KR20160128150A - Jq1을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 JQ1을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서 JQ1이 뇌신경세포에서의 신경 세포사멸에 대해 보호작용을 나타냄을 확인함으로써 신경염증 및 신경세포사멸이 동반되는 뇌신경질환에서 새로운 치료타겟을 확립하고 신약을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

JQ1을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 치료용 조성물{A COMPOSITION FOR TREATING NEUROLOGICAL DISEASES COMPRISING JQ1}

본 발명은 JQ1을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

세포는 산화와 환원의 균형을 통해 적절한 기능을 유지하고 있다. 이러한 산화와 환원의 균형을 유지하도록 하는 것이 oxidant의 생성과 이들의 detoxification이다. 뇌는 산소와 포도당을 공급받고 신경세포에서는 높은 농도의 산소와 포도당을 소모하여 미토콘드리아에서 oxidative phosphorylation 과 에너지를 생성하고 있다. 이들 대사과정을 통해 다양한 산화적 스트레스 유도물질들인 ROS, superoxide, hydroxyl radicals, hydrogen peroxide들이 생성되고 vitamins, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase등에 의해 이들 산화적 스트레스 물질들은 제거되고 있다. basal level의 이들 oxidants은 세포의 신호전달계에 기여하고 단백질의 가역적인 modification을 유도한다. 과도한 양의 ROS는 단백질, 핵산, lipid등의 oxidation 및 비가역적 modidication이 유도되어 결과적으로 이들의 기본적인 기능이 파괴된다. 산화적 스트레스에 의한 세포의 기본 기능을 하는 물질들의 손상은 정상적인 노화과정에서도 나타나고 알츠하이머병과 같은 뇌신경계질환에서도 강력한 위험인자임이 알려져 있다(Jacob KD, Noren Hooten N, Trzeciak AR, Evans MK. 2013. Mechanisms of ageing and development 134(3-4):139-157).

현재까지 신경세포사멸의 억제를 위해 연구된 약물들은 글루타민산 수용체 길항제, 항산화제, 칼슘 혹은 나트륨, 등의 이온채널 차단제, 항염증제 등을 이용한 것이 대부분이며 효과적인 약물이 개발되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 획기적인 아이디어 전환, 신개념의 치료제 타겟발굴 및 drug repositioning의 효과에 대한 연구가 요구되고 있다.

BET(Bromodomain and exterminal domain) 단백질은 epigenetic reader로서 histone 의 acetylated lysine 잔기에 결합한다. 이를 통해 bromodomain-containing 단백질들은 직접적으로 크로마틴의 특정 부위에서 nuclear macromolecular complex를 이루고 DNA 복제, DNA 손상 복구, 크로마틴 remodeling, 전사 조절과 같은 생물학적인 과정을 조절하게 된다. BET family 단백질들은 BRD2, BRD3, BRD4 그리고 Brdt 가 있고 2 amino-terminal bromodomains을 포함하고 전사조절에서 역할이 잘 알려져 있다. 최근 이러한 단백질들에 대한 small-molecular inhibitors로서 I-BET과 JQ1(Chung CW, 외 2011. Journal of medicinal chemistry 54(11):3827-3838)이 개발되면서 염증과 암의 치료제로서의 가능성에 대한 보고들이 되고 있다.

JQ1은 크로마틴에서 acetylated lysine에 BET 단백질과 경쟁하여 BET 단백질의 결합을 방해한다. JQ1에 의한 BET bromodomain의 억제는 c-Myc 의 발현을 억제를 통해 hematopoietic cancer, leukemia와 같은 몇몇 암에서 강력한 항암 효과를 나타냄이 보고되었다. 또한, JQ1은 염증반응을 억제하고 뼈의 파괴를 막을 수 있음이 보고 된 바 있다 (Meng S, Zhang L, Tang Y, Tu Q, Zheng L, Yu L, Murray D, Cheng J, Kim SH, Zhou X, Chen J. 2014.Journal of dental research 93(7):657-662).

[선행 특허문헌]

대한민국 특허 공개번호 제10-2011-0140015호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 뇌신경질환에서의 새로운 치료 타겟을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 JQ1을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 JQ1은 6S)-4-(4-Chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepine-6-acetic acid 1,1-dimethylethyl ester로 이하 'JQ1'이라 하며, 영국 Tocris로부터 구입하여 사용하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 JQ1의 유효량은 10nM에서 100nM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 JQ1을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 완화용 식품 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 JQ1을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 LPS에 의해 증가한 신경세포사멸로부터 신경세포를 보호하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 JQ1의 유효량은 10nM에서 100nM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 JQ1을 유효성분으로 포함하는 세포의 산화적 스트레스 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 산화적 스트레스는 과산화 수소에 의하여 유도되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 JQ1의 유효량은 50nM에서 100nM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 뇌신경질환은 신경 퇴행성 질환 또는 허혈성 뇌 질환일 수 있다.

신경 퇴행성 질환(neurodegenerative disorders)이란 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러가지 증상을 유발하는 질환으로 대부분 질병의 발병이 서서히 시작하며 출생 후 오랜 기간 정상적인 기능을 하다가 증상이 나타난다. 또한 일단 발병하면 사망 시까지 수년 또는 수십 년에 걸쳐 지속적으로 병이 진행하며,가족력이 있는 경우가 많다. 본 발명의 신경 퇴행성 질환의 구체적인 예는 이에 한정되지 아니하나, 파킨슨 병,헌팅턴 병, 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis),척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)일 수 있다.

허혈성 뇌 질환이란 뇌에 혈액을 공급하는 혈관에 여러가지 형태의 병리학적 이상이 발생되어 혈류가 완전히 차단되거나, 현저하게 감소한 상태로서, 산소부족, 기질공급의 감소, 대사산물의 축적이 동시에 진행되는 질환을 말한다. 허혈이 발생한 조직에는 기능 장애가 나타나, 혈관 폐색의 정도, 지속시간에 따라 조직은 위축, 변성,괴사에 이르게 된다. 본 발명의 허혈성 뇌 질환의 구체적인 예로는 이에 한정되지 아니하나, 뇌졸중, 뇌일혈,뇌경색, 두부손상, 뇌순환 대사장애 일 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 화합물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 화합물 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨,만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 1,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 100mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 두뇌 또는 인지기능 증진이나 뇌신경질환의 예방 또는 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물 형태로 제조할 수 있으며, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태의 식품에 대한 조성물을 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 후박 추출물과 황금 추출물의 혼합 조성물이 함유된 껌, 비타민 복합체, 차, 주스 및 드링크 형태로 제조 할 수 있으며, 후박 추출물과 황금 추출물을 유효성분으로 하는 식품 조성물을 과립화, 캡슐화 또는 분말화하여 섭취할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 화합물 이외에 구연산, 액상과당,설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함하며 하기에 예시한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에는 액체 성분에는 특별한 제한 점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 디사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 조성물 중 유효성분의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대하여 약 0.1~50중량%를 포함할 수 있다. 바람직하게는 0.5mg/kg/day~5mg/kg/day의 양으로 섭취하는 경우 두뇌 또는 인지기능 증진 및 뇌 신경 질환 예방 효과가 나타날 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 배양한 신경세포에 H2O2를 처리하여 신경세포사멸모델을 만들고 JQ1에 의해서 신경세포의 보호작용 및 산화적 스트레스 억제효과를 살펴 보았다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 흰쥐의 두뇌로부터 일차 배양한 mixed glia에 JQ1을 100, 500 nM 처리 후 30분 뒤에 10 ng/ml 농도의 LPS 로 자극하고 24시간 배양하여 conditioned media를 얻었다. 이를 17.5일된 흰쥐 태자의 뇌조직으로 배양한 일차배양신경세포에 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후에 20 mg/ml MTT 시약을 배지에 가하여 1시간 처리하고 모두 suction 한 후 DMSO로 형성된 자줏빛의 formazan을 녹여내여 96 well assay plate로 옮겨 540 nm 파장에서 읽어 대조군에 비교 분석하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포의 마이토콘드리아 효소인 succinate dehydrogenase가 tetrazolium salt를 formazan으로 변화시켜 그 값으로 세포의 살아있는 정도를 분석하는 방법이다. MTT 분석을 통해 LPS 처리된 conditioned media에 의해 신경세포사멸이 나타났고 JQ1이 처리된 conditioned media에 의해 세포보호작용이 나타났음이 확인되었다 (도 1 참조).

이후, JQ1에 의한 직접적인 효과를 확인하고자 신경세포에 직접 JQ1을 농도별로 10, 50, 100 nM을 처리하였고 H2O2 자극에 의한 신경세포사멸에의 효과를 MTT 분석과 Western blot을 통해 확인하였다. 그 결과, H2O2에 의해 신경세포사멸이 유도되었고 JQ1 농도의존적으로 신경세포 보호작용이 나타남을 확인하였다. 또한, 신경세포에서 발현되는 nNOS (neuronal nitric oxide synthase)와 PSD95의 발현과 세포사멸 인자로서 cleaved caspase-3의 발현변화를 확인하고자 24시간 처리된 세포로부터 단백질을 얻어 Western blot을 시행한 결과, H2O2에 의해 nNOS 와 PSD95의 발현이 감소하였고, JQ1에 의해 억제됨을 확인하였으며, H2O2에 의해 증가된 cleaved caspase-3의 발현이 JQ1에 의해 억제됨을 확인하였다 (도 2 참조).

본 발명자들은 JQ1에 의한 신경세포보호작용의 효과의 기전을 확인하고자 세포 내 ROS 생성량과 항산화물질인 GSH의 양을 측정하였다. 일차배양 한 신경세포에 JQ1을 처리하고 30분 후 H2O2를 처리하여 1시간 배양 후 ROS 측정 물질인 DCFH₂-DA를 처리하였고 GSH 측정 물질인 monochlorobimane을 처리하였다. 세포내 ROS 생성을 측정하기 위해 50 uM DCFH₂-DA를 세포에 처리하여 20 분 후에 PBS로 세척하고 0.1% triton X-100으로 세포로부터 DCF를 분비시켜 480/540 nm 파장에서 읽어 대조군과 비교 분석하였고, GSH를 측정하기 위해 20 uM monochlorobimane 을 세포에 처리하여 20분후에 PBS로 세척하고 0.1% triton X-100를 처리하여 380/490 nm 파장에서 읽어 대조군과 비교 분석하였다. 그 결과, H2O2에 의해 증가된 세포내 ROS는 JQ1 농도의존적으로 감소되었고, H2O2에 의해 감소된 GSH 레벨은 JQ1에 의해 농도 의존적으로 회복됨을 확인하였다 (도 3 참조). 이러한 결과는, JQ1이 신경세포에서 항산화물질인 GSH를 증가시킴으로서 증가된 ROS를 억제하는 효과를 통해 신경세포사멸을 억제할 수 있음을 보여주었다.

이 후, 신경세포에서의 JQ1의 보호작용을 ex vivo 상태인 organotypic hippocampal slice culture에서 확인하고자 7일령 흰쥐의 두뇌로부터 해마부위를 400 mm 절편을 만들어 mesh에서 10일간 배양하였다. 10일 후에 JQ1을 농도별로 처리하고 1시간 후, H2O2를 처리하였고 24시간 후 단백질을 얻어 Western blot으로 신경세포에서 발현되는 단백질인 nNOS, PSD95의 발현과 caspase-3의 발현별화를 확인하였과. 그 결과, H2O2에 의해 감소된 nNOS 와 PSD95의 발현이 JQ1에 의해 억제됨을 확인하였으며, H2O2에 의해 감소된 caspase-3의 발현이 JQ1에 의해 억제됨을 확인하였다 (도 4 참조).

본 발명자들은 JQ1의 신경보호작용에 대한 다른 매개물질로서 tissue plasminogen activator(tPA)의 활성변화에 대한 효과를 확인해보고자, mixed glia에 LPS와 JQ1을 처리하고 24 시간 후 배지를 얻어 casein zymography를 시행하였다. 그 결과, LPS에 의해 감소된 tPA 할성이 JQ1에 의해 회복됨을 확인하였다 (도 5 참조).

상기 결과를 통해, 본 발명자들은 신경세포사멸시 JQ1의 보호작용이 항산화물질인 GSH 발현을 증가 세포 내 ROS를 억제작용을 통해 나타나고 이때 tPA와 같은 매개물질의 증가를 통해 나타날 수 있음을 증명하였다.

상기 결과를 바탕으로 본 발명은 JQ1이 뇌신경질환시 나타나는 신경세포의 사멸을 억제할 수 있음을 제공한다.

본 발명은 JQ1이 뇌신경세포에서의 신경 세포사멸에 대해 보호작용을 나타냄을 확인한 것으로서 신경염증 및 신경세포사멸이 동반되는 뇌신경질환에서 새로운 치료타겟을 확립하고 신약을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 conditioned media에 의한 신경세포사멸에 대한 효과를 나타낸 그림이다.
JQ1 (100, 500 nM)을 mixed glia (astrocyte and microglia)에 처리한 후 그 미디어를 신경세포에 처리하여 신경세포사멸에 대한 효과를 확인한 그림
도 2는 일차배양 한 신경세포에서 신경세포사멸에 대한 JQ1의 효과에 대한 결과이다. a는 산화적 스트레스 자극인 H2O2에 의한 신경세포 사멸에 대한 JQ1의 신경세포보호효과를 MTT 분석을 통해 확인 한 결과이고, b는 산화적 스트레스 자극인 H2O2에 의한 신경세포 사멸에 대한 JQ1의 신경세포보호효과를 확인하고자 단백질을 얻어 Western blotting을 시행한 결과이다.
도 3은 Intracellular ROS 생성량과 GSH 변화에 대한 JQ1의 효과를 확인한 결과로, a는 ROS 생성량에 대한 JQ1의 효과를 나타내고, b는 GSH 변화에 대한 JQ1의 효과를 나타낸다.
도 4는 Organotypic hippocampal slice culture에서 H2O2 자극에 의한 세포사멸에 대한 JQ1의 효과에 대한 결과이다.
도 5는 Tissue plasminogen activator 활성에 대한 JQ1의 효과에 대한 결과이다. JQ1 (100, 500 nM)을 mixed glia (astrocyte and microglia)에 처리한 후 LPS 10 ng/ml에 의해 감소한 tPA 활성에 대한 JQ1의 효과

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: LPS와 함께 JQ1이 처리된 conditioned media에 의한 신경세포사멸에 대한 효과

생후 2일령된 흰쥐의 뇌로부터 배양한 mixed glia에 10 ng/ml LPS와 JQ1 (100, 500 nM)을 처리하여 24시간 배양 후 배지를 얻어 일차배양 한 신경세포에 처리하여 24시간 후 세포사멸에 대한 효과를 MTT 분석을 통해 확인하였다.

JQ1(100, 500 nM)을 mixed glia (astrocyte and microglia)에 처리하여 24시간 후 그 미디어를 얻어 일차배양한 신경세포에 처리하여 신경세포사멸에 대한 효과를 확인한 결과, LPS에 의해 증가한 신경세포사멸이 JQ1 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다.

실시예 2: 일차배양 한 신경세포에서 신경세포사멸에 대한 JQ1의 효과에 대한 결과

임신 17.5일된 흰쥐의 태자로부터 뇌를 얻어 신경세포를 배양하고 일차 배양된 신경세포에서JQ1의 효과를 확인하고자 세포배양 후 8일째에 H2O2로 자극을 주고 JQ1 (100, 500 nM)을 직접 처리하고 24 시간 후 MTT 분석을 통해 세포사멸을 확인하였고 Western blot을 세포사멸 시 증가하는 단백질인 caspase-3의 활성, 신경세포에서 발현되는 nNOS, PSD95의 발현양을 확인하였다.

<A> 일차배양 한 신경세포에서 H2O2 자극에 의한 신경세포사멸에 대한 JQ1의 효과

산화적 스트레스 자극인 H2O2에 의한 신경세포 사멸에 대한 JQ1의 신경세포보호효과를 MTT 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, H2O2에 의한 신경세포의 사멸은 JQ1 (10, 50, 100 nM) 에 의해 억제되었다.

<B> 일차배양 한 신경세포에서 caspase-3 활성에 대한 JQ1의 효과

산화적 스트레스 자극인 H2O2에 의한 신경세포 사멸에 대한 JQ1의 신경세포보호효과를 확인하고자 단백질을 얻어 nNOS, PSD95, cleaved caspase-3의 발현변화를 Western blotting을 통해 확인한 결과, H2O2에 의해 감소한 nNOS, PSD95 단백질 발현이 JQ1에 의해 억제되었고, H2O2에 의해 증가한 Cleaved caspase-3의 발현이 JQ1에 의해 억제되었다 (도 2).

실시예 3: 일차 배양한 신경세포에서 H2O2에 의한 ROS 증가에 대한 JQ1의 효과

일차배양한 신경세포에서 H2O2 자극에 의해 증가된 세포 내 ROS와 감소한 항산화 단백질 GSH 변화에 대한 JQ1의 효과를 확인하였다.

<A> ROS 생성량에 대한 JQ1의 효과

세포 내 생성된 ROS양을 측정하기 위해 50 mM DCFH₂-DA를 사용하였다. JQ1 처리 후 24시간 뒤에 50 mM DCFH₂-DA를 넣어주고 20분간 배양 후 PBS로 세척하였다. 0.1 % Triton X-100을 넣어주고 5분간 배양 후 200 ml 씩 빛이 차단되는 96 well assay plate에 옮겨 ELISA Reader (Gemini EM, Molecular probe)를 이용하여 480/540 nm 파장에서 읽어 분석하였다. 그 결과, H2O2 에 의해 증가된 세포 내 ROS는 JQ1 에 의해 감소하였다 (도 3).

<B> GSH 변화에 대한 JQ1의 효과

세포에서 생성된 ROS를 제거하는 항산화 물질인 GSH (glutathione)의 변화를 측정하기 위해 20 mM monochlorobimane (mBCl) 을 이용하였다. JQ1 처리 후 24시간 뒤에 20 uM monochlorobimane (mBCl) 을 넣어주고 20분간 배양 후 PBS로 세척하였다. 0.1 % Triton X-100을 넣어주고 5분간 배양 후 200 ml 씩 빛이 차단되는 96 well assay plate에 옮겨 ELISA Reader (Gemini EM, Molecular probe)를 이용하여 380/490 nm 파장에서 읽어 분석하였다. 그 결과, H2O2에 의해 감소된 세포 내 GSH 는 JQ1 농도의존적으로 다시 회복되었다 (도 3).

실시예 4: Organotypic hippocampal slice culture에서 H2O2 자극에 의한 세포사멸에 대한 JQ1 의 효과

JQ1에 의한 신경세포의 보호작용을 확인하고자 organotypic hippocampal slice culture를 하였다. 7일령의 흰쥐 두뇌로부터 해마를 얻어 400 mm 두께로 절편을 얻어 mesh 위에 6개를 얹어 5% CO2 배양기에서 10 일간 배양하였다. 10일 후 혈청이 없는 배지로 갈아주고 H2O2와 JQ1을 처리하고 24 시간 뒤에 단백질을 얻어 nNOS, PSD95의 발현변화와 caspase-3의 활성 정도를 Western blot을 통해 확인하였다. 그 결과, H2O2에 의해 감소한 nNOS와 PSD95의 발현이 JQ1에 의해 농도의존적으로 회복되었고, H2O2에 의해 감소한 procaspase-3의 발현이 JQ1에 의해 농도의존적으로 증가함을 확인하였다. 즉, ex vivo 조건인 organotypic hippocampal slice culture에서 H2O2에 의한 사멸이 JQ1에 의해 회복됨을 확인하였다 (도 4).

실시예 5: tPA(Tissue plasminogen activator)활성에 대한 JQ1 의 효과

흰쥐의 뇌로부터 mixed glia에 10 ng/ml LPS와 JQ1 (100, 500 nM)을 처리하여 24시간 배양 후 배지를 얻어 casein zymography를 통해 JQ1에 의해 tPA 활성 변화를 확인하였다.

그 결과, JQ1을 mixed glia (astrocyte and microglia)에 처리하여 24시간 후 그 미디어를 얻어 casein zymography를 통해 tPA 활성을 확인해 본 결과, LPS 자극에 의해 감소한 tPA 활성이 JQ1 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다 (도 5).

이와 같은 결과를 통해 JQ1 은 뇌세포에서 tPA활성을 증가시킴을 확인하였다.

Claims (9)

1. JQ1을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 JQ1의 유효량은 10nM에서 100nM인 것을 특징으로 하는 뇌신경질환 치료용 약학 조성물.
3. JQ1을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 완화용 식품 조성물.
4. JQ1을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 LPS에 의해 증가한 신경세포사멸로부터 신경세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 4항에 있어서, 상기 JQ1의 유효량은 10nM에서 100nM인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. JQ1을 유효성분으로 포함하는 세포의 산화적 스트레스 억제용 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 산화적 스트레스는 과산화 수소에 의하여 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 상기 JQ1의 유효량은 50nM에서 100nM인 것을 특징으로 하는 조성물.

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