KR20170020389A - 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 과잉 면역 억제용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 과잉 면역 억제용 조성물, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 면역 과잉 억제 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말, 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 과잉 면역 억제용 조성물에 관한 것이다.
면역계는 자연저항, 비특이성 면역체계 및 특이성 면역체계로 구분할 수 있다. 자연저항(1차 방어선)이란 미생물을 위시한 모든 침입자들을 그들의 종류에 관계없이 막아내는 해부생리학적 요소들을 말하며, 비특이성 면역체계(2차 방어선)는 자연저항을 돌파하여 체내로 들어온 침입자들을 제거하는 식세포로 구성된 방어체계를, 그리고 특이성 면역체계(3차 방어선)는 림프구들로 구성된 면역체계를 말하는데, 이 중 특이성 면역체계는 기억능 그리고 자기와 비자기를 구분할 수 있는 능력을 지닌 고도로 발달한 면역체계이다(Richard A. Goldsby, et al., KUBY Immunology, 2000).
백혈구는 2차 또는 3차 방어선을 구성하여 1차 방어선을 돌파하여 체내에 들어온 이물을 담당하게 되며, 세균, 바이러스 감염 또는 염증 반응 시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과의 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다. 대식세포(Macrophage)는 면역반응에 관계하는 주 세포로서 면역세포의 작용을 조절하는 사이토카인(cytokine)을 분비하여 면역반응 조절, 자연면역에서 미생물, 항원, 죽은 조직 등을 식균작용으로 파괴, 체액성 면역 반응에서 작용세포(effector cell)로서의 활동, 지연성 과민 반응(delayed type hypersensivity)에서 항원 제거, 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor-α; TNF-α) 분비를 통한 종양세포의 파괴, 획득면역반응에서 항원의 조작과 제시(antigen processing and presentation), 염증반응에 관여하는 물질이나 사이토카인을 분비하여 염증반응을 조절, 섬유아세포와 혈관내피세포의 성장인자를 생산하여 손상된 조직의 치유 등 다양한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 대식세포는 감염 및 암과 같은 질병에 대하여 방어역할을 수행하며, 염증자극에 의해 염증성 싸이토카인 및 화학매개체를 분비한다. 그람음성균의 막 구성 물질인 지질다당류(리포폴리사카라이드)는 면역세포 중 특히 대식세포를 활성화시켜 TNF-α, 인터류킨-1(interleukin-1; IL-1), IL-6, IL-10, 프로스타노이드 및 산화질소를 분비하게 하는 것으로 알려져 있다.
상술한 면역과 관련된 인자의 세포내 수준을 조절하여 면역을 증강시켜 각종 질환을 치료하려는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 초기에는 화학적 물질을 이용하여 상기 인자들의 세포내 수준을 조절하고자 하였으나, 부작용이 심하다는 단점이 있어, 최근에는 부작용이 없거나 매우 낮은 수준으로 나타나는 천연물 유래 물질을 이용하여 상기 인자들의 세포내 수준을 조절하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
이와 관련하여, 대한민국 공개특허 제10-2014-0019113호는 알파-갈락토실세라마이드 유사체의 면역조절 이상으로 인한 질환의 치료 또는 예방 활성을 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1417341호는 경단구슬모자반 추출물 및 아포-9'-푸코잔티논(apo-9'-fucoxanthinone) 화합물을 포함하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 개시하고 있다.
한편, 세리포리아 락세라타는 백색 부후균의 일종으로서, 생태계에서 셀룰로오스, 헤미 셀룰로오스, 기타 다당류 및 글리세롤 등의 탄소원을 이용하기 위하여 리그닌 분해라는 공동대사(co-metabolism)를 수행하는 것으로 알려져 있다.
세리포리아 락세라타를 이용한 의학적 치료 용도와 관련하여, 대한민국 특허 제10-1031605호에 세리포리아 락세라타 배양액 추출물의 당뇨 치료 용도만이 지금까지 알려져 있을 뿐, 세리포리아 락세라타를 이용한 면역 조절 효과는 아직까지 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 세리포리아 락세라타로부터 분리한 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물이 면역 조절 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 활성 성분을 함유하는 과잉 면역 억제용 조성물, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 과잉 면역 억제용 조성물, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 과잉 면역 억제용 조성물, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품은 과도한 림프구 증식을 억제하므로 과도한 림프구 증가로 인한 면역 과잉 억제 효과가 우수하다.
도 1은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체(EPS)를 다양한 농도로 마우스 유래 비장세포에 처리한 후의 림프구 증식능(%)을 나타낸 그래프이다(**p < 0.01, *p < 0.05).
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 과잉 면역 억제용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포외다당체(extracellular polysaccharide, EPS)"란, 균류 등 미생물의 세포벽의 일부로서, 다당류가 세포 외로 분비되어 그 주위에 협막을 형성하거나 점질물로서 세포주위나 배지로 분비되는 물질을 의미한다. 상기 세포외다당체는 미생물이 항체, 독성물질, 원생동물 및 박테리오파지 등의 외부환경으로부터 자신을 보호하기 위해 분비된다.
상기 세포외다당체는 40 ~ 60 중량%의 당과 30 ~ 40 중량%의 단백질, 40 ~ 50 중량%의 당과 32 ~ 38 중량%의 단백질, 또는 43 ~ 47 중량%의 당과 33 ~ 36 중량%의 단백질을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 약 45 중량%의 당과 약 34 중량%의 단백질을 포함할 수 있다.
상기 당은 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유할 수 있다.
*상기 세포외다당체는 100 ~ 150 kDa, 110 ~ 140 kDa 또는 115 ~ 125 kDa의 분자량을 가질 수 있고, 보다 구체적으로는 약 120 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
본 발명의 일구체예로서, 상기 세포외다당체는, (a) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하는 단계; (b) 상기 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 건조시켜 분말화하는 단계; 및 (c) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 분말을 용매로 추출한 후 이를 여과하고 감압농축하는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.
상기 (a) 단계에서의 세리포리아 락세라타 균사체의 액체 배양을 위한 배지는 설탕, 포도당, 전분, 수수분, 대맥분, 대두분, 황산마그네슘(MgSO4), 1인산칼륨(KH2PO4), 2인산칼륨(K2HPO4) 및 물을 포함할 수 있고, 수소이온농도가 pH 4.5 ~ 6.0인 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 배지는, 설탕 0.2 ~ 3 중량%, 포도당 0.2 ~ 3 중량%, 전분 0.2 ~ 4 중량%, 수수분 0.1 ~ 0.5 중량%, 대맥분 0.1 ~ 0.5 중량%, 대두분 0.2 ~ 3 중량%, 황산마그네슘(MgSO4) 0.05 ~ 0.1 중량%, 1인산칼륨(KH2PO4) 0.05 ~ 0.25 중량%, 2인산칼륨(K2HPO4) 0.05 ~ 0.25 중량% 및 잔량의 물을 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계에서의 액체 배양은 청색 LED 광원 하에서 수행될 수 있고, 구체적으로, 상기 액체 배양은 청색 LED 광원 하에서 이산화탄소의 농도를 1,000 ~ 2,000 ppm으로 유지하여 수행될 수 있다.
상기 액체 배양은 예를 들어, 20 ~ 28 ℃에서, 수소이온농도(pH) 4.5 ~ 6.0, 광원은 청색 LED, 조도는 0.1 ~ 0.8 LUX를 유지하며 공기는 0.5 ~ 2.0 kgf/㎠으로 주입하고 이산화탄소의 농도는 1,000 ~ 2,000 ppm으로 유지하면서 8 ~ 13일간 수행될 수 있다. 구체적으로, 20 ~ 25 ℃, pH 4.5 ~ 6.0, 0.5 ~ 2.0 kgf/㎠, 1,000 ~ 2,000 ppm의 이산화탄소 농도의 조건에서 5 ~ 15일간 수행될 수 있다. 상술한 바와 같은 조건으로 액체 배양할 경우, 생산되는 세포외다당체의 함량이 높으므로 바람직하다.
상기 (a) 단계에서의 모균주로는 PDA(Potato dextrose agar) 배지 상태로 1 ~ 5 ℃에 보관중인 우량 균주 1개를, 삼각플라스크에 PDB(Potato dextrose broth) 배지를 사용하여 진탕 배양기에서 약 25 ℃의 항온을 유지하며 7 ~ 9일간 배양과정을 거친 후 사용할 수 있다. 또한, 이와 같이 모균주를 배양한 후 배양액 또는 수득한 균사체를 접종원으로 이용할 수 있다. 이때, 접종원으로 투입될 균사체의 양은 배양할 용액의 양을 기준으로 0.5 %(w/v) 정도인 것이 바람직하다. 균사체량(%/100 ㎖, w/v)이 많다고 세포외다당체의 함량도 같이 높아지는 것이 아니므로 배지 조성은 균사체의 성장에 가장 양호한 영양 비율 및 환경조건이 아닌, 세포외다당체의 함량을 가장 높게 형성시키는 선택적 배양조건을 적용하는 것이 바람직하다.
상기 배양액은 균사체와 수용액으로 분리 정제할 수 있다. 상기 분리 정제를 위해 원심분리기로 균사체를 제거한 용액을 다중필터프레스(Multi-Sheet Filter Press)와 진동원심막분리기(PALLSEP)로 반복하여 정제한 후 1분간 자외선(UV)을 조사할 수 있다. 또한, 배양액은 산소를 제거한 후 밀봉하여 보관할 수 있으며, 이는 배양액 속에 균사가 존재할 경우 균사의 성장으로 유효성분의 함량에 변화를 가져올 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 제조된 균사체 배양액을 건조시켜 분말화할 수 있다. 상기 건조는 유효물질의 소멸을 방지하기 위해 40 ℃ 이하의 온도, 보다 구체적으로는 30 ℃ 이하의 온도에서 48 내지 96시간 동안 수행될 수 있다. 또한, (b) 단계의 건조는 증발온도를 상대적으로 높게 설정하는 진공건조기보다 진공동결건조기를 사용하는 것이 유효물질 함량 변화가 최소화되므로 바람직하다.
상기 (c) 단계에서는 (b) 단계에서 얻은 균사체 배양액 건조분말을 용매로 추출한 후, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 세포외다당체를 분리한다.
구체적으로, 균사체 배양액 건조분말 3 ~ 10 g에 증류수 100 ㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10 ~ 30 분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 상등액 부피의 2 ~ 3배에 해당하는 추출 용매를 첨가하고 1 ~ 5℃의 냉장고에 넣어 10 ~ 15시간 정치시킬 수 있다. 상기의 정치물에서 상등액만을 다시 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10 ~ 30분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수하여 조(crude) 세포외다당체를 제조할 수 있다. 상기 조 세포외다당체를 30 ℃ 이하에서 진공동결건조하여 세포외다당체를 수득할 수 있다.
상기 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에테르, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 보다 구체적으로는, 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아세톤 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 물 또는 50 내지 80 %(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있다.
상기 과잉 면역 억제용 조성물은 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 80 중량%, 구체적으로, 0.1 내지 50 중량%의 세포외다당체를 포함할 수 있으며, 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물은 상기 세포외다당체의 함량에 해당하는 양으로 적절히 포함될 수 있다. 그러나 보다 구체적으로, 세포외다당체, 이를 포함하는 배양액, 상기 배양액의 건조분말 또는 상기 배양액의 추출물의 유효 함량은 상기 조성물의 사용방법 및 목적에 따라 적절히 조절될 수 있다.
또한, 상기 과잉 면역 억제용 조성물은 면역 활성의 조절 및 면역질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 목적으로 약학적 조성물 또는 건강기능식품 등으로 사용될 수 있으며, 이때 사용량 및 사용 형태는 목적에 따라 적절히 조절할 수 있다.
상기 과잉 면역 억제용 조성물은 면역 과잉 억제 효과를 나타낼 수 있다. 상기 면역 과잉 억제 효과는 비장세포에서 비특이적 자극원으로 인한 림프구 과발현을 억제하여 면역 과잉을 억제하는 효과이다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 과잉 면역 억제용 조성물은 EPS 농도에 의존적으로 투여군의 비장세포에서 비특이적 자극원인 PMA에 의한 림프구 과발현을 EPS 농도에 의존적으로 억제하는 면역 과잉 억제 효과를 나타냈다.
본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체, 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 유효성분의 상술한 면역 과잉 억제 효과를 통해 다양한 자가면역질환에 대한 예방 또는 치료를 나타낸다.
상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증(scleroderma), 아토피 피부염, 건선(乾癬), 천식, 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 피부근염(dermatomyositis), 다발성근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염, 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 측두동맥염(temporal arteritis), 원형탈모증, 청포창, 아프타구내염, 크론병 및 베체트병으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으며, 구체적으로, 류마티스성 관절염, 아토피 피부염, 건선, 천식, 피부근염, 원형탈모증, 청포창, 아프타구내염 및 크론병으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있다.
비장세포의 림프구 과발현의 억제가 류마티스 관절염, 전신성 경피증, 아토피 피부염, 당뇨병, 원형탈모증, 건선, 청포창, 천식, 아프타구내염, 다발성근염, 다발성 경화증 또는 자가면역성 뇌척수염의 치료 또는 예방에 효과적이라는 것은 잘 알려져 있다(관련문헌: 대한민국 등록특허 제 10-1227819 호 참조).
상기 약학적 조성물은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체, 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학적 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여경로에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 유효성분인 세포외다당체를 기준으로 5 내지 1,000 mg/kg체중의 양, 구체적으로는 10 내지 600 mg/kg체중의 양을 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 우수한 면역 과잉 억제 효과를 제공할 뿐만 아니라 약물에 의한 독성 및 부작용도 거의 없어 면역질환의 치료 또는 예방의 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체, 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품은 과잉면역을 억제 또는 개선하여 면역 기능의 항상성을 유지하는 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있고, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민복합체, 건강보조식품 등일 수 있다.
이때, 상기 건강기능식품 중에 포함되는 본 발명에 따른 세포외다당체, 이를 포함하는 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물의 함량은, 통상적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 20 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 건강 음료 조성물의 경우, 건강 음료 조성물 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 구체적으로는 0.3 내지 1 g의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 식품은 본 발명의 세포외다당체, 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물과 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
제조예 1. 세리포리아 락세라타 균사체 배양액, 이의 건조분말, 추출물 및 세포외다당체(exopolysaccharide; 이하, "EPS"라 함)의 제조
1.1
세리포리아
락세라타
균사체 배양액의 제조
경북 상주시에서 채취한 참나무 변제부 속에서 분리한 세리포리아 락세라타 균사체를 계대배양을 통해 육성한 모균을 -80℃에 냉동보관하였다. 상기 냉동 보관중인 균주를 PDA(Potato dextrose agar) 배지(87 플라스틱 배양구; Difco, Becton Dickinson and Company)에서 2 ~ 3회 계대 후 균주(이하 "PDA 배양균주"라 함)를 4 ℃ 냉장고에 보관하여 사용하였다. 그리고 삼각플라스크에 PDB(Potato dextrose broth) 배지(Difco, Becton Dickinson and Company) 600 ㎖를 조성한 후, 여기에 PDA 배양 균주 1개를 넣고 25℃에서 8 일간 진탕배양하여, PDB 배양 균주를 수득하였다.
한편, 균주의 배양을 위해 설탕 1.5 중량%, 포도당 0.5 중량%, 감자전분 0.5 중량%, 수수분 0.25 중량%, 대맥분 0.25 중량%, 대두분 0.75 중량%, 황산마그네슘(MgSO4) 0.05 중량%, 1인산칼륨(KH2PO4) 0.05 중량%, 2인산칼륨(K2HPO4) 0.05 중량% 및 잔량의 물을 포함하는 액체 배양 배지를 800 ℓ 발효조에서 121 ℃에서, 공기를 1.5 kgf/㎠으로 주입하여 20 분간 멸균하였다. 이를, 23 ℃로 냉각한 상태에서 스타터로 상기 PDB 배양 균주 600 ㎖를 접종하고, 공기를 0.5 ~ 1.5 kgf/㎠으로 통기시키면서, 광원은 청색 LED, 조도는 0.5 LUX를 유지하며, 이산화탄소의 농도는 2,000 ppm으로 세리포리아 락세라타 균사체를 23℃의 항온에서 10일간 액체 배양함으로써 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하였다.
1.2
세리포리아
락세라타
배양액 건조분말의 제조
제조예 1.1에서 제조된 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 진공동결건조기를 이용하여 25 ℃에서 72 시간 동안 동결건조시켜 분말화함으로써 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 건조분말을 제조하였다.
1.3
세리포리아
락세라타
배양액 추출물의 제조
제조예 1.2에서 제조된 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 건조분말 5 g에 증류수 100 ㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 8,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하였다. 이의 상등액에 상등액 부피의 2 ~ 3배에 해당하는 에탄올을 첨가하고 4 ℃에서 12 시간 정치시켰다. 이후 정치물에서 상등액을 취해 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 추출물을 제조하였다.
1.4
세리포리아
락세라타
배양액으로부터
EPS
의 제조
제조예 1.3에서 제조된 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 추출물을 다시 8,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수하여 조(crude) EPS를 얻었다. 조 EPS를 진공동결건조기를 이용하여 25℃에서 72시간 진공동결건조시켜 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 EPS를 획득하였다.
실시예
1.
EPS
의 특성 평가
1.1 겔투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC )를 이용한 EPS의 분자량 측정
제조예 1에서 제조한 EPS를 0.1 M Na2SO4/0.05 M NaN3[빙초산(glacial acetic acid)으로 pH를 4로 조정] 용액에 1%(w/v)가 되도록 녹인 다음, 4,000 rpm으로 0.5 시간 동안 원심분리 후, 상층액만을 0.45 ㎛ 시린지 필터(syringe filter)로 여과하여 GPC로 분석하였다.
GPC 분석을 위한 조건은 검출기로 굴절지수를 이용하였으며, GPC 칼럼은 OHpak SB 805 HQ(Shodex, Japan)를 이용하여 이동상을 0.1 M Na2SO4/0.05 M NaN3[빙초산으로 pH를 4로 조정]을 사용하였으며, 이동상의 유속은 1.0 ㎖/분의 속도로 흘려주었다. 표준곡선은 각기 다른 분자량(130 kDa, 400 kDa, 770 kDa 또는 1200 kDa)을 가진 덱스트란(American Polymer Corporation, USA)을 이용하여 작성하였으며, 굴절지수(refractive index, RI) 측정기 Knauer K-2310(Germany)를 이용하여 EPS의 분자량을 측정하였다. 측정 조건을 정리하면 하기 표 1과 같다.
분자량의 측정 | |
GPC 시스템 | Knauer K-501 시스템 |
칼럼 | OHpak SB 805 HQ (Shodex, Japan) |
이동상 | 0.1 M Na2SO4 / 0.05 M NaN3 / pH4 |
유속 | 1.0 ㎖/분 |
측정기 | RI(Knauer K-2310) |
그 결과, 본 발명의 EPS의 분자량은 약 120 kDa으로 나타났다.
1.2
EPS
의 당 및 단백질 함량 측정
제조예 1에서 제조한 EPS를 2차 정제하고 단백질 가수분해 효소를 처리하여 당 및 단백질 함량을 측정하였다.
구체적으로, 1차 정제된 EPS(제조예 1에서 제조한 EPS)를 증류수에 녹이고 8,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액에 상등액 부피의 2 ~ 3배에 해당하는 에탄올을 첨가하고 4 ℃ 냉장고에 넣어 12 시간 정치시켰다. 이후 정치물에서 상등액만을 다시 8,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수하여 2차 정제된 EPS를 획득하였다. 상기 2차 정제된 EPS를 증류수에 용해하고, 단백질 가수분해 효소인 알칼레이즈(alcalase)를 0.5%(w/v)의 농도로 50℃에서 30분간 처리하였다.
당 함량은 페놀-황산법(phenol-sulfuric acid method)에 의해 측정하였다. 구체적으로, 농도별로 희석한 시료 1 ㎖에 80%(w/v) 페놀을 25 ㎕ 첨가한 후 황산 2.5 ㎖를 첨가하여 실온으로 냉각하였다. 이를 465 nm에서 흡광도를 측정하여 당 함량을 계산하였다.
또한, 단백질 함량은 BCA 방법(Smith PK et al., Analytical Biochemistry, 150(1):76-85, 1985)으로 측정되었고, 표준품으로 소혈청알부민을 사용하였다.
상술한 바와 같이 측정한 당 및 단백질 함량은 하기 표 2에 나타냈으며, EPS의 당 함량은 45 ~ 51 중량%이고 단백질 함량은 33 ~ 34 중량%인 것으로 나타났다.
수율(%) | 총 당 함량(%) | 총 단백질 함량(%) | |
EPS | 1.22±0.03 | 45.32±1.41 | 34.17±0.73 |
2차 정제된 EPS | 0.78±0.01 | 50.49±0.52 | 33.50±2.79 |
효소 처리된 EPS* | 0.24±0.06 | 51.39±1.32 | 34.61±1.51 |
*효소 처리: 알칼레이즈 0.5%, 50℃, 30분.
각 수치는 평균±SE(n≥3)임.
또한, EPS의 당 구성 분석 결과, EPS는 주로 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유하고 있는 것으로 나타났다.
실시예
2. 림프구 과다 증식억제 효과 확인
제조예 1의 EPS의 면역 과잉 억제 효과를 평가하기 위하여, 마우스 유래 비장세포를 비특이적 자극원인 포르볼 12-미리스테이트 13-아세트산(phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA)로 처리하고 여러 농도의 EPS를 처리한 후 과도한 림프구 증식을 억제하는지를 확인하였다.
구체적으로, 암컷 Balb/C 마우스로서 생후 8주 내외, 체중 25 g 내외의 것을 한국 효창 사이언스로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 상기 마우스를 경추탈구법으로 희생시킨 후, 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640 용액 상의 100 메쉬 세포 스트레이너(100 mesh cell strainer) 위에서 잘게 부수어 세포를 유리시켰다. 유리된 세포를 포함하는 현탁액을 Lymphoprep™이 담긴 용기에 조심히 넣고 15℃, 2,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 침전된 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포(2×106 cells/㎖)를 96 웰 마이크로 플레이트에 200 ㎕씩 분주하여 배양액 1 ㎖당 PMA 250 ng를 처리하여 비장세포의 림프구 증식을 유도하고, 제조예 1의 EPS를 배양액 1 ㎖당 0.05 ㎍, 0.15 ㎍, 0.5 ㎍, 1.5 ㎍ 또는 5 ㎍씩 적하하였다. 비교를 위해, 대조군의 경우에는 EPS를 처리하지 않았다. 이후 마이크로 플레이트를 5% CO2, 37℃ 및 충분한 습도가 유지되고 있는 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양세포의 증식능을 알아보기 위해, 마이크로 플레이트의 각 웰에서 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma, USA) 어세이(assay)를 수행하였다.
구체적으로, 배양세포에 MTT 용액을 최종 농도 0.1 mg/㎖로 처리하고 알루미늄 호일로 빛을 차단한 상태에서 4시간 동안 배양하여 포르마잔 결정(formazan crystal) 형성을 유도하였다. 상층액을 제거하고, 각 웰에 150 ㎕의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)를 처리하여 10분간 방치한 후 ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 비장세포의 림프구 증식능은 하기 식에 의해 계산하였다.
세포 생존률(%) = (시험군 흡광도/대조군 흡광도) × 100
상기 MTT 어세이는 3회 반복 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타냈다.
처리 농도 | 흡광도 (540 nm) | 흡광도 평균 및 편차 | 생존률(%) | |||
음성대조군(무처리) | 0 | 0.1842 | 0.1526 | 0.1390 | 0.159 ± 0.0008 | 100 |
PMA | 250 ng/㎖ | 0.7287 | 0.6074 | 0.6034 | 0.647 ± 0.071 | 406.9 |
제조예 1의 EPS (㎍/㎖) |
0.05 | 0.7075 | 0.5181 | 0.6831 | 0.636 ± 0.103 | 400.0 |
0.15 | 0.5581 | 0.6609 | 0.5147 | 0.578 ± 0.075 | 363.5 | |
0.5 | 0.4818 | 0.5196 | 0.5127 | 0.505 ± 0.020 | 317.6 | |
1.5 | 0.3680 | 0.4890 | 0.4321 | 0.430 ± 0.061 | 270.4 | |
5 | 0.3013 | 0.4054 | 0.4779 | 0.395 ± 0.089 | 248.4 |
표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 EPS는 비장세포에서 비특이적 자극원인 PMA의 처리에 의해 증가된 림프구 증식을 농도 의존적 및 유의적으로 억제하였다. 이는 과도한 림프구 증가로 인한 면역 과잉을 억제하는 효과로서, 이 결과는 상기 EPS가 자가면역질환의 예방 및 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 보여준다.
Claims (19)
- 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말, 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 과잉 면역 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 세포외다당체는 40 ~ 60 중량%의 당 및 30 ~ 40 중량%의 단백질을 포함하고 100 ~ 150 kDa의 분자량을 갖는, 과잉 면역 억제용 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 세포외다당체는 43 ~ 47 중량%의 당 및 33 ~ 36 중량%의 단백질을 포함하고 115 ~ 125 kDa의 분자량을 갖는, 과잉 면역 억제용 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 당은 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유하는, 과잉 면역 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 세포외다당체가,
(a) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하는 단계;
(b) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 건조시켜 분말화하는 단계; 및
(c) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 분말을 용매로 추출한 후 이를 여과하고 감압 농축하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의하여 제조된, 과잉 면역 억제용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 액체 배양을 위한 배지가 설탕, 포도당, 전분, 수수분, 대맥분, 대두분, 황산마그네슘(MgSO4), 1인산칼륨(KH2PO4), 2인산칼륨(K2HPO4) 및 물을 포함하고, 수소이온농도(pH)가 4.5 ~ 6.0인, 과잉 면역 억제용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 액체 배양은 청색 LED 광원 하에서 수행되고, 이산화탄소의 농도를 1,000 ~ 2,000 ppm으로 유지하여 수행되는, 과잉 면역 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 세포외다당체는 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 80 중량%의 함량으로 포함되는, 과잉 면역 억제용 조성물.
- 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말, 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증(scleroderma), 아토피 피부염, 건선(乾癬), 천식, 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 피부근염(dermatomyositis), 다발성근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염, 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 측두동맥염(temporal arteritis), 원형탈모증, 청포창, 아프타구내염, 크론병 및 베체트병으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 질환인, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 세포외다당체는 40 ~ 60 중량%의 당 및 30 ~ 40 중량%의 단백질을 포함하고 100 ~ 150 kDa의 분자량을 갖는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 세포외다당체는 43 ~ 47 중량%의 당 및 33 ~ 36 중량%의 단백질을 포함하고 115 ~ 125 kDa의 분자량을 갖는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 당은 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 세포외다당체가,
(a) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하는 단계;
(b) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 건조시켜 분말화하는 단계; 및
(c) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 분말을 용매로 추출한 후 이를 여과하고 감압 농축하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의하여 제조된, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 액체 배양을 위한 배지가 설탕, 포도당, 전분, 수수분, 대맥분, 대두분, 황산마그네슘(MgSO4), 1인산칼륨(KH2PO4), 2인산칼륨(K2HPO4) 및 물을 포함하고, 수소이온농도(pH)가 4.5 ~ 6.0인, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 액체 배양은 청색 LED 광원 하에서 수행되고, 이산화탄소의 농도를 1,000 ~ 2,000 ppm으로 유지하여 수행되는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말, 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품.
- 제17항에 있어서,
상기 건강기능식품이 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태인, 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품.
- 제17항에 있어서,
상기 건강기능식품이 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민복합체 또는 건강보조식품인, 과잉 면역 억제 기능 개선용 건강기능식품.
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