KR20170015554A

KR20170015554A - 알로에 다당류의 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20170015554A
Application number: KR1020177002608A
Authority: KR
Inventors: 이반 이 대노프
Original assignee: 베스포크 바이오사이언스, 엘엘씨.
Priority date: 2011-01-06
Filing date: 2011-01-06
Publication date: 2017-02-08
Also published as: AU2017202499B2; KR20180122031A; MX358484B; AU2017202499A1; KR20170038085A; EP2661274B1; ES2742220T3; WO2012094010A1; EP2661274A1; RU2013127633A; CA2822300A1; RU2587784C2; AU2019200361A1; AU2019200361B2; MY194961A; CN108503723A; BR112013017501A2; KR20180120799A; IL227093B; MX2013007561A

Abstract

본 발명은 냉동-건조된 알로에 분말로부터 폴리만난 추출물을 제조하기 위한 방법을 기술한다. 본 발명의 폴리만난 추출물은 하나 이상의 암, 백혈병 및 림프종, 전립선암, 유방암, 및 대장암, 면역 질환, 면역 관련 신생물, 후천성 면역 결핍증, C형 간염의 치료를 위한 멸균의 주사가능한 제형을 제형화하기 위해 추가적으로 사용된다.

Description

알로에 다당류의 조성물 및 방법{compositions and methods of aloe polysaccharides}

본 발명은 일반적으로 알로에 다당류의 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알로에 다당류의 조성물 및 면역조절제로서 및 다양한 종류의 암의 치료를 위한 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 본 발명의 배경은 알로에 베라 다당류의 조성물, 제조 방법, 및 치료적 용도에 관하여 기술하고 있다.

Pasco 등(2007)에 허여된 미국 특허 제7,196,072호는 알로에 베라로부터 분리된 강한 면역자극성 활성을 갖는 복합체, 수용성 다당류 분획을 기술한다. 이 다당류 분획은 그의 주요 구성성분으로서 글루코스, 갈락토스, 만노오스 및 아라비노스를 갖는 2 백만 달톤 이상의 겉보기 분자량을 갖는다. 이 발명은 본 다당류 분획을 선택적으로 허용가능한 약학적 담체 및/또는 부형제와 함께 함유하는 약학적 조성물을 추가로 기술한다. 이들 약학적 조성물은 효과적인 양의 조성물을 대상에게 투여함으로써 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 면역자극을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

Avalos 및 Danhof(2000)에 허여된 미국 특허 제6,083,508호는 알로에 잎으로부터 제거된 내부 띠모양섬유속(fillet)을 갖는 알로에 잎을 발라낸 후 수득된 잎 잔여물만으로부터 알로에 생성물을 형성하기 위한 방법을 개시한다. '508 특허에 따르면, 잔여물은 분쇄에 의해 슬러리(slurry)로 형성되고, 알로에 생성물은 슬러리로부터 생성된다. 그외에 알로에 생성물을 제조하는 단계는 알로에 잎을 이를 발라내기 전에 세척하고, 형성된 슬러리를 액체 및 고체로 분리시키고, 추가로 알로에 생성물을 형성하기 전에 분리된 액체를 처리하여 완하제(laxatives)를 제거하는 단계를 포함한다. 또한, 상기의 단계의 모두를 포함하는 방법은 또한 액체를 형성하기 위해 수행될 수 있다.

미국 특허출원 공개 제2006/0084629호(Needleman and Needleman, 2006)는 알로에 베라 및 마이타케(Maitake) TD로부터 분리된 2가지의 특성화된 고분자량-장쇄 분획의 조합을 개시하며, 이는 신체의 천연 면역 반응을 활성화시키는 장쇄-고 분자량 다당류를 포함하는 면역 시스템 활성을 자극하여, 대식 세포, T-세포, B-세포, 자연 살해 세포, 사이토카인 및 항체의 생산 증가를 유발한다. 이들 장쇄 다당류는 다른 활성 성분과 함께 적절한 면역 시스템 지원을 제공할 수 있으므로, 암, 심장병 및 노화와 같은 쇄약성 질환을 예방한다.

본 발명은 알로에 다당류 조성물 및 면역조절제로서, 그리고 백혈병 및 림프종, 전립선암, 유방암, 및 대장암으로부터 선택되는 다양한 종류의 암, 면역 질환, 특히 면역 관련 신생물의 치료를 위한 상기 조성물의 용도를 기술한다.

본 발명은 하기 단계들을 포함하는 폴리만난(polymannan) 추출물의 미세 분말을 제조하기 위한 방법을 제공한다: (i) 지정된 양의 냉동-건조된(freeze-dried) 알로에 분말을 칭량하며, 여기서 상기 양이 수분 함량에 대하여 보정되는 단계, (ii) 탈이온수에 동결-건조된 분말을 용해시켜 용액을 형성하는 단계, (iii) 유기 용매를 용액에 첨가하여 제1 혼합물을 형성하며, 여기서 탈이온수에 대한 유기 용매의 비율은 적어도 2.5:1인 단계, (iv) 제1 혼합물을 적어도 8시간 동안 정치시키는 단계, (v) 지정된 부피의 상청액을 제1 혼합물로부터 제거하고(withdraw) 과량 부피의 상청액 용액을 첨가하여 제2 혼합물을 형성하는 단계, (vi) 제2 혼합물을 원심분리하는 단계, (vii) 제2 혼합물 내의 침전물의 존재를 관찰하는 단계, (vii) 제2 혼합물 내에 임의의 침전물이 관찰되는 경우, 추가량의 유기 용매를 제1 혼합물에 첨가하는 단계, (viii) 사이포닝(siphoning)에 의해 제1 혼합물의 상청액을 따라내며, 여기서 따라내기가 제2 혼합물 내에서 침전물이 관찰되지 않은 경우에만 행해지는 단계, (ix) 진공하에 여과지 및 흡인 깔대기를 사용하여 제1 혼합물로부터 침전물을 여과하는 단계, (x) 스크래핑(scraping)에 의해 흡인 깔대기로부터 폴리만난 추출물의 분말을 회수하는 단계, (xi) 폴리만난 추출물의 분말을 적어도 8시간 동안 냉동기 내의 뚜껑이 막힌 동결건조 플라스크 속에 놓아두는 단계, (xii) 동결 건조기 내에서 폴리만난 추출물의 냉동 분말을 동결건조시키는 단계, 및 (xiii) 분쇄기에서 폴리만난 추출물의 동결건조된 분말을 극 미세(very fine) 질감으로 분쇄하는 단계.

일 양태에서, 본 방법은 용기 내의 폴리만난 추출물의 미세 분말을 칭량, 표지 및 저장하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 구현예에 기술된 바와 같은 냉동-건조된 알로에 분말은 알로에 베라, 알로에 아르보레슨스 (aloe arborescens ), 알로에 아리스타타 (Aloe aristata ), 알로에 디코토마 (Aloe dichotoma ), 알로에 니예리엔시스 (Aloe nyeriensis ), 알로에 베리에게이트 (Aloe variegate), 알로에 바르바덴시스 (Aloe barbadensis ) 및 알로에 윌디(Aloe wildii)로 구성된 군으로부터 선택된 알로에 종으로부터 유래된다. 본 발명에서 사용된 냉동-건조된 알로에 분말은 알로에 다당류를 포함하며, 여기서 알로에 다당류는 하나 이상의 작은 사슬, 중간 사슬, 큰 사슬, 아주 큰 사슬 다당류, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정한 양태에서, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올 및 프로판올로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 알로에 다당류는 글루코스, 만노오스, 아라비노스, 및 갈락토스로 구성된 군으로부터 선택되는 단당(simple sugar)을 포함하고 11,500 달톤 내지 10,000,000 달톤 이상 범위의 분자량을 갖는다.

다른 양태에서, 냉동-건조된 알로에 분말은 적어도 25%의 알로에 다당류를 갖는다. 또 다른 양태에서, 냉동-건조된 알로에 분말은 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 95% 알로에 다당류를 갖는다. 본 발명의 방법에서 기술된 바와 같이 냉동 건조된 알로에 분말은 66,000 달톤의 분자량을 갖는 적어도 14%의 알로에 다당류, 480,000 달톤의 분자량을 갖는 적어도 9%의 알로에 다당류, 1,000,000 달톤의 분자량을 갖는 적어도 3.5%의 알로에 다당류, 2,000,000 달톤의 분자량을 갖는 적어도 2.4%의 알로에 다당류를 포함한다.

알로에 다당류 조성물과 관련된 방법의 특정한 양태에서, 냉동 건조된 알로에 분말 내에서 약 1.32%-6.36%의 알로에 다당류는 2,000,000 달톤의 분자량을 갖고, 2.55%-3.89%은 1,000,000의 분자량을 갖고, 63.85%-73.36%의 알로에 다당류는 480,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일 양태에서, 냉동 건조된 알로에 분말은 글루코스, 유기산, 락트산, 말산, 시트르산 및 아스파르트산으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 잔여 소분자량 종을 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 하나 이상의 잔여 소분자량 종은 14% 내지 24%의 범위의 양으로 존재한다. 또 다른 양태에서, 폴리만난 추출물의 미세 분말은 백혈병, 림프종, 전립선암, 유방암 및 대장암으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 악성종양의 치료, 및 하나 이상의 면역 장애의 치료에서 사용하기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다.

다른 구현예에서, 본 발명은 탈이온수에 용해된 극 미세 폴리만난 추출물의 지정된 양 및 하나 이상의 약학적 보존제를 포함하는 폴리만난 추출물의 멸균의 주사가능한 제형을 개시한다. 이전 기술된 제형에서 사용될 수 있는 하나 이상의 약학적 보존제는 파라벤, 벤조산 및 이들의 염, 수은, 4급 암모늄 염, 벤질 알코올 및 다른 관련 알코올, 및 페놀로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정한 양태에서, 보존제는 벤질 알코올이다. 일 양태에서, 폴리만난 추출물은 알로에 다당류를 포함하며, 여기서 알로에 다당류는 하나 이상의 작은 사슬, 중간 사슬, 큰 사슬, 아주 큰 사슬 다당류, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 양태에서, 알로에 다당류는 글루코스, 만노오스, 아라비노스 및 갈락토스로 구성된 군으로부터 선택되는 단당을 추가로 포함한다.

다른 특정한 양태에서, 알로에 다당류는 11,500 달톤 내지 10,000,000 달톤 이상의 범위인 분자량을 갖고, 폴리만난 추출물은 적어도 25%의 알로에 다당류를 가지며, 여기서 폴리만난 추출물은 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 95%의 알로에 다당류를 갖는다. 관련 양태에서, 폴리만난 추출물은 66,000 달톤의 분자량을 갖는 적어도 14%의 알로에 다당류, 480,000 달톤의 분자량을 갖는 적어도 9%의 알로에 다당류, 1,000,000 달톤의 분자량을 갖는 적어도 3.5%의 알로에 다당류, 2,000,000 달톤의 분자량을 갖는 적어도 2.4%의 알로에 다당류를 포함한다. 본 발명의 조성물은 백혈병 및 림프종, 전립선암, 유방암 및 대장암으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 암의 치료, 면역조절, 면역자극을 위해, 또는 약화된 면역 시스템 또는 면역 질환을 가진 대상의 치료를 위해 사용된다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 자연 살해(NK) 세포에 있어서 75-80% 증가를 야기한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 백혈병 및 림프종, 전립선암, 유방암, 및 대장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암에 대한 치료를 기술한다: 하나 이상의 암에 대하여 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계 및 멸균의 주사가능한 폴리만난 추출물 제형, 및 하나 이상의 약학적 보존제를 하나 이상의 암을 치료하기에 충분한 용량으로 주 2회 내지 3회 주사하며, 여기서 멸균의 주사가능한 폴리만난 추출물 제형은 탈이온수에 용해된 지정된 양의 극 미세 폴리만난 추출물을 포함하는 것인 단계. 방법은 다음의 단계들을 추가로 포함한다: 하나 이상의 지정된 간격에서 대상으로부터 혈액 샘플을 취하는 단계; 및 혈액 내의 카스파제 3 단백질의 수준을 측정하고 주사하기 이전에 수득된 수준과 비교하며, 여기서 카스파제 3의 증가된 수준은 하나 이상의 암 세포의 아폽토시스의 증가된 수준과 직접적으로 관련되는 것인 단계.

일 양태에서, 멸균의 주사가능한 폴리만난 추출물 제형의 용량은 대상의 체중, 나이, 인종 및 성별에 의존한다. 다른 양태에서, 폴리만난 추출물은 알로에 다당류를 포함하며, 여기서 알로에 다당류는 하나 이상의 작은 사슬, 중간 사슬, 큰 사슬, 아주 큰 사슬 다당류, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 양태에서, 알로에 다당류는 11,500 달톤 내지 10,000,000 달톤 이상 범위의 분자량을 갖는다. 본 발명의 방법에 기술된 바와 같은 폴리만난 추출물은 적어도 25%의 알로에 다당류를 갖는다. 본 발명의 방법의 폴리만난 추출물은 하나 이상의 자연 살해(NK) 세포에 있어서 75-80% 증가를 야기한다.

일 구현예에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 약화된 면역 시스템 또는 면역 질환을 가진 대상에서의 면역조절 또는 면역자극 방법을 개시한다: (i) 약화된 면역 시스템 또는 면역 질환을 가진 대상 및 면역조절 또는 면역자극을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계, (ii) 지정된 용량의 멸균의 주사가능한 폴리만난 추출물 제형을 정맥 투여하며, 여기서 멸균의 주사가능한 폴리만난 추출물 제형이 지정된 양의 탈이온수에 용해된 극 미세 폴리만난 추출물, 및 하나 이상의 약학적 보존제를 포함하고, 여기서 멸균의 주사가능한 폴리만난 추출물 제형의 용량은 대상의 체중, 나이, 인종 및 성별에 의존하는 단계, (iii) 하나 이상의 지정된 간격에서 대상으로부터 혈액 샘플을 취하는 단계; 및 혈액 내의 종양 괴사 인자-알파(TNFα)의 수준을 측정하고, 주사하기 전에 수득된 수준과 비교하며, 여기서 TNFα에서의 증가된 수준이 면역조절 또는 면역자극을 표시하는 단계. 특정한 양태에서, 면역 질환은 면역 관련 종양(neoplasm)이다. 일 양태에서, 폴리만난 추출물은 알로에 다당류를 포함하며, 여기서 알로에 다당류는 하나 이상의 작은 사슬, 중간 사슬, 큰 사슬, 아주 큰 사슬 다당류, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 다른 양태에서, 폴리만난 추출물은 하나 이상의 자연 살해(NK) 세포에 있어서 75-80% 증가를 야기한다. 또 다른 양태에서, 폴리만난 추출물은 적어도 25%의 알로에 다당류를 갖는다.

본 발명은 냉동-건조된 알로에 분말로부터 폴리만난 추출물을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리만난 추출물은 하나 이상의 암, 백혈병 및 림프종, 전립선암, 유방암, 및 대장암, 면역 질환, 면역 관련 신생물, 후천성 면역 결핍증, C형 간염의 치료를 위한 멸균의 주사가능한 제형을 제형화하기 위해 추가적으로 사용된다.

본 발명의 양상 및 장점의 더욱 완전한 이해를 위해, 이하에서는 하기에 첨부되는 도면과 함께 발명의 상세한 설명에 대해 언급된다:
도 1은 상이한 글루코스 및 만노오스 소단위의 정체 시간을 보여주는 알로에 다당류의 크기-배제 크로마토그램을 보여준다.
도 2는 상이한 글루코스 및 만노오스 소단위에 상응하는 피크를 보여주는 알로에 다당류의 크기-배제 크로마토그램을 보여준다.
도 3은 본 발명의 폴리만난 추출물의 양성자-핵 자기 공명 프로파일이다.
도 4a는 메탄올 침전된 알로에 다당류 농축물에서 각각의 다당류 분자 그룹 내의 다당류의 양을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.
도 4b는 메탄올 침전된 알로에 다당류 농축물의 양성자-핵 자기 공명 프로파일이다.
도 5a는 에탄올 침전된 알로에 다당류 농축물에서 각각의 다당류 분자 그룹 내의 다당류의 양을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.
도 5b는 에탄올 침전된 알로에 다당류 농축물의 양성자-핵 자기 공명 프로파일이다.
도 6a는 이소프로필 알코올 침전된 알로에 다당류 농축물에서 각각의 다당류 분자 그룹 내의 다당류의 양을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.
도 6b는 이소프로필 알코올 침전된 알로에 다당류 농축물의 양성자-핵 자기 공명 프로파일이다.
도 7a는 프로판올 침전된 알로에 다당류 농축물에서 각각의 다당류 분자 그룹 내의 다당류의 양을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.
도 7b는 프로판올 침전된 알로에 다당류 농축물의 양성자-핵 자기 공명 프로파일이다.

본 발명의 다양한 구현예를 수행하고 활용함이 하기에 상세하게 논의되어 있지만, 본 발명이 특정한 상황의 넓은 범위에서 구현될 수 있는 수많은 적용가능한 본 발명의 개념을 제공한다는 점이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 특정한 구현예는 단지 본 발명을 수행하고 활용하기 위한 구체적인 방식을 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의된다. 본 명세서에서 정의된 용어는 본 발명이 관련된 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. "한(a)", "한(an)" 및 "그(the)와 같은 용어는 단지 단일의 본질을 지칭하는 것이 아니라, 구체적인 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 용어정의는 본 발명의 구체적인 구현예를 기술하기 위해 사용되지만, 이들 사용이 특허청구범위에서 서술된 바와 같은 것을 제외하고, 본 발명의 범위를 정하는 것은 아니다.

본 발명은 폴리만난 추출물의 제조 방법 및 면역 자극성 화합물로서의 상기 추출물의 주사 형태로의 사용을 기술한다. 면역 자극은 인간 기원의 대식세포/단핵구를 사용하여 평가되고 세포 유형은 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 분비에 대해 평가된다.

알로에 다당류는 일반적으로 10,000 달톤 사슬 길이를 갖는 글루코스 및 만노오스 단당으로 대부분 구성되고 10,000,000 달톤의 분자량을 갖는 분자들로 여겨진다. 만노오스 함량이 더 높고 사슬 길이가 더 길수록 다당류에 의해 발현된 면역조절성 활성이 더 크다. 이들 알로에 다당류를 포함하는 상이한 길이의, 비분지 사슬을 하기 표 1에 나열한다.

표 1: 알로에 다당류 조성물 및 약리 작용.

100,000 달톤 또는 그 이상의 분자량을 가진 알로에 다당류는 하기 표 2에 열거된다.

표 2: 100,000 또는 그 이상의 분자량을 갖는 알로에 다당류의 조성물 및 분자량

폴리만난 추출물에 대한 전구 물질은 "알로에 잎 처리 방법(Method of Processing Aloe Leaves)"으로 표제된 본 발명자들의 선행 특허(미국 특허 제6,083,508호 - Avalos 및 Danhof, 2000)에 기술되어 있다. 폴리만난 추출물 전구 물질의 분석의 증명서는 하기 표 3에 나타낸다.

도 1은 다양한 크기의 글루코스 및 만노오스 소단위의 정체 시간을 보여주는 알로에 다당류 제제(preparation)의 크기-배제 크로마토그램이다. 도 2는 100 내지 10,000,000 달톤 범위의 분자량이 확인된 알로에 다당류 제제의 크기-배제 크로마토그램이다. 도 3은 본 발명의 폴리만난 추출물의 양성자-핵 자기 공명 프로파일이다. 도 3은 다음 사항을 보여준다: (i) 표준 보존제인 소듐 벤조에이트 및 포타슘 소르베이트의 부재, (ii) 더 작은 모노헥소스의 존재, (iii) 생(raw) 알로에 물질을 처리하는데 적용되었던 전체 잎 방법론을 나타내는 이소시트르산의 피크, (iv) 알로에 베라에 대한 일차 마커인 말산 피크의 존재, (v) 큰 다당류 종의 존재를 확정하는 프로파일의 다당류 부분에서 알로에라이드/아세만난 피크의 존재, 및 (vi) 부분적으로 아세틸화된 다당류 글루코스만난의 존재를 확정하는 아세틸기의 존재.

폴리만난 추출 전에 알로에 제제의 크기 배제 크로마토그래피(SEC):

실험: HPLC 시스템은 Waters 410 차등 굴절계와 쌍을 이룬 Hitachi L-7100 펌프 및 7250 오토샘플러이다. SEC는 70℃에서 컬럼 가열기 내에서 작동된 Tosoh Biosep G6000 PWXL TSK 겔 30 cm x 7.8 mm이다. 분자량 표준은 시그마(Sigma)로부터 입수하였다 - 2,000,000 달톤, 1,000,000 달톤, 480,000 달톤, 66,000 달톤 및180 달톤(글루코스). 이동상은 0.70 mL/분의 이동 속도를 가진 탈이온수이다. 주입 부피는 10 uL이다. SEC 방법은 Pugh 등의 문헌(2001)에 기술되어 있다.¹

표 3: 폴리만난 추출물 전구 물질의 분석의 증명서

표 4: 폴리만난 추출 전에 알로에 제제에 대한 SEC 결과

알로에 침전물 평가 연구: 25 ml의 COATS 농축된 알로에를 200 ml 비커 내로 파이펫팅하고 125 ml의 다양한 다당류 침전물 액체를 비커에 첨가한 후, 완전히 교반하였다. 무부하(tared) 탈수소 여과지를 통해 여과시켜 침전된 다당류를 수집하고, 여과 후 건조 오븐에 밤새 놓아두었다. 다음날 아침 침전된 다당류의 건조 중량을 측정하였다. 발명자들은 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올 및 프로판올을 포함하는 4가지 알코올성 침전물을 연구하였다. 2,000,000 달톤 이상, 1,000,000 달톤 이상, 480,000 달톤 이상, 66,000 달톤 이상, 및 매우 작은 소분자 종을 함유하는 잔존 분획, 예컨대 180의 M.W.를 갖는 글루코스를 포함하는 각각의 다당류 분자 그룹에서, 다당류 양의 측정과 함께 기록된 모든 분자 종의 다양한 분량을 측정하는 HPLC 절차를 통해 분말을 통과시켰다(HPLC 데이터는 표 6-9에 나타낸다). 4가지 침전물인 메탄올, 알코올, 이소프로필 알코올 및 프로판올에 상응하는 HPLC 크로마토그램은 각각 도 4a, 5a, 6a 및 7a에 나타낸다. 침전물의 양성자 핵 자기 공명 프로파일을 또한 수득하였고 도 4b, 5b, 6b 및 7b에 나타낸다. 수집된 데이터는 하기 표 5에 나타낸다.

표 5: 알로에 침전물 평가 연구.

표 6: 메탄올 침전된 알로에 다당류 농축물에서 각각의 다당류 분자 그룹내의 다당류의 양을 보여주는 HPLC 데이터.

표 7: 에탄올 침전된 알로에 다당류 농축물에서 각각의 다당류 그룹 내의 다당류 양을 보여주는 HPLC 데이터.

표 8: 이소프로필 알코올 침전된 알로에 다당류 농축물에서 각각의 다당류 분자 그룹 내의 다당류의 양을 보여주는 HPLC 데이터.

표 9: 프로판올 침전된 알로에 다당류 농축물에서 각각의 다당류 분자 그룹 내의 다당류의 양을 보여주는 HPLC 데이터

폴리만난 추출물을 침전에 의해 제조하였다. 상기 기술된 냉동 건조된 알로에 분말을 수분 함량에 대하여 적절하게 보정한 후 칭량하였다. 예를 들면, 수분 함량이 3.7%이고, 80 gm을 필요로 하는 경우, 본 발명자들은 82.96 gm로 칭량하였다. (80 gm + (3.7% x 80) gm). 칭량한 알로에 분말을 스테인리스 스틸 침전 용기 내에서 1 갤론의 탈이온수(D.I)에 완전히 용해시켰다. 2.5 갤론의 95% 에탄올을 첨가하고 교반하여 완전히 혼합되도록 하였다. 용기를 스테일리스 스틸 뚜껑으로 덮고 혼합물을 밤새 정치시켰다.

다음날 2 ml의 맑은 상청액을 취하여 5 mL의 95% 에탄올을 첨가하고 샘플을 20분 동안 3000 rpm으로 원심분리하였다. 샘플을 침전에 대해 검사하였으며, 침전물이 검출되지 않은 경우, 침전이 완전히 완료된 것으로 고려하였다. 임의의 유의미한 정도의 침전이 관찰되는 경우, 진행하기 전에 추가의 95% 에탄올을 침전 용기에 첨가하였다. 침전 용기 내에 맑은 상청액 유액을 용기 바닥의 침전물을 휘젓지 않으면서 사이포닝에 의해 따라냈다. 바닥의 백색 침전물을 흡인 깔대기(Whatman No. 42®) 정량용 무회분 여과지를 사용하여 분리하였다. 침전된 물질을 600 ml 버티스(Virtis) 동결건조 플라스크 속으로 스크랩핑(scraping)하고, 플라스크 한쪽에 전체에 분포시켜 넓게 노출된 표면적을 갖는 박층을 형성함으로써 제거하였다. 동결건조 플라스크를 쉘 냉동기(shell-freezer) 속에 밤새 놓아두었다. 다음날 이의 냉동된 내용물과 함께 냉각된 동결건조 플라스크를 -90℃ 및 1/3 대기에서 작동되는 동결건조기 상에 24시간 동안 놓아두었다. 동결건조기를 끄고, 분말이 균일하게 분쇄된 미세 분말로 감소될 때까지 동결건조된 분말을 작은 분말 분쇄기 속에 놓아두었다. 분쇄된 분말을 칭량하고, 플라스틱인 작은 용기에 넣은 후, 이 용기를 냉동고에 보관하였다.

폴리만난 추출물의 주사가능한 용액의 제조: 상기 기술된 바와 같이 제조한 폴리만난 추출물 분말(PME)은, 수분 함량에 대해 보정하고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같은 적어도 2%의 알로에라이드 함량을 가진 다음에 칭량하였다(1.5 gm). 125 ml의 따뜻한 D.I 물에 1 ml의 농축된 HCl을 첨가하고, 교반한 후, 지속적인 교반을 하면서 PME 분말을 천천히 첨가하였다. 교반은 모든 PME 분말이 용해되고 용액이 맑고 투명해질 때까지 지속하였고, 추가적인 양의 농축된 HCl을 첨가하여 1.6 내지 1.7의 pH를 수득하였다 (pH 미터를 사용하여 계속적으로 측정됨). 추가적인 D.I 물을 첨가하여 부피를 150 ml로 조정한 후, pH를 모니터링하여 pH가 1.6-1.7이 되도록 하였다. 그 후, PME 용액을 0.45㎛의 기공 크기를 가진 Corning® 150 ml 여과기 시스템 플라스크로 부었다. 플라스크 시스템을 냉장고 속에 놓아두고 여과물을 0.22㎛의 기공 크기를 가진 Corning® 150 ml 여과기 시스템 플라스크로 이동시켜, 밤새 냉장고 속에 놓아두었다. 멸균 조건 하에서, 여과기 시스템의 여과기 상부를 제거하고 병을 멸균 캡으로 밀봉하였다. 그 후, 병을 조제 실험실(compounding lab)로 옮기고, 멸균 후드 하에서 0.9% 벤질 알코올을 보존제로서 첨가하고(최종 생성물이 복합-용량 용도이기 때문임), 용액을 멸균의 10 mL 유리 바이알 속에 넣고, 복합용량(multidosage) 마개로 밀봉하였다. 바이알에 배치 넘버, 대조군 넘버, 제조 일자, 6개월의 유효기간과 함께 의사 및 환자의 이름을 표지하였다.

PME 면역조절성 활성 평가: 면역 자극성 활성은 메릴랜드 소재의 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 입수한 인간 기원의 대식세포/단핵구를 사용하여 평가하였다. 세포 유형을 TNFα의 분비에 대해 평가하였다. 표준 세포 조건 하에서, 소량의 최종 PME 생성물을 배양물 내로 도입시켰다. 샘플을 6, 12 및 24 시간째에 취하여 TNFα 수준에 대해 평가하였다. TNFα의 특이적 양은 상이한 세포 배치에서의 가변성으로 인해 사용하지 않았다. 임상적 세팅에서, 면역조절성 반응은 전체 백혈구 계수, 상이한 대식세포/단핵구 계수, 백혈구(white cell) 상의 표면 만노오스 수용체의 숫자, 만노오스-결합 캐리어 단백질의 양 등과 같은 혈액학적 인자의 변화에 기인하여 다양할 것으로 예상된다.

백혈구(white blood cell) 프로파일은 혈류에 지속적으로 진입하고 떠나는 세포에 따라 다양하다. PME에 대한 세포성 만노오스 수용체의 친화성은 만노오스 결합 단백질의 것을 훨씬 초과한다. 신규의 대식세포/단핵구가 혈류로 진입하기 때문에, PME는 순환하는 만노오스-결합 단백질로부터 신규 세포로 이동하게 된다. 대식세포/단핵구 만노오스-결합 단백질에의 PME 결합은 세포전달자 어레이의 방출을 유도한다. TNF-α IL-1β INF-γ, IL-2, 및 IL-6를 포함하는 세포전달자(cytocommunicator)는 암 환자에서 이의 종양 검출 기능에 실패하였던 면역 시스템의 손상된 감시 기능을 정상으로 복구하므로, 악성 세포를 동정 및 제거하는 환자의 면역 시스템을 가능하게 한다.

1,000,000, 300,000, 100,000, 50,000 및 25,000의 분자량을 갖는 폴리만난 추출물 내의 알로에 다당류는 모두 카스파제 활성을 나타냈다. 카스파제 3이 종양 세포 아폽토시스의 매개자이기 때문에, 이러한 카스파제 3, 카스파제 9 및 사이토크롬-C 활성은 본 발명의 조성물에 의한 악성 종양의 치료의 핵심이다. 개시자 (정점인) 카스파제 3 및 효과기 (실행자) 카스파제 3 뿐만 아니라 사이토크롬-C의 면역 조절 활성은 남아 있는 것으로 증명되었고, 종양 세포 아폽토시스의 매개자 시스템일 것으로 고려된다.

본 발명자들은 다양한 유형의 암을 가진 104명의 환자를 대상으로 본 명세서에 기술된 조성물을 시험하였다. 백혈병 및 림프종은 본 발명의 폴리만난 추출물에 대하여 가장 반응성이 있었다(> 98%). 전립선암, 유방암 및 대장암은 또한 본 발명의 폴리만난 추출물에 반응성이 있었다. 시험을 위해, 폴리만난 추출물을 주사로서 투여하였다. 10 mg의 폴리만난 추출물을 주사를 위해 멸균수 내에서 재구성하여 최종 농도 ~ 10 mg/mL을 수득하였다. 이를 일주일에 2 내지 3회 주사하였다. 그후, 환자로부터의 혈청 샘플을 규칙적인 간격으로 취하고 카스파제 3 활성에 대하여 모니터링하였다.

본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 임의의 방법, 키트, 시약, 또는 본 발명의 조성물에 대하여 수행될 수 있고, 그 반대의 경우도 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에 기술된 특정 구현예는 예시적으로 나타내는 것이지 본 발명을 제한하는 것으로 이해되지 않을 것이다. 본 발명의 기본적인 양상은 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 구현예에서 적용될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 기술된 특정 절차에 대하여 단지 통상적인 실험, 다수의 등가물을 사용해서 인식하거나 규명할 수 있을 것이다. 이런 등가물은 본 발명의 범주 이내인 것으로 고려되며 특허청구범위에 의해 포함된다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 나타난 것과 같은 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.

청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 용어 "한(a)" 또는 "한(an)"의 사용은 "하나(one)"의 의미로 사용될 수 있으나, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일맥상통한다. 청구항에서 용어 "또는"의 사용은, 개시가 양자택일 및 "및/또는"을 지칭하는 정의만을 지지하다고 하더라도, 양자택일만을 지칭하거나 양자택일이 상호 독점적인 것으로 명확하게 나타내지 않는 한, "및/또는"의 의미로 사용된다. 본 명세서 전체를 통해, 용어 "약"은 장치, 값을 측정하기 위해 적용될 방법의 오류의 내재하는 변형을 포함하는 값, 또는 연구 대상 중에 존재하는 변형을 나타내기 위해 사용된다.

명세서 및 청구항(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)" (및 "~들을 포함하다" 및 "~를 포함하다"와 같은 "포함하는"의 임의의 형태), "갖는(having)" (및 "~들을 가지다" 및 "~를 가지다"와 같은 "갖는"의 임의의 형태), "포함하는(including)" (및 "~를 포함하다" 및 "~들을 포함하다")와 같은 "포함하는"의 임의의 형태) 또는 "함유하는" (및 "~를 함유하다" 및 "~들을 함유하다")은 포괄적이거나 조정이 가능하며 추가적인, 나열되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "또는 이들의 조합"은 용어에 선행하는 열거된 항목의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들면, "A, B, C 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC와, 특정 문맥에서 순서가 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 임의의 하나를 포함하는 것으로 의도된다. 이 예를 계속하자면, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, 및 등과 같은 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 함유하는 조합이 명확히 포함된다. 통상의 기술자는 문맥으로부터 명확히 다르지 않는 경우, 임의의 조합에서 항목 또는 용어의 숫자에 대해 전형적으로 임의의 제한이 없음을 이해할 것이다.

본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명의 기술내용에 비추어 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예에 관하여 기술되고 있지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범주를 벗어나지 않고, 본 명세서에 기술된 방법의 단계의 순서에서 또는 단계에서 조성물 및/또는 방법에 변형이 적용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이런 유사한 치환체 및 변형태는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 정신, 범주 및 개념 범위에 포함되는 것으로 여겨진다.

참조문헌

United States Patent No. 7,196,072: High Molecular Weight Polysaccharide Fraction From Aloe Vera with Immunostimulatory Activity.

United States Patent No. 6,083,508: Method of Processing Aloe Leaves.

United States Patent Application No. 2006/0084629: Immune System Activating Formula Composed of Selected Long Chain Polysaccharides From Natural Sources.

¹ Pugh N., Ross S.A., ElSohly M.A., and Pasco, D.S. (2001). Characterization of Aloeride, a new high-molecular weight polysaccharide from Aloe vera with potent immunomodulatory activity. J Agr. Food Chem., 49, 1030-1034.

Claims

탈이온수에 용해된 미세 폴리만난 추출물의 지정된 양; 및 하나 이상의 약학적 보존제를 포함하는, 알로에 유래의 다당류를 함유하는 폴리만난 추출물의 주사가능한 제형으로서,
상기 폴리만난 추출물은
적어도 14wt%의 66,000 달톤의 분자량을 갖는 알로에 다당류,
적어도 9wt%의 480,000 달톤의 분자량을 갖는 알로에 다당류,
적어도 3.5wt%의 1,000,000 달톤의 분자량을 갖는 알로에 다당류, 및
적어도 2.4wt%의 2,000,000 달톤의 분자량을 갖는 알로에 다당류를 포함하는 것인, 제형.
제1항에 있어서, 제형이 멸균된 것인, 제형.
제1항에 있어서, 하나 이상의 약학적 보존제가 파라벤, 벤조산 및 이들의 염, 수은, 4급 암모늄 염, 벤질 알코올 및 페놀로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 제형.
제1항에 있어서, 보존제가 벤질 알코올인 것인, 제형.
제1항에 있어서, 폴리만난 추출물이 알로에 다당류를 포함하는 것인, 제형.
제5항에 있어서, 알로에 다당류가 글루코스, 만노오스, 아라비노스 및 갈락토스로 구성되는 군으로부터 선택되는 단당(simple sugar)을 추가로 포함하는 것인, 제형.
제5항에 있어서, 알로에 다당류가 11,500 달톤 내지 10,000,000 달톤 이상의 범위인 분자량을 갖는 것인, 제형.
제1항에 있어서, 폴리만난 추출물이 적어도 25wt%의 알로에 다당류를 갖는 것인, 제형.
제1항에 있어서, 폴리만난 추출물이 25wt% 내지 95wt%의 알로에 다당류를 갖는 것인, 제형.
제1항에 있어서, 제형이 백혈병 및 림프종, 전립선암, 유방암 및 대장암으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 암의 치료에 사용되는 것인, 제형.
제1항에 있어서, 제형이 면역조절, 면역자극, 또는 약화된 면역 시스템 또는 면역 질환을 가진 대상의 치료를 위해 사용되는 것인, 제형.
제1항에 있어서, 제형이 자연 살해(NK) 세포의 생산성에 대하여 75-80% 증가를 야기하는 것인, 제형.
제1항에 있어서, 폴리만난 추출물이 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인, 제형:
지정된 양의 냉동-건조된(freeze-dried) 알로에 분말을 칭량하며, 여기서 상기 지정된 양은 수분 함량에 대하여 보정되는 단계;
탈이온수에 동결-건조된 분말을 용해시켜 용액을 형성하는 단계;
알코올을 용액에 첨가하여 제1 혼합물을 형성하며, 여기서 탈이온수에 대한 알코올의 부피 비율은 적어도 2.5:1인 단계;
제1 혼합물을 적어도 8시간 동안 정치시키는 단계;
지정된 부피의 상청액을 제1 혼합물로부터 취하고 추가량의 알코올을 상청액 용액에 첨가하여 제2 혼합물을 형성하는 단계;
제2 혼합물을 원심분리하는 단계;
제2 혼합물 내의 침전물의 존재를 관찰하는 단계;
제2 혼합물 내에 임의의 침전물이 관찰되는 경우, 추가량의 알코올을 제1 혼합물에 첨가하는 단계;
사이포닝(siphoning)에 의해 제1 혼합물의 상청액을 따라내며, 여기서 따라내기가 제2 혼합물 내에서 침전물이 관찰되지 않은 경우에만 행해지는 단계;
진공하에 여과지 및 흡인 깔대기를 사용하여 제1 혼합물로부터 침전물을 여과하는 단계;
스크래핑에 의해 흡인 깔대기로부터 폴리만난 추출물의 분말을 회수하는 단계;
폴리만난 추출물의 분말을 적어도 8시간 동안 냉동기 내의 뚜껑이 막힌 동결건조 플라스크 속에 놓아두는 단계;
동결 건조기 내에서 폴리만난 추출물의 냉동 분말을 동결건조시키는 단계; 및
분쇄기에서 폴리만난 추출물의 동결건조된 분말을 미세질감으로 분쇄하는 단계.
제13항에 있어서, 알코올이 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올 및 프로판올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 제형.