sendo apresentada na figura abaixo. Não se observaram tumores primários ou metastáticos nos ratos do Grupo C, indicando que as células do baço de ratos tratados com sucesso por meio de imunoterapia assistida por laser, forneceram 100% de protecção para os receptores. Observou-se metástases e morte em 35 dias após a inoculação do tumor em todos os ratos de controle portadores de tumor do Grupo A. Não houve proteção fornecida As células do baço de um rato saudável no Grupo D não forneceram qualquer proteção. Apenas sobreviveu um rato de 10 ratos do Grupo B; porém, esse rato desenvolveu posteriormente tumor primário e metástases. Todos os ratos do Grupo C foram reexpostos 60 dias após a transferência de imunidade adotiva, e todos resistiram ao desafio. As células imunes de baço dos ratos do Grupo C foram coletadas e misturadas com células tumorais na mesma proporção que a primeira transferência adotiva, para avaliar a capacidade das células do baço desses animais em proteger uma coorte subseqüente de ratos Wistar Furth normais (n = 6), que haviam sido inoculados com esta mistura. As células do sistema imunológico dos ratos do grupo C protegeram 5 de 6 ratos não expostos, não se observando tumores primários nem metastáticos. O rato que morreu, sobreviveu por um período de tempo longo (60 versus 30 dias) e um atraso do surgimento do tumor após inoculação (37 versus 7 a 10 dias), em comparação com o grupo de controle.

[000188] A resistência dos ratos tratados com sucesso, após a reexposição a tumores, sugere fortemente que a imunidade tumoral seletiva tem um efeito duradouro.

Curvas de sobrevivência dos em experimentos de transferência imunológica adotiva usando esplenócitos de rato como células imunológicas. Grupo = Resultados de ratos de controle tumoral. A Grupo = Resultados dos ratos injetados com células tumorais misturadas com B células do baço de um rato portador de tumor não tratado. Grupo = Resultados dos ratos injetados com células tumorais misturadas com C células do baço de um rato tratado com sucesso por meio da imunoterapia assistida por laser. Grupo = Resultados usando células do baço de um rato não exposto. D NOTA: Os dados coletados a partir de 2 experiências separadas foram combinados e plotados em conjunto.

Exemplo 13. Imunoterapia assistida por laser combinada com baixa dosagem de quimioterapia

[000189] Em um estudo clínico exemplificativo, dois pacientes com câncer de mama receberam, semanalmente, uma dose entre 150 e 200 mg/m2 de ciclofosfamida (após tratamento inCVAX). Os pacientes responderam bem ao tratamento no início, com redução do tumor e efeitos adversos mínimos. Após alguns meses, a resposta refreou, de modo que o oncologista mudou a baixa dose quimioterapia para um regime semanal de 75 mg/m2 de Paclitaxel, e de novo a resposta foi muito boa, com encolhimento dos tumores. Não surgiram novas metástases. Os pacientes continuaram recebendo baixa dosagem de quimioterapia. Um terceiro paciente passou a ser operável após uma baixa dose de quimioterapia, e uma mastectomia foi realizada, por isso, a combinação com a cirurgia também é uma opção.

Claims

1. Formulação de quitosana glicada viscoelástica para o tratamento de neoplasmas em um sujeito, caracterizadapelo fato de que consiste em um polímero de quitosana glicada e uma solução aquosa, em que o polímero de quitosana glicada tem um peso molecular entre 50.000 e 400.000 Daltons, ainda em que o polímero de quitosana glicada inclui grupos amino glicados presentes de um décimo de um porcento a doze e meio porcento de grupos amino disponíveis, e ainda em que a formulação é formulada para administração por injeção no referido sujeito para o tratamento dos referidos neoplasmas no referido sujeito.

2. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o peso molecular da quitosana glicada viscoelástica é 250.000 Daltons, o grau de desacetilação de uma quitina parental de quitosana glicada viscoelástica é oitenta porcento, e o grau de glicação dos grupos amino desacetilados da quitosana é sete porcento.

3. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o polímero de quitosana glicada possui dois porcento de glicação de seus grupos amino desacetilados.

4. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a solução aquosa possui um pH de entre cinco (5) e sete (7).

5. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a formulação viscoelástica compreende um porcento em peso do polímero de quitosana glicada dissolvido em uma solução aquosa, a referida solução aquosa apresenta uma viscosidade de entre 0,000001 a 0,0001 m2/s (um a cem centistokes), medidos a 25 graus Celsius.

6. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a formulação viscoelástica compreende um porcento em peso de um polímero de quitosana glicada dissolvido em uma solução aquosa, em que polímero de quitosana glicada possui um décimo de um porcento a trinta porcento de glicação dos grupos amino desacetilados, e ainda em que a solução aquosa possui uma viscosidade de 0,000001 a 0,0001 m2/s (um a cem centistokes).

7. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um porcento em peso do polímero de quitosana glicada dissolvida em uma solução aquosa, em que o polímero de quitosana glicada possui cinco porcento de glicação de seus grupos amino desacetilados, e ainda em que a solução aquosa possui uma viscosidade que permite a administração por injeção em um sujeito.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: um imunoadjuvante, que compreende a formulação de quitosana glicada viscoelástica como definida na reivindicação 1.

9. Composição para uso no condicionamento de neoplasias em tratamentos imunológicos e fotofísicos tandem, caracterizada pelo fato de que compreende um imunoadjuvante, em que o imunoadjuvante compreende a formulação de quitosana glicada viscoelástica como definida na reivindicação 1, em que o imunoadjuvante é conjugado a um antígeno específico a um tumor.

10. Imunoadjuvante, caracterizado pelo fato de que compreende: uma formulação de quitosana glicada viscoelástica como definida na reivindicação 1.

11. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o grau de desacetilação de uma quitosana parental da quitosana glicada viscoelástica é oitenta porcento, e em que o polímero de quitosana glicada inclui grupos amino glicados presentes de um décimo de um porcento a 12,5 porcento de grupos amino disponíveis.

12. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a solução aquosa compreende uma solução possuindo um pH de entre cinco (5) e sete (7)

13. Formulação de quitosana glicada viscoelástica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a formulação viscoelástica compreende um porcento em peso do polímero de quitosana glicada disperso em uma solução aquosa, a referida solução aquosa tendo uma viscosidade, a referida viscosidade de entre 0,000001 a 0,0001 m2/s (um a cem centistokes), medidos a cerca de 25 graus Celsius.

14. Imunoadjuvante, caracterizado pelo fato de que compreende a formulação de quitosana glicada viscoelástica como definida na reivindicação 11.

15. Composição para uso no condicionamento de neoplasias em tratamentos imunológicos e fotofísicos tandem, caracterizada pelo fato de que compreende um imunoadjuvante como definido na reivindicação 14, em que o referido imunoadjuvante está sozinho ou conjugado com um antígeno específico a um tumor.