KR20170005591A

KR20170005591A - 신규한 에포틸론 a 유도체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170005591A
Application number: KR1020150095815A
Authority: KR
Inventors: 송재경; 파라줄리 프라카스; 프라사드 판데이 라메스; 이주호; 김대희; 우진석
Original assignee: 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2017-01-16
Also published as: KR101763344B1

Abstract

본 발명은 효소를 이용하여 신규한 에포틸론 A(epothilone A) 유도체를 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 유도체 및 상기 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 에포틸론 A 유도체는 다당류가 수식되어 암세포 성장을 억제하는 효과가 있으므로, 암 치료에 유용하다.

Description

신규한 에포틸론 A 유도체 및 이의 용도{Novel Epothilone A derivatives and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 에포틸론 A 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 에포틸론 A에 갈락토스 또는 시알산을 수식한 유도체, 효소를 이용하여 상기 유도체를 합성하는 방법 및 상기 유도체를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

미세소관(microtubule)은 독특한 세포골격 구조로서 αβ-튜불린(αβ-tubulin) 서브유닛으로 구성되어 세포 내에서 여러 가지 중요한 역할을 수행한다. 예를 들어, 다양한 기능 및/또는 전체 세포 구성을 위한 세포골격유지, 세포 내 물질이동 등을 담당한다(V. Akbari, et al., Comparision of Epothlone and Taxol Binding in Yeast Tubulin using Molecular Modeling. Avicenna. J. Med. Biotechnol. 3 (2011) 167-175.). 이러한 중요성 문에 미세소관은 탁솔(taxol), 에포틸론(epothilones), 디스코더몰라이드(discodermolide) 및 엘류테로빈(eleutherobin) 등과 같은 이미 임상 개발 단계에 있는 항암치료제의 타겟으로 작동되어 왔다(L. He, et al., Novel molecules that interact with microtubules and have functional activity similar to taxol. Drug Discov. Today 6 (2001) 1153-1164.). 상기 안정제들은 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및 두경부암 등을 포함하는 다양한 암을 치료하는데 매우 효과적인 것으로 알려져 있다(G. Shi, et al., Structural insight into the mechanism of epothilone A bound to beta-tubulin and its mutants at Arg282Gln and Thr274lle. J. Biomol. Struct. Dyn. 30 (2012) 559-573.).

에포틸론은 이론적인 세포독성을 띄고 있는 항생제(antibiotics)의 한 종류로 1990년대 초반에 발견되었으며, 임상적으로 항암제로 적용될 수 있다(A. Rogalska, et al., Induction of apoptosis in human ovarian cancer cells by new anticancer compounds, epothilone A and B. Toxicol. In Vitro 27 (2013) 239-249.). 난소암 세포들에 대한 연구에서 에포틸론은 일차적으로 세포분열의 실패 및 세포소기관 수송 또는 세포 내 신호전달과 같은 세포 기능의 이상을 일으키는 미세소관 중합 반응의 잘못된 안정화에 영향을 끼친다(K.H. Altmann, et al., The chemistry and biology of epothilones- the wheel keeps turning. Chem. Med. Chem. 2 (2007) 396-423.). 또한, 에포틸론은 암세포주에서 GTP-비의존적 튜불린 중합을 촉진하여낮은 농도에서 미세소관의 안정화를 가능하게 하고, P-glycoproteins(MDR-efflux 펌프 단백질)의 발현을 유지시킨다(D.M. Bollag, et al., Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a taxol-like mechanism of action. Cancer Res. 55 (1995) 2325-2333.).

항생제의 개발 및 변형은 의약발달의 핵심적인 과정 중 하나이다. 실제로, 가치있는 다양한 항암제들의 약학적 효과는 용해성, 세포내 싸이올기를 가진 물질들에 의한 비활성화, 약물 유출 증가 또는 세포 사이의 약물 농축등에 의해 감소되는 것으로 알려져 있다(X.K. Xie, et al., Enhancement effect of adenovirus-mediated antisense c-myc and caffeine on the cytotoxicity of cisplatin in osteosarcoma cell lines. Chemotherapy 55 (2009) 433-440, M. Tanaka, et al., Anticancer effects of novel photodynamic therapy with glycoconjugated chlorin for gastric and colon cancer. Anticancer Res. 31 (2001) 763-770). 바르부르크 효과(Warburg effect)에 의하면, 암 세포들은 일반 세포들에 비하여 많은 양의 글루코스를 소모하는 것으로 알려져 있다. 따라서 독성 감소, 용해성 향상 및 암 선택성 향상을 위하여 과학자들은 현재 다당류를 포함하는 항암제를 개발하고자 한다(M. Tanaka, et al., Anti-cancer effects of newly developed chemotherapeutic agent, glycoconjugated palladium (II) complex, against cisplatin-resistant gastric cancer cells. BMC Cancer 13 (2003) 237.). 과거의 연구결과는 다당류를 포함하는 항암제가 세포독성이 낮고, 향상된 용해성을 지니며, 세포에 의해 쉽게 구별될 수 있다는 것을 증명하였다(V.K. Tiwari, et al., Carbohydrate based Potential Chemotherapeutic Agents: Recent Developments and their Scope in Future Drug Discovery. Mini. Rev. Med. Chem. 12 (2012) 1497-1519.). 앤트라사이클린류(antracycline, 가령 doxorubicin) 및 글리코실매크롤라이드(glycosylmacrolides, 가령 erythromycin, olendomycin 및 chalcomycin)와 같은 약물에 약간의 다당류 부속물을 추가하는 것은 이들의 약학적 성질을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

글리코실트랜스퍼라제는 항생제에 다당류를 수식하는데 매우 중요한 역할을 한다. 시알산은 넓은 범위의 뉴라민산 다당류로 체인의 끝 위치에 매우 다양한 화학적 구조를 가지고 있고, 세포 표면에 존재하며 세포 인지(cellular recognition) 과정에서 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다(C. Traving, R. Schauer, Structure, function and metabolism of sialic acids. Cell Mol. Life Sci. 54 (1998) 1330-1349.). 시알산은 1번 위치의 카복실기와 5번위치의 아미노기로 인하여 음전하를 가지고 있고, 칼슘이온과 같은 양전하를 가진 물질들의 결합에 중요한 역할을 하여 면역 시스템 상에서 자신과 외부의 침입을 구분하는데 중요한 특정 항원을 구분하는 기능을 수행한다고 알려져 있다(H. Yu, H.A. Chokhawala, S. Huang, X. Chen, One-pot three-enzyme chemoenzymatic approach to the synthesis of sialosides containing natural and non-natural functionalities. Nat Protoc. 1 (2006) 2485-92.). 항암제의 단당류 및 시알산 수식 유도체에 특정 항원을 인식하는 것은 암 예방 및 치료에 매우 획기적인 효과를 발휘한다.

하지만, 에포틸론 A의 유도체는 글루코스가 수식된 형태만 알려져 있어, 시알산 및 다양한 다당류로 수식한 에포틸론 A의 유도체를 합성 필요한 실정이다(P. Parajuli, R.P. Pandey, N. Koirala, Y.J. Yoon, B.G. Kim, J.K. Sohng, Enzymatic synthesis of epothlone A glycosides. AMB Express 4 (2014) 31).

이에, 본 발명자들은 다양한 종류의 다당류로 수식된 에포틸론 A의 유도체를 제조하고자 예의 노력한 결과, 다양한 종류의 단당류 전이효소 및 시알산 전이효소를 이용하여 에포틸론 A의 신규한 유도체를 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신규한 에포틸론 A 유도체 및 이의 제조방법를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 에포틸론 A 유도체를 함유하는 암 치료용 조성물 및 상기 에포틸론 A 유도체를 함유하는 암 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl EpothiloneA, lac-epoA), 3’시아릴락토실 에포틸론A(3‘sialyllactosyl epothilone A, 3’SL-epoA) 및 6’시아릴락토실 에포틸론 A(6‘sialyllactosyl epothilone A, 6‘SL-epoA)로 구성된 군에서 선택되는 에포틸론 A(EpothiloneA) 유도체를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 에포틸론 A(EpothiloneA)와 UDP-D-글루코스(UDP-D-Glucose)를 글리코실트랜스퍼라제로 촉매하여 에포틸론 A 6-o-β-D-글로코시드(EpothiloneA 6-O-β-D-glucoside)를 합성하는 단계; (b) 상기 에포틸론 A 6-o-β-D-글로코시드(EpothiloneA 6-O-β-D-glucoside)와 UDP-D-갈락토스(UDP-D-Galactose)를 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl EpothiloneA, lac-epoA)를 합성하는 단계 및; (c) 상기 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl EpothiloneA, lac-epoA)와 시티딘 5’-모노포스포-N-아세틸뉴라믹 산(cytidine 5’-monophospho-N-acetylneuraminic acid, CMP-NeuAc)를 시아릴트랜스퍼라제(sialyltransferase)로 촉매하여 3’시아릴락토실 에포틸론 A(3‘sialyllactosyl epothilone A, 3’SL-epoA) 또는 6’시아릴락토실 에포틸론 A(6‘sialyllactosyl epothilone A, 6’SL-epoA)를 합성하는 단계를 포함하는 에포틸론 A(EpothiloneA) 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl EpothiloneA, lac-epoA), 3’시아릴락토실 에포틸론A(3‘sialyllactosyl epothilone A, 3’SL-epoA) 및 6’시아릴락토실 에포틸론 A(6‘sialyllactosyl epothilone A, 6‘SL-epoA)로 구성된 군에서 선택되는 에포틸론 A(EpothiloneA) 유도체 또는 상기의 제조방법에 따라 제조된 에포틸론 A 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 에포틸론 A 유도체는 암 세포주의 성장을 억제하는 효과가 있으므로, 암 치료에 유용하다.

도 1은 본원 발명의 에포틸론 A 유도체들을 효소를 이용해 합성하는 경로를 도식화 한 것이다.
도 2는 공지의 방법으로 합성한 에포틸론 A 유도체를 질량분석기 및 HPLC로 분석한 것이다.
도 3은 효소를 이용해 합성한 에포틸론 A 유도체들을 고해상도 질량분석기로 분석한 것이다.
도 4는 본원 발명의 에포틸론 A 유도체들의 순도를 HPLC로 분석한 것이다.
도 5는 본원 발명의 에포틸론 A 유도체들의 암 세포주 성장 억제효과를 측정한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 에포틸론 A를 다당류로 수식하여 제조한 유도체가 암 치료에 뛰어난 효능이 있는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는 공지된 방법(P. Parajuli, et al., Enzymatic synthesis of epothlone A glycosides. AMB Express 4 (2014) 31)으로 글루코스가 수식된 에포틸론 A 유도체(epothilone A 6-O-β-D-glucoside, epoA-Glc)를 제조한 뒤, 갈락토실 트랜스퍼라제(galactosyl transferase) 및 시아릴트랜스퍼라제(sialytransferase)를 이용하여 갈락토스로 수식된 에포틸론 A 유도체(galactosyl EpothiloneA 이하 lac-epoA) 및 갈락토스와 시아릴기로 수식된 에포틸론 A 유도체(3‘sialyllactosyl epothilone A 이하 3’SL-epoA, 6‘sialyllactosyl epothilone A 이하 6‘SL-epoA)를 제조하여 질량 분석기로 분석한 결과, 상기 유도체들이 높은 순도로 제조된 것을 확인하였다(도 1, 도 2 및 도 3).

즉, 본 발명의 일실시예에서는 기존의 방법으로 제조한 eopA-Glc를 Helicobacter pylori (ATCC 43504)로부터 유래한 β1,4-galactosyltransferase를 코딩하는 β1,4-GalT 유전자로부터 발현된 갈락토실 트랜스퍼라제를 이용하여 lac-epoA를 제조하였고, lac-epoA를 기질로 하여 Pasteurella multocida (ATCC 15742)로부터 유래한 α2,3-sialyltransferase를 코딩하는 α2,3-SiaT 유전자로부터 발현된 시아릴 트랜스퍼라제를 이용하여 3‘SL-epoA를 제조하였으며, Photobacterium damselae JT0160로부터 유래한 α2,6-sialyltransferase를 코딩하는 α2,6-SiaT 유전자로부터 발현된 시아릴 트랜스퍼라제를 이용하여 6’SL-epoA를 제조하고, HPLC-PDA 및 LC-MS를 이용하여 분석하여 상기 유도체들이 97%이상의 순도로 제조된 것을 확인하였다(도 4).

따라서 본 발명은 일 관점에서, 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl EpothiloneA, lac-epoA), 3’시아릴락토실 에포틸론A(3'sialyllactosyl epothilone A, 3'SL-epoA) 및 6’시아릴락토실 에포틸론 A(6'sialyllactosyl epothilone A, 6'SL-epoA)로 구성된 군에서 선택되는 에포틸론 A(EpothiloneA) 유도체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 에포틸론 A(EpothiloneA) 유도체는 글리코실트랜스퍼라제(glycosyltransferase), 갈락토실트랜스퍼라제(galactosyltransferase) 및 시아릴트랜스퍼라제(sialyltransferase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 이용하여 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 글리코실트랜스퍼라제(glycosyltransferase)는 YjiC 유전자에 의해 암호화 되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 Bacillus licheniformis DSM(ATCC 14580) 유래 YjjC 유전자에 의해 암호화 되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 갈락토실트랜스퍼라제(galactosyltransferase)는 β1,4-GalT 유전자에 의해 암호화 되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 Helicobacter pylori (ATCC 43504)로부터 유래한 β1,4-GalT 유전자에 의해 암호화 되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시아릴트랜스퍼라제(sialyltransferase)는 α2,3-SiaT 및 α2,6-SiaT로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 암호화 되는 것을 특징으로 할 수 있고, α2,3-SiaT 유전자는 Pasteurella multocida (ATCC 15742)로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있으며, α2,6-SiaT 유전자는 Photobacterium damselae JT0160(GeneBank: AB012285.1)로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 에포틸론 A(EpothiloneA)와 UDP-D-글루코스(UDP-D-Glucose)를 글리코실트랜스퍼라제로 촉매하여 에포틸론 A 6-o-β-D-글로코시드(EpothiloneA 6-O-β-D-glucoside)를 합성하는 단계; (b) 상기 에포틸론 A 6-o-β-D-글로코시드(EpothiloneA 6-O-β-D-glucoside)와 UDP-D-갈락토스(UDP-D-Galactose)를 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl EpothiloneA, lac-epoA)를 합성하는 단계 및; (c) 상기 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl EpothiloneA, lac-epoA)와 시티딘 5’-모노포스포-N-아세틸뉴라믹 산(cytidine 5’-monophospho-N-acetylneuraminic acid, CMP-NeuAc)를 시아릴트랜스퍼라제(sialyltransferase)로 촉매하여 3’시아릴락토실 에포틸론A(3'sialyllactosyl epothilone A, 3'SL-epoA) 또는 6’시아릴락토실 에포틸론 A(6'sialyllactosyl epothilone A, 6'SL-epoA)를 합성하는 단계를 포함하는 에포틸론 A(EpothiloneA) 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

한편, 본 발명의 방법으로 제조한 에포틸론 A 유도체와 같이, 다당류가 수식된 항암제의 경우, 암 세포주를 상대로 한 성장 억제효과는 수식되지 않은 약품에 비해 떨어지나, 다당류 분해 효소와 함께 체내로 투여될 경우 약효과 수~수십 배 뛰어나게 나타난다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있으므로(H. Cheng, et al., Synthesis and enzyme-specific activation of carbohydrate-geldanamycin conjugates with potent anticancer activity. J. Med. Chem. 48 (2005) 645-652.), 본 발명의 에포틸론 A 유도체의 경우, 암 세포주 상태에서는 에포틸론 A 보다 암 세포주 성장 억제효과가 약할 것으로 예측하였다

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명의 에포틸론 A 유도체를 암 세포주에 투여하여 MTT assay를 통해 암 세포주 성장 억제효과를 확인한 결과, 에포틸론 A에 비하여 성장 억제효과가 약한 것을 확인하였다(도 5).

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 본 발명의 에포틸론 A(Epothilone A) 유도체 또는 본 발명의 방법으로 제조된 에포틸론 A(Epothilone A) 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 에포틸론 A 유도체를 포함하는 암 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 잇으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명은 또다른 관점에서, 상기 에포틸론 A 유도체를 포함하는 암 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 암 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 치료 방법은 암이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 암 치료용 조성물은 글루코시다제(Glucosidase), 갈락토시다제(Galactosidase) 및 시아릴리다제(Sialidase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[ 실시예 1] 재조합 단백질의 제조

공지된 방법(R.P. Pandey, et al., Enzymatic synthesis of novel phloretin glucosides. Appl. Environ. Microbiol. 79 (2013) 35163521.)으로 Bacillus 유래 글리코실트렌스퍼라제를 암호화하는 YjiC 유전자를 가지는 재조합 pET28 (a) 벡터를 제조하여 E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) 균주에 형질전환하여 발현하였다. 재조합 균주를 카나마이신(50 μg/mL)을 함유한 Luria- Bertani (LB) 액체 배지에 배양한 뒤, OD600nm 값이 0.6일 때 0.8mM의 IPTG를 투입하여 20℃에서 20시간 150rpm으로 배양하여 효소의 발현을 유도하였다.

갈락토실트랜스퍼라제를 암호화하는 β1,4GalT가 도입된 pET24a 플라스미드는 서울 대학교의 김병기 교수로부터 공여 받았다. 공지된 방법(T.J. Oh, et al., Enzymatic synthesis of vancomycin derivatives using galactosyltransferase and sialyltransferase. J. Antibiot. (Tokyo). 64 (2011) 103-109.)으로 제조한 pET32a 플라스미드에 NdeI 및 HindIII 제한효소로 절단하여 도입한 α2,3 SiaT 유전자를 함유하는 재조합 벡터와 pET15b 플라스미드에 NdeI 및 HindIII 제한효소로 절단하여 도입한 α2,6 SiaT 유전자를 함유하는 재조합 효소는 해당하는 제한효소로 재절단하여 유전자가 도입되었는지 확인하였다.

상기 재조합 벡터들을 각각 E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) 균주에 형질전환하여 발현하였다. 재조합 균주를 카나마이신(50 μg/mL)을 함유한 Luria- Bertani (LB) 액체 배지에 배양(β1,4GalT) 하거나, 앰피실린(100 μg/mL) 을 함유한 Luria- Bertani (LB) 액체 배지에 배양(α2,3 SiaT 및 α2,6 SiaT)한 뒤, OD600nm 값이 0.6일 때 0.5mM(β1,4GalT) 또는 0.4mM(α2,3 SiaT 및 α2,6 SiaT)의 IPTG를 투입하여 20℃에서 20시간 150rpm으로 배양하여 효소의 발현을 유도하였다.

배양한 균주를 회수하여 분쇄한 뒤 얻은 추출물을 이용하여 in vitro 합성반응을 수행하였다.

[실시예 2] 효소반응을 이용한 에포틸론 A 유도체의 제조 및 분석

실시예 2-1. 효소반응을 이용한 에포틸론 A 유도체 제조

공지된 방법(P. Parajuli, R.P. et al., Enzymatic synthesis of epothlone A glycosides. AMB Express 4. 2014.)으로 YiiC 유전자로부터 발현된 글루코스트랜스퍼라제를 이용하여 에포틸론 A 6-o-β-D-글로코시드(EpothiloneA 6-O-β-D-glucoside, epoA-Glc)를 제조하였다(도 1). 제조한 5mM epoA-Glc를 1차 기질로 하고, 10mM UDP-galactose(Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis, MO, USA) 및 10mM CMP-N-acetylneuramic acid (CMP-NeuAC)(Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis, MO, USA)를 sugar 공여체로 하여, β1,4-GalT 및 α2,3-SiaT 또는 α2,6-SiaT에 의해 발현되는 100μM의 정제된 효소를 각각 25mM Tris HCL 버퍼(pH 7.5), 20mM MgCl₂6H₂O가 포함된 반응용액에서 36.5℃로 24시간 반응시킨 후, 5분간 끓여 반응을 중지시키고, 12000rpm에서 원심분리하여 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl Epothilone A, lac-epoA), 3’시아릴락토실 에포틸론A(3'sialyllactosyl epothilone A, 3'SL-epoA) 및 6’시아릴락토실 에포틸론 A(6'sialyllactosyl epothilone A, 6'SL-epoA)를 제조하였다.

실시예 2-2. 효소반응을 이용한 에포틸론 A 유도체 분석

먼저, 상기 실시예 2-1에서 제조한 epoA-Glc를 HPLC-PDA(PDA-HPLC Shimadzu, Japan; SPD-M20A Detector)에서 reverse phase C18 column (Mightysil RP 18 GP, 150 × 4.6 mm, Kanto Chemical, Japan)을 이용하여 UV 흡광도 249nm에서 분석하였다. 그 뒤, high resolution LC-QTOF ESI/MS의 양이온 모드에서 SYNAPT G2-S (Water Corp.)와 연결된 ACQUITY (UPLC, water Corp., Billerica, MA, USA) column을 이용하여 분석하여, epoA-Glc가 제대로 합성된 것을 확인하였다(도 2)

추가로 상기 실시예 2-2에서 제조한 lac-epoA, 3’SL-spoA 및 6’SL-epoA 역시 같은 조건에서 분석하여 높은 순도로 합성된 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).

[실시예 3] 에포틸론 A 유도체의 암 세포 성장 억제효과 확인

상시 실시예 2에서 제조한 에포틸론 A 유도체를 인간 대장암 세포주(HCT116) 및 제대 정맥 내피 세포주(HUVECs)에 투여한 뒤, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl bromide (MTT, Sigma-Aldrich)를 이용한 colorimetric 분석법을 이용하여 세포 분열을 측정한 결과, 농도에 비례하여 상기 에포틸론 A 유도체들이 암 세포주들의 성장을 억제하는 효과가 나타나는 것을 확인하였다(도 5).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

갈락토실 에포틸론 A(galactosyl Epothilone A, lac-epoA), 3’시아릴락토실 에포틸론A(3'sialyllactosyl epothilone A, 3'SL-epoA) 및 6’시아릴락토실 에포틸론 A(6'sialyllactosyl epothilone A, 6'SL-epoA)로 구성된 군에서 선택되는 에포틸론 A(Epothilone A) 유도체.
다음의 단계를 포함하는 에포틸론 A(Epothilone A) 유도체의 제조방법:
(a) 에포틸론 A(Epothilone A)와 UDP-D-글루코스(UDP-D-Glucose)를 글리코실트랜스퍼라제로 촉매하여 에포틸론 A 6-o-β-D-글로코시드(EpothiloneA 6-O-β-D-glucoside)를 합성하는 단계;
(b) 상기 에포틸론 A 6-o-β-D-글로코시드(Epothilone A 6-O-β-D-glucoside)와 UDP-D-갈락토스(UDP-D-Galactose)를 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl Epothilone A, lac-epoA)를 합성하는 단계 및;
(c) 상기 갈락토실 에포틸론 A(galactosyl Epothilone A, lac-epoA)와 시티딘 5’-모노포스포-N-아세틸뉴라믹 산(cytidine 5’-monophospho-N-acetylneuraminic acid, CMP-NeuAc)를 시아릴트랜스퍼라제(sialyltransferase)로 촉매하여 3’시아릴락토실 에포틸론 A(3'sialyllactosyl epothilone A, 3'SL-epoA) 또는 6’시아릴락토실 에포틸론 A(6'sialyllactosyl epothilone A, 6'SL-epoA)를 합성하는 단계.
제1항의 에포틸론 A(Epothilone A) 유도체 또는 제2항의 방법으로 제조된 에포틸론 A(Epothilone A) 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 조성물.