KR20160143977A - 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 링커 분자로서 다양한 종류의 알칸티올레이트를 이용해 금(Gold) 전극 표면을 개질하여 트롬빈의 효소 반응과 관련된 피브리노겐 어셈블리의 형성을 최적화하고, 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)을 전기화학적 활성 마커로 사용함으로써, 타겟 단백질(트롬빈)을 고선택성, 고특이성 및 고감도로 정확하게 검출해낼 수 있는 알칸티올레이트로 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.

Description

표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법{METHOD FOR DETECTING THROMBIN USING SURFACE-MODIFIED GOLD ELECTRODE}
본 발명은 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 링커 분자로서 다양한 종류의 알칸티올레이트를 이용해 금(Gold) 전극 표면을 개질하여 트롬빈의 효소 반응과 관련된 피브리노겐 어셈블리의 형성을 최적화하고, 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)을 전기화학적 활성 마커로 사용함으로써, 타겟 단백질(트롬빈)을 고선택성, 고특이성 및 고감도로 정확하게 검출해낼 수 있는 알칸티올레이트로 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.
트롬빈(Thrombin)은 응고 캐스케이드, 주요 혈전 프로세스 및 지혈과 관련된 필수적인 단백질 분해효소이다. 트롬빈은 피브리노겐(Fibrinogen)을 피브린(Fibrin)으로 변환시켜 혈액 응고를 촉진하고, 폐전이의 진단에 있어 종양 마커로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 혈액 내 트롬빈의 비정상적인 농도는 질병과 연관된 것으로 알려져 있으며, 이러한 트롬빈의 농도는 낮은 μM 수준에서 낮은 nM 수준까지 크게 변화한다. 따라서 높은 민감도 및 선택도로 트롬빈을 측정, 평가하는 것이 중요하다.
종래 트롬빈의 농도 측정을 위해서 트롬빈에 정량적으로 반응하는 히루딘 펩타이드를 이용한 면역측정법이 사용되기도 하였다. 형성된 트롬빈-히루딘 복합체에 대하여 ELISA 검사 또는 친화도 크로마토그래피를 통해 트롬빈의 농도를 확인할 수 있었다. 그러나 히루딘은 생체 외에서 타 단백질과 기결합된 경우 트롬빈과 결합할 수 없어 정확한 양을 측정하기 어려운 문제가 있다.
또한, 압타머를 이용하여 트롬빈 등 단백질을 검출하는 방법도 알려져 있다. 그러나 이러한 방법은 단백질과 특이적으로 결합하는 압타머를 표면에 고정해야 하고, 결합된 단백질의 효소 반응을 이용한 검출방법에 있어 압타머와의 결합으로 인하여 단백질의 활성이 줄어들게 되어 효과적이고 정확한 단백질의 검출이 쉽지 않다는 문제가 있다.
이러한 측면에서, 전기화학적으로 트롬빈을 검출하는 방법이 제안되었다. 이러한 전기화학적인 트롬빈 검출방법은 간단하고, 깨끗하며, 효율적이고, 경제적이며, 소형화가 용이하다는 점에서 큰 관심을 끌고 있다.
피브리노겐은 이황화결합으로 연결된 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있으며, 각각의 피브리노겐은 코일-코일 파트(Coiled-coil part)에 의해 두 개의 외측 D 도메인과 한 개의 중앙 E 도메인을 포함한다. 트롬빈이 이러한 피브리노겐 사슬을 절단함에 따라 피브린 중합이 개시되며, D 도메인 및 E 도메인 사이의 전하 상호작용에 의해 어셈블리가 생성되어 피브린 폴리머를 형성하게 된다.
또한, 피브린 모노머는 트롬빈의 촉매 활성에 의해 비용액상태의 표면-결합된 피브리노겐으로부터 생성되는데, 이러한 피브린 모노머는 피브린뿐만 아니라 원래의 피브리노겐과도 상호작용을 할 수 있어, 피브린 어셈블리를 생성하기 위한 유리한 기회를 제공할 수 있다.
여기서, 흥미로운 것은 표면에 흡착되는 피브린의 배열 및 양이 상이한 표면 화학에 따라 변화될 수 있다는 점이다. 이처럼 피브린 분자의 배향에 관한 연구는 표면-결합된 피브린에 근접하는 트롬빈의 반응성 및 접근성에 영향을 미칠 수 있다는 점에서 중요하다.
한편, 페로센(Ferrocene)은 두 개의 사이클로펜타다이엔 고리와 이들 고리 사이에 존재하는 한 개의 철 원자로 구성된 화합물로서, 전기화학적으로 가역적인 뚜렷한 산화환원 피크를 지닌다. 구체적으로, 페로센으로 표지된 타겟 분자는 0.5V 근방의 낮은 포텐셜에서 양극 피크를 나타낼 수 있다.
현재까지 다양한 방식으로 피브리노겐 어셈블리에 대해 연구한 몇몇 사례가 있었지만, 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)을 이용하여 트롬빈을 전기화학적으로 검출하려는 연구는 보고된 바가 거의 없다.
한국공개특허 제10-2012-0025226호
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)을 이용하여 트롬빈을 전기화학적으로 검출하되, 소정의 링커 분자를 전극 상에 도입 및 표면개질하여 트롬빈의 효소 반응과 관련된 피브리노겐 어셈블리의 흡착 및 고정을 최적화할 수 있는 새로운 형태의 트롬빈 검출방법을 제공함을 기술적 과제로 한다.
구체적으로, 본 발명자는 예의 연구를 거듭한 결과, 알칸티올레이트로 개질된 금 전극의 표면 특성이 표면결합되는 피브리노겐의 양 및 배향에 미치는 영향을 규명하였고, 이를 기초로 전극 상에 피브리노겐 어셈블리가 효율적으로 형성될 수 있는 조건을 확립함으로써, 선택성, 특이성 및 민감도 등 트롬빈의 검출 성능을 극대화할 수 있음을 확인하고 본 발명에 이르렀다.
상기한 기술적 과제를 달성하고자, 본 발명은
(a) 금(Gold) 전극을 알칸티올레이트(Alkanethiolate) 용액에 침지하여, 알칸티올레이트 링커 분자로 표면개질된 전극을 수득하는 단계;
(b) 표면개질된 전극 위에 피브리노겐 용액을 가하여, 피브리노겐을 고정화시키는 단계;
(c) 피브리노겐이 고정화된 전극 위에 트롬빈을 가하여, 피브린 모노머를 형성하는 단계;
(d) 피브린 모노머가 형성된 전극 위에 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib), 및 트롬빈을 포함하는 표적물질을 접촉시켜, 트롬빈의 효소 활성에 의한 응집반응을 유도하는 단계; 및
(e) 페로센의 전자전달에 의해 발생된 산화-환원 전류를 측정하여, 트롬빈을 전기화학적으로 검출하는 단계;
를 포함하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법을 제공한다(도 1 참조).
상기 (a) 단계는 금(Gold) 전극 상에 링커 분자로서 다양한 관능기를 말단에 갖는 알칸티올레이트(Alkanethiolate) 층을 형성하여 전극 표면을 개질하는 단계이다. 여기서, 상기 알칸티올레이트는 그 위에 고정화되는 피브리노겐 어셈블리의 양 및 배향을 조절하는 역할을 한다.
상기 알칸티올레이트(또는 알칸티올)로는 메르캅토헥산올, 메르캅토운데칸산 또는 메르캅토운데칸올을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명자는 도데칸티올(CH3-), 메르캅토헥산올(MCH), 메르캅토운데칸산(COOH-), 메르캅토운데칸올(MCU) 등 다양한 알칸티올레이트들로 금 전극의 표면개질을 시도하고, 이렇게 개질된 표면 특성이 표면-결합되는 피브리노겐의 양, 배열 및 배향에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 메르캅토헥산올, 메르캅토운데칸산 및 메르캅토운데칸올을 적용한 경우 검출 성능이 우수하였고, 그 중 메르캅토운데칸올(MCU)이 트롬빈을 검출하기에 가장 효율적인 어셈블리를 제공함을 확인하였다.
또한, 본 발명자는 제1층으로서 Fc-Fib를 알칸티올레이트로 개질된 금 전극 표면 상에 직접 고정화한 경우;와 제2층으로서 Fc-Fib를 피브린 모노머 상에 고정화한 경우;의 전류 특성을 전기화학적 방법으로 비교, 조사하였다(상세한 것은 후술 실험예 참조). 여기서, 후자는 피브리노겐/알칸티올레이트/전극 상에 트롬빈 용액을 가하여 피브린 모노머층을 형성한 다음, 피브린 모노머 표면 상에 Fc-Fib를 고정화시킴으로써 수행하였다. 그 결과, 표면개질된 전극 상의 피브린 모노머 위에 형성된 Fc-Fib로부터 측정된 산화 피크 전류값은 표면개질된 전극 상에 바로 형성된 Fc-Fib로부터 측정된 산화 피크 전류값의 약 77%에 이를 정도로 매우 높은 수치를 나타내었다.
본 단계에서는, 금(Gold) 전극을 알칸티올레이트(Alkanethiolate) 용액에 침지하기 전에, 에탄올, 아세톤 및 물로 연달아 린스한 후 피라나 용액(Piranha solution)에 침지하여 전처리하는 과정을 추가적으로 수행할 수 있다. 여기서, 피라나 용액(Piranha solution)은 황산과 과산화수소의 혼합용액으로서, 이를 이용하여 전극의 불순물을 완벽하게 제거하여 정확한 트롬빈의 정량을 측정하도록 준비할 수 있다.
본 발명의 표면개질 금 전극을 포함하는 트롬빈 검출용 키트에는 본 발명의 목적에 반하지 않는 범위 내에서 바이오 칩 등이 추가로 포함될 수 있으며, 금 기판(Substrate) 상에 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소 입자 및 모세관 등이 포함될 수도 있다.
상기 (b) 단계는 (a) 단계를 거쳐 표면개질된 금 전극 위에 피브리노겐 용액을 가하여 피브리노겐을 알칸티올레이트 링커층에 고정화시키는 단계이다. 여기서, 고정화되는 피브리노겐 어셈블리의 특성은 그 아래 위치한 알칸티올레이트의 구체적인 종류에 따라 결정된다.
상기 (c) 단계는 (b) 단계를 거쳐 피브리노겐이 고정화된 전극 위에 트롬빈을 가하여, 트롬빈의 효소 작용에 의해 피브리노겐을 피브린 모노머로 변환시키는 단계이다. 여기서, 상기 트롬빈은 용액의 형태로 적용될 수 있으며, 트롬빈이 적용된 후에 인큐베이트하는 과정이 추가로 수행될 수 있다.
상기 (d) 단계는 (c) 단계를 거쳐 형성된 피브린 모노머 표면에 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib) 및 트롬빈을 포함하는 표적물질을 혼합용액 등의 형태로 동시에 접촉 및 노출시켜, 트롬빈의 효소 활성에 의해 응집이 일어나도록 하는 단계이다. 여기서, 접촉되는 트롬빈은 응집반응을 촉매하게 되고, 그 결과 전극 상에 페로센으로 표지된 피브린(Fc-Fibrin) 중합이 형성된다.
상기 페로센은 전극 활성물질 및 전자전달 매개체로 이용되는 것으로, 단백질의 활성 감소를 유발하지 않으면서 산화-환원 전류를 생성시킬 수 있는 분자이다. 페로센은 샌드위치 화합물로서 분자식은 (C5H5)2Fe이며, 다이사이클로펜타다이엔 철(Dicyclopentadienyl iron)이라고도 불린다. 페로센은 주황색 결정으로서 벤젠 등 방향족 화합물과 같은 안정한 성질을 가지고 있어 치환 반응이 잘 일어날 수 있으며, 전극 활성물질인 동시에 전자전달 매개체로 이용되어 트롬빈 농도 리포터 또는 양전하 부여의 특징을 동시에 구현할 수 있다.
본 발명에서의 타겟 단백질인 트롬빈은 인체 내에서 피브리노겐을 피브린으로 변환시키는 효소 활동을 수행한다. 이를 통해, 혈액 내 혈소판이나 혈액세포 및 혈장을 둘러싸 혈병을 형성시키며, 이는 혈액의 응고 기작에 포함된다. 본 발명에 따라 생체 내에서 매우 조직적으로 미세한 반응에서도 반응 메커니즘이 수반되는 혈액응고 반응을 이용할 경우 트롬빈을 매우 빠르게 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 전극(키트)에 접촉되는 혼합용액 내의 표적물질은 임의로 구성될 수 있으며, 표적물질 내에 트롬빈이 포함되어 있는 것을 알고 있는 경우 이의 정량을 측정하기 위해 상기 검출용 전극(키트) 상에 접촉시킬 수 있을 것이다.
본 단계에서, 상기 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)은 트롬빈에 의한 효소적 응집 반응에 의해 생성되는 전기화학적 신호를 획득하기 위한 활성 마커이다. 구체적으로, 본 발명에서 Fc-Fib 용액은 트롬빈의 전기화학적 검출뿐만 아니라 센싱 플랫폼을 최적화하기 위한 흡착 피브리노겐 어셈블리를 조사하기 위한 용도로도 활용된다.
일 구체예에서, 상기 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)은, 0.01 내지 1M(예컨대, 0.05 내지 0.3M)의 중탄산 완충용액(Bicarbonate buffer)에 피브리노겐을 첨가하여 녹이고 pH를 9 내지 10(예컨대, 9.2 내지 9.5)으로 조절한 후, 상기 피브리노겐이 첨가된 중탄산 완충용액에, 무수 조건의 용매(예컨대, DMSO, DMF, THF, HMPA, 아세톤 등의 극성용매)에 페로센이 용융되어 있는 페로센 용액을 첨가 및 반응시켜 제조될 수 있다(하기 그림 1 참조).
[그림 1]
Figure pat00001
이때, 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)을 반응에 참여하지 않은 페로센 및 표지되지 않은 피브리노겐과 분리하기 위해, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피(Sephadex column chromatography)를 추가적으로 수행할 수 있다. 세파덱스 컬럼은 다양한 크기의 글로불린 단백질을 분리시킬 수 있으며, 본 발명에서는 페로센이 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)을 적절히 분리하기 위해 G-10, G-15, G-25, G-50, G-75, G-100 등의 다양한 겔(바람직하게는, G-25)을 이용할 수 있다. 일 구체예로, 절단 완충용액(Cleavage Buffer)를 이용하여 세파덱스 컬럼을 활성화시킨 후 혼합용액을 가하여 표지되지 않은 피브리노겐을 먼저 제거한다. 또한 컬럼을 깨끗한 튜브에 옮긴 후 절단 완충용액을 가하여 컬럼 내에 있는 페로센이 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)을 튜브로 용출시켜 분리하는 것이 가능하다.
한편, 상기 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)은 하기 그림 2와 같은 반응을 통해서도 제조될 수 있다.
[그림 2]
Figure pat00002

상기 (e) 단계는 (d) 단계를 거쳐 도입된 페로센을 전자전달 매개체로 하여 발생된 산화-환원 전류를 측정하여 타겟 단백질인 트롬빈을 전기화학적으로 최종 검출해내는 단계이다. 구체적으로, 전극 표면 상에 형성된 피브린 모노머층에 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib) 및 트롬빈이 혼합된 용액을 접촉시켜 산화-환원 전류값을 측정하여 트롬빈을 검출할 수 있으며, 이때 트롬빈의 농도는 페로센으로 표지된 피브린(Fc-Fibrin) 부분과 비례한다.
본 단계에서, 산화-환원 전류(또는 페로센의 산화 전류)의 측정은 미분펄스 전압 전류법(Differential Pulse Voltammetry; DPV) 또는 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry; CV)을 통해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 미분펄스 전압 전류법(DPV)을 사용한다. 본 발명자는 전극의 표면개질에 사용된 알칸티올레이트에 의존하는 DPV 전류 신호를 모니터링함으로써, 센서 성능을 최적화할 수 있었다. 다양한 시료 내에 각각 포함되어 있는 트롬빈의 농도가 다른 경우, 시료 각각을 피브린 모노머가 고정되어 있는 전극에 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)과 같이 접촉시키면 트롬빈에 의해 고정화되는 페로센으로 표지된 피브린(Fc-Fibrin)의 농도가 달라지게 된다. 여기서, 미분펄스 전압 전류법(DPV)을 통해 산화-환원 전위의 값을 달리하여 변화하는 전류의 세기를 측정할 때 각 전류의 세기가 다르게 측정된다.
또한, 본 단계에서는 산화-환원 전류를 측정하기 위해 전극 시스템을 이용할 수 있다. 상기 전극은 단일 전극 또는 2개 이상의 전극을 이용할 수 있으며, 예를 들어 3 전극 시스템인 경우에는 작업전극, 상대전극 및 기준전극의 시스템을 이용할 수 있다. 작업전극으로는 금, 은, 구리, 백금탄소, ITO 또는 알루미늄 전극을 사용할 수 있고, 상대전극으로는 금, 은, 구리, 백금, 알루미늄 또는 백금 와이어 전극을 사용할 수 있으며, 기준전극으로는 염화은 전극, 칼로멜 전극 또는 황산수은(I) 전극을 사용할 수 있다. 바람직한 일 구체예로는, 상기 (a) 내지 (d) 단계를 거쳐 준비된 표면개질 전극을 작업전극으로, 백금전극을 상대전극으로, Ag/AgCl 전극을 기준전극으로 사용한다.
본 발명에 따른 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법은 넓은 다이내믹 레인지(Dynamic range), 예를 들어 1 ng/ml 내지 1 μg/ml 농도의 트롬빈을 고감도로 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈의 전기화학적 검출방법은 타겟 단백질(트롬빈)을 고선택성, 고특이성 및 고감도로 정확하게 검출해낼 수 있다.
또한, Fc-Fib를 이용한 트롬빈의 전기화학적 검출 성능을 극대화할 수 있다.
아울러, 1 ng/ml 내지 1 μg/ml에 이르는 넓은 범위의 트롬빈 다이내믹 레인지(Dynamic range)에서 높은 선택성을 발휘할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 알칸티올레이트로 개질된 금 전극을 이용하여 트롬빈을 전기화학적으로 검출하는 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 2는 각각 다른 알칸티올레이트 링커에 있어서, 제1층 Fc-Fib 및 제2층 Fc-Fib에 대해 피브리노겐 어셈블리를 조사하기 위한 페로센 산화 DPVs 데이터이다(0.1M PBS). [(A) = 알칸티올레이트/금 표면 상에 형성된 제1층 Fc-Fib의 경우, (B) = 피브린 모노머/알칸티올레이트/금 표면 상에 형성된 제2층 Fc-Fib의 경우]
도 3은 Fc-Fibrin/알칸티올레이트/금 표면 상의 트롬빈(농도 범위: 1 ng/ml 내지 1 μg/ml) 검출과 관련된 DPVs의 알칸티올레이트 종류에 대한 의존성을 보여주는 그래프이다. [(A) = 링커 없음, (B) = CH3-, (C) = COOH-, (D) = MCH, (E) = MCU 및 삽입도로서 페로센의 피크 전류를 트롬빈 농도에 대해 도시한 막대 그래프, (F) = 각 링커 분자 종류별로 산화 피크 전류를 트롬빈 농도에 대해 도시한 선 그래프 및 삽입도로서 Fc-Fibrin/MCH/금 표면에 대한 선 그래프]
도 4의 (A)는 Fc-Fibrin/MCU/금 표면의 경우 다양한 단백질(ADH, mouse-IgG, 미오글로빈, 트립신 및 트롬빈)에 대한 선택성 테스트를 보여주는 DPVs 데이터이고(0.1M PBS), (B)는 (Iprotein-Iblank)/Iblank를 각 단백질에 대해 도시한 막대 그래프이다.
이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
(1) 재료 및 조건
트롬빈(소 혈장으로부터 얻은 것) 및 피브리노겐을 Sigma-Aldrich社로부터, 페로센 카르복실산 NHS 에스테르를 Biotech社로부터, 탄산나트륨-중탄산 완충용액(Sodium carbonate-bicarbonate buffer; SCB) 팩을 Pierce社로부터 입수하였다.
TBS(Tris buffered saline) 팩을 Thermo scientific로부터 구입한 후 탈이온수에 용해시켜 사용할 TBS(25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2)를 구비하였다.
TBS(pH 8.4; NaOH)에 CaCl2(2.5 mM)를 첨가하여 FCB(Fibrinogen cleavage buffer)를 제조하였다.
GE Healthcare UK Ltd.로부터 PD MiniTrap Sephadex G-25 컬럼을 입수하였다.
전기화학적 측정을 위해 CHI 617c 전기화학 분석기를 이용하였다.
금(Gold) 및 그 개질된 전극을 작업전극으로, 백금(Pt) 와이어를 상대전극으로, Ag/AgCl을 기준전극으로 사용하였다.
Fc-Fib를 Ko, HJ.; Park, SM.; Kim, KW. J. Electroanal . Chem . 2015, 742, 70.에 보고된 바에 따라 합성하였다.
(2) 알칸티올레이트로 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출
금 전극을 에탄올, 아세톤 및 물로 연달아 린스한 후, 그 표면을 피라나 용액(H2SO4:H2O2 = 3:1)에 5초 동안 침지하였다.
이어서, 전극을 에탄올에 녹인 1 mM의 알칸티올레이트(도데칸티올, 메르캅토헥산올(MCH), 메르캅토운데칸산, 메르캅토운데칸올(MCU)) 용액에 1시간 동안 침지한 후, 전극 표면을 에탄올 및 물로 세척한 다음, N2 가스로 건조시켰다.
알칸티올레이트가 고정화된 전극 표면 상에 피브리노겐 용액(4.4 mg/ml, FCB 내)을 실온에서 1시간 동안 가한 후, TBS 및 물로 세척한 다음, N2 가스로 건조시켰다.
이어서, 얻어진 표면 위에 트롬빈 용액을 37℃에서 1시간 동안 스폿팅하여 피브린 모노머 표면을 형성하였다.
이어서, 얻어진 표면 위에 Fc-Fib 및 다양한 농도(1 ng/ml 내지 1 μg/ml)의 트롬빈 용액을 37℃의 어두운 곳에서 1시간 동안 가한 후, TBS 및 물로 세척하였다.
얻어진 표면개질 금 전극들 상에, 0.1 M PBS를 사용하여 50 mVs-1의 스캔속도로 DPV를 이용한 양극 스캔(Anodic scan)을 수행하였다.
(3) 제1층 Fc - Fib 및 제2층 Fc - Fib 형성
또한, 제1층 Fc-Fib 및 제2층 Fc-Fib에 대해 피브리노겐 흡착량을 평가하기 위해 다음과 같은 과정을 수행하였다.
제1층의 경우, 알칸티올레이트로 표면개질된 전극 상에 Fc-Fib 용액을 실온에서 1시간 동안 스폿팅한 후, TBS 및 물로 세척하였다.
제2층의 경우, 알칸티올레이트로 표면개질된 전극 상에 피브리노겐 용액(4 mg/ml, FCB 내)을 드롭하여 실온에서 1시간 동안 노출시킨 후, 세척하였다. 이어서, 0.1 % BSA를 포함하는 트롬빈 용액 1 μg/ml를 가하여 피브린 모노머를 형성하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 피브린 모노머로 개질된 표면을 깨끗하게 한 후, 그 표면 상에 Fc-Fib 용액을 노출시킨 다음, TBS 및 물로 세척하였다.
상기 개질된 금 전극들 상에, 0.1 M PBS를 사용하여 50 mVs-1의 스캔속도로 DPV를 수행하였다.
실험예
(1) 제1층 Fc - Fib 양극 전류에 대한 제2층 Fc - Fib 양극 전류의 비율
제1층에서의 Fc-Fib 양극 전류에 대한 제2층에서의 Fc-Fib 양극 전류의 비율을 계산하여 Fc-Fib의 산화 전류를 측정함으로써, 알칸티올레이트층의 영향을 평가하였다.
각각 다른 알칸티올레이트 링커에 있어서, 도 2(A)는 알칸티올레이트/금 표면 상에 형성된 제1층 Fc-Fib에 대해 피브리노겐 어셈블리를 조사하기 위한 페로센 산화 DPVs를 나타낸 것이고, 도 2(B)는 피브린 모노머/알칸티올레이트/금 표면 상에 형성된 제2층 Fc-Fib에 대해 피브리노겐 어셈블리를 조사하기 위한 페로센 산화 DPVs를 나타낸 것이다(0.1 M PBS 사용).
도 2에서 보듯이, COOH- 및 OH-로 개질된 표면은 0.45 V 근방에서 뚜렷한 Fc-Fib의 피크를 나타내었다.
반면, 피브리노겐의 제1층에 있어서 CH3-로 고정화된 표면은 다른 알칸티올레이트들과 비교해 눈에 띄는 포텐셜 이동을 보였는바, 이는 CH3- 알칸티올레이트층의 밀도가 높아짐에 따라 페로센 산화의 전자전달을 위해 더욱 큰 과전압이 필요하기 때문인 것으로 여겨진다.
또한, 도 2(B)에서 보듯이, CH3-로 개질된 전극 상의 제2층에서는 주목할만한 피크가 관찰되지 않았는바, 이러한 결과는 표면 상에 불용성 피브린 모노머의 고밀도층이 형성되어 페로센의 전자전달을 방해함을 의미한다.
제1층 및 제2층에서의 피브리노겐 양을 평가하기 위한 페로센의 전기화학적 산화 피크 전류값, 및 각각의 계산된 비율을 알칸티올레이트 종류별로 정리하여 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00003
관능기가 달라짐에 따라 흡착된 피브리노겐의 양도 다른 값을 나타내었다.
(-)로 하전된 COOH- 개질 표면에서 피크 전류가 가장 높았고 가장 많은 양의 피브리노겐이 흡착되었다.
반면, CH3- 말단 링커로 처리된 소수성 표면의 경우, 알칸티올레이트 링커층 및 피브린 모노머층의 밀도가 높아 페로센 피크를 확보할 수 없었다.
OH-로 개질된 친수성 표면의 경우, 비록 제1층에서의 페로센 전류는 가장 낮았지만, 양극 전류의 비율은 가장 높았다. 이러한 결과는 OH-로 개질된 표면 상의 피브리노겐 어셈블리가 트롬빈에 의한 피브린 중합에 대해 반응성 및 접근성을 지님을 의미한다.
(2) 트롬빈 검출 성능의 알칸티올레이트 종류에 대한 의존성
도 3은 Fc-Fibrin/알칸티올레이트/금 표면 상의 트롬빈(농도 범위: 1 ng/ml 내지 1 μg/ml) 검출과 관련된 DPVs의 알칸티올레이트 종류에 대한 의존성을 보여주는 그래프이다. [(A) = 링커 없음, (B) = CH3-, (C) = COOH-, (D) = MCH, (E) = MCU 및 삽입도로서 페로센의 피크 전류를 트롬빈 농도에 대해 도시한 막대 그래프, (F) = 각 링커 분자 종류별로 산화 피크 전류를 트롬빈 농도에 대해 도시한 선 그래프 및 삽입도로서 Fc-Fibrin/MCH/금 표면에 대한 선 그래프]
도 3(B)에서 보듯이, CH3-로 개질된 표면의 경우 그 위의 빽빽한 층에 의해 페로센의 전자전달이 차단되었으며, 이는 도 2의 결과와 일치한다.
비교의 편의를 위해, 산화 피크 전류 및 트롬빈 농도 간의 관계를 링커 분자별로 도 3(F)에 나타내었다. 다양한 링커들 및 링커가 없는 경우 통틀어, MCU로 개질된 표면만이 피크 전류 및 트롬빈 농도(다이내믹 레인지: 1 ng/ml 내지 1 μg/ml) 간에 우수한 선형관계를 나타내었다.
또한, 피크 전류 vs. 트롬빈 농도의 막대 그래프를 도 3(E)에 나타내었는바, 상관계수(R2) 값이 1에 가까워 이러한 방법이 우수한 선형성을 구현함을 알 수 있다. 즉 도 2에서 살펴본 바와 같이, OH-말단 표면이 효율적인 피브린 어셈블리를 형성함이 확인되었다.
OH-말단 표면 상에서 피브리노겐은 "사이드-온(Side-on)" 배향을 갖는 경향이 있다. 이러한 배향은 피브리노겐이 트롬빈 및 가용성 피브리노겐과 유리하게 상호작용을 할 수 있도록 하는데, 이는 정돈된 상태로 쌓여져 있는 피브리노겐의 세 개 도메인이 용액에 노출되기 때문이다. 즉 MCH와 비교하여 MCU로 기능화된 표면이 적절한 크기 및 관능기를 지닌다.
이러한 결과로부터, 트롬빈 검출의 성능은 알칸티올레이트층에 매우 크게 의존함을 확인할 수 있었다.
(3) 다양한 단백질에 대한 선택성 테스트
Fc-Fib의 촉매 중합에 대한 단백질의 특이성을 조사하기 위해, MCU로 개질된 표면을 대상으로 테스트를 실시하였다.
알코올 탈수소효소(ADH), mouse-IgG, 미오글로빈, 트립신 및 트롬빈을 포함하는 다양한 단백질을 같은 농도로 준비하였다.
도 4(A)는 Fc-Fib/MCU/금 표면의 경우 다양한 단백질(ADH, mouse-IgG, 미오글로빈, 트립신 및 트롬빈)에 대한 페로센의 전기화학적 반응을 보여주는 DPVs 데이터이다.
도 4(B)에서 보듯이, 트롬빈의 존재하에서만 페로센 전류가 크게 변하였으며, 다른 경우는 매우 작은 전기화학적 반응의 변화를 나타내었다.
이러한 결과로부터, 오로지 트롬빈만이 Fc-Fib의 변화를 촉매하며, 본 발명에 따른 방법이 트롬빈 검출에 있어 매우 우수한 선택성을 보임을 확인할 수 있다.
(4) 결과 검토
본 발명자는 알칸티올레이트층이 Fc-Fib를 이용한 트롬빈의 전기화학적 검출 성능에 미치는 영향을 입증하였다.
먼저, 전기화학적 방법으로 피브리노겐 배열을 조사한 결과, 피브리노겐 배열은 알칸티올레이트의 종류에 의존함을 확인하였다.
구체적으로, MCU가 고정화된 표면이 트롬빈 검출에 있어 가장 효율적인 어셈블리를 제공하였으며, 이러한 방법은 피브리노겐에서 피브린 폴리머로의 특이적 변환에 기인하여 트롬빈에 대해 매우 높은 선택성을 보였다.
아울러, 높은 민감도를 보이는 트롬빈의 다이내믹 레인지는 1 ng/ml 내지 1 μg/ml였다.
이를 통해, 본 발명은 실제 실행가능한 트롬빈 검출 기술을 제공함과 더불어, 흡착-피브리노겐 어셈블리의 전기화학적 조사와 관련된 유용한 단초를 제시할 수 있을 것으로 예상된다.

Claims (10)

  1. (a) 금(Gold) 전극을 알칸티올레이트(Alkanethiolate) 용액에 침지하여, 알칸티올레이트 링커 분자로 표면개질된 전극을 수득하는 단계;
    (b) 표면개질된 전극 위에 피브리노겐 용액을 가하여, 피브리노겐을 고정화시키는 단계;
    (c) 피브리노겐이 고정화된 전극 위에 트롬빈을 가하여, 피브린 모노머를 형성하는 단계;
    (d) 피브린 모노머가 형성된 전극 위에 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib), 및 트롬빈을 포함하는 표적물질을 접촉시켜, 트롬빈의 효소 활성에 의한 응집반응을 유도하는 단계; 및
    (e) 페로센의 전자전달에 의해 발생된 산화-환원 전류를 측정하여, 트롬빈을 전기화학적으로 검출하는 단계;
    를 포함하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 알칸티올레이트는 메르캅토헥산올, 메르캅토운데칸산 또는 메르캅토운데칸올인 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 알칸티올레이트는 메르캅토운데칸올인 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  4. 제3항에 있어서,
    표면개질된 전극 상의 피브린 모노머 위에 형성된 Fc-Fib로부터 측정된 산화 피크 전류값은, 표면개질된 전극 상에 바로 형성된 Fc-Fib로부터 측정된 산화 피크 전류값의 77%인 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (d) 단계의 페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)은,
    0.01 내지 1M의 중탄산 완충용액(Bicarbonate buffer)에 피브리노겐을 첨가하여 녹이고 pH를 9 내지 10으로 조절한 후,
    상기 피브리노겐이 첨가된 중탄산 완충용액에, 무수 조건의 용매에 페로센이 용융되어 있는 페로센 용액을 첨가 및 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  6. 제5항에 있어서,
    페로센으로 표지된 피브리노겐(Fc-Fib)을 반응에 참여하지 않은 페로센 및 표지되지 않은 피브리노겐과 분리하기 위해, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피(Sephadex column chromatography)를 추가적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (e) 단계는 미분펄스 전압 전류법(Differential Pulse Voltammetry; DPV)을 이용하여 산화-환원 전류를 측정하는 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (a) 내지 (d) 단계를 거쳐 준비된 표면개질 전극을 작업전극으로, 백금전극을 상대전극으로, Ag/AgCl 전극을 기준전극으로 사용하는 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 금(Gold) 전극을 알칸티올레이트(Alkanethiolate) 용액에 침지하기 전에, 에탄올, 아세톤 및 물로 연달아 린스한 후 피라나 용액(Piranha solution)에 침지하여 전처리하는 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 ng/ml 내지 1 μg/ml 농도의 트롬빈을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는, 표면개질된 금 전극을 이용한 트롬빈 검출방법.
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