KR20160142390A - 면역평가 및 이식거부의 예측을 위한 단백질 바이오마커 - Google Patents

면역평가 및 이식거부의 예측을 위한 단백질 바이오마커 Download PDF

Info

Publication number
KR20160142390A
KR20160142390A KR1020167031144A KR20167031144A KR20160142390A KR 20160142390 A KR20160142390 A KR 20160142390A KR 1020167031144 A KR1020167031144 A KR 1020167031144A KR 20167031144 A KR20167031144 A KR 20167031144A KR 20160142390 A KR20160142390 A KR 20160142390A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
ser
glu
val
ala
Prior art date
Application number
KR1020167031144A
Other languages
English (en)
Inventor
일레인 에프. 리드
한스 앨빈 그리티쉬
제프리 론 빌
Original Assignee
더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 filed Critical 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Publication of KR20160142390A publication Critical patent/KR20160142390A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/775—Apolipopeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 본 명세서에서 동정된 단백질 마커에 대해 대상체로부터의 혈장, 혈청 또는 혈액의 환자 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 대상체에서 실질기관 이식편 거부에 대한 선별 및 검출 방법을 제공한다. 대조군 샘플에 비해 상기 환자 샘플 중에 존재하는 마커의 상승 또는 감소된 양은 거부를 나타내며, 생검 또는 변형된 치료가 필요한 대상체를 동정한다. 상기 방법은 더 비싸고, 위험하며 침습적인 생검 절차를 겪는 일 없이 이식 거부의 위험에 있는 환자를 선별하기 위해 사용될 수 있다.

Description

면역평가 및 이식거부의 예측을 위한 단백질 바이오마커{PROTEIN BIOMARKERS FOR IMMUNE ASSESSMENT AND PREDICTION OF TRANSPLANT REJECTION}
본 출원은 2014년 4월 9일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/977,567호의 유익을 주장하며, 이 기초출원의 전문은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 신장 동종이식편 거부반응을 포함하는 이식 거부의 검출, 예측 및 모니터링에 관한 것이다. 본 발명은 더 구체적으로는 동종이식편 거부반응의 조기 검출을 위해 혈청 중에서 검출될 수 있는 단백질 마커의 용도에 관한 것이다.
손상된 조직을 동일한 종의 살아있는 또는 사망한 개체로부터의 건강한 조직으로 대체하기 위한 이식은 동종이식으로 불린다. 다른 개체로부터의 조직 및 세포는 보통 포유류 면역계에 의해 이물질로서 인식된다. 이는 외래 조직을 거부하는 숙주 방어 반응을 자극한다. 면역계는 때때로 분자 구조의 매우 작은 차이를 인식하고 동종 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 일부 세포 유형은 혈액 세포와 같이 개체들 간에 매우 유사하다. 혈액형이 적합하다면 면역 반응 없이 적혈구 및 혈장과 같은 혈액 생성물을 투여할 수 있다. 적혈구를 제외한 사실상 모든 포유류 세포는 그들의 세포 표면 상에서 주조직적합성 분자를 발현시킨다. 이들 분자는 면역계가 자신을 외래 세포와 구별할 수 있는 중요한 메커니즘이다.
기관 이식은 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 장의 마지막 병기의 다수 형태에 대한 최종적 요법이다. 랑게르한스섬 및 신경 세포와 같은 전문화된 세포의 이식뿐만 아니라 사지 또는 얼굴과 같은 복잡한 조직 이식은 점점 더 흔해지고 있다. 그러나, 이들 절차의 장기간의 성공은 면역 반응에 의해 제한된다. 공여자가 일란성 쌍생아가 아니라면, 대부분의 수용자는 면역억제 의약을 취해야 한다. 현재의 면역억제 요법은 모든 경우에 거부를 예방할 수 없으며, 다수의 상당한 부작용을 가진다. 이들 약물은 생명을 위협하는 감염, 심혈관계 질환, 당뇨병 및 암을 야기할 수 있다.
이식된 기관 및 조직의 기능을 모니터링하기 위해 현재 다수의 방법이 사용된다: 신장에 대해 혈청 크레아티닌, 간에 대해 혈청 트랜스아미나제, 심장에 대한 박출분율, 폐에 대한 산소 포화 및 췌장 이식에 대한 혈청 글루코스. 불행하게도, 이들 시험은 거부에 대해 불량한 민감성 또는 특이성을 가진다. 다수의 경우에, 기관 거부에 대한 최종적 시험은 침습적이며 값비싼 생검이다.
거부의 조직학적 패턴은 각각의 기관에 대해 상이하며, 조직 손상의 별도의 패턴은 "세포성" 대 "체액성" 거부에 대해 동정될 수 있다. 이 차이는 "세포성" 거부에 대한 최고의 치료가 T 림프구의 추가적인 증식을 방지하도록 표적화되는 면역억제 의약의 투여인 반면, "체액성" 거부는 B 림프구를 억제하고, 이식편을 이물질로서 인식하는 항체의 혈장을 없애는 의약에 의해 치료되기 때문에 중요하다. 일반적으로, 경증의 세포성 거부는 빈번하게 반전될 수 있고, 장기간 손상을 야기하지 않을 수도 있다. 체액성 거부는 반전이 더 어려우며, 불량한 이식편 기능을 야기할 더 높은 위험을 가진다. 이식 거부의 다수의 경우에, 세포성과 체액성 면역 반응이 둘 다 조합된 성분이 있다. 이식 거부의 분류를 위한 표준은 동종이식 생검이다.
현재의 면억 억제 전략에 의한 1년 동종이식 기능에서의 상당한 개선에도 불구하고, 이식편 기능의 장기간 유지는 덜 진보되었다. 면역학적 인자와 비면역학적 인자 둘 다, 예컨대 약물 독성 또는 고혈압은 이 질환에 기여하는 것으로 가정된다. 만성 이식 기능장애는 이식편 생검에 대한 특징적인 조직학적 특징을 수반하는 기능의 점진적 악화에 의한 실질기관 이식(solid organ transplant)에서의 현상이다. 신장 이식에서, 이는 만성 거부, 만성 동종이식 신장병(CAN), 또는 관형 위축을 지니는 간질성 섬유증(IFTA)으로서 알려져 있다. 심장 이식에서, 가속화된 죽상동맥경화증 및 간 이식에서 소엽간담관이 있다. 만성 이식 손상은 이식물의 내부 혈관 섬유증을 특징으로 하며, 무증상 AMR과 관련될 수 있다. 초기 단계에 이 문제를 검출하는 것은 프로토콜 생검에 의할때 조차 어렵다.
신장 동종이식편 거부반응의 현재의 진단 방법은 민감하지도 특이적이지도 않다. 바늘 생검은 침습적이며 환자 이환율과 관련된다. 따라서, 거부를 예측하고 진단하기 위한 비침습적 시험을 개발하는 것이 바람직하다.
본 발명은 단백질 마커 세트 및 환자의 면역 상태의 평가를 위한 그리고 기관 이식의 거부를 예측하기 위한 이들 마커의 이용방법을 제공한다. 상기 마커는 보체 C4 아나필라톡신(C4A), 아포지방단백질 A1(ApoA1), α-1 항-키모트립신 C 말단 단편(AACT), C1 프로테아제 저해제(C-inh), 혈청 아밀로이드 A(SAA), C-반응성 단백질(CRP), 아포지방단백질 E(ApoE), 알파-1-항트립신(A1AT), 번역후 변형된 ApoA1, 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4(ITIH4) 및 알파-2-마크로글로불린(A2M)뿐만 아니라 이들 단백질의 단편을 포함한다(표 1 및 표 4, 및 서열번호 1 내지 18 참조).
본 발명은 환자에서 높은 정도의 민감성 및 특이성에 의해 달성될 수 있는 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성(susceptibility)을 검출하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 90% 민감성 및 적어도 90% 특이성에 의해 거부를 검출한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 환자로부터 얻은 샘플 중의 보체 C4 아나필라톡신(C4A)의 5킬로달톤(kDa) 단편의 양을 측정하는 단계; (b) 환자 샘플 중의 C4A의 5kDa 단편의 양을 대조군 샘플 중의 양과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 환자 샘플 중의 C4A의 5kDa 단편의 증가를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플을 보체 C4 아나필라톡신(C4A)의 5킬로달톤(kDa) 단편에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 시약과 환자 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계; (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플에 대한 시약의 특이적 결합의 양과 비교하는 단계; 및 (d) (c)에서의 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 환자 샘플에서 C4A의 5kDa 단편에 대한 특이적 결합의 증가를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 접촉시키는 단계는 환자 샘플을 아포지방단백질 A1(ApoA1) 및/또는 α-1 항-키모트립신 C 말단 단편(AACT)에 결합하는 시약과 접촉시키는 단계, 및 상기 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 환자 샘플 중의 ApoAI 및/또는 AACT 양의 감소를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, (b) 및 (c)의 접촉시키는 단계 및 비교하는 단계는 환자 샘플을 ApoA1 및 AACT에 결합하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은: (a) 환자로부터 얻은 샘플을 표 1에 열거되는 2 이상의 마커를 포함하는 바이오마커 세트에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 시약과 환자 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계; (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플에 대한 특이적 결합의 양과 비교하는 단계; 및 (d) (c)에서의 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 환자 샘플 중의 바이오마커에 대한 특이적 결합의 상당한 증가 또는 감소를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (a) 내지 (c)는 표 1에 열거된 마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 19개까지에 대해 수행된다. 일 실시형태에서, 마커의 세트는 8개 이하의 표 1에 열거된 마커로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 마커의 세트는 6개 이하의 표 1에 열거된 마커로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 마커의 세트는 4개 이하의 표 1에 열거된 마커로 이루어진다.
다음의 마커(C1 프로테아제 저해제(C1-inh), 혈청 아밀로이드 A(SAA), C-반응성 단백질(CRP), 아포지방단백질 E(ApoE), 알파-1-항트립신(A1AT))에 대해, 이식편 거부에 대한 감수성은 마커에 대한 시약의 특이적 결합이 대조군에 비해 환자 샘플 중에서 증가될 때 검출되고/되거나 다음의 마커(AACT, ApoA1, 번역후 변형된 ApoA1, 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4(ITIH4), 알파-2-마크로글로불린(A2M))에 대한 시약의 특이적 결합은 대조군에 비해 감소된다. 전형적인 실시형태에서, 차이는 대조군에 비해 적어도 10%의 감소 또는 증가이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플을 보체 C4 아나필라톡신(C4A)의 5191 달톤 단편, α-1 항-키모트립신 C 말단 단편(AACT), 및 Apo A1로 이루어지고; 선택적으로 추가로 보체 C1 저해제, 및/또는 표 1에 열거된 마커로 이루어진 마커의 세트에 특이적으로 결합된 시약과 접촉시키는 단계; (b) 시약과 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계; (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 (d) (c)에서의 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 C4A의 5191 달톤 단편의 증가 AACT 및/또는 ApoAI의 감소를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 측정하는 단계는 면역분석법을 포함한다. 다른 실시형태에서, 측정하는 단계는 질량분석법을 포함한다. 시약의 대표적인 예는 항체, 핵산 프로브, 또는 합성 프로브를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 프로브 또는 항체는 선택적으로 검출가능한 마커로 표지될 수 있다.
실질기관 이식편의 예는 신장, 간, 심장, 췌장, 폐, 장 및 흉선을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 실질기관 이식편 거부는 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응이다. 실질기관 이식편 거부의 다른 유형은 만성 거부, 예컨대 만성 동종이식 신장병, 또는 관형 위축을 지니는 간질성 섬유증을 포함한다.
본 발명은 추가적으로 C4A의 5kDa 단편, ApoA1, AACT, 및, 선택적으로, 하나 이상의 추가적인 표 1에 열거된 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 일 실시형태에서, 키트는 C4A(또는 이의 5kDa 단편) 및 ApoA1(또는 아미노산 148 내지 183에서 이의 단편) 및/또는 AACT(또는 아미노산 385 내지 422에서 이의 단편)에 결합하는 시약을 포함하고, 일 실시형태에서, 키트는 AACT 및 ApoA1의 5191Da 단편에 특이적으로 결합하는 시약을 포함한다. 일 실시형태에서, 키트는 항체가 고정되는 고체 지지체를 추가로 포함한다. 고체 지지체의 예는 마이크로타이터 플레이트, 비드, 막 또는 당업자에게 공지된 다른 지지체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 항체는 고체 지지체에 고정된 항원에 대한 결합을 통해 고정된다. 일 실시형태에서, 항체는 루미넥스(luminex)와 같은 비드 또는 입자에 대한 결합을 통해 고정된다. 일 실시형태에서, 키트는 색원체 기질을 추가로 포함한다.
추가적으로 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플을 보체 C4 아나필라톡신(C4A)에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 시약과 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계; (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함하되; 대조군에 비해 (b)에서의 결합의 더 큰 양은 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 나타낸다.
본 발명의 다른 예시적인 실시형태는 혈장 또는 혈청 또는 다른 체액 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 및/또는 표 1의 다른 16종의 단백질 중 하나를 검출함으로써 실질기관 동종이식편 거부반응과 관련된 펩타이드 및/또는 단백질 프로파일을 동정하는 질량분석법이며, 상기 분석은 (a) 혈장, 혈청 또는 다른 체액에서 질량분석법에 의해 특이적 펩타이드의 구체적 양을 측정하는 단계; (b) (a)에서의 단백질/펩타이드의 구체적 양을 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함하되; 대조군에 비한 특이적 펩타이드의 더 큰 또는 더 적은 양은 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 나타낸다.
본 발명의 다른 예시적 실시형태는 환자에서 혈장 또는 혈청에서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제를 검출함으로써 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일에 대해 선별하기 위한 ELISA 키트이며, 상기 키트는 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제에 대해 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트; (b) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 다클론성 또는 단클론성 항체-알칼린 포스파타제 컨쥬게이트; (c) p-나이트로페닐-포스페이트; 및 (d) 항원 표준으로서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제를 포함한다.
또한 환자에서 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응에 대한 감수성을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제에 대한 다클론성 또는 단클론성 항체를 제공하는 단계; (b) 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 제공하는 단계; (c) 혈청 또는 혈장을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하는 단계; (d) 마이크로타이터 플레이트에 대해 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 알칼린 포스파타제-항체 컨쥬게이트를 제공하는 단계; (e) p-나이트로페닐-포스페이트를 마이크로타이터 플레이트에 제공하는 단계; 및 (f) 단계 (a) 내지 (e)로서 생기는 반응을 표준 곡선과 비교하여 정상 개체에 비교한 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 예시적 실시형태는 환자에서 혈장 또는 혈청 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제를 검출함으로써 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일에 대해 선별하기 위한 ELISA 키트이며, 상기 키트는 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제에 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트; (b) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 다클론성 또는 단클론성 항체-알칼린 포스파타제; (c) p-나이트로페닐-포스페이트; 및 (d) 항원 표준으로서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제를 포함한다.
본 발명의 다른 예시적 실시형태는 환자에서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 및/또는 표 1에 기재된 단백질을 검출함으로써 실질기관 동종이식편 거부반응과 관련된 분자 프로파일에 대해 혈장, 혈청 및/또는 생물학적 유체 중에서 선별하기 위한 루미넥스 키트이며, 키트는 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 및/또는 표 1에 열거된 단백질에 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체로 코팅된 마이크로비드 어레이; (b) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 및/또는 표 1에 열거된 단백질과 반응성인 다클론성 또는 단클론성 항체 형광 염료 컨쥬게이트; (c) 및 항원 표준으로서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 또는 표 1의 다른 단백질을 포함한다.
본 발명의 실시형태는 AACT 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 SAA 및/또는 CRP 및/또는 A2M 및/또는 ApoE 및/또는 ITIH4 및/또는 A1AT 및/또는 C-inh 및/또는 이들 폴리펩타이드의 단편의 샘플 중의 검출 및/또는 정량화를 위한 분석 및 방법을 제공한다. 본 발명의 전형적인 실시형태는 포유류, 특히 인간의 혈액, 혈장, 혈청 또는 다른 체액과 같은 생물학적 유체 샘플과 함께 사용하기에 적합한 유형의 ELISA-유형 분석을 이용한다. 방법론적 실시형태는 생물학적 유체 샘플 중의 AACT 및/또는 C4A 및/또는 Apo A1폴리펩타이드, 이들 마커의 단편, 및/또는 본 명세서에 기재된 마커의 조합물의 양에 대한 시험을 포함한다. 특정 실시형태는, 예를 들어, 환자에서 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일을 동정하기 위해 α-1 항키모트립신, Apo A1, 보체 C1 저해제 및 C4A의 5191Da 펩타이드와 함께 시험한다. 특정 실시형태는 1(예를 들어, 5191Da C4A 펩타이드) 또는 2(예를 들어, C4A 펩타이드 + α-1 항키모트립신 또는 Apo A1) 또는 3(예를 들어, α-1 항키모트립신, Apo A1 및 5191Da C4A 펩타이드) 또는 모두 4종의 이들 바이오마커를 시험한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 5191Da C4A 펩타이드는 정제되고, 이어서, 이 정제된 펩타이드는 ELISA 시험 등에서 사용될 수 있는 5191Da 펩타이드에 특이적인 다클론성 항체를 생성하기 위해 토끼와 같은 동물에게 주사된다. 유사하게, 단백질에 대한 단클론성 항체 제제는 정제된 5191Da 펩타이드를 마우스에게 주사함으로써, 비장 및 림프절 세포를 채취함으로써, 이들 세포를 마우스 골수종 세포와 융합함으로써 그리고 얻어진 하이브리도마(hybridoma) 세포를 이용하여 단클론성 항체를 생성함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 하나의 예시적 실시형태는 환자에서 하기 단계들을 포함하는 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일에 대해 선별하기 위해 혈장 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제를 검출하는 방법이다: (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제에 대해 다클론성 또는 단클론성 항체를 제공하는 단계; (b) 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 제공하는 단계; (c) 혈청 또는 혈장을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하는 단계; (d) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 알칼린 포스파타제-항체 컨쥬게이트를 마이크로타이터 플레이트에 제공하는 단계; (e) p-나이트로페닐-포스페이트를 마이크로타이터 플레이트에 제공하는 단계; 및 (f) 단계 (a) 내지 (e)의 결과로서 생기는 반응을 표준 곡선과 비교하여 정상 개체에 비교한 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제 수준을 결정하는 단계.
본 발명의 다른 예시적 실시형태는 환자에서 혈장 또는 혈청 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제를 검출함으로써 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일에 대해 선별하기 위한 ELISA 키트이며, 상기 키트는 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제에 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트; (b) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 다클론성 또는 단클론성 항체-알칼린 포스파타제 컨쥬게이트; (c) p-나이트로페닐-포스페이트; 및 (d) 항원 표준으로서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제를 포함한다.
도 1a 내지 도 1c: 신장 동종이식편 거부반응을 검출하는 후보 혈장 단백질을 도시한 도면. (1a) 거부 대 거부 후 샘플을 검출하기 위한 바이오마커 후보를 평가하는 회귀 및 분석 트리(Classification and Regression Tree: CART). (1b) 거부(그룹 A, n=17), 거부 후(그룹 B, n= 17), 및 비거부(그룹 C, n=48) 혈장 샘플 중의 4467Da 및 5191Da 바이오마커 후보의 조절된 강도의 박스 플롯. (1c) 생검-증명된 비거부 환자(n=19)에 비교한 거부 및 거부 후 당시에 거부 환자(n=16)에 대한 생검 시 측정된 혈청 크레아티닌 수준의 박스 플롯.
도 2a 내지 도 2d: α-1 항키모트립신 및 아포지방단백질 A1(Apo A1)의 C-말단 단편의 동정. (2a) 4467Da 바이오마커 후보 펩타이드(SELDI-TOF MS에 의해 측정한 바와 같은 평균 질량)를 함유하는 C8 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)-정제 분획의 고해상도 MALDI-TOF 질량 스펙트럼. 일동위원소(monoisotopic) 질량 차이는 SALV(S, 세린; A, 알라닌; L, 류신; 및 V, 말린)의 서열 사다리를 나타낸다. (2b) α-1-항키모트립신에 대한 단클론성 항체를 이용한 혈장 샘플의 면역침전. 평균 질량(Da)을 지니는 넘버링된 펩타이드를 제공한다. (2c) 인간 Apo A1에 대해 단클론성 항체에 의한 혈장 샘플의 면역침전. (2d) 거부(그룹 A, n=17), 거부 후(그룹 B, n=17) 및 비거부(그룹 C, n=48) 혈장 샘플에서 Apo A1의 SELDI 조절 최대 강도의 박스 플롯.
도 3a 내지 도 3d: 급성 세포성 거부와 관련을 위한 효소-결합 면역흡착 검정법(ELISA)에 의한 아포지방단백질 A1(Apo A1)의 확인. (3a) 본래의 코호트의 서브세트의 혈장 샘플의 ELISA 결과의 박스 플롯. (3b) 제2 독립적 코호트의 혈장 샘플의 ELISA 결과의 박스 플롯. (3c) 신장 생검 전 -제3일 내지 제0일 내에 수집한 샘플을 갖는 수용자에서 Apo A1 수준의 박스 플롯. 25명의 거부 샘플과 22명의 비거부 샘플을 비교하였다. 비거부에서의 평균 Apo A1 수준은 0.22 SD±0.06이고, 거부에서는 0.13 SD±0.04였다. Apo A1 수준은 생검-증명된 비거부인 수용자에 비해 거부 시 상당히 낮았다(P 값 <0.0001). (3d) 모두 3회 기간(거부 전, 거부 및 거부 후)으로부터 혈장 샘플을 갖는 14명의 환자에 대한 개개 Apo A1 결과를 나타내는 선 그래프. (e) 본래의 코호트와 차단점 0.167㎎/㎗ 및 76% 민감성 및 86% 특이성을 나타내는 조합된 제2 코호트 둘 다로부터의 거부 샘플과 비거부 샘플을 비교하는 ROC 분석.
도 4: 신장 동종이식편 거부반응으로 진단된 환자는 비-거부(평균 0.239+/-0.16)(P<0.0024)에 비해 상당히 더 낮은 Apo A1 수준(평균 0.156+/- 0.77)을 가진다는 것을 나타내는, 생검 증명된 비-거부자 대 생검 증명된 거부자 사이의 ApoA1 비교.
도 5: 생검 증명된 비-거부자 대 생검 증명된 거부자 사이의 ApoA1 비교의 민감성 및 특이성을 도시한 도면. 차단점 0.195를 이용하여, Apo A1 수준은 민감성 75% 및 특이성 82%인 시간에 거부가 79%인 환자를 정확하게 분류하였다.
도 6: 항체-기반 ELISA를 이용하는 알파-2-마크로글로불린의 입증.
본 명세서에 기재된 본 발명은 인간 혈장 중에 존재하는 특이적 단백질 마커가 이식 거부를 검출하고, 예측하고, 모니터링하는데 사용될 수 있다는 발견에 기반한다. 이들 단백질 수준의 변화 평가는 거부 위험에 있는 환자를 동정한다.
정의
본 출원에서 사용되는 모든 과학적 및 기술적 용어는 달리 구체화되지 않는 한 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미를 가진다. 본 출원에서 사용되는 바와 같은 다음의 단어 또는 어구는 구체화된 의미를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 대상체로부터의 "샘플"은 혈장, 혈액, 혈청, 타액, 소변 또는 다른 체액을 함유하는 대상체로부터 얻은 표본을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비인간 영장류, 말, 양, 개, 소, 돼지, 닭, 양서류, 파충류, 설치류 등을 포함한다. 전형적인 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "대조군" 샘플은 각각의 마커의 정상적 측정 또는 비교를 위해 사용될 마커의 기준 양을 나타내는 샘플을 의미한다. 전형적으로, 기준은 동일한 대상체 또는 환자로부터 취한 측정일 것이다. 샘플은 대응하는 마커의 공지된 정상 측정을 기준으로 시험을 위해 사용한 실제 샘플 또는 기준 수준 또는 범위일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "보체 C4 아나필라톡신(C4A)의 5킬로달톤(kDa) 단편"은 분자량이 대략 5kDa인 C4A의 단편을 지칭하며, 서열번호 3에 대응하는 5,051Da C4A 단편, 및 서열번호 2에 대응하는 5,191Da C4A 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, C4A의 5kDa 단편은 5,191Da 단편이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 단수의 형태는 달리 명확하게 표시되지 않는 한, 적어도 하나를 의미한다.
마커 및 방법
본 발명은 단백질 마커 세트 및 환자의 면역 상태의 평가를 위해 그리고 기관 이식의 거부를 예측하기 위해 이들 마커를 이용하는 방법을 제공한다. 상기 마커는 보체 C4 아나필라톡신(C4A), 아포지방단백질 A1(ApoA1), α-1 항-키모트립신 C 말단 단편(AACT), C1 프로테아제 저해제(C-inh), 혈청 아밀로이드 A(SAA), C-반응성 단백질(CRP), 아포지방단백질 E(ApoE), 알파-1-항트립신(A1AT), 번역후 변형된 ApoA1, 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4(ITIH4) 및 알파-2-마크로글로불린(A2M)뿐만 아니라 이들 단백질의 단편을 포함한다(표 1 및 표 4, 및 서열번호 1 내지 18 참조). 환자의 혈장 또는 다른 체액에서 이들 마커 수준의 변화는 동종이식편 거부반응을 예측한다.
Figure pct00001
본 발명은 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 민감성 및 특이성이 80% 초과이고, 전형적인 실시형태에서, 민감성 및 적어도 90% 특이성이 적어도 90%인 거부에 대한 감수성을 검출한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 보체 C4 아나필라톡신(C4A) 5킬로달톤(kDa) 단편의 양을 측정하는 단계; (b) 환자 샘플 중의 C4A의 5kDa 단편의 양을 대조군 샘플 중의 양과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 환자 샘플 중의 C4A의 5kDa 단편의 증가를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플을 보체 C4 아나필라톡신(C4A)의 5킬로달톤(kDa) 단편과 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 시약과 환자 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계; (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플 중의 시약의 특이적 결합의 양과 비교하는 단계; 및 (d) (c
대조군 샘플에 비해 환자 샘플 중의 C4A의 5kDa 단편에 대한 특이적 결합의 증가를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 접촉시키는 단계는 환자 샘플을 아포지방단백질 A1(ApoA1) 및/또는 α-1 항-키모트립신 C 말단 단편(AACT)과 결합하는 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 검출하는 단계는 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 환자 샘플에서 ApoAI 및/또는 AACT의 양의 감소를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 접촉시키는 단계 및 비교하는 단계는 환자 샘플을 ApoA1 및 AACT와 결합하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플을 표 1에 열거되는 2 이상의 마커를 포함하는 바이오마커의 세트에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 시약과 환자 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계; (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플 중의 시약의 특이적 결합의 양과 비교하는 단계; 및 (d) (c)에서의 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 환자 샘플 중의 바이오마커에 대한 특이적 결합의 상당한 증가 또는 감소를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (a) 내지 (c)는 표 1에 열거된 마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 19개까지에 대해 수행된다. 일 실시형태에서, 마커의 세트는 8개 이하의 표 1에 열거된 마커로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 마커의 세트는 6개 이하의 표 1에 열거된 마커로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 마커의 세트는 4개 이하의 표 1에 열거된 마커로 이루어진다.
다음의 마커(C4A, C1 프로테아제 저해제(C1-inh), 혈청 아밀로이드 A(SAA), C-반응성 단백질(CRP), 아포지방단백질 E(ApoE), 알파-1-항트립신(A1AT), 이들의 단편을 포함함)에 대해, 이식편 거부에 대한 감수성은 마커에 대한 시약의 특이적 결합이 대조군에 비해 증가될 때 검출되고/되거나 다음의 마커(AACT, ApoA1, 번역후 변형된 ApoA1, 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4(ITIH4), 알파-2-마크로글로불린(A2M), 이들의 단편을 포함함)에 대한 시약의 특이적 결합은 대조군에 비해 감소된다. 전형적인 실시형태에서, 차이는 대조군에 비해 적어도 10%의 감소 또는 증가이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플을 보체 C4 아나필라톡신(C4A)의 5191 달톤 단편, α-1 항-키모트립신 C 말단 단편(AACT), 및 Apo A1로 이루어지고; 선택적으로 추가로 보체 C1 저해제, 및/또는 표 1에 열거된 마커로 이루어진 마커의 세트에 특이적으로 결합된 시약과 접촉시키는 단계; (b) 시약과 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계; (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 (d) (c)에서의 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 C4A의 5191 달톤 단편의 증가 AACT 및/또는 ApoAI의 감소를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 측정은 면역분석법을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 측정은 질량분석법을 포함한다. 다른 분석 방법은 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS), 웨스턴 블롯팅, 및 대용 DNA 주형의 증폭을 포함한다. 시약의 대표적인 예는 항체, 핵산 프로브, 또는 합성 프로브를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 프로브 또는 항체는 선택적으로 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시약은 검출가능한 마커로 표지되고/되거나 색원체 또는 형광 기질을 이용하여 관찰된다.
실질기관 이식편의 예는 신장, 간, 심장, 췌장, 폐, 장 및 흉선을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 실질기관 이식편 거부는 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응이다. 실질기관 이식편 거부의 다른 유형은 만성 거부, 예컨대 만성 동종이식 신장병, 또는 관형 위축을 지니는 간질성 섬유증을 포함한다.
추가적으로 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플을 보체 C4 아나필라톡신(C4A)에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계; (b) 시약과 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계; (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함하되; 대조군에 비해 (b)에서의 결합의 더 큰 양은 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 나타낸다.
본 발명의 다른 예시적 실시형태는 환자에서 혈장 또는 혈청 또는 다른 체액 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 및/또는 표 1의 다른 16종의 단백질 중 하나를 검출함으로써 실질기관 동종이식편 거부반응과 관련된 펩타이드 및/또는 단백질 프로파일을 동정하는 질량분석법이며, 상기 분석은 (a) 질량분석법에 의해 혈장, 혈청 또는 다른 체액 중의 특이적 펩타이드의 구체적 양을 측정하는 단계; (b) (a)에서의 단백질/펩타이드의 구체적 양을 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함하되; 대조군에 비한 특이적 펩타이드의 더 큰 또는 더 적은 양은 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 나타낸다.
또한 환자에서 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응에 대한 감수성을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제에 대한 다클론성 또는 단클론성 항체를 제공하는 단계; (b) 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 제공하는 단계; (c) 혈청 또는 혈장을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하는 단계; (d) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 알칼린 포스파타제-항체 컨쥬게이트를 마이크로타이터 플레이트에 제공하는 단계; (e) p-나이트로페닐-포스페이트를 마이크로타이터 플레이트에 제공하는 단계; 및 (f) 단계 (a) 내지 (e)의 결과로서 생기는 반응을 표준 곡선과 비교하여 정상 개체에 비교한 본 명세서에 개시된 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시형태는 AACT 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 SAA 및/또는 CRP 및/또는 A2M 및/또는 ApoE 및/또는 ITIH4 및/또는 A1AT 및/또는 C-inh 및/또는 이들 폴리펩타이드의 단편의 샘플 중에서의 검출 및/또는 정량화하기 위한 분석 및 방법을 제공한다. 본 발명의 전형적 실시형태는 포유류, 특히 인간의 혈액, 혈장, 혈청 또는 다른 체액과 같은 생물학적 유체 샘플과 함께 사용하기에 적합한 유형의 ELISA-유형 분석을 이용한다. 방법론적 실시형태는 생물학적 유체 샘플 중의 AACT 및/또는 C4A 및/또는 Apo A1폴리펩타이드, 이들 마커의 단편, 및/또는 본 명세서에 기재된 마커의 조합물의 양에 대한 시험을 포함한다. 특정 실시형태는, 예를 들어, 환자에서 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일을 동정하기 위해 α-1 항키모트립신, Apo A1, 보체 C1 저해제 및 C4A의 5191Da 펩타이드와 함께 시험한다. 특정 실시형태는 1(예를 들어, 5191Da C4A 펩타이드) 또는 2(예를 들어, C4A 펩타이드 + α-1 항키모트립신 또는 Apo A1) 또는 3(예를 들어, α-1 항키모트립신, Apo A1 및 5191Da C4A 펩타이드) 또는 모두 4종의 이들 바이오마커를 시험한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 5191Da C4A 펩타이드는 정제되고, 이어서, 이 정제된 펩타이드는 ELISA 시험 등에서 사용될 수 있는 5191Da 펩타이드에 특이적인 다클론성 항체를 생성하기 위해 토끼와 같은 동물에게 주사된다. 유사하게, 단백질에 대한 단클론성 항체 제제는 정제된 5191Da 펩타이드를 마우스에게 주사함으로써, 비장 및 림프절 세포를 채취함으로써, 이들 세포를 마우스 골수종 세포와 융합함으로써 그리고 얻어진 하이브리도마 세포를 이용하여 단클론성 항체를 생성함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 하나의 예시적 실시형태는 환자에서 하기 단계들을 포함하는 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일에 대해 선별하기 위해 혈장 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제를 검출하는 방법이다: (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제에 대해 다클론성 또는 단클론성 항체를 제공하는 단계; (b) 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 제공하는 단계; (c) 혈청 또는 혈장을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하는 단계; (d) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 알칼린 포스파타제-항체 컨쥬게이트를 마이크로타이터 플레이트에 제공하는 단계; (e) p-나이트로페닐-포스페이트를 마이크로타이터 플레이트에 제공하는 단계; 및 (f) 단계 (a) 내지 (e)의 결과로서 생기는 반응을 표준 곡선과 비교하여 정상 개체에 비교한 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제 수준을 결정하는 단계.
마커의 양은 대조군 중에 존재하는 양과 통계적으로 유의한 양만큼 상이하다면 증가 또는 감소된 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 차이는 적어도 10%의 증가 또는 감소이고; 다른 실시형태에서, 차이는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 이상이다. 다른 실시형태에서, 기준 범위는 정상, 대조군 샘플 중에 존재하는 마커의 양에 대해 동정되었고, 해당 마커에 대한 기준 범위 밖에 있는 마커의 양을 갖는 시험 샘플은 거부되기 쉽다. 전형적인 실시형태에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 다른 체액은 혈청, 소변 및 타액을 포함하는 샘플에 대해 사용될 수 있다.
마커의 다음의 조합은 본 발명의 방법과 함께 사용하기 위해 상정된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
대조군에 비한 증가가 거부를 나타내는 마커의 예는 C4A, CRP, SAA, C1-inh, A1AT 및 ApoE를 포함한다. 대조군에 비한 감소가 거부를 나타내는 마커의 예는 AACT, ApoA1, ITIH4 및 A2M을 포함한다.
일 실시형태에서, 측정은 크로마토그래피 또는 분광 분석법을 포함한다. 크로마토그래피는 기체 또는 액체 크로마토그래피일 수 있다. 분광 분석법은 질량분석법일 수 있다. 마커 검출의 다른 공지된 방법이 또한 상정되고, 관심 대상의 개개 마커의 특징에 기반하여 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 분석의 예는 면역분석법 및 전기화학적 검출을 포함한다. 시험 샘플의 측정은 대조군에 직접적으로 비교될 수 있고, 예컨대 시험 샘플 중에 존재하는 마커의 양을 대조군 샘플 중의 마커의 양에 대해 또는 마커의 알려진 정상 수준에 대해 비교될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 마커 양은 동일한 대상체에 대한 기준 양과 비교된다.
다음의 특허 문헌은 이식 거부의 분자 진단에 관한 것이다: 미국 특허 제 7,666,596호, 미국 특허 제2009/0304705호; 미국 특허 제7,691,569호; 미국 특허 제7,645,575호; WO 2009/101083; WO 2009/045104; 미국 특허 공개 제2009/0022730호; WO 2007/104537; WO 2008/027428; 미국 특허 공개 제2008/0038746호; WO 2007/138011; WO 2007/121922; 미국 특허 공개 제2007/0202085호; 미국 특허 제7,235,358호; 미국 특허 공개 제2007/0037166호; 미국 특허 공개 제2006/0088836호; 미국 특허 제7,026,121호; WO 2004/042346; 미국 특허 제7,192,716호; 미국 특허 공개 제2003/0104371호; 및 WO 01/81916. 다음의 특허 공개는 이식 거부에 대한 게놈형 및 표현형 시험에 관한 것이다: 미국 특허 공개 제20077235358호; WO2006029184; 미국 특허 공개 제20070082356호; 유럽 특허 제000253514호; 유럽 특허 제000953220호; 미국 특허 공개 제2004000584728호; WO2005077980; 미국 특허 공개 제2004000557234호; WO02075306; 미국 특허 공개 제2006000641625호; 및 미국 특허 공개 제20050152893호.
키트
본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 위해, 키트가 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 키트는 바이알, 관 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획된 운반체, 패키지 또는 용기를 포함할 수 있으며, 각각의 용기(들)는 본 방법에서 사용될 별도의 구성요소 중 하나를 포함한다. 키트의 프로브, 항체 및 다른 시약은 냉동, 동결건조 또는 약제학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 TBS 또는 PBS 중을 포함하는 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 키트는 또한 시험관내 또는 생체내 시약의 이용에 필요한 다른 시약, 예컨대 완충제(즉, TBS, PBS), 차단제(무지방 탈지유, 정상 혈청, 트윈(Tween)-20 세정제, BSA 또는 카제인을 포함하는 용액) 및/또는 검출 시약(즉, 염소 항-마우스 IgG 바이오틴, 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트, 알로피코시아닌, B-피코에리트린, R-피코에리트린, 페록시다제, 플루오린(즉, 다이라이트(DyLight), Cy3, Cy5, FITC, 하이라이트 플루오르(HiLyte Fluor) 555, 하이라이트 플루오르 647), 및/또는 염색 키트(즉, ABC 염색 키트(ABC Staining Kit), 피어스(Pierce)))를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 예를 들어, 액체 또는 기체 크로마토그래피, 분광 분석법, 전기화학적 분석, 유세포 분석, ELISA, 면역블롯팅(즉, 웨스턴 블롯), 면역세포화학, 면역조직화학과 같은 상기 기재한 통상적으로 이용되는 분석에서 항체, 프로브 및 다른 시약을 이용하기 위한 설명서 및/또는 다른 시약을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 키트는 시약을 정제된 형태로 제공한다. 다른 실시형태에서, 시약은 단독으로 또는 아비딘-컨쥬게이팅된 검출 시약(즉, 항체)과 함께 바이오틴일화된 형태로 제공되는 면역시약이다. 다른 실시형태에서, 키트는 항원을 직접적으로 검출하기 위해 사용될 수 있는 형광 표지된 면역시약을 포함한다. 임의의 이들 시스템을 이용하는데 필요한 완충제 등은 당업계에 잘 공지되어 있고, 최종 사용자에 의해 제조되거나 또는 키트의 부품으로서 제공될 수 있다. 키트는 또한 양성- 및 음성-대조군 단백질 및/또는 조직 샘플을 함유하는 고체 지지체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스팟팅(spotting) 또는 웨스턴 블롯형 분석을 수행하기 위한 키트는 SDS-PAGE에서 사용하기 위한 대조군 세포 또는 조직 용해물 또는 실험 샘플에 대한 추가적인 공간과 함께 사전 고정된 대조군 샘플을 함유하는 나일론 또는 다른 막을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 전형적으로 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 포장 삽입물을 사용을 위한 설명서와 함께 포함하는, 상기 기재된 용기 및 상업적 및 사용자 견지로부터 바람직한 물질을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 추가로, 라벨은 조성물이 구체적 용도를 위해 사용된다는 것을 나타내기 위해 용기 상에 제공될 수 있고, 또한 상기 기재된 것과 같은 용도를 위한 지침을 표시할 수 있다. 지침 및 또는 다른 정보는 키트와 함께 포함된 삽입물 상에 포함될 수 있다.
본 발명은 C4A의 5kDa 단편, ApoA1, AACT, 및, 선택적으로, 하나 이상의 추가적인 표 1에 열거된 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 키트를 추가적으로 제공한다. 일 실시형태에서, 키트는 C4A(또는 이의 5kDa 단편) 및 ApoA1(또는 아미노산 148 내지 183에서 이들의 단편) 및/또는 AACT(또는 아미노산 385 내지 422에서 이들의 단편)에 결합하는 시약을 포함하고, 일 실시형태에서, 키트는 AACT 및 ApoA1의 5191Da 단편에 특이적으로 결합하는 시약을 포함한다. 일 실시형태에서, 키트는 항체가 고정된 고체 지지체를 추가로 포함한다. 고체 지지체의 예는 마이크로타이터 플레이트, 비드, 막 또는 당업자에게 공지된 다른 지지체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 항체는 고체 지지체에 고정된 항원에 대한 결합을 통해 고정된다. 일 실시형태에서, 항체는 루미넥스와 같은 비드 또는 입자에 대한 결합을 통해 고정된다. 일 실시형태에서, 키트는 색원체 기질을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 예시적 실시형태는 환자에서 혈장 또는 혈청 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제를 검출함으로써 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일을 선별하기 위한 ELISA 키트이며, 상기 키트는 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제에 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트; (b) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 다클론성 또는 단클론성 항체-알칼린 포스파타제 컨쥬게이트; (c) p-나이트로페닐-포스페이트; 및 (d) 항원 표준으로서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 본 명세서에 개시된 5191 펩타이드 및/또는 보체 C1 저해제를 포함한다.
본 발명의 다른 예시적 실시형태는 환자에서 혈장 또는 혈청 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제를 검출함으로써 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 분자 프로파일에 대해 선별하기 위한 ELISA 키트이며, 상기 키트는 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제에 대해 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트; (b) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제와 반응성인 다클론성 또는 단클론성 항체-알칼린 포스파타제 컨쥬게이트; (c) p-나이트로페닐-포스페이트; 및 (d) 항원 표준으로서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제를 포함한다.
본 발명의 다른 예시적 실시형태는 환자에서 혈장, 혈청 및/또는 생물학적 유체 중의 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 및/또는 표 1에 기재된 단백질을 검출함으로써 실질기관 동종이식편 거부반응과 관련된 분자 프로파일에 대해 선별하기 위한 루미넥스 키트이며, 상기 키트는 (a) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 및/또는 표 1에 열거된 단백질에 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체로 코팅된 마이크로비드 어레이; (b) α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 및/또는 표 1에 열거된 단백질과 반응성인 다클론성 또는 단클론성 항체 형광 염료 컨쥬게이트; (c) 및 항원 표준으로서 α-1 항-키모트립신 및/또는 Apo A1 및/또는 C4A 및/또는 보체 C1 저해제 또는 표 1의 다른 단백질을 포함한다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 그리고 이를 제조하고 이용함에 있어서 당업자를 돕기 위해 제공한다. 본 실시예는 본 발명의 범주를 달리 제한하기 위한 임의의 방법으로 의도되지 않는다.
실시예 1: α -1 항키모트립신의 아포지방단백질 A1 및 C-말단 단편은 급성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 바이오마커이다
본 실시예는 사례 조절 접근 및 SELDI-TOF-MS를 이용하여 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 단백질의 동정을 입증한다. 각각의 거부 환자로부터, 두 혈장 샘플(하나는 생검일 근처 및 다른 하나는 생검 후 바로)을 비교하였다. 생검으로 확인한 비-거부 환자를 추가로 대조군으로서 분석하였다. 항체 기반 정량적 ELISA를 수행하여 생검 확인 거부(n=40) 및 비-거부(n=70) 환자의 본래의 코호트 및 제2 코호트의 서브세트에서 후보 바이오마커 아포지방단백질 A1(Apo A1)을 확인하였다. 22개의 단백질/펩타이드는 거부와 거부 후 샘플 사이의 상당한 차이를 나타내었다. 펩타이드 5191Da 및 4467Da은 100% 민감성 및 94% 특이성을 지니는 거부를 검출하였다. 4467Da 펩타이드를 α-1 항-키모트립신의 C-말단 단편으로서 동정하였고, 28kDa 단백질을 Apo A1로서 결정하였다. 단백질 수준은 둘 다 거부 후에 비해 거부 시 상당히 더 낮았다. 비-거부 환자의 단백질 수준은 거부 후 샘플과 유사하였다. Apo A1 ELISA 결과는 SELDI 발견과 동시에 일어나는 비거부에 비해 거부 시에 유의하게 더 낮은 Apo A1 수준(본래의 코호트에 대해 p = 0.001 및 제2 코호트에 대해 p = 4.14E-11)을 나타내었다. α-1 항키모트립신, Apo A1, 및 5191Da 펩타이드(C4A의 단편)는 함께 혈장 분자 프로파일을 제공하고, 이는 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된다.
방법
연구 설계 및 환자 집단. 신장 이식 환자를 서면 동의에 의해 유니버시티 오브 캘리포니아 로스 앤젤레스 임상시험심사위원회(University of California Los Angeles Institutional Review Board)-승인 면역 모니터링 연구에 등록시켰다. 16명의 신장 이식 수용자는 생검 확인 ACR의 17가지의 "독립적" 에피소드와 관련된 34종의 혈액 표본에 기여하였다. 한 명의 수용자는 충분한 간격을 두고(4개월) 2회의 거부 에피소드가 있었으며, 중간 혈청 크레아티닌은 정상이었으며, 따라서 본 발명자들은 제2 거부를 독립적 사건으로 고려하였다. 생검-증명 비거부인 환자를 또한 선택하였다(n=48). 모든 생검을 원인을 위해 수행하였고, 혈청 크레아티닌이 상승되거나 또는 이식편 기능이 지연된 후에 취하였다. 거부 생검은 한명이 656일에 일어난 것을 제외하고 이식 후 처음 100일 이내에 일어났다(중앙값=이식후 27일). 밴프 분류(Banff classification)를 사용하여 급성 거부를 스코어링하였다(35, 36). ACR을 이용하는 2회의 생검은 또한 AMR의 증거를 나타내었고, C4d 양성이었다. 거부 환자를 2시점에 연구하였다s: 거부 표본(그룹 A)을 양성 생검일에 가장 가까운 시점에 선택하였고(중앙값= -제1일, 범위: -제16일 내지 +제8일); 거부 후 샘플(그룹 B)을 생검일 후 14일에 가장 가깝게 선택하였다(중앙값=28일, 범위: 14 내지 180일). 17개의 거부 샘플(그룹 A) 중 12개는 생검 전 8일 이내에 수집하였고, 17개 중 5개는 생검 후 8일 이내에 얻었다. 거부 후 샘플(그룹 B)에 대해, 17개 중 16개는 생검 후 60일 이내에 수집하였고, 17개 중 1개는 생검 후 180일에 수집하였다. 비거부 혈장 샘플(대조군으로서 정함, 그룹 C)를 음성 생검에 가장 가까운 일 시점에 선택하였다(중앙값=1일, 범위: -제35일 내지 +제44일). 표 2는 연구 집단의 인구통계를 설명하고, 연령, 성별, 인종, 이식 수 또는 인간 백혈구 항원 미스매치 정도에 대한 유의한 차이가 없음을 나타낸다. 사망 및 생존 공여자의 백분율은 미국 장기 조달 이식 네트워크(U.S. Organ Procurement Transplant Network) 국가 데이터와 유사하였다.
Figure pct00009
Figure pct00010
생검-증명 신장 동종이식편 거부반응이 있는 수용자(n=27)의 제2 코호트를 선택하였고, 다시 2개의 혈장 샘플을 연구하였다(거부 및 거부 후 시점). 모든 생검을 원인을 위해 수행하였고, 혈청 크레아티닌이 상승되거나 또는 이식편 기능이 지연된 후에 취하였다. ACR 양성 생검 중 둘은 또한 AMR의 증거를 갖는 반면, 생검 중 넷은 AMR만의 증거를 가졌다. 거부 표본(n=27)은 생검의 -제7일 내의 시점에 선택하였다(중앙값= -제1일, 범위=-제7일 내지 제0일). 평균 거부 에피소드는 이식 후 122일이었다. 27개의 생검 중 20개는 처음 3개월 내였고, 27개 중 5개는 처음 9개월 내였으며, 27개 중 2개는 1년 초과였다. 거부 후 샘플은 생검 후 8개월 초과에 선택하였다(중앙값=32일, 범위=8 내지 573일). 거부 후 샘플에 대해, 27개 중 20개를 생검 후 3개월 내에 수집하였고 27개 중 3개는 6개월 내에 수집하였으며, 27개 중 1개는 9개월에 수집하였고, 27개 중 3개는 생검 후 1년에 수집하였다. 추가로, 51개의 생검-증명 비거부 샘플의 코호트를 음성 생검에 가장 가까운 시점에 선택하였다(중앙값=8일, 범위=-제22일 내지 581일). 생검-증명 비거부 샘플에 대해, 51개 중 38개를 생검 후 3개월 내에 수집하였고, 51개 중 5개를 6개월 내에 수집하였으며, 51개 중 4개를 생검 후 9개월 내에 수집하였고, 51개 중 4개를 1년에 수집하였다. 비거부자의 이 그룹으로부터의 모든 생검을 원인을 위해 수행하고 혈청 크레아티닌이 상승되고 이식편 기능이 지연된 후에 취하였다.
코호트 둘 다에 대해, 유지 면역억제는 칼시뉴린 저해제(타크로리무스 또는 사이클로스포린), 항증식제(마이코페놀레이트 모페틸 또는 시롤리무스), 및 프레드니손을 포함하였다. 이식전 민감화의 증거가 없는 일부 경우에, 스테로이드를 회수하였다.
혈청 알부민 및 면역글로불린-G 고갈 및 음이온 교환 분획화
혈액 샘플을 BD 배큐테이너(Vacutainer) ACD 용액 A 관(뉴저지주 프랭클린 레이크에 소재한 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton, Dickinson and Company))에서 수집하였다. 혈장을 분리하고 저장하였다. 항체 스핀 칼럼(큐프로테옴(Qproteome), 캘리포니아주 발렌시아에 소재한 퀴아젠사(Qiagen))을 사용하여 인간 혈청 알부민 및 면역글로불린-G를 고갈시켰다. 완전 미니(Complete Mini)(에틸렌다이아민테트라아세트산) 프로테아제 저해제(캘리포니아주 팔로알토에 소재한 로슈(Roche))를 첨가하였다. 아크로프렙 무스탕 큐(AcroPrep Mustang Q)(친수성 폴리에터설폰 막) 음이온 교환 수지 96-웰 플레이트(뉴욕주 이스트 힐스에 소재한 팔(Pall))를 사용하여 고갈된 혈장을 pH 9, pH 6 및 pH 4 분획으로 분리시켰다.
단백질칩 어레이( ProteinChip Array) 제조
단백질칩 어레이(CM10 및 Q10)를 결합을 위해 미리 평형을 유지하였다. pH 분획을 어레이에 결합시키고 나서, 3회 중복해서 분석하였다. 6개의 풀링한 인간 혈청(미조리주 세인트 루이스에 소재한 시그마사(Sigma)) 샘플을 각각의 어레이 세트에 대한 내부 대조군으로서 사용하였다. 샘플 어레이 가공 후에, 기질을 적용하였다: 포화 시나핀산(SPA, 프랑스 소피아-앙티폴리스에 소재한 레이저바이오 랩스(LaserBio Labs)) 또는 20% 포화 알파-사이아노-4-하이드록시 신남산(CHCA, 레이저바이오 랩스). 바이오멕(Biomek) 2000 액체 조절 로봇(캘리포니아주 풀러톤에 소재한 베크만사(Beckman))을 기질 스팟팅을 위해 사용하였다.
질량 스펙트럼 데이터 분석
사이퍼젠(Ciphergen) 단백질칩 소프트웨어 3.2를 이용하는 단백질칩 생물 시스템(ProteinChip Biology System)(PBS IIc) 질량 분석계를 SPA-스팟 어레이(레이저 에너지 150 및 170)를 판독하기 전에 고질량 범위에서 교정하였다. 펩타이드 혼합물을 CHCA-스팟 어레이(레이저 에너지 120 및 135)의 교정을 위해 사용하였다. 각각의 스팟으로부터의 질량 스펙트럼은 평균 240 레이저 샷(shot)이었다. 모든 스펙트럼을 사이퍼젠익스프레스 클라이언트 소프트웨어(CiphergenExpress Client Software) 3.0에서 예비 분석하여 표현 차이 맵핑 분석(Expression Difference Mapping analysis)에 의해 클러스터를 생성하였다. 클러스터는 동일한 질량/전하(m/z) 비를 지니는 피크의 그룹이며, 다중 스펙트럼에 걸친 동일한 단백질 또는 펩타이드로서 처리하였다. 각각의 스펙트럼으로부터의 피크 강도를 사용하여 상대적 단백질/펩타이드 양을 측정하였다. 신호를 정규화하기 위해 총 이온 전류를 사용하였다. 피크 높이의 재현성은 15% 내지 30%의 CV를 나타내는 이전에 공개된 것(37)과 유사하였다.
단백질 동정
MALDI-TOF-MS는 prOTOF 2000 오쏘고날(orthoganol)-TOF 질량 분석계(캘리포니아주 산호세에 소재한 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 이용하여 수행하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 시스템은 프로미넌스 2000(Prominence 2000)(메릴랜드주 컬럼비아에 소재한 시마즈 사이언티픽 인스트루먼츠(Shimadzu Scientific Instruments))였다. 모든 프로토콜 및 시약은 제조업자의 제안에 따랐다.
4467Da 펩타이드
이 펩타이드를 지니는 Q 분획을 역상 C8 칼럼(캘리포니아주 모르파크에 소재한 악시옴(Axxiom)) 상에 장입하였다. C8 분획에 써모-피니간(Thermo-Finnigan) LTQ-FT 전자분무 질량 분석계(매사추세츠주 월섬에 소재)에서 콜로이드-유도 해리 MS/MS를 실시하였다. MS/MS 데이터를 NCBI 블라스트(NCBI Blast)에 의해 검색하였다. α-1-항키모트립신에 대한 다클론성 항체(캘리포니아주 프레몬트에 소재한 랩 비전 코포레이션(Lab Vision Corporation))를 이용하여 면역침전을 수행하고 다음에 MALDI 분석을 하였다.
28kDa 단백질
고수준의 단백질을 지니는 풀링한 샘플 분획을 황산도데실나트륨-PAGE에 의해 분리시켰다. 프로테오실버 플러스 키트(ProteoSilver Plus kit)(시그마)를 이용하여 겔을 염색하였다. 28kDa 근처의 밴드를 절단하고, 겔 내 트립신 분해를 수행하였다. 펩타이드를 MALDI에 의해 분석하였다. 무결함 트립신 덩어리를 온라인 단백질 단편 데이터베이스 검색을 이용하여 MASCOT에서 검색하였다. 인간 Apo A1(미네소타주 미네아폴리스에 소재한 알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 다음에 MALDI 분석에 대해 단클론성 항체를 이용하여 면역침전을 행하였다.
통계학적 분석
비모수(이항) 및 모수(혼합 효과 및 선형 회귀) 모델을 사용하여 유의한 피크를 동정하였다. 0.05 미만의 양측 P 값을 유의한 것으로 고려하였고, 필요하다면 본페로니(Bonferroni) 교정을 사용하였다. CART 분석을 수행하여 후보 바이오마커의 서브세트를 선택하고, 거부를 정확하게 분류하는 그들의 능력을 결정하였다. 선택된 단백질/펩타이드 피크의 조절된 강도를 CART 트레이닝에서 예측자 변수로서 하용하였다. 통계학적 계산을 위해 R 소프트웨어 패키지(버전 3.1, r-project.org에서)를 사용하였다. 전통적인 로지스틱 회귀 분석을 수행하였고, STATA 데이터 분석 및 통계 소프트웨어를 이용하여 ROC 플롯을 생성하였다. 정확하게 분류된 최대값에 의해 차단점을 선택하였다. 통계학적 분석의 상세한 설명은 보충 자료에 제시한다(보충 디지털 컨텐츠 1(Supplemental Digital Content 1), links.lww.com/TP/A465; 문헌[Ziegler, M.E., et al., 2011, Transplantation 92(4):10.1097]으로서 이 자료의 온라인 버전을 이용하여 공개).
혈장 Apo A1 수준의 정량화를 위한 ELISA
총 인간 아포지방단백질 A1 ELISA 분석(메인주 포틀랜드에 소재한 앨러체크(Alerchek))을 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 샘플을 대조군 혈장 샘플과 함께 2회 중복해서 실행하였다. 분석을 소프트맥스 프로(SoftMax Pro 5.4) 소프트웨어(캘리포니아주 서니베일에 소재한 몰레큘러 디바이스(Molecular Devices))를 이용하여 스펙트라맥스 M2 플레이트 판독기 상에서 수행하였다.
결과
거부 샘플과 거부 후 샘플 사이의 혈장 단백질/ 펩타이드 수준의 변화
거부 그룹과 거부 후 그룹 사이의 스펙트럼에 걸친 피크 강도 차이를 분석하였다. 전체적으로, pH 4 분획에서 235개의 피크, pH 6 분획에서 186개의 피크 및 pH 9 분획에서 232개의 피크를 포함하는 653개의 피크 클러스터를 검출하였다.
샘플 환자로부터의 거부 및 거부 후 샘플의 피크 강도를 이항 모델을 이용하여 분석하였다. 81개의 피크 강도(표 S1A, 보충 디지털 컨텐츠 1, links.lww.com/TP/A465 참조)는 상당히 증가된 반면, 63개의 피크(표 S1B, 보충적 디지털 컨텐츠 1 참조)는 거부 샘플에서 상당히 감소되었다. 각각의 조건에서 피크의 총 수에 대한 본페로니 교정 후에, 24개의 피크(표 S2, 보충적 디지털 컨텐츠 1, links.lww.com/TP/A465)는 선형 혼합 모델에 의해 거부 샘플과 거부 후 샘플 사이에 상당히 차이가 있었다. 이항 모델과 선형 혼합 모델 둘 다에 의해 22개의 유의한 단백질 피크를 검출하였다(표 3).
Figure pct00011
17개의 독립적 거부 사건을 회귀 및 분석 트리(CART) 분석에 적용하였고, 거부 샘플과 거부 후 샘플을 가장 잘 구분 짓는 2개 피크(4467Da 및 5191Da)(도 1a)의 조합을 생성하였다. 모든 거부 샘플은 정확하게 검출된 반면, 단지 하나의 거부 후 샘플은 부정확하게 검출되었는데; 이는 100% 민감성 및 94% 특이성을 나타낸다. 5191Da 피크의 강도는 거부 동안 유의하게 증가된 반면(P<0.001), 4467Da 피크는 거부 동안 유의하게 감소되었다(P<0.004)(도 1b). ROC 플롯은 CART 분석에 의해 발견되는 것과 유사한 차단점을 생성하였다.
이들 두 단백질의 피크 강도를 비거부 그룹(그룹 C)과 비교하였다(도 1b). 그룹 B와 C 사이에 5191Da 피크 강도에서 유의한 차이는 없었다(P=0.33). 그러나, 거부에서(그룹 A), 5191Da 피크는 비거부(그룹 C) 이상으로 상승되었다(P<0.001). 4467Da 피크 강도는 비거부(그룹 C)에 비해 거부(그룹 A) 동안 더 낮았고(P<0.001), 비거부(그룹 C)는 거부 후 샘플보다 단지 약간 더 높았다(그룹 B, P=0.04).
5191DA 및 4467DA 단백질 피크 수준은 거부의 진단과 상당히 관련되었지만, 그들의 강도는 거부의 밴프 등급을 구별하는 것으로 나타나지 않았다. 제한된 수 때문에, 거부는 경증(밴프 1A 이하, n=10) 또는 중증(밴프 1B 이상, n=7)으로서 분류되었다. 거부의 조합된 경우(데이터 미제시)에 대해 앞서 열거한 바와 같이 두 그룹은 개개로 동일한 강도 패턴(비거부에 대해)을 나타내었다.
단백질 프로파일링을 위해 사용한 혈장 샘플 중에서, 혈액 샘플 혈청 크레아티닌 수준은 17개의 거부 샘플 중 16개에서, 그리고 48개의 대조군 중 19개에서 이용가능하였다. 거부 후 샘플과 거부 동안 수집한 샘플 간의 혈청 크레아티닌 수준의 유의한 차이가 없었다. 거부 후 샘플에서 크레아티닌 수준(중앙값=1.9)은 사실 거부 시(중앙값=2.2)에 비해 모든 환자에서 더 낮았지만, 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 크레아티닌 회수는 거부 유형, 거부 치료법 및 공여자 상태를 포함하는 다수의 인자에 기인하여 더 느릴 수 있다.
바이오마커 후보의 동정
4467Da 펩타이드를 pH 4 분획에서 검출하였고, 추가 정제는 발린, 류신, 알라닌 및 세린의 일동위원소 질량에 매칭되는 질량 차이를 지니는 피크의 클러스터를 나타내었는데(도 2a) 이는 인간α-1-항키모트립신의 C-말단 단편(AACT)에 대응되는 SALV(S, 세린; A, 알라닌; L, 류신; 및 V, 발린)의 말단 서열을 제공한다. 면역침전 혈장 펩타이드의 고분해능 MALDI 분석은 AACT로서 정체를 확인하였다(도 2b).
신장 동종이식편 거부반응과 관련된 프로파일을 추가로 연구하기 위해, 22개의 유의한 단백질의 목록 중에서 발견된 대략 28kDa에서 피크의 클러스터를 분석하였다(표 3). 도데실황산나트륨-PAGE 다음에 겔 내 트립신 분해에 의한 28kDa 피크의 분리는 MALDI-TOF-MS에 의해 분석하고 Apo A1로서 단백질을 동정하기 위해 MASCOT 상에서 검색한 펩타이드를 생성하였다. 단클론성 항체를 이용하는 면역침전으로 정체를 확인하였다(도 2c). Apo A1 피크 강도는 거부 환자 및 비거부 환자에 비해 거부 후에 상당히 더 높았고, 거부 샘플(P=0.001)보다 거부 후(P=0.035) 샘플과 더 유사하였다(도 2d). Apo A1 단백질 수준은 급성 거부의 진단과 상당히 관련되었지만, 그들은 거부의 개개 밴프 등급과 관련이 없었다. 4467Da 및 28kDa 피크의 로지스틱 회귀 및 CART 분석은 59% 민감성 및 100% 특이성으로 거부와 거부 후가 차이가 있다는 것을 나타내었다.
Apo A1의 확인
SELDI 결과를 입증하기 위해, 정량적 Apo A1 ELISA를 본래의 거부/거부 후 샘플(n=13) 및 비거부 샘플(n=19)의 서브세트 상에서 수행하였다. ELISA에 의해 측정한 Apo A1 수준의 패턴(도 3a)은 SELDI 강도 피크 수준과 일치된다(도 2d). 이들 발견을 추가로 입증하기 위해, Apo A1 ELISA를 대응하는 거부 후 샘플과 함께 생검-확인 급성 세포성 거부(ACR)를 지니는 환자로부터의 27개의 혈장 샘플 및 생검-증명 비거부를 지니는 51명 환자로 이루어진 독립적 코호트 상에서 수행하였다. 제2 코호트에서, ELISA에 의한 Apo A1 수준은 거부 후(평균 =0.22±0.09) 및 비거부 샘플(평균=0.23± 0.07, P=4.14E-11)에 비해 거부 동안(평균 =0.14±0.04) 상당히 더 낮았는데(도 3b), 이 발견은 본래의 코호트와 일치된다.
코호트 둘 다에서, 신장 생검 전 -제3일 내지 제0일 내에 수집한 샘플을 시험하였다. 25개의 거부 및 22개의 비거부 샘플을 비교하였고, Apo A1 수준은 생검-증명 비거부를 지니는 수용자에 비해 거부 시 유의하게 더 낮았다(P 값<0.0001)(도 3c).
새로운 코호트의 서브세트(n= 14)는 또한 거부 에피소드 전 시점에 수집한 이용가능한 혈장 샘플을 가졌다(중앙값 = -제50일, 범위 = -제180일 내지 -제11일). 거부 전 샘플은 거부 후 샘플의 평균 수준과 거의 동일한 Apo A1 수준을 입증하였다(도 3d).
환자의 본래의 코호트와 제2 코호트 둘 다로부터의 거부 및 비거부 샘플의 Apo A1 수준을 이용하여 ROC 분석을 수행하였다(도 3e). 결과는 차단점 0.167 g/㎗이 환자의 80%를 정확하게 검출하는 것의 민감성 76% 및 특이성 86%를 제공한다는 것을 나타낸다. 27명의 거부 환자 중 26명은 다음과 같은 밴프 분류 데이터를 가졌다: 경계 변화=2, 밴프 1A=13, 밴프 2A=6, 밴프 3 혈관=1, 및 밴프 항체-매개 거부(AMR)=4. 환자는 경증 ACR(경계 및 밴프 1A=15), 중증 ACR(밴프 2A 및 밴프 3 혈관=7), 또는 ACR이 없는 AMR(n=4)에 기반한 범주로 그룹화하였다. Apo A1 중앙값 수준은 모든 3개 그룹에 대해 0.14였는데, 이는 거부의 중증이 Apo A1 수준에 의해 구별되지 않는다는 것을 나타낸다.
논의
표면 증감 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량분석법에 의해 발견한 22개의 펩타이드/단백질은 급성 동종이식편 거부반응의 진단과 상당히 관련되었다. 이들 단백질 중 둘, 즉, AACT 및 Apo A1의 정체를 설명하였다. AACT의 C-말단 단편은 거부 후 및 비거부에 비해 거부 동안 상당히 더 낮았다. AACT 단편(4354Da)의 상이한 변화는 안정한 이식을 지니는 환자에 비해 급성 거부가 있는 환자의 소변에서 더 높은 수준으로 발견된다(14). 피멘타(Pimenta) 등(17)은 고성능 액체 크로마토그래피 단리 및 MADLI를 이용하는 카텝신 D에 의한 AACT의 가수분해를 시험하였고, 3개의 펩타이드(4354Da, 4468Da 및 4625Da)를 발견하였다. 이들 절단 생성물은 혈장 중에서 동정된 4467Da 및 서열 데이터에 기반하여 소변에서 발견된 4354Da과 동일한데, 이는 둘 다 카텝신 D에 의해 생성될 수 있다는 것을 시사한다.
오리어던(O'Riordan) 등(14)은 면역조직화학에 의한 신장에서의 총 AACT 수준을 시험하였고, 거부와 대조군 사이에 차이가 없다는 것을 발견하였는데, 이는 수준이 변하는 펩타이드 AACT가 표적 프로테아제 상호작용 후에 절단 결과이고, 따라서 환자 간의 펩타이드 수준 변화는 AACT 표적 프로테아제 활성의 반영이라는 발견을 시사한다. 본 발명자들은 펩타이드 수준의 변화가 시스타틴 C 또는 키니노겐과 같은 카텝신 D에 대한 다른 기질에 대해 차단 또는 결합될 총 AACT의 결과일 수 있다는 가설을 세운다(18). 대안적으로, 거부 동안, 총 AACT는 대신에 그의 1차 표적인 카텝신 G(19), 즉, 동종이식 기능과 관련된 염증-관련 호중구 프로테아제를 저해할 수 있다(20, 21).
28kDa 피크를 Apo A1로서 동정하였다. Apo A1, 및 Apo A1 활성을 모방하는 합성 펩타이드는 강한 항염증 및 항산화 특성을 가진다(22, 23). Apo A1 모방 펩타이드인 D-4F는 마우스 모델에서 만성 거부에 의해 야기되는 내막 병변을 감소시킨다. 이 효과의 메커니즘은 이식편에서 항산화제 유전자 헴 옥시게나제-1의 유도 및/또는 T-림프구 증식 및 효과기 사이토카인 생성에 대한 직접적 효과를 수반한다(24).
Apo A1은 본래의 코호트와 독립적 코호트 둘 다에서 ELISA에 의해 입증되었다. 코호트 둘 다에서 거부, 거부 후 및 비거부 샘플의 비교는 더 낮은 수준의 Apo A1이 거부와 관련된다는 SELDI 발견과 일치되었다. 독립적 코호트에서 거부 전 시점은 거부 에피소드의 개시를 예측할 수 없었는데, 이는 Apo A1 하락이 거부 시간과 밀접하게 관련된다는 것을 나타낸다. 추가로, 모든 환자의 Apo A1 ROC 분석은 Apo A1이 잠재적으로 거부를 설명하기 위해 사용한 서명의 일부일 수 있다는 것을 시사한다. Apo A1은 또한 폐동맥 고혈압, 결장직장암, 및 난소암에서 후보 바이오마커로서 동정하였고(25 내지 27), 더 최근에는 샤가스병, 다낭성난소증후군, 및 만성 폐쇄성 폐질환과 관련되었다(28 내지 30). 모든 이들 연구에서, Apo A1 수준은 비질환에 비해 질환 상태에서 더 낮았다.
감염은 혈청 지질 프로파일에서 변화를 야기할 수 있고, 감소된 Apo A1은 감염을 만성 염증과 관련짓도록 상정되었다(31). 장기간 면역억제 요법의 사용은 이식 환자를 감염에 민감하게 만들었다(32). 본 발명자들은 제2 코호트로부터의 51명의 비거부환자를 시험하였고, 이 연구에서 사용한 혈장 샘플을 수집하였을 때 박테리아 감염의 증거가 있는 5명의 환자를 발견하였다. Apo A1 수준은 이런 소수의 환자에 대해서는 없음에 비해 감염이 있는 비거부 환자에서는 유의하게 다르지 않았다. 이는 신장 이식 환자에 대해 저수준의 Apo A1이 거부 에피소드와 관련된다는 가설에 기여하지만, 이를 확인하는데 더 많은 연구가 필요하다.
5191Da 펩타이드의 단리 및 동정은 혈장 중의 그의 낮은 존재비, 다른 더 흔한 펩타이드와 함께 그의 공동 정제 및 그것을 직접적으로 단편화하는 것의 불능에 기인하여 방해되었다. 알려지지 않은 이유 때문에, 일부 펩타이드는 불량하게 단편화되고, 판독될 수 없는 MS/MS 스펙트럼을 수득하였다(33, 34). 5191 및 4467Da 피크의 조합은 거부 대 비거부를 강하게 평가한 반면, 4467 및 28kDa 피크의 조합은 가치가 없었는데, 따라서 5191Da 피크의 동정은 중요하다. 본 발명자들은 현재 동정을 위해 이 펩타이드를 더 양호하게 단리하고 단편화하는 대안의 방법을 연구 중에 있다.
본 발명자들의 연구 설계의 제한은 신장 생검이 수행되는 것과 항상 동일한 날이 아닌 일상적인 환자 방문 시에 혈장이 수집된다는 것이다. 또한, 본 발명자들의 연구 집단의 임상 매개변수는 면역억제에 대해 균일하지 않았다. 더 나아가, 본래의 코호트에서 2명의 환자만이 AMR을 가졌고, 따라서 AMR에 대한 서명은 결정될 수 없었다. 대다수의 환자는 처음 100일 내에 거부되었고, 따라서 본 발명자들은 단지 초기 거부를 연구하는 것으로 제한하였다. 장래에, 늦은 신장 동종이식편 거부반응을 겪는 환자에서 이들 마커를 연구하는 것은 가치가 있을 것이다. 추가적으로, 본 발명자들은 밴프 분류에 기반한 거부의 중증도와 및 Apo A1 수준 사이의 관계를 발견하지 못하였다. 대상체의 더 큰 코호트에서 이 비교를 다시 시도하는 것에 관심을 가질 것이다. 최종적으로, 본 발명자들은 이들 마커를 더 양호하게 평가하기 위해, 장래의 연구가 임상 상황에서 그들의 진정한 값을 결정하는데 필수적이라는 것을 인식한다. 장래 연구의 가능성을 나타내기 위해, 본 발명자들은 환자의 코호트를 둘 다 시험하였고, 25개의 거부 및 22개의 비거부 샘플이 신장 생검 전 -제3일 내지 제0일에 수집되었다 것을 발견하였다. 본 발명자들이 이들 그룹 간의 Apo A1 수준을 비교할 때, 거부 수준은 유의하게 더 낮았는데(P<0.0001), 이는 장래 연구가 생검 시 이들 환자를 구별할 가능성이 있다는 것을 시사한다.
이 연구는 혈장 중의 신장 동종이식편 거부반응의 후보 바이오마커에 대한 검색이 유망한 임상적 이점을 가진다는 것을 입증한다. 이들 혈장 샘플을 수집한 시점에, 후보 바이오마커는 혈청 크레아티닌 수준 변화보다 더 유익한 변화를 나타내었다. 따라서, 장래의 연구는 Apo A1뿐만 아니라 신장 동종이식편 거부반응을 정확하게 검출하는 그들의 능력에 대한 다른 마커의 정보를 얻어야 한다. 최종적으로, 동정한 두 후보 마커는 항염증 단백질이며, 그들의 기능적 특징이 연구되어야 한다.
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 2: 급성 신장 동종이식편 거부반응과 관련된 혈장 바이오마커로서 아포지방단백질 A1( Apo A1)의 확인
실시예 1에서 Apo-A1로서 동정한 28kDa 단백질은 생검 증명 신장 동종이식편 거부반응이 있는 환자에서 더 낮은 수준을 지속적으로 나타내었다. 효소-결합 면역흡착 검정법(ELISA) 및 생검 증명 거부가 있는 환자로부터의 27개의 혈장 샘플 및 거부가 없는 51명의 환자의 독립적 코호트를 이용하여, 본 발명자들은 질량분석법 연구를 확인하였고, 더 낮은 수준이 신장 동종이식편 거부반응의 진단과 관련된다는 것을 나타내었다.
현재 연구의 목적은 2010년과 2013년 사이에 UCLA에서 이식된 73명의 동종이식 수용자의 독립적 코호트를 이용하여 신장 동종이식편 거부반응에 대한 마커의 예측값을 확인하는 것이었다. 45명/71명 환자는 거부인 반면, 28명의 환자는 생검 증명 비거부였다.
73명의 신장 수용자로부터의 혈장 샘플을 ELISA에 의해 Apo- A1 단백질 수준에 대해 분석하였다. 환자 중 45명은 적어도 하나의 생검 증명 거부 에피소드를 경험한 반면, 28명의 환자는 생검 증명 비거부였다. 거부 진단 전 7일 이내 또는 거부 진단 후 2일에 얻은 혈장 샘플을 Apo A1 수준에 대해 ELISA에 의해 정량화하였다. 신장 동종이식편 거부반응을 밴프 기준을 이용하여 진단하였다. 표 3 및 도 4에서 나타낸 바와 같이, 신장 동종이식편 거부반응으로 진단된 환자는 비거부(평균 0.239+/-0.16)에 비해 Apo A1 수준(평균 0.156+/- 0.77)이 상당히 더 낮았다(P<0.0024). 차단점 0.195를 이용하여, Apo A1 수준은 민감성 75% 및 특이성 82%를 지닐 때 79%를 거부가 있는 환자로 정확하게 분류하였다(도 5).
(표 3)
Figure pct00014
결론: 신장 동종이식편 거부반응의 진단 1주일 내에 상당히 더 낮은 Apo A1 단백질 수준이 발견되었다. 이 연구는 신장 동종이식편 거부반응의 바이오마커로서 Apo A1을 이용하는 것을 추가로 뒷받침하며, 신장 동종이식편 거부반응의 진단을 돕기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라 거부 위험을 결정하기 위해 이식 수용자를을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
실시예 3: 항체 -기반 ELISA 분석을 이용하는 알파-2- 마크로글로불린의 확인
도 6은 질량분석법을 이용하여 입증한 바와 같이 알파-2-마크로글로불린의 동일한 검출 패턴을 나타내는 ELISA 데이터를 제공한다. 대응표본 혈장 샘플을 거부로 진단된 7명의 신장 동종이식 수용자의 거부 시 및 거부 후에 수집하였다. 이들은 상기 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 대응표본 혈청 샘플이다. 데이터는 ELISA에 의해 검출되는 바와 같은 알파-2-마크로글로불린의 수준이 거부 진단 시 감소된다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 질량분석법에 의해 동정되는 바이오마커의 아미노산 서열
상기 실시예 1에서 동정한 단백질 단편의 아미노산 서열을 다음의 표에 기재한 바와 같이 결정하였다.
Figure pct00015
Figure pct00016
본 출원 전체적으로 다양한 간행물이 언급된다. 이들 간행물의 개시내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 상태를 더 완전하게 기재하기 위해 그들의 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.
앞의 언급으로부터 본 발명의 구체적 실시형태는 예시의 목적을 위해 본 명세서에 기재되었지만, 다양한 변형이 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의하는 경우를 제외하고 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California <120> PROTEIN BIOMARKERS FOR IMMUNE ASSESSMENT AND PREDICTION OF TRANSPLANT REJECTION <130> WO/2015/157546 <140> PCT/US2015/025164 <141> 2015-04-09 <150> US 61/977,567 <151> 2014-04-09 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Val Asn Phe Gln Lys Ala Ile Asn Glu Lys Leu Gly Gln Tyr Ala 1 5 10 15 Ser Pro Thr Ala Lys Arg Cys Cys Gln Asp Gly Val Thr Arg Leu Pro 20 25 30 Met Met Arg Ser Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Val Gln Gln Pro Asp 35 40 45 Cys Arg Glu Pro Phe Leu Ser Cys Cys Gln Phe Ala Glu Ser Leu Arg 50 55 60 Lys Lys Ser Arg Asp Lys Gly Gln Ala Gly Leu Gln Arg 65 70 75 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Cys Gln Asp Gly Val Thr Arg Leu Pro Met Met Arg Ser Cys Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Ala Arg Val Gln Gln Pro Asp Cys Arg Glu Pro Phe Leu 20 25 30 Ser Cys Cys Gln Phe Ala Glu Ser Leu Arg Lys Lys Ser 35 40 45 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Ala Lys Arg Cys Cys Gln Asp Gly Val Thr Arg Leu Pro Met Met 1 5 10 15 Arg Ser Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Val Gln Gln Pro Asp Cys Arg 20 25 30 Glu Pro Phe Leu Ser Cys Cys Gln Phe Ala Glu Ser Leu 35 40 45 <210> 4 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 260 265 <210> 5 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu 1 5 10 15 Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His 20 25 30 Val Asp Ala Leu 35 <210> 6 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 20 25 30 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 85 90 95 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 130 135 140 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg 145 150 155 160 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 210 215 220 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 225 230 235 240 Asn Thr Gln <210> 7 <211> 423 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Arg Met Leu Pro Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Phe Cys Pro Ala Val Leu Cys His Pro Asn Ser Pro Leu Asp Glu Glu 20 25 30 Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr His Val Asp Leu Gly 35 40 45 Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Lys Gln Leu 50 55 60 Val Leu Lys Ala Pro Asp Lys Asn Val Ile Phe Ser Pro Leu Ser Ile 65 70 75 80 Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala His Asn Thr Thr Leu 85 90 95 Thr Glu Ile Leu Lys Gly Leu Lys Phe Asn Leu Thr Glu Thr Ser Glu 100 105 110 Ala Glu Ile His Gln Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln 115 120 125 Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn Ala Met Phe Val Lys 130 135 140 Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu Asp Ala Lys Arg Leu 145 150 155 160 Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln Asp Ser Ala Ala Ala 165 170 175 Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly Thr Arg Gly Lys Ile 180 185 190 Thr Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Ser Gln Thr Met Met Val Leu Val 195 200 205 Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met Pro Phe Asp Pro Gln 210 215 220 Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys Lys Lys Trp Val Met 225 230 235 240 Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile Pro Tyr Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys Tyr Thr Gly Asn Ala 260 265 270 Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys Met Glu Glu Val Glu 275 280 285 Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp Arg Asp Ser Leu Glu 290 295 300 Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Ser Arg 305 310 315 320 Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu Gly Ile Glu Glu Ala 325 330 335 Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr Gly Ala Arg Asn Leu 340 345 350 Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Ala Val Leu Asp Val Phe Glu Glu 355 360 365 Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser 370 375 380 Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu 385 390 395 400 Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile Phe Phe Met Ser Lys 405 410 415 Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 420 <210> 8 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu 1 5 10 15 Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile Phe Phe Met Ser Lys 20 25 30 Val Thr Asn Pro Lys Gln 35 <210> 9 <211> 433 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Glu Arg Met Leu Pro Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Phe Cys Pro Ala Val Leu Cys His Pro Asn Ser Pro Leu Asp Glu Glu 20 25 30 Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr His Val Asp Leu Gly 35 40 45 Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Lys Gln Leu 50 55 60 Val Leu Lys Ala Leu Asp Lys Asn Val Ile Phe Ser Pro Leu Ser Ile 65 70 75 80 Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala His Asn Thr Thr Leu 85 90 95 Thr Glu Ile Leu Lys Ala Ser Ser Ser Pro His Gly Asp Leu Leu Arg 100 105 110 Gln Lys Phe Thr Gln Ser Phe Gln His Leu Arg Ala Pro Ser Ile Ser 115 120 125 Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn Ala Met Phe Val Lys 130 135 140 Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu Asp Ala Lys Arg Leu 145 150 155 160 Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln Asp Ser Ala Ala Ala 165 170 175 Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly Thr Arg Gly Lys Ile 180 185 190 Thr Asp Leu Ile Lys Asp Pro Asp Ser Gln Thr Met Met Val Leu Val 195 200 205 Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met Pro Phe Asp Pro Gln 210 215 220 Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys Lys Lys Trp Val Met 225 230 235 240 Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile Pro Tyr Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys Tyr Thr Gly Asn Ala 260 265 270 Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys Met Glu Glu Val Glu 275 280 285 Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp Arg Asp Ser Leu Glu 290 295 300 Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Ser Arg 305 310 315 320 Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu Gly Ile Glu Glu Ala 325 330 335 Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr Gly Ala Arg Asn Leu 340 345 350 Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Val Val Ser Asp Val Phe Glu Glu 355 360 365 Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser 370 375 380 Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu 385 390 395 400 Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile Phe Phe Met Ser Lys 405 410 415 Val Thr Asn Pro Ser Lys Pro Arg Ala Cys Ile Lys Gln Trp Gly Ser 420 425 430 Gln <210> 10 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys 1 5 10 15 Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala 20 25 30 Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn 35 40 45 Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln 50 55 60 Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser 65 70 75 80 Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr 85 90 95 His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro 100 105 110 Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn 115 120 125 Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu 130 135 140 Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys 145 150 155 160 Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu 165 170 175 Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys 180 185 190 Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu 195 200 205 Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val 210 215 220 Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val 225 230 235 240 Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys 245 250 255 Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala 260 265 270 Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu 275 280 285 Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp 290 295 300 Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr 305 310 315 320 Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe 325 330 335 Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys 340 345 350 Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly 355 360 365 Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile 370 375 380 Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu 385 390 395 400 Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr 405 410 415 Gln Lys <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val 1 5 10 15 Val Asn Pro Thr Gln Lys 20 <210> 12 <211> 500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Ser Arg Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Arg Ala Ser Ser Asn Pro Asn Ala Thr Ser Ser Ser Ser Gln 20 25 30 Asp Pro Glu Ser Leu Gln Asp Arg Gly Glu Gly Lys Val Ala Thr Thr 35 40 45 Val Ile Ser Lys Met Leu Phe Val Glu Pro Ile Leu Glu Val Ser Ser 50 55 60 Leu Pro Thr Thr Asn Ser Thr Thr Asn Ser Ala Thr Lys Ile Thr Ala 65 70 75 80 Asn Thr Thr Asp Glu Pro Thr Thr Gln Pro Thr Thr Glu Pro Thr Thr 85 90 95 Gln Pro Thr Ile Gln Pro Thr Gln Pro Thr Thr Gln Leu Pro Thr Asp 100 105 110 Ser Pro Thr Gln Pro Thr Thr Gly Ser Phe Cys Pro Gly Pro Val Thr 115 120 125 Leu Cys Ser Asp Leu Glu Ser His Ser Thr Glu Ala Val Leu Gly Asp 130 135 140 Ala Leu Val Asp Phe Ser Leu Lys Leu Tyr His Ala Phe Ser Ala Met 145 150 155 160 Lys Lys Val Glu Thr Asn Met Ala Phe Ser Pro Phe Ser Ile Ala Ser 165 170 175 Leu Leu Thr Gln Val Leu Leu Gly Ala Gly Glu Asn Thr Lys Thr Asn 180 185 190 Leu Glu Ser Ile Leu Ser Tyr Pro Lys Asp Phe Thr Cys Val His Gln 195 200 205 Ala Leu Lys Gly Phe Thr Thr Lys Gly Val Thr Ser Val Ser Gln Ile 210 215 220 Phe His Ser Pro Asp Leu Ala Ile Arg Asp Thr Phe Val Asn Ala Ser 225 230 235 240 Arg Thr Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Arg Val Leu Ser Asn Asn Ser Asp 245 250 255 Ala Asn Leu Glu Leu Ile Asn Thr Trp Val Ala Lys Asn Thr Asn Asn 260 265 270 Lys Ile Ser Arg Leu Leu Asp Ser Leu Pro Ser Asp Thr Arg Leu Val 275 280 285 Leu Leu Asn Ala Ile Tyr Leu Ser Ala Lys Trp Lys Thr Thr Phe Asp 290 295 300 Pro Lys Lys Thr Arg Met Glu Pro Phe His Phe Lys Asn Ser Val Ile 305 310 315 320 Lys Val Pro Met Met Asn Ser Lys Lys Tyr Pro Val Ala His Phe Ile 325 330 335 Asp Gln Thr Leu Lys Ala Lys Val Gly Gln Leu Gln Leu Ser His Asn 340 345 350 Leu Ser Leu Val Ile Leu Val Pro Gln Asn Leu Lys His Arg Leu Glu 355 360 365 Asp Met Glu Gln Ala Leu Ser Pro Ser Val Phe Lys Ala Ile Met Glu 370 375 380 Lys Leu Glu Met Ser Lys Phe Gln Pro Thr Leu Leu Thr Leu Pro Arg 385 390 395 400 Ile Lys Val Thr Thr Ser Gln Asp Met Leu Ser Ile Met Glu Lys Leu 405 410 415 Glu Phe Phe Asp Phe Ser Tyr Asp Leu Asn Leu Cys Gly Leu Thr Glu 420 425 430 Asp Pro Asp Leu Gln Val Ser Ala Met Gln His Gln Thr Val Leu Glu 435 440 445 Leu Thr Glu Thr Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ser Val 450 455 460 Ala Arg Thr Leu Leu Val Phe Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val 465 470 475 480 Leu Trp Asp Gln Gln His Lys Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr 485 490 495 Asp Pro Arg Ala 500 <210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Arg Thr Leu Leu Val Phe Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val 1 5 10 15 Leu Trp Asp Gln Gln His Lys Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr 20 25 30 Asp Pro Arg Ala 35 <210> 14 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Trp Arg Ser Phe Phe Lys Glu Ala Leu Gln Gly Val Gly Asp Met Gly 1 5 10 15 Arg Ala Tyr Trp Asp Ile Met Ile Ser Asn His Gln Asn Ser Asn Arg 20 25 30 Tyr Leu Tyr Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg Gly Pro Gly 35 40 45 Gly Val Trp Ala Ala Lys Leu Ile Ser Arg Ser Arg Val Tyr Leu Gln 50 55 60 Gly Leu Ile Asp Cys Tyr Leu Phe Gly Asn Ser Ser Thr Val Leu Glu 65 70 75 80 Asp Ser Lys Ser Asn Glu Lys Ala Glu Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys 85 90 95 Asp Pro Asp Arg Phe Arg 100 <210> 15 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Phe Pro Lys Glu Ser Asp Thr Ser Tyr Val Ser Leu Lys Ala Pro 1 5 10 15 Leu Thr Lys Pro Leu Lys Ala Phe Thr Val Cys Leu His Phe Tyr Thr 20 25 30 Glu Leu Ser Ser Thr Arg Gly Tyr Ser Ile Phe Ser Tyr Ala Thr Lys 35 40 45 Arg Gln Asp Asn Glu Ile Leu Ile Phe Trp Ser Lys Asp Ile Gly Tyr 50 55 60 Ser Phe Thr Val Gly Gly Ser Glu Ile Leu Phe Glu Val Pro Glu Val 65 70 75 80 Thr Val Ala Pro Val His Ile Cys Thr Ser Trp Glu Ser Ala Ser Gly 85 90 95 Ile Val Glu Phe Trp Val Asp Gly Lys Pro Arg Val Arg Lys Ser Leu 100 105 110 Lys Lys Gly Tyr Thr Val Gly Ala Glu Ala Ser Ile Ile Leu Gly Gln 115 120 125 Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly Asn Phe Glu Gly Ser Gln Ser Leu Val 130 135 140 Gly Asp Ile Gly Asn Val Asn Met Trp Asp Phe Val Leu Ser Pro Asp 145 150 155 160 Glu Ile Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Gly Pro Phe Ser Pro Asn Val Leu 165 170 175 <210> 16 <211> 299 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln 1 5 10 15 Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg 20 25 30 Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln 35 40 45 Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met 50 55 60 Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu 65 70 75 80 Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu 85 90 95 Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Cys 100 105 110 Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln 115 120 125 Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu 130 135 140 Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala 145 150 155 160 Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala 165 170 175 Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala 180 185 190 Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln 195 200 205 Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg 210 215 220 Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg 225 230 235 240 Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala 245 250 255 Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met 260 265 270 Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly 275 280 285 Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His 290 295 <210> 17 <211> 930 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Lys Pro Pro Arg Pro Val Arg Thr Cys Ser Lys Val Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Leu Ala Ile His Gln Thr Thr Thr Ala Glu Lys Asn Gly 20 25 30 Ile Asp Ile Tyr Ser Leu Thr Val Asp Ser Arg Val Ser Ser Arg Phe 35 40 45 Ala His Thr Val Val Thr Ser Arg Val Val Asn Arg Ala Asn Thr Val 50 55 60 Gln Glu Ala Thr Phe Gln Met Glu Leu Pro Lys Lys Ala Phe Ile Thr 65 70 75 80 Asn Phe Ser Met Ile Ile Asp Gly Met Thr Tyr Pro Gly Ile Ile Lys 85 90 95 Glu Lys Ala Glu Ala Gln Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Val Ala Lys Gly 100 105 110 Lys Ser Ala Gly Leu Val Lys Ala Thr Gly Arg Asn Met Glu Gln Phe 115 120 125 Gln Val Ser Val Ser Val Ala Pro Asn Ala Lys Ile Thr Phe Glu Leu 130 135 140 Val Tyr Glu Glu Leu Leu Lys Arg Arg Leu Gly Val Tyr Glu Leu Leu 145 150 155 160 Leu Lys Val Arg Pro Gln Gln Leu Val Lys His Leu Gln Met Asp Ile 165 170 175 His Ile Phe Glu Pro Gln Gly Ile Ser Phe Leu Glu Thr Glu Ser Thr 180 185 190 Phe Met Thr Asn Gln Leu Val Asp Ala Leu Thr Thr Trp Gln Asn Lys 195 200 205 Thr Lys Ala His Ile Arg Phe Lys Pro Thr Leu Ser Gln Gln Gln Lys 210 215 220 Ser Pro Glu Gln Gln Glu Thr Val Leu Asp Gly Asn Leu Ile Ile Arg 225 230 235 240 Tyr Asp Val Asp Arg Ala Ile Ser Gly Gly Ser Ile Gln Ile Glu Asn 245 250 255 Gly Tyr Phe Val His Tyr Phe Ala Pro Glu Gly Leu Thr Thr Met Pro 260 265 270 Lys Asn Val Val Phe Val Ile Asp Lys Ser Gly Ser Met Ser Gly Arg 275 280 285 Lys Ile Gln Gln Thr Arg Glu Ala Leu Ile Lys Ile Leu Asp Asp Leu 290 295 300 Ser Pro Arg Asp Gln Phe Asn Leu Ile Val Phe Ser Thr Glu Ala Thr 305 310 315 320 Gln Trp Arg Pro Ser Leu Val Pro Ala Ser Ala Glu Asn Val Asn Lys 325 330 335 Ala Arg Ser Phe Ala Ala Gly Ile Gln Ala Leu Gly Gly Thr Asn Ile 340 345 350 Asn Asp Ala Met Leu Met Ala Val Gln Leu Leu Asp Ser Ser Asn Gln 355 360 365 Glu Glu Arg Leu Pro Glu Gly Ser Val Ser Leu Ile Ile Leu Leu Thr 370 375 380 Asp Gly Asp Pro Thr Val Gly Glu Thr Asn Pro Arg Ser Ile Gln Asn 385 390 395 400 Asn Val Arg Glu Ala Val Ser Gly Arg Tyr Ser Leu Phe Cys Leu Gly 405 410 415 Phe Gly Phe Asp Val Ser Tyr Ala Phe Leu Glu Lys Leu Ala Leu Asp 420 425 430 Asn Gly Gly Leu Ala Arg Arg Ile His Glu Asp Ser Asp Ser Ala Leu 435 440 445 Gln Leu Gln Asp Phe Tyr Gln Glu Val Ala Asn Pro Leu Leu Thr Ala 450 455 460 Val Thr Phe Glu Tyr Pro Ser Asn Ala Val Glu Glu Val Thr Gln Asn 465 470 475 480 Asn Phe Arg Leu Leu Phe Lys Gly Ser Glu Met Val Val Ala Gly Lys 485 490 495 Leu Gln Asp Arg Gly Pro Asp Val Leu Thr Ala Thr Val Ser Gly Lys 500 505 510 Leu Pro Thr Gln Asn Ile Thr Phe Gln Thr Glu Ser Ser Val Ala Glu 515 520 525 Gln Glu Ala Glu Phe Gln Ser Pro Lys Tyr Ile Phe His Asn Phe Met 530 535 540 Glu Arg Leu Trp Ala Tyr Leu Thr Ile Gln Gln Leu Leu Glu Gln Thr 545 550 555 560 Val Ser Ala Ser Asp Ala Asp Gln Gln Ala Leu Arg Asn Gln Ala Leu 565 570 575 Asn Leu Ser Leu Ala Tyr Ser Phe Val Thr Pro Leu Thr Ser Met Val 580 585 590 Val Thr Lys Pro Asp Asp Gln Glu Gln Ser Gln Val Ala Glu Lys Pro 595 600 605 Met Glu Gly Glu Ser Arg Asn Arg Asn Val His Ser Gly Ser Thr Phe 610 615 620 Phe Lys Tyr Tyr Leu Gln Gly Ala Lys Ile Pro Lys Pro Glu Ala Ser 625 630 635 640 Phe Ser Pro Arg Arg Gly Trp Asn Arg Gln Ala Gly Ala Ala Gly Ser 645 650 655 Arg Met Asn Phe Arg Pro Gly Val Leu Ser Ser Arg Gln Leu Gly Leu 660 665 670 Pro Gly Pro Pro Asp Val Pro Asp His Ala Ala Tyr His Pro Phe Arg 675 680 685 Arg Leu Ala Ile Leu Pro Ala Ser Ala Pro Pro Ala Thr Ser Asn Pro 690 695 700 Asp Pro Ala Val Ser Arg Val Met Asn Met Lys Ile Glu Glu Thr Thr 705 710 715 720 Met Thr Thr Gln Thr Pro Ala Pro Ile Gln Ala Pro Ser Ala Ile Leu 725 730 735 Pro Leu Pro Gly Gln Ser Val Glu Arg Leu Cys Val Asp Pro Arg His 740 745 750 Arg Gln Gly Pro Val Asn Leu Leu Ser Asp Pro Glu Gln Gly Val Glu 755 760 765 Val Thr Gly Gln Tyr Glu Arg Glu Lys Ala Gly Phe Ser Trp Ile Glu 770 775 780 Val Thr Phe Lys Asn Pro Leu Val Trp Val His Ala Ser Pro Glu His 785 790 795 800 Val Val Val Thr Arg Asn Arg Arg Ser Ser Ala Tyr Lys Trp Lys Glu 805 810 815 Thr Leu Phe Ser Val Met Pro Gly Leu Lys Met Thr Met Asp Lys Thr 820 825 830 Gly Leu Leu Leu Leu Ser Asp Pro Asp Lys Val Thr Ile Gly Leu Leu 835 840 845 Phe Trp Asp Gly Arg Gly Glu Gly Leu Arg Leu Leu Leu Arg Asp Thr 850 855 860 Asp Arg Phe Ser Ser His Val Gly Gly Thr Leu Gly Gln Phe Tyr Gln 865 870 875 880 Glu Val Leu Trp Gly Ser Pro Ala Ala Ser Asp Asp Gly Arg Arg Thr 885 890 895 Leu Arg Val Gln Gly Asn Asp His Ser Ala Thr Arg Glu Arg Arg Leu 900 905 910 Asp Tyr Gln Glu Gly Pro Pro Gly Val Glu Ile Ser Cys Trp Ser Val 915 920 925 Glu Leu 930 <210> 18 <211> 1474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Gly Lys Asn Lys Leu Leu His Pro Ser Leu Val Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Pro Thr Asp Ala Ser Val Ser Gly Lys Pro Gln Tyr Met 20 25 30 Val Leu Val Pro Ser Leu Leu His Thr Glu Thr Thr Glu Lys Gly Cys 35 40 45 Val Leu Leu Ser Tyr Leu Asn Glu Thr Val Thr Val Ser Ala Ser Leu 50 55 60 Glu Ser Val Arg Gly Asn Arg Ser Leu Phe Thr Asp Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asn Asp Val Leu His Cys Val Ala Phe Ala Val Pro Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Asn Glu Glu Val Met Phe Leu Thr Val Gln Val Lys Gly Pro Thr Gln 100 105 110 Glu Phe Lys Lys Arg Thr Thr Val Met Val Lys Asn Glu Asp Ser Leu 115 120 125 Val Phe Val Gln Thr Asp Lys Ser Ile Tyr Lys Pro Gly Gln Thr Val 130 135 140 Lys Phe Arg Val Val Ser Met Asp Glu Asn Phe His Pro Leu Asn Glu 145 150 155 160 Leu Ile Pro Leu Val Tyr Ile Gln Asp Pro Lys Gly Asn Arg Ile Ala 165 170 175 Gln Trp Gln Ser Phe Gln Leu Glu Gly Gly Leu Lys Gln Phe Ser Phe 180 185 190 Pro Leu Ser Ser Glu Pro Phe Gln Gly Ser Tyr Lys Val Val Val Gln 195 200 205 Lys Lys Ser Gly Gly Arg Thr Glu His Pro Phe Thr Val Glu Glu Phe 210 215 220 Val Leu Pro Lys Phe Glu Val Gln Val Thr Val Pro Lys Ile Ile Thr 225 230 235 240 Ile Leu Glu Glu Glu Met Asn Val Ser Val Cys Gly Leu Tyr Thr Tyr 245 250 255 Gly Lys Pro Val Pro Gly His Val Thr Val Ser Ile Cys Arg Lys Tyr 260 265 270 Ser Asp Ala Ser Asp Cys His Gly Glu Asp Ser Gln Ala Phe Cys Glu 275 280 285 Lys Phe Ser Gly Gln Leu Asn Ser His Gly Cys Phe Tyr Gln Gln Val 290 295 300 Lys Thr Lys Val Phe Gln Leu Lys Arg Lys Glu Tyr Glu Met Lys Leu 305 310 315 320 His Thr Glu Ala Gln Ile Gln Glu Glu Gly Thr Val Val Glu Leu Thr 325 330 335 Gly Arg Gln Ser Ser Glu Ile Thr Arg Thr Ile Thr Lys Leu Ser Phe 340 345 350 Val Lys Val Asp Ser His Phe Arg Gln Gly Ile Pro Phe Phe Gly Gln 355 360 365 Val Arg Leu Val Asp Gly Lys Gly Val Pro Ile Pro Asn Lys Val Ile 370 375 380 Phe Ile Arg Gly Asn Glu Ala Asn Tyr Tyr Ser Asn Ala Thr Thr Asp 385 390 395 400 Glu His Gly Leu Val Gln Phe Ser Ile Asn Thr Thr Asn Val Met Gly 405 410 415 Thr Ser Leu Thr Val Arg Val Asn Tyr Lys Asp Arg Ser Pro Cys Tyr 420 425 430 Gly Tyr Gln Trp Val Ser Glu Glu His Glu Glu Ala His His Thr Ala 435 440 445 Tyr Leu Val Phe Ser Pro Ser Lys Ser Phe Val His Leu Glu Pro Met 450 455 460 Ser His Glu Leu Pro Cys Gly His Thr Gln Thr Val Gln Ala His Tyr 465 470 475 480 Ile Leu Asn Gly Gly Thr Leu Leu Gly Leu Lys Lys Leu Ser Phe Tyr 485 490 495 Tyr Leu Ile Met Ala Lys Gly Gly Ile Val Arg Thr Gly Thr His Gly 500 505 510 Leu Leu Val Lys Gln Glu Asp Met Lys Gly His Phe Ser Ile Ser Ile 515 520 525 Pro Val Lys Ser Asp Ile Ala Pro Val Ala Arg Leu Leu Ile Tyr Ala 530 535 540 Val Leu Pro Thr Gly Asp Val Ile Gly Asp Ser Ala Lys Tyr Asp Val 545 550 555 560 Glu Asn Cys Leu Ala Asn Lys Val Asp Leu Ser Phe Ser Pro Ser Gln 565 570 575 Ser Leu Pro Ala Ser His Ala His Leu Arg Val Thr Ala Ala Pro Gln 580 585 590 Ser Val Cys Ala Leu Arg Ala Val Asp Gln Ser Val Leu Leu Met Lys 595 600 605 Pro Asp Ala Glu Leu Ser Ala Ser Ser Val Tyr Asn Leu Leu Pro Glu 610 615 620 Lys Asp Leu Thr Gly Phe Pro Gly Pro Leu Asn Asp Gln Asp Asn Glu 625 630 635 640 Asp Cys Ile Asn Arg His Asn Val Tyr Ile Asn Gly Ile Thr Tyr Thr 645 650 655 Pro Val Ser Ser Thr Asn Glu Lys Asp Met Tyr Ser Phe Leu Glu Asp 660 665 670 Met Gly Leu Lys Ala Phe Thr Asn Ser Lys Ile Arg Lys Pro Lys Met 675 680 685 Cys Pro Gln Leu Gln Gln Tyr Glu Met His Gly Pro Glu Gly Leu Arg 690 695 700 Val Gly Phe Tyr Glu Ser Asp Val Met Gly Arg Gly His Ala Arg Leu 705 710 715 720 Val His Val Glu Glu Pro His Thr Glu Thr Val Arg Lys Tyr Phe Pro 725 730 735 Glu Thr Trp Ile Trp Asp Leu Val Val Val Asn Ser Ala Gly Val Ala 740 745 750 Glu Val Gly Val Thr Val Pro Asp Thr Ile Thr Glu Trp Lys Ala Gly 755 760 765 Ala Phe Cys Leu Ser Glu Asp Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr Ala 770 775 780 Ser Leu Arg Ala Phe Gln Pro Phe Phe Val Glu Leu Thr Met Pro Tyr 785 790 795 800 Ser Val Ile Arg Gly Glu Ala Phe Thr Leu Lys Ala Thr Val Leu Asn 805 810 815 Tyr Leu Pro Lys Cys Ile Arg Val Ser Val Gln Leu Glu Ala Ser Pro 820 825 830 Ala Phe Leu Ala Val Pro Val Glu Lys Glu Gln Ala Pro His Cys Ile 835 840 845 Cys Ala Asn Gly Arg Gln Thr Val Ser Trp Ala Val Thr Pro Lys Ser 850 855 860 Leu Gly Asn Val Asn Phe Thr Val Ser Ala Glu Ala Leu Glu Ser Gln 865 870 875 880 Glu Leu Cys Gly Thr Glu Val Pro Ser Val Pro Glu His Gly Arg Lys 885 890 895 Asp Thr Val Ile Lys Pro Leu Leu Val Glu Pro Glu Gly Leu Glu Lys 900 905 910 Glu Thr Thr Phe Asn Ser Leu Leu Cys Pro Ser Gly Gly Glu Val Ser 915 920 925 Glu Glu Leu Ser Leu Lys Leu Pro Pro Asn Val Val Glu Glu Ser Ala 930 935 940 Arg Ala Ser Val Ser Val Leu Gly Asp Ile Leu Gly Ser Ala Met Gln 945 950 955 960 Asn Thr Gln Asn Leu Leu Gln Met Pro Tyr Gly Cys Gly Glu Gln Asn 965 970 975 Met Val Leu Phe Ala Pro Asn Ile Tyr Val Leu Asp Tyr Leu Asn Glu 980 985 990 Thr Gln Gln Leu Thr Pro Glu Ile Lys Ser Lys Ala Ile Gly Tyr Leu 995 1000 1005 Asn Thr Gly Tyr Gln Arg Gln Leu Asn Tyr Lys His Tyr Asp Gly 1010 1015 1020 Ser Tyr Ser Thr Phe Gly Glu Arg Tyr Gly Arg Asn Gln Gly Asn 1025 1030 1035 Thr Trp Leu Thr Ala Phe Val Leu Lys Thr Phe Ala Gln Ala Arg 1040 1045 1050 Ala Tyr Ile Phe Ile Asp Glu Ala His Ile Thr Gln Ala Leu Ile 1055 1060 1065 Trp Leu Ser Gln Arg Gln Lys Asp Asn Gly Cys Phe Arg Ser Ser 1070 1075 1080 Gly Ser Leu Leu Asn Asn Ala Ile Lys Gly Gly Val Glu Asp Glu 1085 1090 1095 Val Thr Leu Ser Ala Tyr Ile Thr Ile Ala Leu Leu Glu Ile Pro 1100 1105 1110 Leu Thr Val Thr His Pro Val Val Arg Asn Ala Leu Phe Cys Leu 1115 1120 1125 Glu Ser Ala Trp Lys Thr Ala Gln Glu Gly Asp His Gly Ser His 1130 1135 1140 Val Tyr Thr Lys Ala Leu Leu Ala Tyr Ala Phe Ala Leu Ala Gly 1145 1150 1155 Asn Gln Asp Lys Arg Lys Glu Val Leu Lys Ser Leu Asn Glu Glu 1160 1165 1170 Ala Val Lys Lys Asp Asn Ser Val His Trp Glu Arg Pro Gln Lys 1175 1180 1185 Pro Lys Ala Pro Val Gly His Phe Tyr Glu Pro Gln Ala Pro Ser 1190 1195 1200 Ala Glu Val Glu Met Thr Ser Tyr Val Leu Leu Ala Tyr Leu Thr 1205 1210 1215 Ala Gln Pro Ala Pro Thr Ser Glu Asp Leu Thr Ser Ala Thr Asn 1220 1225 1230 Ile Val Lys Trp Ile Thr Lys Gln Gln Asn Ala Gln Gly Gly Phe 1235 1240 1245 Ser Ser Thr Gln Asp Thr Val Val Ala Leu His Ala Leu Ser Lys 1250 1255 1260 Tyr Gly Ala Ala Thr Phe Thr Arg Thr Gly Lys Ala Ala Gln Val 1265 1270 1275 Thr Ile Gln Ser Ser Gly Thr Phe Ser Ser Lys Phe Gln Val Asp 1280 1285 1290 Asn Asn Asn Arg Leu Leu Leu Gln Gln Val Ser Leu Pro Glu Leu 1295 1300 1305 Pro Gly Glu Tyr Ser Met Lys Val Thr Gly Glu Gly Cys Val Tyr 1310 1315 1320 Leu Gln Thr Ser Leu Lys Tyr Asn Ile Leu Pro Glu Lys Glu Glu 1325 1330 1335 Phe Pro Phe Ala Leu Gly Val Gln Thr Leu Pro Gln Thr Cys Asp 1340 1345 1350 Glu Pro Lys Ala His Thr Ser Phe Gln Ile Ser Leu Ser Val Ser 1355 1360 1365 Tyr Thr Gly Ser Arg Ser Ala Ser Asn Met Ala Ile Val Asp Val 1370 1375 1380 Lys Met Val Ser Gly Phe Ile Pro Leu Lys Pro Thr Val Lys Met 1385 1390 1395 Leu Glu Arg Ser Asn His Val Ser Arg Thr Glu Val Ser Ser Asn 1400 1405 1410 His Val Leu Ile Tyr Leu Asp Lys Val Ser Asn Gln Thr Leu Ser 1415 1420 1425 Leu Phe Phe Thr Val Leu Gln Asp Val Pro Val Arg Asp Leu Lys 1430 1435 1440 Pro Ala Ile Val Lys Val Tyr Asp Tyr Tyr Glu Thr Asp Glu Phe 1445 1450 1455 Ala Ile Ala Glu Tyr Asn Ala Pro Cys Ser Lys Asp Leu Gly Asn 1460 1465 1470 Ala

Claims (21)

  1. 환자에서 실질기관 이식편 거부(solid organ graft rejection)에 대한 감수성(susceptibility)을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 환자로부터 얻은 샘플에서 보체 C4 아나필라톡신(C4A)의 5킬로달톤(kDa) 단편의 양을 측정하는 단계;
    (b) 상기 C4A의 5kDa 단편의 양을 대조군 샘플 중의 양과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)에서의 비교하는 단계가 상기 대조군 샘플에 비해 상기 환자 샘플에서 C4A의 5kDa 단편의 양의 증가를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 환자로부터 얻은 상기 샘플을 상기 C4A의 5kDa 단편에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 아포지방단백질 A1(ApoA1) 및/또는 α-1 항-키모트립신 C 말단 단편(AACT)의 양을 측정하는 단계를 더 포함하고, 상기 검출하는 단계는 상기 비교하는 단계가 상기 대조군 샘플에 비해 상기 환자 샘플에서 ApoAI 및/또는 AACT 양의 감소를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 더 포함하는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (b) 및 (c)의 접촉시키는 단계 및 비교하는 단계는 상기 환자 샘플을 ApoA1 및 AACT에 결합하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 환자 샘플을 표 1에 열거된 2 이상의 마커를 포함하는 마커의 세트에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 마커의 세트는 8개 이하의 표 1에 열거된 마커로 이루어진, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 다음의 마커(C1 프로테아제 저해제, 혈청 아밀로이드 A, C-반응성 단백질, 아포지방단백질 E, 알파-1-항트립신(A1AT))는 대조군에 비해 증가되고/되거나 다음의 마커(AACT, ApoA1, 번역후 변형된 ApoA1, 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4, 알파-2-마크로글로불린)는 대조군에 비해 감소되는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 차이는 대조군에 비해 적어도 10%의 감소인, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 차이는 대조군에 비해 적어도 10%의 증가인, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 면역분석법을 포함하는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 질량분석법을 포함하는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 시약은 항체, 핵산 프로브 또는 합성 프로브인, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 실질기관 이식편 거부는 급성 세포성 신장 동종이식편 거부반응인, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 거부의 검출은 적어도 90% 민감성 및 적어도 90% 특이성을 나타내는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  15. 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 상기 환자로부터 얻은 샘플을, 보체 C4 아나필라톡신(C4A)의 5191 달톤 단편, α-1 항-키모트립신 C 말단 단편(AACT), 및 아포지방단백질 A1(Apo A1)으로 이루어지고; 선택적으로 추가로 보체 C1 저해제(C-inh), 알파-1-항트립신(A1AT), 혈청 아밀로이드 A(SAA), C 반응성 단백질(CRP), 아포지방단백질 E (ApoE), 인터-알파-트립신 저해제 중쇄 H4(ITIH4), 및/또는 알파-2-마크로글로불린(A2M)으로 이루어진 마커의 세트에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시약과 상기 샘플 사이의 특이적 결합의 양을 측정하는 단계;
    (c) (b)에서의 특이적 결합의 양을 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 (c)에서의 비교하는 단계가 대조군 샘플에 비해 C4A의 5191 달톤 단편의 증가 또는 AACT 및/또는 ApoAI 감소를 나타낼 때 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 실질기관 이식편 거부에 대한 감수성을 검출하는 방법.
  16. C4A의 5kDa 단편, ApoA1, AACT, 및, 선택적으로, C-inh, A1AT, SAA, CRP, ApoE, ITIH4, 및 A2M으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체가 고정된 고체 지지체를 더 포함하는 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 고체 지지체는 마이크로타이터 플레이트인, 키트.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체는 상기 고체 지지체에 고정된 항원에 대한 결합을 통해 고정된, 키트.
  20. 제17항에 있어서, 상기 항체는 비드 또는 입자에 대한 결합을 통해 고정되는, 키트.
  21. 제17항에 있어서, 색원체 기질을 더 포함하는, 키트.
KR1020167031144A 2014-04-09 2015-04-09 면역평가 및 이식거부의 예측을 위한 단백질 바이오마커 KR20160142390A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461977567P 2014-04-09 2014-04-09
US61/977,567 2014-04-09
PCT/US2015/025164 WO2015157546A1 (en) 2014-04-09 2015-04-09 Protein biomarkers for immune assessment and prediction of transplant rejection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160142390A true KR20160142390A (ko) 2016-12-12

Family

ID=54288409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167031144A KR20160142390A (ko) 2014-04-09 2015-04-09 면역평가 및 이식거부의 예측을 위한 단백질 바이오마커

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10451636B2 (ko)
EP (1) EP3129781A4 (ko)
JP (1) JP2017513009A (ko)
KR (1) KR20160142390A (ko)
AU (1) AU2015243424A1 (ko)
CA (1) CA2944990A1 (ko)
WO (1) WO2015157546A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019178143A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 The Regents Of The University Of California Assessing transplant rejection status by analysis of t-cell receptor subunit repertoire diversity

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3732487A1 (en) * 2017-12-27 2020-11-04 Vito NV Biomarkers for typing allograft recipients
CN112375138B (zh) * 2020-11-13 2022-12-13 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种重组载脂蛋白e和应用
WO2023212285A1 (en) * 2022-04-28 2023-11-02 Children's Hospital Medical Center Methods for predicting and treating chronic lung allograft dysfunction

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030104371A1 (en) 1997-09-24 2003-06-05 Strom Terry B. Methods of evaluating transplant rejection
GB0018614D0 (en) 2000-07-28 2000-09-13 Rose Marlene L Organ transplant rejection and associated conditions
US7026121B1 (en) 2001-06-08 2006-04-11 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
AU2003281287A1 (en) 2002-07-04 2004-01-23 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd Toxicity markers
AU2003275363A1 (en) 2002-10-01 2004-04-23 The Johns Hopkins University Use of biomarkers for detecting acute renal transplant rejection
GB0419728D0 (en) * 2004-09-06 2004-10-06 Novartis Ag Organic compounds
US7645575B2 (en) 2004-09-08 2010-01-12 Xdx, Inc. Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders
US7666596B2 (en) 2005-05-23 2010-02-23 University Of Alberta Tissue rejection
WO2007084446A2 (en) 2006-01-13 2007-07-26 Renovar Incorporated Systems and methods for monitoring immune responses and predicting outcomes in transplant recipients
GB0605217D0 (en) 2006-03-15 2006-04-26 Novartis Ag Method and compositions for assessing acute rejection
GB0607943D0 (en) 2006-04-21 2006-05-31 Novartis Ag Biomarkers for chronic transplant dysfunction
US20100104581A1 (en) 2006-05-25 2010-04-29 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods for Diagnosing and Treating Graft Rejection and Inflammatory Conditions
WO2008084331A2 (en) 2006-06-21 2008-07-17 Hopitaux Universitaires De Geneve Biomarkers for renal disorders
US7993832B2 (en) 2006-08-14 2011-08-09 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders
WO2008027428A2 (en) 2006-08-28 2008-03-06 Source Precision Medicine Gene expression profiling for identification, monitoring and treatment of transplant rejection
GB0617429D0 (en) 2006-09-05 2006-10-18 Electrophoretics Ltd Markers of renal transplant rejection and renal damage
US8039227B2 (en) 2007-09-20 2011-10-18 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Peptide biomarkers predictive of renal function decline and kidney disease
US8003333B2 (en) * 2007-09-28 2011-08-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Serum biomarkers for early detection of acute cellular rejection
WO2009045104A1 (en) 2007-10-05 2009-04-09 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Method for diagnosing presymptomatic organ transplant rejection
EP2088205A1 (en) 2008-02-11 2009-08-12 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) PSMB10: A diagnosis marker and therapeutic target of chronic rejection.
WO2009114699A2 (en) 2008-03-12 2009-09-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High molecular weight ngal as a biomarker for chronic kidney disease
EP2131200A1 (en) 2008-06-04 2009-12-09 BRAHMS Aktiengesellschaft A marker for graft failure and mortality
ES2434996T3 (es) 2008-10-31 2013-12-18 St Vincent's Hospital Sydney Limited Métodos de pronóstico en enfermedad renal crónica
WO2010070043A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Biomarkers for the diagnosis of renal allograft and kidney status
CA2770259A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Rules-Based Medicine, Inc. Methods and devices for detecting obstructive uropathy and associated disorders
JP5998055B2 (ja) 2010-02-05 2016-09-28 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
WO2012102963A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Urine biomarkers for prediction of recovery after acute kidney injury : proteomics
EP2518512A1 (en) 2011-04-29 2012-10-31 Medizinische Universität Wien Method for indicating a renal disease in a patient by determining at least one protein in isolated HDL
US20130052665A1 (en) * 2011-08-25 2013-02-28 Bruce Xuefeng Ling Methods for diagnosis of systemic juvenile idiopathic arthritis
US20140038203A1 (en) 2012-07-09 2014-02-06 Musc Foundation For Research Development Methods for detecting or predicting kidney disease

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019178143A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 The Regents Of The University Of California Assessing transplant rejection status by analysis of t-cell receptor subunit repertoire diversity

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015157546A1 (en) 2015-10-15
US20170030928A1 (en) 2017-02-02
US10451636B2 (en) 2019-10-22
AU2015243424A1 (en) 2016-10-27
EP3129781A4 (en) 2017-10-11
CA2944990A1 (en) 2015-10-15
JP2017513009A (ja) 2017-05-25
EP3129781A1 (en) 2017-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9134326B2 (en) Biomarkers for liver fibrosis
US8394601B2 (en) Peptide biomarkers predictive of renal function decline and kidney disease
US9095549B2 (en) Diagnosis and prognosis of colorectal cancer
US8741662B2 (en) Albumin-bound protein/peptide complex as a biomarker for disease
KR101788414B1 (ko) 간암 조기 진단용 바이오마커 및 그 용도
CN109564225B (zh) 作为指示不良事件的标志物的组蛋白和/或proADM
O'Riordan et al. Urinary proteomic analysis of chronic allograft nephropathy
KR20160142390A (ko) 면역평가 및 이식거부의 예측을 위한 단백질 바이오마커
Ziegler et al. Apolipoprotein A1 and C-terminal fragment of α-1 antichymotrypsin are candidate plasma biomarkers associated with acute renal allograft rejection
US8642347B2 (en) Urinary CA125 peptides as biomarkers of ovarian cancer
KR102328932B1 (ko) 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단 또는 예측을 위한 소변 엑소좀 바이오마커
KR102039816B1 (ko) 신장이식 후 이식 장기의 섬유증 진단 또는 예측용 바이오마커
KR101390543B1 (ko) 췌장암 진단용 마커 및 이의 용도
WO2011028960A1 (en) Biomarkers for neurological conditions
EP2391653B1 (en) Biomarkers associated with nephropathy
KR101274835B1 (ko) 만성 폐쇄성 폐질환의 급성 악화 진단용 바이오마커 조성물 및 바이오마커 검출 방법
US20130236917A1 (en) Albumin-bound protein/peptide complex as a biomarker for disease
KR102131860B1 (ko) 아르기닌이 메틸화된 ggt1에 특이적으로 결합하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물
KR102519913B1 (ko) 췌장 신경내분비 종양 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 췌장 신경내분비 종양 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법
EP3961218A1 (en) Composition and kit for detecting testican-1 for identifying exposure to particulate matter in lung and method using the same
US20210063394A1 (en) Methods and compositions for diagnosis of rickettsia infection
KR20080091234A (ko) 신장 질환의 진단 방법 및 이를 위한 마커
Füldner The urine proteome of kidney transplant patients: A new approach for the identification of non-invasive rejection markers
Nomura et al. The Comprehensive Proteomic Analyses for the Discovery of Novel Markers of Alcohol Abuse