EA036992B1 - Композиции и способы повышения производства - Google Patents
Композиции и способы повышения производства Download PDFInfo
- Publication number
- EA036992B1 EA036992B1 EA201692057A EA201692057A EA036992B1 EA 036992 B1 EA036992 B1 EA 036992B1 EA 201692057 A EA201692057 A EA 201692057A EA 201692057 A EA201692057 A EA 201692057A EA 036992 B1 EA036992 B1 EA 036992B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- virus
- influenza
- yield
- host cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 127
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 93
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 37
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 337
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 143
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 111
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 98
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 83
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 83
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 83
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 83
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 80
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 61
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 60
- -1 chloro, phenoxy, benzyloxy Chemical group 0.000 claims description 51
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 51
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 48
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 43
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 43
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 41
- VGYFMXBACGZSIL-MCBHFWOFSA-N pitavastatin Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)\C=C\C1=C(C2CC2)N=C2C=CC=CC2=C1C1=CC=C(F)C=C1 VGYFMXBACGZSIL-MCBHFWOFSA-N 0.000 claims description 36
- 229960002797 pitavastatin Drugs 0.000 claims description 35
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 claims description 28
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 23
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 20
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 19
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 19
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 claims description 19
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 16
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 16
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 15
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 10
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 claims description 9
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 77
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 16
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 abstract 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 156
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 87
- 239000000047 product Substances 0.000 description 78
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 65
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 65
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 46
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 45
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 37
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 35
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 34
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 30
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 27
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 25
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 24
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 23
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 23
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 22
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 22
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 20
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 19
- ZGGHKIMDNBDHJB-NRFPMOEYSA-M (3R,5S)-fluvastatin sodium Chemical compound [Na+].C12=CC=CC=C2N(C(C)C)C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 ZGGHKIMDNBDHJB-NRFPMOEYSA-M 0.000 description 18
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 18
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-N (R)-mevalonic acid Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 17
- KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N DL-mevalonic acid Natural products OCCC(O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 229960003765 fluvastatin Drugs 0.000 description 16
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 15
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 15
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 14
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 13
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 13
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 12
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 12
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 12
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 10
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 description 10
- AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N mevastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=CCC[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 10
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 9
- AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N SJ000287055 Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 9
- 229940125425 inverse agonist Drugs 0.000 description 9
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 9
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 9
- BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N mevastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C21 BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 108091005436 5-HT7 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102100036321 5-hydroxytryptamine receptor 2A Human genes 0.000 description 8
- 101710138091 5-hydroxytryptamine receptor 2A Proteins 0.000 description 8
- 102100039126 5-hydroxytryptamine receptor 7 Human genes 0.000 description 8
- 101710150237 5-hydroxytryptamine receptor 7 Proteins 0.000 description 8
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 8
- 229960005110 cerivastatin Drugs 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 description 8
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 8
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 7
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 7
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 7
- SEERZIQQUAZTOL-ANMDKAQQSA-N cerivastatin Chemical compound COCC1=C(C(C)C)N=C(C(C)C)C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 SEERZIQQUAZTOL-ANMDKAQQSA-N 0.000 description 7
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 7
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 7
- 229950009116 mevastatin Drugs 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- BPRHUIZQVSMCRT-VEUZHWNKSA-N rosuvastatin Chemical compound CC(C)C1=NC(N(C)S(C)(=O)=O)=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O BPRHUIZQVSMCRT-VEUZHWNKSA-N 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 6
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 6
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 6
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 6
- 229960000672 rosuvastatin Drugs 0.000 description 6
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 5
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 5
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 5
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 102100040368 5-hydroxytryptamine receptor 6 Human genes 0.000 description 4
- 101710150235 5-hydroxytryptamine receptor 6 Proteins 0.000 description 4
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 description 4
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 230000003288 anthiarrhythmic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003416 antiarrhythmic agent Substances 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N heptanoic acid group Chemical group C(CCCCCC)(=O)O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N quinidine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@H]2[C@@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N 0.000 description 4
- 150000003254 radicals Chemical group 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VSWICNJIUPRZIK-UHFFFAOYSA-N 2-piperideine Chemical compound C1CNC=CC1 VSWICNJIUPRZIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YVWGGGGMRDLOGA-GOSISDBHSA-N 4-methyl-1-[2-[(2r)-1-(3-methylphenyl)sulfonylpyrrolidin-2-yl]ethyl]piperidine Chemical compound C1CC(C)CCN1CC[C@@H]1N(S(=O)(=O)C=2C=C(C)C=CC=2)CCC1 YVWGGGGMRDLOGA-GOSISDBHSA-N 0.000 description 3
- 102100024959 5-hydroxytryptamine receptor 2C Human genes 0.000 description 3
- 101710138093 5-hydroxytryptamine receptor 2C Proteins 0.000 description 3
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 3
- 102000007527 Autoreceptors Human genes 0.000 description 3
- 108010071131 Autoreceptors Proteins 0.000 description 3
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical group [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000000543 Histamine Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010002059 Histamine Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ALOBUEHUHMBRLE-UHFFFAOYSA-N Ibutilide Chemical compound CCCCCCCN(CC)CCCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 ALOBUEHUHMBRLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Chemical group BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 229960004170 clozapine Drugs 0.000 description 3
- QZUDBNBUXVUHMW-UHFFFAOYSA-N clozapine Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=NC2=CC(Cl)=CC=C2NC2=CC=CC=C12 QZUDBNBUXVUHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N compound E Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]1C(N(C)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=N1)=O)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 3
- IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N cyclobenzothiazole Natural products C1=CC=C2SC=NC2=C1 IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 3
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 3
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 229960004053 ibutilide Drugs 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 3
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 description 3
- VWBQYTRBTXKKOG-IYNICTALSA-M pravastatin sodium Chemical compound [Na+].C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 VWBQYTRBTXKKOG-IYNICTALSA-M 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 3
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 125000005913 (C3-C6) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000006272 (C3-C7) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- CSNIZNHTOVFARY-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2C=NSC2=C1 CSNIZNHTOVFARY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029077 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Human genes 0.000 description 2
- ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N Amiodarone hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(I)=C(OCC[NH+](CC)CC)C(I)=C1 ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- XOCKHJGSZGOQJG-UHFFFAOYSA-N COC1C(N(CCC1)CO)(C1=CC=CC=C1)OC Chemical class COC1C(N(CCC1)CO)(C1=CC=CC=C1)OC XOCKHJGSZGOQJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N Compactin Natural products OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(CO)OC2Oc3cc(O)c4C(=O)C(=COc4c3)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C(O)C1O VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 240000001879 Digitalis lutea Species 0.000 description 2
- 108050004812 Dopamine receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000015554 Dopamine receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 2
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 2
- 102100029108 Elongation factor 1-alpha 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 2
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 2
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 2
- DJBNUMBKLMJRSA-UHFFFAOYSA-N Flecainide Chemical compound FC(F)(F)COC1=CC=C(OCC(F)(F)F)C(C(=O)NCC2NCCCC2)=C1 DJBNUMBKLMJRSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000883736 Homo sapiens Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 101000841231 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 2
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010909 Monoamine Oxidase Human genes 0.000 description 2
- 108010062431 Monoamine oxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 2
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 229940123934 Reductase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- BRWJOFVUBXZORB-UHFFFAOYSA-N [3-(2-aminoethyl)-1h-indol-5-yl]carbamic acid Chemical compound C1=C(NC(O)=O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 BRWJOFVUBXZORB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005422 alkyl sulfonamido group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960005260 amiodarone Drugs 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940065524 anticholinergics inhalants for obstructive airway diseases Drugs 0.000 description 2
- 229940082992 antihypertensives mao inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 150000001562 benzopyrans Chemical class 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 2
- 229940097320 beta blocking agent Drugs 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 229960002624 bretylium tosilate Drugs 0.000 description 2
- KVWNWTZZBKCOPM-UHFFFAOYSA-M bretylium tosylate Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.CC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1Br KVWNWTZZBKCOPM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- GPUADMRJQVPIAS-QCVDVZFFSA-M cerivastatin sodium Chemical class [Na+].COCC1=C(C(C)C)N=C(C(C)C)C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 GPUADMRJQVPIAS-QCVDVZFFSA-M 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000000812 cholinergic antagonist Substances 0.000 description 2
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- IXTMWRCNAAVVAI-UHFFFAOYSA-N dofetilide Chemical compound C=1C=C(NS(C)(=O)=O)C=CC=1CCN(C)CCOC1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 IXTMWRCNAAVVAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002994 dofetilide Drugs 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 229960000449 flecainide Drugs 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N haloperidol Chemical compound C1CC(O)(C=2C=CC(Cl)=CC=2)CCN1CCCC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229940095570 lescol Drugs 0.000 description 2
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940092923 livalo Drugs 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- HZVOZRGWRWCICA-UHFFFAOYSA-N methanediyl Chemical group [CH2] HZVOZRGWRWCICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940099246 mevacor Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002899 monoamine oxidase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- RHGYHLPFVJEAOC-FFNUKLMVSA-L pitavastatin calcium Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)\C=C\C1=C(C2CC2)N=C2C=CC=CC2=C1C1=CC=C(F)C=C1.[O-]C(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)\C=C\C1=C(C2CC2)N=C2C=CC=CC2=C1C1=CC=C(F)C=C1 RHGYHLPFVJEAOC-FFNUKLMVSA-L 0.000 description 2
- 229940089484 pravachol Drugs 0.000 description 2
- REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N procainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000244 procainamide Drugs 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960004431 quetiapine Drugs 0.000 description 2
- URKOMYMAXPYINW-UHFFFAOYSA-N quetiapine Chemical compound C1CN(CCOCCO)CCN1C1=NC2=CC=CC=C2SC2=CC=CC=C12 URKOMYMAXPYINW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001404 quinidine Drugs 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 229960001534 risperidone Drugs 0.000 description 2
- RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N risperidone Chemical compound FC1=CC=C2C(C3CCN(CC3)CCC=3C(=O)N4CCCCC4=NC=3C)=NOC2=C1 RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003797 solvolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- ZBMZVLHSJCTVON-UHFFFAOYSA-N sotalol Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 ZBMZVLHSJCTVON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002370 sotalol Drugs 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- UIZPEXQHMIZQPQ-IBGZPJMESA-N terikalant Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1CCN(CC[C@@H]2C3=CC=CC=C3OCC2)CC1 UIZPEXQHMIZQPQ-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 229960001722 verapamil Drugs 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- HXTGXYRHXAGCFP-UHFFFAOYSA-N volinanserin Chemical compound COC1=CC=CC(C(O)C2CCN(CCC=3C=CC(F)=CC=3)CC2)=C1OC HXTGXYRHXAGCFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CJDRUOGAGYHKKD-XMTJACRCSA-N (+)-Ajmaline Natural products O[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H]2[C@@H]3[C@H](O)[C@@]45[C@@H](N(C)c6c4cccc6)[C@@H](N1[C@H]3C5)C2 CJDRUOGAGYHKKD-XMTJACRCSA-N 0.000 description 1
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- IVTMXOXVAHXCHI-YXLMWLKOSA-N (2s)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydrazinyl-2-methylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1.NN[C@@](C(O)=O)(C)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 IVTMXOXVAHXCHI-YXLMWLKOSA-N 0.000 description 1
- MKJIEFSOBYUXJB-HOCLYGCPSA-N (3S,11bS)-9,10-dimethoxy-3-isobutyl-1,3,4,6,7,11b-hexahydro-2H-pyrido[2,1-a]isoquinolin-2-one Chemical compound C1CN2C[C@H](CC(C)C)C(=O)C[C@H]2C2=C1C=C(OC)C(OC)=C2 MKJIEFSOBYUXJB-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- FJLGEFLZQAZZCD-JUFISIKESA-N (3S,5R)-fluvastatin Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C(C)C)C(\C=C\[C@H](O)C[C@H](O)CC(O)=O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 FJLGEFLZQAZZCD-JUFISIKESA-N 0.000 description 1
- VDSBXXDKCUBMQC-HNGSOEQISA-N (4r,6s)-6-[(e)-2-[2-(4-fluoro-3-methylphenyl)-4,4,6,6-tetramethylcyclohexen-1-yl]ethenyl]-4-hydroxyoxan-2-one Chemical compound C1=C(F)C(C)=CC(C=2CC(C)(C)CC(C)(C)C=2\C=C\[C@H]2OC(=O)C[C@H](O)C2)=C1 VDSBXXDKCUBMQC-HNGSOEQISA-N 0.000 description 1
- IUTYUDPWXQZWTH-UHFFFAOYSA-N (8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-3-yl) 2,2-diphenylacetate Chemical compound CN1C(C2)CCC1CC2OC(=O)C(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 IUTYUDPWXQZWTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N (8S)-3-(2-deoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NCC2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006700 (C1-C6) alkylthio group Chemical group 0.000 description 1
- HXTGXYRHXAGCFP-OAQYLSRUSA-N (r)-(2,3-dimethoxyphenyl)-[1-[2-(4-fluorophenyl)ethyl]piperidin-4-yl]methanol Chemical compound COC1=CC=CC([C@H](O)C2CCN(CCC=3C=CC(F)=CC=3)CC2)=C1OC HXTGXYRHXAGCFP-OAQYLSRUSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWYZHKAOTLEWKK-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline Chemical class C1=CC=C2CNCCC2=C1 UWYZHKAOTLEWKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTZQTRPPVKQPFO-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzoxazole Chemical compound C1=CC=C2C=NOC2=C1 KTZQTRPPVKQPFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 1-(3,7-dihydroxyphenoxazin-10-yl)ethanone Chemical compound OC1=CC=C2N(C(=O)C)C3=CC=C(O)C=C3OC2=C1 PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001637 1-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(*)=C([H])C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 102000007445 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108010086241 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001622 2-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C(*)C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 2154-56-5 Chemical compound [CH2]C1=CC=CC=C1 SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710158485 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Proteins 0.000 description 1
- 125000004208 3-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C([H])C(*)=C1[H] 0.000 description 1
- UIAGMCDKSXEBJQ-IBGZPJMESA-N 3-o-(2-methoxyethyl) 5-o-propan-2-yl (4s)-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate Chemical compound COCCOC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC(C)C)[C@H]1C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 UIAGMCDKSXEBJQ-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- UFGTZUKOBHLAAC-UHFFFAOYSA-N 4-(5,6-dimethyl-1-benzofuran-2-yl)piperidine Chemical compound O1C=2C=C(C)C(C)=CC=2C=C1C1CCNCC1 UFGTZUKOBHLAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDKDXQMFHSGLKV-UHFFFAOYSA-N 4-[5-(4-nitrophenoxy)pentoxy]benzenecarboximidamide Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1OCCCCCOC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LDKDXQMFHSGLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001255 4-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1F 0.000 description 1
- AWQSAIIDOMEEOD-UHFFFAOYSA-N 5,5-Dimethyl-4-(3-oxobutyl)dihydro-2(3H)-furanone Chemical compound CC(=O)CCC1CC(=O)OC1(C)C AWQSAIIDOMEEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKACIACGQZSZRA-UHFFFAOYSA-N 5-(phenoxymethyl)-2h-tetrazole Chemical class N1=NNN=C1COC1=CC=CC=C1 OKACIACGQZSZRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005479 5-HT2 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000049773 5-HT2A Serotonin Receptor Human genes 0.000 description 1
- LDCYZAJDBXYCGN-VIFPVBQESA-N 5-hydroxy-L-tryptophan Chemical compound C1=C(O)C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 LDCYZAJDBXYCGN-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102100022738 5-hydroxytryptamine receptor 1A Human genes 0.000 description 1
- 101710138638 5-hydroxytryptamine receptor 1A Proteins 0.000 description 1
- 229940000681 5-hydroxytryptophan Drugs 0.000 description 1
- ASXGJMSKWNBENU-UHFFFAOYSA-N 8-OH-DPAT Chemical compound C1=CC(O)=C2CC(N(CCC)CCC)CCC2=C1 ASXGJMSKWNBENU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFZPJDFBJFHYIV-UHFFFAOYSA-N 8-[4-[4-(1,2-benzothiazol-3-yl)piperazin-1-yl]butyl]-8-azaspiro[4.5]decane-7,9-dione Chemical compound C1C(=O)N(CCCCN2CCN(CC2)C=2C3=CC=CC=C3SN=2)C(=O)CC21CCCC2 ZFZPJDFBJFHYIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000321096 Adenoides Species 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010058298 Argininosuccinate synthetase deficiency Diseases 0.000 description 1
- CEUORZQYGODEFX-UHFFFAOYSA-N Aripirazole Chemical compound ClC1=CC=CC(N2CCN(CCCCOC=3C=C4NC(=O)CCC4=CC=3)CC2)=C1Cl CEUORZQYGODEFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940122361 Bisphosphonate Drugs 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 125000000882 C2-C6 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003601 C2-C6 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 102100038220 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 201000011297 Citrullinemia Diseases 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 101150049660 DRD2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000511 Dopamine D1 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004980 Dopamine D2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090001111 Dopamine D2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001506042 Duck influenza virus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224431 Entamoeba Species 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003837 Epithelial Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000140 Epithelial Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000160765 Erebia ligea Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 101100134929 Gallus gallus COR9 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000224466 Giardia Species 0.000 description 1
- 241001272178 Glires Species 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000017911 HTR1A Human genes 0.000 description 1
- 101150015707 HTR1A gene Proteins 0.000 description 1
- 101150104779 HTR2A gene Proteins 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000150562 Hantaan orthohantavirus Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124056 Histamine H1 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101000988577 Homo sapiens 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Proteins 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 101150007193 IFNB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150088952 IGF1 gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 206010022005 Influenza viral infections Diseases 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000004016 L-Type Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000420 L-Type Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UCUNFLYVYCGDHP-BYPYZUCNSA-N L-methionine sulfone Chemical compound CS(=O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O UCUNFLYVYCGDHP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 241001494920 Larus argentatus Species 0.000 description 1
- 241001136801 Larus canus Species 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical class CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100496087 Mus musculus Clec12a gene Proteins 0.000 description 1
- VHWBWHBJEXGPNM-UHFFFAOYSA-N N(2)-(2,4-dichlorophenyl)-N-(7-{[(2,4-dichlorophenyl)amino]sulfonyl}-1-oxo-1,2-dihydronaphthalen-2-yl)glycinamide Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1NCC(=O)NC1C(=O)C2=CC(S(=O)(=O)NC=3C(=CC(Cl)=CC=3)Cl)=CC=C2C=C1 VHWBWHBJEXGPNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 238000004497 NIR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- BDUHCSBCVGXTJM-IZLXSDGUSA-N Nutlin-3 Chemical compound CC(C)OC1=CC(OC)=CC=C1C1=N[C@H](C=2C=CC(Cl)=CC=2)[C@H](C=2C=CC(Cl)=CC=2)N1C(=O)N1CC(=O)NCC1 BDUHCSBCVGXTJM-IZLXSDGUSA-N 0.000 description 1
- ODYFGDACHPDINU-UHFFFAOYSA-N O.O.O.[Ca] Chemical compound O.O.O.[Ca] ODYFGDACHPDINU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000228145 Penicillium brevicompactum Species 0.000 description 1
- 241000228153 Penicillium citrinum Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N Physostigmine Natural products C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)C2C1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- QIZDQFOVGFDBKW-DHBOJHSNSA-N Pseudotropine Natural products OC1C[C@@H]2[N+](C)[C@H](C1)CC2 QIZDQFOVGFDBKW-DHBOJHSNSA-N 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical class C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVOLLAQWKVFTGE-UHFFFAOYSA-N Pyridostigmine Chemical compound CN(C)C(=O)OC1=CC=C[N+](C)=C1 RVOLLAQWKVFTGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001630 Pyrus pyrifolia var culta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002609 Pyrus pyrifolia var. culta Species 0.000 description 1
- 241000918584 Pythium ultimum Species 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical class [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000223996 Toxoplasma Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- FBJARMMBZVBGBO-OCAPTIKFSA-N [(1s,5r)-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]methanol Chemical class C1CC[C@H]2CC[C@@H]1N2CO FBJARMMBZVBGBO-OCAPTIKFSA-N 0.000 description 1
- ANGKOCUUWGHLCE-HKUYNNGSSA-N [(3s)-1,1-dimethylpyrrolidin-1-ium-3-yl] (2r)-2-cyclopentyl-2-hydroxy-2-phenylacetate Chemical compound C1[N+](C)(C)CC[C@@H]1OC(=O)[C@](O)(C=1C=CC=CC=1)C1CCCC1 ANGKOCUUWGHLCE-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- CIUQDSCDWFSTQR-UHFFFAOYSA-N [C]1=CC=CC=C1 Chemical compound [C]1=CC=CC=C1 CIUQDSCDWFSTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 210000002534 adenoid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000002723 alicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- IYABWNGZIDDRAK-UHFFFAOYSA-N allene Chemical group C=C=C IYABWNGZIDDRAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- XSDQTOBWRPYKKA-UHFFFAOYSA-N amiloride Chemical compound NC(=N)NC(=O)C1=NC(Cl)=C(N)N=C1N XSDQTOBWRPYKKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002576 amiloride Drugs 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 125000004397 aminosulfonyl group Chemical group NS(=O)(=O)* 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 125000002490 anilino group Chemical group [H]N(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000561 anti-psychotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940027991 antiseptic and disinfectant quinoline derivative Drugs 0.000 description 1
- 229960004957 aprindine Drugs 0.000 description 1
- NZLBHDRPUJLHCE-UHFFFAOYSA-N aprindine Chemical compound C1C2=CC=CC=C2CC1N(CCCN(CC)CC)C1=CC=CC=C1 NZLBHDRPUJLHCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004421 aryl sulphonamide group Chemical group 0.000 description 1
- FQCKMBLVYCEXJB-MNSAWQCASA-L atorvastatin calcium Chemical compound [Ca+2].C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 FQCKMBLVYCEXJB-MNSAWQCASA-L 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000008316 benzisoxazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229940053197 benzodiazepine derivative antiepileptics Drugs 0.000 description 1
- 150000001557 benzodiazepines Chemical class 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000004663 bisphosphonates Chemical class 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012069 chiral reagent Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 1
- PUFQVTATUTYEAL-UHFFFAOYSA-N cinchocaine Chemical compound C1=CC=CC2=NC(OCCCC)=CC(C(=O)NCCN(CC)CC)=C21 PUFQVTATUTYEAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001747 cinchocaine Drugs 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229940066901 crestor Drugs 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004981 cycloalkylmethyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 229950003040 dalvastatin Drugs 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 125000005047 dihydroimidazolyl group Chemical class N1(CNC=C1)* 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000000312 effect on influenza Effects 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- QQSGDKKFXBGYON-UHFFFAOYSA-N ethoxy-methylperoxy-(6-methyl-2-propan-2-ylpyrimidin-4-yl)oxy-sulfanylidene-$l^{5}-phosphane Chemical compound CCOP(=S)(OOC)OC1=CC(C)=NC(C(C)C)=N1 QQSGDKKFXBGYON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001640 fractional crystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002686 geranylgeranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- FVIZARNDLVOMSU-UHFFFAOYSA-N ginsenoside K Natural products C1CC(C2(CCC3C(C)(C)C(O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O FVIZARNDLVOMSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTQSADJAYQOCDD-UHFFFAOYSA-N ginsenoside-Rd2 Natural products C1CC(C2(CCC3C(C)(C)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC(C(C(O)C1O)O)OC1COC1OCC(O)C(O)C1O ZTQSADJAYQOCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229960002462 glycopyrronium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003878 haloperidol Drugs 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000938 histamine H1 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 150000002462 imidazolines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000000530 impalefection Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 229940079865 intestinal antiinfectives imidazole derivative Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 229940002661 lipitor Drugs 0.000 description 1
- 229960001226 live attenuated influenza Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229960000423 loxapine Drugs 0.000 description 1
- YQZBAXDVDZTKEQ-UHFFFAOYSA-N loxapine succinate Chemical compound [H+].[H+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O.C1CN(C)CCN1C1=NC2=CC=CC=C2OC2=CC=C(Cl)C=C12 YQZBAXDVDZTKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 1
- 230000000936 membranestabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- AGVNHDNTFYHZNL-QGZVFWFLSA-N n,3-dimethyl-n-[(2r)-4-(4-methylpiperidin-1-yl)butan-2-yl]benzenesulfonamide Chemical compound C([C@@H](C)N(C)S(=O)(=O)C=1C=C(C)C=CC=1)CN1CCC(C)CC1 AGVNHDNTFYHZNL-QGZVFWFLSA-N 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002362 neostigmine Drugs 0.000 description 1
- LULNWZDBKTWDGK-UHFFFAOYSA-M neostigmine bromide Chemical compound [Br-].CN(C)C(=O)OC1=CC=CC([N+](C)(C)C)=C1 LULNWZDBKTWDGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229960000715 nimodipine Drugs 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000021049 nutrient content Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229960005017 olanzapine Drugs 0.000 description 1
- KVWDHTXUZHCGIO-UHFFFAOYSA-N olanzapine Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=NC2=CC=CC=C2NC2=C1C=C(C)S2 KVWDHTXUZHCGIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- ZVTQYRVARPYRRE-UHFFFAOYSA-N oxadiazol-4-one Chemical compound O=C1CON=N1 ZVTQYRVARPYRRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004095 oxindolyl group Chemical class N1(C(CC2=CC=CC=C12)=O)* 0.000 description 1
- LDCYZAJDBXYCGN-UHFFFAOYSA-N oxitriptan Natural products C1=C(O)C=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 LDCYZAJDBXYCGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940062042 oxygen 50 % Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940098377 penicillium brevicompactum Drugs 0.000 description 1
- XDRYMKDFEDOLFX-UHFFFAOYSA-N pentamidine Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1OCCCCCOC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 XDRYMKDFEDOLFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004448 pentamidine Drugs 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 description 1
- 229960002340 pentostatin Drugs 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 125000005004 perfluoroethyl group Chemical group FC(F)(F)C(F)(F)* 0.000 description 1
- 229940083254 peripheral vasodilators imidazoline derivative Drugs 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical class OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001697 physostigmine Drugs 0.000 description 1
- PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N physostigmine Chemical compound C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)[C@@H]2[C@@]1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- KYKNRZGSIGMXFH-ZVGUSBNCSA-M potassium bitartrate Chemical compound [K+].OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O KYKNRZGSIGMXFH-ZVGUSBNCSA-M 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 239000001472 potassium tartrate Substances 0.000 description 1
- 229940111695 potassium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011005 potassium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960003910 promethazine Drugs 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003528 protein farnesyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 229960002290 pyridostigmine Drugs 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005514 radiochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- LALFOYNTGMUKGG-BGRFNVSISA-L rosuvastatin calcium Chemical compound [Ca+2].CC(C)C1=NC(N(C)S(C)(=O)=O)=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O.CC(C)C1=NC(N(C)S(C)(=O)=O)=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O LALFOYNTGMUKGG-BGRFNVSISA-L 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000000862 serotonergic effect Effects 0.000 description 1
- 108010006590 serotonin 5 receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000003215 serotonin 5-HT2 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- GZKLJWGUPQBVJQ-UHFFFAOYSA-N sertindole Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1N1C2=CC=C(Cl)C=C2C(C2CCN(CCN3C(NCC3)=O)CC2)=C1 GZKLJWGUPQBVJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000652 sertindole Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 231100000245 skin permeability Toxicity 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 description 1
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RGEBGDYYHAFODH-DHMAKVBVSA-M sodium;(e,3r,5s)-7-[4-(4-fluorophenyl)-2-[methyl(methylsulfonyl)amino]-6-propan-2-ylpyrimidin-5-yl]-3,5-dihydroxyhept-6-enoate Chemical class [Na+].CC(C)C1=NC(N(C)S(C)(=O)=O)=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O RGEBGDYYHAFODH-DHMAKVBVSA-M 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000004059 squalene synthase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229950007576 terikalant Drugs 0.000 description 1
- 229960005333 tetrabenazine Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003558 transferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 125000000876 trifluoromethoxy group Chemical group FC(F)(F)O* 0.000 description 1
- 125000003258 trimethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N vinyl-ethylene Natural products C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008478 viral entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 102000038650 voltage-gated calcium channel activity Human genes 0.000 description 1
- 108091023044 voltage-gated calcium channel activity Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930188494 zaragozic acid Natural products 0.000 description 1
- 229960000607 ziprasidone Drugs 0.000 description 1
- MVWVFYHBGMAFLY-UHFFFAOYSA-N ziprasidone Chemical compound C1=CC=C2C(N3CCN(CC3)CCC3=CC=4CC(=O)NC=4C=C3Cl)=NSC2=C1 MVWVFYHBGMAFLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDOZVRUNCMBHFH-UHFFFAOYSA-N zotepine Chemical compound CN(C)CCOC1=CC2=CC=CC=C2SC2=CC=C(Cl)C=C12 HDOZVRUNCMBHFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способам повышения выхода белка и клеточной продуктивности. Химические соединения способствуют продуцированию клетками-хозяевами биологических молекул для повышения выхода продукта.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в целом относится к способам и композициям для получения биологических молекул (например, биологических препаратов) в клетках-хозяевах, таких как терапевтические, профилактические и диагностические белки. Изобретение относится также к повышению выхода биологических молекул из культивируемых клеток.
Предпосылки создания изобретения
Многие биологические препараты, такие как терапевтические, профилактические и диагностические белки, продуцируются в клетках-хозяевах. Антигены, используемые для приготовления вакцины, например для вакцин против гриппа, зачастую производятся в клетках млекопитающих или в куриных яйцах (Govorkova, et al., Dev. Biol. Stand. 98:39-51, (1998)). Аналогично, многие рекомбинантные белки, в том числе моноклональные антитела и терапевтические средства на основе пептидов, продуцируются в подходящих клетках-хозяевах. Тем не менее, выход в этих системах продуцирования зачастую остается субоптимальным.
Было проведено несколько исследований для повышения выхода антигенных белков или вирусов, продуцируемых в клеточной культуре или яйцах. Производители противогриппозных средств вводили 25 мкг/мл гидрокортизона в качестве добавки в свежий инокулят, используемый для инфицирования яиц с развивающимися эмбрионами (международная патентная публикация WO 02/074336). Для повышения производительной способности клеточных культур тестировали обработку соединениями с малыми молекулами, лекарственными средствами или белками. В международной патентной публикации WO 2012/134130 описано взаимодействие белка CHD6 и полимеразы вируса гриппа в качестве отрицательного модулятора репликации вируса. Гены CHD6 подавлялись инфицированными трансфектирующими, зараженными гриппом клеточными линиями НЕК293Т или А549 с РНК с короткой шпилькой. Этот метод дает примерно 5-10-кратное увеличение титра вируса по сравнению с контрольными клетками.
В другом исследовании, описанном в патенте США № 7132271, описывается, что подавление интерферон-опосредуемых противовирусных ответов, в частности двухцепочечных РНК-зависимых киназ, может вызывать способность клеточных культур стимулировать повышенную репродукцию вируса. Перед заражением вирусом стабильные или транзиторные клетки были модифицированы с получением мутаций с дефицитом PKR или 2-5А синтетазы. Установлено, что EMCV (вирус энцефаломиокардита) может воспроизводиться в PKR-дефицитных клетках при 0,001 TCID50/клетка с тысячекратным и более увеличением вирусной репликации по сравнению с контролем.
В публикации патента США 2013-0315954 раскрывается способ улучшения продуцирования вируса гриппа, при котором продуцирование осуществляется в присутствии ингибитора, имеющего малую молекулу, взаимодействия между белком Mdm2 и белком р53. Соединения, имеющие небольшие молекулы, включают производные имидазолина, производные имидазола, производные оксиндола, производные спироиндолинона, производные хинолина, производные бисарилсульфонамида, производные бензодиазепина, производные пиперидина, производные феноксиуксусной кислоты, производные феноксиметилтетразола, производные халкона, производные тетразола, дисульфидные производные, диаминоарильные производные и пептидные ингибиторы Mdm2 белков. В одном конкретном эксперименте клеточную линию MDCK, зараженную вирусом гриппа H3N2, обрабатывали 0,1, 1,0 и 10 мкМ производного дигидроимидазола (Nutlin-3).
Количественное определение вирусного генома в супернатанте показало, что при исходной множественности заражения (multiplicity of infection - MOI) 10-3 и предварительной обработке нутлином через 24 ч после заражения в супернатанте произведено до 19 раз больше копий вирусного генома по сравнению с контролем.
В международной патентной публикации WO 2012/136852 раскрывается применение фармацевтических лекарственных средств для повышения производительной способности клеток MDCK или А549 продуцирования вируса гриппа А. После инкубирования с лекарственным средством в течение 24-48 ч после заражения определяли титр вируса и активность нейраминидазы. 0,01-10 мкМ симвастатина добавляли перед инокуляцией вирусом гриппа подтипа А и получали примерно 1,5-3-кратное увеличение титра вируса H1N1 при концентрации 1,0 мкМ. Показано, что только один штамм вируса гриппа подтипа A (H1N1, но не H3N2 и H5N1) дает более чем приблизительно 1,5-кратное увеличение титра вируса в клетках, обработанных симвастатином. Повышение выхода вируса для других фармацевтических препаратов с использованием испытанных штаммов вируса гриппа А зависело от штамма, дозы и/или лекарственного средства.
На сегодняшний день в патентной или научной литературе не описано применение соединений, имеющих небольшие молекулы, в очень низких концентрациях, таких как 0,05 мкМ или менее, для повышения выхода биологических молекул в системах клеток-хозяев. Сохраняется потребность в надежном производстве, повышенных эффективностях производства и экономически эффективной технологической переработке биологических продуктов для лечебного, профилактического и диагностического применения.
- 1 036992
Сущность изобретения
Настоящее изобретение в целом представляет способы, которые повышают продуцирование белков, подходящих для фармацевтических областей применения, таких как диагностические, терапевтические или профилактические области применения. Таким образом, изобретение подходит для производства фармацевтических препаратов, например биологических препаратов, включая вакцины.
В широком смысле изобретение включает в себя выявление того, что модуляция определенного(ых) пути(ей) клеточного метаболизма в системе клетки-хозяина может привести к повышенному продуцированию биологических молекул в хозяине. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения, применимые для осуществления настоящего изобретения, могут регулировать липидизацию (пренилирование) белка, биосинтез холестерина и/или сигнальную трансдукцию G-белок-связанного рецептора, такую как внутриклеточная цАМФ-зависимая передача сигнала.
Точнее, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам повышения выхода биологических молекул, таких как рекомбинантные белки и вирусные частицы, полученные в системах клетокхозяев, путем модуляции статин-ассоциированного клеточного пути метаболизма. Без теоретического обоснования данные, представленные в настоящем документе, свидетельствуют о том, что эффект повышения выхода может опосредоваться мевалотаным путем метаболизма, включая как холестеринзависимые, так и холестерин-независимые механизмы действия.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам повышения выхода биологических молекул, таких как рекомбинантные белки и вирусные частицы, полученные в системах клеток-хозяев, посредством модуляции допамин- и/или серотонин-ассоциированного пути клеточного метаболизма. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения подходящие соединения, которые влияют на допаминовый путь и/или серотониновый путь метаболизма, являются селективными лигандами одного или нескольких рецепторов, такими как агонисты и антагонисты (например, полные агонисты, частичные агонисты, нейтральные антагонисты, обратные агонисты и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения такие соединения действуют по меньшей мере через один серотониновый рецептор, включая, но без ограничения, 5-НТ7, 5-НТ1, и/или 5-НТ5 рецепторную передачу сигнала в клеткехозяине. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие соединения действуют посредством 5-НТ7 рецепторной передачи сигнала. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие соединения могут снижать уровни внутриклеточного цАМФ.
Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что наблюдаемые эффекты повышения не ограничиваются ни продуцированием вируса в клетке-хозяине, ни конкретной клеточной линией. Скорее всего, применение подходящих соединений, описанных в данном изобретении (например, соединений, которые могут модулировать статин- и/или 5HTR-асоциировαнную передачу сигнала, включая статины и молекулы, подобные статину, лиганды рецепторов, структурные аналоги или производные, функциональные эквиваленты и их сочетания), может обеспечивать более общие способы повышения продуцирования белка в различных системах клеток-хозяев. Кроме того, авторы настоящего изобретения определили, что некоторые молекулы, представленные в данном изобретении, являются эффективными в повышении продуцирования вируса/белка при применении в удивительно низких концентрациях. Это особенно выгодно для производства фармацевтических продуктов, для которых требуется высокая степень чистоты, подходящая для человека. Таким образом, такие способы подходят для производства биологических препаратов в промышленном масштабе.
Соответственно, представлены способы получения белков в системах клеток-хозяев, таких как клеточные культуры или яйца с развивающимся эмбрионом, включающие контактирование/обработку клетки-хозяина по меньшей мере одним реагентом, выбранным из табл. 1. Остатки в указанных соединениях подробно определены ниже.
- 2 036992
Таблица 1
Название | Структура |
Формула 1 Флувастатин и его аналоги | / /2-Х—Z’ R3 7 Ro |
Формула 2 Питавастатин и его аналоги | Ro /L x—z R |
Формула 3 Аторвастатин и его аналоги | HO ,H Rv LX N—X' / H r/ R4 |
Формула 4 Церивастатин и его аналоги | H0K /° H04 γ γ у coo r4 L ..0 X ,-OH A/B — / R\ 1 R2 Ri R2 ......о ........о г т I II |
Формула 5 Ловастатин/мевастатин и их аналоги (в некоторых вариантах осуществления, за исключением симвастатина) | ΗΟ.//Ο 1 R |
Формула 6 Правастатин и его аналоги | on HOOC ио J R |
Формула 7 Розувастатин и его аналоги | OH OH -COOR4 R.3 ‘^7 T irR N N t R5 |
Формула 8 Сульфонамиды и их аналоги | /(CJU ArSO,--N X ------(CH2)m nr’r2 |
Формула 9 Сложный эфир тропанола, его тропаминамидные аналоги | Ri Ri—(Ат)—X—C—C-ϊ-Rj Rs 0 |
Формула 10 Бензизотиазол, бензизоксазол и их аналоги | R—N N — |
Формула 11 Бензипираны и их аналоги | CH2CH2---N X--R R |
- 3 036992
Формула 12 | НС/ L/*\ /---;9 N---R, 22 '' \/ | ||
Тетрагидропиридин, пиперидин аналоги | и | их | |
Формула 13 | (( )/ СНОН ( N—(СН2)2 (( )) F | ||
Диметоксифенилпиперидинметанол аналоги | и | его | \^/ (Ό \_/ \^/ сн3о осн3 |
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один реагент (например, один или несколько реагентов) для осуществления настоящего изобретения выбран(ы) из соединений, приведенных в табл. 2.
Таблица 2
СОЕДИНЕНИЕ | ФОРМУЛА | INCHI_KEY | СТРУКТУРА |
Соединение А ВА003098-АА-1 | C22H25NO2 | IUTYUDPWXQZWTH- UHFFFAOYSA-N | |
Соединение В CGP006085A-AA-1 | C15H19NO | UFGTZUKOBHLAAC- UHFFFAOYSA-N | |
Соединение С CGP033313-NX-1 | C2oH24F3N30 | DXIYSVWOHCXFHW- UHFFFAOYSA-N | r\ F F |
Соединение D CGS024212A-AG-1 (пентамидин) | c18h21n3o4 | LDKDXQMFHSGLKV- UHFFFAOYSA-N | П 55 1 \ J J 1 0 |
Соединение Е NVP-AFZ077-NX-1 | C19H30N2O2S | YVWGGGGMRDLOGA- GOSISDBHSA-N | Г 1! 4=/ © \ |
- 4 036992
Соединение F NVP-AKS755-AH-1 | c18h25no2s | HOWTKGSYSJEIG- UHFFFAOYSA-N | 111 .. |
Соединение G NVP-BYF589-BA-1 (питавастатин) | c25h24fno4 | VGYFMXBACGZSIL- MCBHFWOFSA-N | „° - H Ύ i 1' । O n o Λ 1 Г I| ! F |
Соединение Н PKF114-213-NX-1 (тиоспирон) | c24h32n4o2s | ZFZPJDFBJFHYIV- UHFFFAOYSA-N | H—0 ·;··Μ \—. ,. '-'pj Q |
Соединение PKF116-328-AE-1 (терикалант) | c24h31no3 | UIZPEXQHMIZQPQ- IBGZPJMESA-N | Я > |
Соединение J PKF117-462-NX-1 (MDL 100907) | c22h28no3f | HXTGXYRHXAGCFP- UHFFFAOYSA-N | . 1 i.p T JU \ |
Как с коммерческой точки зрения, так и с точки зрения безопасности особенно предпочтительно достижение высокого выхода белка в системе клеток-хозяев (например, в культуре клеток и яйцах) при применении соединений, описанных в данном изобретении, в относительно низких концентрациях.
Соответственно, настоящее изобретение представляет способ получения биологических молекул из систем клеток-хозяев, таких как клеточные культуры или яйца, включающий контактирование клеткихозяина по меньшей мере с одним химическим реагентом, таким как статин или производное статина, при низких концентрациях. В некоторых вариантах осуществления изобретения статин или производное статина не является симвастатином. Такой реагент может присутствовать в конечной концентрации в интервале от 0,001 до 10 мкМ, предпочтительно 0,05 мкМ или менее, когда клетка-хозяин представляет собой клеточную культуру. Когда клетка-хозяин представляет собой яйцо с развивающимся эмбрионом, химический реагент может присутствовать в концентрации по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 мкМ на яйцо или более.
Подходящие химические реагенты, используемые в настоящем изобретении, представляют собой химические соединения, которые обладают терапевтической эффективностью и нетоксичны при применении в клетках или животных. Особенно желательно, чтобы такие соединения обладали подробно описанными профилями безопасности для регуляторных целей. Таким образом, применимые химические реагенты могут быть выбраны из коммерчески доступных фармацевтических лекарственных средств, которые были одобрены как безопасные для человека и, таким образом, прошли тщательное тестирование на токсичность и выведение. Такие реагенты особенно подходят в качестве усилителей производительной способности биологических систем продуцирования. Соответственно, способы по изобретению включают известные фармацевтические средства, химические реагенты и их аналоги, описанные в настоящем документе. Предпочтительно эти реагенты применяются в количестве, эффективном для повышения выхода биологического продукта по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 3,5 раза, по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере примерно в 4,5 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 5,5 раза, по меньшей мере примерно в 6 раз, по меньшей мере примерно в 6,5 раз, по меньшей мере примерно в 7 раз, по меньшей мере, примерно в 7,5 раз, по меньшей мере примерно в 8 раз, по меньшей мере примерно в 8,5 раз, по меньшей мере примерно в 9 раз, по меньшей мере примерно в 9,5 раз или примерно в 10 раз или более по сравнению с контролем.
- 5 036992
Способ по настоящему изобретению может также повышать выход биологических молекул или биологических продуктов, которые продуцируются в соответствии с данным изобретением, по меньшей мере на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 500% или более по сравнению с контролем. Предпочтительно повышение выхода можно количественно определить по количеству полученных биологических молекул, например по общему количеству частиц (вРНК копий/мл), инфекционных частиц (IU/мл) или белка (г/мл) в культуральной надосадочной жидкости по сравнению с контролем. Для производства вируса гриппа предпочтительно повышение выхода НА антигена измеряется по сравнению с контролем. Для целей данного изобретения повышение выхода предпочтительно измеряется с помощью обнаружения целевого продукта методом ELISA, для вакцин гриппа - методом HA-ELISA.
Предпочтительными химическими реагентами являются реагенты, которые не подвергаются значительному метаболизированию клетками-хозяевами. Химические реагенты являются стабильными и не подвергаются разложению в присутствии клеток-хозяев, реагентов и в условиях производства, и их наличие может отслеживаться с помощью применяемых методов анализа на протяжении всего производственного процесса. Также предложены способы клиренса или разложения химических реагентов по настоящему изобретению, используемых в системах клеток-хозяев.
Несмотря на то, что химические реагенты не должны присутствовать в очищенном образце (например, продукте), реагенты могут отслеживаться в ходе производственного процесса. Реагенты являются химически стабильными и могут количественно определяться или обнаруживаться в их неметаболизированной форме в супернатанте клеточной культуры через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 и 60 ч контактирования с клеткой-хозяином. Предпочтительно реагенты не подвергаются разложению, что определяется в конечном продукте с помощью масс-спектрометрии с пределом обнаружения 0,5 нг/мл в чистом растворителе (примерно 50% ацетонитрил). При производстве вакцины против гриппа не подвергшиеся метаболизму химические реагенты отсутствуют или их невозможно обнаружить, т.е. в присутствуют в количествах, которые не могут быть обнаружены при пределе обнаружения (limit of detection - LOD) 0,5 нг/мл или менее, в чистом растворителе, в супернатанте клеточной культуры в течение периода до 60 ч после инфицирования (например, при MOI вирусной инфекции 10-3 или 10-4).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлен способ производства биологических продуктов, таких как белки и вирусы, представляющие интерес, в системе клеткихозяина, отличающийся тем, что производство проводится в присутствии по меньшей мере одного химического реагента в конечной концентрации 0,05 мкМ или менее, или в соответствии с которым достигается 2-кратное увеличение выхода продукта.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам производства вирусов из клеточной культуры или яиц с развивающимся эмбрионом с применением по меньшей мере одного химического реагента в конечной концентрации в интервале от 0,001 до 1,0 мкМ, посредством чего достигается по меньшей мере двукратное увеличение производства антигена.
Настоящее изобретение особенно применимо и эффективно при производстве вакцин против гриппа за счет улучшения роста вируса, повышения производительной способности клеток, повышения титра вируса, экспрессии и/или выхода НА антигенов. Способ по настоящему изобретению обеспечивает повышенное количество и дозы антигенных продуктов, полученных из расчета на продуцирующую партию. Соответственно, настоящее изобретение представляет способ получения вируса гриппа в клеткаххозяевах, предпочтительно клетках млекопитающих, более предпочтительно культивируемых клетках, отличающийся тем, что производство осуществляется в присутствии по меньшей мере одного реагента с концентрацией 1 мкМ или менее, предпочтительно 0,05 мкМ или менее, посредством которого вирусные частицы или антигены получают с выходом, более чем в 2 раза превышающим контроль.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет способ получения штамма гриппа В в системах клеток-хозяев, таких как культуры клеток или яйца с развивающимся зародышем, отличающийся тем, что производство проводится в присутствии реагента или его производного и приводит к выходу вирусных частиц или антигенов, более чем в 2 раза превышающему контроль.
В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один химический реагент может применяться для обработки клетки-хозяина до, во время или после трансфекции/инфекцирования клетки-хозяина с помощью вируса или другого вектора. Клетки-хозяева могут контактировать по меньшей мере с одним химическим реагентом в течение периода продолжительностью от 0 до 1 ч, от 0 до 2 ч, от 0 до 3 ч, от 0 до 4 ч, от 0 до 5 ч, от 0 до 12 ч, от 0 до 20 ч, от 0 до 30 ч, от 0 до 40 ч, от 0 до 50 ч, от 0 до 60 ч до или после трансфекции/инфицирования таким образом, чтобы достичь повышения выхода биологического продукта, представляющего интерес.
Кроме того, изобретение представляет способы повышения продуцирования рекомбинантных белков (или их фрагментов), выходы которых считаются неоптимальными (например, низкие выходы и средние выходы) при экспрессии в определенных клетках-хозяевах в типовых условиях роста. Продуцирование белка считается субоптимальным, когда выходы, как правило, находятся в интервале 2-10 мг/л (от средних до низких выходов), в частности примерно 5 мг/л или менее (низкие выходы). Такие способы включают в себя применение одного или нескольких соединений по настоящему изобретению, например статинов и их структурных аналогов (включая симвастатин), их функциональных экви- 6 036992 валентов, а также некоторых GPCR-связывающие реагентов, которые описаны в настоящем изобретении.
Способы по настоящему изобретению особенно полезны для увеличения продуцирования белков, производимых с низкими выходами.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена блок-схема процесса идентификации химических реагентов, которые улучшают выход НА.
На фиг. 2 представлено повышение выхода НА зависимым от дозы образом, количественное определенное с помощью ELISA, для штамма H3N2 IVR-165 при MOI=10-4 через 60 ч после инфицирования (hours post infection - hpi).
На фиг. 3 представлена диаграмма, иллюстрирующая повышение выхода НА, полученное для нескольких штаммов вируса гриппа подтипа A H3N2 с использованием 1 мкМ сульфонамида или 0,05 мкМ питавастатина. В этих исследованиях, как правило, наблюдалось 2-3-кратное повышение выхода НА.
На фиг. 4 представлена гистограмма, показывающая повышенный выход НА, полученный в нескольких штаммах вируса гриппа подтипа В с использованием 1 мкМ сульфонамида и 0,05 мкМ питавастатина. В зависимости от штамма, как правило, наблюдалось по меньшей мере 2-10-кратное повышение выхода НА.
Фиг. 5 показывает повышение выхода НА, которое количественно определено с помощью кПЦР РНКаза-резистетных М транскриптов вируса гриппа: (а) общее количество частиц в сравнении с выходом НА при использовании 1 мкМ сульфонамида или 0,05 мкМ питавастатина; (b) общее количество всех частиц в сравнении с повышением выхода НА при использовании 0,05 мкМ питавастатина.
На фиг. 6 представлен линейный график, показывающий возможность отслеживания соединений с использованием масс-спектрометрии для обнаружения питавастатина и сульфонамида. Предел обнаружения реагентов от чистого растворителя (50% ацетонитрила) составляет приблизительно 0,5 нг/мл.
На фиг. 7 представлено сравнение выхода вируса гриппа подтипа AH3N2 НА (мкг/мл) из клеток, обработанных производными флувастатина и питавастатином в концентрации 0,05 мкМ и контролем.
На фиг. 8 представлено сравнение выхода НА вируса гриппа подтипа А/Техас Х223А (г/мл) из клеток, обработанных коммерчески доступными статинами.
На фиг. 9 представлена вовлеченность биосинтеза холестерина: фиг. 9А иллюстрирует схему мевалонатного пути метаболизма; фиг. 9В показывает, что блокирование всех трех ветвей биосинтеза холестерина специфическими комбинациями ингибиторов ферментов может имитировать влияние правастатина на выход белка в клетках-хозяевах.
На фиг. 10 представлено наглядное сравнение выходов НА в Ambr15 и встряхиваемых колбах; оба соединения повышают выход низко-экспрессирующегося B/Mass/2/12 в средах CDM и DM134 в Ambr15.
На фиг. 11 представлено наглядное сравнение выхода НА в Ambr15 и встряхиваемых колбах; только AFZ077 повышает выход высоко-экспрессирующегося A/VIC/361/1 (IVR165) в средах CDM и DM134 СМИ в Ambr15.
На фиг. 12 представлены выходы НА в штаммах вирусов гриппа А и В при применении двух выявленных соединений-лидеров в двух концентрациях при двух различных плотностях клеток (низкая и высокая ICD), как определено с помощью HA-ELISA.
На фиг. 13 представлена диаграмма, показывающая выход НА в штамме вируса гриппа В, испытанном с BYF589 в указанных концентрациях.
На фиг. 14 представлена диаграмма, показывающая выход НА в штамме вируса гриппа В, испытанном с AFZ077 в указанных концентрациях.
На фиг. 15 представлена диаграмма, показывающая, что повышение выхода НА вируса гриппа с помощью AFZ077 связано со снижением активности 5НТ7 рецептора. Штамм вируса гриппа В (В/Массачусетс) в DM134 среде; выход НА через 65 ч, как измерено с помощью ELISA (г/мл).
На фиг. 16 представлены результаты определения выходов НА вируса гриппа штамма A (IVR165), полученные с помощью ELISA после обработки указанными соединениями в указанных различных концентрациях.
На фиг. 17 представлена диаграмма, показывающая сравнение выходов НА при обработке доступными аналогами, выявленными с помощью SAR, и AFZ077.
На фиг. 18 представлены два графика: (А) выход белка в клетках, обработанных BFY589, относительно необработанных клеток, где каждая точка данных представляет собой тестированный белокмишень; (В) кратность повышения экспрессии белка как функция контрольного выхода (необработанного), где каждая точка данных представляет собой тестированный белок-мишень.
- 7 036992
Подробное описание изобретения
Авторы настоящего изобретения определили способы, которые способствуют повышению продуцирования или экспрессии биологических продуктов системами клеток-хозяев. При прочих равных условиях при добавлении по меньшей мере одного химического реагента по изобретению в низких концентрациях продуцирование значительно улучшается по сравнению с продуцированием биологических молекул соответствующими контрольными клетками, обработанными подходящим носителем, таким как ДМСО, при прочих равных условиях.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения повышение выхода биологических молекул в системах клеток-хозяев является по меньшей мере двукратным по сравнению с соответствующим контролем. Выход биологических молекул, полученных в присутствии химических реагентов, используемых в изобретении, может изменяться в зависимости от индивидуальных особенностей конкретной клетки-хозяина, вируса, белка, химического реагента, определения того, какова желаемая клеточная активность, или других определенных пользователем параметров, обычно используемых в данном экспериментальном анализе. В некоторых вариантах осуществления изобретения выход продуцирования представляющего интерес биологического продукта увеличивается по меньшей мере на 20%, например, по меньшей мере на 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275,300, 350, 400, 450 и 500% по сравнению с контролем (т.е. по сравнению с выходом, полученным без добавленного соединения, но в остальном в эквивалентных условиях).
Подходящие концентрации химических реагентов, используемых в настоящем изобретении, могут быть выбраны в интервале примерно 0,1 нМ - 10 мкМ. Подходящие концентрации соединения, используемого для осуществления изобретения, относятся к концентрациям, эффективным для увеличения выхода продуцирования по сравнению с контролем. Подходящие концентрации могут изменяться в интервале, например, 0,1-5000 нМ, например, 0,5-1000 нМ, 0,5-500 нМ, 0,5-250 нМ, 0,5-200 нМ, 0,5-150 нМ, 0,5-100 нМ, 0,5-75 нМ, 0,5-50 нмоль, 0,5-25 нМ, 0,5-20 нМ, 0,5-15 нМ, 0,5-10 нМ, 0,5-5 нМ, 1-100 нМ, 1-75 нМ, 1-50 нМ, 1-25 нМ, 1-20 нмоль, 1-15 нмоль, 1-10 нМ, 2-50 нмоль, 2-40 нмоль, 2-20 нмоль, 2-10 нмоль, и т.д. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффективные концентрации составляю т<50 нМ, например, <40 нМ, <30 нМ, <25 нМ, <20 нМ, <15 нМ, <14 нМ, <13 нМ, <12 нМ, <11 нМ, <10 нМ, <9 нМ, <8 нМ, <7 нМ, <6 нМ, <5 нМ. Например, химические реагенты, используемые в настоящем изобретении, могут присутствовать в конечной концентрации 0,001-0,5 мкМ, предпочтительно примерно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 или 0,10 мкМ. Предпочтительно химический реагент контактирует с клеткой-хозяином при самой низкой концентрации, что может обеспечивать увеличение выхода продукта по меньшей мере на 20%. Более предпочтительно химический реагент контактирует с клеткой-хозяином при самой низкой концентрации, которая может обеспечить по меньшей мере двукратное увеличение выхода продукта.
Концентрация химического реагента будет также зависеть от конкретного реагента, системы или условий, которые могут привести к результатам, описанным в данном изобретении, и остаются нетоксичными по отношению к клетке-хозяину, вирусу или биологическому продукту. Оптимальные концентрации, которые обеспечивают достижение результатов по изобретению, могут быть скорректированы с использованием стандартных методов. Например, могут подбираться эксперименты для достижения соответствующих условий и результатов в промышленном масштабе.
Некоторые химические реагенты, описанные в данном изобретении, могут характеризоваться их физическими, химическими и фармакологическими свойствами. Эти реагенты могут подвергаться химической обработке для обеспечения реагента при оптимальной концентрация для увеличения выхода биологических продуктов в системах клеток-хозяев, в частности клеточных культурах и яйцах.
В одном аспекте действие или активность некоторых химических реагентов, которые контактируют с клетками-хозяевами, могут быть улучшены с помощью повышения липофильности реагента. Химические и структурные модификации реагентов могут усиливать мембранный транспорт или экспрессию белка. В конкретном аспекте химические реагенты могут быть химически модифицированы для получения пролекарственных аналогов. Стандартные способы получения и применения пролекарств соответствующим образом особенно применимы к химическим реагентам, используемым в настоящем изобретении. См. The Practice of Medicinal Chemistry, Ch. 31-32 (Ed. Wermuth, Academic Press, San Diego, Calif., 2001).
Примеры пролекарств реагентов, применяемых в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными фармацевтическими веществами, которые, как известно, проявляют физиологическое действие в условиях in vivo, таких как гидролиз, метаболизм и т.п., после введения пролекарства субъекту. Как правило, пролекарствами-биопредшественниками являются соединения, которые являются неактивными или обладают низкой активностью по сравнению с соответствующим активным лекарственным соединением и которые содержат одну или несколько защитных групп и превращаются в активную форму в результате метаболизма или сольволиза. И активная форма лекарственного средства, и любые высвобожденные продукты метаболизма должны обладать приемлемой низкой токсичностью. Пролекарства-носители представляют собой лекарственные соединения, которые содержат транспортный фрагмент, например которые улучшают поглощение и/или локализованную доставку на сайт(ы) действия. У такого
- 8 036992 пролекарства-носителя связь между лекарственным фрагментом и транспортным фрагментом желательно представляет собой ковалентную связь, пролекарство является неактивным или менее активным, чем лекарственное соединение, и любой высвобожденный транспортный фрагмент является приемлемо нетоксичным. Для пролекарств, в которых транспортный фрагмент предназначен для усиления поглощения, обычно высвобождение транспортного фрагмента должно быть быстрым. В других случаях желательно использовать фрагмент, который обеспечивает медленное высвобождение, например некоторые полимеры или другие фрагменты, такие как циклодекстрины. Пролекарства-носители могут, например, использоваться для улучшения одного или нескольких из следующих свойств: повышенная липофильность, повышенная продолжительность фармакологических эффектов, повышение сайт-специфичности, снижение токсичности и побочных реакций и/или улучшение характеристик лекарственной формы (например, стабильности, растворимости в воде, подавление нежелательного органолептического или физико-химического свойства). Например, липофильность может быть повышена этерификацией (а) гидроксильных групп липофильными карбоновыми кислотами (например, карбоновой кислотой, содержащей по меньшей мере один липофильный фрагмент) или (b) групп карбоновых кислот липофильными спиртами (например, спиртом, содержащим по меньшей мере один липофильный фрагмент, например алифатическими спиртами). Химические реагенты, используемые в настоящем изобретении, модифицируются для способствования производительной способности систем клеток-хозяев, экспрессиирующих биологические продукты in vitro.
Таким образом, изобретение относится к химическим реагентам в форме обычных фармацевтически приемлемых кислот, например малеиновой, хлористоводородной, бромистоводородной, фосфорной, уксусной, фумаровой, салициловой, лимонной, молочной, миндальной, винной и метансульфоновой. Химические реагенты могут также образовывать сольваты, такие как гидраты, и изобретение также распространяется на эти формы.
Следует отметить, что структура некоторых химических реагентов, используемых в настоящем изобретении, может содержать один или несколько стереоцентров, и каждый центр может существовать в R- или S-конфигурации или их комбинациях. Аналогично, соединения, представленные в данном изобретении, могут содержать одну или несколько двойных связей, и каждая из них может существовать в Е (транс) или Z (цис) конфигурации или их комбинации. Следует иметь в виду, что представление одного конкретного стереоизомера, региоизомера, диастереомера, энантиомера или эпимера включает все возможные стереоизомеры, региоизомеры, диастереомеры, энантиомеры или эпимеры и их смеси. Таким образом, соединения, представленные в настоящем изобретении, включают все отдельные стереоизомерные, региоизомерные, диастереомерные, энантиомерные и эпимерные формы, а также их соответствующие смеси. Следует иметь в виду, что представление одной конкретной химической структурой или химическое название соединения, которое содержит один или несколько хиральных центров, но не определено конкретной стереохимией, включает все возможные стереоизомеры, включая смеси всех возможных стереоизомеров, чистые формы или практически чистые формы одного конкретного стереоизомера и чистые формы или практически чистые формы альтернативного стереоизомера. Методики обращения или оставления без изменений конкретного стереоцентра и методики разделения смесей стереоизомеров хорошо известны в данной области, и специалисты данной области техники могут выбрать подходящий метод для конкретной ситуации (См., например, Furniss et al. (eds.), VOGEL'S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5th ED., Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, 809-816; and Heller, Acc. Chem. Res. 1990, 23, 128).
Любой асимметричный атом (например, атом углерода или т.п.) реагента(ов), используемого(ых) в настоящем изобретении, может быть представлен в рацемической или энантиомерно обогащенной конфигурации, например (R)-, (S)- или (R, S)-конфигурации. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый асимметричный атом имеет по меньшей мере 50% энантиомерный избыток, по меньшей мере 60% энантиомерный избыток, по меньшей мере 70% энантиомерный избыток, по меньшей мере 80% энантиомерный избыток, по меньшей мере 90% энантиомерный избыток, по меньшей мере 95% энантиомерный избыток или по меньшей мере 99% энантиомерный избыток (R)- или ^-конфигурации. Заместители на атомах с ненасыщенными связями могут, если это возможно, присутствовать в цис-(Z)или транс-(Е)-форме. Химические реагенты по настоящему изобретению могут быть представлены в виде рацемической смеси, содержащей R- или S-форму, или, альтернативно, энантиомерно обогащенной Rили S-формой и/или в зависимости от желаемого уровня функциональной активности в каждом энантиомере.
Любые полученные смеси изомеров могут быть разделены на основе отличия физико-химических свойств составляющих в чистые или по существу чистые геометрические или оптические изомеры, диастереоизомеры, рацематы, например, с помощью хроматографии и/или фракционной кристаллизации.
Химические реагенты, используемые в настоящем изобретении, могут быть разработаны или смоделированы с помощью общего химического анализа. Например, специалист в данной области техники сможет модифицировать компоненты и боковые группы соединения с получением конформационного аналога при использовании соотношения структура-активность (structure-activity relationships - SAR).
- 9 036992
Целями SAR являют предоставление каждого достаточного активного соединения для дальнейшего профилирования биологической активности. Структуры могут быть определены, главным образом, на основе данных масс-спектрометрии и ядерного магнитного резонанса.
Выделение и очистка химических реагентов, промежуточных соединений и аналогов достигаются, если это желательно, с помощью любой подходящей методики разделения или очистки, такой как, например, фильтрация, экстракция, кристаллизация, колоночная хроматография, тонкослойная хроматография, тонкослойная хроматография, центробежная хроматография, ВЭЖХ или комбинацией этих методик. Конкретные примеры подходящих методик синтеза и выделения можно найти в патентах, описанных в настоящем документе, которые включены в данное изобретение во всей полноте в качестве ссылок.
Проблемой добавления синтетических соединений к процессу производства является потенциальная токсичность продуктов разложения, таких как метаболиты. Продуктами разложения могут быть метаболиты соединения, полученные в результате его биотрансформации в клетке-хозяине, например биотрансформации в более полярную молекулу, такой как окисление, восстановление. Продукт разложения может отличаться от исходного соединения по таким параметрам, как молекулярная масса, степень растворимости и молекулярная структура или композиция. Поскольку продукты разложения подвергаются технологической переработке, есть вероятность того, что концентрация этих продуктов разложения может достичь неприемлемых уровней, которые являются особенно проблематичным в последующих процессах.
Анализы выведения химического реагента, метаболита или их аналогов по существу могут проводиться, как описано в настоящем изобретении. Методы количественного определения или идентификации метаболита известны специалистам в данной области техники в свете применения стандартных аналитических методов, включая ВЭЖХ, ТСХ, электрохимический анализ, масс-спектроскопию, спектроскопию показателя преломления, ультрафиолетовую спектроскопию, флуоресцентный анализ, радиохимический анализ, спектроскопию в ближней инфракрасной области, спектроскопию ядерного магнитного резонанса, анализ рассеяния света и другие способы, известные в данной области техники.
В одном аспекте химические реагенты, используемые в настоящем изобретении, по существу не метаболизируются или не подвергаются разложению во время технологической обработки, очистки или концентрации НА антигенов вируса гриппа. Следовые количества неметаболизированных соединений могут оставаться после очистки вируса гриппа, как определено с помощью масс-спектроскопии, обычно менее 0,25% от первоначально введенного количества остается после очистки.
Уровни содержания метаболита, присутствующие в среде или продукте, не должны превышать, например, более примерно 1%, более примерно 2%, более примерно 3%, более примерно 4%, более примерно 5%, более примерно 10%, более примерно 20%, более примерно 30%, более примерно 40%, более примерно 50% по меньшей мере одной испытанной активности исходного соединения или введенного количества выбранного химического реагента.
В одном аспекте химические реагенты не обнаруживаются в очищенном образце. Химические реагенты могут отслеживаться, как показано в данном изобретении при пределе обнаружения (LOD) примерно 0,5 нг/мл чистого растворителя (50% ацетонитрил). Предпочтительно любые химические реагенты, которые могут присутствовать в очищенном образце, обнаруживаются при 0,5 нг/мл или менее в супернатанте клеточной культуры, более предпочтительно в очищенном образце, таком как конечный продукт, который представляет собой монопродукт, содержащий одновалентные частицы вируса гриппа или антигена.
Аналоги статина.
Применение симвастатина в качестве усилителя роста было описано ранее (см выше). Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что некоторые другие статиновые соединения способствуют увеличению выхода биологических молекул, продуцируемых в системах клеток-хозяев. Эти статиновые реагенты могут повышать выход по меньшей мере в 2 раза при низких концентрациях статинов. В конкретном аспекте химические реагенты, описанные в данном изобретении, удивительным образом нашли широкое применение на многих подтипах и штаммах гриппа в особенно низких концентрациях.
Принципы настоящего изобретения в целом могут широко применяться со многими статинами, но предпочтительно отличными от симвастатина. Значение и определение ингибитора 3-гидрокси-3метилглутарил-коэнзим-А редуктазы (ингибитор HMG-KoA редуктазы) в данном изобретении относится к любому селективному, конкурентному ингибитору HMG-KoA редуктазы, скоростьлимитирующего фермента, превращающего HMG-KoA в мевалонат, которые обычно называют холестерин-понижающими статинами.
Статины описываются характерной структурой, состоящей из фрагмента гептеновой или гептановой кислоты (в форме свободной кислоты, соли или лактона), связанного с ароматическим или алициклическим ядром. Биологическая активность статинов тесно связана с их стереохимией, особенно в конфигурации хиральных атомов указанного фрагмента гептеновой или гептановой кислоты. Статины и их аналоги являются коммерчески доступными и широко используются для ингибирования превращения мевалоната с помощью HMG-KoA редуктазы в холестерины. Анализы определения действия статинов
- 10 036992 через данный биологический путь метаболизма раскрыты в патенте США № 4231938.
Статины можно разделить на две группы: полученные в результате брожения и синтетические. Природные статины являются производными метаболитов грибов (ML-236В/компактин/монокалин K), выделенных из Pythium ultimum, Monacus ruber, Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum и Aspergillus terreus, хотя было показано, что они могут быть получены и синтетическим путем. В качестве примера статин может быть выбран из аторвастатина, мевастатина (или компактина), флуиндостатина, велостатина, флувастатина, далвастатина, церивастатина, пентостатина, розувастатина, ловастатина (такого как мевинолин), питавастатина, симвастатина или их аналогов.
Статиновые производные хорошо известны в литературе и могут быть получены способами, описанными в публикации The Peptides: Vol. 5, Analysis, Synthesis, Biology: Academic Press NY (1983) и в патенте США № 4397786. Различные аналоги статина, которые увеличивают экспрессию и выход биологических молекул и продуктов, в частности биологических продуктов вируса гриппа, получены из куль тивируемых клеток и яиц.
Любой из этих статинов и их аналогов может применяться в настоящем изобретении.
Формула 1 - Флувастатин и родственные аналоги.
В одном предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению химического реагента формулы 1 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в системах клеток-хозяев, таких как культура клеток, или в яйцах. Формула 1 включает статин структуры:
Формула 1
где один из R и R0 представляет собой 5а , а другой представляет собой первичный или вто ричный C1-6алкил, не содержащий асимметричный атом углерода, С3-6циклоалкил или фенил-(CH2)m-, где R4 представляет собой водород, C1-3алкил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, C1-3алкокси, н-бутокси, изобутокси, трифторметил, фтор, хлор, фенокси или бензилокси, R5 представляет собой водород, C1-3алкил, C1-3алкокси, трифторметил, фтор, хлор, фенокси или бензилокси, R5a представляет собой водород, C1-2алkил, C1-2алкокси, фтор или хлор и m равно 1, 2 или 3, при условии, что оба R5 и R5a должны представлять собой водород, когда R4 представляет собой водород, R5a должен представлять собой водород, когда R5 представляет собой водород, не более чем один из R и R5 представляет собой трифторметил, не более чем один из R и R5 представляет собой фенокси, не более чем один из R4 и R5 представляет собой бензилокси;
R2 представляет собой водород, C1-3алkил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, С3-6циклоалкил, C1-3алкокси, н-бутокси, изобутокси, трифторметил, фтор, хлор, фенокси или бензилокси;
R3 представляет собой водород, C1-3алкил, C1-3алкокси, трифторметил, фтор, хлор, фенокси или бензилокси при условии, что R3 должен представлять собой водород, когда R2 представляет собой водород, не более чем один из R2 и R3 представляет собой трифторметил, не более чем один из R2 и R3 представляет фенокси и не более чем один из R2 и R3 представляет собой бензилокси;
X представляет собой -(CH2)n- или -CH=CH-, где n равно 0, 1, 2 или 3; и
Z представляет собой
или где R6 представляет собой водород или C1-3алkил и
R7 представляет собой водород, C1-3алкил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, бензил или М, где М представляет собой фармацевтически приемлемый катион.
Натриевая соль флувастатина, выпускаемая в продажу фирмой Novartis Pharmaceuticals под названием Лескол (LESCOL), может быть получена как описано в патенте США № 5354772. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения аналог статина формулы 1 представляет собой флувастатин (C24H26FNO4 или (3R,5S,6Е)-7-[3-(4-фторфенил)-1-(пропан-2-ил)-1Н-индол-2-ил]-3,4дигидроксигепт-6-еновая кислота) следующей структуры:
- 11 036992
Повышенная клеточная активность может быть получена при конечной концентрации флувастатина или его аналогов в интервале от 0,001 до 10 мкМ. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, но без ограничения, оптимальная конечная концентрация флувастатина составляет 0,05 мкМ или менее.
Формула 2 - Питавастатин и родственные аналоги.
В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к применению химического реагента формулы 2 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в системах клеток-хозяев, таких как культура клеток, или следующей структуры:
в яйцах. Предпочтительно формула 2 включает статины
Формула 2 где каждый из R и R0 независимо представляет собой C1-6aлкил (первичный, вторичный или третичный), С3-7циклоалкил или цикл А
каждый из R1, R2, R3, R4 и R5 независимо представляет собой водород, C1.4aлкил, C1.4алкокси, трифторметил, фтор, хлор, фенокси, бензилокси или гидроксильную группу; при условии, что не более чем один из R1 и R2 представляет собой трифторметил, не более чем один из R1 и R2 представляет собой фенокси, не более чем один из R1 и R2 представляет собой бензилокси, не более чем один из R1 и R2 представляет собой гидроксильную группу, не более чем один из R3-R5 представляет собой трифторметил, не более чем один из R3-R5 представляет собой гидроксильную группу;
X представляет собой -(CH2)2- или -CH^CH- (цис и/или транс);
Z представляет собой
,
или или
где Q представляет собой
при условии, что Q может представлять собой
, только когда X представляет собой -CH=CH и/или R6 представляет C1-3αлкил;
R6 представляет собой водород или C1-3aлкил;
R7 представляет собой водород, R8 или М;
R8 представляет собой физиологически приемлемую и гидролизуемую эфирную группу;
М представляет собой фармацевтически приемлемый катион.
Кальциевая соль питавастатина, выпускаемая в продажу фирмой Kowa Co. под названием Ливало (LIVALO), может быть получена, как описано, среди прочих, в патенте США № 5753675. В особенно предпочтительном варианте осуществления используется питавастатин (изображен как соединение G в табл. 2), который представляет собой аналог статина формулы 2 (C24FNO4 или (3R,5S,6Е)-7-[2циклопропил-4-(4-фторфенил)хинолин-3-ил)-3,5-дигидроксигепт-6-еновая кислота) следующей структуры:
- 12 036992
Повышенную клеточную активность получают при конечной концентрации производных формулы 2 в интервале от 0,001 до 10 мкМ. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, но без ограничения, оптимальная конечная концентрация питавастатина составляет 0,05 мкМ или менее. В качестве примера, как описано далее в настоящем изобретении, неожиданно было установлено, что питавастатин является более эффективным в повышении выхода продуцирования белка в концентрации 5 нМ, чем в концентрации 50 нМ, которая, в свою очередь, более эффективна, чем концентрация 500 нМ. Это особенно выгодно при производстве терапевтических композиций для применения человеком.
Однако данное изобретение не ограничивается исключительно питавастатиновыми или флувастатиновыми реагентами. Аналоги формулы 1 и 2 были испытаны и привели к неожиданным эффектам, охватываемым настоящим изобретением. Эти аналоги были протестированы как дополнительно описано ниже.
Формула 3 - Аторвастатин и родственные аналоги.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению химического реагента формулы 3 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в системах клеток-хозяев, таких как культура клеток, или в яйцах. Предпочтительно формула 3 включает статиновой аналог следующей структуры:
Формула 3 где X представляет собой -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- или -CH2CH(CH3)-;
R1 представляет собой 1-нафтил; 2-нафтил; циклогексил; норборненил; 2-, 3- или 4-пиридинил; фенил, фенил, замещенный фтором, хлором, бромом, гидроксильной группой; трифторметил; алкил, содержащий от одного до четырех атомов углерода, алкокси, содержащий от одного до четырех атомов углерода, или алканоилокси, содержащий от двух до восьми атомов углерода;
один из R2 или R3 представляет собой -CONR5R6, где R5 и R6 независимо представляют собой водород; алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода; 2-, 3- или 4-пиридинил; фенил; фенил, замещенный фтором, хлором, бромом, циано, трифторметилом или карбоалкокси-группой, содержащей от трех до восьми атомов углерода; а другой из R2 или R3 представляет собой водород; алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода; циклопропил; циклобутил; циклопентил; циклогексил; фенил; или фенил, замещенный фтором, хлором, бромом, гидроксильной группой; трифторметил; алкил, содержащий от одного до четырех атомов углерода, алкокси, содержащий от одного до четырех атомов углерода, или алканоилокси, содержащий от двух до восьми атомов углерода;
R4 представляет собой алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода; циклопропил; циклобутил; циклопентил; циклогексил; или трифторметил.
Кальциевую соль аторвастатина, выпускаемую в продажу фирмой Pfizer под названием Липитор (LIPITOR), получают, как описано, среди прочих, в патенте США № 5273995. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения аналог статина формулы 3 представляет собой аторвастатин (C33H34FN2O5; [R-(R*,R*)]-2-(4-фторфенил)-β, тригидрат кальциевой соли δ-дигидрокси-5-(1метилэтил)-3-фенил-4-[(фениламино)карбонил]-1Н-пиррол-1-гептановой кислоты (2:1)) следующей структуры:
Формула 4 - Церивастатин и родственные соединения.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению химического реагента формулы 4 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Предпочтительно формула 4 включает в себя аналог статина следующей структуры:
- 13 036992
Формула 4 где А - В представляет собой радикал формулы -CH=CH- или -CH2-CH2-;
Z представляет собой радикал формулы! -CH или атом азота;
R1, R2 и R3 независимо друг от друга представляют собой водород, насыщенный или ненасыщенный, линейный или разветвленный углеводородный радикал, который содержит до 6 атомов углерода и, необязательно, может быть замещенным на концевом атоме углерода насыщенным или ненасыщенным циклическим углеводородным радикалом, содержащим 3-6 атомов углерода, циклическим углеводородным радикалом, содержащим 3-7 атомов углерода и насыщенным или ненасыщенным один или два раза, ароматическим радикалом, выбранным из группы, включающей фенил, фурил, тиенил или пиридинил, который может необязательно нести на ядре 1-3 одинаковых или разных заместителя, выбранных из группы, включающей галоген, трифторметил, алкил или алкенил, каждый из которых содержит до 6 атомов углерода, гидроксильную группу, алкоксигруппу, содержащую 1-6 атомов углерода, карбоксильную группу или карбалкоксильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода в алкоксильном фрагменте;
R4 представляет собой водород, прямой или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный углеводородный радикал, содержащий до 5 атомов углерода, бензильный радикал, ядро которого может быть замещенным 1-2 раза галогеном или алкильным радикалом, содержащим 1-4 атома углерода, ион щелочного металла или аммония NR5R6R7R8, где R5, R6, R7 и R8 являются одинаковыми или разными и представляют собой водород, алкил, содержащий 1-4 атомов углерода, или гидроксиалкил, содержащий 1-4 атома углерода.
Натриевая соль церивастатина, выпускаемая на рынок фирмой Bayer под названием Байкол (BAY COL), может быть получена, как описано, среди прочих, в патенте США № 5177080. В особенно предпочтительном варианте осуществления аналог статина формулы! 4 представляет собой церивастатин ([S[R*,S*-(Е)]]-7-[4-(4-фторфенил)-5-метоксиметил)-2,6-бис-(1-метилэтил)-3-пиридинил]-3,5-дигидрокси-6гептеноат; C26H33FNO5Na) следующей структуры:
Формула 5 - Ловастатин/мевастатин и их родственные соединения.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению химического реагента формулы! 5 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Предпочтительно формула 5 включает аналог статина следующей структуры:
Формула 5 где R представляет собой атом водорода, гидроксильную группу или 2-метилбутирилоксигруппу (-OCOCH(CH3)CH2CH3).
Ловастатин, выпускаемый на рынок фирмой Merck под торговым названием Мевакор (MEVACOR), может быть получен, как описано, среди прочих, в патенте США № 4231938. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения статиновый аналог формулы 5 представляет собой ловастатин ([1S-[1α(R*),3α,7α,8α(2S*,4S*),8aα]]-l,2,3,7,8,8а-гексагидро-3,7-диметил-8-[2-(тетрагидро-4-гидрокси-6оксо-2Н-пиран-2-ил)этил]-1-нафталенил-2-метилбутаноат; С36О36О5) следующей структуры:
- 14 036992
В еще одном особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения аналог статина формулы 5 представляет собой мевастатин (1S,7R,8S,8aR)-8-{2-[(2R,4R)-4-гидрокси-6-оксотетрагидро2Н-пиран-2-ил]этил}-7-метил-1,2,3,7,8,8а-гексагидронафтαлин-1-ил-(2S)-2-метилбутаноат; С23Н34О6) следующей структуры:
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения симвастатин, который является аналогом формулы 5, не применяется.
Формула 6 - Правастатин и родственные соединения.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению химического реагента формулы 6 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Предпочтительно формула 6 включает аналог статина следующей структуры:
Формула 6 где R представляет собой группу структуры:
и лактоны с закрытым кольцом, их соли и сложные эфиры.
Натриевая соль правастатина, выпускаемая на рынок фирмой Bristol-Myers-Squibb под торговым названием Правахол (PRAVACHOL), может быть получена, как описано, среди прочих, в патенте США № 4346227. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения аналог статина формулы 6 представляет собой правастатин (1-нафталингептановая кислота, 1,2,6,7,8,8а-гексагидро-β,δ,5,6-тригидрокси-2-метил-8-(2-метил-1-оксобутокси)-, мононатриевая соль 1S-[1α(βS*,δ5S*),2α,6α,8β(R*),8aα]C23H35NaO7) следующей структуры:
Формула 7 - Розувасатин и родственные соединения.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению химического реагента формулы 7 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Предпочтительно формула 7 включает аналог статина следующей структуры:
- 15 036992
Формула 7 где R1 представляет собой низший алкил, арил или аралкил, каждый из которых может содержать один или несколько заместителей;
R2 и R3, каждый независимо, представляют собой водород, низший алкил или арил, и каждый из указанных низшего алкила и арила может содержать один или несколько заместителей;
R4 представляет собой водород, низший алкил или катион, способный образовывать нетоксичную фармацевтически приемлемую соль;
X представляет собой атом серы, атом кислорода, сульфонил или иминогруппу, которая может содержать заместитель;
пунктирная линия означает наличие или отсутствие двойной связи или соответствующий лактон с замкнутым кольцом.
Натриевая соль розувастатина, выпускаемая на рынок фирмой AstraZeneca под торговым названием Крестор (CRESTOR), может быть получена, как описано, среди прочих, в патенте США № 4346227. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения аналог статина формулы 7 представляет собой розувастатин (бис-[(Е)-7-[4-(4-фторфенил)-6-изопропил-2-[метил(метилсульфонил)амино]пиримидин-5-ил](3R,5S)-3,5-дигидроксигепт-6-еновая кислота]; C22H27FN3O6S2) структуры, представленной ниже.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способам повышения выхода продуцирования представляющих интерес биологических продуктов в клетках-хозяевах, включающим ингибирование мевалонатного пути метаболизма клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ингибирование мевалонатного пути метаболизма включает в себя прямое или непрямое ингибирование самого мевалоната. Кроме того или в качестве альтернативы, ингибирование мевалонатного пути метаболизма может включать в себя ингибирование передачи сигнала вниз по каскаду передачи сигнала, а именно, путей передачи сигнала, которые контролируют пренилирование белка и биосинтез холестерина соответственно. Как показано на фиг. 9В, блокирование всех трех ветвей пути метаболизма мевалоната комбинациями специфических ингибиторов ферментов может имитировать действие правастатина на выход белка в клетках-хозяевах. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения применяются специфические ингибиторы ферментов, которые катализируют пути метаболизма, такие как ингибиторы сквален-синтетазы (например, зарагозовые кислоты), ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы геранилгеранилтрансферазы и любые их сочетания. Таким образом, данное изобретение предоставляет один или несколько ингибиторов мевалонатного пути метаболизма для применения в производстве биологических продуктов в клетке-хозяине. Изобретение также представляет способы производства биологического продукта, включающие в себя стадию ингибирования мевалонатного пути метаболизма клетки-хозяина, в которых ингибирование может включать контактирование клетки-хозяина с одним или несколькими ингибиторами ферментов, задействованными в белковом пренилировании, и синтеза холестерина. Изобретение включает биологический продукт, полученный любым из указанных способов.
Соединения, не являющиеся производными статинов.
Настоящее изобретение включает также соединения, не являющиеся производными статинов (далее нестатиновые соединения), которые могут применяться для повышения выхода биологических молекул в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения подходящие нестатиновые соединения для осуществления настоящего изобретения представляют собой реагенты, которые действуют посредством серотонин-ассоциированного пути метаболизма, допамин-ассоциированного пути метаболизма или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения подходящие соединения представляют собой реагенты, которые модулируют определенные G-белок-связанные рецепторы.
- 16 036992
Формула 8 - Сульфонамиды, их аналоги и другие обратные агонисты 5НТ7.
В одном аспекте химические реагенты, применяемые в настоящем изобретении, включают сульфонамидные аналоги. Сульфонамидные аналоги были идентифицированы как обратные агонисты G-белок-связанных рецепторов (G-protein-coupled-receptors - GPCR), в частности обратные агонисты 5НТ7. Соответственно, настоящее изобретение также включает в себя применение химических реагентов, которые взаимодействуют 5НТ7 рецепторами или модулируют 5НТ7 рецепторы, в частности обратных агонистов 5НТ7. Другие агонисты 5НТ7, охватываемые данным изобретением, включают, но без ограничения, арилсульфонамиды на основе арилпиперазин- и 1,2,3,4-тетрагидроизохинолинов (Vermeulen, et al. (2004), Journal of Medicinal Chemistry, 47, 5451-5466), 5-гидрокситриптофан, 8-гидрокси-2-(ди-н-пропиламино)тетралин 1-Br (8-ОН DPAT) и 5-карбоксиаминотриптамин (5-СТ) (Siddiqui, et al. (2007), Pharmacology Biochemistry and Behavior, 87, 386-392).
В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет применение химического реагента формулы 8 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Предпочтительно формула 8 включает сульфонамидные соединения следующей структуры:
/(СНЛ,
ArSO2---II X \ ~T^R3
------(СН2)т nr’r2
Формула 8 где Ar представляет собой необязательно замещенный моно- или бициклический ароматический или гетероароматический цикл;
R1 и R2 независимо представляют собой водород, C1-6алкил, арил-C1-6алкил или вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенное 5-7-членное гетероциклическое кольцо, необязательно содержащее дополнительный гетероатом, выбранный из атома азота, атома серы или атома кислорода, причем атом азота является замещенным атомом водорода, C1-6алкилом, С3-7циклоалкилом или необязательно замещенной арильной, гетероарильной или арил-С1-6алкильной группой;
R3 представляет собой водород или C1-6алкил;
X представляет собой атом кислорода, атом серы или связь;
N равно 2 или 3;
m равно 1 или 2.
C1-6алкильные группы, сами по себе или как часть другой группы, могут быть прямыми или разветвленными. Необязательные заместители для ароматических и гетероароматических групп включают в себя C1-6алкил, необязательно замещенный NR7R8, С2-6алкенил, С2-6алкинил, C1-6алкилтио, циано, нитро, галоген, CF3, C2F5, NR7R8, CONR7R8, NR7COR8, S(O)PNR14 CHO, OCF3, SCF3, COR9, CH2OR9, CO2R9 или 0R9, где р равно 1 или 2, и R7, R8 и R9 независимо представляют собой водород, С1-6алкил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный арил-С1-6алкил. Могут присутствовать несколько заместителей, и в случае нескольких заместителей они могут быть одинаковыми или разными.
Соответственно, Ar представляет собой необязательно замещенный моно- или бициклический ароматический или гетероароматический цикл. Предпочтительно Ar представляет собой необязательно замещенную нафтильную, фенильную или тиенильную группу. Наиболее предпочтительно Ar представляет собой нафтил, фенил или тиенил, замещенный одним или несколькими атомами галогенов, в частности, 2,3-дибромтиенил. В R1 и R2 необязательные заместители для гетероциклических колец включают C1-6 алкил. Предпочтительно R1 и R2 образуют необязательно замещенное 5-7-членное гетероциклическое кольцо, в частности необязательно замещенное б-членное кольцо. Наиболее предпочтительно R1 и R2 образуют пиперидиновое кольцо, необязательно замещенное одной или двумя метильными группами, или R1 и R2 образуют пиперазиновое кольцо, замещенное по атому азота необязательно замещенным арильным кольцом.
Предпочтительно R3 представляет собой водород.
Предпочтительно X представляет собой связь.
Предпочтительно n и m принимают такие значения, что вместе с X образуют часть 5- или 6-членного кольца.
Предпочтительная оптимальная конечная концентрация соединения формулы 8 составляет 1,0 мкМ или менее.
Особенно предпочтительным сульфонамидным аналогом формулы 8 является (C19H30N2SO2), который может быть получен, как описано в патенте США № 6265408, и структура которого соответствует формулам:
- 17 036992
или
Неограничивающий вариант осуществления изобретения представлен как соединение Е в табл. 2, которое представляет собой обратный агонист серотонина 5НТ-2 и 5НТ-7-рецепторов. Обратный агонист представляет собой реагент, который связывается с тем же рецептором, что и агонист, но вызывает фармакологическую реакцию, противоположную реакции, которую вызывает агонист. Таким образом, необходимым условием для обратного агониста является то, что рецептор должен иметь конститутивный (также известный как внутренний или базальный) уровень активности в отсутствие какого-либо лиганда. Это означает, что обратный агонист снижает активность ниже базального уровня.
Было известно, что при связывании с лигандом 5НТ7 рецептор передает сигналы посредством увеличения внутриклеточного цАМФ через активность аденилилциклазы (АЦ). Обнаружение s в примере 13 (фиг. 15) свидетельствует о том, что повышение выхода продукции зависит от снижения лигандопосредованной активности рецептора 5НТ7, поскольку эффекты повышения могут быть аннулированы при наличии серотонина (5НТ), который должен конкурировать с ингибитором в связывании с рецепто ром.
Формула 9 - Сложные эфиры тропанола, их аналоги и другие ингибиторы ауторецепторов.
В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение предоставляет применение химического реагента формулы 9 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Молекулы этого класса были идентифицированы в качестве ингибиторов пресинаптических ауторецепторов и действуют как антихолинергические средства. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя применение химических реагентов, которые модулируют пресинаптические ауторецепторы и другие пресинаптические гетерорецепторы на холинергической синапсе, включая, но без ограничения, 7-(4-[4-(2,3-дихлорфенил)-1-пиперазинил]бутокси)-3,4-дигидро-2(1Н)хинолинон (Kikuchi, et al. (1995), The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 274, 329-336) и (-)-3-(3-гидроксифенил)-N-проnилпиперидин [(-)-3-РРР] (Thorberg, et al. (1987), Journal of Medicinal Chemistry, 30, 2008-2012). Антихолинергические средства по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, неостигмин, гликопирроний, физостигмин и пиридостигмин (Nair, et al. (2004), Continuing Education in Anaesthesia, Critical Care & Pain, 4, 164-168).
Предпочтительно формула 9 включает аналоги тропанила следующей структуры:
Кг I Ri—(Ar)—X—С—C-Y-R, ' I II
Rj О
Формула 9 где Ar представляет собой фенил, бета-нафтил или ароматическое гетероциклическое 6-членное кольцо, содержащее один из двух атомов азота;
R1 представляет собой один или несколько заместителей на ядре Ar, предпочтительно в параположении, и выбран(ы) из группы, включающей H, CH3, CH2-CH(CH3)2, O-CH3, Cl, F, Br, CF3, NH2, S-СНз, CN, NO2;
R2=H, CH3, C2H5, -CH(CH3)2;
^-N—R4;
R3 представляет собой I , где R4 представляет собой Н, CH3, С2Н5;
R5 представляет собой Н, CH3;
X отсутствует или представляет собой О, S, NH, NCH3, -CH=CH-, -С=С-;
Y представляет собой О, NH.
Предпочтительный аналог тропанила формулы 9, который представляет собой (C18H25NO2), может быть получен, как описано, среди прочих, в WO 94/01435, и его структура соответствует формулам:
или
- 18 036992
Формула 10 - Бензотиазол, его аналоги и другие допамин-, 5НТ2А и 5НТ1А-связывающие реагенты.
В еще одном аспекте настоящее изобретение представляет применение химического реагента формулы 10 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Молекулы данного класса были идентифицированы как обладающие нейролептической активностью. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя химические реагенты, которые обладают сродством к допаминовому D2 и серотониновым 5НТ2А и 5НТ1А рецепторам (Hrib, et al., J. Med. Chem., 22; 37(15):2308-2314 (1994)). Другие допамин-, 5НТ2А и 5НТ1А связывающие реагенты, охватываемые изобретением, включают, но без ограничения, клозапин, галоперидол и гидроксилированные дибензазецины (Hamacher, et al., (2006), ВМС Pharmacology, 6, 11).
Предпочтительно формула 10 включает бензотиазоловые и бензизоксазоловые аналоги следующей структуры:
где R представляет собой
Формула 10 n равно 3 или 4;
R1 и R2 независимо представляют собой низший алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода;
Y представляет собой атом кислорода или атом серы;
Z представляет собой водород или галоген, или их фармацевтически приемлемые нетоксичные кислотно-аддитивные соли.
В одном аспекте аналог формулы 10, представляющий собой (C24H32N4O2S), может быть получен, как описано, среди прочих, в DE 3247530, и его структура соответствует следующей формуле:
Формула 11 - Бензипираны, их аналоги и другие противоаритмические лекарственные средства.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет применение химического реагента формулы 11 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Молекулы данного класса были идентифицированы как обладающие противоаритмической активностью. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя химические реагенты, которые обладают противоаритмической активностью класса I, класса II, класса III или класса IV, включая лидокаин, дифенилиндантион, хинидин, прокаинамид, флекаинид, бета-блокаторы, верапамил, дигиталис, бретилий, ибутилид, соталол, амиодарон, дофетилид (Kowey, et al. (2000), American Heart Journal, 140, 12-20).
- 19 036992
Предпочтительно формула 11 включает в себя аналоги бензопирана следующей структуры:
Формула 11 где R1 представляет собой водород, галоген, гидроксильную группу, алкокси, нитрогруппу, аминогруппу, алкилсульфонамидо, бис-(алкилсульфонил)амино или ациламиногруппу;
X представляет собой атом азота или >CH-радикал;
R представляет собой радикал формулы
где А представляет собой одинарную связь или метилен, когда X представляет собой атом азота, карбонил, и
R2 и R3, которые являются одинаковыми или разными, представляют собой водород, галоген, гидроксильную группу, алкокси, нитро, амино, алкилсульфонамидо, бис-(алкилсульфонил)амино, ациламино, сульфамоил или циано или R2 и R3, когда они являются соседними, вместе образуют метилендиоксиили этилендиоксирадикал, или R представляет собой пиридил или 2(2Н)-бензимидазолонил, если X представляет собой >CH-; и
R' и R, которые являются одинаковыми, представляют собой водород или алкил, и их соли.
Аналог формулы 11, который представляет собой (C24H31NO3), может быть получен, как описано, среди прочих, в ЕР 300908, и его структура соответствует следующей формуле:
Формула 12 - Тетрагидропиридины, их аналоги и другие ингибиторы МАО.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению химического реагента формулы 12 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Молекулы данного класса были идентифицированы как обладающие положительным терапевтическим действием при лечении депрессии. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя применение химических веществ, которые ингибируют моноаминоксидазы (МАО), противодействуют действию тетрабеназина или обладают направленным воздействием на допаминергические и серотонинергические системы в головном мозге (Mattson, Doctorates Thesis, Gothenborg University, ISBN: 978628-8741-4 (2013)). Другие ингибиторы МАО, охватываемые настоящим изобретением, включают, но без ограничения, производные оксадиазолона, тетразола, оксадиазинона, инденопиридазина и (1Н)-пиразола (Chimenti, et al. (2006), Chemical Biology & Drug Design, 67, 206-214).
Предпочтительно формула 12 включает аналоги тетрагидропиридина и пиперидина следующей структуры:
Формула 12 где R1 представляет собой водород, алкильную группу, содержащую 1-4 атомов углерода, которая может быть замещенной гидроксильной группой или оксорадикалом, алкенильную или алкинильную группу, каждая из которых содержит от 3 до 4 атомов углерода, циклоалкилметильную группу, содер- 20 036992 жащую от 4 до 7 атомов углерода, или бензильную группу, в которой фенильный радикал может быть замещенным не более чем 3 заместителями, выбранными из группы, включающей алкильную и алкоксигруппы, каждая из которых содержит от 1 до 4 атомов углерода, но R1 не должен представлять собой метильную группу в случае, когда А представляет собой этиленовый радикал и В представляет собой метиленовый радикал; и в то же время
R2, R3, R4 и R5, каждый, представляют собой водород;
R2 представляет собой водород или алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода;
R3 представляет собой водород, алкильную или алкоксигруппу, каждая из которых содержит от 1 до 4 атомов углерода, галоген с атомным номером до 35 или гидроксильную группу; или
R3 и R4 вместе представляют собой триметиленовый или тетраметиленовый радикал или соответствующий конденсированному бензольному кольцу 1,3-бутадиеновый радикал;
R5 представляет собой водород или алкильную группу, содержащую 1-4 атомов углерода;
А представляет собой этиленовый или метиленовый радикал или прямую связь;
В представляет собой метиленовый, этиленовый или триметилеовый радикал, в результате чего А и В вместе всегда содержат 3 атома углерода; и
X и Y, каждый, представляют собой атом водорода или вместе они представляют собой дополнительную связь, их соли с неорганическими и органическими кислотами.
Аналог формулы 12, который представляет собой (C15H19NO), может быть получен, как описано, среди прочих, в DE 2408476, и его структура соответствует формуле
Формула 13 - Диметоксифенилпиперидинметанолы и их аналоги.
В еще одном аспекте настоящее изобретение представляет применение химического реагента формулы 13 для производства биологических продуктов, в частности вакцин против гриппа, в культуре клеток или в яйцах. Было описано, что эти аналоги выступают в качестве 5НТ2 антагонистов и противоаритмических средств. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя химические реагенты, которые обладают противоаритмической активностью класса I, класса II, класса III или класса IV, включая лидокаин, дифенилиндантоин, хинидин, прокаинамид, флекаинид, бета-блокаторы, верапамил, дигиталис, бретилий, ибутилид, соталол, амиодарон, дофетилид (Kowey, et al. (2000), American Heart Journal, 140, 12-20).
Предпочтительно структура аналогов формулы 13 соответствует следующей формуле:
Формулы 13 где n равно 2, 3 или 4;
каждый R и R1 независимо представляет собой водород, C1-6алкил, галоген, трифторметил, гидроксильную группу, C1-6алкокси или аминогруппу и R и R1 заместители для C1-6алкила представляют собой метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, пентил, гексил, циклопропил, циклопентил, предпочтительно метил и этил.
Включены все галогены, предпочтительными являются фтор и хлор. Типичными C1-6алкоксильными заместителями являются метокси, этокси, изопропокси и вышеуказанные алкильные группы, присоединенные через атом кислорода. В тех случаях, когда R или R1 отличны от водорода, заместители могут находиться в любом положении, (орто-, мета- или пара), но пара-положение является предпочтительным для монозамещенных фенильных фрагментов. 2,3-, 2,4-, 2,5-, 3,4- или 3,5-дизамещенные фенильные фрагменты включены в настоящее изобретение.
В одном аспекте аналог формулы 13, который представляет собой альфа-(2,3-диметоксифенил)-1[2-(4-фторфенил)этил]-4-пиперидинметанол (C22H2BNO3F), может быть получен, как описано, среди прочих, в патенте США № 5134149, и его структура соответствует следующей формуле:
- 21 036992
Настоящее изобретение включает в себя применение других реагентов с аналогичными фармакологическими активностями в производстве представляющих интерес биологических молекул в клеткехозяине. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие реагенты включают в себя реагенты, которые действуют на такой(ие) же или частично совпадающий(е) путь(и) клеточной передачи сигнала. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения такие реагенты совместно используют один и тот же механизм действия или частично совпадающие механизмы действия для осуществления определенного клеточного результата в клетке-хозяине. Такие механистически эквивалентные реагенты могут быть или не быть структурно связанными друг с другом.
Таким образом, настоящее изобретение представляет способы получения представляющего интерес биологического продукта в клетке-хозяине или повышения выхода такого продукта, включающие контактирование клетки-хозяина с реагентом для повышения выхода белка в клетке-хозяине, где реагент выбран из группы, включающей средства, которые ингибируют передачу сигнала 5НТ7 рецептора, реагенты, которые ингибируют один или несколько путей передачи сигнала допаминового рецептора, реагенты, которые являются обратными агонистами одного или нескольких гистаминовых рецепторов, реагенты, которые блокируют ионные каналы (например, натриевые каналы, кальциевые каналы и т.д.), реагенты, которые ингибируют продуцирование цАМФ, реагенты, которые ингибируют передачу сигналов гистаминового рецептора, а также их любые комбинации. Способ обычно включает контактирование клетки-хозяина с реагентом, выращивание или культивирование клетки-хозяина в течение периода времени, по меньшей мере часть которого осуществляется в присутствии указанного реагента, сбор представляющего интерес биологического продукта из клетки-хозяина, необязательно дополнительную очистку биологического продукта, введение биологического продукта в фармацевтическую композицию, содержащую биологический продукт и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель, необязательно стерильное фильтрование фармацевтической композиции, расфасовка стерильной фармацевтической композиции в подходящие лекарственные формы. Фармацевтические композиции, полученные способами, описанными в настоящем изобретении, включены в настоящее изобретение.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения реагент ингибирует передачу сигнала 5HTR, где реагент может представлять собой обратный агонист рецептора. В некоторых вариантах осуществления изобретения реагент может быть ингибитором допаминового(ых) рецептора(ов). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения реагент может представлять собой допаминовый D1 и/или D2 агонист. Таким образом, применение реагента, который действует в качестве обратного агониста 5HT7R для производства терапевтической композиции, содержащей биологический продукт, включено в настоящее изобретением.
Примеры таких реагентов включают, без ограничения, SB-258719 (нейтральный антагонист 5HT7R, доступный от GSK), SB-258741 (AFZ; частичный обратный агонист 5HT7R, доступный от GSK), SB-269970 (надежный обратный агонист 5HT7R, доступный от GSK), рисперидон (антагонист допаминовых рецепторов D1 и D2, а также обратный агонист 5НТ7 серотониновых рецепторов; а также обратный агонист H1 и Н2 гистаминовых рецепторов), сертиндол (связывается с D2, 5-НТ2А, 5-НТ2С, 5-НТ6, 5-НТ7, D3, a1); зипразидон (связывается с D2, 5-НТ2А, 5-НТ1А, 5-HT1-D, 5-НТ2С, 5-НТ7, D3, a1, NRI, SRI); локсапин (связывается с D2, 5-НТ2А, 5-НТ6, 5-НТ7, D1, D4, a1, M1, HI, NRI); зотепин (связывается с D2, 5-НТ2А, 5-НТ2С, 5-НТ6, 5-НТ7, D1, D3, D4, a1, H1, NRI); клозапин (связывается с D2, 5-НТ2А, 5НТ1А, 5-НТ3, 5-НТ6, 5-НТ7, D1, D3, D4, a1, a2, M1, H1); оланзапин (связывается с D2, 5-НТ2А, 5-НТ2С, 5-НТЗ, 5-НТ6, D1, D3, D4, D5, a1, M1-5, H1), кветиапин (связывается с D2, 5-НТ2А, 5-НТ6, 5-НТ7, a1, а2, H1); прометазин (сильный антагонист H1 гистаминового рецептора с от слабой до умеренной аффинностью к 5HT2k/c серотониновым рецепторам и допаминовому D2 рецептору, а также блокатор Na+ каналов). Могут быть также подходящими некоторые блокаторы ионных каналов. Примеры включают, но без ограничения, ингибиторы и блокаторы потенциал-зависимых Na+ каналов и холинэстеразы, задействованные в транспорте и метаболизме липидов, такие как дибукаин (ингибитор бутинэстеразы); ингибиторы и блокаторы потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа (например, нимодипин); ингибиторы и блокаторы натриевых каналов, такие как априндин (противоаритмический мембранстабилизирующий реагент класса 1b), амилорид (прямой блокатор эпителиального натриевого канала ENaC) и ингибиторы и блокаторы калиевых каналов задержанного внутреннего выпрямления и кальциевых каналов L-типа,
- 22 036992 такие как полуфумарат ибутилида (противоаритмическое средство III класса).
Обработка клеток-хозяев.
Если не указано иное, рекомбинантные белки, культура клеток, иммунологические и микробиологические методы, используемые в настоящем изобретении, представляют собой стандартные реагенты и методики, хорошо известные специалистам данной области техники. Такие методики описаны и объяснены в литературных источниках, таких как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984); J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991); D.M. Glover and B.D. Hanes (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996); F.M. Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1996); J.E. Coligan et al., (editors) Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons (включая все обновления до настоящего времени), которые включены в данное описание в качестве ссылок.
Отличительным признаком способов по настоящему изобретению является эффект повышения выхода биологических молекул или продуктов, продуцируемых в системах клеток-хозяев. Термин выход биологических молекул, когда используется в данном описании, относится к общему количеству рекомбинантно экспрессированных биологических молекул, которые могут быть выделены, таких как белки, полипептиды, антитела (например, полной длины или их антигенсвязывающих фрагменты, аналоги, полученные методами генной инженерии, гуманизированные аналоги и т.д.), нуклеиновые кислоты, вирусы, ферменты, вирусоподобные частицы, полученные с помощью клетки-хозяина, предпочтительно в эукариотической культуре клеток, такой как культура растительных клеток, клеток птиц или млекопитающих, выращенных в условиях, подходящих для экспрессии, секреции или продуцирования. В частности, биологические молекулы могут подвергаться дополнительной технологической обработке с получением желательного биологического продукта, такого как вакцина.
Повышенные выходы обычно измеряются в миллиграммах белка на 1 миллилитр объема (мг/мл) или в граммах белка на 1 литр объема (г/л).
Повышенный выход также может измеряться как кратное увеличение количества биологических молекул, продуцируемых системами клеток-хозяев, подвергающимися воздействию химических реагентов, используемых в настоящем изобретении, по сравнению с соответствующими контрольными системами, включая соответствующие системы клеток-хозяев, которые не обрабатывались такими химическими реагентами.
При применении способов по настоящему изобретению уровни содержания экспрессированных биологических молекул увеличиваются примерно в 2-20 раз по сравнению с контролем. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения выход повышается по меньшей мере приблизительно в 2,5 раза, примерно в 3 раза, примерно в 3,5 раза, примерно в 4 раза, примерно в 4,5 раза, примерно в 5 раз, примерно в 5,5 раза, примерно в 6 раз, примерно в 6,5 раза, примерно в 7 раз, примерно в 7,5 раз, примерно в 8 раз, примерно в 8,5 раз, примерно в 9 раз, примерно в 9,5 раз или примерно в 10 раз или более по сравнению с контролем.
В альтернативном аспекте любое повышение выхода может измеряться как увеличение количества, выраженное в процентах относительно контроля. Например, увеличение выхода или клеточной продуктивности может включать 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 500% или большее увеличение любых измеряемых параметров по сравнению с контролем.
Как показано в примерах ниже, предпочтительный аспект настоящего изобретения характеризуется измерением повышенного количества вирусных частиц (вРНК копий/мл), инфекционных частиц (IU/мл) или вирусных белков (г/мл), полученных в супернатанте культуры. В одном типе измерений увеличение НА или NP белка показывает способность химического реагента увеличивать выход антигенных белков, продуцированных системой клетки-хозяина. Увеличение продуктивности клеток также может характеризоваться измерением параметров, показывающих по меньшей мере 2-кратное, 4-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 15-кратное, 20-кратное, 25-кратное, 30-кратное, 35-кратное, 40-кратное, 45-кратное, 50-кратное увеличение количества вирусных частиц, частиц инфекционного вируса или вирусных белков, предпочтительно выход НА.
Измерение выхода может проводиться во время проводимой ранее технологической обработки вирусного производства, например во время транскрипции гена вируса, экспрессии белка, продуцирования вирусных частиц или высвобождения из клеточной культуры. Стандартные способы обнаружения биологических продуктов в рекомбинантных системах могут применяться в зависимости от измеряемой характеристики биологической молекулы. Измерения, которые могут показывать продуктивность и производительность системы клетки-хозяина, можно также проводить с помощью способов, хорошо известных в данной области; например, количественное определение изменений в морфологии и клеточной поверхности маркеров с использованием таких методов, как проточная цитометрия или иммуноцитохимия (например, окрашивание клеток антителами, специфическими к ткани или к клеточному маркеру), изучение морфологии клеток с использованием светолучевой или конфокальной микроскопии или количественное определение изменений экспрессии генов с использованием методов, хорошо известных в
- 23 036992 данной области, таких как ПЦР и определение профиля генной экспрессии.
В предпочтительном аспекте продукты вирусной экспрессии, предпочтительно продукты вируса гриппа, количественно определяются для продуцирования частиц, инфекционных частиц или антигенных белков. Вирус гриппа и антигены могут количественно определяться с помощью таких методов, как иммунологические анализы, включая, но без ограничения, конкурентные и неконкурентные тестсистемы, с использованием методов, таких как вестерн-блоттинг, иммуногистохимические радиоиммунологические методы анализа, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноферментные сэндвич-анализы, иммунопреципитация, реакции преципитации, реакции диффузной проципитации в геле, методы иммунодиффузионных анализов, реакции агглютинации, методы анализов реакции фиксации комплемента, методы иммунорадиометрических анализов, флуоресцентных иммуноанализов, иммуноанализов белка А и анализ FACS (возбужденной флуоресценции сортированных клеток).
Титры вирусов могут измеряться в системах клеток-хозяев с помощью методов фокусобразующего анализа и гемагглютинационного анализа. Эти методы анализа хорошо известны в данной области техники.
Способы по настоящему изобретению предназначены для применения в системах клеток-хозяев, таких как клеточные культуры, или в яйцах. В предпочтительном аспекте клеточные культуры обрабатывают по меньшей мере одним химическим реагентом в клеточной культуре объемом более примерно 200 мкл, например более примерно 1 мл. Более предпочтительно объем культуры клеток составляет от примерно 1 мл до 10000 л, например, от примерно 2 мл до примерно 10000 л. В некоторых вариантах осуществления изобретения подходящий объем партии продукции составляет примерно 15, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500 мл, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 350, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 л или более.
В предпочтительном аспекте клетки могут выращиваться в культуре в присутствии достаточного количества химического реагента в условиях, подходящих для репликации и сборки вирусов или экспрессии биологических продуктов. В некоторых аспектах клетки можно культивировать при температуре ниже примерно 37°С, предпочтительно при температуре равной или менее чем примерно 35°С. Обычно клетки выращиваются в присутствии реагента при температуре в интервале от примерно 32 до приблизительно 35°С. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки выращиваются при температуре в интервале от примерно 32 до примерно 34°С, например, при температуре примерно 33°С. В предпочтительном аспекте MDC клетки, используемые в данном изобретении, выращиваются при температуре примерно 34°С.
Клетки могут контактировать с химическим реагентом в соответствии с экспериментальными условиями, определяемыми исследователем. В приведенных ниже примерах показан по меньшей мере один функциональный набор условий, применимых для клеток млекопитающих, в частности условия применения суспензий. В одном предпочтительном аспекте стадия контактирования клетки-хозяина может проводиться во время инкубирования или роста клеток и до инокуляции или одновременно с инокуляцией вирусом.
Рекомбинантная экспрессия биологических молекул в клетках-хозяевах представляет собой стандартный способ, доступный специалисту в данной области техники. Способы трансфектирования клеток могут включать электропорацию (электроблоттинг генов), сонопорацию, оптическую трансфекцию, слияние протопластов, импалефекцию, магнетофекцию или вирусную трансдукцию. Обычно используемые реагенты трансфекции включают, например, фосфат кальция, DEAE-декстран и липиды. Ссылки на доступные источники примеров подробных методик включают, например, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9, Ausubel, et al. Eds., John Wiley & Sons, 1998. В случае вируса или бактерии клетки инфицируют или инокулируют при желаемой множественности инфекции (MOI). Трансфекция и инфекция могут применяться в данном описании взаимозаменяемо.
Количество биологических молекул, продуцируемых клетками-хозяевами, обработанными химическим реагентом, может количественно определяться после инокуляции или одновременно с инокуляцией вирусом. Мониторинг ответа на вирусную инфекцию клеточной мембраны до, во время и после добавления химических реагентов может обеспечить понимание, например, проникновения вирусов в клетки, уровень содержания вирусной геномной ДНК и/или поврежденной РНК, уровень транскрипции вирусной геномной ДНК в РНК, уровень содержания одного или нескольких экспрессированных вирусных белков, количество вирусных частиц, образованных внутри клетки, и/или количество вирусных частиц, высвобожденных из клетки. Без теоретического обоснования авторы полагают, что химические реагенты оказывают действие на фазы роста вирусов в клетках-хозяевах.
Агент может добавляться в среду, содержащую клетки-хозяева до трансфеции, одновременно с ней или в период времени после трансфекции и до сбора клеток-хозяев или экспрессированной биологической молекулы. Например, клетки-хозяева могут контактировать с химическим реагентом в эффективной концентрации в течение интервала времени в диапазоне от 0 до 1 ч, от 0 до 2 ч, от 0 до 3 ч, от 0 до 4 ч, от 0 до 5 ч, от 0 до 12 ч, от 0 до 20 ч, от 0 до 30 ч, от 0 до 40 ч, от 0 до 50 ч, от 0 до 60 ч до или после трансфекции или после инфицирования. Время контактирования может оптимизироваться для достижения
- 24 036992 уровня выхода, который по меньшей мере в 2 раза больше выхода, достигаемого в контроле. Неожиданно, химические реагенты, используемые в настоящем изобретении, могут контактировать с клеткойхозяином в течение короткого периода времени, предпочтительно клетке не требуется предварительная обработка, и химический реагент может добавляться одновременно с вирусом.
При выборе подходящего реагента для способствования повышению продуцирования представляющих интерес биологических молекул в системах клеток-хозяев одним желательным признаком может быть то, что реагент является эффективным для повышения продуцирования при применении в относительно низких концентрациях по меньшей мере по двум причинам. Во-первых, меньшее количество таких реагентов будут необходимы для производства таких продуктов в промышленных масштабах. Вовторых, для применения в области фармацевтических средств, нутрицевтиков и косметических препаратов желательно, чтобы конечный продукт представлял собой чистую форму, свободную от загрязняющих веществ или примесей. Применение в процессе производства такого реагента в низких концентрациях означает, что было бы проще удалить указанный реагент из конечного продукта. Другим желательным признаком подходящих реагентов для способствования продуцированию представляющих интерес биологических молекул является то, что такие реагенты представляют собой уже утвержденные коммерчески доступные продукты, профили безопасности которых подробно охарактеризованы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения реагенты, используемые в изобретении, присутствуют в достаточной концентрации в момент трансфекции. Условия могут регулироваться и оптимизироваться специалистом в данной области техники для достижения желаемых параметров для увеличения выхода биологических молекул. Как было упомянуто выше, предпочтительно количество, эффективное для повышения продуцирования или выхода представляющих интерес биологических молекул, является достаточно низким, чтобы оно являлось коммерчески целесообразным и безопасным для применения человеком. Обычно эффективное количество измеряется концентрацией в общем объеме препарата, когда присутствует реагент, например в объеме партии культуры клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффективные количества подходящих реагентов, используемых в данном изобретении, находятся в интервале от 0,1 нМ до 10 мкМ, предпочтительно составляют менее 5 мкМ, более предпочтительно составляют менее 1 мкМ, еще более предпочтительно составляют менее 100 нМ.
Оптимальная концентрация параметра, показательного для увеличения выхода или продуцирования может меняться в зависимости от индивидуальных особенностей системы экспрессии, требований пользователя, и определение оптимальной концентрации любого одного или нескольких реагентов, повышающих экспрессию в данной методике эксперимента, находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники.
Возможно, что для контактирования с системой клеток-хозяев может применяться комбинация химических реагентов, такая как включающая по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре реагента, которые добавляют последовательно или в виде коктейля. Добавление последующего реагента может осуществляться с временными интервалами в диапазоне 0-1, 2, 3, 4, 5 ч после добавления первого или предшествующего соединения. В зависимости от вируса, клетки-хозяина, условий трансфекции и экспрессии продуктов, обработка химическими реагентами или комбинациями химических реагентов может приводить к супераддитивным (синергическим) эффектам. Например, в дополнение к повышенному выходу могут наблюдаться следующие эффекты, превышающие ожидаемые эффекты: увеличение количества доз производимых биологических продуктов, сокращение времени от производства до доставки лекарств пациентам, увеличение количества пациентов, проходящих лечение, увеличение экспрессии белка/антигена, увеличение высвобождения вирусных частиц, увеличение количества обнаруженного NP, показывающее увеличение производства вирусных частиц, увеличение плотности НА антигена на вирусных частицах, повышение эффективности комбинации химических реагентов в отношении производства биологических продуктов. Синергетические эффекты могут выявляться с помощью применимых способов, описанных в настоящем изобретении.
В одном аспекте обработка клеток-хозяев может проводиться в среде, которая дает возможность системе клетки-хозяина взаимодействовать с химическими реагентами без необходимости изменять среду. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя среду, в которой может проводиться выращивание и трансфекция клеток в присутствии по меньшей мере одного химического реагента перед инокуляцией вирусом.
Среда, в которой обрабатываются клетки-хозяева, может также включать в себя ряд ингредиентов, в том числе аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, сахара и другие компонентов, причем каждый ингредиент может присутствовать в количестве, которое поддерживает культивирование эпителиальных клеток млекопитающих в условиях in vitro.
В некоторых областях применения может быть предпочтительным дополнительное обогащение содержания питательных веществ для поддержания более быстрого роста и повышения продуцирования биологических молекул с помощью клеток-хозяев, предпочтительно, чтобы обеспечить более подходящие условия окружающей среды для культивирования прихотливых клеток млекопитающих. Для осуществления такого обогащения к базальной среде или к полной среде по изобретению может быть добавлено одно или несколько вспомогательных веществ. Вспомогательные вещества, которые преимуществен- 25 036992 но могут быть добавлены в данную среду, включают один или несколько цитокинов (например, факторы роста, такие как EGF, aFGF, bFGF, iGf-1, IGF-2, HB-EGF, KGF, HGF и т.п.), гепарин (для стабилизации гепаринсвязывающих факторов роста, таких как FGF, HB-EGF, KGF и HGF) и один или несколько пептидов, полученных из животных (например, HSA или BSA), дрожжей (например, дрожжевого экстракта: дрожжевого экстракта или ультрафильтрата дрожжевого экстракта) или растений (например, пептиды из риса или сои). Цитокины, которые могут быть природными или рекомбинантными, являются коммерчески доступными, например, от компании Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.) или от компании R&D Systems, Inc. (Rochester, Minn) и могут добавляться в питательные среды в концентрациях, рекомендованных производителем для конкретного типа клеток, подлежащих культивированию (обычно конечная составляет примерно 0,00001-10 мг/л). Гепарин является коммерчески доступным, например, от Sigma (St. Louis, МО), и предпочтительно гепарин слизистой оболочки свиней используется в среде в конечной концентрации примерно 1-500 USP единиц/литр. Животные, дрожжевые и растительные пептиды могут быть получены на коммерческой основе (например, животные пептиды - от Sigma; дрожжевые пептиды от Difco, Norwell, Mass., и растительные пептиды - от Quest International, Norwich, New York) или могут быть получены и введены в настоящую культуральную среду, как подробно описано в одновременно находящейся на рассмотрении заявке на патент США № 60/028,197, поданной октября 1996 г., содержание которой в полном объеме включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В некоторых аспектах настоящего изобретения особенно подходящим типом среды для практического осуществления настоящего изобретения является среда, не содержащая белков (protein-free medium (РЕМ среда), которая полностью очищена от белка (например, не содержащая белки сыворотки крови, такие как сывороточный альбумин или факторы прикрепления, питательные белки, такие как факторы роста, или белки-носители ионов металлов, такие как трансферрин, церулоплазмин и т.д.).
В идеале, среды, не содержащие сыворотки и не содержащие белки, которые предполагается использовать по настоящему изобретению, дополнительно будут очищены от любого вещества животного происхождения или любого материала, который полностью или частично получен из животного источника, включая рекомбинантные ДНК животного происхождения или рекомбинантные ДНК белка животного происхождения.
Клеточные линии и клеточная культура.
В соответствии с изобретением может применяться любая система клеток-хозяев, предпочтительно эукариотическая, предпочтительно клеток млекопитающих. Обычно клетки-хозяева позвоночных включают, но без ограничения, клетки приматов (например, людей, обезьян и т.д.), собак, птиц (например, кур, уток и т.д.), кошек, крупного рогатого скота, лошадей, овец, свиней, коз, грызунов и кроликов. В одном предпочтительном аспекте клетки позвоночных представляют собой клетки из яиц с развивающимся эмбрионом.
В другом аспекте клетка представляет собой клеточную линию. Обычно культивируемая клетка сертифицирована в соответствии с требованиями ВОЗ для производства вакцин. Требования к сертификации таких клеточных линий включают характеристику в отношении по меньшей мере одной генеалогии, ростовых характеристик, иммунологических маркеров, вирусной чувствительности, туморогенности и условий хранения, а также тестирования на животных, яйцах и культурах клеток. Неограничивающие примеры клеток-хозяев, подходящих для настоящего изобретения, включают эукариотические клетки, такие как клетки растений, клетки млекопитающих, клетки птиц (например, такие как клетки утки), клетки насекомых, дрожжевые клетки и т.д. Неограничивающие примеры подходящих клеток включают в себя первичные клетки, такие как первичные эпителиальные клетки (например, кератиноциты, клетки эпителия шейки матки, клетки эпителия бронхов, клетки трахеального эпителия, эпителиальные клетки почек и ретинальные эпителиальные клетки) и устойчивые клеточные линии и их штаммы или производные (например, 293 эмбриональные клетки почки, BHK клетки, эпителиальные клетки шейки матки HeLa и PER-Сб клетки сетчатки, MDBK (NBL-1) клетки, 911 клетки, CRFK клетки, MDCK клетки, СаСо-2, СарТ клетки, CHO клетки, BEWO клетки, Chang клетки, Detroit 562 клетки, FRIIK-4, НЕК-293, 229 клетки HeLa, S3 клетки HeLa, Нер-2 клетки, KB клетки, LS180 клетки, LS174T клетки, NCI-H-548 клетки, RPMI 2650 клетки, SW-13 клетки, Т24 клетки, WI-28 VA13, 2RA клетки, WISH клетки, BS-C-I клетки, LLC-MK2 клетки, клетки М-3 клона, клетки 1-10, RAG клетки, RD, ТСМК-1 клетки, Y-1 клетки, LLC-PK1 клетки, РК (15) клетки, GH1 клетки, GH3 клетки, L2 клетки, LLC-RC 256 клетки, МН1С1 клетки, ХС клетки, MDOK клетки, WSW клетки, TH-I, B1 клетки или их производные), NS0 (клетки миеломы мыши), стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки (например, ЕВ66® клетки), клетки фибробластов из любой ткани или органа (включая, но без ограничения, клетки фибробластов сердца, печени, почек, толстой кишки, кишечника, пищевода, желудка, нервной ткани (головного и спинного мозга), легких, сосудистой ткани (артерии, вены, капилляров), лимфоидной ткани (лимфатических желез, аденоидные, миндалин, костного мозга и крови), селезенки и клеточные линии фибробласта и фибробластоподобные клеточные линии (например, CHO, TRG-2 клетки, IMR-33 клетки, Don клетки, GHK-21 клетки, клетки цитруллинемии, клетки Dempsey, клетки Detroit 551, клетки Detroit 510, клетки Detroit 525, клетки Detroit 529, клетки Detroit 532, клетки Detroit 539, клетки Detroit 548, клетки
- 26 036992
Detroit 573, клетки HEL 299, клетки IMR-90, клетки MRC-5, клетки WI-38, клетки WI-26, клетки MiCl.sub.l, клетки CHO, CV-1 клетки, клетки COS-1, клетки COS-3, клетки COS-7, клетки Vero, DBS-FrhL-2 клетки, клетки BALB/3T3, F9 клетки, SV-клетки Т2, М-MSV-BALB/3T3, клетки K-BALB, клетки BLO-11, клетки NOR-10, С.sub.3H/ЮTI/2 клетки, клетки HSDM1C3, клетки KLN2O5, клетки McCoy, мышиные L-клетки, клетки штамма 2071 (мышиные L), клетки L-M штамма (мышиные L), L-MTK- (мышиные L) клетки, NCTC клоны 2472 и 2555, SCC-PSA1 клетки, Swiss/3Т3, клетки индийского мунжтака, SIRC клетки, CII клетки и клетки Йенсена или их производные). Предпочтительно клетки млекопитающих выбраны из группы, включающей клетки MDCK, клетки 293, клетки PER-C6, клетки CHO или их производные.
Оптимальные условия высева на чашки и культивирования для данного типа клеток животного происхождения могут быть определены специалистами данной области техники с использованием стандартного эксперимента. В обычных условиях получения монослойной культуры клетки можно высевать на поверхность культуральных сосудов без факторов прикрепления. В качестве альтернативы сосуды могут предварительно покрываться природными, рекомбинантными или синтетическими факторами прикрепления или пептидными фрагментами (например, коллагеном, фибронектином, витронектином, ламинином и т.п. или их природными или синтетическими фрагментами), которые являются коммерчески доступными, например, от компании Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.), компании R&D Systems, Inc. (Rochester, Minn.), Genzyme (Cambridge, Mass.) и компании Sigma (St. Louis, Mo.). Выделенные клетки могут также высеваться в или на природную или синтетическую трехмерную матрицу подложки, такую как предварительно отформованной коллагеновый гель или синтетический биополимерный материал. Для суспензионного культивирования клетки, как правило, суспендируют в культуральной среде и вводят в сосуд для культивирования, который облегчает выращивание клеток в суспензии, например во вращающуюся колбу, перфузионное устройство или биореактор (см. Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, New York: Alan R. Liss, Inc., p. 123-125 (1983)). В идеале, перемешивание среды и суспендированных клеток сводится к минимуму для предотвращения денатурации компонентов среды и срезания клеток в процессе культивирования.
В предпочтительном аспекте клетки для получения вируса гриппа могут быть выращены в среде, содержащей сыворотку, или бессывороточной среде. В некоторых случаях, например, для получения очищенных вирусов желательно выращивать клетки в бессывороточных условиях. Клетки можно культивировать в небольших масштабах, например менее чем в 25 мл среды, в культуральных пробирках или колбах или в колбах большего объема при перемешивании, в роллерных бутылях или на микрогранулированном носителе (например, на микрогранулированных носителях DEAE-декстран, таких как Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories, гранулах из сополимера стирола и триметиламина, таких как Hillex, SoloHill, Ann Arbor), в колбах, бутылях или культуральных реакторах. Микрогранулированные носители представляют собой маленькие сферы (диаметром в интервале 100-200 мкм), которые обеспечивают большую площадь поверхности для роста прикрепленных клеток на единицу объема клеточной культуры. Например, 1 л среды может включать в себя более 20 млн гранул микроносителя, обеспечивающих более 8000 см2 поверхности роста. Для промышленного производства вирусов, например для производства вакцин, зачастую желательно культивировать клетки в биореакторе или ферментере. Объем доступных биореакторов, например биореактора Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, Minn.); биореакторов NBS (New Brunswick Scientific, Эдисон, штат Нью-Джерси); лабораторных и промышленных биореакторов от В. Braun Biotech International (В. Braun Biotech, Melsungen, German) составляет от менее 1 до более 100 л.
В соответствии с предпочтительным аспектом клетка-хозяин может контактировать с вирусом до контактирования, одновременно в контактированием или после контактирования с химическим реагентом. Оптимальные методы инфицирования клеток млекопитающих с вирусом хорошо известны в данной области и знакомы любому специалисту. Вирусное инфицирование клеток может количественно определяться различными способами. MOI представляет собой отношение числа инфекционных вирусных частиц к числу клеток, подлежащих инфицированию. Таким образом, MOI 0,1 приводит к средней инокуляции 1 вирусной частицей каждых 10 клеток. Теоретически обоснованной MOI является введение одной инфекционной вирусной частицы в каждую клетку-хозяин, которая присутствует в культуре. Тем не менее одну и ту же клетку могут инфицировать несколько вирусов, что сохраняет некоторый процент неинфицированных клеток. Это явление может быть уменьшено при использовании более высокого MOI для гарантированного инфицирования каждой клетки. Таким образом, представленные вирусные частицы могут быть введены в клетки, которые описаны в данном изобретении, с MOI в интервале от 0,001 до 100, например, 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100.
Можно ожидать, что вирус-инфицированные клетки млекопитающих, культивируемые в суспензии в присутствии реагента, дают более высокие титры вируса (например, в 2, 3, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 250, 500 или в 1000 раз более высокие титры), чем клетки, которые не контактировали с соединениемкандидатом. Эти способы могут применяться для получения различных вирусов млекопитающих и вирусных векторов, включая, но без ограничения, ретровирусы и т.п., и наиболее предпочтительно могут применяться для получения вирусов гриппа. После обработки инфицированных клеток химическим реа
- 27 036992 гентом используемые культуральные среды, содержащие вирусы, вирусные векторы, вирусные частицы или их компоненты (белки и/или нуклеиновые кислоты (ДНК и/или РНК)), могут использоваться для различных целей, включая производство вакцин, производство вирусных векторов для применения в клеточной трансфекции или генной терапии, инфицирования животных или клеточных культур, изучении вирусных белков и/или нуклеиновых кислот и т.п. В качестве альтернативы вирусы, вирусные векторы, вирусные частицы или их компоненты могут необязательно выделяться из используемой культуральной среды в соответствии с методиками выделения белка и/или нуклеиновой кислоты, которые известны специалисту в данной области техники.
Настоящее изобретение может также применяться в способах получения рекомбинантных белков из клеток млекопитающих, в частности из клеток млекопитающих, выращенных в суспензии. Клетки могут подвергаться изменениям методами генной инженерии перед контактированием с химическим реагентом либо они могут быть трансфицированы одной или несколькими экзогенными молекулами нуклеиновых кислот и контактировать с достаточным количеством химического реагента. Оптимальные методы генной инженерии клеток млекопитающих для экспрессирования представляющего интерес полипептида хорошо известны в данной области техники и, следовательно, известны любому специалисту. Клетки, полученные методами генной инженерии, могут быть выращены в присутствии реагента в виде монослойных культур или более предпочтительно в виде суспензионных культур в соответствии с методами, описанными в настоящем документе. После культивирования клеток представляющая интерес биологическая молекула необязательно может подвергаться очистке от клеток и/или применяемой культуральной среды в соответствии с методами выделения белков, которые известны специалистам в данной области техники. Выделение и очистка биологических молекул или их производных, полученных способом в соответствии с настоящим изобретением, проводятся с помощью обычных методов, которые известны специалистам в данной области техники.
В целом, выделение белков изначально зависит от их происхождения. Различаются внутри- и внеклеточные белки. Если белки находятся внутри клеточных тел, сначала необходимо разрушить клетки, что проводится, например, с помощью сдвиговых усилий или осмолиза. После этого отделение нерастворимого материала, например клеточных мембран и клеточных стенок, осуществляется, например, путем центрифугирования.
Центрифугирование используется по умолчанию для разделения клеток, клеточных органелл и белков. Более эффективным методом с точки зрения тонкости разделения является пульс-электрофорез. Кроме того, после отделения других компонентов клеток существует необходимость разделения белков различных размеров, пептидов и аминокислот. Выделение белков может проводиться с помощью одноили двумерного гель-электрофореза или капиллярного электрофореза. Для выделения аминокислот и пептидов используются, например, хроматографические методы, такие как аффинная хроматография, ионообменная хроматография (IEC) или хроматография с обращенной фазой (RPC). Наличие липидов и необходимость удаления или дезактивации протеаз являются неблагоприятными для очистки. Белки, присутствующие во внеклеточном матриксе, необязательно извлекать из клеток, но после отделения всех нерастворимых веществ, они являются сильно разбавленными и, как правило, присутствуют в гораздо меньших количествах, чем в качестве внутриклеточных белков.
Технологическая обработка вируса.
После культивирования клетки-хозяина в течение периода времени, подходящего для репликации вируса до высоких титров, вирус может быть выделен. Вообще вирусы могут выделяться из культуральной среды, в которой были выращены инфицированные клетки. Сырую среду обычно осветляют перед концентрацией вирусов гриппа. Общие методы включают фильтрацию, ультрафильтрацию, адсорбцию на сульфат бария и элюирование, а также центрифугирование. Например, сырую среду из инфицированных культур можно сначала осветлять центрифугированием, например, при 1000-2000xg, в течение периода времени, достаточного для удаления остатков клеток и других крупных твердых частиц, например, от 0 до 30 мин. В качестве альтернативы, среду фильтруют через 0,8 мкм фильтр из ацетата целлюлозы для удаления интактных клеток и других крупных частиц. Необязательно, супернатант осветленной среды затем центрифугируют для осаждения вирусов гриппа, например при 15000xg, в течение примерно 3-5 ч. После повторного суспендирования вирусного пеллета в подходящем буфере, таком как STE (0,01 M Tris-HCl; 0,15 M NaCl, 0,0001 M ЭДТА) или фосфатно-буферный раствор (PBS) при рН 7,4, вирус концентрируют центрифугированием в градиенте плотности по сахарозе (60-12%) или тартрату калия (50-10%). Подходящими являются непрерывные или ступенчатые градиенты, например градиент сахарозы от 12 до 60% в четыре стадии с шагом 12%. Градиенты центрифугируют со скоростью и в течение времени, достаточных для концентрирования вирусов в различимый пеллет для восстановления. В качестве альтернативы и для наиболее крупномасштабных коммерческих применений вирус элюируют с градиентом плотности с использованием центрифуги с зональным ротором, работающим в непрерывном режиме. Дополнительные подробные сведения, достаточные для специалиста для получения вирусов гриппа из культур тканей, предоставлены, например, в публикациях Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds), Textbook of influenza, p. 324-332; Merten et al. (1996), Production of influenza virus
- 28 036992 incell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151, а также в патенте США № 5690937 и публикациях заявок США № 20040265987,
20050266026 и 20050158342, которые включены в данное описание в виде ссылок. При желании, выделенные вирусы можно хранить при -80°С в присутствии сахарозы-фосфата-глутамата (SPG) в качестве стабилизатора.
Вирусы, полученные способом по настоящему изобретению, могут подвергаться технологической обработке для получения вакцинных препаратов. Такие вакцинные препараты могут быть получены описанным далее способом, который является особенно предпочтительным вариантом осуществления изобретения. Вакцина гриппа может быть получена следующим образом: вирусы гриппа выращивают в культуре клеток, например в суспензии клеток MDCK (WO 97/037000). Вирусы собирают, очищают и концентрируют фильтрацией с использованием 0,45 мкм фильтра и CS-хроматографии. После добавления детергента (например, Tween 80) препарат вируса обрабатывают BPL. Затем вирусы подвергают расщеплению с использованием СТАВ. После ультрацентрифугирования и стадии адсорбции препарат вирусного белка подвергается ионообменной хроматографии с использованием ТМАЕ или Sartobind Q в качестве смолы. Хроматография может проводиться в присутствии каприлата натрия (приблизительно 50 мМ для Sartobind; 100 мМ для ТМАЕ) и хлорида натрия (400 мМ для Sartobind и 200 мМ для ТМАЕ). Перед применением детергента в сочетании с ионообменной хроматографией части фрагментированной статочной ДНК могут быть удалены путем осаждения с катионным детергентом, таким как СТАВ, как описано в Onions et al., Biologicals, 2010, (38) 544-551. Настоящее изобретение может применяться в качестве части процесса, описанного в вышеуказанной публикации Onions.
Далее белковый препарат концентрируют с помощью ультрафильтрации. Белки можно дополнительно смешивать с другим вирусным препаратом (в случае трех- или четырехвалентных сезонных вакцин) и, необязательно, стерильно фильтровать, смешивать с наполнителем и расфасовывать. Часть настоящего изобретения включает в себя вакцины против гриппа, которые могут быть получены при использовании данного процесса.
Анализы.
В одном из примеров анализ клеточной продуктивности клетки-хозяина, обработанной химическими реагентами, может включать в себя определение клеточной производительности, например количественное определение по меньшей мере одного продукта экспрессии. Термин клеточная производительность (клеточная продуктивность), как используется в данном изобретении, относится к общему количеству рекомбинантно экспрессированного белка (например, полипептидов, антител и т.п.) или частиц, продуцированных клеткой в единицу времени при определенных условиях роста.
Клеточная производительность может также определяться путем идентификации изменения в природе биологического продукта или клеточного фенотипа в присутствии химического реагента по сравнению с соответствующим контрольным элементом в отсутствии реагента. Предпочтительно экспрессия или биологический продукт в этом способе количественно определяет продуцирование вирусных частиц, нуклеиновых кислот или белков.
В конкретном аспекте прямое количественное определение биологической молекулы является более точным, чем стандартные методы анализа бляшкообразования.
В предпочтительном примере продукт экспрессии представляет собой НА белок, количественно определенный с помощью ELISA и методов, известных специалистам в данной области. НА белок может представлять собой очищенный гликопротеиновый белок или связанный с вирусными компонентами, такими как расщепленные или цельные мембраны вирионов.
Для количественного определения синтеза рекомбинантных белков, кодирующих последовательности нуклеиновых кислот, РНК или ДНК могут количественно определяться с помощью хорошо известных методов, таких как методы нозерн-блоттинга, а также полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), в которых используются классические методы гибридизации нуклеиновых кислот.
Антигены.
Антиген может представлять собой любую молекулу (например, нуклеиновой кислоты, ДНК, РНК, белка, пептида, гликопротеина, гликопептида, углевода, липида, липопептида, полисахарида), которая может распознаваться компонентами иммунной системы независимо от того, могут они вызывать активацию иммунной системы или нет.
Антиген может быть связан с патогеном, таким как вирус коровьей оспы, авипоксвирус, вирус гриппа индейки, вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус лейкоза кошачьих, вирус птичьего гриппа, куриный пневмовирус, собачий парвовирус, вирус лошадиного гриппа, FHV, вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус гриппа штамма цыпленок/Пеннсильвания/1/83, вирус инфекционного бронхита; вирус Денге, вирус кори, вирус краснухи, вирус псевдобешенства, вирус Эпштейна-Барр, ВИЧ, SIV, EHV, BHV, HCMV, вирус Хантаан, столбнячная палочка, вирус эпидемического паротита, вирус кори, вирус герпеса 1 типа, вирус герпеса 2 типа, цитомегаловирус человека, вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус гепатита Е, респираторно-синцитиальный вирус, вирус папилломы человека, вирус гриппа, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium (например, Plasmodium
- 29 036992 falciparum и Plasmodium vivax), Toxoplasma, Cryptococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Haemophilus,
Diptheria, Tetanus, Pertussis, Escherichia, Candida, Aspergillus, Entamoeba, Giardia и Trypanasoma. Антигены могут представлять собой фрагмент или часть природно существующего антигена или синтетической молекулы, которая имитирует природный антиген или часть природного антигена.
В предпочтительном аспекте любой штамм вируса гриппа или его подтипа охватывается настоящим изобретением. Предпочтительно штамм вируса гриппа соответствует клиническому изоляту по меньшей мере одного циркулирующего штамма вируса гриппа А или В. Вирусы типа А в основном подразделяются на антигенные подтипы на основе двух вирусных поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящее время идентифицировано 16 подтипов НА (обозначенных как H1-H16) и 9 подтипов NA (N1-N9), которые могут быть обнаружены у диких водоплавающих птиц. Из 135 возможных комбинаций НА и NA только четыре (H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 и H5N1) широко распространены в человеческой популяции, поскольку вирус был впервые выделен в 1933 году.
Способ согласно настоящему изобретению демонстрирует конкретное улучшение продуцирования подтипов и штаммов, которые трудно поддавались воспроизводству. Например, процессы рекомбинации, как правило, не используются для вакцин против гриппа В вследствие отсутствия подходящих высокопродуктивных донорных штаммов гриппа В, которые антигенно являются достаточно разными. Скорее всего, рекомбинация как процесс была недооценена, поскольку эволюция вируса гриппа В была количественно определена с использованием данных, полученных только из генов НА. Тем не менее, настоящее изобретение значительно улучшает выход антигенных белков, полученных из штаммов вируса гриппа В типа, включая штаммы, полученные более константным и менее трудоемким способом, который был недостижим до настоящего изобретения. Штаммы В типа могут быть получены с выходом более 20, 30, 40, 50, 60 мкг/мл, что определяют с помощью ОФ-ВЭЖХ вирусных культур, очищенных от сахарозы. Выход антигенов типа В является штамм-специфическим, и возможно, что некоторые штаммы могут производить меньше чем в среднем 20 мкг/мл, что наблюдается в обычных штаммах и подтипах вируса гриппа. В тех случаях, когда выход зависит от штамма или вида, увеличение выхода может быть относительным измерением, которое может быть определено по сравнению с контрольным штаммом или типом.
Вакцина против гриппа В может быть частью одновалентной, двухвалентной, трехвалентной, четырехвалентной или семивалентной вакцины, которая может включать в себя более одного штамма подтипа В и может включать в себя комбинации других штаммов, таких как, но без ограничения, штаммы H1, H2, Н3, Н5, Н7 и/или Н9.
Подходящие штаммы вируса гриппа подтипа В, полученные по изобретению, включают вирус гриппа В, вирус гриппа В/Энн Арбор 1/8 6, вирус гриппа В/Харбин/7/94, вирус гриппа В/Гонконг/5/72, вирус гриппа B/Lee/40, вирус гриппа группы В/Виктория, вирус гриппа В/Ямагата 16/88, вирус гриппа группы В/Ямагата, вирус гриппа В/Яманаши/1бб/98, вирус гриппа типа В/Панама 45/90.
В особенно предпочтительном аспекте способы по настоящему изобретению повышают выход штаммов пандемического гриппа, включая, но без ограничения, штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Ирландия/1378/83 (H5N8), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Англия/63 (H7N3), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Англия/66 (H6N2), А/индюк/Англия/69 (H7N2), А/индюк/Шотландия/70 (H6N2); штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Англия N28/73 (H5N2), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Англия/110/77 (H6N2), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Англия/647/77 (H1N1), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Онтарио/7732/66 (H5N9), штамм вируса гриппа индеек
А/индюк/Англия/199/79 (H7N7), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Онтарио/7732/66 (H5N9), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Ирландия/1378/85 (H5N8), штамм вируса гриппа индеек
А/индюк/Англия/50-92/91 (H5N1), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Висконсин/68 (H5N9), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Массачусетс/65 (H6N2), штамм вируса гриппа индеек
А/индюк/Орегон/71 (H7N3), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Онтарио/6228/67 (H8N4), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Висконсин/66 (H9N2), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Англия/647/77 (H1N1), штамм вируса гриппа индеек А индюк/Онтарио/6118/68 (H8N4), штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Германия 3/91, штамм вируса гриппа индеек А/индюк/Миннесота/833/80 (H4N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Индонезия/03 (H5N1), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/FPV/Росток/1934, штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Техас/298313/04, штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Техас/167280-4-/02, штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Гонконг/220/97, штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Италия/8/98, штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Виктория/76 (H7N7), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Германия/79 (H7N7), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Шотландия/59 (H5N1); штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Пенсильвания/1370/83 (H5N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Керетаро-19/95 (H5N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Керетаро-20/95 (H5N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Гонконг/258/97 (H5N1), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Италия/1487/97 (H5N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Лейпциг/79 (H7N7), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Виктория/185 (H7N7), штамм вируса куриного
- 30 036992 гриппа А/цыпленок/Виктория/92 (H7N3), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Квинсленд/95 (H7N3), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Пакистан/1369/95 (H7N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Пакистан/447-4/95 (H7N3), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/НК/69/97 (H9N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Наком-Патом/Таиланд/Си-К2/2004 (H5N1), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Гонконг/31.2/2002 (H5N11), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Вьетнам/С58/04 (H5N1), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Вьетнам/38/2004 (H5N1), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Алабама/7395/75 (H4N8), штамм вируса куриного гриппа А/Германия/N/49 (H100N7), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Пекин/1/94 (H9N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Гонконг/623/97 (H9N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Пенсильвания/8125/83 (H5N2), штамм вируса куриного гриппа А/цыпленок/Гонконг/97 (H5N1), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Аньян/AVL-1/01, штамм вируса утиного гриппа А/утка/Нью-Йорк/17542-4/86 (H9N1), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Альберта/28/76 (H4N6), штамм вируса утиного гриппа А/утка Наньчан/4-165/2000 (H4N6), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Германия/49 (H10N7), штамм вируса утиного гриппа А/черная утка/Австралия/702/78 (H3N8), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Вьетнам/11/2004 (H5N1), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Альберта/60/76 (H12N5), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Гонконг/19б/77 (H1), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Висконсин/1938/80 (H1N1), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Бавария/2/77 (H1N1N1), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Бавария/1/77 (H1N1), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Австралия/749/80 (H1N1), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Гонконг/Y280/97 (H9N2), штамм вируса утиного гриппа А/утка/Альберта/35/76 (H1N1), штамм вируса птичьего гриппа А/кряква/Гурьев/263/82 (H14N5), штамм вируса птичьего гриппа А/кряква/РА/10218/84 (H5N2), штамм вируса птичьего гриппа А/кряква/Астрахань/244/82 (H14N6), штамм вируса гусиного гриппа А/гусь/Гуандун/1/96, штамм вируса гусиного гриппа А/гусь/Лейпциг/137-8/79 (H7N7), штамм вируса гусиного гриппаА/гусь/Гонконг/1л/222/97 (H6N7), штамм вируса гусиного гриппа А/гусь/Лейпциг/1877/79 (H7N7), штамм вируса гусиного гриппа А/гусь/Лейпциг/192-7/79 (H7N7), штамм вируса гусиного гриппа А Env/HK/437-4/99, штамм вируса гусиного гриппа A/Env/HK/437-6/99, штамм вируса гусиного гриппа A/Env/HK/437-8/99, штамм вируса гусиного гриппа A/Env/HK/437-10/99, штамм вируса птичьего гриппа А/штамм вируса птичьей чумы/Нидерланды/27 (H7N7), штамм вируса птичьего гриппа А/штамм вируса птичьей чумы/Добсон/27 (H7N7), штамм вируса птичьего гриппа А/штамм вируса птичьей чумы/Росток/34 (H7N1), штамм вируса птичьего гриппа А/штамм вируса птичьей чумы/Египет/45 (H7N1), штамм вируса птичьего гриппа А/штамм вируса птичьей чумы/Уэйбридж (H7N7), штамм вируса птичьего гриппа А/крачка/Южная Африка/61 (H5N3), штамм вируса птичьего гриппа А/крачка/Австралия/670С/75 (H11N9), штамм вируса птичьего гриппа А/перепел/Вьетнам/36/04 (H5N1), штамм вируса птичьего гриппа А/чайка/Мэриленд/704/77 (H13N6), штамм вируса птичьего гриппа А/обыкновенная чайка/Швеция/5/99 (H16N3), штамм вируса птичьего гриппа А/серебристая чайка/DE/677/88 (H2N8), штамм вируса птичьего гриппа А/лебедь/Италия/179/06 (H5N1), штамм вируса птичьего гриппа А/Гонконг/156/97 (AHK/156/97), штамм вируса птичьего гриппа А/перепел/HK/G197 (H9N2), штамм вируса птичьего гриппа А/перепел/Гонконг/AF57/93 (H9N2), штамм вируса птичьего гриппа А/чирок/НК W312/97 (H6N1), штамм вируса птичьего гриппа А/буревестник/Западная Австралия/2576/79 (H15N9), штамм вируса птичьего гриппа А/буревестник/Австралия/72 (H6N5), штамм вируса птичьего гриппа А/Гонконг/212/03, штамм вируса птичьего гриппа А/Англия/32177 (H3N2), вирусы пандемии гриппа А птичьего происхождения, вирус птичьего гриппа H5N1, штамм вируса птичьего гриппа H7N1, вирус птичьего гриппа H9N2 и вирус птичьего гриппа, адаптированный к холоду (са) и чувствительный к температуре (ts), исходный донорный штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
Вакцины вируса гриппа могут содержать все белки, пептиды или части вируса гриппа, а также нуклеиновые кислоты, которые кодируют эти белки, пептиды или их части, а также сами частицы вируса гриппа, рекомбинантные белки вируса гриппа, в том числе белки оболочек вируса гриппа белки, субвирусные частицы, вирусоподобные частицы (VLP), VLP-комплексы и/или их части, которые могут использоваться для целей иммунизации против гриппа.
Инактивированные вакцины гриппа обычно могут быть предоставлены с помощью дезактивирующего реплицированного вируса по изобретению с использованием известных способов, таких как, но без ограничения, обработка формалином или пропиолактоном. Типы инактивированных вакцин, которые могут применяться в настоящем изобретении, могут включать в себя цельно-верионную (WV) вакцину или субверионную (SV) вирусную вакцину. WV вакцина содержит интактный инактивированный вирус, в то время как SV вакцина содержит очищенный вирус, разрушенный с помощью детергентов, которые солюбилизируют липид-содержащую вирусную оболочку с последующей химической инактивацией остаточного вируса.
Кроме того, вакцины, которые могут применяться, включают вакцины, которые содержат изолированные поверхностные белки НА и NA, называемые поверхностными антигенными вакцинами. В общем, ответы на SV поверхностные антигеннные вакцины (т.е. очищенный НА или NA) похожи. Экспериментальная инактивированная WV вакцина, содержащая антиген NA, иммунологически связанный с эпидемическим вирусом и несвязанный НА, оказывается, является менее эффективной, чем обычные вакцины.
- 31 036992
Инактивированные вакцины, содержащие оба соответствующих поверхностных антигена, являются предпочтительными.
Живые вакцины аттенуированного гриппа, использующие реплицированный вирус, также могут применяться для профилактики или лечения вирусной инфекции гриппа в соответствии с известными этапами способа: Ослабление предпочтительно достигается в одну стадию путем передачи ослабляющих генов из ослабленного вируса-донора к реплицированному изоляту или реассортантному вирусу в соответствии с известными способами (см., например, Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2:174-181 (1993)). Поскольку устойчивость к вирусу гриппа А опосредуется развитием иммунного ответа на НА и NA гликопротеины, гены, кодирующие эти поверхностные антигены, должны приходить из подтвержденных вирусов или клинических изолятов высокого роста. Аттенуирующие гены получают от ослабленного родителя. При таком подходе гены, придающие ослабление, предпочтительно не кодируют НА и NA гликопротеины. В противном случае эти гены не могут быть переданы реассортантам, несущим поверхностные антигены изолята клинического вируса. Многие донорные вирусы были оценены на их способность воспроизводимо ослаблять вирусы гриппа. В качестве неограничивающего примера адаптированный к холоду (СА) донорный вирус А/Энн Арбор(АА)/6/60 (H2N2) может применяться для получения аттенуированных вакцин (см., например, Edwards, J. Infect. Dis. 169:68-76 (1994); Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2:174-181 (1993)). Кроме того, живые аттенуированные рессортантные вирусные вакцины могут быть получены в результате скрещивания донорного вируса с вирулентным реплицированным вирусом по изобретению.
Реассортантное потомство затем отбирают при 25°С (ограничивающей репликации вирулентного вируса) в присутствии H2N2 антисыворотки, которая ингибирует репликацию вирусов, несущих поверхностные антигены аттенуированного донорного вируса AI AAI6/60 (H2N2) са.
Другие аттенуирующие мутации могут вводиться в гены вируса гриппа с помощью сайтнаправленного мутагенеза для спасения инфекционных вирусов, несущих эти мутантные гены. Аттенуирующие мутации могут вводиться как в некодирующие области генома, так и в кодирующие области. Такие аттенуирующие мутации могут также вводиться в другие гены, отличные от НА или NA, например РВ2 ген полимеразы (Subbarao et al., J. Virol. 67:7223-7228 (1993)). Таким образом, также могут генерироваться новые донорские вирусы, несущие аттенуирующие мутации, введенные с помощью сайтнаправленного мутагенеза, и такие новые вирусы-доноры могут использоваться в производстве живых аттенуированных реассортантов вакцин-кандидатов H1N1 и H3N2 способом, аналогичным способу, описанному выше для донорского вируса AI AAI6/60 са. Аналогично, другие известные и подходящие аттенуированные донорские штаммы могут быть реассортированы реплицированным вирусом гриппа по изобретению для получения ослабленных вакцин, пригодных для применения в вакцинации млекопитающих (см. Ewami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3802-3805 (1990); Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:5177-5181 (1991); Subbarao et al., J. Virol. 67:7223-7228 (1993); заявка на патент США № 08/471100, содержание которых полностью включено в данное описание в качестве ссылки).
Вакцинные препараты.
Вакцинные композиции по настоящему изобретению, подходящие для вакцинации или для парентерального или перорального введения, включают аттенуированные или инактивированные вирусы гриппа, необязательно дополнительно включающие стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Композиция может дополнительно содержать вспомогательные реагенты или наполнители, которые известны в данной области техники.
Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и/или эмульсии, которые могут содержать вспомогательные реагенты или наполнители, известные в данной области техники. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и подходящие для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат.
Носители или окклюзионные повязки могут применяться для повышения проницаемости кожи и усиления абсорбции антигена. Жидкие лекарственные формы для перорального введения обычно могут содержать липосомные растворы, содержащие жидкую лекарственную форму. Подходящие формы для суспендирования липосом включают эмульсии, суспензии, растворы, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, традиционно используемые в данной области, такие как очищенная вода. Кроме инертных разбавителей, такие композиции могут также включать адъюванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты или подсластители, вкусовые вещества или отдушки. См., например, ниже публикации Berkow, Goodman, Avery's, Osol, и Katzung, содержание которых во всей полноте введено в данное описание в качестве ссылки, включая все приведенные там ссылки.
Когда композиция вакцины по настоящему изобретению используется для введения индивидууму, она может дополнительно содержать соли, буферы, адъюванты или другие соединения, которые желательны для улучшения эффективности композиции.
Адъюванты представляют собой соединения, которые могут использоваться для усиления специфического иммунного ответа. Обычно адъювант и композицию смешивают до введения в иммунную систему или вводят отдельно, но в то же самое место млекопитающего, подлежащего иммунизации.
- 32 036992
Неоднородность в вакцине может обеспечиваться путем смешивания реплицированных вирусов гриппа по меньшей мере двух штаммов вируса гриппа, например 2-50 штаммов или любого диапазона разновидности штаммов или значения в указанном диапазоне.
В соответствии с настоящим изобретением вакцины могут быть предоставлены для вариаций одного штамма вируса гриппа или для нескольких штаммов вируса гриппа с использованием способов, известных в данной области техники.
После приготовления композицию вакцины можно затем вводить в субъекту, нуждающемуся в этом. Таким образом, аттенуированная или инактивированная вакцинная композиция по настоящему изобретению обычно может предоставляться либо до вспышки инфекции (так, чтобы предотвратить или ослабить ожидаемую инфекцию), либо после инициации фактической инфекции. Например, такая композиция вакцины может вводиться различными парентеральными путями, такими как подкожный, внутривенный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, интраназальный, пероральный или чрескожный. Парентеральное введение может представлять собой болюсную инъекцию или медленную перфузию по времени. Предпочтительным режимом применения вакцинной композиции по настоящему изобретению является внутримышечное или подкожное введение. См., например, ниже публикации Berkow, Goodman, Avery и Katzung, содержание которых полностью включено в данное описание в качестве ссылок, включая все ссылки, указанные в них.
Вакцинная композиция вводится субъекту в эффективном количестве. Эффективное количество композиции вакцины представляет собой количество, которое является достаточным для достижения желаемого биологического эффекта. Понятно, что эффективная доза будет зависеть от возраста, пола, состояния здоровья и массы реципиента, вида сопутствующего лечения, если таковое имеется, частоты приема лечения и природы желаемого эффекта. Диапазоны эффективных доз, приведенных ниже, не предназначены для ограничения изобретения, а представляют предпочтительные диапазоны доз. Тем не менее наиболее предпочтительная доза будет подбираться для индивидуального субъекта специалистом в данной области техники способом, понятным и осуществимым без излишнего экспериментирования.
Данное изобретение включает в себя следующие конкретные варианты осуществления. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения терапевтических, профилактических или диагностических биологических молекул из системы клетки-хозяина, включающему контактирование системы клетки-хозяина по меньшей мере с одним химическим веществом, выбранным из табл. 1. Клетка-хозяин может представлять собой культуру клеток или яйцо с развивающимся эмбрионом. Культуру клеток предпочтительно выбирают из группы, включающей MDCK, Vero, BHK, PERC6 или CHO. В предпочтительном варианте осуществления изобретения биологическая молекула представляет собой антитело, фрагмент антитела или вакцинный антиген, в частности вирусный антиген, особенно предпочтительно - антиген, специфический в отношении вируса гриппа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения в качестве химических реагентов используется статин или аналоги статина, отличные от симвастатина. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения концентрация этих аналогов статина, отличных от симвастатина, составляет от 0,001 до 10 мкМ, особенно предпочтительно меньше или равна 0,05 мкМ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используются соединения следующей общей формулы:
или
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения применяются флувастатин, питавастатин, аторвастатин, церивастатин, ловастатин, мевастатин, правастатин, розувастатин или производные этих соединений, в частности флувастатин, питавастатин или их производные.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полученная биологическая молекула подвергается дальнейшей обработке с получением конечного стерильного продукта, например, посредством дополнительных стадий концентрации, очистки, фильтрации, получения препарата, стерилизации и наполнения. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения терапевтических, профилактических или диагностических биологических молекул из клетки-хозяина, включающему контактирование клетки-хозяина с химическим соединением, описанным в табл. 1, сбор биологической молекулы и технологическую переработку биологической молекулы в конечный терапевтический, профилактический или диагностический продукт. Предпочтительно продукт представляет собой вакцину против гриппа, в частности вакцину против гриппа В.
- 33 036992
Определения
Термин клетка-хозяин означает клетку, которая содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, такую как вектор, поддерживает репликацию и/или экспрессию нуклеиновой кислоты и, необязательно, продуцирование одного или нескольких кодированных продуктов, включая полипептид и/или вирус. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими, такими как E.coli, или эукариотическими, такими как клетки дрожжей, насекомых, амфибий, птиц или млекопитающих, включая клетки человека и клетки яиц с развивающимися эмбрионами. Термин клетка-хозяин включает в себя культивируемые клетки, комбинации или смеси клеток-хозяев, включая, например, смешанные культуры клеток различных типов или клеточных линий (например, клетки Vero и CEK).
Термины биологические молекулы, биологический продукт, используемые в данном описании, включают в себя любые молекулы, выделенные из живого организма, а также их производные, мутанты или варианты и/или биологически активные фрагменты. В контексте настоящего изобретения биологические молекулы или биологические продукты включают в себя биофармацевтические продукты или биопрепараты. Например, биологический продукт может представлять собой белок, такой как антигены, ферменты (например, киназы, протеазы, фосфатазы, трансферазы, факторы коагуляции и т.д.), пептиды, антитела, рецепторы, слитые белки, факторы роста, гормоны, цитокины (например, хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины, фактор некроза опухоли), нейротоксины и т.п. Биологическим продуктом может быть нуклеиновая кислота, нуклеотид, углевод, липид, вирусные или бактериальные белки, например, для применения в вакцинах, вирусные частицы. Предпочтительно биологическая молекула может применяться в качестве активного ингредиента в фармацевтическом препарате, таком как вакцина или фармацевтическое средство. В контексте настоящего изобретения термины продукт, белок и биологические молекулы могут использоваться в данном описании взаимозаменяемо. В некоторых вариантах осуществления изобретения подходящие биологические молекулы представляют собой рекомбинантные белки, включая, но без ограничения, секретированные белки, фрагменты белков (например, внеклеточные домены трансмембранных белков), химерные белки и/или меченые белки. Одна или несколько меток, если присутствуют, могут находиться на С-конце, N-конце и/или внутри белка (например, между двумя модулями). В некоторых вариантах осуществления изобретения такие рекомбинантные белки могут содержать один или несколько фрагментов сигнальных пептидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие рекомбинантные белки могут быть в виде предшественников (например, прогормонов) или их метаболитов.
Термины улучшать, увеличивать или повышать относятся к статистически значимому или физиологически значимому количеству, которое сравнивается с соответствующим контролем.
Термин соединение-кандидат или химический реагент относится к любому химическому, фармацевтическому или лекарственному средству и т.п., которое используется для модулирования экспрессии или производства биологических молекул в системах клеток-хозяев, таких как клеточная культура или яйца. Химические реагенты, используемые в данном изобретении, также включают их аналоги, а также их фармацевтически приемлемые носители, разбавители и препараты.
Термин изомеры, когда используется в данном описании, относится к различным соединениям с одинаковой молекулярной формулой, которые различаются по расположению и конфигурации атомов. Кроме того, термин оптический изомер или стереоизомер, когда используется в данном описании, относится к любой из различных стереоизомерных конфигураций, которые могут существовать для данного соединения по настоящему изобретению, включая геометрические изомеры. Подразумевается, что заместитель может присоединяться к хиральному центру, представляющему собой атом углерода. Таким образом, настоящее изобретение включает энантиомеры, диастереомеры или рацематы соединения. Энантиомеры представляют собой пару стереоизомеров, которые не являются зеркальными отражениями друг друга. Смесь пары энантиомеров в соотношении 1:1 представляет собой рацемическую смесь. Термин используется для обозначения рацемической смеси, когда это необходимо. Диастереоизомеры представляют собой стереоизомеры, которые содержат по меньшей мере два асимметричных атома, но которые не являются зеркальным отражением друг друга. Абсолютная стереохимия задается в соответствии с RS-системой Ингольда-Кана-Прелога. Когда соединение представляет собой чистый энантиомер, стереохимия каждого хирального атома углерода может быть определена как R или S. Разделенные соединения, абсолютная конфигурация которых не известна, могут быть обозначены (+) или (), в зависимости от направления (правовращающее или левовращающее), в котором они вращают плоскополяризованный свет при длине волны D линии натрия. Некоторые из соединений, описанных в данном изобретении, содержат один или несколько асимметричных центров или осей и, следовательно, могут давать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы, которые могут быть определены в терминах абсолютной стереохимии как (R)- или (S)-. Настоящее изобретение включает все такие возможные изомеры, в том числе рацемические смеси, оптически чистые формы и промежуточные смеси. Оптически активные (R)- и (S)-изомеры могут быть получены с использованием хиральных синтонов или хиральных реагентов или разделяться с использованием традиционных методик. Если соединение содержит двойную связь, заместитель может иметь Е- или Z-конфигурацию. Если соединение содержит дизамещенный циклоалкил, циклоалкильный заместитель может иметь цис- или трансконфигурацию.
- 34 036992
Подразумевается, что все таутомерные формы также включены в данное изобретение.
Термин пролекарство, когда используется в данном описании, означает соединение, которое может быть превращено в физиологических условиях или путем сольволиза в конкретное соединение или фармацевтически приемлемую соль такого соединения. Пролекарства включают соединения, в которых аминокислотный остаток или полипептидная цепь из двух или более аминокислотных остатков ковалентно соединены посредством амидной или эфирной связи со свободной аминогруппой, гидроксильной группой или группой карбоновой кислоты. Рассматриваемые аминокислотные остатки включают, но без ограничения, 20 природных аминокислот. Другие подходящие аминокислоты включают 4-гидроксипролин, гидроксилизин, демозин, изодемозин, 3-метилгистидин, норвалин, β-аланин, 5-аминомасляную кислоту, циртуллин, гомоцистеин, гомосерин, орнитин и метионинсульфон.
Термин обрабатывать, обработка, контактирование, в присутствии относятся к добавлению химического реагента к раствору или среде или к смешиванию химического реагента с раствором или средой, которые облегчают взаимодействие клетки с реагентом. Термин обрабатывать (лечить) или обработка (лечение), используемый в контексте введения субъекту (например, пациенту), относится к терапевтическому и/или профилактическому вмешательству для получения желаемого результата у субъекта, например для облегчения, лечения, задержки начала, уменьшения тяжести, предотвращения или снижения вероятности возникновения состояния или заболевания в популяции. Например, настоящее изобретение может быть осуществлено при производстве фармацевтической композиции (терапевтической и/или профилактической), которая может применяться в способе лечения субъекта, нуждающегося в этом, где указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества композиции.
Термины эффективное количество и эффективная доза, когда используются в данном описании, относятся к любому количеству или дозе соединения или композиции, которые являются достаточными для выполнения поставленной(ых) задачи(задач), т.е. получения желаемого биологического или медицинского ответа в ткани или у субъекта при приемлемом соотношении польза/риск. Соответствующее предполагаемая задача может быть объективной (т.е. измеримой некоторым тестом или маркером) или субъективной (т.е. у субъекта проявляются симптомы или субъект чувствует эффект). В некоторых вариантах осуществления изобретения эффективное количество представляет собой количество, при введении которого популяции субъектов, отвечающих определенным клиническим критериям, в популяции получают статистически значимый ответ. Эффективное количество обычно вводят в соответствии со схемой приема, которая может включать введение нескольких стандартных доз. Для любого конкретного фармацевтического средства эффективное количество (и/или подходящая стандартная доза в схеме введения) может изменяться в зависимости, например, от способа введения, сочетания с другими фармацевтическими реагентами. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффективное количество представляет собой количество, которое вызывает достаточный (например, защитный) иммунный ответ, который является статистически значимым в целевой популяции. В некоторых вариантах осуществления изобретения конкретное эффективное количество (и/или стандартная доза) для любого конкретного пациента может зависеть от множества факторов, включая расстройство, подлежащее лечению, и тяжесть расстройства; активность применяемого конкретного фармацевтического средства; применяемую специфическую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания пациента; время введения, путь введения и/или скорость экскреции или метаболизма конкретного применяемого фармацевтического средства; продолжительность лечения и подобные факторы, которые известны в области медицины. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество представляет собой количество, которое при введении в соответствии с определенной схемой дает положительный результат с достаточно приемлемым уровнем нежелательных побочных эффектов, так что побочные эффекты, если они присутствуют, являются достаточно терпимыми для пациента, чтобы продолжать лечение в соответствии с данной схемой. Специалистам в данной области техники будет понятно, что в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стандартная доза может рассматриваться как доза, содержащая эффективное количество, если она содержит количество, подходящее для введения в контексте схемы приема лекарственного средства, коррелированной с положительным результатом.
Термин популяция, группа населения (как во фразе целевая популяция) может относиться к группе индивидуумов (например, пациентов), которые отвечают определенным клиническим критериям. Как правило, статистически значимый биологический эффект может наблюдаться в популяции, включающей в себя по меньшей мере 50 индивидуумов, предпочтительно более 50 индивидуумов. Популяция может быть определена по возрасту, например пожилые люди (например, 65 лет и старше); педиатрическая популяция (например, новорожденные, младенцы, дети 2-12 лет, 3-6 лет, 2-7 лет или 6-12 лет), подростки (например, 12-16 лет, 12-18 лет, 13-19 лет или 19-21 лет), молодые люди (например, 17-24 лет), взрослые (например, 18-64 лет) и т.д. Кроме того, или в качестве альтернативы, популяция может быть определена с помощью определенного(ых) медицинского(их) состояния(ий), например популяция с подавленным иммунитетом, с предшествующей историей конкретного состояния, с более высоким риском развития конкретного медицинского состояния, с определенным генетическим фоном, с диагностиро- 35 036992 ванным конкретным заболеванием или расстройством, получает или планируют получить конкретную лечебную терапию или любые их комбинации.
Термин контроль относится к клетке-хозяину (клеткам-хозяевам) или системам, включающим клетки-хозяева, которые подвергаются, по существу, идентичному тестированию, но не контактируют с химическим реагентом или которые обрабатываются ДМСО. В качестве альтернативы термин контроль относится к тестируемому соединению, использующемуся в качестве сравнительного реагента, с которым сравниваются другие соединения или системы.
Выражение низкая концентрация химических реагентов, когда используется данном описании, относится к присутствию соединений в количестве от 0,1 нМ до 10 мкМ. Низкая концентрация представляет собой относительное количество и может включать в себя концентрации, приведенные выше в данном описании. Соответственно, термин более низкая концентрация относится к диапазону концентраций, которые могут адекватно обеспечить нужные результаты в настоящем документе по сравнению с контролем в конкретной системе.
Термин продукт разложения в данном контексте означает примесь, образующуюся в результате химического изменения композиции в процессе производства и/или хранения композиции под действием, например, света, температуры, рН, воды или взаимодействия с наполнителем и/или непосредственной закрытой системой контейнера.
Примеры
Схема научного подхода.
Для идентификации химических соединений, подходящих для увеличения роста или продуцирования продукта биологической системы (например, продуцирования вируса гриппа в MDCK клетках), используют подход, включающий следующие этапы.
(1) Проведение высокопроизводительных скринингов с использованием библиотеки соединений с небольшими молекулами, включая природные иммунодепрессанты и соединения с низким уровнем токсичности, которые нацелены на соответствующие биологические процессы и пути клеточного метаболизма на различных стадиях жизненного цикла вируса гриппа.
(2) Подтверждение действия выявленных соединений (соединений-лидеров) в лабораторных суспензионных культурах клеток MDCK с использованием множества штаммов и подтипов вируса гриппа.
(3) Проведение анализа зависимости структура-активность (SAR) выявленных соединений и скрининг дополнительных структурно-родственных аналогов.
(4) Исследование механизма действия (mechanism-of-action - МОА) выявленных соединений.
(5) Подтверждение результатов концептуальных исследований в системе биореактора.
Выявляют несколько соединений, которые даже в низких концентрациях дают значительное повышение выхода различных штаммов и подтипов гриппа, включая штаммы гриппа В.
Пример 1. Высокопроизводительный скрининг.
В соответствии с методикой высокопроизводительного скрининга (High Throughput Screening HTS) соединения тестируют в 384-луночном формате, содержащем клетки MDCK 33016PF (клетки описаны в патенте США № 6455298), инфицированные вирусом гриппа А/реассортант/NYMC Х-183 H3N2. Библиотеку соединений, включающую 14398 химических реагентов, подвергают первичному скринингу с использованием метода ELISA, основанного на нуклеопротеине (NP-ELISA), при концентрации соединения 1 мкМ. 1547 лучших, согласно первичному скринингу, соединений подвергают тестированию методом NP-ELISA в исследовании зависимости доза-ответ с использованием диапазона концентраций 0,001-10 мкМ. После этого вторичный скрининг проводят на 268 лучших соединениях первичного скрининга, тестированных методом NP-ELISA в исследовании зависимости доза-ответ. Вторичный скрининг дает 88 лучших соединений, 80 из которых показывают по меньшей мере 50% увеличение выхода NP и/или НА при концентрациях соединений менее 10 мкМ.
В одном случае при наибольших тестированных концентрациях сигналы НА и NP не поддаются измерению. Например, статиновое лекарственное средство в концентрации 10,0 мкМ дает на -12,34% увеличение НА сигнала и -11,44% увеличение NP сигнала. Вполне возможно, что при такой высокой дозе истощение холестерина, например, из мембраны клетки-хозяина или вируса является результатом функции статина, что ставит под угрозу целостность клеток и вирусной мембраны. Десять лучших соединений, выбранных для тестирования, представлены в табл. 3.
Два наиболее эффективных соединения (соединения-лидеры), выбранные для дальнейшего тестирования, представляют собой сульфонамид (аналог формулы 3)
- 36 036992
Таблица 3 и питавастатин (аналог формулы 2)
Соединение | Концентрация в лунке (мкМ) | Средн. % повышения выхода НА | Средн. % увеличения NP сигнала |
Тетрагидропиридин | 0,08 | 24,89 | 27,29 |
0,16 | 30,19 | 44,21 | |
0,31 | 27,89 | 40,52 | |
0,63 | 38,90 | 64,44 | |
1,25 | 50,71 | 65,48 | |
2,50 | 86, 11 | 104,71 | |
5,00 | 91,58 | 137,47 | |
10, 00 | 102,19 | 166,64 | |
Сульфонамид 1 ' Q O-S-Ο | 0,08 | 64,93 | 21,01 |
0,16 | 64,33 | 31,11 | |
0,31 | 64,38 | 23,61 | |
0,63 | 91,94 | 21,38 | |
1,25 | 92,47 | 50,73 | |
2,50 | 129,92 | 65,71 | |
5,00 | 122,77 | 87,25 | |
10, 00 | 159,01 | 107,41 | |
Тропанил С1Л 0 | 0,08 | 33,48 | -1,47 |
0,16 | 37,55 | 1,76 | |
0,31 | 42,65 | 12,87 | |
0,63 | 48,67 | 22,70 | |
1,25 | 58,61 | 52,25 | |
2,50 | 77,61 | 87,42 | |
5,00 | 82,92 | 133,32 | |
10, 00 | 123,48 | 175,04 | |
Статин | 0,08 | 67,38 | 91,92 |
0,16 | 76, 13 | 90,98 | |
0,31 | 74,03 | 90,22 | |
0,63 | 83,20 | 69,05 | |
1,25 | 68,34 | 65,28 | |
2,50 | 60,97 | 63,19 | |
5,00 | 16,25 | 29,27 | |
10, 00 | -12,34 | -11,44 | |
Бензизотиазол СХ /-а S-M 4—' '—\ /ΛΖζ N\j(J | 0,08 | 26, 67 | 5,84 |
0,16 | 25,97 | 14,84 | |
0,31 | 22,62 | 26, 68 | |
0,63 | 28,39 | 26,79 | |
1,25 | 34,15 | 47,70 | |
2,50 | 47,99 | 53,27 |
- 37 036992
5,00 | 88,58 | 78,01 | |
10,00 | 124,63 | 99,38 | |
Бензпираны ОО о о О Си Ϊ 0 ^0 | 0,08 | 41,56 | 49,66 |
0,16 | 50,02 | 46,81 | |
0,31 | 49,52 | 47,83 | |
0,63 | 64,30 | 69,11 | |
1,25 | 60,09 | 76, 67 | |
2,50 | 80,12 | 123,05 | |
5,00 | 78,27 | 97,64 | |
10,00 | 107,06 | 91,94 | |
Диметоксифенил- пиперидинметанолы XX ^х Н г ΧΝ iUj О1 cr 1 | 0,08 | 40,64 | 26,88 |
0,16 | 49,76 | 42,89 | |
0,31 | 46, 61 | 51,23 | |
0,63 | 57,07 | 70,43 | |
1,25 | 62,46 | 67,14 | |
2,50 | 64,47 | 96, 13 | |
5,00 | 67,07 | 124,66 | |
10,00 | 97,73 | 148,67 |
Пример 2. Подтверждающее тестирование выявленных соединений.
Два лучших выбранных соединения подвергают тестированию для подтверждения их активности, проводимому в 10 мл суспензионных культур с использованием нескольких штаммов и подтипов вируса гриппа. После инкубирования вируса супернатант собирают и количественно определяют выход вируса/НА. Выход НА количественно определяют с помощью ELISA. Количество инфекционных частиц измеряют с помощью анализа фокусообразования (focus formation assay - FFA) на основе NP. Вирусные частицы количественно измеряют подсчетом с помощью кПЦР последовательностей нуклеиновых кислот. Выход вирусных частиц, инфекционных частиц и НА, определенный в культуральном супернатанте, показывает аналогичное увеличение при применении сульфонамидного аналога (далее сульфонамидный аналог) и питавастатина по сравнению с контролем. Однако питавастатин повышает выход при значительно более низкой концентрации, чем сульфонамидный аналог. Результаты исследования повышения ответа зависимым от дозы образом для штамма H3N2 IVR-165 представлены на фиг. 2. Питавастатин приводит к 3-кратному увеличению выхода НА даже при таких низких концентрациях, как 0,05 или даже 0,01 мкМ.
Пример 3. Тестирование выявленных соединений с различными штаммами вируса гриппа.
Для изучения области штаммов вируса гриппа, которые могут повреждаться в результате обработки соединениями, описанными в данном изобретении, клетки MDCK инфицируют различными штаммами и подтипами вируса гриппа с использованием 1 мкМ сульфонамида или 0,05 мкМ питавастатина. Вирусное инфицирование проводят при MOI 10-3 или 10-4 в течение примерно 60 ч при температуре 34°С.
I. Вирус гриппа А.
Образец получают из супернатанта через 60 ч после вирусной инокуляции для исследования механизма действия с целью определения экспрессии гена или экспрессии белка. Как показано на фиг. 3, наблюдается значительное повышение выхода НА для нескольких штаммов вируса гриппа, таких как вирус гриппа подтипа A H1N1 (штаммы А/Брисбен/10/10 и А/Соломон х145), вирус гриппа подтипа A H3N2 (штаммы А/Виктория/361/11, А/Брисбен/10/07, А/Уругвай/716/07 и А/Техас/50/12).
II. Вирус гриппа подтипа В.
Химические реагенты, используемые в настоящем изобретении, оказывают значительное влияние на продуцирование вируса/белка вируса гриппа подтипа В. Как показано На фиг. 4, сульфонамид и питавастатин дают по меньшей мере 2-кратное увеличение продуцирования НА по сравнению с контролем со множеством штаммов вируса гриппа подтипа В (штамм В/Панама/45/90, В/Флорида/4/06, В/Висконсин/1/10, В/Брисбен/60/08 и В/Массачусетс/2/12).
Эти данные показывают, что действие соединений не ограничивается определенным штаммов вируса.
Пример 4. Механизм действия и жизнеспособность клеток.
Исследования механизма действия проводят с целью определения влияния химических веществ на различные стадии жизненного цикла вируса. Время добавления при исследовании составляет -32, -24, -8, -1, +2, +4, + 6 ч от инфицирования клеток. В исследовании вирусной инфекции с единственным циклом клетки инкубируют с вирусом при MOI 5 на льду в течение 1 ч для предоставления возможности вирусу прикрепиться. Спустя 1 ч незакрепленные вирусы смывают, клетки переносят в 34°С для слияния вирусов и проникновения их в клетки. После стадии промывки добавление 1,0 мкМ сульфонамида или 0,05 мкМ питавастатина осуществляют в различные моменты времени (Т=0, 2, 4, 6 ч). Сульфонамидный
- 38 036992 аналог и питавастатин, как оказывается, являются стабильными в течение периода времени до 32 ч в культуре до заражения вирусом гриппа H3N2 штамма IVR-165 (А/Виктория/361/2011). Выход НА снижается от примерно 20 пг/мл до примерно 5 мкг/мл для сульфонамидного аналога через 6 ч после инфицирования и от примерно 20 до примерно 5 мкг/мл для питавастатина через 2 ч после инфицирования. Полученные результаты свидетельствуют о том, что выход НА зависит от времени добавления после вирусного инфицирования, что может являться результатом действия конкретного реагента и конкретной стадии жизненного цикла вируса.
Анализы жизнеспособности клеток проводят с использованием MDCK клеток, обработанных 1 мкМ сульфонамида или ДМСО (контроль). Жизнеспособность клеток отслеживают в течение 60 ч с использованием VI-CELL машины (Beckman Coulter) (жизнеспособность клеток измеряется на основе вытеснения трипанового синего). Сульфонамидный аналог, используемый в данном тестировании, не является поступающим в продажу лекарственным препаратом, поэтому его токсичность использовалась для идентификации жизнеспособности клеток при инкубации с наивысшей тестируемой концентрацией 10 мкМ и контактировании в течение 60 ч. Ни сульфонамид, ни питавастатин не оказывают негативного влияния на жизнеспособность клеток. В клетках, обработанных сульфонамидом, обнаруживается 91% жизнеспособность.
Пример 5. Масс-спектрометрический анализ.
Анализ жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра, управляемого в режиме мониторинга нескольких реакций (Multiple Reaction Monitoring - MRM), разработан для контроля присутствия соединения/клиренса в супернатанте клеточной культуры и после процесса вирусной очистки с помощью градиента плотности сахарозы. Оценку предела обнаружения (limit of detection - LOD) проводят серийным разведением соединений в жидкости, содержащей моновалентную вакцину и затем выполняют последовательное разведение соединений с использованием указанной жидкости до концентрации 1 нг/мл. Перед анализом во все образцы добавляют ацетонитрил (50% об./об.) и образцы центрифугируют в течение 5 мин на лабораторной центрифуге для удаления осадка белка. Для обоих образцов, содержащих 1 нг/мл сульфонамида и 1 нг/мл питавастатина, соотношение сигнала и шума составляет более 100 (более 400 в случае сульфонамида). Из наблюдаемого соотношения сигнала и уровня шума при концентрации 1 нг/мл консервативно оцененный предел обнаружения составляет менее 0,5 нг/мл, и предел количественного определения составляет примерно 5 нг/мл (фиг. 6А). Калибровочные кривые для каждого соединения выглядят одинаково линейными от 1 до более 50 нг/мл со значениями R2 более 0,95 (фиг. 6А, 6В). Для определения метаболизма или разложения соединения в культуре клеток соединения вводят только в среду или в смесь среда+MDCK клетки. Супернатант этих образцов отбирают в 0 и 60 ч для масс-спектрометрического анализа. Через 60 ч потери соединений не обнаружены (фиг. 6В). Для определения возможности удаления соединений из супернатанта культуры клеток после процесса очистки вируса клетки MDCK инфицируют вирусом гриппа типа А или В в присутствии соединений. Через 60 ч осветленный супернатант клеточной культуры (1) замораживают при -80°С для последующего ЖХ-МС анализа или (2) подвергают вирусной очистке с центрифугированием в градиенте плотности сахарозы и вирусные частицы пеллетируют. Эти очищенные образцы также тестируют ЖХ-МС для определения качества очистки образцов от соединений. Обнаружены следовые количества (ниже LOQ, приближающиеся к LOD) в этих очищенных образцах. Общее количество (в нг) соединений, остающихся после очистки вируса, составляет менее 0,25% от их исходного количества в клеточных культурах (фиг. 6С).
Пример 6. Исследования в больших объемах.
Для определения возможности воспроизводства выхода НА в больших объемах два выявленных соединения разбавляют ДМСО и применяют в концентрациях 0,2 и 5 мкМ в образцах объемом 10 или 60 мл, содержащих культуру MDCK клеток, инфицированную H3N2 штаммом (IVR165) с MOI=10-4, в течение 60 ч. Количество вирусных частиц определяют с помощью кПЦР РНКаза-резистентных РНК транскриптов, таких как ген М вируса гриппа (см. Ngaosuwankul et al. Virology Journal, 7:75 (2010), doi: 10.1186/1743-422X-7-75). Выход НА нормализуют относительно контроля. Исследования показывают, что соответствующее увеличение выхода НА наблюдается в обоих образцах культуры объемом 10 и 60 мл.
Результаты, представленные на фиг. 5, показывают, что повышение выхода НА или повышение количества частиц коррелированы пропорционально, как подтверждено ELISA и кПЦР.
Множество аналогов соединений-лидеров испытывают для сравнения друг с другом. Большинство аналогов повышает выход вируса гриппа при тестируемой концентрации. Однако для некоторых аналогов тестируемая концентрация не является оптимальной. На фиг. 8 представлены результаты тестирования аналогов статина для сравнения активности при 0,05 мкМ. Розувастатин идентифицирован как аналог, который не дает потенциала повышения выхода относительно сравнительных статинов при 0,05 мкМ. Однако необходимо оптимизировать альтернативные концентрации и экспериментальные условия, соответствующие тестированному химическому реагенту, такому как розувастатин, для получения нужных эффектов.
- 39 036992
Пример 7. SAR исследования.
Исследование зависимости структура-активность (Structure Activity Relationship - SAR) проводят для выявления аналогов соединений-лидеров. Идентифицируют 88 сульфонамидных аналогов, из которых тестируют три соединения. Один аналог приводит к увеличению выхода аналогично увеличению при применении соединения-лидера. Идентифицируют 155 аналогов питавастатина, из которых тестируют более 148 соединений. Кроме того, тестируют несколько других коммерчески доступных статинов (фиг. 8). Большинство тестируемых аналогов дают по меньшей мере 2-кратное увеличение выхода вирусных частиц. В частности показано, что (i) соединение-лидер пивастатин превосходит некоторые другие коммерчески доступные статины, включая симвастатин (фиг. 8), (ii) флувастатин и некоторые производные флувастатина, такие как метиловый или этиловый эфиры флувастатина, даже превосходят питавастатин (фиг. 7). Особенно предпочтительные варианты аналогов статина по изобретению включают реагенты, представленные в табл. 4, которые дают по меньшей мере 2-кратное увеличение выхода НА, как измерено с помощью ELISA, по сравнению с контрольной обработкой ДМСО в условиях, описанных выше.
Таблица 4
HA-ELISA | ||
Соединения | Кратность повшения выхода НА по сравнению с ДМСО контролем | НА (мкг/мл) |
Статиноподобный аналог 1 | 4,92 | 7,78 |
Статиноподобный аналог 2 | 4,71 | 8,01 |
Статиноподобный аналог 3 | 4,71 | 8,50 |
Статиноподобный аналог 4 | 4,32 | 7,34 |
Статиноподобный аналог 5 | 4,14 | 6,89 |
Статиноподобный аналог 6 | 3,56 | 6,56 |
Статиноподобный аналог 7 | 3,51 | 7,61 |
Статиноподобный аналог 8 | 3,43 | 6,47 |
Статиноподобный аналог 9 | 3,16 | 6,38 |
Статиноподобный аналог 10 | 2,99 | 6,56 |
Статиноподобный аналог 11 | 2,97 | 6,42 |
Статиноподобный аналог 12 | 2,92 | 9,29 |
Статиноподобный аналог 13 | 2,89 | 8,63 |
Статиноподобный аналог 14 | 2,83 | 7,34 |
Статиноподобный аналог 15 | 2,73 | 19,69 |
Статиноподобный аналог 16 | 2,59 | 19,69 |
Статиноподобный аналог 17 | 2,57 | 14,34 |
Статиноподобный аналог 18 | 2,56 | 17,31 |
Статиноподобный аналог 19 | 2,54 | 12,51 |
Статиноподобный аналог 20 | 2,53 | 7,72 |
Статиноподобный аналог 21 | 2,43 | 7,19 |
Статиноподобный аналог 22 | 2,40 | 9,28 |
Статиноподобный аналог 23 | 2,24 | 10,56 |
Статиноподобный аналог 24 | 2,13 | 8,44 |
Статиноподобный аналог 25 | 2,09 | 8,55 |
Пример 8. Выявление пути передачи сигнала.
В способе повышения продуцирования биологического продукта с помощью добавления химических реагентов, описанном в изобретении, оценивают механизмы действия, объясняющие наблюдаемые эффекты усиления. Для выявления и характеристики химических добавок, подходящих для применения, и для определения целесообразности применения указанного способа для производства указанных продуктов в качестве рабочей модели используют продуцирование вакцины гриппа в клетках MDCK 33016PF. С этой целью для подробного анализа выбирают топ-соединение BYF589, которое повышает выход НА в нескольких штаммах и подтипах вируса гриппа по меньшей мере в 2 раза (соединение G в табл. 2). Для того чтобы определить, является ли повышение выхода НА с помощью BYF589 следствием ингибирования HMGCR, проводят исследования механизма действия соединения в системе. Для проверки мевалонатного (MEV) пути передачи сигнала используют специфические ингибиторы фермента (как показано на фиг. 9А). Эти ингибиторы ферментов селективно нацелены на конкретные ветви MEV пути метаболизма, обеспечивая определение более удобного пути для механизма действия (МОА) BYF.
- 40 036992
Исследуют возможные эффекты BYF589, а также различных ингибиторов ферментов пути метаболизма на жизнеспособность клеток и уровни общего клеточного холестерина. Тестируемые образцы включают ДМСО, BYF589 (1 мкМ), MEV (100 мкМ), FTI (0,5 мкМ), ZA (1 мкМ) и GTI (0,5 мкМ). Через ч после обработки не обнаруживают никакого неблагоприятного влияния на жизнеспособность клеток, как измерено с помощью свечения клеточного титра (cell titer glow).
Свободный холестерин окисляется холестериноксидазой с образованием кетона холестерина и Н2О2 с последующим взаимодействием со смесью Amplex Red+пероксидаза из хрена (HRP) для получения флуоресцентного резоруфинового продукта. Для этой части эксперимента определяют выход НА и клеточного холестерина, нормализованных по ДМСО, повышение выхода НА коррелирует с более низким уровнем холестерина в клетках, обработанных BYF, и является зависимым от дозы, что позволяет сделать предположение о том, что содержание холестерина может быть задействовано в повышении выхода. MEV сам по себе не оказывает никакого влияния на клеточные уровни холестерина. При применении MEV в сочетании с BYF снижается повышение выхода НА без повышения уровней содержания холестерина в клетках, свидетельствуя о том, что снижение содержания одного холестерина не является достаточным, чтобы приводить к повышению выхода НА.
Когда три ингибитора соответствующих ответвлений MEV пути передачи сигнала используют в различных комбинациях, наблюдается аддитивный эффект, свидетельствуя о том, что несколько разветвлений указанного пути фактически участвует в создании эффекта усиления. Полученные результаты представлены на фиг. 9В. Эти результаты показывают, что блокирование всех трех ветвей указанного пути определенной комбинацией ингибиторов фермента может имитировать действие соединения по повышению выхода НА. Кроме того, подтверждено, что бифосфонат, ингибитор действия BYF589, который следует далее, но перед точкой разветвления сигнала, может вызвать аналогичный зависимый от дозы эффект повышения выхода НА, хотя и менее надежный, чем BYF589.
Пример 9. Исследования экспрессии генов.
Доказательства, представленные в литературе, свидетельствуют о том, что статины могут подавлять IFN и IFN-опосредуемые гены, такие как IP10 (CxCL10). Поэтому проводят исследование возможности наличия связи повышения выхода НА вируса гриппа с реакцией на подавление интерферона (IFN) статинами. Экспрессию генов IP10 и IFNB1 измеряют после инфицирования в присутствии или в отсутствие BYF589 соединения. Предварительные данные кОТ-ПЦР позволяют сделать предположение о задержке/подавлении индукции IFNb и IP10 в инфицированных вирусом MDCK клетках в присутствии BYF589. Наблюдаемое время задержки для обоих генов, испытанных в присутствии BYF589 соединения, составляет по меньшей мере 2 ч по сравнению со временем индукции гена (измеренным при пиковом значении) в отсутствие BYF589 соединения.
Пример 10. Определение времени обработки клетки-хозяина соединением, повышающим выход.
Для того чтобы оценить, насколько два соединения-лидера (BYF589 и AFZ077) могут работать посредством обычного пути передачи сигнала, каждое соединение добавляют к культуре клетки-хозяина в различное время после заражения и через 24 ч после заражения измеряют их влияние на выход НА. Результаты показывают, что при добавлении BYF589 во время инфицирования вирусом (Т=0) в течение 24 ч достигается примерно 4-кратное увеличение выхода НА по сравнению с контролем, выращенным без соединения. Тем не менее при добавлении соединения BYF589 в последующие моменты времени (Т=2, 4 или 6) значительного повышения выхода НА в течение 24 ч не наблюдается. В противоположность этому добавление AFZ077 во время инфицирования (Т=0), а также в последующие моменты времени (Т=2 и 4) приводит примерно к 4-кратному увеличению выхода НА через 24 ч после инфицирования; однако при добавлении AFZ077 через 6 ч после инфицирования (Т=6) существенного увеличения выхода не наблюдается. Эти результаты указывают на то, что повышение выхода НА с помощью двух соединений зависит от времени добавления в инфицированные культуры клеток-хозяев. Кроме того, исходя из временных различий эффектов каждого соединения, есть вероятность того, что эти два соединения целевым образом воздействуют на разные стадии жизненного цикла вируса. Дополнительно или в качестве альтернативы, два соединения могут регулировать различные пути передачи сигналов клетокхозяев.
Пример 11. Параллельное сравнение в мини-биореакторе.
Указанные два соединения-лидера дополнительно тестируют в коммерчески доступной системе биореактора малой производительности Ambr15™ (TAP Biosystems). Система Ambr15 имитирует характеристики классических биореакторов на микроуровне (10-15 мл), управляемых с помощью автоматизированного рабочего места, что позволяет быстро оценивать несколько культур в биореакторе на микроуровне.
Для тестирования оба соединения-лидера тестируют одновременно в контролируемых условиях с двумя препаратами инфекционной среды (DM134 и CDM) и двумя штаммами гриппа, А/Виктория/361/2011 (IVR-165) (с высоким уровнем экспрессии) и В/Массачусетс/2/2012 (с низким уровнем экспрессии).
- 41 036992
Используемое в эксперименте инфицирование, характеризуется следующими показателями: плотность высева 1,0х106 клеток/мл или 2,5х106 клеток/мл; рН 7,1 ±0,02 (двойной контроль рН с помощью 0,05N NaOH и газообразного СО2); растворенный кислород 50% (50-80%), контролируется газообразным О2; перемешивание 1000 об/мин (местный контроль); температура 34,0°С, контролируется с помощью регулирующего зонда биореактора; тип реактора Spargeless, реакторы расширенного диапазона температур; доза аэрации в процессе эксперимента 1 мл/мин.
Результаты, полученные в эксперименте в системе Ambr15, представлены на фиг. 10 и 11. Оба соединения-лидера повышают выход НА для штамма В с низким уровнем экспрессии в обеих тестируемых средах. Однако для тестируемого штамма А с высоким уровнем экспрессии добавление AFZ077 приводит к гораздо большему повышению выхода НА в обеих тестируемых средах. Количественное определение выхода НА осуществляют с помощью ELISA с последующим подтверждением с помощью ВЭЖХ. AFZ077 повышает выход НА в DM134 среде с низкой (1х106 на 1 мл) и высокой (2,5х106 на 1 мл) плотностями инфицированных клеток в системе. Для последней при сочетании высокой ICD с AFZ обработкой обработка AFZ077 приводит к в ~4 раза более высокому выходу по сравнению с первоначальным выходом, что превышает первоначальное целевое 2-кратное повышение (фиг. 12). Таким образом, в системе Ambr15 добавление AFZ077 повышает выход НА в DM134 среде во встряхиваемых колбах и 15 мл биореакторах для всех исследованных штаммов. BYF589 повышает выход НА в DM134 среде во встряхиваемых колбах и 15 мл биореакторах в штамме вируса гриппа В с низким уровнем экспрессии. В целом, больший эффект повышения выхода наблюдается для штаммов с низким уровнем экспрессии. Кроме того, дополнительные эффекты наблюдаются при применении AFZ077 и более высокой плотности инфицирующих клеток.
Пример 12. Биореактор большого объема.
Предыдущие исследования показывают, что соединение AFZ077 повышает выход НА в DM134 среде в опытных встряхиваемых колбах и биореакторах объемом 15 мл. Результаты подтверждают с использованием трех различных вирусов (штаммы высокой, средней и низкой экспрессии). Результаты показывают, что BYF589 повышает выход НА в DM134 среде в исследованиях во встряхиваемых колбах и биореакторах объемом 15 мл для штамма гриппа В с низким уровнем экспрессии, но не для штамма H3N2 с высоким уровнем экспрессии. Для подтверждения этих результатов в системе большего объема используют биореакторы TD AMBR™ объемом 250 мл. Оба соединения-лидера (а также только ДМСО в качестве отрицательного контроля и среду без соединения/без ДМСО в качестве двойного отрицательного контроля) тестируют со штаммами с высоким и низким уровнем экспрессии для определения возможности воспроизведения повышения выхода, наблюдаемого в культурах небольшого объема, в системе большего объема. Параметры эксперимента: отработанный DM134: свежий PFM (1:3); штаммы вируса А/Виктория/361/2011 (IVR-165) и В/Массачусетс/02/2012; MOI 10-5 для А/Виктория IVR-165 и 10-4 для В/Массачусетс; ICD: 2,0е6-3,0е6 клеток/мл; N-1 процесс: 1В (без замены среды); время сбора урожая через 65-72 ч после инфицирования; выходы НА количественно определяют с помощью двух методов: ОФ-ВЭЖХ и HA-ELISA. Полученные результаты представлены на фиг. 13 и 14. Данные, представленные на фиг. 13, показывают, что BYF589 в дозе 0,005 мкМ приводит примерно к 37% увеличению выхода по сравнению с контролем без ДМСО, как измерено с помощью НА-ВЭЖХ. Данные, представленные на фиг. 14, показывают, что при определенных условиях AFZ077 не дает значительного повышения выхода НА по сравнению с контролем в любой из испытанных доз для штамма В/Массачусетс в системе Ambr250. Примечательно, что значения ошибок представляют одно стандартное отклонение от среднего значения и иллюстрируют вариабельность HA-ELISA анализа при повторах эксперимента.
Пример 13. Механистически связанные соединения (функциональные эквиваленты).
Установлено, что повышающее действие AFZ077 на выход НА гриппа зависит от снижения активности рецептора 5НТ7, поскольку AFZ эффекты могут аннулироваться при добавлении серотонина (5НТ) в качестве лиганда (фиг. 15). Это свидетельствует о том, что такие эффекты опосредуются активностью рецептора, показывая, что другие реагенты, которые способны опосредовать такие же или подобные клеточные эффекты, могут повышать выход белка так же, как и соединения-лидеры. Исследования соединений формулы 8 (например, соединения Е) проводят для выявления потенциальных соединений, которые могут совместно использовать определенные механизмы действия, как представлено в табл. 5.
Таблица 5
СОЕДИНЕНИЕ | СВЯЗВАЮЩИЕ АКТИВНОСТИ | СТРУКТУРА |
Соединение Е (контрольное соединение) NVP-AFZ077 (SB-258741) | '· » 1 |
- 42 036992
Соединение К NVP-AHL128 | u. | |
Соединение L Клозапин | D2, 5-НТ2А, 5- НТ1А, 5-НТ2С, 5- НТЗ, 5-НТ6, 5- НТ7, DI, D3, D4, al, а2, Ml, Hl | CL’’ i ‘ . ..·......·.. „ . Й |
Соединение М Рисперидон | D2, 5-НТ2А, 5- НТ7, al, а2 | ό |
Соединение N NVP-XCD714 SB-269970 | p \ / ^x —s о о | |
Соединение О Кветиапин | D2, 5-НТ2А, 5- НТ6, 5-НТ7, al, а2, Hl | ,—он —g —/ о N=K 0.0 |
Результаты сравнительного исследования для оценки относительных выходов НА представлены на фиг. 16. Некоторые из этих кандидатов были дополнительно протестированы на их способность увеличивать выход НА относительно AFZ077 (фиг. 17).
Дополнительные SAR исследования проводят для дальнейшей идентификации соединенийкандидатов, способных повышать выход. 165 аналогов испытывают в концентрации 0,05 мкМ в 10 мл вирусных культур со штаммом H3N2. BYF589 повышает выход по сравнению с контролем без соедине- 43 036992 ния (ДМСО) в ~2 раза. 14 из 165 выявленных в результате скрининга соединений также повышают выход НА, как и BYF589, или превосходят его при тестируемой концентрации. Выявлены аналоги, которые примерно в 2 раза превосходят BYF589.
Пример 14. Усиление экспрессии рекомбинантного белка.
Для дальнейшей оценки общей применимости соединений, выявленных в исследованиях выхода НА, одно из соединений-лидеров, BYF589, тестируют на экспрессию рекомбинантного белка с помощью гетерологичных клеток. В частности, в исследование включены белки, которые, как ранее было установлено, трудно экспрессируются в НЕК293 клетках и которые упоминаются как белки низких выходов. В типичной оптимизированной системе низкие выходы определяются как выходы 5 мг/л или менее. Для экспериментов отбирают примерно 20 конструктов целевых белков с типичными выходами в интервале 2-10 мг/л. Они секретируются белками млекопитающих, которые представляют собой усеченные версии аналогов полной длины. Каждый конструкт (в варианте вектора pRS5a) содержит по меньшей мере одну метку (например, по меньшей мере С-концевой FlagHis в дополнение к тому, что многие являются слитыми N- или С-терминально с мышиным IgG1 Fc). Для снижения систематических ошибок выбирают примерно равные количества метки каждого типа.
Все мишени с выходом <1 или >10 мг/л удаляют. Затем мишени сортируют по типу метки. Наконец, если это выглядит как представление определенного диапазона молекулярной массы, несколько дубликатов удаляют. Затем для выбора образцов первые 6-7 из меток каждого типа включают без дополнительных критериев отбора. Полученный список мишеней представлен ниже.
Соединение BYF589 растворяют в ДМСО для получения конечного рабочего раствора с концентрацией 70 мкМ (1000х).
В тестировании используют клетки НЕК293 Freestyl (Life Technologies), которые могут отслеживаться от Главного банка клеток с небольшим количеством пассажей (low-passage Master Cell bank) до получения продукта. Клетки выращивают в HEK293F средах в высокопроизводительных (UltraYield) колбах Томсона объемом 2,5 л при разведении до 0,2 млн клеток/мл и в течение 3 дней дважды дают им возможность достигать плотности 1,5 млн клеток/мл. Затем перед трансфекцией клетки аликвотируют в стандартные колбы Корнинга с завинчивающимися крышками объемом 1 л при объеме заполнения 300 мл. Для каждой мишени в одну колбу добавляют 300 мкл BYF589, а в другую - нет. Затем клетки трансфицируют PEI плазмидным комплексом, полученным следующим образом: максипрепарат плазмиды оттаивают, смешивают, затем указанный объем добавляют в 293F среду. Исходный раствор с концентрацией 2 мг/мл линейного PEI с ММ 25000 (Polysciences #23966-2) разбавляют до концентрации 1 мг/мл с помощью 293F среды, затем указанный объем добавляют к плазмидной ДНК, перемешивают с помощью инверсии, а затем оставляют стоять на 2-10 мин. После этого равный объем смеси PEI/ДНК добавляют в каждую из двух колб (одна с соединением, другая без соединения), которые затем энергично закручивают, возвращают в шейкер и инкубируют при 37 °С со встряхиванием со скоростью 120 об/мин и 8% СО2 (те же условия, что при выращивании, описанном выше). Используемые количества отражают ранее оптимизированные условия, при которых (на 1 л) используют 400 мкг плазмиды в 1,6 мл среды плюс 3,2 мл 1 мг/мл PEI.
Отбирают небольшие образцы среды супернатантов (Filipp Gortalum) и анализируют их с помощью Octet. Соотношение между исходным выходом необработанных клеток и соотношением выхода от обработанных и необработанных клеток.
Клеточные суспензии загружают в колонку со смолой Ni-NTA в соответствии со стандартным протоколом. Используют метод очистки на основе имидазола, который хорошо известен в данной области техники. Предварительный анализ выхода белка выполняют с помощью ВСА анализа, результаты которого затем подтверждают LC90 электроферограммой.
Результаты экспериментов представлены на фиг. 18. График слева (фиг. 18А) показывает взаимосвязь между выходом белка в присутствии и в отсутствие соединения BYF589 (при 70 нМ). Каждая точка данных на графике представляет 20 протестированных мишеней. График показывает тенденцию способности соединения увеличивать выход белка, хотя и в разной степени. График справа (фиг. 18В) представляет кратность повышения выхода белка как функцию исходного выхода (без обработки соединением). Он показывает общую тенденцию, что выходы белков, уже производимых с высокими выходами (белки высоких выходов), далее не увеличиваются за счет присутствия соединения, в то время как экспрессии белков низких выходов более вероятно могут быть повышены с помощью соединения. Среди 20 протестированных белков все белки с выходом примерно <4 мг/л показывают по меньшей мере 1,5-кратное увеличение выхода при обработке соединением BYF589 в условиях испытания. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что испытанное соединение показывает общий эффект повышения выхода белка для широкого спектра белков.
- 44 036992
Таблица 6 | ||||
НАЗВАНИЕ ОБРАЗЦА | ID БЕЛКА |l | ГО КЛОНа] выход | ΙΜΓ л) |Штр11Х-КО^ | Природная I нерасшепленная ММ |
НЕК293 pRScFchAMBER-NP 000871 1-tam-177-26-177 | 411251 | 52985 | 2.9 152501069 | 44762 |
HEK293.₽RScFchAMBER-NP 0010056094111^-389-62-339 | 411263 | 78290 | 7.6 152501061 | 62057 |
ΗΕΚ283 pRScFchAMBER-NP 001165089-^-147-28-147 | 411270 | 96023 | 5,9 152591016 | 41375 |
ΗΕΚ293 pRScFchAMBER-NP 001936.lium.208-20.162 | 411274 | 69556 | 5.2 152591037 | 43347 |
ΗΕΚΪ93: pRScFchAMBER-NP 0031094ium-303-18-303 | 411272 | 75329 | 9.6 152501064 | 60073 |
HEK293.pRScFchAMBERW 005082-lium-196-22-196 | 411263 | 71090 | 1.3 152501035 | 46810 |
HEK293»RScFchAMBER4<IP 006110-tam-215.23-215 | 411255 | 69518 | 2.4 152591071 ,1.5.152551363 6.0 152501343 | «765 |
6,8 15259135В | ||||
6.8 152551341 2.0 152501344 | ||||
НЕК2ЭЗ pRSnFchAMBER$41P 080726 1-hum-116-25-116 HEK2S3 pRSnFchAMBERS-IP 002333 2-hum.711-20-6 7 8 9 10 11 12 13 14 1511 HEK253 pRSnFchAMBERS-tP 006265 l-hum-98-22-98 HEK293 pRSnFchAMBER$-HP 006'05 Шт-453-23-453 HEK293 pRSnFchAMBERTIP 0001324iu^2>27-378 HEK293 pRSnF-hWBERTIP 000445 Fum-154-1-154 HEK293 ₽RSnFchAf4BER44P~001423-5um-169-33 118 | 411264 411267 41Q906 411275 410338 410913 410903 | 59201 6349В 64998 59221 ?743Е 95263 7)637 | 1.6 1525G3C5 4,7 152591238 6.9 152501240 2,1 152501247 4.2 152501239 4.1 152501274 7,6 152501313 1,0 152501312 | 37581 103704 36176 76275 66440 43311 36962 |
Варианты осуществления изобретения
1. Способ получения терапевтических, профилактических или диагностических биологических молекул в системе клетки-хозяина, включающий контактирование системы клетки-хозяина по меньшей мере с одним химическим реагентом, выбранным из табл. 1-5.
2. Способ по варианту осуществления 1, в котором система клетки-хозяина представляет собой культуру клеток или куриное яйцо с развивающимся эмбрионом.
3. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором культура клетки выбрана из группы, включающей клетки MDCK, Vero, BHK, EB66 или CHO.
4. Способ по варианту осуществления 1, в котором химический реагент представляет собой статин или его аналог или лиганд серотонинового рецептора с конечной концентрацией от 0,0001 до 10 мкМ.
5. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором концентрация химического реагента составляет 0,05 мкМ или менее и его структура соответствует следующим формулам:
или
6. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором система клетки-хозяина инфицирована вирусом.
7. Способ по варианту осуществления 6, в котором химический реагент добавлен одновременно с инокуляцией вирусом клетки-хозяина.
8. Способ по варианту осуществления 7, в котором вирус представляет собой вирус гриппа.
9. Способ по варианту осуществления 8, в котором биологическая молекула, продуцируемая системой клетки-хозяина, выбрана из частицы вируса гриппа, расщепленного вириона вируса гриппа или гликопротеина вируса гриппа.
10. Способ по варианту осуществления 9, в котором гликопротеин вируса гриппа представляет собой гемагглютинин.
11. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором выход продуцируемой биологической молекулы повышается по меньшей мере в 2 раза по сравнению с контролем, как измерено с помощью ELISA.
12. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором аналог статина выбран из группы, включающей флувастатин, питавастатин, аторвастатин, церивастатин, ловастатин, мевастатин, правастатин или их изомеры.
13. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором химический реагент представляет собой флувастатин или питавастатин или их изомеры.
14. Способ получения терапевтического, профилактического или диагностического белка вируса гриппа в культуре клеток, включающий контактирование культуры клеток по меньшей мере с одним статиновым соединением или его аналогом в концентрации от 0,05 мкМ или меньше.
15. Способ получения терапевтического, профилактического или диагностического белка в культуре клеток, отличающийся тем, что получение проводится в присутствии по меньшей мере одного статина или его производного, отличного от симвастатина, в котором белок получают по меньшей мере с 1,5-кратным повышением по сравнению с контролем, как измерено с помощью ELISA.
- 45 036992
16. Способ по варианту осуществления 14 или 15, в котором статин представляет собой
или и их аналоги.
17. Способ по варианту осуществления 16, в котором аналог статина выбран из группы, включающей флувастатин, питавастатин, аторвастатин, церивастатин, ловастатин, мевастатин, правастатин или их изомеры.
18. Способ по варианту осуществления 17, в котором аналог статина представляет собой флувастатин или питавастатин или их изомеры.
19. Способ получения штамма вируса гриппа В в клетке-хозяине, включающий контактирование клетки-хозяина с химическим реагентом в концентрации 0,05 мкМ или менее, который повышает выход по меньшей мере 5 раз, как измерено с помощью ELISA.
20. Способ по варианту осуществления 19, в котором химический реагент представляет собой
или или и их аналоги.
21. Способ по варианту осуществления 19 или 20, в котором производят штамм вируса гриппа В, расщепленный вирион вируса гриппа В или гликопротеин вируса гриппа В.
22. Способ по варианту осуществления 21, в котором гликопротеин вируса гриппа В представляет собой гемагглютинин.
23. Способ получения терапевтических, профилактических или диагностических биологических молекул из клетки-хозяина, включающий:
(a) способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, (b) технологическую обработку полученной молекулы в конечный терапевтический, профилактический или диагностический продукт.
24. Способ получения вакцины против гриппа, в котором осуществляются следующие стадии:
a) выращивание вируса в среде, содержащей культуру клеток и по меньшей мер один химический реагент, выбранный из табл. 1;
b) обработка вируса для получения стерильной вакцины.
25. Способ получения вакцины гриппа В, в котором осуществляются следующие стадии:
a) выращивание вируса в среде, содержащей культуру клеток и по меньшей мере один химический реагент для получения по меньшей мере 1,5-кратного увеличения выхода вируса гриппа В по сравнению с контролем, как измерено с помощью ELISA;
b) обработка вируса для получения стерильной вакцины.
26. Способ по вариантам осуществления 23-25, в котором химические реагенты выбраны из табл. 1 или 3.
27. Способ получения вакцины против гриппа, в котором проводят следующие стадии:
a) выращивание вируса в культуре клеток в присутствии статинового реагента в концентрации 0,05 мкМ или меньше;
b) обработка вируса для получения стерильной вакцины.
Claims (13)
1. Способ получения терапевтических, профилактических или диагностических рекомбинантных белков и вирусных частиц в системе клетки-хозяина, включающий контактирование системы клеткихозяина с химическим реагентом формулы 2
имеющим конечную концентрацию от 0,001 до 10 мкМ,
- 46 036992 где каждый из R и R0 представляет собой независимо первичный, вторичный или третичный
С1-6алкил, С3-7циклический алкил или кольцо А
каждый R1, R2, R3, R4 и R5 представляет собой независимо водород, C1-4αлкил, C1-4алкокси, трифторметил, фтор, хлор, фенокси, бензилокси или гидрокси группы при условии, что не более чем один из R1 и R2 представляет собой трифторметил, не более чем один из R1 и R2 представляет собой фенокси, не более чем один из R1 и R2 представляет собой бензилокси, не более чем один из R1 и R2 представляет собой гидрокси, не более чем один из R3-R5 является трифторметилом, не более чем один из R3-R5 является гидроксилом;
X представляет собой -(CH2)2- или -CH=CH- (цис и/или транс);
Z представляет собой
или —сн—
I он
где Q представляет собой
или при условии, что Q может представлять собой —с—
II , только когда X представляет собой -CH=CH- и/или R6 представляет собой C1-3aлкил, R6 представляет собой водород или C1-3алкил, R7 представляет собой водород, R8 или М, где R8 представляет собой физиологически приемлемую и гидролизуемую сложноэфирную группу, а М представляет собой фармацевтически приемлемый катион.
2. Способ по п.1, в котором система клетки-хозяина представляет собой культуру клеток или куриное яйцо с развивающимся эмбрионом.
3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором культура клетки выбрана из группы, включающей клетки MDCK, Vero, BHK или CHO.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором концентрация указанного химического реагента составляет от 0,5 до 50 нМ.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором систему клетки-хозяина инфицируют вирусом.
6. Способ по п.5, в котором химический реагент добавляют одновременно с инокуляцией вирусом клетки-хозяина.
7. Способ по п.5, в котором вирус представляет собой вирус гриппа.
8. Способ по п.7, в котором указанный рекомбинантный белок или указанная вирусная частица, производимая системой клетки-хозяина, выбраны из частиц вируса гриппа, расщепленного вириона вируса гриппа или гликопротеина вируса гриппа.
9. Способ по п.8, в котором гликопротеин вируса гриппа представляет собой гемагглютинин.
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором выход продуцируемого(ой) указанного рекомбинантного белка или указанной вирусной частицы повышен по меньшей мере в 1,5 раза по сравнению с контролем, как измерено с помощью ELISA.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором указанный химический реагент представляет собой питавастатин или его изомеры.
12. Способ по п.1, в котором указанный рекомбинантный белок представляет собой белок вируса гриппа, указанная система клетки-хозяина представляет собой культуру клеток, а концентрация указанного химического реагента составляет от 0,5 до 50 нМ.
13. Способ по п.1, в котором указанная система клетки-хозяина представляет собой культуру клеток, а указанный рекомбинантный белок получают по меньшей мере с 1,5-кратным повышением по сравнению с контролем, как измерено с помощью ELISA.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14165334 | 2014-04-18 | ||
PCT/EP2015/058533 WO2015158927A1 (en) | 2014-04-18 | 2015-04-20 | Compositions and methods to increase production |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201692057A1 EA201692057A1 (ru) | 2017-02-28 |
EA036992B1 true EA036992B1 (ru) | 2021-01-25 |
Family
ID=50513756
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201692057A EA036992B1 (ru) | 2014-04-18 | 2015-04-20 | Композиции и способы повышения производства |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20170044216A1 (ru) |
EP (1) | EP3131578B1 (ru) |
JP (1) | JP6741587B2 (ru) |
KR (1) | KR102464673B1 (ru) |
CN (1) | CN106471119B (ru) |
AU (1) | AU2015247277B2 (ru) |
BR (1) | BR112016024296B1 (ru) |
CA (1) | CA2944951A1 (ru) |
EA (1) | EA036992B1 (ru) |
MX (1) | MX2016013540A (ru) |
WO (1) | WO2015158927A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20200397711A1 (en) * | 2019-06-22 | 2020-12-24 | Gregory Brian LEE | Microparticle compositions for treatment of infection or disease, methods of making the same, and methods of treating subjects with microparticle compositions |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009292801A (ja) * | 2008-06-06 | 2009-12-17 | Touken Kin | 経口用ナノ脂肪球製剤 |
WO2012136852A1 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Method for increasing the replication capacity of an influenza virus in cultured cells |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007129290A1 (en) * | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Prendergast Patrick T | Statins for the treatment of viral influenza infections |
ES2651414T3 (es) | 2012-08-31 | 2018-01-26 | The Governors Of The University Of Alberta | Métodos para la producción de células que tienen un fenotipo de hepatocitos primarios humanos y composiciones |
-
2015
- 2015-04-20 EA EA201692057A patent/EA036992B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-04-20 CN CN201580032595.1A patent/CN106471119B/zh active Active
- 2015-04-20 CA CA2944951A patent/CA2944951A1/en not_active Abandoned
- 2015-04-20 BR BR112016024296-3A patent/BR112016024296B1/pt active IP Right Grant
- 2015-04-20 MX MX2016013540A patent/MX2016013540A/es unknown
- 2015-04-20 US US15/304,650 patent/US20170044216A1/en not_active Abandoned
- 2015-04-20 WO PCT/EP2015/058533 patent/WO2015158927A1/en active Application Filing
- 2015-04-20 AU AU2015247277A patent/AU2015247277B2/en active Active
- 2015-04-20 JP JP2016561382A patent/JP6741587B2/ja active Active
- 2015-04-20 EP EP15720923.0A patent/EP3131578B1/en active Active
- 2015-04-20 KR KR1020167030961A patent/KR102464673B1/ko active IP Right Grant
-
2019
- 2019-03-11 US US16/297,895 patent/US11897918B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009292801A (ja) * | 2008-06-06 | 2009-12-17 | Touken Kin | 経口用ナノ脂肪球製剤 |
WO2012136852A1 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Method for increasing the replication capacity of an influenza virus in cultured cells |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11897918B2 (en) | 2024-02-13 |
WO2015158927A1 (en) | 2015-10-22 |
JP2017515462A (ja) | 2017-06-15 |
CN106471119A (zh) | 2017-03-01 |
AU2015247277A1 (en) | 2016-10-27 |
CA2944951A1 (en) | 2015-10-22 |
BR112016024296A2 (pt) | 2017-10-10 |
AU2015247277B2 (en) | 2020-05-14 |
KR102464673B1 (ko) | 2022-11-08 |
CN106471119B (zh) | 2020-11-10 |
EA201692057A1 (ru) | 2017-02-28 |
MX2016013540A (es) | 2017-01-23 |
JP6741587B2 (ja) | 2020-08-19 |
US20200040040A1 (en) | 2020-02-06 |
EP3131578B1 (en) | 2020-06-03 |
US20170044216A1 (en) | 2017-02-16 |
KR20160145064A (ko) | 2016-12-19 |
BR112016024296B1 (pt) | 2023-10-10 |
EP3131578A1 (en) | 2017-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Arora | Cell culture media: a review | |
EP2614140B1 (en) | Mdck-derived cell lines adapted to serum-free culture and suspension culture and method for preparing vaccine virus using the cells | |
JP2021078505A (ja) | インフルエンザウイルスワクチン及びその使用 | |
US9381238B2 (en) | Method for improving the production of influenza viruses and vaccine seeds | |
US7883844B2 (en) | Method for propagating influenza virus | |
US11897918B2 (en) | Compositions and methods to increase production | |
Li et al. | Small molecule RAF265 as an antiviral therapy acts against HSV‐1 by regulating cytoskeleton rearrangement and cellular translation machinery | |
CN113423422B (zh) | 增殖方法 | |
US20140024101A1 (en) | Method for increasing the replication capacity of an influenza virus in cultured cells | |
Li et al. | Cellular protein GLTSCR2: a valuable target for the development of broad-spectrum antivirals | |
JP7072090B2 (ja) | コロナウイルス増殖方法 | |
JP2023003130A (ja) | インフルエンザウイルスの増殖方法 | |
WO2022034882A1 (ja) | コロナウイルス増殖方法 | |
JP6283315B2 (ja) | C型肝炎ウイルス粒子形成促進剤及びc型肝炎ウイルス粒子の産生方法 | |
JP2022032289A (ja) | 増殖方法 | |
KR101785083B1 (ko) | 노로바이러스 배양용 조성물 및 배양 방법 | |
Liu et al. | p53 suppresses the inflammatory response following respiratory syncytial virus infection by inhibiting TLR2 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |