KR20160145064A - 생산을 증가시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

단백질 수율 및 세포 생산성을 증가시키는 방법이 본원에서 개시된다. 화학작용제는 생물학적 분자의 숙주 세포 생산을 용이하게 하여 생산 수율을 증가시킨다.

Description

생산을 증가시키는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS TO INCREASE PRODUCTION}
본 발명은 일반적으로 숙주 세포에서 생물학적 분자 (예를 들어, 생물학적 치료제), 예를 들어, 치료적, 예방적 및 진단적 단백질을 생산하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 배양된 세포로부터 생물학적 분자의 수율을 증가시키는 것과 관련된다.
많은 생물학적 치료제, 예를 들어, 치료적, 예방적 및 진단적 단백질이 숙주 세포에서 생산된다. 예를 들어, 인플루엔자(influenza) 백신에 대한 백신 항원은 종종 포유류 세포 또는 계란(hens egg)에서 생산된다 (Govorkova, et al, Dev Biol Stand 98:39-51, (1998)). 유사하게, 단클론성 항체 및 펩타이드-기반 치료제를 포함하는 많은 재조합 단백질이 적합한 숙주 세포에서 생산된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 생산 시스템의 수율은 종종 차선책으로 남아있다.
여러 연구들은 세포 배양 또는 난(egg)으로부터 생산된 항원성 단백질 또는 바이러스의 수율을 증가시키도록 추진되었다. 인플루엔자 제조사는 발육란(embryonated egg)을 감염시키는데 사용된 신선한 접종물에서 첨가물로서 25 μg/ml 하이드로코르티손을 포함하였다 (국제 특허 공개 WO 02/074336). 소분자 화합물, 약물 또는 단백질의 처리는 세포 배양물의 생산 능력을 증가시키기 위해 테스트되었다. 국제 특허 공개 WO 2012/134130은 바이러스 복제의 음성 조절자로서 CHD6 단백질 및 인플루엔자 바이러스 폴리머라제의 상호작용을 확인하였다. CHD6 유전자는 인플루엔자 감염된 HEK293T 또는 A549 세포주를 짧은 헤어핀(hairpin) RNA로 트랜스펙션함으로써 침묵하게 된다. 이 기술은 대조군 세포보다 대략 5 - 10배의 바이러스 역가의 증가를 생산한다.
또 다른 연구에서, 미국 특허 7,132,271은 인터페론-중재 항바이러스 반응의 억제를 개시하며, 구체적으로는 이중 가닥 RNA 의존적 키나제는 증가된 바이러스 증식을 유도하는 세포 배양의 허용을 변화시킬 수 있다. 안정한 또는 일과성 세포는 바이러스로 감염 전에 PKR-결핍 또는 2-5A 신테타제-결핍 돌연변이를 생성하도록 변형되었다. EMCV (뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus))가 PKR-결핍 세포에서 0.001 TCID50/세포로 복제될 수 있으며 대조군보다 천 배 정도의 바이러스 복제의 증가를 초래한다고 개시되어 있다.
미국 특허 공개 2013-0315954에서, 인플루엔자 바이러스의 생산을 개선하는 방법이 개시되어 있으며 Mdm2 단백질 및 p53 단백질 간의 상호작용의 소분자 억제자의 존재 하에 생산이 수행된다. 소분자 화합물은 이미다졸린 유도체, 이미다졸 유도체, 옥신돌 유도체, 스피로인돌리논 유도체, 퀴놀론 유도체, 비스아릴설폰아미드 유도체, 벤조디아페진 유도체, 피페리딘 유도체, 페녹시아세트산 유도체, 페녹시메틸테트라졸 유도체, 칼콘 유도체, 테트라졸 유도체, 디설파이드 유도체, 디아미노아릴 유도체 및 Mdm2 단백질의 펩타이드 억제자를 포함한다. 한 특정 구체예에서, MDCK 세포주는 인플루엔자 H3N2 바이러스로 감염되었고 0.1 μM, 1.0 μM, 및 10μM 디하이드로이미다졸 화합물 (Nutlin-3)이 처리되었다. 상층액에서 바이러스 게놈의 측정은 10-3의 초기 감염 다중도 (multiplicity of infection; MOI)에서, 및 감염 후 24시간에 Nutlin의 전처리가 상층액에서 대조군과 비교하여 최대 19배 더 많은 카피의 바이러스 게놈을 생산하였다는 것을 나타냈다.
국제 특허 공개 WO 2012/136852는 MDCK 또는 A549 세포에서 인플루엔자 A 바이러스의 생산 능력을 증가시키기 위한 의약품의 사용을 개시한다. 감염 후 24-48시간 동안 약물과 함께 배양한 후, 바이러스 역가 및 뉴라미니다제 활성이 측정되었다. 0.01 - 10 μM 심바스타틴은 인플루엔자 서브타입 A 바이러스로의 접종 전에 첨가되었고 1.0 μM 농도에서 대략 1.5 - 3배 증가한 H1N1 바이러스 역가를 생산하였다. 단 하나의 인플루엔자 서브타입 A 균주 (H3N2 및 H5N1이 아니라 H1N1)는 심바스타틴 처리된 세포에서 대략 1.5배 더 큰 바이러스 역가를 수득하는 것으로 나타났다. 인플루엔자 A 균주를 사용하여 테스트된 다른 의약품에 대한 바이러스 수율의 증가는 균주, 용량 및/또는 약물 의존적이었다.
지금까지, 어떠한 특허 또는 문헌도 숙주 세포 시스템으로부터 생물학적 분자의 수율을 증가시키기 위해 매우 낮은 농도, 예를 들어, 0.05 μM 이하에서 소분자 화합물의 사용을 기술하지 않았다. 왕성한 제조, 증가된 생산 효율 및 치료적, 예방적 및 진단적 사용을 위한 생물학적 생성물의 비용 효율적인 가공이 여전히 필요하다.
본 발명은 일반적으로 약학적 적용, 예를 들어, 진단적, 치료적 또는 예방적 적용에서의 사용에 적합한 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 그러므로 본 발명은 약학적 생성물, 예를 들어, 백신을 포함하는 생물학적 치료제의 제조에 적합하다.
본 발명은 넓은 의미에서 숙주 세포 시스템에서 특정 세포 경로(들)의 조절이 숙주에서 생물학적 분자의 향상된 생산으로 이어질 수 있다는 인식을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명을 수행하는데 유용한 화합물은 단백질 지질화 (프레닐화(prenylation)), 콜레스테롤 생합성, 및/또는 G-단백질-커플링된 수용체 신호 변환, 예를 들어, 세포 내 cAMP-의존적 신호 전달을 조절할 수도 있다.
더 구체적으로는, 한 양태에서, 본 발명은 스타틴-관련 세포 경로를 조절함으로써, 숙주 세포 시스템에서 생산된 생물학적 분자, 예를 들어, 재조합 단백질 및 바이러스 입자의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 이론에 결부되지 않으면서, 본원에서 제공된 데이터는 콜레스테롤-의존적 및 콜레스테롤-독립적 작용 메커니즘 둘 다를 수반하는 메발로네이트 경로를 통해 향상 효과가 중재될 수도 있다고 제안한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 도파민- 및/또는 세로토닌-관련 세포 경로를 조절함으로써 숙주 세포 시스템에서 생산된 생물학적 분자, 예를 들어, 재조합 단백질 및 바이러스 입자의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 도파민 경로 및/또는 세로토닌 경로에 영향을 주는 적합한 화합물은 수용체, 예를 들어, 작용제 및 길항제 (예를 들어, 전체 작용제, 부분적 작용제, 중성 길항제, 역작용제, 등) 중 하나 이상에 대한 선택적 리간드이다. 일부 구체예에서, 이러한 화합물은 적어도 하나의 세로토닌 수용체를 통해 작용하며, 숙주 세포에서 5-HT7, 5-HT1, 및/또는 5-HT5 수용체 신호 전달을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 이러한 화합물은 5-HT7 수용체 신호 전달을 통해 작용한다. 일부 구체예에서, 이러한 화합물은 세포 내 cAMP 수준을 감소시킬 수 있다.
놀랍게도, 본 출원의 발명자들은 관찰된 향상 효과가 숙주 세포에서 바이러스 생산에 제한되지 않으며, 특정 세포주에 제한되는 것도 아니라는 것을 발견하였다. 오히려, 본원에서 기술된 적합한 화합물 (예를 들어, 스타틴 및 스타틴-유사 분자, 수용체 리간드, 구조적 유사체 또는 유도체, 기능적 등가물, 및 이것들의 조합을 포함하는, 스타틴- 및/또는 5HTR-관련 신호 전달을 조절할 수 있는 화합물)의 사용은 다양한 숙주 세포 시스템에서 단백질 생산을 증가시키는 더 일반적인 수단을 제공할 수도 있다. 게다가, 발명자들은 본원에서 제공된 특정 분자가 놀랍게도 저농도에서 사용될 때 바이러스/단백질 생산을 향상시키는데 있어서 효율적이라는 것을 확인하였다. 이것은 인간 사용에 적합한, 높은 정도의 순도를 필요로 하는 약학적 생성물을 제조하는데 특히 유리하다. 따라서, 이러한 방법들은 생물학적 치료제의 상업적 규모의 생산에 적합하다.
따라서 숙주 세포 시스템, 예를 들어, 세포 배양 또는 발육란으로부터 단백질을 생산하는 방법이 제공되며, 숙주 세포와 표 1에서 선택된 적어도 하나의 약제를 접촉시키고/숙주 세포에 표 1에서 선택된 적어도 하나의 약제를 처리하는 단계를 포함한다. 화합물에 대한 잔기는 하기 더 상세히 한정된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 구체예에서, 적어도 하나의 약제 (예를 들어, 하나 또는 그 이상의 약제)는 본 발명을 수행하기 위해 하기 표에서 제공된 화합물로부터 선택된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
상업적 및 안전성 관점 둘 다로부터, 숙주 세포 시스템 (예를 들어, 세포 배양 및 난)에서 상대적으로 낮은 농도로 본원에서 기술된 화합물의 사용에 의해 향상된 단백질 수율을 달성하는 것이 특히 유리하다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포와 낮은 농도의 적어도 하나의 화학작용제, 예를 들어, 스타틴 또는 스타틴 유도체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포 시스템, 예를 들어, 세포 배양 또는 난으로부터 생물학적 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 스타틴 또는 그 유도체는 심바스타틴이 아니다. 이러한 약제는 숙주 세포가 세포 배양물일 때 0.001 μM - 10 μM, 바람직하게는 0.05 μM 이하의 최종 농도로 존재할 수도 있다. 숙주 세포가 발육란일 때, 화학작용제는 난 당 적어도 10 - 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μM 이상의 농도로 존재할 수도 있다.
본 발명에서 사용된 적합한 화학작용제는 세포 또는 동물에서 사용될 때 치료적 효능을 가지고 독성이 아닌 것들이다. 이러한 화합물은 조절 목적을 위해 잘 특성화된 안전 프로파일을 가지는 것이 특히 바람직하다. 따라서, 유용한 화합물은 상업적으로 이용 가능한 의약품으로부터 선택될 수도 있으며, 이것들은 인간 사용에 안전한 것으로 승인되었고 이로 인해 독성 및 클리어런스(clearance)에 대하여 엄격한 테스트를 거쳤다. 이러한 약제는 생물학적 생산 시스템에서 성장 인핸서(enhancer)로서 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 방법은 공지된 약품, 화학작용제 및 본원에서 기술된 이것들의 유사체를 포함한다. 바람직하게는, 이 약제들은 비교 대조군에서 보이는 것보다 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 또는 최대 약 10배 이상만큼 생물학적 생성물 수율을 증가시키는데 유효한 양으로 사용된다.
본 발명의 방법은 또한 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500% 이상의 수율의 증가만큼 본원에서 생산된 생물학적 분자 또는 생물학적 생성물의 수율을 증가시킬 수도 있다. 바람직하게는, 수율의 증가는 대조군과 비교하여 배양 상층액에서 생산된 생물학적 분자, 예를 들어, 총 입자 (vRNA 카피/ml), 감염성 입자 (IU/ml) 또는 단백질 (μg/ml)의 양으로 측정될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 제조를 위해서, 바람직하게는 대조군과 비교하여 HA 항원 수율의 증가가 측정된다. 본 특허의 목적을 위해서, 수율의 증가는 바람직하게는 생성되는 표적 생성물을 검출하는 ELISA로 측정되고, 독감 백신에 대해서는 HA-ELISA로 측정된다.
바람직한 화학작용제는 숙주 세포에 의해 고도로 대사되지 않는 것들이다. 화학작용제는 안정하고 숙주 세포, 시약 및 제조 조건의 존재 하에 실질적으로 분해되지 않고 생산 공정에 걸쳐 적용 가능한 검정에 의해 추적될 수 있다. 본원에서 기술된 숙주 세포 시스템에서 사용된 화학작용제의 클리어런스 또는 분해를 검출하는 방법이 또한 제공된다.
화학작용제는 정제된 샘플 (예를 들어, 생성물)에 존재해서는 안되지만, 약제는 제조 공정 중에 추적될 수 있다. 약제는 화학적으로 안정하고 숙주 세포와 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 45시간, 50시간, 55시간 및 60시간 접촉 후 세포 배양물 상층액에서 비대사된 형태로 측정되거나 검출될 수 있다. 바람직하게는, 약제는 질량 분석법을 사용하여 최종 생성물에서 측정된 바와 같이 분해되지 않으며 순수 용제 (대략 50% 아세토니트릴)에서 0.5 ng/ml의 검출 한계를 가진다. 독감 백신 생산을 위해서, 비대사된 화학작용제는 없거나 검출 불가능하다, 즉, 세포 배양물 상층액에서, 감염 후 최대 60시간에 순수 용제 중 0.5 ng/ml 이하의 검출 한계 (LOD)에서 검출될 수 없는 수준이다 (예를 들어, 10-3 또는 10-4의 낮은 MOI 바이러스 감염).
본 발명의 일부 구체예에서, 숙주 세포 시스템에서 생물학적 생성물, 예를 들어, 원하는 단백질 및 바이러스를 제조하는 방법이 제공되며, 제조는 0.05 μM 이하의 최종 농도를 포함하거나 또는 생성물의 2배 증가가 달성되는 적어도 하나의 화학작용제의 존재 하에 행해지는 것을 특징으로 한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 0.001 μM - 1.0 μM의 범위의 최종 농도를 가지고 항원 생산의 2배 증가가 달성되는 적어도 하나의 화학작용제를 사용하여 세포 배양 또는 발육란으로부터 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 바이러스 성장을 개선하고, 세포 생산성을 증가시키고, HA 항원의 바이러스 역가, 발현 및/또는 수율을 증가시킴으로써 인플루엔자 백신 제조에서 특정 사용 및 효과를 가진다. 본 발명의 방법은 제조 배치 당 얻어진 항원성 생성물의 증가된 양 및 용량을 생산한다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 더 바람직하게는 배양된 세포에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공하며, 생산은 1 μM 이하, 바람직하게는 0.05 μM 이하의 농도를 가지고, 바이러스 입자 또는 항원이 대조군과 비교하여 2배 더 높은 수율로 생산되는 적어도 하나의 약제의 존재 하에 행해지는 것을 특징으로 한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 숙주 세포 시스템, 예를 들어, 세포 배양 또는 발육란에서 인플루엔자 B 균주를 생산하는 방법을 제공하며, 생산은 약제 또는 이것의 유도체의 존재 하에 행해지고 대조군과 비교하여 2배 더 큰 바이러스 입자 또는 항원의 수율을 생산하는 것을 특징으로 한다.
[10] 일부 구체예에서, 적어도 하나의 화학작용제는 바이러스 또는 또 다른 벡터에 의한 숙주 세포의 트랜스펙션/감염 이전에, 동시에 또는 이후에 숙주 세포를 치료하는데 사용될 수 있다. 숙주 세포는 원하는 생물학적 생성물의 수율의 증가를 달성하기 위해서, 트랜스펙션/감염 이전에 또는 이후에 0 내지 1시간, 0 내지 2시간, 0 내지 3시간, 0 내지 4시간, 0 내지 5시간, 0 내지 12시간, 0 내지 20시간, 0 내지 30시간, 0 내지 40시간, 0 내지 50시간, 0 내지 60시간의 기간 동안 적어도 하나의 화학작용제와 접촉할 수도 있다.
본 발명은 전형적인 성장 조건 하에서 특정 숙주 세포에서 발현될 때 생산 수율이 차선책인 것으로 간주되는 (예를 들어, "낮은 일더(yielder)" and "중간 일더"), 재조합 단백질 (또는 이것들의 단편)의 생산을 증가시키는 방법을 더 제공한다. 단백질 생산은 수율이 전형적으로 2-10 mg/L 범위 ("중간 내지 낮은 일더"), 특히 약 5 mg/L 이하 ("낮은 일더")일 때 차선책으로 간주된다. 이러한 방법은 본원에서 기술된 바와 같이 본 개시물에 포함된 화합물, 예를 들어, 스타틴 및 그것들의 구조적 유사체 (심바스타틴 포함), 뿐만 아니라 그것들의 기능적 등가물, 및 특정 GPCR 결합제 중 하나 이상의 사용을 포함한다. 본 발명의 방법은 낮은 일더의 단백질 생산을 향상시키는데 특히 유용하다.
도 1은 HA 수율을 개선하는 화학작용제의 확인을 위한 공정 흐름도를 나타낸다.
도 2는 감염 후 60시간 (hpi)에 MOI = 10-4의 H3N2 균주 IVR-165를 이용한 ELISA에 의해 측정된 HA 수율의 용량 반응 향상을 나타낸다.
도 3은 1 μM 설폰아미드 또는 0.05 μM 피타바스타틴을 사용하여 다수의 인플루엔자 서브타입 A H3N2 균주로부터 얻어진 향상된 HA 수율을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. 이 연구들에서는 전형적으로 2-3배 HA 수율이 관찰되었다.
도 4는 1 μM 설폰아미드 및 0.05 μM 피타바스타틴에 대하여 다수의 서브타입 B 균주로부터 얻어진 향상된 HA 수율을 입증하는 막대 그래프를 나타낸다. 균주에 따라 전형적으로 적어도 2-10배 HA 수율이 관찰되었다.
도 5는 RNAase-저항성 독감 M 전사물의 qPCR에 의해 측정된 HA 수율 향상을 나타낸다. (a) 총 입자는 1 μM 설폰아미드 또는 0.05 μM 피타바스타틴에 대한 HA 수율과 비교될 수 있다. (b) 0.05 μM 피타바스타틴을 사용하여 총 입자와 HA 수율 증가의 비교.
도 6은 피타바스타틴 및 설폰아미드의 검출을 위해 질량 분석법을 사용하는, 화합물 추적 가능성을 나타내는 선형 플롯을 나타낸다. 검정은 대략 0.5 ng/ml의 순수 용제 (50% 아세토니트릴)로부터 검출 한계를 가지고 있다.
도 7은 0.05μM에서 피타바스타틴과 비교하여 플루바스타틴 유도체 및 대조군이 처리된 세포의 서브타입 AH3N2 HA 수율 (μg/ml)을 나타낸다.
도 8은 상업적으로 이용 가능한 스타틴이 처리된 세포의 서브타입 A/Texas X223A HA 수율 (μg/ml)의 비교를 나타낸다.
도 9는 메발로네이트 경로의 관련성을 도시한다: (A) 메발로네이트 경로의 개략도를 예시하고; (B) 특이적 효소 억제자 조합으로 메발로네이트 경로의 세 줄기 모두의 차단은 숙주 세포에서 단백질 수율에 대한 스타틴의 효과를 모방할 수 있다.
도 10은 Ambr15 vs 셰이크 플라스크에서 HA 수율의 세부 비교(side-by-side comparison)를 제공한다; 두 개의 납 화합물 모두 Ambr15의 CDM 및 DM134 배지 둘 다에서 저발현 B/Mass/2/12에 대한 수율을 향상시켰다.
도 11은 Ambr15 vs 셰이크 플라스크에서 HA 수율의 세부 비교를 제공한다; 단지 AFZ077이 Ambr15의 CDM 및 DM134 배지 둘 다에서 고발현 A/Vic/361/11 (IVR165)에 대한 수율을 향상시켰다.
도 12는 HA-ELISA로 측정된 바와 같이, A 및 B 균주에서, 두 가지 농도의 두 개의 납 화합물로, 두 개의 다른 세포 밀도 (저 및 고 IDC)에서, HA 수율을 제공한다.
도 13은 표시된 농도의 BYF589로 테스트된 B 균주에서 HA 수율을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 14는 표시된 농도의 AFZ077로 테스트된 B 균주에서 HA 수율을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 15는 AFZ077에 의한 Flu HA 수율 향상이 5HT7 수용체의 활성의 감소에 의존적이라는 것을 나타내는 그래프를 제공한다. DM134 배지 중 Flu B 균주 (B/Mass); ELISA에 의한 65시간 HA 수율 (μg/ml).
도 16은 A 균주 (IVR165)의 HA 수율의 ELISA 결과를 요약한다; 보이는 바와 같이 다양한 농도로 표시된 화합물이 처리됨.
도 17은 AFZ077에 관하여, SAR의 이용 가능한 유사체의 HA 수율을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 18은 두 개의 그래프를 제공한다: (A) BFY589-처리된 세포 대 미처리 세포의 단백질 수율 (여기에서 각각의 데이터 포인트는 테스트된 표적 단백질을 나타낸다); (B) 대조군 수율 (미처리)의 함수로서 배수 증가하는 단백질 발현 (여기에서 각각의 데이터 포인트는 테스트된 표적 단백질을 나타낸다).
발명자들은 숙주 세포 시스템의 생물학적 생성물의 증가된 생산 또는 발현을 용이하게 하는 확인된 방법을 가지고 있다. 생산은 동등한 조건 하에서 적합한 비히클(vehicle), 예를 들어, DMSO가 처리된 해당하는 대조군 세포로부터 생산된 생물학적 분자와 비교하여 본원에 포함된 적어도 하나의 화학작용제의 낮은 농도를 사용하여 크게 개선된다.
따라서, 일부 구체예에서, 숙주 세포 시스템으로부터 생물학적 분자의 수율의 증가는 해당 대조군과 비교하여 적어도 2배이다. 본 발명에서 사용된 화학작용제의 존재 하에 생산된 생물학적 분자의 수율은 특정 숙주 세포, 바이러스, 단백질, 화학작용제, 원하는 세포 활성을 구성하는 것의 결정 또는 주어진 실험 분석에 흔히 사용되는 다른 사용자 정의 파라미터의 개개의 특징에 따라 다를 수도 있다. 일부 구체예에서, 원하는 생물학적 생성물의 생산 수율은 대조군 (즉, 화합물이 없지만 동등한 조건에서 성장함)과 비교하여 적어도 20% 만큼, 예를 들어, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 350%, 400%, 450%, 및 500% 만큼 증가된다.
본 발명에서 사용된 화학작용제의 적합한 농도는 약 0.1 nM - 10 μM의 범위로부터 선택될 수도 있다. 본 발명을 수행하는데 사용된 화합물의 적합한 농도는 대조군과 비교하여 생산 수율을 증가시키는데 효과적인 농도를 말한다. 적합한 농도는, 예를 들어, 0.1-5000 nM, 예를 들어, 0.5-1000 nM, 0.5-500 nM, 0.5-250 nM, 0.5-200 nM, 0.5-150 nM, 0.5-100 nM, 0.5-75 nM, 0.5-50 nM, 0.5-25 nM, 0.5-20 nM, 0.5-15 nM, 0.5-10 nM, 0.5-5 nM, 1-100 nM, 1-75 nM, 1-50 nM, 1-25 nM, 1-20 nM, 1-15 nM, 1-10 nM, 2-50 nM, 2-40 nM, 2-20 nM, 2-10 nM, 등의 범위일 수도 있다.
일부 구체예에서, 효과적인 농도는 ≤50 nM, 예를 들어, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤25 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤14 nM, ≤13 nM, ≤12 nM, ≤11 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM이다. 예로서, 본 발명에서 사용된 화학작용제는 0.001 μM - 0.5 μM, 바람직하게는 약 0.01μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.06 μM, 0.07 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 또는 0.10 μM의 최종 농도로 존재할 수도 있다. 바람직하게는 화학작용제는 생성물 수율의 적어도 20% 증가를 달성할 수 있는 최저농도로 숙주 세포와 접촉되어 있다. 더 바람직하게는, 화학작용제는 생성물 수율의 적어도 2배 증가를 달성할 수 있는 최저농도로 숙주 세포와 접촉되어 있다.
화학작용제의 농도는 또한 본 발명에 의해 기술된 결과를 생산할 수 있고 숙주 세포, 바이러스, 또는 생물학적 생성물에 대하여 비독성을 유지하는 특정 약제, 시스템 또는 조건에 의존적일 것이다.본 발명의 결과를 달성하는 최적의 농도는 일상적인 방법을 사용하여 조정될 수 있다. 예를 들어, 실험 조건은 생산 규모에 적합한 조건 및 결과를 달성하도록 맞춰질 수 있다.
본원에서 기술된 특정 화학작용제는 물리적, 화학적 및 약학적 성질을 특징으로 할 수도 있다. 이 약제들은 숙주 세포 시스템, 특히 세포 배양 및 난에서 생물학적 생성물의 수율을 증가시키기에 최적의 농도로 약제를 제공하도록 화학적으로 조작될 수도 있다.
한 양태에서, 약제의 친유성이 증가되는 경우 숙주 세포와 접촉되어 있는 특정 화학작용제의 효과 또는 활성이 향상될 수 있다. 약제의 화학적 및 구조적 변형은 세포막 수송 또는 단백질 발현을 향상시킬 수도 있다. 특정 양태에서 화학작용제는 프로드러그(prodrug) 유사체를 생산하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 프로드러그의 제조 및 사용에 수반되는 표준 기술은 본 발명에서 사용된 화학작용제에 적합하게 적용 가능하다. The Practice of Medicinal Chemistry, Ch. 31-32 (Ed. Wermuth, Academic Press, San Diego, Calif., 2001) 참조.
본 발명에서 사용된 약제의 예시의 프로드러그는 대상체에게 프로드러그의 투여 후 생체 내 생리학적 작용, 예를 들어, 가수분해, 물질대사 등을 나타내는 것으로 이미 공지되어 있는 상업적으로 이용 가능한 약학적 물질이다. 일반적으로, 생체전구물질 프로드러그는 화합물이며, 이것들은 비활성이거나 해당 활성 약물 화합물과 비교하여 낮은 활성을 가지고, 하나 이상의 보호기를 함유하고 물질대사 또는 가용매분해에 의해 활성형으로 전환된다. 활성 약물 형태 및 어떠한 방출된 대사 생성물 둘 다는 허용 가능하게 낮은 독성을 가지고 있어야 한다. 담체 프로드러그는 수송 모이어티를 함유하는, 예를 들어, 흡수 및/또는 작용 부위(들)로의 국소적 전달을 개선하는 약물 화합물이다. 이러한 담체 프로드러그에 바람직하게, 약물 모이어티와 수송 모이어티 간의 결합은 공유 결합이고, 프로드러그는 비활성이거나 약물 화합물보다 덜 활성이고, 어떠한 방출된 수송 모이어티는 허용 가능하게 비-독성이다. 프로드러그에 대하여 수송 모이어티가 흡수를 향상시키는 경우, 전형적으로 수송 모이어티의 방출은 신속해야 한다. 다른 경우에는, 느린 방출을 제공하는 모이어티, 예를 들어, 특정 폴리머 또는 다른 모이어티, 예를 들어, 사이클로덱스트린을 이용하는 것이 바람직하다. 담체 프로드러그는, 예를 들어, 다음 속성 중 하나 이상을 개선하는데 사용될 수 있다: 증가된 친유성, 약학적 효과의 증가된 기간, 증가된 부위-특이성, 감소된 독성 및 부작용, 및/또는 약물 제형의 개선 (예를 들어, 안정성, 수용성, 원치않는 감각 수용성 또는 물리화학적 속성의 억제). 예를 들어, 친유성은 친유성 카르복시산 (예를 들어, 적어도 하나의 친유성 모이어티를 가진 카르복시산)으로 하이드록실 기, 또는 (b) 친유성 알콜 (예를 들어, 적어도 하나의 친유성 모이어티를 가진 알콜, 예를 들어 지방족 알콜)로 카르복시산 기의 에스터화에 의해 증가될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 화학작용제는 시험관 내에서 생물학적 생성물을 발현하기 위한 숙주 세포 시스템의 생산성을 용이하게 하도록 변형된다.
따라서 본 발명은 통상적인 약학적으로 허용 가능한 산, 예를 들어 말레산, 염산, 브롬화수소산, 인산, 아세트산, 푸마르산, 살리실산, 시트르산, 젖산, 만델산, 타르타르산 및 메탄설폰산의 형태로 화학작용제를 포함한다. 화학작용제는 또한 용매화합물, 예를 들어, 수화물을 형성할 수도 있고, 본 발명은 이러한 형태로 연장된다.
본 발명에서 사용된 화학작용제 중 일부의 구조는 하나 이상의 입체 중심(stereocenter)을 보유할 수도 있고 각각의 중심은 R 또는 S 형태, 또는 이것들의 조합으로 존재할 수도 있다고 언급될 것이다. 유사하게, 본원에서 제공된 화합물은 하나 이상의 이중 결합을 보유할 수도 있고 E (트랜스) 또는 Z (씨스) 형태, 또는 이것들의 조합으로 존재할 수도 있다. 한 특정 입체이성질체, 레지오이성질체(regioisomer), 부분입체이성질체, 거울상이성질체 또는 에피머의 제공은 모든 가능한 입체이성질체, 레지오이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체 또는 에피머 및 이것들의 혼합물을 포함하는 것으로 생각되어야 한다. 따라서, 본원에서 제공된 화합물들은 입체이성질체, 레지오이성질체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체, 및 에피머 형태의 별도의 형태 모두, 뿐만 아니라 이것들의 해당 혼합물을 포함한다. 하나 이상의 비대칭 중심을 함유하지만, 특정 입체화학을 지정하지 않는 화합물에 대한 한 특정 화학 구조 또는 화학명은 모든 가능한 입체 이성질체를 포함하다고 생각되어야 하며, 모든 가능한 입체 이성질체의 혼합물, 한 특정 입체 이성질체의 순수형 또는 실질적 순수형 및 대안의 입체 이성질체의 순수형 또는 실질적 순수형을 포함한다. 특정 입체 중심, 및 입체이성질체의 혼합물을 분해하는 것들을 전화시키거나 비대전된 채로 두는 기술은 업계에 잘 공지되어 있고 특정 상황에 대하여 적절한 방법을 선택하는 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, Furniss et al. (eds.), VOGEL'S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5th ED., Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, 809-816; 및 Heller, Acc. Chem. Res. 1990, 23, 128 참조.
본 발명에서 사용된 약제(들)의 어떠한 비대칭 원자 (예를 들어, 탄소 등)는 라세미 또는 거울상이성질체가 풍부한, 예를 들어, (R)-, (S)- 또는 (R,S)-형태의 형태로 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 각각의 비대칭 원자는 (R)- 또는 (S)-형태로 적어도 50% 거울상이성질체 초과량, 적어도 60% 거울상이성질체 초과량, 적어도 70% 거울상이성질체 초과량, 적어도 80% 거울상이성질체 초과량, 적어도 90% 거울상이성질체 초과량, 적어도 95% 거울상이성질체 초과량, 또는 적어도 99% 거울상이성질체 초과량을 가진다. 불포화 결합을 가진 원자에서 치환기는, 가능한 경우, 씨스-(Z)- 또는 트랜스-(E)-형태로 존재할 수도 있다. 본원에 포함된 화학작용제는 R- 또는 S- 형태 둘 다를 함유하는 라세미 혼합물로 또는 대안으로 R- 또는 S- 형태로 및/또는 각각의 거울상이성질체에서 기능적 활성의 원하는 수준에 따라 거울상이성질체가 풍부한 상태로 존재할 수도 있다.
결과로 생긴 어떠한 이성질체의 혼합물도 구성 성분의 물리화학적 차이에 근거하여, 예를 들어, 크로마토그래피 및/또는 분별 결정법에 의해 순수한 또는 실질적으로 순수한 기하 또는 광학 이성질체, 부분입체이성질체, 라세미 화합물로 분리될 수 있다.
본 발명에서 사용된 화학작용제는 일반적인 화학 분석에 의해 디자인 또는 모델링될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 구조-활성 상관 관계 (SAR)를 이용하여 구성 성분 및 화합물의 측기를 형태적 유사체로 변형시킬 수도 있다. SAR은 생물학적 활성의 추가의 프로파일링을 위해 각각의 활성 화합물의 충분한 양을 제공하는 것을 목표로 한다. 구조는 주로 질량 분석법 및 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance) 데이터에 근거하여 결정될 수도 있다.
화학작용제, 중간물 및 유사체의 단리 및 정제는, 필요한 경우, 어떠한 적합한 분리 또는 정제 과정, 예를 들어, 여과, 추출, 결정화, 컬럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 원심 크로마토그래피, HPLC, 또는 이 과정들의 조합에 의해 달성된다. 적합한 합성 및 단리 과정의 구체적인 예시는 본원에서 기술된 특허들에서 발견될 수 있으며 이것들은 그 전문이 참고로 포함된다.
제조 공정에 합성 화합물을 첨가하는데 있어서 문제점은 분해 생성물, 예를 들어, 대사산물의 독성에 대한 가능성이다. 분해 생성물은 숙주 세포에서 그것의 생체 변환(biotransformation), 예를 들어, 산화, 환원에 의해 더 극성인 분자로의 생체 변환의 결과로서 생성된 화합물의 대사산물일 수 있다. 분해 생성물은 분자량, 가용성의 정도, 및 분자 구조 또는 조성과 같은 방법으로 원래의 화합물과는 다를 수도 있다. 분해 생성물은 제조 공정의 대상이기 때문에, 이 분해 생성물들은 다운스트림 공정에서 특히 문제가 되는 허용 불가능한 수준으로 농축되는 것이 가능하다.
화학작용제, 대사산물, 또는 이것들의 유사체의 클리어런스에 대한 검정은 근본적으로 본원에서 기술된 바와 같이 달성될 수도 있다. 대사산물의 정량 또는 확인을 위한 검정은 HPLC, TLC, 전기화학 분석, 질량 분석법, 굴절률 분광법, 자외선 분광법, 형광 분석, 방사선화학 분석, 근적외 분광법, 핵 자기 공명 분광법, 광 산란 분석 및 업계에 공지되어 있는 다른 방법을 포함하는 표준 분석 방법을 사용하는 광의 업계의 당업자에게 공지되어 있다.
한 양태에서, 본 발명에서 사용된 화학작용제는 인플루엔자 HA 항원의 가공, 정제 또는 농축 중에 실질적으로 대사되거나 분해되지 않는다. 극미량의 비대사된 화합물은 질량 분석법에 의해 측정된 바와 같이 인플루엔자 바이러스 정제 후에도 남아있을 수 있으며, 전형적으로는 정제 공정 후 원래의 투입량의 0.25% 미만이 남아있다.
배지 또는 생성물에 존재하는 대사산물의 수준은 모체 화합물의 적어도 하나의 테스트된 활성 또는 선택된 화학작용제의 투입량의, 예를 들어, 약 1% 이상, 2%, 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상을 초과해서는 안 된다.
한 양태에서, 화학작용제는 정제된 샘플에서 검출되지 않는다. 화학작용제는 약 0.5 ng/ml 순수 용제 (50% 아세토니트릴)의 검출 한계 (LOD)에서 본원에서 예시된 바와 같이 추적될 수 있다. 바람직하게는, 정제된 샘플에 존재할 수도 있는 어떠한 화학작용제도 세포 배양물 상층액에서, 더 바람직하게는 정제된 샘플, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 또는 항원의 1가 벌크를 포함하는 모노벌크(모노벌크)인 최종 생성물에서 0.5 ng/ml 이하로 검출된다.
스타틴 유사체
성장 인핸서로서 심바스타틴의 사용은 사전 기술되었다 (상기 참조). 하지만, 발명자들은 여러 다른 스타틴 화합물이 숙주 세포 시스템에서 생산된 생물학적 분자의 증가된 수율을 용이하게 한다는 것을 발견하였다. 이러한 스타틴 약제들은 낮은 스타틴 농도에서 적어도 2배 수율을 초래할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명에서 기술된 화학작용제는 놀랍게도 특히 낮은 농도에서 많은 인플루엔자 서브타입 및 균주에 널리 적용된다.
본 발명의 원리는 일반적으로 바람직하게는 심바스타틴을 제외한 많은 스타틴에 널리 적용 가능하다. 본 발명에서 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-보조효소-A 리덕타제 억제자 ("HMG-CoA 억제자")의 의미 및 정의는 HMG-CoA 리덕타제의 어떠한 선택적, 경쟁적 억제자, 일반적으로 콜레스테롤-저하 스타틴으로 불리는, HMG-CoA를 메발로네이트로 전환시키는 속도-제한 효소를 말한다.
스타틴은 특유의 구조를 공유하며, 방향족 또는 지환식 코어에 연결된 헵텐산 또는 헵탄산 모이어티 (유리 산, 염 또는 락톤)로 구성된다. 스타틴의 생물학적 활성은 그것들의 입체화학, 특히 상기 헵텐산 또는 헵탄산 모이어티의 비대칭 원자에서의 형태와 밀접하게 관련된다. 스타틴 및 이것들의 유사체는 상업적으로 이용 가능하고 HMG-CoA 리덕타제에 의한 콜레스테롤로의 메발로네이트의 전환을 억제하는데 널리 사용된다. 스타틴이 이 생물학적 경로를 통해 작용하는지를 결정하기 위한 검정은 미국 특허 4,231,938에서 개시된다.
스타틴은 두 개의 군으로 나누어질 수 있다: 발효-유래 및 합성. 자연 발생한 스타틴은 피티움 울티멈(Pythium ultimum), 모나쿠스 루버(Monacus ruber), 페니실리움 시트리넘(Penicillium citrinum), 페니실리움 브레비콤팩텀(Penicillium brevicompactum) 및 아스페르질루스 테레우스(아스페르질루스 terreus)로부터 분리된 균류 대사산물의 유도체 (ML-236B/컴팩틴/모노칼린 K)이지만, 나타난 바와 같이 그것들은 또한 합성에 의해서도 제조될 수 있다. 예로서, 스타틴은 아토르바스타틴, 메바스타틴 (또는 컴팩틴), 플루인도스타틴, 벨로스타틴, 플루바스타틴, 달바스타틴, 세리바스타틴, 펜토스타틴, 로수바스타틴, 로바스타틴 (예를 들어, 메비놀린), 피타바스타틴, 심바스타틴, 또는 이것의 유사체로부터 선택될 수도 있다.
스타틴 유도체는 문헌에서 잘 공지되어 있으며 The Peptides: Vol. 5, Analysis, Synthesis, Biology: Academic Press NY (1983); 및 US 4397786에서 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 생물학적 분자 및 생성물의 발현 및 수율을 증가시키는 다양한 스타틴 유사체, 특히 배양된 세포 및 난으로부터 생산된 인플루엔자 바이러스 생성물.
이러한 스타틴 및 이것들의 유사체 중 어느 것도 본 발명에서 사용될 수 있다.
식 1 - 플루바스타틴 및 관련 유사체
한 바람직한 양태에서, 본 발명은 숙주 세포 시스템, 예를 들어, 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 1의 화학작용제의 사용에 관한 것이다. 식 1은 다음 구조를 가지는 스타틴을 포함한다:
Figure pct00005
식 1
상기 식에서
R 및 Ro 중 하나는
Figure pct00006
이고
다른 하나는 비대칭 탄소 원자, C3-6 사이클로알킬 또는 페닐-(CH2)m-을 함유하지 않는 1차 또는 2차 C1-6 알킬이고, R4는 수소, C1- 3알킬, n-부틸, i-부틸, t-부틸, C1- 3알콕시, n-부톡시, i-부톡시, 트리플루오로메틸, 플루오로, 클로로, 페녹시 또는 벤질옥시이고, R5는 수소, C1- 3알킬, C1- 3알콕시, 트리플루오로메틸, 플루오로, 클로로, 페녹시 또는 벤질옥시이고, R5a는 수소, C1- 2알킬, C1- 2알콕시, 플루오로 또는 클로로이고, m은 1, 2 또는 3이며, 단 R4가 수소일 때 R5 및 R5a 둘 다는 수소여야 하고, R5가 수소일 때 R5a는 수소여야 하고, R4 및 R5 중 하나 이하는 트리플루오로메틸이고, R4 및 R5 중 하나 이하는 페녹시이고, R4 및 R5 중 하나 이하는 벤질옥시이고, R2는 수소, C1- 3알킬, n-부틸, i-부틸, t-부틸, C3-6 사이클로알킬, C1-3 알콕시, n-부톡시, i-부톡시, 트리플루오로메틸, 플루오로, 클로로, 페녹시 또는 벤질옥시이고, R3는 수소, C1- 3알킬, C1- 3알콕시, 트리플루오로메틸, 플루오로, 클로로, 페녹시 또는 벤질옥시이며, 단 R2가 수소일 때 R3는 수소여야 하고, R2 및 R3 중 하나 이하는 트리플루오로메틸이고, R2 및 R3 중 하나 이하는 페녹시이고, R2 및 R3 중 하나 이하는 벤질옥시이고, X는 -(CH2)n- 또는 -CH=CH-이고, n은 0, 1, 2 또는 3이고, Z는
Figure pct00007
또는
Figure pct00008
이고
R6는 수소 또는 C1- 3알킬이고, R7은 수소, C1- 3알킬, n-부틸, i-부틸, t-부틸, 벤질 또는 M이고, M은 약학적으로 허용 가능한 양이온이다.
Novartis Pharmaceuticals에 의해 상표명 LESCOL 하에 시판되는 플루바스타틴 나트륨은 미국 특허 5,354,772에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 식 1의 스타틴 유사체는 다음 구조를 가진 플루바스타틴 (C24H26FNO4 또는 (3R, 5S, 6E)-7-[3-(4-플루오로페닐)-1-(프로판-2-일)-1H-인돌-2-일]-3,4-디하이드록시헵트-6-에노익 산)이다:
Figure pct00009
.
증가된 세포 활성은 0.001μM - 10μM의 범위에서 플루바스타틴 또는 이것의 유사체의 최종 농도에 의해 얻어질 수도 있다. 비-제한적이지만 특정 바람직한 양태에서, 플루바스타틴의 최적의 최종 농도는 0.05μM 이하이다.
식 2 - 피타바스타틴 및 관련 유사체
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 숙주 세포 시스템, 예를 들어, 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 2의 화학작용제의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 식 2는 다음 구조를 가지는 스타틴을 포함한다:
Figure pct00010
식 2
상기 식에서 R 및 Ro의 각각은 독립적으로 C1-6 알킬 (1차, 2차 또는 3차), C3-7 사이클로알킬 또는 고리 A
Figure pct00011
이고
R1, R2, R3, R4 및 R5의 각각은 독립적으로 수소, C1- 4 알킬, C1-4 알콕시, 트리플루오로메틸, 플루오로, 클로로, 페녹시, 벤질옥시 또는 하이드록시이며; 단 R1 및 R2 중 하나 이하는 트리플루오로메틸이고, R1 및 R2 중 하나 이하는 페녹시이고, R1 및 R2 중 하나 이하는 벤질옥시이고, R1 및 R2 중 하나 이하는 하이드록시이고, R3 -R5 중 하나 이하는 트리플루오로메틸이고, R3-R5 중 하나 이하는 하이드록실이고:
X는 -(CH2)2― 또는 ―CH=CH― (씨스 및/또는 트랜스)이고:
Z는
Figure pct00012
또는
Figure pct00013
이고
Q는
Figure pct00014
또는
Figure pct00015
이며
단 X가 -CH=CH이고 및/또는 R6가 C1-3 알킬일 때만 Q는
Figure pct00016
일 수도 있고; R6는 수소 또는 C1-3 알킬이고; R7은 수소, R8 또는 M이고; R8은 생리학적으로 허용 가능한 및 가수분해 가능한 에스터 기이고; m은 약학적으로 허용 가능한 양이온이다.
Kowa Co에 의해 상표명 LIVALO 하에 시판되는 피타바스타틴 칼슘은, 다른 여러 곳 중에서, 다른 미국 특허 5,753,675에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 피타바사틴이 사용되며 (표 4에서 화합물 G로 도시됨), 다음 구조를 가지는 식 2의 스타틴 유사체 (C25H24FNO4 또는 (3R, 5S, 6E)-7-[2-사이클로프로필-4-(4-플루오로페닐)-퀴놀린-3-일)-3,5-디하이드록시헵트-6-에노익 산)이다:
Figure pct00017
.
증가된 세포 활성은 0.001 - 10 μM의 범위의 식 2의 유도체의 최종 농도로 얻어진다. 비-제한적이지만 특정 바람직한 구체예에서, 피타바스타틴의 최적의 최종 농도는 0.05 μM 이하이다. 본원에서 추가로 예시된 바와 같이, 예상 외로, 피타바스타틴 화합물은 50 nM보다 5 nM에서 단백질 생산 수율을 증가시키는데 더 효율적인 것으로 발견되었으며, 이것은 결국 500 nM보다 더 효율적이었다. 이것은 인간 사용을 위한 치료적 조성물의 제조에 특히 유리하다.
하지만, 본 발명은 단지 피타바스타틴 또는 플루바스타틴 약제에만 제한되지 않는다. 식 1 및 2의 유사체가 테스트되었으며 본 발명에 포함되는 놀라운 효과를 생산하였다. 이러한 유사체들은 하기 추가로 기술된 바와 같이 테스트되었다.
식 3 - 아토르바스타틴 및 관련 유사체
한 양태에서, 본 발명은 숙주 세포 시스템, 예를 들어, 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 3의 화학작용제의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 식 3은 다음 구조를 가진 스타틴 유사체를 포함한다:
Figure pct00018
식 3
상기 식에서 X는 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- 또는 -CH2CH(CH3)-이다.
R1은 1-나프틸; 2-나프틸; 사이클로헥실; 노르보르네닐; 2-, 3-, 또는 4-피리디닐; 페닐, 불소, 염소, 브롬, 하이드록실로 치환된 페닐; 트리플루오로메틸; 1 내지 4개의 탄소 원자의 알킬, 1 내지 4개의 탄소 원자의 알콕시, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자의 알카노일옥시이다. R5 및 R6가 독립적으로 수소; 1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬; 2-, 3-, 또는 4-피리디닐; 페닐; 불소, 염소, 브롬, 시아노, 트리플루오로메틸, 또는 3 내지 8개의 탄소 원자의 카르보알콕시로 치환된 페닐인 경우 R2 또는 R3는 -CONR5R6이고; R2 또는 R3 중 다른 하나는 수소; 1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬; 사이클로프로필; 사이클로부틸; 사이클로펜틸; 사이클로헥실; 페닐; 또는 불소, 염소, 브롬, 하이드록실로 치환된 페닐; 트리플루오로메틸; 1 내지 4개의 탄소 원자의 알킬, 1 내지 4개의 탄소 원자의 알콕시, 또는 2 내기 8개의 탄소 원자의 알카노일옥시이다. R4는 1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬; 사이클로프로필; 사이클로부틸; 사이클로펜틸; 사이클로헥실; 또는 트리플루오로메틸이다.
Pfizer에 의해 상표명 LIPITOR 하에 시판되는 아토르바스타틴 칼슘은 다른 여러 곳 중에서, 미국 특허 5,273,995에서와 같이 제조되고 미국 특허 5,273,995에서 기술된다. 특정 바람직한 구체예에서, 식 3의 스타틴 유사체는 다음 구조를 가지는 아토르바스타틴 (C33H34FN2O5; [R-(R*, R*)]-2-(4-플루오로페닐)-β, δ-디하이드록시-5-(1-메틸에틸)-3-페닐-4-[(페닐아미노)카르보닐]-1H피롤-1-헵탄산,칼슘 염 (2:1) 3수화물)이다:
Figure pct00019
.
식 4 - 세리바스타틴 및 관련 화합물
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 4의 화학작용제의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 식 4는 다음 구조를 가진 스타틴 유사체를 포함한다:
Figure pct00020
상기 식에서 A-B는 식 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-의 라디칼을 나타내고, Z는 식 -CH의 라디칼 또는 질소를 나타내고, R1, R2 및 R3는, 서로 독립적으로, 수소, 최대 6개의 탄소 원자를 가지고 말단 탄소 상에서 선택적으로 3-6개의 탄소 원자를 가진 포화 또는 불포화, 환식 탄화수소 라디칼에 의해 치환될 수도 있는 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 라디칼, 3-7개의 탄소 원자를 가지고 한 번 또는 두 번 포화되거나 불포화되는 환식 탄화수소 라디칼, 다음 기들: 할로겐, 트리플루오로메틸, 선택적으로 각각 최대 6개의 탄소 원자를 가진 알킬 또는 알케닐, 하이드록실, 1-6개의 탄소 원자를 가진 알콕시, 카르복실, 또는 알콕시 모이어티에서 1-6개의 탄소 원자를 가진 카르브알콕시와 핵에 1-3개의 동일하거나 다른 치환기를 가지고 있을 수 있는, 페닐, 퓨릴, 티에닐 또는 피리디닐을 포함하는 기로부터 선택된 방향족 라디칼을 나타내고, R4는 수소, 최대 5개의 탄소 원자를 가진 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소 라디칼, 핵이 할로겐에 의해 1-2번 치환될 수 있는 벤질 라디칼 또는 1-4개의 탄소 원자, 알칼리 금속 이온 또는 암모늄 이온 NR5R6R7R8을 가진 알킬 라디칼을 나타낸다 (여기에서 R5, R6, R7 및 R8은 동일하거나 다르고 수소, 1-4개의 탄소 원자를 가진 알킬 또는 1-4개의 탄소 원자를 가진 하이드록시알킬을 나타낸다).
Bayer에 의해 상표명 BAYCOL 하에 시판되는 세리바스타틴 나트륨은, 다른 여러 곳 중에서, 미국 특허 5,177,080에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 식 4의 스타틴 유사체는 다음 구조를 가지는 세리바스타틴 ([S-[R*, S*-(E)]]-7-[4-(4-플루오로페닐)-5-메톡시메틸)-2,6비스(1-메틸에틸)-3-피리디닐]-3,5-디하이드록시-6-헵테노에이트; C26H33FNO5Na)이다:
Figure pct00021
식 5 - 로바스타틴/메바스타틴 및 관련 화합물
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서, 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 5의 화학작용제의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 식 5는 다음 구조를 가진 스타틴 유사체를 포함한다:
Figure pct00022
식 5
상기 식에서 R은 수소 원자, 하이드록시 기 또는 2-메틸부티릴옥시 기 (-OCOCH(CH3)CH2CH3)이다.
Merck에 의해 상표명 MEVACOR로 시판되는 로바스타틴은, 다른 여러 곳 중에서, 미국 특허 4,231,938에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 식 5의 스타틴 유사체는 다음 구조를 가지는 로바스타틴 ([1S-[1α(R*),3α,7α,8α(2S*,4S*),8aα]]-1,2,3,7,8,8a-헥사하이드로-3,7-디메틸-8-[2-(테트라하이드로-4-하이드록시-6-옥소-2H-피란-2-일)에틸]-1-나프탈레닐 2-메틸부타노에이트; C24H36O5)이다:
Figure pct00023
.
또 다른 특정 바람직한 구체예에서, 식 5의 스타틴 유사체는 다음 구조를 가지는 메바스타틴 (1S, 7R, 8S, 8aR)-8-{2-[(2R, 4R)-4-하이드록시-6-옥소테트라하이드로-2H-피란-2-일]에틸}-7-메틸-1,2,3,7,8,8a-헥사하이드로나프탈렌-1-일 (2S)-2-메틸부타노에이트; C23H34O6)이다:
Figure pct00024
.
본 발명의 특정 구체예에서, 식 5의 유사체인 심바스타틴은 사용되지 않는다.
식 6 - 프라바스타틴 및 관련 화합물
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 6의 화학작용제의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 식 6은 다음 구조를 가지는 스타틴 유사체를 포함한다:
Figure pct00025
식 6
상기 식에서 R은 다음 구조의 기 및 고리-폐쇄 락톤, 이것들의 염 및 에스터를 나타낸다:
Figure pct00026
또는
Figure pct00027
.
Bristol-Myers-Squibb에 의해 상표명 PRAVACHOL 하에 시판되는 프라바스타틴 나트륨은, 다른 여러 곳 중에서, 미국 특허 4,346,227에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 식 6의 스타틴 유사체는 다음 구조를 가지는 프라바스타틴 (1-나프탈렌-헵탄산, 1,2,6,7,8,8a-헥사하이드로-β,δ,6-트리하이드록시-2-메틸-8-(2-메틸-1-옥소부톡시)-, 일나트륨 염, [1S[1α(βS*,δS*),2α,6α,8β(R*),8aα]; C23H35NaO7])이다.
Figure pct00028
식 7 - 로수바스타틴 및 관련 화합물
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 7의 화학작용제의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 식 7은 다음 구조를 가지는 스타틴 유사체를 포함한다:
Figure pct00029
식 7
상기 식에서 R1은 저급 알킬, 아릴, 또는 아랄킬이며, 이것들 각각은 하나 이상의 치환기를 가질 수도 있고; R2 및 R3 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 또는 아릴이고, 상기 저급 알킬 및 아릴 각각은 하나 이상의 치환기를 가질 수도 있고; R4는 수소, 저급 알킬, 또는 비-독성 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있는 양이온이고; X는 황, 산소, 또는 설포닐, 또는 치환기를 가질 수도 있는 이미노이고; 점선은 이중 결합, 또는 해당 고리-폐쇄 락톤의 존재 또는 부재를 나타낸다.
AstraZeneca에 의해 상표명 CRESTOR 하에 시판되는 로수바스타틴 나트륨은, 다른 여러 곳 중에서, 미국 특허 4,346,227에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 식 7의 스타틴 유사체는 하기 나타난 구조를 가지는 로수바스타틴 (비스[(E)-7-[4-(4-플루오로페닐)-6-아이소프로필-2-[메틸(메틸설포닐)아미노] 피리미딘-5-일](3R,5S)-3,5-디하이드록시헵트-6-에노익 산]; C22H27FN3O6S)2])이다.
본 발명은 숙주 세포에서 원하는 생물학적 생성물의 생산 수율을 향상시키는 방법을 더 포함하며, 숙주 세포의 메발로네이트 경로를 억제하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 메발로네이트 경로의 억제는 메발로네이트 그 자체의 직접적 또는 간접적 억제를 수반한다. 추가적으로 또는 대안으로, 메발로네이트 경로의 억제는 다운스트림 신호 전달 캐스케이드, 즉, 각각 단백질 프레닐화 및 콜레스테롤 생합성을 제어하는 경로를 억제하는 단계를 수반할 수도 있다. 도 9B에서 입증된 바와 같이, 특이적 효소 억제자 조합으로 메발로네이트 경로의 세 줄기 모두의 차단은 숙주 세포에서 단백질 수율에 대한 스타틴의 효과를 모방할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 경로에 촉매 작용하는 효소의 특이적 억제자, 예를 들어, 스쿠알렌 신타제 억제자 (예를 들어, 자라고즈산), 파르네실 트랜스퍼라제 억제자, 제라닐제라닐 트랜스퍼라제 억제자, 및 이것들의 어떠한 조합이 이용된다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포에서 생물제제의 제조시 사용을 위한 메발로네이트 경로의 하나 이상의 억제자를 제공한다. 본 발명은 또한 생물학적 생성물을 제조하는 방법을 제공하며, 숙주 세포의 메발로네이트 경로를 억제하는 단계를 포함하고, 억제는 숙주 세포와 단백질 프레닐화 및 콜레스테롤 합성에 수반된 효소의 하나 이상의 억제자를 접촉시키는 단계를 포함할 수도 있다. 본 발명은 이러한 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 생물학적 생성물을 포함한다.
Figure pct00030
비 스타틴 화합물
또한 숙주 세포에서 생물학적 분자의 수율을 증가시키는데 사용될 수 있는 비-스타틴 화합물이 본 발명에 포함된다. 일부 구체예에서, 본 발명을 수행하는데 적합한 비-스타틴 화합물은 세로토닌-관련 경로, 도파민-관련 경로, 또는 이것들의 조합을 통해 작용하는 약제이다. 일부 구체예에서, 적합한 화합물은 특정 G-단백질-커플링된 수용체를 조절하는 약제이다.
식 8 - 설폰아미드 , 이것의 유사체 및 5HT7의 다른 역작용제
한 양태에서 본 발명에서 유용한 화학작용제는 설폰아미드 유사체를 포함한다. 설폰아미드 유사체는 G-단백질-커플링된-수용체 (GPCR)의 역작용제, 구체적으로는 5HT7의 역작용제로서 확인되었다. 따라서, 본 발명은 또한 5HT7 수용체와 상호작용하거나 이것을 조절하는 화학작용제, 특히 5HT7의 역작용제으 L사용을 포함한다. 본 발명에 포함되는 5HT7의 다른 작용제는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 아릴피페라진- 및 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-기반 아릴설폰아미드 (Vermeulen, et al. (2004) Journal of Medicinal Chemistry, 47, 5451-5466), 5-하이드록시트립토판, 8-하이드록시-2-(디-n-프로필아미노)테트랄린 1-Br (8-OH DPAT) 및 5-카르복시-아미노트립타민 (5-CT) (Siddiqui, et al. (2007) Pharmacology Biochemistry and Behavior, 87, 386-392).
한 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 8의 화학작용제의 사용을 제공한다. 바람직하게는 식 8은 다음 구조를 가지는 설폰아미드 화합물을 포함한다:
Figure pct00031
식 8
상기 식에서 Ar은 선택적으로 치환된 일- 또는 이환식 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고; R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, 아릴 C1-6 알킬이거나 또는 그것들이 부착되는 질소와 함께 선택적으로 질소, 황 또는 산소로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환된 5- 내지 7-원자 헤테로환식 고리를 형성하며, 질소 원자는 수소, C1-6 알킬, 사이클로 C3-7 알킬, 또는 선택적으로 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 아릴 C1-6 알킬 기로 치환되고; R3는 수소 또는 C1-6 알킬이고; X는 산소, 황 또는 결합이고; n은 2 또는 3이고; m은 1 또는 2이다. C1-6알킬 기는, 단독으로든 또는 또 다른 기의 일부로서든, 직쇄 또는 분지형일 수도 있다. 방향족 및 헤테로방향족 기에 대한 선택적 치환기는 선택적으로 NR7R8, C2- 6알케닐, C2- 6알키닐, C1- 6알킬티오, 시아노, 나이트로, 할로겐, CF3, C2F5, NR7R8, CONR7R8, NR7COR8, S(O)p NR7R8, CHO, OCF3, SCF3, COR9, CH2 OR9, CO2 R9 또는 OR9로 치환된 C1-6 알킬을 포함하며 p는 1 또는 2이고 R7, R8 및 R9는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 아릴 C1-6 알킬이다. 하나 이상의 치환기가 존재할 수도 있으며 다수의 치환기의 경우에 이것들은 같거나 다를 수 있다.
적합하게는 Ar은 선택적으로 치환된 일- 또는 이환식 방향족 또는 헤테로방향족 고리이다. 바람직하게는 Ar은 선택적으로 치환된 나프틸, 페닐 또는 티에닐 기이다. 가장 바람직하게는 Ar은 하나 이상의 할로겐, 특히 2,3-디-브로모티에닐에 의해 치환된 나프틸, 페닐 또는 티에닐이다. R1 및 R2에서 헤테로환식 고리에 대한 선택적 치환기는 C1-6 알킬을 포함한다. 바람직하게는 R1 및 R2는 선택적으로 치환된 5- 내지 7-원자 헤테로환식 고리, 특히 선택적으로 치환된 6-원자 고리를 형성한다. 가장 바람직하게는 R1 및 R2는 하나 또는 두 개의 메틸 기로 선택적으로 치환된 피페리딘 고리를 형성하거나, 또는 R1 및 R2는 질소 상에서 선택적으로 치환된 아릴 고리로 치환된 피페라진 고리를 형성한다. 바람직하게는 R3는 수소이다.
바람직하게는 X는 결합이다. 바람직하게는 n 및 m은, X와 함께, 5- 또는 6-원자 고리의 일부를 형성하는 값을 가진다.
식 8의 바람직한 최적의 최종 농도는 1.0 μM 이하이다.
특히 바람직한 설폰아미드 유사체는 (C19H30N2S02)이며 미국 특허 6,265,408에서 기술된 바와 같이 제조될 수도 있고 다음 구조를 가진다:
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
.
비-제한 구체예는 표 4에서 화합물 E로서 도시되며, 이것은 세로토닌 5HT-2 및 5HT-7 수용체의 역작용제이다. 역작용제는 작용제와 같은 수용체에 결합하지만 상기 작용제와 상반되는 약학적 반응을 유도하는 약제이다. 따라서, 역작용제 반응에 대한 필수조건은 어떠한 리간드의 부재시에도 구성 (고유 또는 기저로도 알려져 있음) 수준 활성을 가져야 한다는 것이다. 이것은 기저 수준 이하로 활성을 감소시킨다는 것을 의미한다.
리간드 결합시 5HT7 수용체는 아데닐릴 사이클라제 (AC) 활성을 통한 세포 내 cAMP의 증가를 통해 신호를 전달하는 것으로 공지되어 있다. 실시예 13에서의 발견 (도 15)은 생산 수율 향상이 5HT7 수용체의 리간드-중재 활성의 감소에 의존적이라고 제안하는데, 향상 효과가 수용체로의 결합에 대하여 억제자와 경쟁해야 하는 세로토닌 (5HT)의 존재에 의해 폐지될 수 있기 때문이다.
식 9 - 트로파놀 에스터, 이것의 유사체 및 자가 수용체의 다른 억제자
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 9의 화학작용제의 사용을 제공한다. 분자의 이 분류는 시냅스 전 자가 수용체의 억제자로서 확인되었고 콜린 억제제로서 작용한다. 따라서, 본 발명은 7-(4-[4-(2,3-디클로로페닐)-1-피페라지닐]부틸옥시)-3,4-디하이드로-2 (1H)-퀴놀리논 (Kikuchi, et al. (1995) The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 274, 329-336) 및 (-)-3-(3-하이드록시페닐)-N-프로필피페리딘 [(-)-3-PPP] (Thorberg, et al. (1987) Journal of Medicinal Chemistry, 30, 2008-2012)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 콜린성 시냅스 상에서 시냅스 전 자가 수용체 및 다른 시냅스 전 헤테로수용체를 조절하는 화학작용제의 사용을 포함한다. 본 발명에 포함된 콜린 억제제는 네오스티그민, 글리코피로늄, 피소스티그민 및 피리도스티그민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. (Nair, et al. (2004) Continuing Education in Anaesthesia, Critical Care & Pain, 4, 164-168).
바람직하게는 식 9는 다음 식을 가지는 트로파닐 유사체를 포함한다:
Figure pct00034
식 9
상기 식에서 Ar은 페닐 또는 베타-나프틸, 또는 두 개의 질소 중 하나를 함유하는 방향족 헤테로환식 6-원자 고리이고; R1은 Ar 핵의 하나 이상의 치환기이고; 바람직하게는 파라(para) 위치에 있고, H, CH3, CH2-CH(CH3)2, O-CH3, Cl, F, Br, CF3, NH2, S-CH3, CN, NO2로 구성된 군으로부터 선택되고; R2=H, CH3, C2H5, CH(CH3)2이고; R3는
Figure pct00035
이고;
R4는 H, CH3, C2H5이고; R5는 H, CH3이고; X는 없거나, O, S, NH, NCH3, -CH=CH-, -C=C-이고; Y는 O, NH이다.
식 9의 바람직한 트로파닐 유사체는 (C18H25NO2S)이며, 다른 여러 곳 중에서, WO 94/01435에서 기술된 바와 같이 제조될 수도 있고, 다음 구조를 가진다:
Figure pct00036
또는
Figure pct00037
식 10 - 벤지오티아졸 , 이것의 유사체 및 다른 도파민, 5HT2A 및 5HT1A 결합제
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 10의 화학작용제의 사용을 제공한다. 분자의 이 분류는 신경 이완 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명은 도파민 D2 및 세로토닌 5HT2A 및 5HT1A 수용체에 대한 친화도를 가지는 화학작용제를 포함한다 (Hrib, et al, J.Med.Chem, 22; 37(15):2308-2314 (1994)). 본 발명에 포함된 다른 도파민, 5HT2A 및 5HT1A 결합제는 클로자핀, 할로페리돌, 및 수산화된 디벤자제신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (Hamacher, et al., (2006) BMC Pharmacology, 6, 11).
바람직하게는 식 10은 다음 식을 가지는 벤지오티아졸 및 벤지속사졸 유사체를 포함한다:
Figure pct00038
식 10
상기 식에서 R은 다음을 나타내고:
Figure pct00039
상기 식에서 n은 3 또는 4이고, R1 및 R2는 독립적으로 1 내지 4개의 탄소 원자의 저급 알킬이고, Y는 산소 또는 황이고, Z는 수소 또는 할로겐, 또는 이것들의 약학적으로 허용 가능한 비-독성 산 부가 염이다.
한 양태에서, 식 10의 유사체는 (C24H32N4O2S)이며, 다른 여러 곳 중에서, DE3247530에서 기술된 바와 같이 제조될 수도 있고, 다음 구조를 가진다:
Figure pct00040
.
식 11 - 벤지피란 , 이것의 유사체 및 다른 항부정맥제
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 11의 화학작용제의 사용을 제공한다. 분자의 이 분류는 항부정맥 활성을 가진 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명은 리도카인, 디페닐단토인, 퀴니딘, 프로카인아미드, 플레카이니드, 베타 차단제, 베라파밀, 디지탈리스, 브레틸리움, 이부틸리드, 소탈롤, 아미오다론, 도페틸리드를 포함하는 분류 I, 분류 II, 분류 III 또는 분류 IV 항부정맥 활성을 가진 화학작용제를 포함한다. (Kowey, et al. (2000) American Heart Journal, 140, 12-20).
바람직하게는 식 11은 다음 식을 가지는 벤조피란 유사체를 포함한다:
Figure pct00041
식 11
상기 식에서 R1은 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 나이트로, 아미노 또는 알킬설폰아미도, 비스(알킬설포닐)아미노, 또는 아실아미노이고, X는 질소 또는 >CH- 라디칼을 나타내고, R은 다음 식의 라디칼이다:
Figure pct00042
상기 식에서 X가 질소, 카르보닐일 때, A는 단일 결합, 메틸렌이고, 동일하거나 다른 R2 및 R3는 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 나이트로, 아미노, 알킬설폰아미도, 비스(알킬설포닐)아미노, 아실아미노, 설파모일 또는 시아노이거나, 또는 R2 및 R3는, 그것들이 인접할 때, 함께 메틸렌디옥시 또는 에틸렌디옥시 라디칼을 형성하거나, 또는 R은, X가 >CH-를 나타낼 때, 피리딜 또는 2(2H)-벤지미다졸로닐이고, 동일한 R' 및 R"는 수소 또는 알킬, 및 그것들의 염이다.
식 11의 유사체는 (C24H31NO3)이며, 다른 여러 곳 중에서, EP300908에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있고, 다음 구조를 가진다:
Figure pct00043
.
식 12 - 테트라하이드로피리딘 , 이것의 유사체 및 MAO의 다른 억제자
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 12의 화학작용제의 사용을 제공한다. 분자의 이 분류는 우울증(mental depression)의 치료에 있어서 치료적 이점을 보유하는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명은 모노아민 옥시다제 (MAO)를 억제하거나 테트라베나진의 작용에 길항 작용하거나, 또는 뇌에서 도파민 작용성 및 세로토닌 작용성 시스템을 표적화하는 화학작용제의 사용을 포함한다 (Mattson, Doctorates Thesis, Gothenborg University, ISBN: 978-628-8741-4 (2013)). 본 발명에 포함된 다른 MAO 억제자는 옥사디아졸론, 테트라졸, 옥사디아지논, 인데노피리다진 유도체, 및 (1H)-피라졸 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. (Chimenti, et al. (2006) Chemical Biology & Drug Design, 67, 206-214).
바람직하게는 식 12는 다음 식을 가진 테트라하이드로피리딘 및 피페리딘 유사체를 포함한다:
Figure pct00044
식 12
상기 식에서 R1은 수소, 1-4개의 탄소 원자를 함유하고 하이드록실 또는 옥소 라디칼로 치환될 수도 있는 알킬 기, 각각 3 또는 4개의 탄소 원자를 함유하는 알케닐 또는 알키닐 기, 4 내지 7개의 탄소 원자를 함유하는 사이클로알킬메틸 기, 또는 벤질 기를 나타내며 페닐 라디칼은 많아도 3개의 치환기에서 각각 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 및 알콕시 기로 구성된 기로 치환될 수도 있지만, A가 에틸렌 라디칼을 나타내고 B가 메틸렌 라디칼을 나타내는 경우에 R1은 메틸 기가 아니어야 하고 동시에 R2, R3, R4 및 R5 각각은 수소를 나타내고, R2는 수소 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 알킬을 나타내고, R3는 수소, 각각 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 또는 알콕시 기, 원자 번호 최대 35인 할로겐 또는 하이드록실 기를 나타내거나, 또는 R3 및 R4는 함께 트리메틸렌 또는 테트라메틸렌 라디칼 또는, 위에 융합된(fused-on) 벤젠 고리에 해당하는, 1,3-부타디에닐렌 라디칼을 나타내고, R5는 수소 또는 1-4개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 기를 나타내고, A는 에틸렌 또는 메틸렌 라디칼 또는 직접적인 결합을 나타내고, B는 메틸렌, 에틸렌 또는 트리메틸렌 라디칼을 나타내고, A 및 B는 함께 3개의 탄소 원자를 항상 함유하고, X 및 Y는 각각 수소 원자를 나타내거나, 또는 그것들은 함께 추가적인 결합 및 무기 및 유기 산을 가진 이것들의 추가 염의 추가적인 결합에 반응한다.
식 12의 유사체는 (C15H19NO)이며, 다른 여러 곳 중에서, DE2408476에서 기술된 바와 같이 제조될 수도 있고, 다음 구조를 가진다:
Figure pct00045
.
식 13 - 디메톡시페닐 - 피페리딘메탄올 , 이것의 유사체.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 생성물, 특히 독감 백신의 제조를 위한 식 13의 화학작용제의 사용을 제공한다. 이러한 유사체들은 5HT2 길항제 및 항부정맥제로서 작용하는 것으로 기술되었다. 따라서, 본 발명은 리도카인, 디페닐단토인, 퀴니딘, 프로카인아미드, 플레카이니드, 베타 차단제, 베라파밀, 디지탈리스, 브레틸리움, 이부틸리드, 소탈롤, 아미오다론, 도페틸리드를 포함하는, 분류 I, 분류 II, 분류 III 또는 분류 IV 항부정맥 활성을 가진 화학작용제를 포함한다 (Kowey, et al. (2000) American Heart Journal, 140, 12-20).
바람직하게는 식 13의 유사체는 다음 식을 가진다:
Figure pct00046
식 13
상기 식에서 n은 2, 3 또는 4이고 각각의 R 및 R1은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, 할로겐, 트리플루오로메틸, 하이드록시, C1-6 알콕시, 또는 아미노를 나타내고, C1-6 알킬에 대한 R 및 R1 치환기는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, n-부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 사이클로프로필, 사이클로펜틸이며 메틸 및 에틸이 바람직하다. 모든 할로겐이 포함되며 플루오로 및 클로로가 바람직하다. 대표적인 C1-6 알콕시 치환기는 메톡시, 에톡시, 아이소프로폭시 및 산소를 통해 부착된 상기 언급된 알킬 기의 예이다. R 또는 R1이 수소 이외의 것인 경우, 치환기는 어떠한 위치 (오르쏘, 메타 또는 파라)에도 위치할 수 있지만 파라가 단일 치환된 페닐 모이어티에 대하여 바람직하다. 2,3-, 2,4-, 2,5-, 3,4-, 또는 3,5- 2치환된 페닐 모이어티가 본원에 포함된다.
한 양태에서 식 13의 유사체는 알파-(2,3-디메톡시페닐)-1-[2-(4-플루오로페닐)엔틸]-4-피페리딘메탄올 (C22H28NO3F)이며, 다른 여러 곳 중에서, 미국 특허 5,134,149에서 기술된 바와 같이 제조될 수도 있고, 다음 구조를 가진다:
Figure pct00047
.
본 발명은 숙주 세포에서 원하는 생물학적 분자를 생산하는데 있어서 유사한 약학적 활성을 가진 다른 약제의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 약제는 같은 또는 중첩 세포 신호 변환 경로(들)에 대하여 작용하는 것들을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 이러한 약제는 숙주 세포에서 특정 세포적 결과를 유발하도록 같은 또는 중첩 작용 메커니즘을 공유한다. 이러한 기작론적으로 동등한 약제는 서로 구조적으로 관련될 수도 있거나 그렇지 않을 수도 있다.
따라서, 본 발명은 숙주 세포에서 원하는 생물학적 생성물을 생산하거나, 이러한 생성물의 수율을 향상시키는 방법을 제공하며, 숙주 세포에서 단백질 생산을 향상시키기 위해 숙주 세포와 약제를 접촉시키는 단계를 포함하는데, 약제는 5HT7 수용체 신호 전달을 억제하는 약제, 하나 이상의 도파민 수용체 신호 전달을 억제하는 약제, 하나 이상의 히스타민 수용체의 역작용제인 약제, 이온 채널 (예를 들어, 나트륨 채널, 칼슘 채널, 등)을 차단하는 약제, cAMP 생산을 억제하는 약제, 히스타민 수용체 신호 전달을 억제하는 약제, 및 이것들의 어떠한 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 방법은 일반적으로 숙주 세포와 약제를 접촉시키는 단계; 약제의 존재 하에 적어도 일부가 수행되는, 일정 기간 동안 숙주 세포를 성장시키거나 배양하는 단계; 숙주 세포로부터 원하는 생물학적 생성물을 수확하는 단계, 선택적으로 생물학적 생성물을 추가로 정제하는 단계, 생물학적 생성물을 생물학적 생성물 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물로 제형화하는 단계, 선택적으로 약학적 조성물을 멸균 여과하는 단계, 멸균 약학적 조성물을 적합한 투약 형태로 포장하는 단계를 포함한다. 본원에서 기술된 방법에 의해 제조되는 약학적 조성물이 본 발명에 포함된다.
일부 구체예에서, 약제는 5HTR 신호 전달을 억제하는데, 약제는 수용체의 역작용제일 수 있다. 일부 구체예에서, 약제는 도파민 수용체(들)의 억제자일 수도 있다. 일부 구체예에서, 약제는 도파민 D1 및/또는 D2 길항제일 수 있다. 따라서, 생물제제를 포함하는 치료적 조성물의 제조를 위해 5HT7R의 역작용제로서 작용하는 약제의 사용이 본 발명에 포함된다.
이러한 약제의 예는, 제한 없이, 다음을 포함한다: SB-258719 (GSK로부터 이용 가능한 중성 5HT7R 길항제), SB-258741 ("AFZ"; GSK로부터 이용 가능한 부분적 5HT7R 역작용제), SB-269970 (GSK로부터 이용 가능한 강력한 5HT7R 역작용제), 리스페리돈 (D1 및 D2 도파민 수용체의 길항제 및 5HT7 세로토닌 수용체의 역작용제; 또한 H1 및 H2 히스타민 수용체의 역작용제), 세르틴돌 (D2, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT6, 5-HT7, D3, a1에 결합함); 지프라시돈 (D2, 5-HT2A, 5-HT1A, 5-HT1D, 5-HT2C, 5-HT7, D3, a1, NRI, SRI에 결합함); 록사핀 (D2, 5-HT2A, 5-HT6, 5-HT7, D1, D4, a1, M1, H1, NRI에 결합함); 조테핀 (D2, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT6, 5-HT7, D1, D3, D4, a1, H1, NRI에 결합함); 클로자핀 (D2, 5-HT2A, 5-HT1A, 5-HT3, 5-HT6, 5-HT7, D1, D3, D4, a1, a2, M1, H1에 결합함); 올란자핀 (D2, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT3, 5-HT6, D1, D3, D4, D5, a1, M1-5, H1에 결합함), 퀘티아핀 (D2, 5-HT2A, 5-HT6, 5-HT7, a1, a2, H1에 결합함); 프로메타진 (5HT2a/c 세로토닌 수용체 및 도파민 D2 수용체에 대한 친화도를 조절하기에는 약한 H1 히스타민 수용체의 강력한 길항제; 또한 Na+ 채널의 차단제). 특정 이온 채널 차단제가 또한 적합할 수도 있다. 예는 지질 수송 및 물질대사에 수반된 전위-의존적 Na+ 채널 및 콜린에스테라제의 억제자 및 차단제, 예를 들어, 디부카인 (부틴에스테라제 억제자); 전위-개폐 L형 칼슘 채널의 억제자 및 차단제 (예를 들어, 니모디핀); 나트륨 채널의 억제자 및 차단제, 예를 들어, 아프리딘 (분류 1b 항부정맥 막 안정화제), 아밀로라이드 (상피 나트륨 채널 ENaC의 직접적 차단제); 및 지연된 내향성 칼륨 채널(inward rectifier potassium channel) 및 L형 칼슘 채널의 억제자 및 차단제, 예를 들어, 이부틸리드 헤미푸마레이트 (분류 III 항부정맥제)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
숙주 세포의 치료
달리 지시되지 않으면, 본 발명에서 이용된 재조합 단백질, 세포 배양, 면역학적 및 미생물학적 기술은 표준 과정이며, 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 기술들은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hanes (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), 및 F.M. Ausubel et al, (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1996), 및 J.E. coligan et al., (editors) Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons (현재까지 모든 업데이트 내용이 포함됨)와 같은 출처의 문헌을 통해 기술되고 설명되며, 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 방법의 특징은 숙주 세포 시스템에서 생산된 생물학적 분자 또는 생성물의 개선된 수율의 효과이다. 본원에서 사용된 바와 같이 생물학적 분자의 수율은 발현, 분비 또는 생산에 적합한 조건 하에 생성된 숙주 세포, 바람직하게는 진핵세포 배양, 예를 들어, 식물, 조류 또는 포유류 세포 배양에 의해 생산된 회수 가능한 재조합에 의해 발현되는 생물학적 분자, 예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드, 항체 (예를 들어, 전장 또는 항원-결합 단편, 이것의 조작된 대응물, 이것의 인간화된 대응물, 등), 핵산, 바이러스, 효소, 바이러스 유사 입자의 총량을 말한다. 특히, 생물학적 분자는 원하는 생물학적 생성물, 예를 들어, 백신으로 추가로 가공될 수 있다.
증가된 수율은 전형적으로 밀리리터 단위의 부피 당 밀리그램 단위의 단백질 (mg/mL) 또는 리터 단위의 부피 당 그램 단위의 단백질 (g/L)로 측정된다.
증가된 수율은 또한 본 발명에서 사용된 화학작용제가 처리되지 않은 숙주 세포 시스템을 포함하는 대조군과 비교하여 본 발명에서 사용된 화학작용제에 노출된 해당 숙주 세포 시스템에 의해 생산된 생물학적 분자의 배수 증가로서 측정될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여, 발현된 생물학적 분자의 수준은 대조군에 의해 생산되는 양을 초과하여 약 2배 내지 최대 약 20배만큼 증가된다. 바람직한 구체예에서, 수율의 증가는 비교 대조군의 수율보다 적어도 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 6.5배, bout 7배, 약 7.5배, 약 8배, 약 8.5배, 약 9배, 약 9.5배, 또는 최대 약 10배 또는 그 이상이다.
대안의 양태에서, 수율의 어떠한 증가도 비교 대조군보다 더 큰 퍼센트 양으로서 측정될 수 있다. 예를 들어, 수율 또는 세포 생산성의 증가는 대조군과 비교하여 어떠한 측정된 파라미터에서도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500% 또는 그 이상의 증가를 포함할 수 있다.
하기 실시예에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 바람직한 양태는 배양 상층액에서 생산된 바이러스 입자 (vRNA 카피/ml), 감염성 입자 (IU/ml) 또는 바이러스 단백질 (μg/ml)의 증가된 양의 측정을 특징으로 한다. 측정의 한 유형에 있어서, HA 또는 NP 단백질의 증가는 숙주 세포 시스템에 의해 생산된 항원성 단백질의 수율을 증가시키는 화학작용제의 능력을 나타낸다. 세포 생산성의 증가는 또한 바이러스 입자, 감염성 바이러스 입자 또는 바이러스 단백질, 바람직하게는 HA 수율의 적어도 2배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 증가를 나타내는 파라미터의 측정을 특징으로 할 수도 있다.
수율의 측정은 바이러스 제조의 업스트림 공정 중에, 예를 들어, 바이러스 유전자 전사, 단백질 발현 또는 바이러스 입자 생산 또는 세포 배양물로부터의 방출 중에 행해질 수 있다. 재조합 시스템에서 생물학적 생성물의 검출을 위한 표준 방법은 측정된 생물학적 분자의 특성에 따라 사용될 수도 있다. 측정값은 숙주 세포 시스템의 생산성 및 능력을 나타낼 수도 있으며 예를 들어, 기술들, 예를 들어, 유동 세포 분석법 또는 면역 세포 화학법 (예를 들어, 조직-특이적 또는 세포-마커 특이적 항체로 세포의 염색)을 사용하여 형태의 변화 및 세포 표면 마커를 측정하는, 업계에 잘 공지된 방법에 의해, 광학 또는 공초점 현미경을 사용하는 세포의 형태의 검사에 의해, 또는 업계에 잘 공지되어 있는 기술, 예를 들어, PCR 및 유전자-발현 프로파일링을 사용하여 유전자 발현의 변화를 측정함으로써 달성될 수도 있다.
바람직한 양태에서, 바이러스 발현 생성물, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 생성물은 입자 생산, 감염성 입자 또는 항원성 단백질에 대하여 측정된다. 인플루엔자 바이러스 및 항원은 웨스턴 블롯, 면역 조직 화학적 방사선 면역검정, ELISA (효소 결합 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침강 검정, 침강소 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체 결합 검정, 면역방사 계측 검정, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정 및 FACS 분석과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 면역검정과 같은 기술들에 의해 측정될 수 있다.
바이러스 역가는 숙주 세포 시스템에서 병소 형성 검정 및 적혈구 응집 검정에 의해 측정될 수도 있다. 이 검정 기술들은 업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 방법은 숙주 세포 시스템, 예를 들어, 세포 배양물 또는 난에서 사용되도록 의도된다. 바람직한 양태에서, 세포 배양물은 약 200 마이크로리터 이상, 예를 들어, 약 1 밀리리터 이상의 세포 배양 부피로 적어도 하나의 화학작용제가 처리된다. 더 바람직하게는, 세포 배양 부피는 약 1 밀리리터 내지 10000 리터, 예를 들어, 약 2 밀리리터 내지 약 10000 리터이다. 일부 구체예에서, 적합한 생산의 배치 부피는 약 15 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 500 mL, 1 L, 5 L, 10 L, 15 L, 20 L, 30 L, 40 L, 50 L, 75 L, 100 L, 150 L, 200 L, 350 L, 300 L, 400 L, 500 L, 1,000 L, 2,000 L, 3,000 L, 4,000 L, 5,000 L, 또는 그 이상이다.
바람직한 양태에서, 세포는 바이러스의 복제 및 조립 또는 생물학적 생성물의 발현에 적합한 조건 하에 충분한 양의 화학작용제의 존재 하에 배양물에서 성장할 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 약 37℃ 이하의 온도에서, 바람직하게는 약 35℃와 같거나, 그 미만의 온도에서 배양될 수 있다. 전형적으로, 세포는 약 32℃ 내지 약 35℃의 온도에서 약제의 존재 하에 배양된다. 일부 구체예에서, 세포는 약 32℃ 내지 34℃, 예를 들어, 약 33℃의 온도에서 배양된다. 바람직한 양태에서, 본원에서 사용된 MDC 세포는 약 34℃에서 배양된다.
세포는 연구원에 의해 결정된 실험 조건에 따라 화학작용제와 접촉될 수 있다. 하기 실시예는, 특히 현탁 조건 하에서, 포유류 세포에 유용한 조건의 적어도 하나의 기능적 세트를 입증한다. 한 바람직한 양태에서, 숙주 세포를 접촉시키는 단계는 세포의 배양 또는 확장 중에 및 바이러스의 접종 이전에 또는 이것과 동시에 일어날 수도 있다.
숙주 세포에서 생물학적 분자의 재조합 발현은 당업자에게 이용 가능한 표준 기술이다. 세포를 트랜스펙션하는 방법은 전기천공법 (유전자 전기 이동), 초음파 천공법, 광학 트랜스펙션, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 또는 바이러스 형질도입을 포함할 수도 있다. 흔히 사용되는 트랜스펙션 시약은, 예를 들어, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란 및 지질을 포함한다. 상세히 설명된 프로토콜의 예로서 많은 참조 텍스트, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9, Ausubel, et al. Eds., John Wiley and Sons, 1998이 이용 가능하다. 바이러스 또는 박테리아의 경우에서, 세포는 원하는 감염 다중도 (MOI)에서 감염되거나 접종된다. 트랜스펙션 및 감염은 본원에서 교체 가능하게 사용될 수도 있다.
화학작용제가 처리된 숙주 세포에 의해 생산된 생물학적 분자의 양은 바이러스의 접종 전에, 후에 또는 이와 동시에 측정될 수도 있다. 화학작용제 첨가의 시간을 둘러싼 세포막의 바이러스 감염의 반응의 모니터링은, 예를 들어, 세포로의 바이러스 진입, 영향을 받은 바이러스 게놈 DNA 및/또는 RNA의 수준, 바이러스 게놈 DNA의 RNA로의 전사의 수준, 발현된 하나 이상의 바이러스 단백질의 수준, 세포 내부에 형성된 바이러스 입자의 수, 및/또는 세포로 방출된 바이러스 입자의 수에 대한 이해를 제공할 수 있다. 어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, 화학작용제는 숙주 세포에서 바이러스 성장기에 대한 그것들의 효과를 발휘한다고 생각된다.
약제는 숙주 세포 또는 발현된 생물학적 분자의 수확 이전 일정 기간에, 수확과 동시에, 수확 이후 일정 기간에 숙주 세포를 함유하는 배지에 첨가될 수도 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 트랜스펙션 이전 또는 이후 또는 감염 후 0 내지 1시간, 0 내지 2시간, 0 내지 3시간, 0 내지 4시간, 0 내지 5시간, 0 내지 12시간, 0 내지 20시간, 0 내지 30시간, 0 내지 40시간, 0 내지 50시간, 0 내지 60시간의 시간 간격으로 화학작용제의 유효 농도와 접촉될 수 있다. 접촉 시간은 대조군과 비교하여 달성된 것의 적어도 2배인 수율의 수준을 달성하도록 최적화될 수도 있다. 놀랍게도, 본 발명에서 사용된 화학작용제는 짧은 기간 동안 숙주 세포와 접촉되어 있을 수도 있으며, 바람직하게는 세포는 전처리가 필요하지 않고 화학작용제는 바이러스와 동시에 첨가될 수도 있다.
숙주 세포 시스템에서 원하는 생물학적 분자의 향상된 생산을 돕는데 적합한 약제를 선택하는데 있어서, 한 바람직한 특징은 약제가 상대적으로 낮은 농도로 사용될 때 적어도 두 가지 이유로 생산량을 증가시키는데 효율적인 것일 수도 있다. 첫 번째로, 이러한 약제의 더 작은 양이 이러한 생성물의 상업적-규모 제조에 필요할 것이다. 두 번째로, 약학적, 기능성 식품 및 화장품 적용에 대하여, 최종 생성물은 순수한 형태이며, 오염물질 또는 불순물이 없는 것이 바람직하다. 제조 공정 중에 사용된 이러한 약제의 낮은 농도는 최종 생성물로부터 약제의 제거가 더 쉽다는 것을 의미한다. 원하는 생물학적 분자의 생산을 돕는데 적합한 약제에 대한 또 다른 바람직한 특징은 이러한 약제가 이미 승인된, 상업적으로 이용 가능한 제품이며, 이것의 안전성 프로파일이 잘 특성화되어 있다는 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 사용된 약제는 트랜스펙션의 시간에 충분한 농도로 존재한다. 조건은 생물학적 분자의 증가된 수율에 바람직한 파라미터를 달성하기 위해서 당업자에 의해 조정되고 최적화될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 바람직하게는, 원하는 생물학적 분자의 생산 또는 수율을 향상시키기에 효과적인 양은 인간 사용을 위해 상업적으로 실현 가능하고 안전하기에는 적다. 전형적으로, 유효량은 약제가 존재할 때 조제물의 총 부피, 예를 들어, 세포 배양물의 배치 부피 중 농도로 측정된다. 일부 구체예에서, 본원에서 사용된 적합한 약제의 유효량은 0.1 nM 내지 10 μM, 바람직하게는 5 μM 이하, 더 바람직하게는 1 μM 이하, 더 바람직하게는 100 nM 이하이다.
증가된 수율 또는 생산성을 나타내는 파라미터의 최적의 농도는 발현 시스템의 개개의 특성, 사용자의 요구사항, 및 주어진 실험 시나리오에서 어떠한 하나 이상의 발현 인핸서의 최적의 농도를 구성하는 것의 결정에 따라 달라질 수도 있으며 당업계의 기술 분야에서 통상의 지식 수준을 가진 당업자의 범위 내에 있다.
화학작용제의 조합, 예를 들어, 순차적으로 또는 칵테일로 첨가된 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개의 약제가 숙주 세포 시스템을 접촉시키는데 사용될 수도 있다는 것이 가능하다. 차후의 약제의 첨가는 처음 또는 이전 화합물의 첨가 후 0-1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간의 시간 간격으로 수행될 수 있다. 바이러스, 숙주 세포, 트랜스펙션 조건, 및 발현 생성물에 따라, 화학작용제 또는 화학작용제의 조합의 처리는 상승 ("시너지") 효과를 초래할 수도 있다. 예를 들어, 증가된 수율 이외에, 실제로 예상되는 효과를 넘어서는 다음 효과가 가능하다: 제조된 생물학적 생성물의 용량의 증가된 수, 제조에서 환자에게 약물의 전달까지의 감소된 시간, 치료되는 환자의 증가된 수, 증가된 단백질/항원 발현, 바이러스 입자의 증가된 방출, 증가된 바이러스 입자 생산을 도시하는 증가된 NP 검출, 바이러스 입자 상에서 증가된 HA항원 밀도, 생물학적 생성물을 생산하기 위한 화학작용제의 조합의 증가된 효능. 시너지 효과는 본원에서 기술된 바와 같이 적용 가능한 방법에 의해 검출될 수도 있다.
한 양태에서, 숙주 세포의 처리는 배지를 변화시킬 필요 없이 숙주 세포 시스템과 화학작용제의 상호작용을 허용하는 배지에서 행해질 수도 있다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 세포의 배양 및 트랜스펙션 둘 다가 바이러스의 접종 이전에 적어도 하나의 화학작용제의 존재 하에 행해질 수도 있는 배지를 포함한다.
숙주 세포가 처리되는 배지는 또한 아미노산, 비타민, 유기 및 무기 염, 당 및 다른 구성요소를 포함하는 많은 성분들을 포함할 수도 있으며, 각각의 성분은 시험관 내에서 포유류 상피 세포의 배양을 지원하는 양으로 존재한다.
일부 적용에 대하여, 숙주 세포에 의한 생물학적 분자의 더 빠른 성장 및 향상된 생산을 지원하기 위해서, 바람직하게는 까다로운 포유류 세포의 배양에 더 적합한 환경을 제공하기 위해서, 완전 배지의 영양분을 더 풍부하게 하는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 농후화를 달성하기 위해서, 하나 이상의 보충물이 선택적으로 본 발명의 기본 배지 또는 완전 배지에 첨가될 수도 있다. 본 배지에 유리하게 첨가될 수도 있는 보충물은 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, 성장 인자, 예를 들어, EGF, aFGF, bFGF, IGF-1, IGF-2, HB-EGF, KGF, HGF 등), 헤파린 (헤파린-결합 성장 인자, 예를 들어, FGF, HB-EGF, KGF 및 HGF를 안정화시키기 위해서) 및 동물 (예를 들어, HSA 또는 BSA), 효모 (예를 들어, 효모 추출물, 이스톨레이트 또는 효모 추출물 한외 여과물) 또는 식물 (예를 들어, 쌀 또는 콩 펩타이드)로부터 유래된 하나 이상의 펩타이드를 포함한다. 천연 또는 재조합에 의한 것일 수도 있는 사이토카인은, 예를 들어, Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.) 또는 R&D Systems, Inc. (Rochester, Minn)로부터 상업적으로 이용 가능하고 배양되는 특정 세포 유형에 대하여 제조사에 의해 권장되는 농도 (전형적으로 약 0.00001-10 mg/리터의 최종 농도)로 배지에 첨가될 수도 있다. 헤파린은, 예를 들어, Sigma (St. Louis, Mo.)로부터 상업적으로 이용 가능하고, 바람직하게는 약 1-500 U.S.P. 유닛/리터의 배지에서 최종 농도로 사용되는 돼지 점막 헤파린이다. 동물, 효모 및 식물 펩타이드는 상업적으로 얻어질 수도 있거나 (예를 들어, 동물 펩타이드에 대하여 Sigma로부터; 효모 펩타이드에 대하여 Difco, Norwell, Mass.로부터; 및 식물 펩타이드에 대하여 Quest International, Norwich, New York로부터), 또는 동시 계류중인, 공동 소유의 1996년 10월 10일에 출원된 미국 출원 번호 60/028,197에서 상세히 기술된 바와 같이 유래되고 본 배양 배지로 제형화될 수도 있으며, 이것의 개시물은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 실시에 특히 적합한 유형의 배지는 단백질 (예를 들어, 무혈청 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 또는 부착 인자, 영양 단백질, 예를 들어, 성장 인자, 또는 금속 이온 담체 단백질, 예를 들어, 트랜스페린, 세룰로플라스민, 등)이 전혀 없는 무단백질 배지 (가끔 "PFM 배지"로 불림)이다.
이상적으로는, 본 발명과 함께 사용에 대하여 고려되는 무혈청 및 무단백질 배지 둘 다는 추가로, 재조합 동물 DNA 또는 재조합 동물 단백질 DNA를 포함하는 어떠한 동물 유래 물질, 또는 동물 근원으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 어떠한 물질도 없을 것이다.
세포주 및 세포 배양
본 발명에 따르면, 어떠한 숙주 세포 시스템, 바람직하게는 진핵세포, 바람직하게는 포유류가 사용될 수 있다. 전형적으로 척추동물 숙주 세포는 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이, 등), 개, 새 (예를 들어, 암탉, 오리, 등), 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 설치류, 및 토끼의 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 바람직한 양태에서, 척추동물 세포는 발육란으로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 세포는 세포주이다. 전형적으로 배양된 세포는 백신 생산을 위한 WHO 요구사항에 따라 증명된다. 이러한 세포주를 증명하기 위한 요구사항은 가계도, 성장 특성, 면역학적 마커, 바이러스 민감성, 종양 형성 및 저장 조건 중 하나에 대한, 뿐만 아니라 동물, 난, 및 세포 배양에서의 테스트에 의한 특성화를 포함한다. 본 발명에 적합한 숙주 세포의 비-제한적 예는 진핵세포 세포, 예를 들어, 식물 세포, 포유류 세포, 조류 세포 (예를 들어, 오리 세포), 곤충 세포, 효모 세포, 등을 포함한다. 적합한 세포의 비-제한적 예는 다음을 포함한다: 1차 세포, 예를 들어, 1차 상피 세포 (예를 들어, 각질 형성 세포, 자궁 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 계통 확립 세포주(established cell line) 및 그것들의 균주 또는 유도체 (예를 들어, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK (NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CaCo-2, CapT 세포, CHO 세포, BeWo 세포, Chang 세포, Detroit 562 세포, FRllK-4, HEK-293, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS180 세포, LS174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, Clone M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, RD, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, 또는 이것들의 유도체), NS0 (쥐 골수종 세포), 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포 (예를 들어, EB66? 세포), 어떤 조직 또는 기관 (심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직 (뇌, 척수), 폐, 관 조직 (동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직 (림프선, 선양, 편도, 골수, 및 혈액), 비장을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)의 섬유아세포, 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주 (예를 들어, CHO 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증(citrullinemia) 세포, Dempsey 세포, Detroit 551 세포, Detroit 510 세포, Detroit 525 세포, Detroit 529 세포, Detroit 532 세포, Detroit 539 세포, Detroit 548 세포, Detroit 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl.sub.1 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, Vero 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C.sub.3H/IOTI/2 세포, HSDM1C3 세포, KLN2O5 세포, McCoy 세포, Mouse L 세포, 균주 2071 (Mouse L) 세포, L-M 균주 (Mouse L) 세포, L-MTK- (Mouse L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, Swiss/3T3 세포, 문착 세포, SIRC 세포, CII 세포, 및 Jensen 세포, 또는 이것들의 유도체)를 포함한다. 바람직하게는, 포유류 세포는 MDCK, 세포, 293 세포, PER-C6 세포, CHO 세포 또는 이것들의 유도체로 구성도니 군으로부터 선택된다.
주어진 동물 세포 유형에 대하여 최적의 평판 배양 및 배양 조건은 당업자에 의해 단지 일상적인 실험만을 사용하여 결정될 수 있다. 일상적인 단층 배양 조건에 대하여, 세포는 부착 인자 없이 배양 용기의 표면 상에 평판 배양될 수 있다. 대안으로, 용기는 천연, 재조합 또는 합성 부착 인자 또는 펩타이드 단편 (예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 등, 또는 이것들의 천연 또는 합성 단편)으로 사전 코팅될 수 있으며, 이것들은 예를 들어, Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.), R&D 시스템, Inc. (Rochester, Minn.), Genzyme (Cambridge, Mass.) 및 Sigma (St. Louis, Mo.)로부터 상업적으로 이용 가능하다. 분리된 세포는 또한 천연 또는 합성 3차원 지지 매트릭스, 예를 들어, 사전 형성된 콜라겐 겔 또는 합성 생폴리머 물질로 또는 이것들 위로 분주될 수 있다. 현탁 배양에 대하여, 세포는 전형적으로 배양 배지에 현탁되고 현탁액에서 세포의 배양을 용이하게 하는 배양 용기, 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flask), 관류 장치, 또는 바이오리액터(bioreactor)로 도입된다 (Freshney, R. I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, New York: Alan R. Liss, Inc., pp. 123-125 (1983) 참조). 이상적으로는, 배양 중에 배지 구성요소의 변성 및 세포의 전단을 방지하기 위해서 배지 및 현탁된 세포의 교반이 최소화될 것이다.
바람직한 양태에서, 인플루엔자 바이러스 생산용 세포는 혈청-함유 또는 무혈청 배지에서 배양될 수 있다. 일부 경우에서, 예를 들어, 정제된 바이러스의 제조를 위해서는, 무혈청 조건에서 세포를 키우는 것이 바람직하다. 세포는 소규모로, 예를 들어, 25 ml 미만의 배지, 배양 튜브 또는 플라스크에서, 또는 교반을 동반하는 큰 플라스크에서, 회전 병에서, 또는 플라스크, 병 또는 반응기 배양의 미소담체 비드 (예를 들어, DEAE-덱스트란 미소담체 비드, 예를 들어, Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; 스티렌 코폴리머-트리-메틸아민 비드, 예를 들어, Hillex, SoloHill, Ann Arbor) 상에서 배양될 수 있다. 미소담체 비드는 세포 배양물의 부피마다 부착 세포 성장을 위한 큰 표면적을 제공하는 작은 구체이다 (직경이 100-200 마이크론의 범위). 예를 들어, 배지의 단일 역가는 8000 평방 센티미터 이상의 성장 표면을 제공하는 2천만 개 이상의 미소담체 비드를 포함할 수 있다. 바이러스의 상업적 생산, 예를 들어, 백신 생산을 위해서는, 종종 바이오리액터 또는 발효기에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 바이오리액터, 예를 들어, Cyto3 바이오리액터 (Osmonics, Minnetonka, Minn.); NBS 바이오리액터 (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.); B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)의 실험실 및 상업적 규모의 바이오리액터는 1리터 이하 내지 100 리터 이상의 부피로 이용 가능하다.
바람직한 양태에 따르면, 숙주 세포는 화학작용제와의 접촉 이전에, 동시에 또는 이후에 바이러스와 접촉될 수도 있다. 바이러스로 포유류 세포를 감염시키기 위한 최적의 방법은 업계에 잘 공지되어 있으며 당업자에게 익숙할 것이다. 세포의 바이러스 감염은 다양한 방법으로 정량화될 수 있다. MOI는 감염되는 세포의 수에 대한 감염성 바이러스 입자의 비율이다. 따라서, 0.1의 MOI는 10개의 세포 모두에 대하여 평균 1개의 바이러스 입자의 접종을 초래한다. MOI 배후의 일반적인 이론은 배양물에 존재하는 모든 숙주 세포에 하나의 감염성 바이러스 입자를 도입하는 것이다. 하지만, 하나 이상의 바이러스는 같은 세포를 감염시킬 수도 있으며 이것은 감염되지 않은 세포의 퍼센트를 남겨둔다. 이 발생은 모든 세포가 감염된다는 것을 보장하기 위해서 더 높은 MOI를 사용함으로써 감소될 수 있다. 그러므로 제공된 바이러스 입자는, 본원에서 기술된 바와 같이, 0.001 내지 100, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100의 MOI로 세포에 투여될 수 있다.
약제의 존재 하에 현탁액에서 배양된 바이러스-감염된 포유류 세포는 후보 화합물과 접촉되지 않은 상기 세포들보다 더 높은 바이러스 역가 (예를 들어, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 25-, 50-, 100-, 250-, 500-, 또는 1000배 더 높은 역가)를 생산할 것으로 예상될 수도 있다. 이러한 방법들은 레트로바이러스(retrovirus) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 포유류 바이러스 및 바이러스 벡터를 생산하는데 사용될 수도 있고, 가장 바람직하게는 인플루엔자 바이러스를 생산하는데 사용된다. 감염된 세포에 화학작용제의 처리 후, 바이러스, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 이것들의 구성요소 (단백질 및/또는 핵산 (DNA 및/또는 RNA))를 포함하는 사용된 배양 배지는 백신 생산, 세포 트랜스펙션 또는 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터의 생산, 동물 또는 세포 배양물의 감염, 바이러스 단백질 및/또는 핵산의 연구 등을 포함하는 다양한 목적을 위해 사용될 수도 있다. 대안으로, 바이러스, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 이것들의 구성요소는 당업자에게 익숙한 단백질 및/또는 핵산 분리용 기술에 따라 사용된 배양 배지로부터 선택적으로 분리될 수도 있다.
본 발명은 또한 포유류 세포, 특히 현탁액에서 키워진 포유류 세포로부터 재조합 단백질의 생산을 위한 방법에 사용될 수도 있다. 세포는 화학작용제와의 접촉 전에 유전적으로 조작될 수도 있거나, 또는 그것들은 하나 이상의 외인성 핵산 분자로 트랜스펙션되고 충분한 양의 화학작용제와 접촉될 수도 있다. 원하는 폴리펩타이드를 발현하기 위해 포유류 세포를 유전적으로 조작하기 위한 최적의 방법은 업계에 잘 공지되어 있고 그러므로 당업자에게 익숙할 것이다. 유전적으로 조작된 세포는 약제의 존재 하에 단층 배양으로서, 또는 더 바람직하게는 본원에서 기술된 방법에 따르는 현탁 배양으로서 배양될 수도 있다. 세포의 배양 후, 원하는 생물학적 분자는 선택적으로 당업자에게 익숙한 단백질 분리 기술에 따라 세포 및/또는 사용된 배양 배지로부터 정제될 수도 있다. 본 발명에 따르는 방법에 의해 생산된 생물학적 분자 또는 이것의 유도체의 분리 및 정제는 당업자에게 공지되어 있는 일반적인 방법에 의해 수행된다.
일반적으로, 단백질의 분리는 처음에는 그것들의 기원에 따른다. 세포 내 단백질과 세포 외 단백질이 구분된다. 단백질이 세포체 내에 위치한 경우, 먼저 세포를 파괴하는 것이 필요하며, 이것은, 예를 들어, 전단력 또는 삽투압 용해(osmolysis)에 의해 수행된다. 그 이후 불용성 물질, 예를 들어, 세포막 및 세포벽의 분리가, 예를 들어, 원심분리에 의해 수행된다. 원심분리는 기본적으로 세포, 세포 소기관 및 단백질의 분리에 사용된다. 분리 능력에 관하여 더 효율적인 방법은 펄스 전기영동(pulse electrophoresis)이다. 추가적으로, 다른 세포 구성요소의 분리 이후에, 여전히 다른 크기의 단백질, 펩타이드 및 아미노산을 분리할 필요가 있다. 단백질의 분리는 1차원 또는 2차원 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동에 의해 실행될 수도 있다. 아미노산 및 펩타이드의 분야에서, 예를 들어, 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (IEC), 또는 역상 크로마토그래피 (RPC)가 사용된다. 지질의 존재 및 프로테아제의 제거 또는 불활성화의 필요성은 정제에 관하여 불리한 점이다. 세포 외 매트릭스에 존재하는 단백질이 세포로부터 추출될 필요는 없지만, 모든 불용물의 분리 이후, 그것들은 고도로 희석되어 보통 세포 내 단백질보다 훨씬 더 작은 양으로 존재한다.
바이러스 가공
높은 역가로의 바이러스 복제를 허용하기에 적합한 기간 동안 숙주 세포를 배양한 후, 바이러스가 회수될 수 있다. 바이러스는 전형적으로 감염된 세포가 성장한 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 전형적으로 미정제(crude) 배지는 인플루엔자 바이러스의 농축 이전에 정화된다. 일반적인 방법은 여과, 한외 여과, 바륨 설페이트 상에 흡착 및 용출, 및 원심분리를 포함한다. 예를 들어, 감염된 배양물의 미정제 배지는 먼저, 예를 들어, 1000-2000xg로 세포 데브리(debris) 및 다른 큰 입자상 물질을 제거하기에 충분한 시간, 예를 들어, 10 내지 30분 동안 원심분리에 의해 정화될 수 있다. 대안으로, 배지는 온전한 세포 및 다른 큰 입자상 물질을 제거하기 위해 0.8 μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과된다. 선택적으로, 정화된 배지 상층액은 그 다음에 인플루엔자 바이러스를 펠릿화하기 위해, 예를 들어, 15,000xg로, 대략 3-5시간 동안 원심분리된다. 적절한 버퍼, 예를 들어, pH 7.4의 STE (0.01M Tris-HC1;0.15M NaCl; 0.0001M EDTA) 또는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)에서 바이러스 펠릿의 재현탁 후, 바이러스는 수크로스 (60%-12%) 또는 칼륨 타르트레이트 (50%-10%) 상에서 밀도 구배 원심분리에 의해 농축된다. 연속적 또는 단계적 구배, 예를 들어, 12% 내지 60%에서 4번의 12% 단계의 수크로스 구배가 적합하다. 구배는 회수를 위해 바이러스를 가시적인 밴드로 농축하기에 충분한 속도로, 및 시간 동안 원심분리된다. 대안으로, 및 대부분의 대규모 상업적 적용을 위해서, 바이러스는 연속적 방식으로 작동하는 띠 원심분리 회전자를 사용하여 밀도 구배로부터 용출된다. 조직 배양으로부터 인플루엔자 바이러스의 제조를 통해 기술 중 하나를 안내하기에 충분한 추가적인 상세한 설명은, 예를 들어, Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds) Textbook of lnfluenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151, 및 미국 특허 5,690,937, 미국 공개 출원 번호 20040265987, 20050266026 및 20050158342에서 제공되며, 이것들은 본원에 참고로 포함된다. 원하는 경우, 회수된 바이러스는 안정화제로서 수크로스-포스페이트-글루타메이트 (SPG)의 존재 하에 -80℃에서 저장될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 바이러스는 백신 조제물로 가공될 수 있다. 이러한 백신 조제물은 특히 바람직한 구체예인 다음 공정에 의해 얻어질 수 있다: 인플루엔자 바이러스 백신은 다음과 같이 제조될 수 있다: 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, MDCK 현탁 세포는 세포 배양물에서 성장한다 (WO97/037000). 바이러스는 0.45 마이크로미터 여과 및 CS 크로마토그래피로 수확, 정제 및 농축된다. 세제 (예를 들어 tween 80)의 첨가 후, 바이러스 조제물에 BPL이 처리된다. 그 이후 바이러스는 CTAB로 분할된다. 초원심분리 및 흡착 단계 이후 바이러스 단백질 조제물은 레진으로서 TMAE 또는 Sartobind Q를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피를 거친다. 크로마토그래피는 나트륨 카프릴레이트 (Sartobind에 대하여 약 50mM; TMAE에 대하여 100mM) 및 나트륨 클로라이드 (Sartobind에 대하여 400 mM; 및 TMAE에 대하여 200mM)의 존재 하에 행해질 수도 있다. 이온 교환 크로마토그래피와 결합하여 세제의 사용 전에, 단편화된 잔류 DNA의 일부는 Onions et al, Biologicals 2010 (38) 544-551에서 기술된 바와 같이 CTAB와 유사한 양이온성 세제를 이용한 침전에 의해 제거될 수 있다. 본 발명은 공정의 일부로서 적용될 수 있다.
그 이후 단백질 조제물은 한외 여과에 따라 농축된다. 단백질은 선택적으로 다른 바이러스 조제물과 혼합될 수도 있으며 (3가- 또는 4가 계절성 백신의 경우에), 선택적으로 멸균 여과, 충전 및 포장될 수도 있다. 본 발명의 일부는 이 공정에 의해 얻을 수 있는 인플루엔자 백신을 포함한다.
검정
한 예에서, 화학작용제에 노출된 숙주 세포의 세포 생산성의 분석은 세포 생산성의 결정, 예를 들어, 적어도 하나의 발현 생성물의 측정을 수반할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 세포 생산성은 특정 성장 조건 하에서, 재조합으로 발현된 단백질 (예를 들어, 폴리펩타이드, 항체, 등) 또는 단위 시간 당 세포에 의해 생산된 입자의 총량을 말한다.
세포 생산성은 또한 약제의 부재시 해당 대조군과 비교하여 화학작용제의 존재 하에 생물학적 성성물의 성질의 변화 또는 세포 표현형의 확인에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는 이 방법에서 발현 생성물 또는 생물학적 생성물은 바이러스 입자, 핵산 또는 단백질의 생산을 측정한다.
특정 양태에서, 생물학적 분자의 직접적인 측정은 표준 플라크 검정보다 더 정확하다.
바람직한 예에서, 발현 생성물은 ELISA 및 당업자에게 쉽게 이용 가능한 기술을 사용하여 측정된 HA 단백질이다. HA 단백질은 정제된 당단백질이거나 또는 바이러스 구성요소, 예를 들어, 분할 또는 전체 비리온 막에 결합될 수도 있다.
재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 합성을 측정하기 위해서, RNA 또는 DNA는 잘 공지된 방법, 예를 들어, 노던 블롯, 뿐만 아니라 고전적인 핵산 하이브리드화(hybridization) 기술을 이용하는 RT-PCT을 사용하여 측정될 수도 있다.
항원
항원은 그것이 면역 시스템의 활성화를 촉발시킬 수 있는지에 상관없이 면역 시스템의 구성요소에 의해 인식될 수 있는 어떠한 분자 (예를 들어, 핵산, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 당단백질, 당펩타이드, 탄수화물, 지질, 지질펩타이드, 다당류)도 될 수 있다.
항원은 병원체, 예를 들어, 백시니아(vaccinia), 조류폭스 바이러스(avipox virus), 칠면조 인플루엔자 바이러스(turkey influenza virus), 소 백혈병 바이러스(bovine leukemia virus), 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus), 조류 인플루엔자, 닭 폐 바이러스 감염증 바이러스(chicken pneumovirosis virus), 개 파르보바이러스(canine parvovirus), 말 인플루엔자(equine influenza), FHV, 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease virus; NDV), Chicken/Pennsylvania/1/83 인플루엔자 바이러스, 감염성 기관지염 바이러스(infectious bronchitis virus); 뎅기열 바이러스(Dengue virus), 홍역 바이러스(measles virus), 풍진 바이러스(Rubella virus), 가성 광견병(pseudorabies), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), HIV, SIV, EHV, BHV, HCMV, 한탄(Hantaan), 파상풍균(C. tetani), 볼거리(mumps), 모빌리바이러스(Morbillivirus), 1형 단순 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex virus type 1), 2형 단순 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex virus type 2), 인간 시토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus), E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus), 호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory Syncytial virus), 인간 유두종 바이러스(Human Papilloma virus), 인플루엔자 바이러스, 살모넬라(Salmonella), 네이세리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia), 클라미디아(Chlamydia), 보르데텔라(Bordetella), 말라리아원충(Plasmodium) (예를 들어, 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum) 및 삼일열말라리아원충(Plasmodium vivax)), 톡소플라스마(Toxoplasma), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 해모필루스(Haemophilus), 디프테리아(Diptheria), 파상풍(Tetanus), 백일해(Pertussis), 대장균(Escherichia), 칸디다(Candida), 아스페르질루스(Aspergillus), 엔트아메바(Entamoeba), 지아르디아(Giardia) 및 트리파나소마(Trypanasoma)와 연관될 수도 있다. 항원은 자연 발생 항원의 단편이나 일부 또는 자연 발생 항원이나 자연 발생 항원의 일부를 모방하는 합성 분자일 수 있다.
바람직한 양태에서, 어떠한 인플루엔자 바이러스 균주 또는 서브타입도 본 발명에 포함된다. 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스 균주는 인플루엔자 A 또는 B 바이러스 중 적어도 하나의 순환성 균주의 임상적 분리물에 해당한다. A형 바이러스는 원칙적으로 두 개의 바이러스 표면 당단백질, 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)를 기반으로 하는 항원성 서브타입으로 분류된다. 현재 16개의 HA 서브타입 (Hl 내지 H16으로 지정됨) 및 9개의 NA 서브타입 (N1 내지 N9)이 확인되었으며 이것들 모두는 야생형 물새에서 발견될 수 있다. HA 및 NA의 가능한 135개의 조합 중에서, 바이러스가 1933년에 처음으로 분리된 이후로 단지 4개 (H1N1, H1N2, H2N2, H5N1 및 H3N2)만이 인간 집단에서 널리 순환되었다.
본 발명의 방법은 생산하기 어려운 서브타입 및 균주의 생산에 있어서의 특별한 개선을 나타낸다. 예를 들어, 재배열 공정은 일반적으로 항원에 관련하여 충분히 구별되는 적합한 고수율 인플루엔자 B 공여체 균주의 결핍 때문에 인플루엔자 B 백신에는 사용되지 않는다. 인플루엔자 B 바이러스의 평가가 단지 HA 유전자로부터 얻어진 데이터만을 사용하여 측정되었기 때문에 아마도 공정으로서 재배열은 과소평가되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 본 발명 이전에는 달성할 수 없는 더 일정하고 덜 노동 집약적인 방식에서의 균주를 포함하는 B형 균주로부터 얻어진 항원성 단백질의 수율을 크게 개선한다. B형 균주는 수크로스 정제된 바이러스 배양물의 RP-HPLC에 의해 측정된 바와 같이 20 μg/ml, 30 μg/ml, 40 μg/ml, 50 μg/ml, 60 μg/ml 이상으로 생산될 수 있다. B형 항원의 수율은 균주 특이적이며 특정 균주는 일반적인 인플루엔자 균주 및 서브타입에서 볼 수 있는 평균 20 μg/ml 미만을 생산할 수도 있다는 것이 가능하다. 수율이 균주 또는 유형에 의존적인 경우에, 수율의 증가는 대조군 균주 또는 유형과 비교하여 결정될 수 있는 상대적인 측정값일 수도 있다.
인플루엔자 B 백신은 1가, 2가, 3가, 4가 또는 7가 백신의 일부일 수도 있으며, 이것들은 하나 이상의 서브타입 B 균주를 포함할 수도 있고 다른 균주들, 제한은 아니지만, 예를 들어, H1, H2, H3, H5, H7 및/또는 H9 균주의 조합을 포함할 수도 있다.
본 발명에 의해 생산된 서브타입 B 인플루엔자 바이러스의 적합한 균주는 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 B/Ann Arbor 1/86, 인플루엔자 바이러스 B/Harbin/7/94, 인플루엔자 바이러스 B/Hong Kong/5/72, 인플루엔자 바이러스 B/Lee/40, 인플루엔자 바이러스 B/Victoria group, 인플루엔자 바이러스 B/Yamagata 16/88, 인플루엔자 바이러스 B/Yamagata group, 인플루엔자 바이러스 B/Yamanashi/166/98, 인플루엔자 바이러스 B형/Panama 45/90을 포함한다.
특히 유리한 양태에서, 본 발명의 방법은 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Ireland/1378/83 (H5N8), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/England/63 (H7N3), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/England/66 (H6N2), A/Turkey/England/69 (H7N2), A/Turkey/Scotland/70 (H6N2); 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/England N28/73 (H5N2), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/England/110/77 (H6N2), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/England/647/77 (H1N1), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Ontario/7732/66 (H5N9), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/England/199/79 (H7N7), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Ontario/7732/66 (H5N9), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Ireland/1378/85 (H5N8), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/England/50-92/91 (H5N1), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Wisconsin/68 (H5N9), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Massachusetts/65 (H6N2), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Oregon/71 (H7N3), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Ontario/6228/67 (H8N4), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Wisconsin/66 (H9N2), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/England/647/77 (H1N1), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Ontario/6118/68 (H8N4), 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Tur/Ger 3/91, 칠면조 인플루엔자 바이러스 균주 A/Turkey/Minnesota/833/80 (H4N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Indonesia/03 (H5N1), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/FPV/Rostock/1934, 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Texas/298313/04, 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Texas/167280-4-/02, 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Hong Kong/220/97, 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Italy/8/98, 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Victoria/76 (H7N7), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Germany/79 (H7N7), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Scotland/59 (H5N1); 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Queretaro-19/95 (H5N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Queretaro-20/95 (H5N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Hong Kong/258/97 (H5N1), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Italy/1487/97 (H5N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Leipzig/79 (H7N7), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Victoria/185 (H7N7), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Victoria/92 (H7N3), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Queensland/95 (H7N3), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Pakistan/1369/95 (H7N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Pakistan/447-4/95 (H7N3), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/HK/G9/97 (H9N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Nakom-Patom/Thailand/CU-K2/2004(H5N1), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Hong Kong/31.2/2002 (H5N11), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Vietnam/C58/04 (H5N1), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Vietnam/38/2004(H5N1), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Alabama/7395/75 (H4N8), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Germany/N/49 (H100N7), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Beijing/1/94 (H9N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Hong Kong/G23/97 (H9N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Pennsylvania/8125/83 (H5N2), 닭 인플루엔자 바이러스 균주 A/Chicken/Hong Kong/97 (H5N1), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Anyang/AVL-1/01, 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/New York/17542-4/86 (H9N1), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Alberta/28/76 (H4N6), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Nanchang/4-165/2000 (H4N6), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Germany/49 (H10N7), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Black Duck/Australia/702/78 (H3N8), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Vietnam/11/2004 (H5N1), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Alberta/60/76 (H12N5), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Hong Kong/196/77 (H1), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Wisconsin/1938/80 (H1N1), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Bavaria/2/77 (H1N1N1), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Bavaria/1/77 (H1N1), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Australia/749/80 (H1N1), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Hong Kong/Y280/97 (H9N2), 오리 인플루엔자 바이러스 균주 A/Duck/Alberta/35/76 H1N1), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Mallard duck/Gurjev/263/82 (H14N5), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Mallard duck/PA/10218/84 (H5N2), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Mallard duck/Astrakhan/244/82 (H14N6), 거위 인플루엔자 바이러스 균주 A/Goose/Guangdong/1/96, 거위 인플루엔자 바이러스 균주 A/Goose/Leipzig/137-8/79 (H7N7), 거위 인플루엔자 바이러스 균주 A/Goose/Hong Kong/W222/97 (H6N7), 거위 인플루엔자 바이러스 균주 A/Goose/Leipzig/187-7/79 (H7N7), 거위 인플루엔자 바이러스 균주 A/Goose/Leipzig/192-7/79 (H7N7), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Env/HK/437-4/99, 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Env/HK/437-6/99, 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Env/HK/437-8/99, 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Env/HK/437-10/99, 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Fowl plague 바이러스 균주/Dutch/27 (H7N7), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Fowl plague 바이러스 균주/Dobson/27 (H7N7), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Fowl plague 바이러스 균주/Rostock/34 (H7N1), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Fowl plague 바이러스 균주/Egypt/45 (H7N1), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Fowl plague 바이러스 균주/Weybridge (H7N7), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Tem/South Africa/61 (H5N3), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Tern/Australia/G70C/75 (H11N9), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Quail/Vietnam/36/04(H5N1), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Gull/Maryland/704/77 (H13N6), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Black-headed gull/Sweden/5/99 (H16N3), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Herring gull/DE/677/88 (H2N8), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Swan/Italy/179/06 (H5N1), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Hong Kong/156/97 (A/HK/156/97), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Quail/HK/G1/97 (H9N2), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Quail/Hong Kong/AF157/93 (H9N2), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Teal/HK/W312/97 (H6N1), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Shearwater/West Australia/2576/79 (H15N9), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Shearwater/Australia/72 (H6N5), 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/Hong Kong/212/03, 조류 인플루엔자 바이러스 균주 A/England/321/77 (H3N2), 조류 기원의 조류 유행성 인플루엔자 A 바이러스, 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스, 조류 H7N1 인플루엔자 균주, 조류 H9N2 인플루엔자 바이러스, 및 조류 인플루엔자 바이러스, 저온-적응 (ca) 및 온도 민감성 (ts) 마스터 공여체 균주, A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 유행성 인플루엔자 균주의 수율을 향상시킨다.
인플루엔자 바이러스 백신은 인플루엔자 바이러스의 모든 단백질, 펩타이드 또는 이것들의 일부, 뿐만 아니라 이러한 단백질, 펩타이드 또는 이것들의 일부를 암호화하는 핵산, 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스 입자 그 자체, 인플루엔자 외피 단백질을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질, 바이러스 일부의 입자, 바이러스-유사 입자 (VLP), VLP-복합체, 및/또는 이것들의 일부를 포함할 수도 있으며, 이것들은 인플루엔자에 대한 면역화 목적을 위해 사용될 수도 있다.
비활성화된 인플루엔자 바이러스 백신은 전형적으로 공지된 방법, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 포르말린 또는 베타-프로피오락톤 처리를 사용하여 본 발명의 복제된 바이러스를 비활성화시킴으로써 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비활성화된 백신 유형은 전체-바이러스 (WV) 백신 또는 서브비리온 (SV) 바이러스 백신을 포함할 수 있다. WV 백신은 온전한, 비활성화된 바이러스를 함유하는 한편, SV 백신은 지질-함유 바이러스 외피를 가용화하는 세제로 붕괴된 후 이어서, 잔류 바이러스가 화학적으로 비활성화된 정제된 바이러스를 함유한다.
이에 더하여, 사용될 수 있는 백신은 분리된 HA 및 NA 표면 단백질을 함유하는 것들을 포함하며, 이것들은 표면 항원 백신으로 불린다. 일반적으로, SV 표면 항원 (즉, 정제된 HA 또는 NA) 백신에 대한 반응은 유사하다. 유행성 바이러스에 면역학적으로 관련된 NA 항원 및 무관한 HA를 함유하는 실험용 비활성화된 WV 백신은 통상적인 백신보다 덜 효율적인 것으로 나타난다. 관련된 표면 항원 둘 다를 함유하는 비활성화된 백신이 바람직하다.
복제된 바이러스를 사용하여 생, 약독화된 인플루엔자 바이러스 백신은 또한 공지된 방법 단계에 따라 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다: 약독화는 바람직하게는 공지된 방법에 따라 약독화된 공여체 바이러스에서 복제된 분리물 또는 재배열된 바이러스로 약독화 유전자를 이동시킴으로써 단일 단계에서 달성된다 (예를 들어, Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2:174-181 (1993) 참조). 인플루엔자 A 바이러스에 대한 저항성은 HA 및 NA 당단백질에 대한 면역 반응의 발달에 의해 중재되기 때문에, 이러한 표면 항원을 암호화하는 유전자는 재배열된 바이러스 또는 고성장 임상적 분리물에서 생산되어야 한다. 약독화 유전자는 약독화된 모체로부터 유래된다. 이 접근법에서, 약독화를 부여하는 유전자는 바람직하게는 HA 및 NA 당단백질을 암호화하지 않는다. 그렇지 않으면, 이 유전자들은 임상적 바이러스 분리물의 표면 항원을 함유하는 재배열체로 이동될 수 없다. 많은 공여체 바이러스가 인플루엔자 바이러스를 증식 가능하게 약독화하는 능력에 대하여 평가되었다. 비-제한적 예로서, A/Ann Arbor(AA)/6/60 (H2N2) 저온 적응 (ca) 공여체 바이러스는 약독화된 백신 생산에 사용될 수 있다 (예를 들어, Edwards, J. Infect. Dis. 169:68-76 (1994); Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2:174-181 (1993) 참조). 추가적으로, 생, 약독화된 재배열체 바이러스 백신은 공여체 바이러스와 본 발명의 독성 복제된 바이러스를 교배하여 생성될 수 있다. 재배열체 자손은 그 이후 H2N2 항혈청의 존재 하에, 25℃ (독성 바이러스의 복제에 대하여 제한적임)에서 선택되며, 이것은 약독화된 AI AAI6/60 (H2N2) ca 공여체 바이러스의 표면 항원을 함유하는 바이러스의 복제를 억제한다.
다른 약독화 돌연변이는 이 돌연변이 유전자들을 함유하는 감염성 바이러스를 구제하기 위한 부위-관련 돌연변이 생성에 의해 인플루엔자 바이러스 유전자로 도입될 수 있다. 약독화 돌연변이는 게놈의 비-암호화 영역뿐 아니라, 암호화 영역으로 도입될 수 있다. 이러한 약독화 돌연변이는 또한 HA 또는 NA 이외의 유전자, 예를 들어, PB2 폴리머라제 유전자로 도입될 수 있다 (Subbarao et al., J. Virol. 67:7223-7228 (1993)). 따라서, 부위-관련 돌연변이 생성에 의해 도입된 약독화 돌연변이를 함유하는 새로운 공여체 바이러스가 또한 생성될 수 있고, 이러한 새로운 공여체 바이러스는 AI AAI6/60 ca 공여체 바이러스에 대하여 상기 기술된 바와 유사한 방식으로 생 약독화된 재배열체 H1N1 및 H3N2 백신 후보물질의 생산에 사용될 수 있다. 유사하게, 다른 공지된 및 적합한 약독화된 공여체 균주는 포유동물의 백신접종에서의 사용에 적합한 약독화된 백신을 얻기 위해 본 발명의 복제된 인플루엔자 바이러스와 함께 재배열될 수 있다 (Ewami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3802-3805 (1990); Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5177-5181 (1991); Subbarao et al., J. Virol. 67:7223-7228 (1993); 미국 특허 출원 일련 번호 08/471,100, 이 참고문헌들은 전문이 참조로 포함된다).
백신 제형
접종 또는 비경구 또는 경구 투여에 적합한, 본 발명의 백신 조성물은 약독화된 또는 비활성화된 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 선택적으로 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 더 포함한다. 조성물은 업계에 공지된 바와 같이, 보제(auxiliary agent) 또는 부형제를 더 포함할 수 있다.
비경구 투여용 조제물은 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및/또는 에멸젼을 포함하며, 이것들은 업계에 공지된 보제 또는 부형제를 함유할 수도 있다. 비-수성 용용제의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브 오일, 및 주사 가능 유기 에스터, 예를 들어, 에틸 올레에이트이다.
담체 또는 폐쇄 드레싱(occlusive dressing)은 피부 투과성을 증가시키고 항원 흡수를 향상시키는데 사용될 수 있다. 경구 투여용 액체 투약 형태는 일반적으로 액체 투약 형태를 함유하는 리포솜 용액을 포함할 수도 있다. 리포솜의 현탁에 적합한 형태는 업계에서 흔히 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어, 정제수를 함유하는 에멀젼, 현탁액, 용액, 시럽, 및 엘릭서(elixir)를 포함한다. 불활성 희석제 외에, 이러한 조성물은 또한 보조제, 습윤제, 에멀젼화제 및 현탁화제, 또는 감미제, 향미제, 또는 방향제를 포함할 수 있다. 예를 들어, Berkow, 하기, Goodman, 하기, Avery's, 하기, Osol, 하기 및 Katzung, 하기를 참고하면 되고, 이것들은 그 전문이 본원에 참고로 포함되며, 본원에서 인용된 모든 참고문헌에 포함된다.
본 발명의 백신 조성물이 개체로의 투여에 사용될 때, 그것은 염, 버퍼, 보조제, 또는 조성물의 효능의 개선에 바람직한 다른 화합물을 더 포함할 수 있다.
보조제는 특이적 면역 반응을 증가시키는데 사용될 수 있는 화합물이다. 보통, 보조제 및 조성물은 면역 시스템으로 제공 이전에 혼합되거나, 또는 별도로, 하지만 면역화되는 포유동물의 같은 부위로 제공된다.
백신의 이질성은 적어도 두 개의 인플루엔자 바이러스 균주, 예를 들어, 2-50개 또는 그 안에 어떤 범위 또는 값의 균주에 대한 복제된 인플루엔자 바이러스를 혼합함으로써 제공될 수도 있다.
본 발며에 따르면, 백신은 업계에 공지된 기술을 사용하여, 인플루엔자 바이러스의 단일 균주의 변이 또는 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 균주에게 제공될 수 있다.
제조되면, 백신 조성물은 그것을 필요로 하는 대상체에 투여될 수도 있다. 전형적으로, 본 발명의 약독화된 또는 비활성화된 백신 조성물은 따라서 감염의 발병 이전에 (예상된 감염의 예방 또는 감쇠를 위해서) 또는 실제의 감염의 시작 이후에 제공될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 백신 조성물의 투여는 다양한 비경구 경로, 예를 들어, 피하, 정맥 내, 피 내, 근육 내, 복강 내, 비강 내, 경구 또는 경피 경로에 의해 이루어질 수도 있다. 비경구 투여는 시간이 흐름에 따라 볼루스 주사(bolus injection)에 의해 또는 시간이 흐름에 따르는 점진적 관류에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명의 백신 조성물의 바람직한 사용 방식은 근육 내 또는 피하 적용에 의한 것이다. 예를 들어, Berkow, 하기, Goodman, 하기, Avery, 하기 및 Katzung, 하기를 참고하면 되고, 이것들은 그 전문이 본원에 참고로 포함되며, 본원에서 인용된 모든 참고문헌을 포함한다.
백신 조성물은 유효량으로 대상체에게 투여된다. 백신 조성물의 유효량은 원하는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 수령체의 유효량은 나이, 성별, 건강, 및 체중, 존재하면, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과의 성질에 의존적일 것이라고 생각된다. 하기 제공된 유효량의 범위는 본 발명을 제한하려는 것은 아니며 바람직한 용량 범위를 나타낸다. 하지만, 가장 바람직한 투약량은 과도한 실험 없이, 당업자에 의해 이해되고 결정 가능한 바와 같이, 개개의 대상체에 맞춰질 것이다.
본 특허는 하기 특이적 구체예를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 숙주 세포 시스템을 표 1로부터 선택된 적어도 하나의 화학작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포 시스템으로부터 치료적, 예방적 또는 진단적 생물학적 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 숙주 세포는 세포 배양물 또는 발육란일 수 있다. 세포 배양물은 바람직하게는 MDCK, Vero, BHK, PERC6 또는 CHO의 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 생물학적 분자는 항체, 항체 단편, 또는 백신 항원, 특히 바이러스 항원, 특히 바람직하게는 독감 항원이다. 바람직한 구체예에서, 스타틴 또는 심바스타틴 이외의 스타틴 유사체가 화학작용제로서 사용된다. 바람직한 구체예에서, 이 비-심바스타틴 스타틴의 농도는 0.001 μM 내지 10 μM, 특히 바람직하게는 0.05 μM 이하이다. 바람직한 구체예에서, 하기 일반식의 화합물이 사용된다:
Figure pct00048
또는
Figure pct00049
특히 바람직한 구체예에서, 플루바스타틴, 피타바스타틴, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴 또는 로수바스타틴, 또는 이 화합물들의 유도체, 특히 플루바스타틴 또는 피타바스타틴 또는 유도체가 사용된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 생산된 생물학적 분자는, 예를 들어, 추가적인 농축, 정제, 여과, 제형화, 멸균 및 충전 단계에 의해 최종 멸균 생성물을 수득하기 위해 더 가공된다. 그래서 한 구체예에서, 본 특허는 숙주 세포의 치료적, 예방적 또는 진단적 생물학적 분자의 생산 방법에 관한 것이며, 숙주 세포를 표 1에서 기술된 화합물과 접촉시키는 단계, 생물학적 분자를 수득하는 단계 및 생물학적 분자를 최종 치료적, 예방적 또는 진단적 생성물로 가공하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 생성물은 인플루엔자 백신, 특히 인플루엔자 B 백신이다.
정의
용어 "숙주 세포"는 이종 기원 핵산, 예를 들어, 벡터를 함유하고, 핵산의 복제 및/또는 발현, 및 선택적으로 폴리펩타이드 및/또는 바이러스를 포함하는 하나 이상의 암호화된 생성물의 생산을 지원하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어, 대장균(E. coli), 또는 진핵세포, 예를 들어, 효모, 곤충, 양서류, 조류 또는 포유류 세포일 수 있으며, 인간 세포 및 발육란 내 세포를 포함한다. 용어 숙주 세포는 배양된 세포, 숙주 세포의 조합 또는 혼합물을 포함하며, 예를 들어, 다른 세포 유형 또는 세포주의 혼합된 배양물 (예를 들어, Vero 및 CEK 세포)을 포함한다.
"생물학적 분자", "생물학적 생성물"은 본원에서 사용된 바와 같이 생 유기체로부터 분리된 어떠한 분자뿐 아니라 이것들의 유도체, 돌연변이 또는 변이체 및/또는 생물학적 활성 단편을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 생물학적 분자 또는 생물학적 생성물은 생물 약제 또는 생물학적 치료제를 포함한다. 예를 들어, 생물학적 생성물은 단백질, 예를 들어, 항원, 효소 (예를 들어, 키나제, 프로테아제, 포스파타제, 트랜스퍼라제, 응고 인자, 등), 펩타이드, 항체, 수용체, 융합 단백질, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인 (예를 들어, 케모킨, 인터페론, 인터류킨, 림포킨, 종양 괴사 인자), 신경독소, 등일 수 있다. 생물학적 생성물은, 예를 들어, 백신, 바이러스 입자에서 사용되는 핵산, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 지질, 바이러스 또는 박테리아 단백질일 수 있다. 바람직하게는 생물학적 분자는 약학적 조제물, 예를 들어, 백신 또는 약품에서 활성 성분으로 사용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "생성물", "단백질" 및 생물학적 분자는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, 적합한 생물학적 분자는 분비된 단백질, 단백질의 단편 (예를 들어, 막관통 단백질의 세포 외 도메인), 키메라 단백질, 및/또는 태그된 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 재조합 단백질이다. 하나 이상의 태그는, 존재하는 경우, C-말단, N-말단 상에 있을 수도 있고, 및/또는 단백질 내에 (예를 들어, 두 개의 모듈의 사이에) 배치될 수도 있다. 일부 구체예에서, 이러한 재조합 단백질은 하나 이상의 신호 펩타이드 모이어티를 함유할 수도 있다. 일부 구체예에서, 이러한 재조합 단백질은 전구체 (예를 들어, 프로호르몬) 또는 이것의 대사산물의 형태일 수도 있다.
용어 "개선하다", "증가시키다" 또는 "향상시키다"는 해당 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 또는 생리학적으로 유의한 양을 말한다.
용어 "후보 화합물" 또는 "화학작용제"는 숙주 세포 시스템, 예를 들어, 세포 배양물 또는 난에서 생물학적 분자의 발현 또는 생산을 조절하는데 사용되는 어떠한 화학적 실체물, 약품, 약물, 등을 말한다. 본원에서 사용된 화학작용제는 또한 유사체 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및 이것들의 제형을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이성질체"는 같은 분자식을 가지고 있지만 원자의 배열 및 형태가 다른 상이한 화합물을 말한다. 또한 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "광학 이성질체" 또는 "입체이성질체"는 본 발명의 주어진 화합물에 대하여 존재할 수도 있는 다양한 입체이성질체의 형태 중 어느 것을 말하고 기하학적 이성질체를 포함한다. 치환기는 탄소 원자의 비대칭 중심에 부착될 수도 있다고 생각된다. 그러므로, 본 발명은 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 라세미 화합물을 포함한다. "거울상이성질체"는 서로의 비-중첩 가능한 거울상인 입체이성질체의 쌍이다. 거울상이성질체의 쌍의 1:1 혼합물은 "라세미" 혼합물이다. 용어는 적절한 경우 라세미 혼합물을 지정하는데 사용된다. "부분입체이성질체"는 적어도 두 개의 비대칭 원자를 가지고 있지만, 서로 거울상이 아닌 입체이성질체이다. 절대 입체화학은 Cahn-Ingold-Prelog R-S 시스템에 따라 명시된다. 화합물이 순수한 거울상이성질체일 때 각각의 비대칭 탄소에서 입체화학은 R 또는 S로 명시될 수도 있다. 절대 형태가 공지되어 있지 않은 분해된 화합물은 그것들이 나트륨 D 선의 파장에서 평면 편광을 회전시키는 방향 (덱스트로- 또는 좌선성)에 따라 (+) 또는 (-)로 지정될 수 있다. 본원에서 기술된 화합물 중 몇몇은 하나 이상의 비대칭 중심 또는 축을 함유하고 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 절대 입체화학에 관하여, (R)- 또는 (S)-로서 한정될 수도 있는 다른 입체이성질체 형태를 발생시킬 수도 있다. 본 발명은 라세미 혼합물, 광학적 순수형 및 중간 혼합물을 포함하는 이러한 가능한 이성질체 모두를 포함하는 것을 의미한다. 광학적 활성 (R)- 및 (S)-이성질체는 비대칭 신톤 또는 비대칭 시약을 사용하여 제조되거나, 통상적인 기술을 사용하여 분해될 수도 있다. 화합물이 이중 결합을 함유하면, 치환기는 E 또는 Z 형태일 수도 있다. 화합물이 2치환된 사이클로알킬을 함유하면, 사이클로알킬 치환기는 씨스- 또는 트랜스-형태를 가질 수도 있다. 모든 호변이성체가 또한 포함되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "프로드러그"는 생리학적 조건 하에 또는 가용매분해에 의해 명시된 화합물 또는 이러한 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염으로 전환될 수도 있는 화합물이다. 프로드러그는 아미노산 잔기, 또는 두 개 이상의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드 사슬이 유리 아미노, 하이드록시, 또는 카르복시산 기에 결합된 아미드 또는 에스터를 통해 공유 결합되는 화합물을 포함한다. 고려된 아미노산 잔기는 20개의 자연 발생 고리 아미노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 아미노산은 4-하이드록시프롤린, 하이드록시리신, 데모신, 아이소데모신, 3-메틸 히스티딘, 노르발린, β-알라닌, δ-아미노부티르산, 시트룰린, 호모시스테인, 호모세린, 오르니틴 및 메티오닌 설폰을 포함한다.
용어 "처리하다", "처리", "접촉", "~의 존재 하에"는 세포와 약제의 상호작용을 용이하게 하는 용액 또는 배지에서 화학작용제의 첨가 또는 혼합을 말한다. 용어 "처리하다" 또는 "처리"는 대상체 (예를 들어, 환자)로의 투여의 맥락에서 사용될 때 대상체에서 바람직한 결과를 발효하기 위한, 예를 들어, 집단에서 질병 또는 질환을 완화하거나, 치유하거나, 질병 또는 질환의 발병을 지연시키거나, 질병 또는 질환의 심각도를 감소시키거나, 질병 또는 질환의 발생을 예방하거나 질병 또는 질환의 발생 확률을 감소시키기 위한 치료적 및/또는 예방적 간섭 행위이다. 예를 들어, 본 발명은 약학적 조성물 (치료적 및/또는 예방적)을 제조하기 위해 수행될 수도 있으며, 이것은, 방법이 대상체에게 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 경우, 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량(effective amount)" 및 "유효량(effective dose)"은 그것의 의도된 목적(들), 즉, 허용 가능한 이익/위험 비율로 조직 또는 대상체에서 원하는 생물학적 또는 의약적 반응을 달성하기에 충분한 화합물 또는 조성물의 어떤 양 또는 용량을 말한다. 관련된 의도된 목적은 객관적 (즉, 몇몇 테스트 또는 마커에 의해 측정 가능함) 또는 주관적 (즉, 대상체는 효과에 대한 암시를 제공하거나 효과를 느낀다)일 수도 있다. 일부 구체예에서, 유효량은 특정 임상적 기준을 충족하는 대상체의 집단에게 투여될 때, 집단 중에서 통계적으로 유의한 반응이 얻어지는 양이다. 유효량은 보통 다회수 단위 용량을 포함할 수도 있는 주입 요법으로 투여된다. 어떤 특정 약품에 대해서, 유효량 (및/또는 효과적인 주입 요법 이내의 적절한 단위 용량)은 다른 약품과 조합시, 예를 들어, 투여 경로에 따라 다를 수도 있다. 일부 구체예에서, 유효량은 표적 집단에서 통계적으로 유의한 충분한 (예를 들어, 방어적) 면역 반응을 유도하는 양이다. 일부 구체예에서, 어떠한 특정 환자에 대한 특이적 유효량 (및/또는 단위 용량)은 다양한 인자에 의존할 수도 있으며 의학계에 잘 공지되어 있는 바와 같이 치료되는 장애 및 장애의 심각도; 이용되는 특이적 약품의 활성; 이용되는 특이적 조성물; 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식단; 투여 시시, 투여 경로, 및/또는 이용되는 특이적 약품의 배설 또는 물질대사의 속도; 처리 기간; 등의 인자를 포함한다. 일부 구체예에서, 유효량은, 특정 요법에 따라 투여될 때, 부작용이, 존재하는 경우, 환자가 요법을 계속하는데 있어서 충분히 용인 가능하도록, 합리적으로 허용 가능한 수준의 해로운 부작용과 함께 긍정적인 결과를 생산하는 양이다. 당업자들은 본 발명의 일부 구체예에서, 단위 투약량이 긍정적인 결과와 관련된 투약 요법의 맥락에서 투여에 적합한 양을 함유하는 경우 유효량을 함유하는 것으로 간주될 수도 있다고 인정할 것이다.
"집단" ("표적 집단"과 같음)은 특정 임상적 기준을 충족하는 개체 (예를 들어, 환자)의 군을 말할 수도 있다. 전형적으로, 통계적으로 유의한 생물학적 효과는 적어도 50명, 바람직하게는 그 이상의 개체 집단에서 관찰될 수도 있다. 집단은 나이로, 예를 들어, 노인 (예를 들어, 65살 이상); 소아 (예를 들어, 신생아, 영유아, 아동 2-12살, 3-6살, 2-7살, 또는 6-12살), 청소년 (예를 들어, 12-16살, 12-18살, 13-19살 또는 19-21살), 청년 (예를 들어, 17-24살), 성인 (예를 들어, 18-64살), 등으로 한정될 수도 있다. 추가적으로 또는 대안으로, 집단은 특정 질병(들)으로, 예를 들어, 억제된 면역력을 가진 사람들, 특정 질병의 병력이 있는 사람들, 특정 질병에 걸릴 위험이 더 높은 사람들, 특정 유전적 배경을 가진 사람들, 특정 질환 또는 장애로 진단된 사람들, 특정 치료 요법을 받고 있거나 받기로 예정된 사람들, 또는 이것들의 어떤 조합으로도 한정될 수 있다.
"대조군"은 실질적으로 동일한 테스트를 거치지만 화학작용제와 접촉되어 있지 않거나 DMSO가 처리되지 않은 숙주 세포(들) 또는 숙주 세포를 포함하는 시스템을 말한다. 대안으로, 대조군은 다른 화합물 또는 시스템이 비교되는 비교 작용제로서 사용되는 테스트 화합물을 말한다.
구절 화학작용제의 "저농도"는 본원에서 사용된 바와 같이 0.1 nM 내지 10 μM로의 화합물의 존재를 말한다. 저농도는 상대적인 양이고 본원에서 개시된 것보다 더 높은 농도를 포함할 수 있다. 적합하게는, 용어 더 낮은 농도는 본원에서 특정 시스템에서 대조군과 비교하여 원하는 결과를 충분히 생산할 수 있는 농도의 범위를 말한다.
본 맥락에서 용어 "분해 생성물"은 조성물의 제조 및/또는 저장 중에, 예를 들어, 광, 온도, pH, 물의 효과에 의해 또는 부형제 및/또는 직접 용기 폐쇄 시스템과의 반응에 의해 초래된 조성물의 화학적 변화에 기인하는 불순물을 의미한다.
실시예
과학적 접근법의 개요
성장을 향상시키는데 적합한 화합물 또는 생물학적 생산 시스템 (예를 들어, MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산)으로부터 회수된 생성물을 식별하기 위해서, 하기 접근법을 사용하였다: (1) 고처리량 스크리닝을 인플루엔자 바이러스 생활 주기의 다른 스테이지에서 적절한 생물학적 공정 및 세포 경로를 표적화하는 선천적 면역 억제자 또는 저독성 화합물을 포함하는 소분자의 라이브러리를 사용하여 수행하였다. (2) 납 화합물의 효과를 다수의 독감 균주 및 서브타입을 사용하는 연구 규모 MDCK 현탁 세포 배양에서 확인하였다. (3) 납 화합물의 SAR 분석을 행하였고 추가적인, 구조적으로 관련된 유사체를 스크리닝하였다. (4) 납 화합물의 작용 메커니즘 (MOA)을 분석하였다. (5) 개념 입증 연구를 바이오리액터 시스템에서 행하였다. 저농도에서도, 인플루엔자 B 균주를 포함하는 다양한 독감 균주 및 서브타입보다 상당한 수율의 증가를 생산하는 여러 화합물을 식별하였다.
실시예 1 - 고처리량 스크리닝
검정 과정 (고처리량 스크리닝 (HTS))에서, 화합물을 A/재배열체/NYMC X-183 H3N2 인플루엔자로 감염된 MDCK 33016PF 세포 (세포는 US6455298에서 기술됨)를 함유하는 384-웰 포맷에서 테스트하였다. 14,398개의 화학작용제의 라이브러리를 1μM의 화합물 농도에서 핵단백질 (NP)-ELISA를 사용하여 1차 스크리닝을 실시하였다. 1차 스크리닝의 1547개의 히트(hit)를 0.001μM-10μM의 화합물 농도를 사용하는 용량 반응 검정에서 NP-ELISA를 실시하였다. 이어서 2차 스크리닝을 용량 반응 검정에서 HA-ELISA에 의해 1차 스크리닝의 268개의 히트에 대하여 실시하였다. 2차 스크리닝은 88개의 히트를 생성하였고, 이 히트들 중 80개는 10 μM 미만의 화합물 농도에서 NP 및/또는 HA의 적어도 50% 증가를 나타냈다.
한 예에서, 테스트된 가장 높은 농도에서, HA 및 NP 신호 둘 다를 측정할 수 없었다. 예를 들어, 10.0 μM의 스타틴 약물 농도는 -12.34%의 HA 증가 및 -11.44% NP 신호를 생산하였다. 이 높은 용량에서, 예를 들어, 숙주 세포 막 또는 바이러스 막에서 콜레스테롤 고갈은 스타틴 기능의 결과였고, 이로 인해 세포 및 바이러스 막 온전성을 손상시키는 것이 가능하다. 테스트를 위해 선택된 상위 10개의 화합물은 표 2에 포함된다.
추가의 테스트에서 2개의 가장 효과적인 화합물은 다음과 같다: 설폰아미드 (식 3의 유사체)
Figure pct00050
및 피타바스타틴 (식 2의 유사체)
Figure pct00051
.
Figure pct00052
실시예 2 - 납 화합물에 대한 확인 연구
선택된 2개의 최고의 화합물을 다수의 독감 균주 및 서브타입을 사용하여 10 ml 현탁 배양에서 확인 테스트를 수행하였다. 바이러스 배양 후, 상층액을 수확하였고 바이러스/HA 수율을 정량하였다. HA 수율을 ELISA로 측정하였다. 감염성 입자를 NP-기반 병소 형성 검정 (FFA)으로 측정하였다. 바이러스 입자를 핵산 서열의 qPCR 정량화로 측정하였다. 설폰아미드 유사체 (이후 "설폰아미드 유사체") 또는 피타바스타틴을 사용하여 배양 상층액에서 측정된 총 바이러스 입자, 감염성 입자 및 HA의 수율은 대조군과 비교하여 유사한 증가를 나타냈다. 하지만, 피타바스타틴은 설폰아미드 유사체보다 훨씬 더 낮은 농도에서 수율을 증가시켰다. H3N2 균주 IVR-165에 대한 용량-반응 향상 연구의 결과는 도 2에서 나타난다. 피타바스타틴은 0.05 또는 심지어 0.01 μM 정도로 낮은 농도에서도 HA 수율의 3배 증가로 이어졌다.
실시예 3 - 다양한 인플루엔자 바이러스 균주로 납 화합물의 테스트
본원에서 화합물 처리에 의해 영향을 받을 수 있는 인플룽네자 균주의 범위를 연구하기 위해서, MDCK 세포를 1 μM 설폰아미드 또는 0.05 μM 피타바스타틴을 사용하여 다른 인플루엔자 바이러스 균주 및 서브타입으로 감염시켰다. 바이러스 감염을 34 ℃에서 대략 60시간 동안 10-3 또는 10-4의 MOI로 행하였다.
I. 인플루엔자 A
유전자 발현 또는 단백질 발현을 식별하기 위한 작용 메커니즘 연구를 위해 바이러스 접종 후 60시간에 상층액으로부터 샘플을 얻었다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 유의한 HA 수율 향상을 다수의 인플루엔자 균주, 예를 들어, 인플루엔자 서브타입 A H1N1 (균주 A/Brisbane/10/10 및 A/Solomon x145), 인플루엔자 서브타입 A H3N2 (균주 A/Victoria/361/11, A/Brisbane/10/07, A/Uruguay/716/07 및 A/Texas/50/12)에서 관찰하였다.
II. 인플루엔자 서브타입 B
본 발명에서 사용된 화학작용제는 인플루엔자 서브타입 B 바이러스/단백질의 생산에 대하여 유의한 효과를 가진다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 설폰아미드 및 피타바스타틴은 인플루엔자 서브타입 B의 다수의 균주 (균주 B/Panama/45/90, B/Florida/4/06, B/Wisconsin/1/10, B/Brisbane/60/08 및 B/Mass/2/12)에서 대조군에 비해 HA의 적어도 2배 증가를 생산하였다.
이 데이터는 화합물의 효과가 특정 바이러스 균주에 제한되지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 4 - 작용 메커니즘 및 세포 생존력 연구
바이러스 생활 주기의 다른 스테이지에 대한 화학작용제의 효과를 결정하기 위해 작용 메커니즘 연구를 행하였다. 세포의 감염으로부터 -32시간, -24시간, -8시간, -1시간, +2시간, +4시간, + 6시간에 첨가 시기를 연구하였다. 단일 주기 바이러스 감염 연구에서, 바이러스 부착을 허용하기 위해 세포를 1시간 동안 얼음 위에서 5의 MOI로 바이러스와 함께 배양하였다. 1시간 후, 미부착 바이러스를 씻어냈고, 세포를 34℃로 이동시켜 바이러스가 세포를 융해시켜 세포에 진입하게 하였다. 1.0 uM 설폰아미드 또는 0.05 uM 피타바스타틴을 세척 단계 이후 다른 시점 (T = 0, 2, 4, 6시간)에 첨가하였다. 설폰아미드 유사체 및 피타바스타틴은 인플루엔자 H3N2 균주 IVR-165 (A/Victoria/361/2011)로 감염 이전에 배양물에서 32시간 까지 안정한 것으로 나타났다. 설폰아미드 유사체에서 감염 후 6시간에 약 20μg/ml에서 약 5 μg/ml로 감소된 HA 수율이 나타났고 피타바스타틴에서 감염 후 2시간에 약 20 μg/ml에서 약 5 μg/ml로의 감소가 나타났다. 결과는 HA 수율이 바이러스 생활 주기의 특정 약제 및 특정 스테이지의 효과의 결과일 수도 있는, 바이러스 감염 후 첨가 시기에 의존적이라고 제안한다.
세포 생존력 검정을 1uM 설폰아미드 또는 DMSO 대조군이 처리된 MDCK 세포를 사용하여 수행하였다. 세포 생존력을 VI-CELL 기계 (Beckman Coulter)을 사용하여 시간이 흐름에 따라 60시간까지 모니터링하였다 (트리판 블루 배제를 기반으로 하여 측정된 세포 생존력). 본원에서 사용된 설폰아미드 유사체는 시판되는 약물이 아니고, 그러므로 가장 높은 테스트된 농도 10 μM에서 및 접촉 60시간 동안의 배양의 과정 중에 독성을 행하여 세포 생존력을 확인하였다. 설폰아미드 및 피타바스타틴 둘 다는 세포 생존력에 대하여 부정적인 영향을 가지고 있었다. 적어도 91%의 생존력이 설폰아미드 처리된 세포에서 검출된다.
실시예 5 - 질량 분석법
다중 반응 모니터링 (MRM) 방식으로 작동되는 삼중 사중극 질량 분석기를 사용하는 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS) 검정이 개발되어 세포 배양 상층액에서 및 바이러스 정제 공정 이후 화합물 존재/클리어런스를 수크로스-밀도 구배로 모니터링하였다. 검출 한계 (LOD)의 추정치를 백신 모노벌크 유체에서 화합물의 단계 희석에 이어서 모노벌크를 사용하여 1 ng/ml에 이르기까지 화합물의 단계 희석을 수행함으로써 결정하였다. 분석 이전에 아세토니트릴을 모든 샘플에 첨가하였고 샘플을 벤치탑(benchtop) 원심분리기에서 5분 동안 원심분리하여 단백질 침전물을 제거하였다.
설폰아미드 및 피타바스타틴의 1ng/ml 샘플 둘 다에 대하여 신호 대 잡음 비(signal to noise)는 100 이상 (설폰아미드의 경우에는 400 이상)인 것으로 추정되었다. 1ng/ml 농도에서 관찰된 신호 대 잡음 비 수준으로부터, 검출 한계는 어림잡아 0.5ng/ml 이하인 것으로 추정되고 정량 한계는 약 5 ng/ml로 추정된다 (도 6A). 각 화합물에 대한 보정 곡선은 1 ng/ml에서 50 ng/ml 이상까지 일관되게 선형인 것으로 관찰되었으며 R2 값은 0.95 이상이다 (도 6A, 6B).　화합물이 세포 배양물에서 대사 또는 분해되는지를 결정하기 위해서, 화합물을 배지 단독 또는 배지 + MDCK 세포에 첨가하였다. 이 첨가된 샘플의 상층액을 질량 분석을 위해 0 및 60hr에 채취하였다. 60시간 이후에는 화합물의 손실이 관찰되지 않았다 (도 6B).　 화합물이 바이러스 정제 공정 이후 세포 배양 상층액으로부터 제거될 수 있는지를 결정하기 위해서, MDCK를 화합물의 존재 하에 인플루엔자 A형 또는 B형 바이러스로 감염시켰다. 60시간 후, 정화된 세포 배양 상층액을 (1) 추후 LC-MS 분석을 위해 -80℃에서 냉동시키거나; 또는 (2) 바이러스 입자의 수크로스-밀도 구배 원심분리 및 펠릿화를 수반하는 바이러스 정제 공정을 거치게 하였다. 이 "정제된" 샘플을 또한 LC-MS로 테스트하여 화합물이 정제 공정 중에 제거되는지를 결정하였다. 이 정제된 샘플에서 단지 미량 (LOQ 이하, 및 LOD에 근접함)을 검출하였다. 바이러스 정제 후에 남아있는 화합물의 총량 (ng 단위)은 세포 배양물로의 원래의 투입량의 0.25% 미만이다 (도 6C).
실시예 6 - 확장된 부피의 연구
HA 수율이 더 큰 테스트 부피에서도 재현 가능한지를 확인하기 위해서, 2개의 납 화합물을 DMSO에 희석하여 60시간 동안 MOI = 10-4로 H3N2 균주 (IVR165)로 감염된 MDCK 세포 배양물을 포함하는 10 ml 또는 60 ml 샘플 부피에 0.2 μM 및 5 μM의 농도로 적용하였다. 바이러스 입자를 RNAse-저항성 RNA 전사물, 예를 들어, 독감 M 유전자의 qPCR로 측정하였다 (Ngaosuwankul et al, Virology Journal 7:75 (2010) doi: 10.1186/1743-422X-7-75 참조). HA 수율을 대조군에 대하여 표준화하였다. 연구는 HA 수율의 상응하는 증가가 10 ml 및 60 ml 배양물 둘 다에서 관찰된다는 것을 나타냈다.
도 5에서 나타난 바와 같이 결과는 ELISA 및 qPCR 둘 다에 의해 확인된 바와 같이 HA 수율 또는 입자가 상관 비례적으로 증가한다는 것을 나타낸다.
납 화합물의 다수의 유사체를 서로 비교를 위해 테스트하였다. 하지만, 특정 유사체에 대해서는, 테스트된 농도가 최적이 아니었다. 도 8에서 나타난 바와 같이, 스타틴 유사체를 0.05 μM에서 활성의 비교를 위해 테스트하였다. 로수바스타틴을 0.05 μM에서 비교 스타틴의 잠재 수율을 생산하지 않는 유사체로 확인하였다. 하지만, 대안의 농도 및 실험 조건은 테스트된 화학작용제, 예를 들어, 로수바스타틴에 효과를 맞출 수 있도록 최적화되어야 한다.
실시예 7 - SAR 연구
납 화합물의 유사체를 식별하기 위해 구조 활성 관계 (SAR) 연구를 행하였다. 88개의 설폰아미드 유사체를 식별하였으며 이것들 중 3개의 화합물을 테스트하였다. 한 유사체는 납 화합물과 유사한 수율 증가로 이어졌다. 155개의 피타바스타틴 유사체를 식별하였으며 이것들 중 148개 이상을 테스트하였다. 이에 더하여, 여러 다른 상업적으로 이용 가능한 스타틴을 테스트하였다 (도 8). 테스트된 유사체의 대부분은 바이러스 입자 수율의 적어도 2배 증가를 나타냈다. 특히 (i) 납 화합물 피타바스타틴이 심바스타틴을 포함하는 여러 다른 상업적으로 이용 가능한 스타틴보다 더 우수하고 (도 8), (ii) 플루바스타틴 및 플루바스타틴메틸 또는 -에틸 에스터와 같은 여러 플루바스타틴 유도체가 피타바스타틴보다 훨씬 더 잘 수행하는 것으로 나타났다 (도 7). 본 발명의 스타틴 유사체의 특히 바람직한 구체예는 상기 기술된 조건 하에서 DMSO 처리를 사용하는 대조군과 비교하여 ELISA로 측정된 HA 수율의 적어도 2배 증가를 제공하는 표 3에서 나열된 약제를 포함한다.
HA-ELISA
화합물 DMSO 대조군 이상의
HA 배수 증가 		HA ( ug /ml)
스타틴 -유사 유사체 1 4.92 7.78
스타틴 -유사 유사체 2 4.71 8.01
스타틴 -유사 유사체 3 4.71 8.50
스타틴 -유사 유사체 4 4.32 7.34
스타틴 -유사 유사체 5 4.14 6.89
스타틴 -유사 유사체 6 3.56 6.56
스타틴 -유사 유사체 7 3.51 7.61
스타틴 -유사 유사체 8 3.43 6.47
스타틴 -유사 유사체 9 3.16 6.38
스타틴 -유사 유사체 10 2.99 6.56
스타틴 -유사 유사체 11 2.97 6.42
스타틴 -유사 유사체 12 2.92 9.29
스타틴 -유사 유사체 13 2.89 8.63
스타틴 -유사 유사체 14 2.83 7.34
스타틴 -유사 유사체 15 2.73 19.69
스타틴 -유사 유사체 16 2.59 19.69
스타틴 -유사 유사체 17 2.57 14.34
스타틴 -유사 유사체 18 2.56 17.31
스타틴 -유사 유사체 19 2.54 12.51
스타틴 -유사 유사체 20 2.53 7.72
스타틴 -유사 유사체 21 2.43 7.19
스타틴 -유사 유사체 22 2.40 9.28
스타틴 -유사 유사체 23 2.24 10.56
스타틴 -유사 유사체 24 2.13 8.44
스타틴 -유사 유사체 25 2.09 8.55
실시예 8 - 신호 전달 경로의 설명
세포 배양물에서 생물학적 생산을 향상시키기 위한 발명자들의 화학적 첨가물 접근법에 있어서, 관찰된 향상 효과를 강조하는 작용 메커니즘을 평가하였다. 적용되는 화학적 첨가물을 식별하고 특성화하기 위해서는, 발명자들의 MDCK 33016PF 세포에서의 독감 백신 생산을 작업 모델로 사용하였고 이러한 생성물을 제조하는데 있어서 이 접근법의 실행 가능성을 결정하는데 사용하였다. 그 목적을 위해서, 인플루엔자의 다수의 균주 및 서브타입에서 HA 수율을 적어도 2배만큼 향상시키는 최고의 화합물, BYF589 (표 4의 화합물 G)를 상세한 평가를 위해 선택하였다. BYF589에 의한 HA 수율 향상이 HMGCR 억제의 결과인지를 결정하기 위해서, 시스템의 작용 방식을 더 잘 이해하기 위한 연구를 행하였다. 메발로네이트 (MEV) 경로를 조사하기 위해서, 특이적 효소 억제자를 이용하였다 (도 9A에서 설명됨). 3개의 효소 억제자는 선택적으로 MEV 경로의 특이적 분지를 표적화하며, BYF 작용 메커니즘 ("MOA") 결정에 대하여 더 나은 대책을 제공한다.
세포 생존력 및 총 세포 콜레스테롤 수준에 대하여 BYF589 뿐 아니라 경로의 다양한 효소 억제자의 가능한 효과를 조사하였다. 테스트된 샘플은 DMSO, BYF589 (1 μM), MEV (100 μM), FTI (0.5 μM), ZA (1 μM) 및 GTI (0.5 μM)를 포함한다. 처리 24시간 후, 세포 역가 글로(glow)에 의해 측정된 바와 같이 세포 생존력에 대하여 부정적인 효과는 검출되지 않았다.
유리 콜레스테롤은 콜레스테롤 옥시다제에 의해 산화되어 콜레스테롤 케톤 및 H202를 형성하며, 이어서 이것은 Amplex Red + HRP와 반응하여 형광 제품 레소루핀을 생산한다. 실험의 이 부분에 대하여, DMSO에 대하여 표준화된 HA 수율 및 세포 콜레스테롤 둘 다를 측정하였는데, HA 향상은 BYF가 처리된 세포에서 더 낮은 콜레스테롤과 연관성이 있고, 이것은 용량-의존적이며, 콜레스테롤 함량이 향상에 수반될 수도 있다고 제안한다. 단독으로, MEV는 세포 콜레스테롤 수준에 대하여 아무 효과가 없었다. BYF와 결합하여 사용될 때, MEV는 HA 수율 향상을 감소시키지만 세포 콜레스테롤 수준을 보충하는 것은 아니며, 콜레스테롤 감소 단독은 HA 향상을 부여하기에 충분하지 않다고 제안한다.
MEV 경로의 해당 암(arm)의 3개의 억제자가 다양한 조합으로 사용될 때, 첨가물 효과를 관찰하였으며, 경로의 다수의 분지가 사실상 향상 효과를 부여하는데 수반된다고 제안한다. 결과는 도 9B에서 요약된다. 이 결과들은 특이적 효소 억제자 조합으로 이 경로의 3개의 암 모두의 차단은 화합물의 HA 향상 효과를 모방할 수 있다는 것을 나타낸다. 하류에서 BYF589 작용의 억제자이지만 상류에서는 신호 전달 분지점의 억제자인 바이포스포네이트는 BYF589보다는 덜 강력하지만 HA 효과의 유사한 용량-의존적 향상을 유도할 수 있다는 것이 추가로 확인되었다.
실시예 9 - 유전자 발현 연구
문헌에서의 증거는 스타틴이 IFN 및 IFN-중재 유전자, 예를 들어, IP10 (CxCL10)을 억제할 수 있다고 제안한다. 그러므로 독감 HA 향상이 스타틴에 의한 인터페론 (IFN) 반응의 억제와 관련된 것일 수도 있는지를 조사하였다. IP10 및 IFNB1의 유전자 발현을 감염 이후 BYF589 화합물의 존재 하에 또는 부재시 측정하였다. 예비 qRT-PCR 데이터는 BYF589의 존재 하에 바이러스-감염된 MDCK 세포에서 IFNb 및 IP10의 지연/억제된 유도를 제안한다. BYF589 화합물의 존재 하에 테스트된 유전자 둘 다에서 관찰된 지연 시간은 BYF589 화합물의 부재시 유전자 유도의 시기 (피크에서 측정됨)와 비교하여 적어도 2시간이었다.
실시예 10 - 숙주 세포의 향상제 처리 시기
2개의 납 화합물 (BYF589 및 AFZ077)이 공통 경로를 통해 작동할 수도 있는지를 평가하기 위해서, 각각의 화합물을 감염 후 다양한 시점에 숙주 세포 배양물에 첨가하였고 HA 수율에 대한 효과를 감염 후 24시간에 측정하였다. 결과는 BYF589가 바이러스 감염 시간 (T = 0)에 첨가될 때, 화합물 없이 키워진 대조군과 비교하여, 24시간에 대략 4배의 HA 수율 증가가 달성되었다는 것을 나타낸다. 하지만, BYF589 화합물이 이후의 시간 (T = 2, 4 또는 6)에 첨가될 때, 24시간에 유의한 HA 수율 향상이 관찰되지 않았다. 이에 반해서, 감염 시간 (T = 0), 뿐 아니라 이후의 시간 (T = 2 & 4)에 AFZ077의 첨가는 감염 후 24시간에 대략 4배의 HA 수율 증가를 달성하였다; 하지만, AFZ077이 감염 후 6시간 (T = 6)에 첨가될 때 유의한 증가를 보이지 않았다. 이 결과는 2개의 화합물에 의한 HA 향상이 감염된 숙주 세포 배양물로의 첨가 시간에 의존적이라는 것을 나타낸다. 또한, 각 화합물의 효과의 일시적인 차이를 기반으로 하여, 2개의 화합물이 바이러스 생활 주기의 다른 스테이지를 표적화할 가능성이 크다. 추가적으로 또는 대안으로, 2개의 화합물은 숙주 세포의 다른 경로를 조절할 수도 있다.
실시예 11 - 소형 바이오리액터 세부 비교
2개의 납 화합물을 상업적으로 이용 가능한 소규모 바이오리액터 시스템, ambr15™ (TAP Biosystems)에서 추가로 테스트하였다. ambr15 시스템은 마이크로 규모 (10-15 ml)로 고전적인 바이오리액터의 특징을 모방하며, 자동화된 워크스테이션(workstation)에 의해 제어되고, 이것은 마이크로 규모로 다수의 바이오리액터 배양물의 신속한 평가를 가능하게 한다.
테스트하기 위해 두 납 화합물을 제어된 조건 하에서 두 개의 감염 배지 제형 (DM134 및 CDM) 및 두 개의 독감 균주, A/Victoria/361/2011 (IVR-165) (고발현) 및 B/Massachusetts/2/2012 (저발현)을 이용하여 나란히 테스트하였다. 실험에서 사용된 감염 파라미터는 다음과 같다: 분주 밀도는 1.0x106 세포/ml 또는 2.5x106 세포/mL였고; pH는 7.1 +/- 0.02였고 (0.05N NaOH 및 CO2 가스를 이용한 이중 제어에 의한 pH 제어); DO는 50%였으며 (범위 50-80%), O2 가스에 의해 제어되고; 교반은 1000 rpm으로 이루어졌고 (개별 제어); 온도는 34.0℃였며, 바이오리액터 제어장치 프로브로 개별적으로 모니터링하였고; 용기 유형은 Spargeless, 확장된 온도 용기였고; 실행 중에 공기 공급률은 1 mL/min였다.
ambr15 실험의 결과는 도 10 및 11에서 요약된다. 두 납 화합물은 두 배지에서 저발현 B 균주에 대하여 HA 수율을 향상시켰다. 하지만, 고발현 A 균주, AFZ077은 테스트된 두 배지에서 HA 수율의 훨씬 큰 향상을 달성하였다. HA의 정량을 ELISA로 수행한 다음 HPLC로 확인하였다. 또한 AFZ077이 이 시스템에서 낮은 (mL 당 1 x 106) 및 높은 (mL 당 2.5 x 106) 감염 세포 밀도 둘 다를 가지는 DM134 배지에서 HA 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. 후자에 대하여, 높은 ICD 포맷과 AFZ 처리를 조합함으로써, AFZ077에 의한 향상은 원래의 수율보다 ~4배 더 높은 수율을 초래하였으며, 원래의 2패 표적을 뛰어넘는다 (도 12). 요약하면, ambr15 시스템을 이용하여, AFZ077은 지금까지 테스트된 모든 균주에 대하여 셰이크 플라스크 및 15ml 바이오리액터의 DM134 배지에서 HA 수율을 증가시킨다. BYF589는 불량하게 발현하는 독감 B 균주에 대하여 셰이크 플라스크 및 15ml 바이오리액터의 DM134 배지에서 HA 수율을 증가시킨다. 전반적으로, 저발현 균주에서 더 큰 향상 효과를 볼 수 있다. 이에 더하여, AFZ077 및 더 높은 감염 세포 밀도를 사용하여 첨가물 효과를 관찰하였다.
실시예 12 - 대규모 바이오리액터
앞선 연구에서, AFZ077 화합물은 연구용 셰이크 플라스크 및 15 mL 바이오리액터 둘 다의 DM134 배지에서 HA 수율을 증가시키는 것으로 나타났다. 결과를 3개의 다른 바이러스 (고-, 중-, 및 불량한-발현 균주)를 사용하여 확인하였다. BYF589는 고발현 H3N2 균주가 아니라, 불량한-발현 독감 B 균주에 대하여 연구용 셰이크 플라스크 및 15 mL 바이오리액터의 DM134 배지에서 HA 수율을 증가시키는 것으로 나타났다. 대규모 시스템에서 이 발견들을 확인하기 위해서, TD ambr™ 250 mL 바이오리액터를 이용하였다. 소규모 배양물에서 관찰된 향상이 대규모 시스템에서 재현될 수 있는지를 결정하기 위해 두 납 화합물 (뿐만 아니라 음성 대조군으로서 DMSO 단독, 및 이중-음성 대조군으로서 무화합물/무 DMSO)을 고- 및 저발현 균주로 테스트하였다. 다음 파라미터를 사용하였다: 소비된 DM134:신선한 PFM (1:3); 바이러스 균주는 A/Victoria/361/2011 (IVR-165) 및 B/Massachusetts/02/2012였고; MOI는 A/Victoria IVR-165에 대하여 10-5 및 B/Massachusetts에 대하여 10-4였고; ICD: 2.0e6 - 3.0e6 세포/mL; N-1 공정: 1B (배지 교환 없음); 및 수확 시간은 감염 후 65-72시간이었다. HA 수율을 2가지 방법, RP-HPLC 및 HA-ELISA으로 측정하였다. 데이터는 도 13 및 14에서 제공된다. 도 13은 0.005 μM 용량의 BYF589가 HA-HPLC에 의해 결정된 바와 같이 무 DMSO 대조군보다 약 37% 수율 증가를 나타냈다는 것을 보여준다. 도 14는, 테스트된 특정 조건 하에서, AFZ077이 ambr250 시스템에서 균주에 대하여 테스트된 용량들 중 어느 것에서도 대조군보다 유의한 HA 수율의 증가를 수득하지 않는 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 오차 막대는 검정 반복 사이에서 HA-ELISA 검정의 가변성을 설명하기 위해, 평균으로부터 하나의 표준 편차를 나타낸다는 것을 알아야한다.
실시예 13 - 기작론적으로 관련된 화합물 (기능적 등가물)
AFZ 효과는 리간드로서 세로토닌 (5HT)을 첨가함으로써 폐지될 수 있기 때문에 AFZ077에 의한 독감 HA에 대한 향상 효과는 5HT7 수용체 활성의 감소에 의존적이라는 것이 발견되었다 (도 15 참조). 이것은 이러한 효과가 수용체 활성에 의해 중재되는 것으로 제안하는데, 같거나 유사한 세포 효과를 중재할 수 있는 다른 약제들 또한 납 화합물이 가능한 방식으로 단백질 수율을 향상시킬 수도 있다는 것을 나타낸다. 식 8 (예를 들어, 화합물 E)에 기초한 연구를 확장하여 특정 작용 메커니즘을 공유할 수도 있는 잠재적인 화합물을 식별하였으며, 하기 표 5에서 요약된 바와 같다.
Figure pct00053
Figure pct00054
상대적인 HA 수율을 평가하기 위한 비교 연구의 결과는 도 16에서 제공된다. 이 후보물질들 중 일부를 AFZ077과 비교하여 HA 수율을 향상시키는 능력에 대하여 추가로 테스트하였다 (도 17).
수율을 증가시키는 후보 화합물을 더 식별하기 위해서 추가적인 SAR 연구를 수행하였다. 165개의 유사체를 H3N2 균주를 이용하여 10 ml 바이러스 배양물에서 0.05 uM로 테스트하였다. BYF589는 무화합물 (DMSO) 대조군보다 수율을 ~2배만큼 향상시켰다. 스크리닝된 165개 중 14개는 테스트된 농도에서 HA 수율을 향상시키는데 있어서 BYF589 정도로 우수하거나 더 나았다. 최고의 유사체는 BYF589보다 ~2배 더 나은 것으로 발견되었다.
실시예 14 - 재조합 단백질 발현의 향상
HA 수율 연구에서 식별된 화합물의 일반적인 유용성을 추가로 평가하기 위해서, 납 화합물 중 하나, BYF589를 이종 기원 세포를 사용하여 재조합 단백질 발현에 대하여 테스트하였다. 특히, 앞서 HEK293 세포에서 발현하기 어려운 것으로 발견된 단백질이 포함되었으며, 이것들은 "저생산자(low yielder)"로 불린다. 전형적인 최적화된 시스템에서, 저생산자들은 5 mg/L 이하의 수율을 가지는 것으로 한정된다. 2-10 mg/L의 전형적인 수율을 가지는 약 20개의 표적 단백질의 구조를 실험을 위해 선택하였다. 그것들은 분비된 포유류 단백질이며, 이것들은 전장 대응물의 절단된 버전이다. 각 구조 (pRS5a 벡터의 변이체에서)는 적어도 하나의 태그 (예를 들어, 적어도 C-말단 FlagHis 태그- 이에 더하여, 다수는 N- 또는 C-말단에서 마우스 IgG1 Fc에 융합된다)를 함유하였다. 거의 동일한 수의 각각의 태그 유형을 선택하여 바이어스(bias)를 감소시켰다.
<1 mg/L 또는 > 10 mg/L의 수율을 가지는 모든 표적을 제거하였다. 그 다음, 표적들을 태그 유형으로 분류하였다. 마지막으로, 특정 분자량 범위가 크게 표현된 것처럼 보이는 경우, 소수의 "복제물"들은 도태되었다. 이어서, 샘플을 선택하기 위해, 추가적인 선택 기준 없이 각 태그 유형의 처음 6-7개를 포함시켰다. 결과로 생긴 표적 목록을 하기 재현한다.
최종적으로 70 μM 작용 스톡(stock) (1000x)을 제공하기 위해서 BYF589 화합물을 DMSO에 용해시켰다.
사용된 세포는 생성물의 수령을 직접적으로 추적 가능한 저계대배양 Master Cell bank의 것인 HEK293 자유형 세포 (Life Technologies)였다. 세포를 0.2 백만 개의 세포/ml로 분할되는 2.5L Thomson UltraYield 플라스크의 HEK293F 배지에서 키웠고 3일에 1.5 백만 개의 세포/ml의 표적 밀도로 두 배가 되게 한다. 이어서 세포를 트랜스펙션 전에 1L 표준 Corning 스크류캡 플라스크에 300 ml의 권장 용량으로 앨리쿼트하였다. 각 표적에 대하여, 한 플라스크는 BYF589 300 ul가 첨가되었고 다른 것은 그렇지 않았다. 이어서 세포를 다음과 같이 제조된 PEI 플라스미드 복합체로 트랜스펙션하였다: Maxiprep 플라스미드를 융해시켜서 혼합한 다음, 지시된 부피를 293F 배지에 첨가하였다. 선형 25,000 MW PEI (Polysciences #23966-2)의 2 mg/ml 스톡을 293F 배지를 이용하여 1 mg/ml로 희석한 다음, 지시된 부피를 플라스미드 DNA에 첨가하였고, 뒤집어서 혼합한 다음, 2-10분 동안 방치하였다. 이어서 동일 부피의 PEI/DNA 혼합물을 2개의 플라스크 각각에 첨가하였으며 (하나는 화합물이 들어있고 다른 하나는 없음), 이어서 이것들을 격렬하게 돌리기 보다는 셰이커로 돌려놓고 37℃에서, 120 rpm으로 흔들면서 8% CO2에서 (상기 성장과 같은 조건) 배양하였다. 사용된 양은 발명자들의 (리터 당) 1.6 ml 배지 중 400 ug 플라스미드 플러스 1 mg/ml PEI 3.2 ml인 이전에-최적화된 조건을 반영한다.
배지 상층액의 작은 샘플을 수거하여 (Filipp Gortalum) 옥텟(Octet)으로 검정하였다. 미처리된 초기 수율과 미처리 세포에 대한 처리된 세포의 수율의 비의 상관관계.
세포 현탁액을 표준 프로토콜에 따라 Ni-NTA 레진 컬럼에 로딩하였다. 업계에 잘 공지되어 있는 이미다졸-기반 정제 방법을 사용하였다. 단백질 수율의 예비 분석을 BCA 검정에 이어서 확인을 위해 LC90 전기영동도로 실행하였다.
실험의 결과는 도 18에서 요약된다. 좌측 그래프 (도 18A)는 BYF589 화합물 (70 nM)의 존재 및 부재시 단백질 수율 간의 관계를 나타낸다. 그래프에서 각 데이터 포인트는 테스트된 20개의 표적을 나타낸다. 그래프는 화합물이 다양한 정도이기는 하지만 단백질 수율을 증가시킬 수 있다는 성향을 입증한다. 우측 그래프 (도 18B)는 초기 수율 (화합물이 처리되지 않았을 때)의 함수로서 단백질 수율의 배수 증가를 플롯팅한다. 그것은 이미 높은 수율을 가지는 경향이 있는 단백질 ("고생산자(high yielder)")이 화합물의 존재에 의해 더 향상되지 않는 한편, 저생산자의 발현은 화합물에 의해 향상될 가능성이 더 크다는 일반적인 성향을 나타낸다. 테스트된 20개의 단백질 중에서, 약 ≤4 mg/L의 수율을 가진 것들 모두는 테스트된 조건 하에서, BYF589 화합물이 처리될 때 적어도 1.5배의 수율 증가를 나타낸다. 종합해보면, 이 발견들은 테스트된 화합물이 다양한 단백질에 대한 단백질 수율에 대하여 일반적인 향상 효과를 나타낸다고 제안한다.
Figure pct00055
본 발명의 구체예
1. 숙주 세포 시스템으로부터 치료적, 예방적 또는 진단적 생물학적 분자를 생산하는 방법으로서, 숙주 세포 시스템을 표 1-5로부터 선택된 적어도 하나의 화학작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
2. 구체예 1에 있어서, 숙주 세포 시스템은 세포 배양물 또는 발육란인, 방법.
3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 세포 배양은 MDCK, Vero, BHK, EB66 또는 CHO 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
4. 구체예 1에 있어서, 화학작용제는 스타틴 또는 이것의 유사체, 또는 세로토닌 수용체 리간드이며, 0.0001 μM 내지 10 μM의 최종 농도를 가지는, 방법.
5. 구체예 1 내지 구체예 4 중 어느 하나에 있어서, 화학작용제는 0.05 μM 이하의 농도 및 다음과 같은 구조를 포함하는, 방법:
Figure pct00056
또는
Figure pct00057
.
6. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포 시스템은 바이러스로 감염되는, 방법.
7. 구체예 6에 있어서, 화학작용제는 숙주 세포의 바이러스 접종과 동시에 첨가되는, 방법.
8. 구체예 7에 있어서, 바이러스는 인플루엔자인, 방법.
9. 구체예 8에 있어서, 숙주 세포 시스템에 의해 생산된 생물학적 분자는 인플루엔자 바이러스 입자, 분할된 인플루엔자 비리온 또는 인플루엔자 바이러스 당단백질로부터 선택되는, 방법.
10. 구체예 9에 있어서, 인플루엔자 바이러스 당단백질은 헤마글루티닌인, 방법.
11. 구체예 1 내지 구체예 10 중 어느 하나에 있어서, 생산된 생물학적 분자의 수율은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 대조군과 비교하여 적어도 2배 증가되는, 방법.
12. 구체예 1 내지 구체예 11 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 플루바스타틴, 피타바스타틴, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴 또는 이것들의 이성질체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
13. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 하나에 있어서, 화학작용제는 플루바스타틴 또는 피타바스타틴 또는 이것들의 이성질체인, 방법.
14. 세포 배양물에서 치료적, 예방적 또는 진단적 인플루엔자 단백질을 생산하는 방법으로서, 세포 배양물을 0.05 μM 이하의 농도의 적어도 하나의 스타틴 화합물 또는 이것의 유사체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
15. 세포 배양물에서 치료적, 예방적 또는 진단적 단백질을 생산하는 방법으로서, 생산은 심바스타틴 이외의 적어도 하나의 스타틴 또는 이것의 유도체의 존재 하에 행해지고, 단백질은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 대조군과 비교하여 적어도 1.5배 증가하여 생산되는, 방법.
16. 구체예 14 또는 구체예 15에 있어서, 스타틴은
Figure pct00058
또는
Figure pct00059
및 이것들의 유사체인, 방법.
17. 구체예 16에 있어서, 스타틴 유사체는 플루바스타틴, 피타바스타틴, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴 또는 이것들의 이성질체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
18. 구체예 17에 있어서, 스타틴 약제는 플루바스타틴 또는 피타바스타틴 또는 이것들의 이성질체인, 방법.
19. 숙주 세포물에서 인플루엔자 B 균주를 생산하는 방법으로서, 숙주 세포를 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 0.05μM 이하의 농도로 수율을 적어도 1.5배 증가시키는 화학작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
20. 구체예 19에 있어서, 화학작용제는
Figure pct00060
또는
Figure pct00061
및 이것들의 유사체인, 방법.
21. 구체예 19 또는 구체예 20에 있어서, 인플루엔자 B 균주 바이러스 입자, 분할된 인플루엔자 B 비리온 또는 인플루엔자 B 바이러스 당단백질이 생산되는, 방법.
22. 구체예 21에 있어서, 인플루엔자 B 바이러스 당단백질은 헤마글루티닌인, 방법.
23. 숙주 세포로부터 치료적, 예방적 또는 진단적 생물학적 분자를 생산하는 방법으로서,
(a) 구체예 1 내지 구체예 22 중 어느 하나에서 구현되는 방법
(b) 생산된 분자를 최종 치료적, 예방적 또는 진단적 생성물로 가공하는 단계
를 포함하는, 방법.
24. 인플루엔자 백신을 생산하는 방법으로서, 다음 단계가 행해지는, 방법:
a. 세포 배양물 및 표 1에서 선택된 적어도 하나의 화학작용제를 포함하는 배지에서 바이러스를 성장시키는 단계.
b. 멸균 백신을 생산하기 위해서 바이러스를 가공하는 단계.
25. 인플루엔자 B 백신을 생산하는 방법으로서, 다음 단계가 행해지는, 방법:
a. ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 대조군과 비교하여 인플루엔자 B의 적어도 1.5배 증가를 생산하기 위해서 세포 배양물 및 적어도 하나의 화학작용제를 포함하는 배지에서 바이러스를 성장시키는 단계 및
b. 멸균 백신을 생산하기 위해서 바이러스를 가공하는 단계.
26. 구체예 23 내지 구체예 25 중 어느 하나에 있어서, 화학작용제는 표 1 또는 표 3에서 선택되는 방법.
27. 인플루엔자 백신을 생산하는 방법으로서, 다음 단계가 행해지는, 방법:
a. 0.05 μM 이하의 농도로 스타틴 약제의 존재 하에 세포 배양물에서 바이러스를 성장시키는 단계
b. 멸균 백신을 생산하기 위해서 바이러스를 가공하는 단계

Claims (15)

  1. 숙주 세포 시스템으로부터 치료적, 예방적 또는 진단적 생물학적 분자를 생산하는 방법으로서, 숙주 세포 시스템을 표 1에서 선택된 적어도 하나의 화학작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 숙주 세포 시스템은 세포 배양물 또는 발육란인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 세포 배양물은 MDCK, Vero, BHK 또는 CHO 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1 항에 있어서, 화학작용제는 0.001 μM 내지 10 μM의 최종 농도를 가지는 스타틴 또는 이것의 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학작용제는 0.05 μM 이하의 농도 및 다음과 같은 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00062
    또는
    Figure pct00063
    .
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 시스템은 바이러스로 감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6 항에 있어서, 화학작용제는 숙주 세포의 바이러스 접종과 동시에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7 항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8 항에 있어서, 숙주 세포 시스템에 의해 생산된 생물학적 분자는 인플루엔자 바이러스 입자, 분할된 인플루엔자 비리온 또는 인플루엔자 바이러스 당단백질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 당단백질은 헤마글루티닌인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 생산된 생물학적 분자의 수율은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 대조군과 비교하여 적어도 1.5배 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 유사체는 플루바스타틴, 피타바스타틴, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴 또는 이것들의 이성질체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학작용제는 플루바스타틴 또는 피타바스타틴 또는 이것들의 이성질체인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 세포 배양물에서 치료적, 예방적 또는 진단적 인플루엔자 단백질을 생산하는 방법으로서, 세포 배양물을 0.05 μM 이하의 농도로 적어도 하나의 스타틴 화합물 또는 이것의 유사체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 세포 배양물에서 치료적, 예방적 또는 진단적 단백질을 생산하는 방법으로서, 생산은 심바스타틴 이외에 적어도 하나의 스타틴 또는 이것의 유도체의 존재 하에 행해지고, 단백질은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 대조군과 비교하여 적어도 2배 증가하여 생산되는, 방법.
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