CN104918602B - 通过棕榈酰化修饰酪氨酸酶调节黑色素生成 - Google Patents

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Abstract

提供了用于通过修饰酪氨酸酶棕榈酰化调节黑色素生成的组合物和方法。

Description

通过棕榈酰化修饰酪氨酸酶调节黑色素生成
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年12月20日提交的美国临时申请号61/740,048的优先权。
发明背景。
发明领域
本发明涉及黑色素合成的调节。更具体地，本发明涉及改变酪氨酸酶的活性的组合物和方法。
现有技术的描述
人皮肤和毛发的色素沉着是世界上人们的关注问题。在一些情况下，期望具有总体较亮的肤色。最通常地，人们希望具有均匀的肤色，无论底层颜色。所有人都希望延缓灰发的出现，这是衰老的迹象。
皮肤和毛发的色素沉着由被称为黑色素细胞的专门细胞控制。黑色素细胞在其内含有被称为黑色素体的细胞器，其制造各种形式的黑色素(包括黑色真黑色素和红色褐黑色素)，然后黑色素细胞将其分布在皮肤或毛发内。黑色素的生物合成中最重要的酶是酪氨酸酶，并且其抑制已经是被设计为使肤色光亮的大多数商业产品的焦点。
酪氨酸酶是一种金属蛋白，其在核糖体合成，通过高尔基体转运至前黑色素体，然后载入其中。当前黑色素体成熟时，铜分子也作为酪氨酸酶的辅助因子载入其中，并且pH增加以达到所述酶的最佳值。成熟黑色素体然后开始合成黑色素。
酪氨酸酶的转运没有得到充分理解。近来，蛋白的棕榈酰化已经作为哺乳动物蛋白的亚细胞定位的机制受到关注(综述于T. Iwanaga, R. Tsutsumi, J. Noritake, Y.Fukata, M. Fukata “Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling,Progress in Lipid Research 48:117-127, 2009; C. Salaun, J. Greaves, L.Chamberlain “The intracellular dynamic of protein palmitoylation” J. Cell Biol. 191:1229-1238, 2010; C. Aicart-Ramos, R. Valero, I. Rodrigues-Crespo“Protein palmitoylation and subcellular trafficking” Bioch. Biophys. Acta1808:2981-2994. 2011)。在任何这些综述中都没有公开酪氨酸酶作为棕榈酰化的目标。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了用于增加需要此类增加的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法，其包括用DHHC 2、3、7、15、6、11、17、21或22的一种或多种抑制剂处理皮肤或毛发。
根据本发明的第二个方面，提供了用于通过用PPT型酶的一种或多种抑制剂处理皮肤或毛发而减少需要此类减少的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法。
根据本发明的第三个方面，提供了用于通过用至少一种棕榈酰化肽处理皮肤或毛发而减少需要此类减少的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法。
根据本发明的第四个方面，提供了用于增加哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素增加有效量的DHHC 2、3、7、15、6、11、17、21或22的一种或多种抑制剂。
根据本发明的第五个方面，提供了用于减少哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素减少有效量的PPT型酶的一种或多种抑制剂。
根据本发明的第六个方面，提供了用于减少哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素减少有效量的至少一种棕榈酰化肽。
本发明的其它方面和目的将从随后说明书和权利要求变得更加显而易见。
附图简述
图1是蛋白棕榈酰化的循环的示意图。
图2A和2B描绘棕榈酰化抑制剂(2-BP)对酪氨酸酶的棕榈酰化的影响。
图3A和3B代表2-BP对NHEM和重构的人皮肤模型中的黑色素合成的影响。
图4A和4B说明2-BP对酪氨酸酶的mRNA表达和糖基化的影响。
图5A和5B代表2-BP对酪氨酸酶的降解的影响。
图6描绘2-BP对酪氨酸酶的泛素化的影响。
图7代表2-BP对酪氨酸酶棕榈酰化的影响。
图8是蛋白的DHHC(棕榈酰化)家族的图示。
图9代表筛选酪氨酸特异性DHHC的结果。
图10A和10B说明DHHC 2、3、7和15沉默对MNT-1细胞中的酪氨酸酶棕榈酰化的影响。
图11A和11B代表NHEM中的DHHC 2、3、7和15-myc的细胞内定位的分析。
图12A和12B说明人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点。
图13A和13B说明人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点。
图14A-14D描绘PP-2和KA对NHEM中的黑色素合成的影响。
图15代表PP-2和KA对人酪氨酸酶(DOPA氧化)体外活性的影响。
图16描绘PP-2对NHEM中的酪氨酸酶蛋白的影响。
本发明优选实施方案的详述
蛋白棕榈酰化或S-酰化是影响许多蛋白的定位和活性的可逆的翻译后脂质修饰。如图1中示意表示，棕榈酰化是通过棕榈酰基酰基转移酶(PAT)完成的将棕榈酸基团结合至蛋白的半胱氨酸残基的酶促过程。PATS共享DHHC结构域(天冬氨酸-组氨酸-组氨酸-半胱氨酸特征基序)，并且在哺乳动物细胞中存在23或24个单独的含DHHC蛋白，每个都具有其自身的底物特异性。对于含DHHC蛋白的目标的共有序列是未知的，除了其含有半胱氨酸。几十种蛋白被棕榈酰化，并且名单尚不完整。含DHHC蛋白主要定位于高尔基体膜中，在那里它们通过其合成后不久的棕榈酰化引起目标蛋白的重定位。
棕榈酰化是通过普遍定位于胞质溶胶的酰基蛋白硫酯酶(APT)和棕榈酰基蛋白硫酯酶(PPT)酶促可逆的。哺乳动物细胞中似乎存在几种APT，但只存在两种PPT。棕榈酰化蛋白被转运远离高尔基体，并且结合至核内体、溶酶体或质膜。作为重定位的后果，它们可被降解(例如，在溶酶体中)，或者它们可以变为PPT的底物，改变它们的定位和/或返回至高尔基体用于重新棕榈酰化。以这种方式，DHHC PAT和APT/PPT的相对活性决定蛋白的定位，无论是否更集中于高尔基体附近或分散至核内体或质膜。该系统是动态的，其中蛋白恒定地来回穿梭且被降解。
Dawson等人描述了棕榈酰基:蛋白硫酯酶(PPT1)的抑制剂(Dawson, G.,Schroeder, C., Dawson, P. Palmitoyl:protein thioesterase (PPT1) inhibitorscan act as pharmacological chaperones in infantile Batten Disease. Bioch. Biophys. Res. Comm. 395:66-69, 2010.)。N端添加亲脂性荧光团NBD的抑制剂CS38(NBD-βAGDap(Pal)VKIKK)是比Dap1 (AcGDap(Pal)VKIKK)好3倍的抑制剂。CS38是具有2μM的IC50的最有效的肽抑制剂。真正巯基的NBD形式(CS8:GGC(Pal) VKIKK)具有与CS38相当的抑制活性。经设计以促进细胞摄取的具有TAT样聚精氨酸(R7)尾区的其它肽(AcGDap(Palm)GGR7)也是强烈的PPT1抑制剂(例如AcGDap(Pal)GG)R)7)。VKIKK的任何截短消除抑制活性。APT的抑制在阻断黑色素生成中的效力要低得多。
关于棕榈酰化在黑色素生成中的作用几乎一无所知。在影响黑色素生成的基因的基因组范围筛选中，基因ZDHHC9被鉴定为其中通过siRNA的抑制减少黑色素生成的基因(A.Ganesan, H. Ho, B. Bodemann, S. Petersen, J. Aruri, S. Koshy, Z. Richardson,L. Le, T. Krasieva, M. Roth, P. Farmer, M. White “Genome-wide siRNAfunctional genomics of pigmentation identifies novel genes and pathways thatimpact melanogenesis in human cells”. PLOS Genetics 4(12):e1000298, doi:10.1371/journal.pgen.1000298, 2008)。针对该PAT的siRNA抑制MITF(microthalmia相关转录因子)RNA和酪氨酸酶蛋白积累。酪氨酸酶蛋白的siRNA抑制由与巴弗洛霉素的孵育所抑制，这升高了溶酶体的pH且抑制蛋白降解。他们表明，他们的筛选方法鉴定了影响黑色素体蛋白货物的黑色素体转运/分选的新型基因。然而，他们暗示棕榈酰化的抑制应减少黑色素生成。事实上，如本发明中未覆盖，棕榈酰化的总体抑制增加了黑色素生成，并且PATDHHC9不是酪氨酸酶的特异性修饰剂。
Wu等人研究了黑色素调节素(melanoregulin)的棕榈酰化，所述黑色素调节素是以其棕榈酰化形式防止黑色素从黑色素细胞转移至角质形成细胞的蛋白(X. Wu, J.Martina, J. Hammer “Melanoregulin is stably targeted to the melanosomemembrane by palmitoylation” Bioch. Biophys. Res. Comm. 426:209-214.)。棕榈酰化将黑色素调节素蛋白定位至黑色素体，从而抑制从黑色素细胞转移黑色素。据观察，黑色素调节素的棕榈酰化的抑制降低了其在溶酶体的积累，并且通过推断，降低了其在黑色素体中的积累。Wu等人没有呈现关于黑色素生成或酪氨酸酶的任何证据。
本发明在于本发明人的以下令人惊讶的发现：酪氨酸酶的棕榈酰化/去棕榈酰化在黑色素生成中发挥作用。更具体地，本发明人已发现，PAT(棕榈酰基-酰基转移酶或DHHC)在黑色素细胞中对酪氨酸酶的棕榈酰化导致酪氨酸酶被转运远离黑色素体，导致皮肤和毛发中黑色素的出现的降低。本发明人推断，酪氨酸酶远离黑色素体的改变定位导致其降解。此外，酪氨酸酶的棕榈酰化的抑制，即PAT的抑制，据推测导致酪氨酸酶在黑色素体中的保留，和皮肤和毛发中黑色素的出现的增加。抑制PAT的化合物包括2-溴棕榈酸盐(2-BP)。如下面实施例中显示，本发明人已经确定，负责酪氨酸酶棕榈酰化的PAT是DHHC 2、3、7和15，而DHHC 6、11、17、21和22显示微弱亲和力，且DHHC 9似乎不会棕榈酰化酪氨酸酶。进一步确定，酪氨酸酶在半胱氨酸500上棕榈酰化，因为将该氨基酸突变为丙氨酸阻断了所述酶的棕榈酰化。
本发明人已经进一步发现，如下面实施例中显示，抑制负责酪氨酸酶的去棕榈酰化的PPT(棕榈酰基-蛋白硫酯酶)，导致酪氨酸酶的降解增加和皮肤和毛发中黑色素的出现的降低。棕榈酰化肽；即，含有棕榈酰化氨基酸的肽，抑制PPT。可用于本发明目的的示例性肽包括棕榈酰化肽-1或PP1(甘油聚甲基丙烯酸酯(和)PEG-8(和)棕榈酰基寡肽，其含有100ppm的棕榈酰化六肽棕榈酰基-val-gly-val-ala-pro-glu)(可作为Biopeptide EL购自Sederma)，和棕榈酰化肽-2或PP2(水(和)丁二醇(和)葡聚糖(和)棕榈酰基三肽-8，其含有500 ppm的由精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸组成的棕榈酰化三肽)(可作为Neutrazen购自Lucas Meyer Cosmetics)。
DHHC、PPT和/或APT的抑制剂可单独使用或与色素沉着的其它抑制剂或促进剂(诸如对苯二酚、曲酸等)组合使用。这些抑制剂可以与其它化妆品或皮肤病学有用的化合物(诸如防晒剂、消炎药、维生素A及其衍生物、维生素C及其衍生物和其它维生素、微量矿物质和营养素)组合。所述抑制剂可以与常用的皮肤递送形式(诸如乳剂、洗剂、霜剂、精华素、水凝胶、聚合物、有机硅等)混合。它们可以与香料、抗微生物化合物、防腐剂和抗氧化剂组合。
实施例
实施例1-棕榈酰化抑制剂2-BP对酪氨酸酶的棕榈酰化的影响
将正常人表皮黑色素细胞(NHEM)与2-溴棕榈酸盐(2-BP)孵育24小时，并且通过Western印迹(WB)使用小鼠单克隆抗酪氨酸酶IgG抗体T311(1:120稀释液)测定总酪氨酸酶。总酪氨酸酶蛋白水平通过微管蛋白进行归一化。棕榈酰化酪氨酸酶通过酰基-RAC和WB评估。图2A和2B中显示的结果是三次测定的平均值SE。*p < 0.05 vs. DMSO。
NHEM与各种浓度的2-BP(棕榈酰化的抑制剂)的孵育，与DMSO对照相比，导致每个细胞的酪氨酸酶蛋白的总量的统计学显著增加。此外，尽管总蛋白的量增加，但棕榈酰化酪氨酸酶的量减少。
实施例2 - 2-BP对NHEM和重构的人皮肤模型中的黑色素合成的影响
NHEM用所示浓度的2-BP处理48小时。测量黑色素含量(实心柱)和细胞数(空心柱)。值是三次测定的平均值±SE。*p < 0.05 vs. DMSO。通过数码相机摄取细胞沉淀的宏观图(图3A)。重构的人皮肤模型(亚洲型)与25 μM 2-BP孵育17天。测定真黑色素(EM)和褐黑色素(PM)含量，并且通过下式计算。EM=PTCA*25, PM=4-AHP*9。值是三次测定的平均值±SE。*p < 0.05 vs. DMSO。通过数码相机摄取17天后人皮肤模型的宏观图(图3B)。
NHEM与各种浓度的2-BP的孵育，与DMSO对照相比，导致每个细胞的黑色素含量的统计学显著增加。此外，将人皮肤模型与2-BP的孵育还导致组织的总黑色素(真黑色素(EM)和褐黑色素(PM))含量的统计学显著增加。
实施例3 - 2-BP对酪氨酸酶的mRNA表达和糖基化的影响。
将NHEM与2-BP培养6或24小时。通过实时定量PCR分析酪氨酸酶mRNA水平。所示结果是三次测定的平均值±SE。*p < 0.05 vs. DMSO (图4A)。将NHEM与5 μM 2-BP孵育24小时。通过WB对酪氨酸酶的成熟和未成熟的形式进行通过endo H的糖苷酶消化处理和WB分析(图4B)。据观察，NHEM与2-BP的孵育导致酪氨酸酶mRNA表达的降低，但对酪氨酸酶的糖基化没有影响。
实施例4- 2-BP对酪氨酸酶的降解的影响
NHEM用1 μ g/ml环己酰亚胺(蛋白合成抑制剂)在有(■)或没有(◇) 10 μM 2-BP的情况下处理4小时。通过WB使用小鼠单克隆抗酪氨酸酶IgG抗体T311 (1:120稀释液)分析酪氨酸酶水平。对于每个条件，将酪氨酸酶的条带强度通过作为内部对照的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的条带强度进行归一化。所示结果是三次测定的平均值±SE。*p < 0.05vs. DMSO (图5A和5B)。
如图中显示，当NHEM用环己酰亚胺(蛋白合成抑制剂)处理时，酪氨酸酶水平降低。然而，孵育培养基中2-BP的额外存在抑制了环己酰亚胺的影响，表明2-BP抑制酪氨酸酶的降解。
实施例5- 2-BP对酪氨酸酶的泛素化的影响
将NHEM用5 μM 2-BP处理24小时。相等蛋白量的细胞裂解物用于通过酪氨酸酶的IP，并且酪氨酸酶的泛素化(UB)水平通过WB使用抗UB抗体分析。
图6中显示的结果表明2-BP对酪氨酸酶的泛素化没有影响。因此，据观察，如图7中的示意图所示，尽管2-BP抑制酪氨酸酶降解，并且导致黑色素合成的活化，但泛素蛋白酶体系统不参与该现象。
实施例6 - 酪氨酸酶特异性DHHC的筛选
如本文上面所示，PAT共享富含DHHC的结构域，并且可以成簇为遗传保守的DHHC家族蛋白(Tsutsumi R, Fukata Y, Fukata M “Discovery of protein-palmitoylatingenzymes”, Eur J Physiol. 2008 Sep;456(6):1199-206.)。这示意性地显示于图8。为了阐明这些DHHC中的何者参与酪氨酸酶棕榈酰化，HEK293T细胞用酪氨酸酶和个别DHHC转染。用[3H]棕榈酸盐代谢标记后，将蛋白通过SDS-PAGE分开(图9)。上小图显示通过抗酪氨酸酶抗体的WB；下小图显示放射自显影。DHHC 3、7、15各显示对酪氨酸酶棕榈酰化的强烈影响，且DHHC 2、6、11、17、21、22各显示对酪氨酸酶棕榈酰化的微弱影响。
实施例7 - DHHC 2、3、7和15沉默对MNT-1细胞中的酪氨酸酶棕榈酰化的影响
为了评价DHHC 2、3、7和/或15是否参与酪氨酸酶棕榈酰化，本发明人评价了敲低DHHC 2、3、7或15对酪氨酸酶的影响。MNT-1细胞用针对DHHC 2、3、7和15的siRNA或对照siRNA转染。3天后，重复siRNA转染。初始转染后6天，通过酰基-RAC和WB分析酪氨酸酶棕榈酰化。结果(图10)显示六次测定的平均值±SE。*p < 0.05 vs. DMSO。结果表明，DHHC 2、3、7和15可参与酪氨酸酶棕榈酰化。使用针对DHHC 2和15的siRNA观察到的棕榈酰化酪氨酸酶的量的降低是统计学显著的。
实施例8 - NHEM中的DHHC 2、3、7和15-myc的细胞内定位的分析
用具有myc标签的DHHC 2、3、7和15转染的NHEM(亚洲)用抗myc抗体染色，并且还用针对Vti1b(高尔基体)或HMB45(黑色素体)的抗体标记。结果显示于图11A和11B。发现DHHC2定位于黑色素体、质膜和高尔基体中。还发现定位于高尔基体中的是DHHC 7和15。发现DHHC 3定位于内质网(ER)中。
实施例9 - 人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点
MNT-1细胞用野生型酪氨酸酶或三种酪氨酸酶之一(在三个关键半胱氨酸密码子之一处突变，其导致半胱氨酸替换为丙氨酸，如下：C8A、C35A或C500A)转染。48小时后，通过酰基-RAC和WB分析酪氨酸酶的棕榈酰化。图12A中显示的结果表明，Cys500的密码子的突变导致酪氨酸酶棕榈酰化的丢失，表明Cys500是人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点。通过软件CSS-Palm 3.0对人酪氨酸酶中最可能S-棕榈酰化位点的预测(如图12B中显示)支持该发现。
实施例10 - 人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点
HEK293T细胞用酪氨酸酶和个别DHHC转染。用[3H]棕榈酸盐代谢标记4小时后，将蛋白通过SDS-PAGE分开。在图13A和13B的每个中，上小图是放射自显影，且下小图显示使用抗酪氨酸酶抗体的WB分析。结果表明，具有C500A的突变的酪氨酸酶没有被DHHC 2、3、7或15棕榈酰化(白色星号)，进一步支持了上述实施例9中的酪氨酸酶的棕榈酰化位点是Cys500的观察。
实施例11- PP2对NHEM中的黑色素合成的影响
NHEM(亚洲)在PP2存在的情况下在有或没有2-BP 的情况下孵育120小时。PP2抑制2-BP处理的细胞和没有用2-BP处理(无细胞毒性)的细胞两者中的黑色素合成(图14A和14B)。平均值±S.E. (N=3) * p<0.05, vs.对照。
曲酸(KA)用作阳性对照。如图14C和14D中显示，KA轻度抑制2-BP处理的细胞和没有用2-BP处理的细胞两者中的黑色素合成。
实施例12- PP2对黑色素生成的作用机制：PP2对NHEM中的黑色素合成的影响
如图15中显示，PP2不抑制人酪氨酸酶(DOPA氧化)体外活性，而曲酸(阳性对照)以剂量依赖的方式抑制酪氨酸酶活性。平均值±S.E. (N=4) * p<0.05, vs. 对照。
实施例13- PP2对黑色素生成的作用机制：PP2对NHEM中的酪氨酸酶蛋白水平的影响
NHEM在PP2存在的情况下在有或没有2-BP 的情况下孵育48小时。如图16中显示，PP2降低2-BP处理的人NHEM(亚洲)中的酪氨酸酶蛋白水平。平均值±S.E. (N=3) * p<0.05, vs. 对照。
尽管本文上面已经参照具体实施方案、特征和方面描述了本发明，但是应当认识到，本发明并不因此受到限制，反而在效用中延伸到其它修改、变化、应用和实施方案，并且因此，所有此类其它修改、变化、应用和实施方案应被视为在本发明的精神和范围内。

Claims (2)

1.用于增加需要此类增加的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的非治疗方法，其包括用包含黑色素增加有效量的具有天冬氨酸-组氨酸-组氨酸-半胱氨酸结构域(DHHC)的棕榈酰基酰基转移酶的至少一种抑制剂的组合物处理所述皮肤或毛发，所述DHHC选自DHHC2、3、7、15、6、11、17、21和22，其中所述至少一种抑制剂是2-溴棕榈酸盐。
2.用于增加哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素增加有效量的具有天冬氨酸-组氨酸-组氨酸-半胱氨酸结构域(DHHC)的棕榈酰基酰基转移酶的至少一种抑制剂和色素沉着的额外促进剂，所述DHHC选自DHHC 2、3、7、15、6、11、17、21和22，其中所述至少一种抑制剂是2-溴棕榈酸盐。
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