KR20170024166A

KR20170024166A - 팔미토일화에 의한 티로시나제의 변형에 의한 멜라닌 생성의 조절

Info

Publication number: KR20170024166A
Application number: KR1020177005427A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 비. 야로쉬; 리베 데클레르크; 요코 니키; 나오아키 사이토
Original assignee: 이엘씨 매니지먼트 엘엘씨
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2017-03-06
Also published as: EP2934474A1; EP3207919A1; WO2014099609A1; AU2013363330A1; US20140178319A1; JP6246832B2; KR20150093844A; CA2895238A1; US20150283104A1; AU2013363330B2; KR101870094B1; CN104918602B; CN104918602A; US20150283054A1; CA2895238C; EP2934474A4; JP2017078074A; JP2016504997A; US9283166B2; US20150283105A1

Abstract

티로시나제 팔미토일화를 변형함으로써 멜라닌 생성을 조절하는 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

팔미토일화에 의한 티로시나제의 변형에 의한 멜라닌 생성의 조절{MODULATION OF MELANOGENESIS BY MODIFICATION OF TYROSINASE BY PALMITOYLATION}

<관련 출원의 상호-참조>

본 출원은 2012년 12월 20일 출원된 U.S. 가출원 특허출원번호 제61/740,048호로부터 우선권을 주장한다.

<기술 분야>

본 발명은 멜라닌 합성의 조절에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 티로시나제의 활성을 변형하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

<선행 기술의 기재>

인간 피부 및 모발의 색소침착은 전 세계 사람들의 관심이다. 일부 경우에, 그 바람은 전체적으로 더 밝은 피부색을 갖는 것이다. 거의 일반적으로 사람들은 근본적인 색에 상관없이 일정한 피부 색을 갖기를 바란다. 모든 사람은 노화의 신호인 새치가 나타나는 것을 늦추길 원한다.

피부 및 모발의 색소침착은 멜라닌 세포(melanocyte)라 불리는 전문화된 세포에 의해 조절된다. 멜라닌 세포는 멜라닌의 종류(흑색 유멜라닌(eumelanin) 및 적색 페오멜라닌(pheomelanin))을 생성하는 멜라노솜이라 불리는 세포소기관을 그 안에 함유하고 그 후 멜라닌 세포는 피부 또는 모발 내에 이를 분포시킨다. 멜라닌의 생합성에서 가장 중요한 효소는 티로시나제이고, 그것의 억제는 피부 색이 밝아지도록 제작된 대부분의 상품의 초점이 되어 왔다.

티로시나제는, 리보솜에서 합성되고 골지체를 통과하여 프리-멜라노솜으로 전달되고 그 후 그 안에 실어지는 금속단백질(metalloprotein)이다. 프리-멜라노솜이 성숙하면, 구리 분자는 또한 티로시나제에 대한 공동-인자로서 그것에 실어지고, pH가 증가하여 효소를 위한 최적에 도달한다. 성숙한 멜라노솜은 그 후 멜라닌을 합성하기 시작한다.

티로시나제의 전달은 잘 이해되지 않았다. 최근에, 단백질의 팔미토일화는 포유류 단백질의 세포내 위치결정의 메커니즘으로서 주목을 받았다(문헌[T. 이와나가(Iwanaga), R. 츠츠미(Tsutsumi), J. 노리타케(Noritake), Y. 푸카타(Fukata), M. 푸카타 Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling, Progress in Lipid Research 48:117-127, 2009; C. 살라운(Salaun), J. 그리브스(Greaves), L. 체임벌린(Chamberlain) "The intracellular dynamic of protein palmitoylation" J. Cell Biol . 191:1229-1238, 2010; C. 에까르-라모스(Aicart-Ramos), R. 발레로(Valero), I. 로드리게스-크레스포(Rodrigues-Crespo) "Protein palmitoylation and subcellular trafficking" Bioch . Biophys . Acta 1808:2981-2994. 2011]에서 검토됨). 티로시나제는 이들 리뷰의 어떤 것에도 팔미토일화의 표적으로 개시되지 않았다.

본 발명의 한 측면에 따라, DHHC 2, 3, 7, 15, 6, 11, 17, 21, 또는 22의 하나 이상의 억제제로 피부 또는 모발을 처리하는 것을 포함하는, 이러한 증가가 필요한 포유류 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 증가시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 두 번째 측면에 따라, PPT-유형 효소의 하나 이상의 억제제로 피부 또는 모발을 처리함에 의해 이러한 감소가 필요한 포유류 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 세 번째 측면에 따라, 적어도 하나의 팔미토일화 펩티드로 피부 또는 모발을 처리함에 의해 이러한 감소가 필요한 포유류 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 네 번째 측면에 따라, 화장용으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 비히클 중에 DHHC 2, 3, 7, 15, 6, 11, 17, 21, 또는 22의 하나 이상의 억제제의 멜라닌 증가-유효량을 포함하는, 포유류 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 증가시키는 화장용 또는 피부과학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다섯 번째 측면에 따라, 화장용으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 비히클 중에 PPT-유형 효소의 하나 이상의 억제제의 멜라닌 감소-유효량을 포함하는, 포유류 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 감소시키는 화장용 또는 피부과학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 여섯 번째 측면에 따라, 화장용으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 비히클 중에 적어도 하나의 팔미토일화 펩티드의 멜라닌 감소-유효량을 포함하는 포유류 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 감소시키는 화장용 또는 피부과학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면 및 목적은 다음의 설명 및 청구항으로부터 더 분명해질 것이다.

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도 1은 단백질 팔미토일화의 회로의 도식적인 재현이다.
도 2a 및 2b는 티로시나제의 팔미토일화에 미치는 팔미토일화 억제제(2-BP)의 효과를 도시한다.
도 3a 및 3b는 NHEM 및 재건된 인간 피부 모델에서 멜라닌 합성에 미치는 2-BP의 효과를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 mRNA 발현 및 티로시나제의 글리코실화에 미치는 2-BP의 효과를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 티로시나제의 분해에 미치는 2-BP의 효과를 나타낸다.
도 6은 티로시나제의 유비퀴틴화에 미치는 2-BP의 효과를 도시한다.
도 7은 티로시나제 팔미토일화에 미치는 2-BP의 효과를 나타낸다.
도 8은 단백질의 DHHC(팔미토일화) 종류를 나타낸다.
도 9는 티로시나제 특이적 DHHC에 대한 스크리닝의 결과를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 MNT-1 세포 내 티로시나제 팔미토일화에 미치는 DHHC 2, 3, 7 및 15 사일런싱(silencing)의 효과를 나타낸다.
도 11a 및 11b는 NHEM 내 DHHC 2, 3, 7 및 15-myc의 세포내 위치결정의 분석을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 인간 티로시나제 내 팔미토일화 위치를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 인간 티로시나제 내 팔미토일화 위치를 나타낸다.
도 14a-14d는 NHEM에서 멜라닌 합성에 미치는 PP-2 및 KA의 효과를 도시한다.
도 15는 생체외 인간 티로시나제(DOPA 산화) 활성에 미치는 PP-2 및 KA의 효과를 나타낸다.
도 16은 NHEM에서 티로시나제 단백질에 미치는 PP-2의 효과를 도시한다.

단백질 팔미토일화 또는 S-아실화는 많은 단백질의 위치결정 및 활성에 영향을 주는 가역적인 번역-후 지질 변형이다. 개략적으로 도 1에서 나타난 바와 같이, 팔미토일화는 팔미토일 아실 전이효소(PAT)에 의해 달성된 단백질의 시스테인 잔기에 팔미트산 기를 붙이는 효소 공정이다. PAT는 DHHC 도메인(아스파테이트-히스티딘-히스티딘-시스테인 시그니처 모티프)을 공유하고 포유류 세포에는 23 또는 24 별개의 DHHC-함유 단백질이 있고, 각각은 그것 자체의 기질 특이성이 있다. DHHC-함유 단백질의 표적에 대한 공통 서열은, 그것이 시스테인을 함유한다는 것 외에는 알려지지 않았다. 많은 단백질은 팔미토일화되고 그 목록은 아직 완성되지 않았다. DHHC-함유 단백질은 그것의 합성 직후 팔미토일화에 의한 표적 단백질의 재배열을 일으키는 곳인 골지막에 주로 위치한다.

팔미토일화는 세포질 도처에 위치한 아실-단백질 티오에스테라아제(APT) 및 팔미토일-단백질 티오에스테라아제(PPT)에 의해 효소 가역적이다. 포유류 세포에는 여러 APT가 있으나 오직 두 PPT만이 있는 것으로 보인다. 팔미토일화된 단백질은 골지로부터 전달되어 엔도솜, 리소좀 또는 원형질 막에 붙는다. 재배열의 결과로 이는 분해되거나(예를 들어, 리소좀에서) 또는 이는 PPT에 대한 기질이 되어, 이의 위치결정을 바꾸고 및/또는 재-팔미토일화를 위해 골지로 되돌아갈 수 있다. 이렇게 하여, DHHC PAT 및 APT/PPT의 상대적인 활성은, 골지 주위에 더 농축될지 또는 엔도솜 또는 원형질 막에 분산될 지, 단백질의 위치결정을 결정한다. 시스템은 역동적이어서, 단백질이 끊임없이 왕복하고 분해된다.

팔미토일의 억제제:단백질 티오에스테라아제(PPT1)는 문헌[도슨(Dawson) 외. (도슨, G., 슈뢰더(Schroeder), C., 도슨, P. Palmitoyl:protein thioesterase (PPT1) inhibitors can act as pharmacological chaperones in infantile Batten Disease. Bioch . Biophys . Res. Comm . 395:66-69, 2010.)]에 의해 설명되었다. 친지성 형광단 NBD, CS38(NBD-βAGDap(Pal)VKIKK)의 N-말단 첨가가 있는 억제제는 Dap1(AcGDap(Pal)VKIKK)보다 3-배 더 좋은 억제제이다. CS38은 2 μM의 IC₅₀을 갖는 가장 강한 펩티드 억제제이다. 모사 티올의 NBD 형태(CS8: GGC(Pal) VKIKK)가 CS38에 비교할 만한 억제 활성을 갖는다. 세포 유입을 촉진하도록 설계된 폴리아르기닌(R₇) 말단(AcGDap(Palm)GGR₇)과 같은 TAT가 있는 부가적 펩티드는 또한 강한 PPT1 억제제(예를 들어 AcGDap(Pal)GG)R)7)이었다. VKIKK의 모든 절단은 억제 활성을 제거하였다. APT의 억제는 멜라닌 생성을 막는데 훨씬 덜 효과적이다.

사실상 어떤 것도 멜라닌 생성에서 팔미토일화의 역할에 대해 알려지지 않았다. 멜라닌 생성에 영향을 주는 유전자의 유전자-전체 스크린에서, 유전자 ZDHHC9는 siRNA에 의한 억제가 멜라닌 생성을 감소시키는 것 중 하나로 확인되었다(문헌[A. 가네산(Ganesan), H. Ho, B. 보데만(Bodemann), S. 피터슨(Petersen), J. 아루리(Aruri), S. 고시(Koshy), Z. 리처드슨(Richardson), L. Le, T. 크라시에바(Krasieva), M. 로스(Roth), P. 파머(Farmer), M. 화이트(White) "Genome-wide siRNA functional genomics of pigmentation identifies novel genes and pathways that impact melanogenesis in human cells". PLOS Genetics 4(12):e1000298, doi:10.1371/journal.pgen.1000298, 2008]). 이 PAT에 대한 siRNA는 MITF(마이크로탈미아-결합된 전사 인자) RNA 및 티로시나제 단백질 축적을 억제하였다. 티로시나제 단백질의 siRNA 억제는 리소좀의 pH를 올리고 단백질 분해를 억제하는 바필로마이신(bafilomycin)으로의 인큐베이션에 의해 역전되었다. 그들은 스크리닝 방법이 멜라노솜 단백질 카고의 멜라노솜 전달/분류에 영향을 주는 새로운 유전자를 식별한다는 것을 제시한다. 그러나, 그들은 팔미토일화의 억제가 멜라닌 생성을 감소시켜야 한다는 것을 암시한다. 사실, 본 발명에서 드러나지 않은 것과 같이, 팔미토일화의 일반적 억제는 멜라닌 생성을 증가시키고, PAT DHHC9는 티로시나제의 특이적 조절인자(modifier)가 아니다.

우(Wu) 등은, 그것의 팔미토일화된 형태에서, 멜라닌 세포로부터 케라틴 세포(keratinocyte)로의 멜라닌의 전사를 방지하는 단백질인 멜라노레귤린(melanoregulin)의 팔미토일화를 연구하였다(문헌[X. 우, J. 마티나(Martina), J. 해머(Hammer) "Melanoregulin is stably targeted to the melanosome membrane by palmitoylation" Bioch . Biophys . Res. Comm . 426:209-214.]). 팔미토일화는 멜라노레귤린 단백질을 멜라노솜에 국부화시켜 그렇게 함으로써 멜라닌 세포로부터 멜라닌의 전사를 억제한다. 멜라노레귤린의 팔미토일화의 억제는 리소좀에 및, 추론컨대 멜라노솜에 그것의 축적을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 우 등은 멜라닌 생성 또는 티로시나제에 관한 어떤 입증도 제시하지 않았다.

본 발명은 티로시나제의 팔미토일화/데팔미토일화가 멜라닌 생성에서 역할을 한다는 발명자들에 의한 놀라운 발견에 있다. 더 구체적으로, 발명자들은 PAT(팔미토일-아실 전이효소 또는 DHHC)에 의한 멜라닌 세포에서 티로시나제의 팔미토일화가 멜라노솜으로부터 티로시나제의 전달로 이어져, 피부 및 모발에서 멜라닌의 출현 감소를 야기한다는 것을 발견하였다. 발명자들은 멜라노솜으로부터 티로시나제의 변화된 위치결정이 그것의 분해로 이어진다고 이론화한다. 더욱이, 티로시나제의 팔미토일화의 억제, 즉, PAT의 억제는, 짐작건대 멜라노솜에서 티로시나제의 유지, 및 피부 및 모발에서 멜라닌의 증가된 출현의 결과를 낳는다. PAT를 억제하는 화합물은 2-브로모팔미테이트(2-BP)를 포함한다. 아래, 실시예에서 나타나는 바와 같이, 발명자들은, DHHC 6, 11, 17, 21, 및 22가 약한 친화도를 보이고, DHHC 9가 티로시나제를 팔미토일화하는 것으로 보이지 않는데 반하여, 티로시나제 팔미토일화를 책임지는 PAT는 DHHC 2, 3, 7 및 15이라고 밝혔다. 이 아미노산을 알라닌으로 돌연변이를 일으키는 것이 효소의 팔미토일화를 막기 때문에, 티로시나제가 시스테인 500에 팔미토일화된다는 것이 추가로 확인되었다.

발명자들은 아래 실시예에서 나타나는 바와 같이, 티로시나제의 데-팔미토일화를 책임지는 PPT(팔미토일-단백질 티오에스테라제)를 억제하는 것이 티로시나제의 증가된 분해 및 피부 및 모발에서 멜라닌의 출현의 감소로 이어진다는 것을 추가로 밝혔다. PPT는 팔미토일화된 펩티드; 즉, 팔미토일화된 아미노산을 함유하는 펩티드에 의해 억제된다. 본 발명의 목적에 유용한 예시적인 펩티드는, 세더마(Sederma)의 바이오펩티드 EL로 입수가능한 팔미토일화된 펩티드-1 또는 PP1(100 ppm의 팔미토일화된 헥사펩티드 팔미토일-val-gly-val-ala-pro-glu를 함유하는, 팔미토일 올리고펩티드 (및) PEG-8 (및) 글리세릴 폴리메타크릴레이트), 및 루카스 메이어 코스메틱스(Lucas Meyer Cosmetics)의 뉴트라젠(Neutrazen)으로 입수가능한 팔미토일화된 펩티드-2 또는 PP2(아르기닌, 히스티딘, 및 페닐알라닌으로 이루어진 500 ppm의 팔미토일화된 트리-펩티드를 함유하는, 팔미토일 트리펩티드-8 (및) 덱스트란 (및) 부틸렌 글리콜 (및) 물)을 포함한다.

DHHC, PPT 및/또는 APT의 억제제는 단독으로 또는 히드로퀴논, 누룩산(kojic acid) 등과 같은 색소침착의 다른 억제제 또는 촉진제와 결합하여 사용될 수 있다. 이들 억제제는 자외선 차단제, 소염제, 비타민 A 및 그것의 유도체, 비타민 C 및 그것의 유도체 및 다른 비타민, 미량의 미네랄 및 영양소와 같은 다른 화장용으로 또는 피부과학적으로 유용한 화합물과 결합될 수 있다. 억제제는 에멀젼, 로션, 크림, 세럼, 하이드로겔, 고분자, 실리콘, 등과 같은 피부를 위한 통상의 전달 형태와 혼합될 수 있다. 이들은 향기, 향균성 화합물, 방부제 및 항산화제와 결합될 수 있다.

<실시예>

실시예 1 - 티로시나제의 팔미토일화에 미치는 팔미토일화 억제제 2-BP의 효과

보통 인간 상피 멜라닌 세포(NHEM)는 24 시간 동안 2-브로모팔미테이트(2-BP)로 인큐베이션되고, 총 티로시나제는 마우스 단일클론 항-티로시나제 IgG 항체 T311(1:120 희석)을 사용한 웨스턴-블럿(Western-blot)(WB)에 의해 측정된다. 총 티로시나제 단백질 수준은 튜불린에 의해 정규화된다. 팔미토일화된 티로시나제는 아실-RAC 및 WB에 의해 평가된다. 도 2a 및 2b에서 나타난 결과는 3 개 측정의 평균 SE이다. *p < 0.05 vs. DMSO.

DMSO 대조군과 비교한, 팔미토일화의 억제제인 다양한 농도의 2-BP로의 NHEM의 인큐베이션은 세포 당 티로시나제 단백질의 총 양에 통계적으로 상당한 증가를 야기한다. 게다가, 총 단백질의 양이 증가하는 반면, 팔미토일화된 티로시나제의 양은 감소하였다.

실시예 2 - NHEM 및 재건된 인간 피부 모델에서 멜라닌 합성에 미치는 2-BP의 효과

NHEM은 48 시간 동안 2-BP의 나타난 농도로 처리되었다. 멜라닌 함량(닫힌 막대) 및 세포 수(열린 막대)가 측정되었다. 수치는 3 개 측정의 평균±SE 이다. *p < 0.05 vs. DMSO. 세포 펠렛의 육안 시점은 디지털 카메라에 의해 찍혔다(도 3a). 재건된 인간 피부 모델(아시아인 유형)은 17 일 동안 25 μM 2-BP로 인큐베이션 되었다. 유멜라닌(EM) 및 페오멜라닌(PM) 함량은 다음 수식에 의해 결정되고 계산되었다. EM=PTCA*25, PM=4-AHP*9. 수치는 3 개 측정의 평균±SE 이다. *p < 0.05 vs. DMSO. 17일 후 인간 피부 모델의 육안 시점은 디지털 카메라에 의해 찍혔다(도 3b).

다양한 농도에서 2-BP로의 NHEM의 인큐베이션은, DMSO 대조군과 비교해서, 세포 당 멜라닌 함량에 통계적으로 상당한 증가를 야기한다. 게다가, 2-BP로의 인간 피부 모델을 인큐베이션시키는 것은 또한 총 멜라닌: 조직의 유멜라닌(EM) 및 페오멜라닌(PM) 함량에서 통계적으로 상당한 증가를 야기한다.

실시예 3 - 티로시나제의 mRNA 발현 및 글리코실화에 미치는 2-BP의 효과

NHEM는 6 또는 24 시간 동안 2-BP로 배양되었다. 티로시나제 mRNA 수준은 실시간 정량 PCR에 의해 분석되었다. 결과는 3 개 측정의 평균±SE 이다. *p < 0.05 vs. DMSO(도 4a). NHEM은 24 시간 동안 5 μM 2-BP로 인큐베이션되었다. 티로시나제의 성숙 및 미성숙 형태에 대한 엔도 H 및 WB 분석에 의한 글리코시다아제 소화 처리는 WB에 의해 수행되었다(도 4b). 2-BP로의 NHEM의 배양은 티로시나제 mRNA 발현의 감소를 야기하였지만, 티로시나제의 글리코실화에 어떤 영향도 미치지 않았다.

실시예 4 - 티로시나제의 분해에 미치는 2-BP의 효과

NHEM은 4 시간 동안 1 μ g/ml 시클로헥스이미드, 단백질 합성 억제제, 및 10 μM 2-BP의 존재(■) 또는 부재(◇)로 처리되었다. 티로시나제 수준은 마우스 단일클론 항-티로시나제 IgG 항체 T311(1:120 희석)을 사용한 WB에 의해 분석되었다. 티로시나제의 밴드 강도는 각 상태에 대한 내부 대조군으로써 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)의 밴드 강도에 의해 정규화된다. 결과는 3 개 측정의 평균± SE 이다. *p < 0.05 vs. DMSO(도 5a 및 5b).

도면에서 나타난 바와 같이, NHEM이 단백질 합성 억제제인 시클로헥스이미드로 처리될 때, 티로시나제 수준은 감소한다. 그러나, 인큐베이션 배지에서 2-BP의 부가적 존재는 시클로헥스이미드의 영향을 억제하고, 이는 2-BP가 티로시나제의 분해를 억제하는 것을 나타낸다.

실시예 5 - 티로시나제의 유비퀴틴화에 미치는 2-BP의 효과

NHEM은 24 시간 동안 5 μM 2-BP로 처리되었다. 세포 용해물의 동일한 단백질 양이 티로시나제에 의한 IP에 사용되었고, 티로시나제의 유비퀴틴화(UB) 수준은 항-UB 항체를 사용하여 WB에 의해 분석되었다.

도 6에서 나타난 결과는 2-BP가 티로시나제의 유비퀴틴화에 어떤 영향도 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 도 7에서 개략적으로 나타난 바와 같이, 2-BP가 티로시나제 분해를 억제하고 멜라닌 합성의 활성을 야기하는 동안, 유비퀴틴 프로테아좀 시스템은 이 현상에 관여하지 않음이 관찰되었다.

실시예 6 - 티로시나제-특이적 DHHC의 스크리닝

본원에 나타난 바와 같이, PAT는 DHHC-풍부 도메인을 공유하고 유전적으로 보존된 DHHC 종류 단백질로 군집될 수 있다(문헌[츠츠미 R, 푸카타 Y, 푸카타 M "Discovery of protein-palmitoylating enzymes", Eur J Physiol . 2008 Sep;456(6):1199-206]). 이는 도 8에서 개략적으로 나타났다. 이들 DHHC 중 어떤 것이 티로시나제 팔미토일화에 관련되는지 밝히기 위해, HEK293T 세포는 티로시나제 및 각 DHHC로 형질감염되었다. [3H]팔미테이트로 물질대사 표지 한 후, 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되었다(도 9). 상부 패널은 항-티로시나제 항체에 의한 WB를 나타내고; 하부 패널은 방사선사진을 나타낸다. 티로시나제 팔미토일화에 대해서, DHHC 3, 7, 15 각각은 강한 효과를 나타내고, DHHC 2, 6, 11, 17, 21, 22 각각은 약한 효과를 나타낸다.

실시예 7 - MNT-1 세포 내 티로시나제 팔미토일화에 미치는 DHHC 2, 3, 7, 및 15 사일런싱의 효과

DHHC 2, 3, 7 및/또는 15가 티로시나제 팔미토일화에 참여하는지 평가하기 위해, 발명자들은 티로시나제에 DHHC 2, 3, 7 또는 15의 녹다운(knocking down) 영향을 평가하였다. MNT-1 세포는 DHHC 2, 3, 7 및 15에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질감염되었다. 3 일 후, siRNA 형질감염이 반복되었다. 처음 형질감염의 6 일 후, 티로시나제 팔미토일화가 아실-RAC 및 WB에 의해 분석되었다. 결과(도 10)는 6 개 측정의 평균±SE을 나타낸다. *p < 0.05 vs. DMSO. 결과는, DHHC 2, 3, 7 및 15가 티로시나제 팔미토일화에 참여할 수 있음을 나타낸다. DHHC 2 및 15에 siRNA를 사용하는, 팔미토일화된 티로시나제의 양에서 관찰된 감소는 통계적으로 상당하다.

실시예 8 - NHEM에서 DHHC 2-, 3-, 7- 및 15-myc의 세포내 위치결정의 분석

myc 태그가 있는 DHHC 2, 3, 7 및 15로 형질감염된 NHEM(아시아인)은 항-myc 항체로 착색되고 또한 Vti1b(골지체) 또는 HMB45(멜라노솜)에 대한 항체로 표지된다. 결과는 도 11a 및 11b에 나타난다. DHHC 2는 멜라노솜, 원형질 막, 및 골지체에 국부화되는 것이 발견되었다. 또한 DHHC 7 및 15도 골지체에 국부화되는 것이 발견되었다. DHHC 3은 소포체(ER)에 국부화되는 것이 발견되었다.

실시예 9 - 인간 티로시나제 내 팔미토일화 위치

MNT-1 세포는 야생형 티로시나제 또는 세 개의 티로시나제 중 하나로 형질감염되어, 세 개 핵심 시스테인 코돈 중 하나에서 돌연변이되어, 다음과 같이 C8A, C35A 또는 C500A로 시스테인을 알라닌으로 교체하는 결과를 낳았다. 48 시간 후, 티로시나제의 팔미토일화는 아실-RAC 및 WB에 의해 분석된다. 도 12a에 나타난 결과는 Cys500에 대한 코돈 내 돌연변이는 티로시나제 팔미토일화의 손실을 야기함을 나타내는데, 이는 Cys500이 인간 티로시나제 내 팔미토일화 위치임을 나타낸다. 도 12b에서 나타난 바와 같이, 소프트웨어 CSS-팜(Palm) 3.0에 의해 인간 티로시나제에서 가장 가능성이 높은 S-팔미토일화 위치의 예측은 연구결과를 뒷받침한다.

실시예 10 - 인간 티로시나제 내 팔미토일화 위치

HEK293T 세포는 티로시나제 및 개별 DHHC로 형질감염되었다. [3H]팔미테이트로 4 시간 물질대사 표지 후, 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 도 13a 및 13b 각각에서, 상부 패널은 방사선사진이고 하부 패널은 항-티로시나제 항체에 의한 WB 분석을 나타낸다. 결과는, C500A의 돌연변이가 있는 티로시나제는 DHHC 2, 3, 7 또는 15에 의해 팔미토일화되지 않음을 나타내었고(흰색 별표), 티로시나제의 팔미토일화 위치가 Cys500임을, 위 실시예 9의 관찰을 추가로 뒷받침한다.

실시예 11 - NHEM에서 멜라닌 합성에 미치는 PP2의 효과

NHEM(아시아인)은 PP2의 존재 하에서 2-BP 존재 또는 부제 하에 120 시간 동안 인큐베이션 되었다. PP2는 2-BP-처리된 세포에서 및 세포독소 없이 2-BP로 처리되지 않은 세포에서 모두 멜라닌 합성을 억제하였다(도 14a 및 14b). 평균±S.E. (N=3) * p<0.05, vs. 대조군.

누룩산(KA)은 양의 대조군으로 사용되었다. 도 14c 및 14d에서 나타나듯이, KA는 2-BP 처리된 세포 및 2-BP로 처리되지 않은 세포에서 모두 멜라닌 합성을 약하게 억제한다.

실시예 12 - 멜라닌 생성에 미치는 PP2의 작용의 메커니즘 : NHEM에서 멜라닌 합성에 미치는 PP2의 효과

도 15에서 나타난 바와 같이, 누룩산(양의 대조군)은 티로시나제 활성을 용량 의존 방식으로 억제하는 반면, PP2는 체외에서 인간 티로시나제(DOPA 산화) 활성을 억제하지 않았다. 평균 ±S.E. (N=4) * p<0.05, vs. 대조군.

실시예 13 - 멜라닌 생성에 미치는 PP2의 작용의 메커니즘 : NHEM에서 티로시나제 단백질 수준에 미치는 PP2의 효과

NHEM은 PP2의 존재 하에서 2-BP 존재 또는 부재 하에 48 시간 동안 인큐베이션 되었다. 도 16에서 나타난 바와 같이, PP2는 2-BP-처리된 인간 NHEM(아시아인)에서 티로시나제 단백질 수준을 감소시켰다. 평균 ±S.E. (N=3) *p<0.05, vs. 대조군.

본 발명이 구체적인 실시양태, 특징 및 측면에 관하여 앞서 설명되었지만, 발명이 그에 따라 제한되는 것이 아니라, 다른 변형, 변화, 응용, 및 실시양태로 유용성이 확장된다고 인정될 것이고, 그에 따라 모든 이러한 다른 변형, 변화, 응용, 및 실시양태는 본 발명의 목적 및 범위 내에 있다고 여겨진다.

Claims

팔미토일-단백질 티오에스테라제(PPT)의 하나 이상의 억제제의 멜라닌 감소-유효량을 포함하는 화장용 조성물로 피부 또는 모발을 처리함으로써 멜라닌의 출현 감소를 필요로 하는 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법.
제1항에 있어서, PPT의 하나 이상의 억제제가, 하나 이상의 팔미토일화된 아미노산을 함유하는 하나 이상의 펩티드인, 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법.
제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 억제제가 팔미토일화된 펩티드-1(PP1)을 포함하는, 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법.
제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 억제제가 팔미토일화된 펩티드-2(PP2)를 포함하는, 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법.
하나 이상의 팔미토일화된 펩티드의 멜라닌 감소-유효량을 포함하는 화장용 조성물로 피부 또는 모발을 처리함으로써 멜라닌의 출현 감소를 필요로 하는 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법.
제5항에 있어서, 하나 이상의 팔미토일화된 펩티드가, 하나 이상의 팔미토일화된 아미노산을 함유하는 하나 이상의 펩티드인, 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법.
제6항에 있어서, 하나 이상의 팔미토일화된 펩티드가 팔미토일화된 펩티드-1(PP1)을 포함하는, 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법.
제6항에 있어서, 하나 이상의 팔미토일화된 펩티드가 팔미토일화된 펩티드-2(PP2)를 포함하는, 멜라닌의 출현을 감소시키는 방법.
팔미토일-단백질 티오에스테라제(PPT)의 하나 이상의 억제제의 멜라닌 감소-유효량을 포함하는, 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 감소시키는 제제.
제9항에 있어서, PPT의 하나 이상의 억제제가, 하나 이상의 팔미토일화된 아미노산을 함유하는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 제제.
제10항에 있어서, PPT의 하나 이상의 억제제가 팔미토일화된 펩티드-1(PP1)을 포함하는 제제.
제10항에 있어서, PPT의 하나 이상의 억제제가 팔미토일화된 펩티드-2(PP2)를 포함하는 제제.
하나 이상의 팔미토일화된 펩티드의 멜라닌 감소-유효량을 포함하는, 피부 또는 모발에서 멜라닌의 출현을 감소시키는 제제.
제13항에 있어서, 하나 이상의 팔미토일화된 펩티드가 팔미토일화된 펩티드-1(PP1)을 포함하는 제제.
제13항에 있어서, 하나 이상의 팔미토일화된 펩티드가 팔미토일화된 펩티드-2(PP2)를 포함하는 제제.
제13항에 있어서, 부가적인 색소침착 억제제를 더 포함하는 제제.