KR20160141906A - 신생 혈관 형성 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CCR4-NOT transcription complex subunit 2 (CNOT2) 유전자의 신규 용도에 관한 것이다.
CNOT2 유전자는 세포 내 신생혈관형성을 조절하고 신생혈관형성 유전자들의 발현을 촉진시킴으로써 비정상적 신생혈관형성에 영향을 주는바, CNOT2 유전자 억제제로 이 유전자의 발현을 저해하여 신생혈관형성 관련 질환의 유발을 억제시키는 작용 효과를 가질 수 있고, 또한 신생혈관형성 관련 질환의 진단 또는 치료제의 표적 유전자로 활용될 수 있다.

Description

신생 혈관 형성 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ANGIOGENESIS RELATED DISEASE}

본 발명은 CNOT2 유전자의 신규 용도에 관한 것이다.

신생혈관형성(Angiogenesis)이란 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 일련의 과정으로, 배 발생과 같은 초기 발생과정과, 상처 치유와 같은 인체 방어 현상에 있어서 중요한 역할을 한다. 정상적인 상태에서는 신생혈관형성의 유도물질과 억제물질이 상호 정교하게 작용하여 조절되지만, 정상적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장하게 되면 암, 류마티스성 관절염 및 당뇨병성 실명증 등 여러 질환을 야기한다.

특히, 암세포는 신생혈관형성을 통해 영양분을 공급받고 다른 장기로 전이하기 때문에, 신생혈관형성은 암의 성장과 전이에 필수적이다. 실제 여러 종류의 암에서, 암조직에 형성된 모세혈관의 밀도와 암의 전이 가능성 간에는 밀접한 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 염증성 질환의 대표적인 질환인 류마티스성 관절염은 자가면역 이상이 원인이지만, 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 신생혈관형성을 유도하여 연골이 파괴된다. 해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 많은 안과질환도 신생혈관형성이 원인이 되고 있다. 대표적인 예인 당뇨병성 실명증은 당뇨병의 합병증으로, 망막에 있는 모세혈관이 신생혈관형성을 통해 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 된다. 따라서, 신생혈관형성 억제물질은 신생혈관형성이 지속적으로 일어나는 암, 류마티스성 관절염 및 당뇨병성 실명증등의 여러 질병의 치료제 및 예방제로 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 종래에는 신생혈관형성을 억제하기 위해서 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달의 억제에 관한 연구가 활발하였다. 그러나 종래기술에서는 초기에는 신생혈관형성이 억제되는듯한 양상을 보이다가, 이후에 암세포로 항암제가 전달되는 경로까지 억제하여 결국은 암세포가 더욱 공격적으로 변하는 부작용이 존재하였다.

이러한 배경 하에, 신생혈관형성 억제제를 통해 신생혈관 형성 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 연구개발이 수행될 필요성이 있다.

본 발명은 CNOT2 유전자 억제제를 유효성분으로 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 CNOT2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자는 신생혈관형성과 관련된 질환을 진단하고 예방하며 치료할 수 있는 새로운 방법을 연구하던 중, CCR4-NOT transcription complex subunit 2 (CNOT2) 유전자가 신생혈관형성을 조절하고 신생혈관형성 관련 유전자들의 발현을 촉진시킴으로써 신생혈관형성 관련 질환을 유발할 수 있다는 기작을 최초로 확인하여, 신생혈관형성에 있어서 CCR4-NOT transcription complex subunit 2 (CNOT2) 유전자 관련 신규 용도를 규명하였다.

이에 따라, 본 발명은 CNOT2 유전자 억제제를 유효성분으로 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 CNOT2 유전자 억제제는 CNOT2 유전자의 발현을 억제하여 신생혈관형성을 억제하고, 신생혈관형성 관련 유전자들의 발현을 억제시킴으로써 신생혈관형성과 관련된 질환을 조절하는 효과가 우수하므로, 신생혈관형성 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 예방은 본 발명의 조성물의 투여로 신생혈관형성 관련 질환의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 치료는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 CNOT2 유전자는 인간(NCBI Gene ID BC002597), 마우스(NCBI Gene ID BC063105 등 다양한 종에 존재하는 유전자이다. CNOT2 유전자는 CCR4-NOT transcription Complex를 구성하는 subunit 중 하나로, yeast, 인간 등에서 확인된다. CCR4-NOT transcription complex는 CNOT1, CNOT2, CNOT3, CNOT6, CNOT7, CNOT8, CNOT9, CNOT10, CNOT11 등의 subunit을 포함하며, 각각의 유전자마다 담당하는 기능이 다르다. CNOT2, CNOT4 및 CNOT8은 CNOT1과 interaction하는 반면, CNOT3은 CNOT1과 binding 하지 않고 CNOT8과 binding 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 CNOT2 유전자 억제제는 CNOT2 단백질을 코딩하는 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA) 또는 shRNA(small hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 CNOT2 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다.

본 발명에서 안티센스 서열은 CNOT2 mRNA에 상보적이고 CNOT2 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, CNOT2 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성할 수 있다. 또한, 생체 내에서 올리고뉴클레오티드를 합성시키는 물질을 투여하여서도 합성할 수 있다.

시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 일 예는 RNA 중합효소 I을 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 일 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 siRNA는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법 또는 유전자 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(CNOT2 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(CNOT2 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 CNOT2 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출구조 모두 가능하다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 시험관내 또는 생체내에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명에서 shRNA는 small hairpin RNA 혹은 short hairpin RNA (shRNA)를 의미하며, RNA 간섭으로 유전자의 발현을 침묵(silencing)시킬 때 사용하는 작은 hairpin 구조를 가진 RNA이다.

shRNA는 벡터를 이용하여 세포로 도입되며, shRNA hairpin 구조는 세포 내 다른 물질에 의하여 절단되어 siRNA가 되는데 이 siRNA가 RNA induced silencing complex (RISC)와 결합하게 되고, 이 결합체(complex)는 siRNA와 서열이 맞는 부분을 가진 mRNA에 달라붙어서 그 mRNA를 절단하고, 그 결과 mRNA가 파괴되므로 그 유전자 발현이 되지 않게 되어 유전자 침묵이 일어나게 된다.

본 발명에서 CNOT2 유전자 억제제는 바람직하게는 siRNA, 또는 shRNA일 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 siRNA일 수 있으며, 서열번호 3 또는 4의 shRNA일 수 있다.

본 발명에서 신생혈관형성은 이미 존재하는 혈관으로부터 미세혈관이 생성되는 것을 의미하며, 비정상적인 신생혈관형성은 여러 질환의 원인이 된다. 신생혈관형성 관련 질환은 예를 들어, 암, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 실명증, 황반변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 망막 변성, 만성 염증성 관절염, 골 관절염, 자가면역 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게, 신생혈관 형성 관련 질환은 암이며, 유방암, 간암, 방광암, 췌장암, 난소암 또는 전립선암으로부터 선택되는 암 중 어느 하나일 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 특히, 유방암 및 난소암에 현저한 예방 및 치료 효과를 보인다.

상기와 같이 본 발명에 따른 CNOT2 유전자 억제제는 CNOT2 유전자를 억제함으로써 신생 혈관 형성을 조절 또는 억제할 수 있으므로, CNOT2 유전자 억제제를 유효성분으로 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 CNOT2 유전자 억제제를 포함하는 약학 조성물은 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 제형화하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 과립제, 산제, 캡슐제, 트로키, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 예를 들어, 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오즈, 덱스트로오즈, 수크로오즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 의약으로서, 신생혈관형성 관련 질환 치료제로서 사용할 수 있고, 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 특히 주사 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 예를 들면, 구강, 비강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하, 흡입 또는 국소 투여가 가능하며, 이들로 한정되지 않는다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스 및 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용할 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 포함되며, 상기 액상 제제에는 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 첨가제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 상기 비수성용제와 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등을 사용할 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 연령 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로, 및 기간에 따라 다르며, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 CNOT2 유전자 억제제의 약학적으로 유효한 양은 0.5∼100 ㎎/day/체중㎏, 바람직하게는 0.5∼5 ㎎/day/체중㎏이다. 본 발명의 CNOT2 유전자 억제제는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 환자의 조건에 따라 적절히 변화될 수 있으므로, 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있으며 의약품 외에도 보충제, 의약부외품 등으로도 사용할 수 있다.

본 발명은 CNOT2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 CNOT2 유전자의 발현량을 측정함으로써 신생혈관형성 관련 질환의 진단이 가능하다.

본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 상기 프로브 또는 프라이머는 CNOT2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 특징이 있으며, 본 발명에서 언급한 CNOT2 유전자의 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6 일 수 있다.

상기 진단은 병리 상태를 확인하는 것을 나타내는 용어로서, 본 발명에서의 진단은 CNOT2 유전자의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 신생혈관형성 관련 질환의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 진단용 조성물은 본 발명의 CNOT2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머 이외에도 상기 프로브 또는 프라이머의 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함할 수 있으며, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태로 제공될 수 있다.

본 발명에서, 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미한다. 상기 프로브는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고 타겟 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 포함한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에서, 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하며, 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 및 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 신생혈관형성 관련 질환 진단용 조성물이 키트의 구성 요소로써 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예를 들어, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) CNOT2 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 CNOT2 유전자의 발현양, CNOT2 단백질의 양 또는 CNOT2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, CNOT2 유전자의 발현양, CNOT2 단백질의 양 또는 CNOT2 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료를 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 먼저 CNOT2 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 상기 시료는 CNOT2 유전자의 발현량, CNOT2 단백질의 양 또는 CNOT2 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

이후, 시료가 처리된 세포에서 CNOT2 유전자의 발현량, CNOT2 단백질의 양 또는 CNOT2 단백질의 활성을 측정할 수 있다. CNOT2 유전자의 발현량, CNOT2 단백질의 양 또는 CNOT2 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들면, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), tube formation 등을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

측정 결과, CNOT2 유전자의 발현량, CNOT2 단백질의 양 또는 CNOT2 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 신생혈관형성 관련 질환의 치료 또는 예방용 물질로 판정될 수 있다.

CNOT2 유전자는 세포 내 신생혈관형성을 조절하고 신생혈관형성 유전자들의 발현을 촉진시킴으로써 비정상적 신생혈관형성에 영향을 주는바, CNOT2 유전자 억제제로 이 유전자의 발현을 저해하여 신생혈관형성 관련 질환의 유발을 억제시키는 작용 효과를 가질 수 있고, 또한 CNOT2 유전자는 신생혈관형성 관련 질환의 진단 또는 치료제의 표적 유전자로 활용될 수 있다.

도 1은 정상 조직 및 암조직에서 CNOT2의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 CNOT2 유전자 발현 억제에 따른 세포 증식 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 CNOT2 발현 변화에 따른 혈관 형성 관련 유전자들의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 CNOT2 발현 변화에 따른 혈관 형성 및 Migration 변화를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>. 여러 암 세포주 및 정상 세포에서 CNOT2의 발현 확인

1. 정상 세포 주 및 암세포 중에서의 CNOT 단백질 발현 확인

정상 췌장 세포(HIT-15), 췌장암 세포주(BXPC-3), 정상 전립선 세포(RWPE-1), 전립선암 세포주(PC-3, LNcap), 정상 유방 세포(MCF-10A), 및 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-231 cells)에서 CNOT2의 발현량을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 1의 A에 나타내었다.

도 1의 A에서 확인되는 바와 같이, 정상세포주에서는 CNOT2의 발현량이 매우 낮은 반면, 췌장암, 전립선암, 유방암 세포주에서 CNOT2 유전자 발현이 크게 증가된 것이 확인되었다.

2. 조직 검정을 통한 CNOT2 발현 확인

또한, 조직 검정(Tissue array)을 통해 유방암, 췌장암, 전립선암, 간암, 방광암 및 난소암 조직에서 CNOT2의 발현 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 1의 B에 나타내었다.

도 1의 B에서 확인되는 바와 같이, CNOT2의 발현량이 정상조직과 대비하여 모든 암 조직에서 증가되는 것이 확인되었다.

3. 면역 조직 화학법을 통한 CNOT 2 발현 확인

또한, 상기 조직 검정 조직 중 유방 조직 및 난소 조직에 대하여 면역조직화학법 (IHC)을 수행하여, CNOT2의 발현을 확인하였다.

조직을 포르말린으로 고정하고, 파라핀으로 포매한 FFPEs(paraffin-embedded tissues)를 4μm 두께로 섹션하고, 제조사의 프로토콜에 따라 벤타나 자동 면역염색기(Ventana automated immunostainner)(Ventana Medical Systems,Tucson, AZ)를 이용하여 염색하였다. 섹션된 슬라이드들을 60℃에서 1시간동안 건조시키고, EZ 프렙(EZ Prep)(Ventana Medical Systems)을 이용하여 75℃에서 4분 동안 탈파라핀화(deparaffinized)하였다. 세포 컨디셔닝(열 전처리)은 Tris/Borate/EDTA를 포함한 CCl 용매에서 20분 동안 100℃ 온도에서 이루어졌다. CNOT2 항체를 사용하였으며, 42℃에서 2시간 동안 인큐베이트 하였다. 시그날은 i-view 검출 키트(detectionkit)(Ventana Medical Systems)를 사용하여 LSAB(labelled streptavidin-biotin) 방법에 기초하여 검출하였다. 키트의 각 단계는 37˚C에서 억제제의 처리(1% H₂O₂, 4분), 바이오티닐레이티드(biotinylated) Ig(8분), 스트렙 타비딘-HRP(Streptavidin-Horseradish peroxydase, 8분), DAB(chromogen+substrate, 8분)와 코퍼(Copper,4분)로 구성되었다. 또한, 대조염색(Counterstaining)은 메이어의 헤마토자일린(Mayer'shematoxylin)(ScyTek, Logan, UT)으로 상온에서 2분 동안 행하였다.

그 결과를 도 1의 C에 나타내었다. 도 1의 C에서 확인되는 바와 같이, 정상 유방 조직 또는 정상 난소조직과 대비하여 유방암 또는 난소암 조직 각각에서 CNOT2가 증가되는 것이 확인되었다.

< 실시예 2> CNOT2 유전자 억제에 의한 세포 증식 변화의 확인

1. siRNA 처리된 세포에서 세포증식 억제 확인

CNOT2 유전자 Knockdown을 위하여, siRNA를 이용하여 각각 CNOT2 유전자의 발현을 억제하였다. siRNA로 Knockdown을 위하여, CNOT2 siRNA(서열 번호 1: sense sequence- GUUGGACCUUUCAGAUUUUU, 서열번호 2: anstisense seqeunce- AAAUCUGAAAGGUCCAAUCUU) (Thermo scientific 회사, 미국) 및 control siRNA(바이오니아, 한국)를 구매하고, 제조업체의 설명서에 따라 lipofetamine 2000을 이용하여 CNOT2 siRNA (Thermo scientific 회사, 미국) 및 control siRNA(바이오니아, 한국)를 MDA-MB-231 세포에 트랜스펙션하였다. 그 다음날 신선한 배지로 바꿔주고 세포를 유지시켰다. 실시간 세포 분석(Real-Time Cell Analyzer, RTCA) DP (Roche)를 이용하여 세포 증식 변화를 확인하였다.

그 결과를 도 2의 A에 나타내었다. 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, CNOT2 siRNA를 처리한 세포군의 경우, 세포 증식이 억제되었음이 확인되었다.

2. shRNA 처리된 MDA -MB- 231세포 및 MCF -7 세포에서 세포증식 억제 확인

CNOT2 유전자 Knockdown을 위하여, shRNA (서열 번호 3 shRNA#1 CCGGCGGGTTACTAACATTCCTCAACTCGAGTTGAGGAATGTTAGTAACCCGTTTTT, 서열번호 4: shRNA#2 CCGGATGAATGGAGGAGACGTATTACTCGAGTAATACGTCTCCTCCATTCATTTTTTG)를 이용하여 각각 CNOT2 유전자의 발현을 억제하였다. shRNA로 Knockdown을 위하여, CNOT2 shRNA를 sigma에서 구입한 후, 제조업체의 설명서에 따라 MDA-MB-231 세포주와 MCF-7 세포주에서 CNOT2가 결핍된 shRNA CNOT2 세포주를 제조하였다. CNOT2 shRNA stable MDA-MB-231 세포주와 MCF-7 세포주에서, 씨딩 후 1일부터 7일까지의 세포수를 측정하여 세포 증식 정도를 확인하였다.

그 결과를 도 2의 B에 나타내었다. 도 2의 B에서 확인되는 바와 같이, CNOT2가 억제된 Stable cell line인 MDA-MB-231 세포주와 MCF-7 세포주에서 모두 세포 증식이 억제되는 것이 확인되었다.

3. Cyclin D 발현 억제 효과 확인

상기 shRNA 처리된 MDA-MB-231 세포주에서 세포증식 마커인 cyclin D1의 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하여, 그 결과를 도 2의 C에 나타내었다.

도 2의 C에 나타낸 바와 같이, CNOT2 유전자가 억제된 Stable cell line인 MDA-MB-231 세포주에서 cyclin D1의 발현이 저해되는 것이 확인되었다.

< 실시예 3> CNOT2의 발현량 변화에 따른 신생혈관형성 관련 인자의 발현량 변화 확인

1. mRNA 검정을 통한 유전자 발현 변화 확인

상기 실시예 ２에서 CNOT2 siRNA로 트랜스펙션된 MDA-MB-231 세포를 이용하여, mRNA 검정(바이오니아)을 수행하여, 변화되는 유전자들의 기능을 분석하였다.

그 결과를 도 3의 A에 나타내었으며, 신생혈관형성 기능을 갖는 유전자가 가장 많이 변화되는 것을 확인하였다.

도 3의 B에는 발현이 감소되는 10개의 유전자들을 나열하였다.

2. 혈관 형성 인자의 발현 변화 확인

상기 실시예 2에서 제조된 CNOT2 siRNA 처리된 MDA-MB-231 세포 및 CNOT2 shRNA 처리된 MDA-MB-231 세포에서 CNOT2, HIF2, 및 VEGF 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하였다.

RT-PCR을 수행하기 위하여, 세포에 TRIzol reagent (Life Technologies)를 부가하여 제조업체의 설명서에 따라 RNA를 추출한 후, 2ug의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 그리고 바이오니아 회사를 통해서 mRNA array를 보낸 후 결과를 받았다. 확인을 위하여 qRT-PCR을 하였다. Lightcycler SYBR Green PCR mater mixture (Roche Applied Sciences)를 이용하여 Lightcycler TM instrument를 통해 분석을 수행하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머 (primer)의 서열은 다음과 같으며, 내부대조군으로 GAPDH가 사용되었다.

그 결과를 도 3의 C, 및 도 3의 D에 나타내었다.

도 3의 C는 CNOT2 siRNA 처리된 MDA-MB-231 세포에서의 발현 변화를 확인한 것이며, 도 3의 D는 CNOT2 shRNA 처리된 MDA-MB-231 세포에서 발현 변화를 확인한 것이다.

상기 도 3의 C 및 D에서 확인되는 바와 같이, CNOT2 siRNA 또는 shRNA로 CNOT2의 발현이 억제된 경우, 혈관 형성 관련 인자인 HIF2 및 VEGF 유전자의 발현이 감소되는 것이 확인되었다.

또한 상기 기재된 RT-PCR 방법과 동일한 방식으로, CNOT2 유전자의 과발현시 VEGF의 발현 변화를 확인하였다. CNOT2 유전자의 과발현 세포는 psG5-CNOT2의 vector를 이용하여 MDA-MB-231 세포주에서 48 시간 동안 과발현시켜 제조하였다.

상기 실험 결과를 도 3의 E에 나타내었다. CNOT2의 유전자의 과발현시킨 세포주에서 CNOT2의 과다 발현에 따라, VEGF 발현 역시 증가되는 것을 확인하였다.

3. CNOT2 shRNA stable MDA -MB-231 세포주에서 VEGF 발현 변화 확인

상기 mRNA 수준의 발현 변화 확인과 함께, 웨스턴 블롯을 통해서 CNOT2 shRNA stable MDA-MB-231 세포주에서 VEGF의 발현 변화를 확인하여, 그 결과를 도 3의 F에 나타내었다.

도 3의 F에서 확인되는 바와 같이, CNOT2 발현 억제에 따라 VEGF 발현 역시 감소되는 것이 확인되었다.

또한, ELISA를 통해 VEGF 발현 변화를 확인하여, 그 결과를 도 3의 D에 나타내었다. VEGF ELISA Kit는 R&D systems사에서 제조된 제품을 사용하여 제조사의 사용 지침에 따라 실험이 수행되었다.

도 3의 G에 나타낸 바와 같이, VEGF 발현이 Stable cell line에서 감소되는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터, CNOT 2 억제가 혈관 형성인자들의 발현을 억제시킴으로써 신생 혈관 생성 작용을 억제함을 확인하였다.

< 실시예 4> CNOT2 억제에 따른 혈관 형성 억제 확인

1. CNOT2 억제에 따른 신생 혈관 형성 억제 효과 확인

Matrigel (10 mg/ml)로 미리 코팅한 체임버슬라이드에 HUVECs을 1 x 10⁴ 세포/웰로 배양한 후, 상기 실시예 3에서 제조된 대조군 및 CNOT2 shRNA stable 세포주 배양 상등액을 취하여 첨가하고 72시간을 더 배양하였다. 또한, 혈관 형성 인자인 VEGF를 첨가하여 함께 내피 세포관 형성 정도를 확인하였다.

상기 실험 결과를 도 4의 A에 나타내었다.

도 4의 A에서 확인되는 바와 같이, CNOT2 발현이 억제된 CNOT2 shRNA stable 세포주 배양 상등액을 처리한 샘플에서 내피 세포관 형성이 크게 억제되는 것이 확인되었다.

2. CNOT2 발현 변화에 따른 migration 정도 확인

또한 migration 검정을 위해 상기 실시예 2 및 실시예 3에서 제조된 CNOT2 siRNA 처리된 MDA-MB-231 세포주와 CNOT2 overexpression plasmid 처리된 MDA-MB-231 세포주를 제조한 후, 하루동안 배양하고, tip으로 wound를 일으켰다. 그 후, 배지를 교환하고, 24시간 더 배양 한 후 crystal violet 염색을 수행하여, migration된 세포들을 counting하였다.

그 결과를 도 4의 B 및 도 4의 C에 나타내었다.

도 4의 B에서 확인되는 바와 같이, CNOT2 siRNA 처리된 MDA-MB-231 세포주에서 Migration 정도가 낮은 것이 확인되었다. 반면, 도 4의 C에서 확인되는 바와 같이, pSG5 CNOT2 과발현 벡터(pSG-5-cnot2)를 transfection한 MDA-MB-231 세포주에서는 Migration이 강하게 일어나는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 CNOT2 발현 억제가 신생혈관 생성을 통한 migration 진행 억제에 효과가 있음을 확인하였다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ANGIOGENESIS RELATED DISEASE <130> P15-066-KHU <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CNOT2 siRNA sense sequence <400> 1 guuggaccuu ucagauuuuu 20 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CNOT2 siRNA anti-sense sequence <400> 2 aaaucugaaa gguccaaucu u 21 <210> 3 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CNOT2 shRNA 1 <400> 3 ccggcgggtt actaacattc ctcaactcga gttgaggaat gttagtaacc cgttttt 57 <210> 4 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CNOT2 shRNA 2 <400> 4 ccggatgaat ggaggagacg tattactcga gtaatacgtc tcctccattc attttttg 58 <210> 5 <211> 1770 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(1770) <223> CCR4 NOT transcription complex subunit 2 mRNA <400> 5 cttggatccg cgggacaaga aaattcatgc gagggagacg tggtgggcgg tccttcctgt 60 gacacgaccc ttgagtgaca gttctatttg 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3014 <212> RNA <213> Mus musculus <220> <221> gene <222> (1)..(3014) <223> CCR4-NOT transcription complex, subunit 2, mRNA <400> 6 gatacgtcgc catcttggat ccgcgggaca agaaaattca tgcgtactgt gaggaaagga 60 cacgactcta tggtgaggac tgatggacat acattatctg agaaaagaaa ctaccagagc 120 agaagaatcc catcgtttat catgttctgg ttggactcct ttcttatcgt ttgctggagt 180 ttgaacttca gagctatggt gtcaaccctg ctgtaatatc tcaggggagc tcctagtgtg 240 gggctggtgc catggctcac cctccaacct ttccttcttc acttcagcct ccagctctga 300 gctttcccat ccccagagta gcaaatgttg aaagaagttg cacaggtgac aaacagcatg 360 tttggtgctt caagaaagaa gtttgtagag ggggtggaca gcgactacca tgatgagaac 420 atgtactaca gccagtcttc tatgttccca catcggtcag agaaagatat gctggcatcg 480 ccatctacgt caggtcagct gtctcaattt ggggcaagtt tatacgggca acaaagtgca 540 ctaggccttc caatgagggg gatgagcaac aatacccctc agttaaatcg cagcttatca 600 caaggcactc agttaccgag ccacgtcacg ccaacaacag gggtaccaac aatgtcactt 660 cacacgcctc catctccaag caggggtatt ttgcctatga atcctaggaa tatgatgaac 720 cactcccagg ttggtcaggg 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Sequence <220> <223> HIF2 forward primer <400> 9 ctgccaccac tgatgaatta 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF2 reverse primer <400> 10 tggccactta ctacctgacc ctt 23 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF forward primer <400> 11 gcacccatgg cagaagg 17 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF reverse primer <400> 12 ctcgattgga tggcagtagc t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 cttttaactc tggtaaagtg g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 14 ttttggctcc cccctgcaaa t 21

Claims (12)

1. CCR4-NOT transcription complex subunit 2 (CNOT2) 유전자 억제제를 유효성분으로 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, CNOT2 유전자 억제제는 CNOT2 단백질을 코딩하는 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA) 또는 shRNA(small hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제2항에 있어서, siRNA는 서열번호 1 및 서열번호 2인 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제2항에 있어서, shRNA는 서열번호 3 또는 서열번호 4인 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 신생혈관형성 관련 질환은 암, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 실명증, 황반변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 망막 변성, 만성 염증성 관절염, 골 관절염, 자가면역 질환 중에서 선택되는 어느 하나인 약학 조성물.
6. CNOT2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 진단용 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 신생혈관형성 관련 질환 진단용 조성물.
8. 제6항에 있어서, 신생혈관형성 관련 질환은 암, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 실명증, 황반변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 망막 변성, 만성 염증성 관절염, 골 관절염, 자가면역 질환 중에서 선택되는 어느 하나인 진단용 조성물.
9. CNOT2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 신생혈관형성 관련 질환 진단용 키트.
10. (a) CNOT2 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 CNOT2 유전자의 발현양, CNOT2 단백질의 양 또는 CNOT2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, CNOT2 유전자의 발현양, CNOT2 단백질의 양 또는 CNOT2 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 신생혈관형성 관련 질환의 치료 또는 예방용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptasepolymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 신생혈관 형성 관련 질환은 암, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 실명증, 황반변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 망막 변성, 만성 염증성 관절염, 골 관절염, 자가면역 질환 중에서 선택되는 어느 하나인 신생혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.

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