KR20160129550A

KR20160129550A - 저대사 유도용 조성물, 저대사 유도방법 및 그 기술을 이용한 어류 운송방법

Info

Publication number: KR20160129550A
Application number: KR1020150061860A
Authority: KR
Inventors: 최인호; 정찬문; 장만; 박민재; 소혜경
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2016-11-09
Also published as: EP3289864A4; EP3289864A1; KR101755255B1; WO2016175476A1

Abstract

본 발명은 어류의 저대사 유도용 조성물, 저대사 유도방법 및 그 기술을 이용한 어류 운송방법에 관한 것으로 보다 구체적으로 본 발명의 어류의 장시간 저대사 유도방법은 저대사 유도물질인 T1AM을 어류에 처리함으로써 어류의 호흡률이 감소하고 제거하면 호흡률이 원상태로 회복될 뿐만 아니라 호흡률 감소에 따라 산소 소모율이 감소하고 생존시간은 증가하나 장시간 산소결핍과 같은 스트레스로 인해 나타나는 샤페론(chaperone)의 발현양상에는 변화를 나타내지 않고, T1AM에 의한 호흡률의 감소는 수온을 10 ℃ 내린 것과 동일한 효과를 나타내므로 이 기술을 이용하여 어육 품질 저하가 없으면서도 안전하고 경제적인 어류 운송방법을 제공할 수 있다.

Description

저대사 유도용 조성물, 저대사 유도방법 및 그 기술을 이용한 어류 운송방법{Method and composition for inducing a long-time hypometabolism and fish transportation method using thereof}

본 발명은 저대사 유도물질을 어류에 처리하여 저대사(hypometabolism)를 유도하는 어류의 저대사 유도용 조성물, 저대사 유도방법 및 그 기술을 이용한 어류 운송방법에 관한 것이다.

3-아이오도타이로민(3-iodothyronamine, T1AM)은 갑상선 호르몬(T3, T4)인 타이로이드 호르몬의 한 유도체로 체내에서 생성될 수 있는 저대사(hypometabolism) 유도물질이다. 설치류의 대다수 조직 샘플(뇌, 간, 심장, 신장, 근육 등)과 심지어 인체 혈액에서도 극미량(pico mole) 존재하는 것으로 밝혀져 있다(Zucchi R et al., 2006). 또한 3-아이오도타이로민은 합성 가능한 물질로 그 제조방법이 미국등록특허 제6,979,750호 및 제7,321,065호 및 본원 발명자의 선행특허인 한국등록특허 제1,112,731호에 개시되어 있어 대량생산이 가능해 산업적 이용에 용이하다.

한편 선행 연구에 따르면, T1AM을 마우스에 복강 투여(예, 50 mg/kg)하면 수 분 이내에 산소 소모율과 체온이 감소하기 시작하고, 투여 1시간 30분 - 2시간 이후에는 체온이 28 - 30도까지 떨어지며, 5 - 6시간 경과할 때쯤 정상 체온으로 회복되는 것으로 보고되고 있다 (Ju H et al., 2011). 뿐만 아니라, 최근 in vitro 실험 결과에 의하면, 근세포(C2C12)에 T1AM(75 μM)을 6시간 처리한 경우 세포의 산소 소모율이 대조군에 비해 60%까지 감소하는 것으로 밝혀졌다(Ju H et al., 2015). 이러한 결과로 미루어 볼 때, T1AM이 포유동물(마우스)뿐만 아니라 타 척추동물에서도 대사율(산소 소모율)을 낮출 것이라는 가설이 가능하다.

어류는 변온성 척추동물로서, 계통학적으로는 척추동물 첫 분류군에 해당된다. 따라서 T1AM과 같은 저대사 유도물질이 어류의 대사율을 낮출 수 있다면 척추동물의 중간 위치에 해당되는 양서류, 파충류 그리고 조류에서도 동일한 결과를 얻을 수 있을 것으로 추측되지만 아직까지 T1AM가 어류의 저대사를 유도하는지 그리고 T1AM을 제거할 경우 대사율을 회복하는지 등 어류를 대상으로 한 저대사 유도물질 T1AM의 효능에 대해 규명된 바 없다.

극히 일부 수종을 제외하면 어류는 오직 물에서만 생존하며 따라서 수질 및 수온에 따라 성장과 생존율이 극히 달라진다. 따라서 어류의 생존율을 증대시키기 위해 해수의 온도를 냉각시키는 방법을 이용한 한국등록특허 제232,408호 및 해수의 단계적 온도조절을 이용한 한국등록특허 제740,457호 등 수온 조절을 이용하여 어류의 대사를 낮추는 방법이 가장 많이 알려져 있으나 이와 같은 수온조절 방식은 수온저하에 따른 어류가 받는 스트레스로부터 자유로울 수 없기 때문에 육질의 저하 또는 폐사의 위험을 여전히 수반하고 있고, 수온조절 장치 설비에 따른 비용부담이 초래된다.

이 밖에도 어류의 운송방법에는 천연 마취 조성물을 이용하는 한국등록특허 제1,208,741호와 같은 마취 수송법 및 전기쇼크 수송법 등이 있으나 안전성과 품질저하의 문제로 널리 상용화되기에는 어려움이 있고, 일본공개특허 제1999-220974호와 같이 동면유도를 이용한 인공동면 수송법이 있으나 유사동면 유도물질을 동면중인 동물의 혈청으로부터 수득해야하고 각성시키기 위한 각성물질을 따로 투입해야한다는 점에서 산업적으로 상용화되기에는 어려움이 있다.

따라서 대량 제조생산 가능한 유도물질을 활용하여 유사동면 또는 저대사 상태와 같은 최대한 자연스러운 생리조절을 유도하여 어류가 스트레스를 받지 않고 장시간 생존하여 품질 손상 없이 활어상태로 운송될 수 있고 별도의 수온조절 장치가 요구되지 않아 비용을 절감할 수 있는 산업적 이용가치가 높은 경제적인 어류 운송기술이 요구되어진다.

미국등록특허 제6,979,750호 미국등록특허 제7,321,065호 한국등록특허 제1,112,731호 한국등록특허 제232,408호 한국등록특허 제740,457호 한국등록특허 제 1,208,741호 일본공개특허 제1999-220974호

Zucchi R, Chiellini G, Scanlan TS, and Grand DK (2006) Trace amine-associated receptors and their ligands. Br J Pharmacol. 149:967-978. Ju H, So H, Ha K, Park K. Lee J-W, Chung C-M, and Choi I. (2011) Sustained torpidity following multi-dose administration of 3-iodothyronamine in mice. Journal of Cellular Physiology 226:853-858.

본 발명의 목적은 T1AM(3-iodothyronamine)과 같은 저대사(hypometabolism) 유도물질 처리에 의해 어류의 저대사를 유도하고 저대사 유도물질을 제거하여 대사율이 회복되는 저대사 유도물질에 의한 어류의 저대사 유도용 조성물, 저대사 유도방법 및 그 기술을 이용한 어류 운송방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 T1AM(3-iodothyronamine) 처리 및 제거에 따른 어류의 호흡률, 산소 소모율, 생존시간 및 스트레스 대응 단백질의 발현 변화 양상 등을 확인함으로써 어류를 대상으로 한 T1AM의 저대사(hypometabolism) 유도 효능을 최초로 규명하여 저대사 유도물질에 의한 어류의 저대사 유도용 조성물, 저대사 유도방법 및 그 기술을 이용한 어류 운송방법을 제공한다.

본 발명에 따른 저대사(hypometabolism) 유도물질에 의한 어류 저대사 유도 방법은 T1AM과 같은 저대사 유도물질의 처리에 의해 호흡률이 감소하고 제거하면 호흡률이 원상태로 회복되어 수온 조절 없이 수온을 낮추는 것과 동일한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 호흡률 감소에 따라 산소의 소모율이 감소하고 생존시간은 증가하나 장시간 산소결핍과 같은 스트레스로 인해 나타나는 샤페론(chaperone)의 발현양상에는 변화를 나타내지 않아 본 발명의 저대사 유도물질에 의한 어류의 장시간 저대사는 스트레스로 작용하지 않고 저대사 유도물질의 제거와 더불어 정상의 상태로 회복될 수 있는 어류의 저대사 유도 방법으로 어류 수송 등에 활용될 수 있다.

도 1은 비파(Hypostomus plecostomus)의 호흡률을 측정하기 위한 측정 장치(A) 및 이를 이용해 비파를 용액이 담긴 튜브에 투입해 실험하는 모습(B)을 촬영한 사진이다.
도 2는 TIAM 농도에 따른 비파의 호흡률 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 TIAM의 농도가 0.005%가 되게 투여한 것에 따른 전후 비파의 호흡률 변화(A)(n=6) 및 TIAM 제거에 의해 다시 회복되는 비파의 장시간 호흡률 변화(B)(n=5) 추이를 나타낸 그래프이다.
도 4는 비히클(vehicle) 용액에서 비파의 호흡률 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 수온에 따른 비파의 호흡률 변화를 나타낸 그래프이다(n=6).
도 6은 비파의 산소 소모율을 측정하기 위한 측정장치(A) 및 이를 이용해 비파를 용액이 담긴 밀폐된 유리병에 투입해 실험하는 모습(B)을 촬영한 사진이다.
도 7은 0.005% TIAM 용액 또는 대조군(비히클 용액) 용액이 담긴 밀페된 유리병에 비파를 투입해 측정한 용존 산소량(A) 및 호흡률(B)의 변화를 나타낸 비교 그래프이다(●: 대조군(control), ○: TIAM).
도 8은 0.005% TIAM 용액 또는 대조군(비히클 용액) 용액이 담긴 밀페된 유리병에 비파를 투입해 측정한 산소 소모율(A) 및 생존시간(B)을 나타낸 비교 그래프이다[*: 두 그룹(TIAM 용액 및 대조군(비히클 용액)) 간의 유의적 차이가 있음을 의미한다(독립 대응표본 t-검정: independent paired t - test, P < 0.05)].
도 9는 TIAM를 투여 후 시간 경과별 개체(Con: 0분(투여 전), 400T: 400분 경과, 800T: 800분 경과, 1200T: 1200분 경과), 투여 후 제거한 개체(1200R: TIAM 투여 후 600분부터 1200분까지 TIAM을 제거해 유도된 저대사 상태로부터 회복된 개체), 및 TIAM을 투여하지 않은 개체(1200C: TIAM 투여 없이 비히클 용액 내에 1200분까지 있었던 개체)에 대한 HSP90 및 알파베타-크리스탈린(αβ-crystallin)의 발현 양상을 나타낸 것이다(n=4).

본 발명은 T1AM(3-iodothyronamine), DADLE([D-Ala2,D-Leu5] enkephalin), 5'-AMP(5'-adenosine monophosphate) 및 H₂S(hydrogen sulfide)로 이루어진 그룹에서 선택되는 저대사(hypometabolism) 유도물질을 포함하는 용액에 어류를 투입하거나 어류를 포함하는 용액에 T1AM(3-iodothyronamine), DADLE([D-Ala2,D-Leu5] enkephalin), 5'-AMP(5'-adenosine monophosphate) 및 H₂S(hydrogen sulfide)로 이루어진 그룹에서 선택되는 저대사 유도물질을 투여함으로써 이루어지는 어류의 저대사 유도방법에 대한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 저대사 유도물질은 보다 구체적으로 T1AM(3-iodothyronamine)일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 저대사 유도물질이 T1AM(3-iodothyronamine)인 경우 T1AM은 전체 용액에 0.002% (w/v) 이상의 농도, 보다 구체적으로 0.002 내지 0.01% (w/v) 농도, 보다 구체적으로 0.003 내지 0.0095% (w/v) 농도, 보다 더 구체적으로 0.004 내지 0.0085 % (w/v) 농도, 보다 더 구체적으로 0.005 내지 0.0075% (w/v) 농도로 포함될 수 있다. 그러나 전체 용액 중 T1AM의 농도는 어종 또는 개체의 중량 등에 의해 조절될 수 있는 것으로 상기 범위에 반드시 한정되는 것은 아니다. T1AM 농도가 0.002% (w/v) 이하로 포함되는 경우 15시간 이상 경과해도 호흡률이 최저치를 나타내지 않아 안정한 저대사가 유도되지 않을 수 있고, 0.01% (w/v)를 초과할 경우 지나치게 빨리 최저 호흡률로 유도되어 어류가 저호흡률에 충분히 순응하지 못할 수도 있다.

본 발명의 일 양태에서, 저대사 상태는 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 7시간 이상, 8시간 이상, 9시간 이상, 10시간 이상, 보다 구체적으로 10 내지 20 시간 , 보다 더 구체적으로 약 20 시간 동안 유지될 수 있다. 그러나 목적하는 저대사 유도 시간은 이에 한정되는 것은 아니며 유도물질의 농도 조절 등을 통하여 조절될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 저대사 유도물질을 제거함으로써 어류의 저대사가 회복될 수 있다. 저대사 유도물질 제거는 예를 들어 비히클(vehicle) 용액을 일정 속도로 계속 주입하는 방식으로 수행될 수 있으나 제거방식이 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에서, 저대사 유도 전 먹이 공급이 중단될 수 있으며 이는 저대사 상태에서 일어날 수 있는 소화불량이나 장염 등의 질환을 예방하기 위한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 어류의 저대사 유도는 항온 조건에서 수행되는 것으로 이는 어종별 생육에 적합한 수온을 유지하는 것을 의미한다.

본 발명은 a) T1AM(3-iodothyronamine), DADLE([D-Ala2,D-Leu5] enkephalin), 5'-AMP(5'-adenosine monophosphate) 및 H₂S(hydrogen sulfide)로 이루어진 그룹에서 선택되는 저대사(hypometabolism) 유도물질을 포함하는 용액에 어류를 투입하는 단계; b) 상기 a) 단계의 용액 내 어류를 목적지까지 이동시키는 단계; 및 c) 용액에서 저대사 유도물질을 제거하여 어류의 저대사 상태를 회복하는 단계를 포함하는 저대사 유도물질을 이용한 어류 운송방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 어류 운송을 위한 저대사 유도물질은 보다 구체적으로 T1AM(3-iodothyronamine)일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 어류 운송을 위한 저대사 유도물질이 T1AM(3-iodothyronamine)인 경우 T1AM은 전체 용액에 0.002% (w/v) 이상의 농도, 보다 구체적으로 0.002 내지 0.01% (w/v) 농도, 보다 구체적으로 0.003 내지 0.0095% (w/v) 농도, 보다 더 구체적으로 0.004 내지 0.0085 % (w/v) 농도, 보다 더 구체적으로 0.005 내지 0.0075% (w/v) 농도로 포함될 수 있다. 그러나 전체 용액 중 T1AM의 농도는 어종 또는 개체의 중량 등에 의해 조절될 수 있는 것으로 상기 범위에 반드시 한정되는 것은 아니다. T1AM 농도가 0.002% (w/v)이하로 포함되는 경우 20시간이 경과해도 호흡률이 최저치를 나타내지 않아 안정한 저대사가 유도되지 않을 수 있고, 0.01% (w/v)를 초과할 경우 지나치게 빨리 최저 호흡률로 유도되어 어류가 저호흡률에 충분히 순응하지 못할 수도 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 어류 운송을 위한 어류의 저대사 유도는 항온 조건에서 수행되는 것으로 이는 어종별 생육에 적합한 수온을 유지하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 어류 운송을 위한 어류 저대사 상태는 장시간 운송을 위해 공기 주입을 수반할 수 있다.

본 발명은 T1AM(3-iodothyronamine), DADLE([D-Ala2,D-Leu5] enkephalin), 5'-AMP(5'-adenosine monophosphate) 및 H₂S(hydrogen sulfide)로 이루어진 그룹에서 선택되는 저대사(hypometabolism) 유도물질; 및 용매를 함유하는 어류의 저대사 유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 저대사 유도물질은 T1AM(3-iodothyronamine)일 수 있으며. 이 경우 T1AM은 전체 용액에 0.002% (w/v) 이상의 농도, 보다 구체적으로 0.002 내지 0.01% (w/v) 농도, 보다 구체적으로 0.003 내지 0.0095% (w/v) 농도, 보다 더 구체적으로 0.004 내지 0.0085 % (w/v) 농도, 보다 더 구체적으로 0.005 내지 0.0075% (w/v) 농도로 포함될 수 있다. 그러나 전체 용액 중 T1AM의 농도는 어종 또는 개체의 중량 등에 의해 조절될 수 있는 것으로 상기 범위에 반드시 한정되는 것은 아니다. T1AM 농도가 0.002% (w/v)이하로 포함되는 경우 20시간이 경과해도 호흡률이 최저치를 나타내지 않아 안정한 저대사가 유도되지 않을 수 있고, 0.01% (w/v)를 초과할 경우 지나치게 빨리 최저 호흡률로 유도되어 어류가 저호흡률에 충분히 순응하지 못할 수도 있다.

본 발명의 일 양태에서, 어류의 저대사 유도용 조성물을 위한 용매는 육수 또는 해수일 수 있다. 상기 육수는 민물에서 사는 어류의 생육에 적합한 모든 종류의 물 또는 용매를 의미한다.

이하, 본 발명에 따르는 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실험예 등에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실험예]

○ 통계분석

측정결과에 해당하는 모든 수치는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 산소 소모율 및 생존시간에 대한 그룹 차이는 독립 대응표본 t-검정(independent pair's t-test)으로 검증하였다. 통계 분석은 SPSS/PC+를 이용하였으며, P = 0.05에서 유의성을 판단하였다.

○ 실험동물 및 관리

모든 실험예는 비파(Hypostomus plecostomus)를 암수 구별 없이 사용하였다. 실험에 들어가기에 앞서 모든 개체들을 수조 수온 25 ± 0.5 ℃, pH ~7.0, 12:12 LD (Light/Dark) 조건을 유지하였다. 개체의 배식은 매일 아침 10시에 하였으며, 실험을 하기 24시간 전부터 금식을 하였다.

○ T1AM(3-iodothyronamine)

모든 실험예에 사용된 T1AM(3-iodothyronamine)은 유기합성을 통해서 생성 정제된 물질(국내등록특허 제1,112,731호)로 NMR 분석과 동물 효능 실험을 통해 물질특성의 적합성을 판정하였다.

실험예1: T1AM 농도에 따른 호흡률 변화

실험 전에 전자저울(AFX-200G, Shimadzu, JP)로 개체의 체중을 측정하였다. 개체가 들어가는 주사기 튜브(KOVAX-SYRINGE; 21GX1, Seoul, KR)에 48시간 동안 저장해둔 물(pH 6.5-7.5, 25 ℃)을 사용하여 실험을 하였다. 튜브 아래쪽에는 에어펌프(Air Pump)를 연결하여, 미소량의 공기를 주입하였으며, 물의 온도는 열전대 온도기(thermocouple thermometer; Cole-Parmer, Vermon Hills, IL)를 이용하여 측정 하였다. 항온수조(single tissue bath; harvard)에 수온을 일정하게 함으로써 튜브의 수온(25 ℃)을 일정하게 유지하였다.

T1AM을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO; SIGMA, Missouri, US) 에 녹여서 사용하였으며, 개체의 무게와 물 용량에 따라 T1AM의 양과 농도를 결정하였다. TIAM 투여 전에 400분 동안 튜브 내에서의 개체 안정화 시간을 가졌으며, 0.000%, 0.002%, 0.003%, 0.005%, 0.0075% (w/v)농도에서 개체의 아가미(gill) 호흡률(ventilation frequency)을 30분 단위로 관찰 기록하였다.

T1AM 농도(0.000%, 0.002%, 0.003%, 0.005%, 0.0075% (w/v))에 따른 비파 개체의 호흡률 변화를 비교한 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 수온이 일정한 상태(25 ℃)에서 T1AM 농도가 높아질수록 호흡률은 더 빨리 감소하였으며, 최저 호흡률은 0.0075% (w/v)의 경우 200분, 0.005% (w/v)에서는 400분, 0.003% (w/v)에서는 800분에서 나타났다. T1AM 농도 0.002% (w/v)의 경우 실험 종료시간(1200분)까지 최저치를 보이지 않았으며, T1AM을 넣지 않은 상태(0.000% (w/v)) 경우 호흡률이 거의 변하지 않았다.

실험예2: 적정 T1AM 농도에 의한 장시간 호흡률 변화 추이

1) 0.005% T1AM 용액에서 비파의 호흡률 변화

상기 실험예1에서 비파 개체의 호흡률 변화와 생존시간 등을 고려하여 적정 T1AM 농도를 0.005% (w/v)로 정하였다. 바파가 500 ml 용액 내 튜브에 들어 있는 상태에서 200분 동안 T1AM을 투여 없이 비파의 호흡률을 측정하고, T1AM 농도가 0.005% (w/v)가 되게 맞춘 뒤 30분 단위로 1200분 까지 비파의 호흡률을 측정하였다.

그 결과, 도 3A에서 확인할 수 있는 바와 같이 T1AM 투여 전 (-200 ~ 0분) 비파의 평균 호흡률은 180 ± 20 (회/min)이었다. T1AM 투여 후에는 400분에서 호흡률이 최저치(10 ~ 25 회/min)에 도달한 뒤 실험종료 시간인 1200분까지 지속되는 것을 확인하였다(n = 6).

2) 비히클(vehicle) 용액에서 비파의 호흡률 변화

또한 단순히 시간에 따른 호흡률 변화를 조사하기 위해 비히클(vehicle) 용액(-T1AM/+DMSO)에 개체를 넣은 뒤 1200분(“1200C”)까지 개체의 호흡률을 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 실험예1에서 T1AM을 넣지 않은 상태(0.000% (w/v)) 경우와 유사하게 비파의 호흡률은 거의 변하지 않았다.

3) T1AM 투여 및 제거에 의한 비파의 호흡률 변화

T1AM을 제거할 경우 호흡률이 회복되는지 확인하기 위해 상기 1)과 동일하게 T1AM 투여한 다음 600분부터 1200분 (“1200R”)까지 비히클(vehicle) 용액을 2 ml/min 속도로 총 500 ml을 갈아 주었다.

그 결과, 도 3B에서 확인할 수 있는 바와 같이 비파의 호흡률은 상기 1)에서 얻은 결과와 거의 동일하게 400분 전후에서 최저치를 보이다가 600분 이후 빠르게 상승하여 원래 수준으로 회복되는 것을 확인하였다(n = 5).

실험예 3: 수온(체온)에 따른 호흡률 변화

비파 개체가 들어 있는 튜브 안 수온(25 ℃)을 냉각수 순환기(Circulator) 이용하여, 30분 단위로 1 ℃ 내려 수온을 5 ℃까지 내리면서 개체의 호흡률을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 수온 감소와 더불어 비파 개체의 호흡률도 비례적으로 감소하여 수온이 12 ~ 14 ℃에서 최저 호흡률이 되는 경향을 확인하였다(n = 6).

실험예 4: T1AM 투여에 따른 용존 산소량 소모율과 생존시간

전자저울로 개체의 체중을 측정한 뒤, 0.005% (w/v) T1AM 용액을 유리병(Z305197, 500 ml, SCHOTT DURAN, DE)에 채워 항온수조(25 ℃)에서 온도를 유지 하였다. 30분 후 천천히 비파 개체를 넣고 뒤이어 DO 탐침(probe)을 넣은 뒤 병 입구를 밀폐시켰다. 곧 이어 일정한 수온에서 20분 단위로 DO 값(O₂ mg) 및 개체의 호흡률을 측정하였으며, 산소 소모율은 수중 용존 산소량(dissolved oxygen, DO)의 변화를 시간으로 나누어 계산하였고, 용존 산소량은 Cyberscan PCD 6500(Eutech instruments, ARC, SG) DO 탐침(probe: EC620SSP)를 이용하여 측정하였다. 동일한 방법으로 T1AM 용액 대신 비히클(vehicle) 용액을 이용해 대조군으로 측정하였다. 시간 경과와 더불어 용존 산소가 소진됨에 따라 개체는 호흡을 멈추고 균형을 잃는 모습을 보이고, 이런 상태로 40 분간 호흡을 멈추고 있으면 사망으로 간주하고, 이 시간에서 마지막 호흡을 했던 시간을 정하여 개체의 생존시간으로 정하였다.

그 결과, 도 7 및 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 용존 산소량은 대조군(control)에 비해 T1AM 그룹이 느리게 감소를 하였고(n = 4; 도 7A), 호흡률은 T1AM 그룹이 대조군에 비해 낮게 그리고 더 오래 지속되는 것을 확인하였다(n = 4; 도 7B). 이에 따라 산소 소모율은 대조군에 비해 TIAM 그룹에서 50% 이상 유의하게 낮게 나타났다(n = 4; 도 8A). 또한 생존시간은 TIAM 그룹이 대조군 보다 200분 정도 유의하게 증가하였다(n = 4; 도 8B).

실험예5: 샤페론 단백질(chaperone) 발현 변화

장시간의 저대사 유도에 따른 스트레스 유발 여부를 조사하기 위해 열충격단백질(heat shock protein) 발현 변화를 분석하였다. 열충격단백질은 샤페론(chaperone) 분자의 일종으로 스트레스 유발 시 이에 대응하여 발현을 증가하는 단백질이다. 이 분석을 위해 상기 실험예2 1)에서 T1AM 투여 전 0분(“Con”), T1AM 투여 후 400분(“400T”), 800분(“800T”), 1200분(“1200T”)에서의 각 비파 개체, 상기 실험예2 3)에서 T1AM 투여한 다음 600분부터 1200분까지 비히클(vehicle) 용액을 2 ml/min 속도로 총 500 ml을 갈아 준 비파 개체(“1200R”), 및 상기 실험예2 2)에서 T1AM을 투여하지 않고 1200분까지 호흡률을 측정한 비파 개체(“1200C”)로부터 뇌조직 및 기타 조직들을 적출하여 액체질소에 냉동 보관하였다(n = 4).

전체 조직 용해물 준비를 위하여 뇌조직을 조직 용해 완충액(Tissue Lysis Buffer: [20 mM HEPES (pH 7.4), 75 mM NaCl, 2.5 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, TritonX-100(0.05% w/v), 20 mM 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 1 mM Na₃VO₄, 10 mM NaF, 0.5 mM 디티올트레이톨(dithiolthreitol, DTT), 프로테아제 저해제 칵테일 타블렛(protease inhibitor cocktail tablet, Complete Mini, 11836153001, Mannheim, Roche, GE)])으로 균질화 시킨 후 4 ℃ 13,000 rpm 에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질의 정량은 브래드포드 분석(Bradford assay) 방법을 이용하였고, 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 표준곡선(standard curve)을 얻었다. 각 그룹의 조직 샘플을 800 ㎕의 멸균된 증류수가 담긴 튜브에 1.6 ㎕씩 넣고 각각의 튜브에 200 ㎕의 브래드포드 분석 시약(Bradford assay reagent, Bio-rad, CA)을 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 뒤, λ = 595 nm에서 흡광도(UV-1610PC, Shimadzu, Japan)를 측정하였다. 시료는 100 ㎍ 씩 분주하여 액체질소에 급냉동시켜 -80 ℃에 보관하였다.

면역블롯 분석(Immunoblot analysis)을 위하여 상기 100 ㎍씩 분주한 전체 조직 용해물(lysate)에 6X 샘플 완충액(sample buffer)을 첨가하여 5분간 끓인 후 8% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel) 상에서 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 뒤, 겔(gel) 상의 분리된 단백질들을 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane: Amersham, buckinghamshire, UK)으로 전기이동(electrotransfer)하여 막(membrane)에 블롯팅(blotting) 하였다. 이어 폰소 S(Ponceau S)로 염색하여 블롯(blot)을 확인하였으며, 1X TBST를 이용하여 충분히 염료를 없애 준 뒤, 5% (w/v) 스킴밀크(skim milk) 용액으로 블로킹(blocking) 하였다. 이후 1차 항체(primary antibody)를 스킴밀크(skim milk)에 희석하여 첨가하고 4 ℃에서 12시간 반응시켰다. 반응 후 1X TBST를 이용하여 10분 간격으로 5번 세척하였고, 1차 항체의 호스트 소스(host source)에 맞는 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase) - 표지(labeled) 2차 항체(secondary antibody)를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 항체와의 반응이 끝난 후 1X TBST로 세척하는 과정을 반복한 뒤 ECL 검지 키트(Amersham)를 항원-항체 반응으로 발색을 유도하여 X-ray 필름(film)에 노출·감광시켜 결과를 얻었다. 대조군(Loading control)을 조사(reprobing) 하기 위하여 결과를 확인한 막(membrane)에 스트립 완충액(stripping buffer: Thermo, NMR, IL)을 넣고 상온에서 15분간 진탕기(shaker)에서 반응시킨 후 1X TBST로 다섯 번 5분 간격으로 세척하고 다시 블로킹(blocking)한 뒤, 1차 항체를 반응시켰다. 대조군(loading control)은 베타-액틴(β-actin)을 사용하였고 이때 나타나는 밴드의 강도를 표준화 지표로 사용하였으며, 실험에 사용한 1차 항체는 HSP90 (MBL, SR-B830, JP), 알파베타-크리스탈린(αβ-crystallin, Santa cruz Biotech, sc-22744, CA)을 사용하였고, 2차 항체는 Cell signaling Technology (7074, 3 Trask Lane, MA)의 토끼(rabbit) IgG 와 Bivision (640205, 980 Linda Vista Avenue, Moutain view, CA)의 마우스(mouse) IgG를 사용해 수행하였다.

그 결과, 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이 HSP90(도 8A) 및 알파베타-크리스탈린(αβ-crystallin)(도 8B)의 발현은 모두 모든 그룹 간에 유의적 차이를 보이지 않았다(P > 0.05, n = 4). 즉 T1AM을 투여하거나 투여하지 않거나 또는 투여했다가 제거한 모든 상황에서 HSP90 및 알파베타-크리스탈린(αβ-crystallin)과 같은 열충격 단백질의 발현 양상은 변하지 않았다. 따라서 비파는 저대사 유도물질인 T1AM에 의한 장시간 호흡감소에도 불구하고 산소결핍과 같은 스트레스를 겪지 않았다는 것을 확인하였다.

Claims

T1AM(3-iodothyronamine), DADLE([D-Ala2,D-Leu5] enkephalin), 5'-AMP(5'-adenosine monophosphate) 및 H₂S(hydrogen sulfide)로 이루어진 그룹에서 선택되는 저대사(hypometabolism) 유도물질을 포함하는 용액에 어류를 투입하거나 어류를 포함하는 용액에 T1AM(3-iodothyronamine), DADLE([D-Ala2,D-Leu5] enkephalin), 5'-AMP(5'-adenosine monophosphate) 및 H₂S(hydrogen sulfide)로 이루어진 그룹에서 선택되는 저대사 유도물질을 투여함으로써 이루어지는 어류의 저대사 유도방법.
제1항에 있어서,
저대사 유도물질은 T1AM(3-iodothyronamine)인 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도방법.
제2항에 있어서,
T1AM(3-iodothyronamine)은 전체 용액에 0.002% (w/v) 농도 이상으로 포함되는 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도방법.
제2항에 있어서,
T1AM(3-iodothyronamine)은 전체 용액에 0.002 내지 0.01% (w/v) 농도 로 포함되는 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도방법.
제1항에 있어서,
저대사 유도물질을 제거함으로써 어류의 저대사가 회복되는 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도방법.
제1항에 있어서,
어류의 저대사 유도는 항온 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도방법.
a) T1AM(3-iodothyronamine), DADLE([D-Ala2,D-Leu5] enkephalin), 5'-AMP(5'-adenosine monophosphate) 및 H₂S(hydrogen sulfide)로 이루어진 그룹에서 선택되는 저대사(hypometabolism) 유도물질을 포함하는 용액에 어류를 투입하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 용액 내 어류를 목적지까지 이동시키는 단계; 및
c) 용액에서 저대사 유도물질을 제거하여 어류의 저대사 상태를 회복하는 단계를 포함하는 저대사 유도물질을 이용한 어류 운송방법.
제7항에 있어서,
저대사 유도물질은 T1AM(3-iodothyronamine)인 것을 특징으로 하는 저대사 유도물질을 이용한 어류 운송방법.
제8항에 있어서,
T1AM(3-iodothyronamine)은 전체 용액에 0.002% (w/v) 농도 이상으로 포함되는 것을 특징으로 하는 저대사 유도물질을 이용한 어류 운송방법.
제8항에 있어서,
T1AM(3-iodothyronamine)은 전체 용액에 0.002 내지 0.01% (w/v) 농도 로 포함되는 것을 특징으로 하는 저대사 유도물질을 이용한 어류 운송방법.
제7항에 있어서,
어류 운반은 항온 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 저대사 유도물질을 이용한 어류 운송방법.
T1AM(3-iodothyronamine), DADLE([D-Ala2,D-Leu5] enkephalin), 5'-AMP(5'-adenosine monophosphate) 및 H₂S(hydrogen sulfide)로 이루어진 그룹에서 선택되는 저대사(hypometabolism) 유도물질; 및 용매를 함유하는 어류의 저대사 유도용 조성물.
제12항에 있어서,
저대사 유도물질은 T1AM(3-iodothyronamine)인 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도용 조성물.
제12항에 있어서,
용매는 물 또는 해수인 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도용 조성물.
제13항에 있어서,
T1AM(3-iodothyronamine)은 전체 용액에 0.002% (w/v) 농도 이상으로 포함되는 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도용 조성물.
제13항에 있어서,
T1AM(3-iodothyronamine)은 전체 용액에 0.002 내지 0.01% (w/v) 농도 로 포함되는 것을 특징으로 하는 어류의 저대사 유도용 조성물.