KR20160127821A - 다량체 Fc 단백질 - Google Patents

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데이비드 폴 험프리스
셜리 제인 피터스
브라이언 존 스미스
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Abstract

본 발명은 인간 Fc 수용체에 결합하는 다량체 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단백질을 포함하는 치료 조성물, 및 면역 장애의 치료에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

다량체 Fc 단백질{MULTIMERIC FC PROTEINS}
본 발명은 인간 Fc 수용체에 결합하는 다량체 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 다량체 융합 단백질을 포함하는 치료 조성물, 및 면역 장애의 치료에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
면역 장애는 상이한 징후, 증상, 병인 및 발병 메커니즘을 갖는 매우 다양한 질환들을 포괄한다. 이 질환들 중 많은 질환들은 병원성 항체 및/또는 병원성 면역 복합체의 능동적인 개입을 특징으로 한다. 일부 질환들, 예컨대, ITP(면역 혈소판감소증, 면역 혈소판자색반증, 특발성 저혈소판자색반증으로서 가변적으로 지칭됨)에서, 병원성 항체에 대한 표적 항원(Hoemberg, Scand HJ Immunol, Vol 74(5), p489-495, 2011) 및 질환 과정이 상당히 잘 이해되어 있다. 이러한 면역 장애들은 종종 단일요법 또는 조합요법으로 사용되는 다양한 보편적인 약제들에 의해 치료된다. 이러한 약제들의 예는 다수의 부작용들, 정맥내 면역글로불린(IVIG) 및 항-D와 관련되어 있는 코르티코스테로이드(corticosteroids)이다.
종종 면역글로불린으로서 지칭되는 항체는 쇄간 디설파이드(disulphide) 결합에 의해 함께 결합되어 있는 2개의 동일한 중쇄(H) 및 2개의 동일한 경쇄(L)를 포함하는 Y형 분자이다. 각각의 쇄는 서열에서 상이하고 항원 결합을 담당하는 하나의 가변 도메인(V)으로 구성된다. 또한, 각각의 쇄는 하나 이상의 불변 도메인(C)으로 구성된다. 경쇄에는 단일 불변 도메인이 존재한다. 중쇄에는 아이소타입(isotype)에 따라 3개 이상, 종종 4개의 불변 도메인들이 존재한다(IgG, IgA 및 IgD는 3개의 불변 도메인들을 갖고, IgM 및 IgE는 4개의 불변 도메인들을 갖는다).
인간에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로서 지칭되는 면역글로불린의 5종의 상이한 클래스들 또는 아이소타입들이 존재한다. 모든 이 클래스들은 기본 4쇄 Y형 구조를 갖지만, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로서 지칭되는 그들의 중쇄들에서 상이하다. IgA는 IgA1 및 IgA2로서 지칭되는 2종의 서브클래스들로 더 세분될 수 있다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로서 지칭되는 IgG의 4종의 서브클래스들이 존재한다.
항체의 Fc 도메인은 전형적으로 이량체화하여 Fc 도메인을 형성하는, 각각의 중쇄의 적어도 마지막 2개의 불변 도메인들을 포함한다. Fc 도메인은 원칙적으로 FcRn에의 결합, 신체 전체에 걸친 분포, 보체를 고정시키는 능력 및 세포 표면 Fc 수용체에의 결합을 통한 항체 반감기의 결정을 포함하는 항체 이펙터 기능의 제공을 담당한다.
항체 아이소타입들 사이의 차이는 Fc 도메인에서 가장 현저하고, 이것은 항원에의 결합 시 상이한 이펙터 기능의 유발로 이어진다. 구조적 차이도 항체의 중합 상태의 차이로 이어진다. 따라서, IgG, IgE 및 IgD는 일반적으로 단량체인 반면, IgM은 오량체 및 육량체 둘 다로서 존재하고, IgA는 주로 혈청에서 단량체로서 존재하고 장점액성 분비물에서 이량체로서 존재한다.
정맥내 면역글로불린(IVIG)은 수천 명의 건강한 혈액 기증자들로부터 모은 면역글로불린이다. IVIG는 낮은 IgG 수준을 갖는 환자에서 기회 감염을 예방하기 위한 IgG 대체 요법으로서 처음에 사용되었다(문헌(Baerenwaldt, Expert Rev Clin Immunol, Vol 6(3), p425-434, 2010)에서 검토됨). ITP를 갖는 소아에서 IVIG의 소염 성질이 발견된 후(Imbach, Helv Paediatri Acta, Vol 36(1), p81-86, 1981), IVIG는 현재 ITP, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 가와사키병(Kawasaki disease) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증의 치료용으로 허가를 받은 상태이다(Nimmerjahn, Annu Rev Immunol, Vol 26, p513-533, 2008).
병원성 면역 복합체를 수반하는 질환에서, 성분 면역글로불린 분획의 소수 분획이 불균형적으로 효과적이라는 것이 제안되었다. 미량(전형적으로 1%∼5%)의 IgG가 IVIG 내에서 다량체 형태로 존재한다는 것이 관찰된다. 이 다량체 분획의 대부분은 보다 더 적은 양의 삼량체 이상의 형태를 가지면서 이량체인 것으로 생각된다. 추가 이량체가 수용자 항-이디오타입(idiotype) 항체의 결합에 의해 주입 후 형성될 수 있다는 것도 제안되었다. 한 이론은 이 다량체 형태들이 그들의 향상된 결합력(avidity)으로 인해 저친화성 Fcγ 수용체에의 결합에 대해 면역 복합체와 경쟁한다는 것이다(Augener, Blut, Vol 50, p249-252, 1985; Teeling, Blood Vol 98(4), p1095-1099, 2001; Machino, Y., Clin Exp Immunol, Vol 162(3), p415-424, 2010; Machino, Y. et al., BBRC, Vol 418, p748-753, 2012). 또 다른 이론은 IVIG 내의 IgG의 시알산 당형태(glycoforms), 특히 보다 더 높은 수준의 α2-6 시알산 형태의 존재가 Fcγ 수용체 활성화 상태의 변경을 야기한다는 것이다(Samuelsson, Science, Vol 291, p484-486, 2001; Kaneko, Science, Vol 313, p670-673, 2006; Schwab, European J Immunol Vol 42, p826-830, 2012; Sondermann, PNAS, Vol 110(24), p9868-9872, 2013).
병원성 항체를 수반하는 질환에서, 인간에게 투여된 매우 큰 용량(1∼2 g/kg)의 IVIG가 FcRn에 의해 수행된 정상적인 IgG 항상성 메커니즘을 효과적으로 압도한다는 것이 제안되었다. 효과적으로, 기증자 IVIG에 의한 수용자 IgG의 큰 희석은 환자 병원성 항체의 향상된 이화작용 및 보다 더 짧은 혈청 반감기를 야기한다. 효능에 대한 다른 제안된 메커니즘은 병원성 항체의 항-이디오타입 중화 및 보체 인자의 일시적인 감소를 포함한다(Mollnes, Mol Immunol, Vol 34, p719-729, 1997; Crow, Transfusion Medicine Reviews, Vol 22(2), p103-116, 2008; Schwab, I. and Nimmerjahn, F. Nature Reviews Immunology, Vol 13, p176-189, 2013).
IVIG의 임상적 사용에 대한 상당한 단점들이 존재한다. IVIG는 제조 방법 및 기증자 풀(pools)의 본질적인 차이로 인해 제조자들 사이에 가변적인 제품 품질을 갖는다(Siegel, Pharmacotherapy Vol 25(11) p78S-84S, 2005). IVIG는 매우 큰 용량, 전형적으로 대략 1∼2 g/kg으로 제공된다. 이 큰 용량은 환자에게 불편함을 줄 수 있고 주입 관련 부작용을 초래할 수 있는, 긴 주입 지속시간(종종 수일에 걸쳐 분산된 4시간∼8시간)을 필요로 한다. IgA 결핍 개체들에서 잘 이해되어 있는 반응인 심각한 부작용이 일어날 수 있다. 사이토카인 방출도 IVIG를 제공받는 환자들에서 관찰될 수 있으나, 이것은 주로 용량 및 주입 속도의 조심스러운 조절에 의해 최소화된다. 환자당 사용된 많은 양 및 인간 기증자에의 의존의 결과로서, IVIG의 제조는 비싸고 전세계적 공급은 심각하게 제한된다.
종합하면, IVIG의 단점은 병원성 항체 및 병원성 면역 복합체의 질환 생물학을 방해할 수 있는 분자의 임상적 공급, 투여 및 효능의 관점에서 개선할 필요성이 있다는 것을 의미한다.
IVIG 요법에 대한 잠재적인 대체 요법으로서 사용하기 위한 중합체 Fc 융합 단백질이 문헌에 기재되어 있다(Mekhaiel et al.; Nature Scientific Reports 1:124, published 19th October 2011). 이 문헌(Mekhaiel et al.)에는 육량체 hIgG1-Fc-LH309/310CL-테일피스(tailpiece)가 기재되어 있다.
본 발명자들은 변경된 Fc 수용체 결합 및/또는 변경된 보체 결합을 포함하는, 단백질의 이펙터 기능을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질을 생성하였다. 상기 변경은 본 발명의 다량체 융합 단백질의 안전성 및 효능을 크게 개선한다.
따라서, 본 발명에서 본 발명자들은 IVIG 및 종래기술 대체물들의 단점들 중 많은 단점들을 해결하는, 개선된 제조용이성 및 보다 더 큰 효능 및 안전성을 갖는 개선된 다량체 융합 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 조심스럽게 조절된 조건 하에서 다량으로 생성되어, 제한된 공급 및 가변적인 품질이라는 문제점을 제거할 수 있다. 나아가, 개선된 효능 및 안전성은 보다 더 적은 용량의 투여를 가능하게 하고 부작용의 위험을 감소시킨다.
상기 문헌(Mekhaiel et al.)에 기재된 단백질은 일차적으로 백신으로서 사용되기 위해 개발되었고, 전형적으로 "융합 파트너"로서 지칭되는 상이한 단백질, 예컨대, 항원, 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), 약물, 리간드, 수용체, 사이토카인 또는 케모카인에 융합되었다. 일례에서, 본 발명의 단백질은 융합 파트너를 포함하지 않는다.
재조합 IgM 유사 IgG를 생성하기 위해 IgM 또는 IgA로부터의 카복실-말단 테일피스가 전체 IgG 분자 불변 영역의 카복실-말단에 추가된 중합체 융합 단백질은 종래기술에 기재되어 있다(Smith R.I.F. and Morrison, S.L. Biotechnology, Vol 12, p683-688, 1994; Smith R.I.F. et al., J Immunol, Vol 154, p2226-2236, 1995; Sørensen V. et al., J Immunol, Vol 156, p2858-2865, 1996). 연구된 IgG 분자는 가변 영역을 포함하는 온전한 면역글로불린이었다. 대조적으로, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 항체 가변 영역을 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명에서 본 발명자들은 IVIG 및 종래기술 대체물들의 단점들 중 많은 단점들을 해결하는, 개선된 제조용이성 및 보다 더 큰 안전성 및 효능을 갖는 개선된 다량체 융합 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 조심스럽게 조절된 조건 하에서 다량으로 재조합적으로 생성되어, 제한된 공급 및 가변적인 품질이라는 문제점을 제거할 수 있다. 나아가, 보다 더 큰 안전성 및 효능은 보다 더 적은 용량의 투여를 가능하게 하고 부작용의 위험을 상당히 감소시킨다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 "Fc-다량체"로서 총칭되고, 이들 2개의 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 숙련된 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌들 및 특허들은 참고로 도입된다.
본원에 기재된 실시양태들 중 임의의 실시양태들이 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
달리 특정되어 있지 않은 한, 본 명세서에서 항체 도메인 내의 잔기를 지칭하기 위해 EU 넘버링 시스템이 사용된다. 이 시스템은 처음에 문헌(Edelman et al., 1969)의 저자들에 의해 고안되었고 문헌(Kabat et al., 1987)에 상세히 기재되어 있다(Edelman et al., 1969; "The covalent structure of an entire γG immunoglobulin molecule," PNAS Biochemistry Vol.63 pp78-85; Kabat et al., 1987; in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).
위치 번호 및/또는 아미노산 잔기가 특정 항체 아이소타입에 대해 주어진 경우, 당분야에서 숙련된 자에 의해 공지되어 있는 바와 같이, 이것은 임의의 다른 항체 아이소타입 내의 상응하는 위치 및/또는 아미노산 잔기에 적용될 수 있다. IgM 또는 IgA로부터 유래된 테일피스 내의 아미노산 잔기를 지칭할 때, 주어진 위치 번호는 당분야의 통상적인 관행에 따라 천연 생성 IgM 또는 IgA 내의 잔기의 위치 번호이다.
본 발명은 2개 이상의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함하는 다량체 융합 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 중쇄 Fc 영역들을 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함하고; 각각의 중쇄 Fc 영역은, 위치 309의 시스테인 잔기, 및 FcR 결합 및/또는 보체 결합을 변경시키는 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함하고, 그 C-말단에서, 단량체 단위가 다량체로 조립되게 하는 테일피스에 융합되며; 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 가변 영역을 포함하지 않는 것인 다량체 융합 단백질을 제공한다.
일례에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 융합 파트너를 추가로 포함한다. 용어 '융합 파트너'는 구체적으로 하나 이상의 항체 가변 도메인을 배제한다. 전형적으로, 용어 '융합 파트너'는 항원, 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), 약물, 리간드, 수용체, 사이토카인 또는 케모카인을 지칭한다.
존재하는 경우 상기 융합 파트너는 중쇄 또는 각각의 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 융합된다. 융합 파트너는 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 직접적으로 융합될 수 있다. 대안적으로, 융합 파트너는 존재하는 경우 힌지(hinge)를 포함할 수 있는 개재 아미노산 서열에 의해 간접적으로 융합될 수 있다. 예를 들면, 융합 파트너와 중쇄 Fc 영역 사이에 짧은 링커 서열이 제공될 수 있다.
일례에서, 본 발명의 단백질은 융합 파트너를 포함하지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 하나 이상의 항체 가변 영역을 포함하지 않고, 전형적으로 상기 분자는 VH 또는 VL 항체 가변 영역을 포함하지 않는다. 일례에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 Fab 단편을 포함하지 않는다.
본 발명의 다량체 융합 단백질의 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명의 항체 Fc 도메인은 임의의 적합한 종으로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인으로부터 유래된다.
항체 Fc 도메인은 (서브클래스 IgA1 및 IgA2를 포함하는) IgA, IgD, IgE, (서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는) IgG 및 IgM을 포함하는, 항체의 임의의 적합한 클래스로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 항체 Fc 도메인은 IgG1로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 항체 Fc 도메인은 IgG4로부터 유래된다.
항체 Fc 도메인은 중쇄 Fc 영역으로서 각각 지칭되는 2개의 폴리펩티드 쇄들을 포함한다. 2개의 중쇄 Fc 영역들은 이량체화하여 항체 Fc 도메인을 생성한다. 항체 Fc 도메인 내의 2개의 중쇄 Fc 영역들이 서로 상이할 수 있지만, 이들은 통상적으로 서로 동일할 것이라는 것이 인식될 것이다. 따라서, 용어 '중쇄 Fc 영역'이 이하 본원에서 사용되는 경우, 이것은 동일한 중쇄 Fc 영역과 이량체화하여 항체 Fc 도메인을 생성하는 단일 중쇄 Fc 영역을 지칭하는 데 사용된다.
전형적으로, 각각의 중쇄 Fc 영역은 2개 또는 3개의 중쇄 불변 도메인들을 포함하거나 이들로 구성된다.
천연 항체에서, IgA, IgD 및 IgG의 중쇄 Fc 영역은 2개의 중쇄 불변 도메인들(CH2 및 CH3)로 구성되고, IgE 및 IgM의 중쇄 Fc 영역은 3개의 중쇄 불변 도메인들(CH2, CH3 및 CH4)로 구성된다. 이들은 이량체화하여 Fc 도메인을 생성한다.
본 발명에서, 중쇄 Fc 영역은 항체의 하나 이상의 상이한 클래스, 예를 들면, 1개, 2개 또는 3개의 상이한 클래스로부터의 중쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인들을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG2로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인들을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG3으로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인들을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인들을 포함한다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 "Fc-다량체"로서 총칭되고, 이들 2개의 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명자들은 예상외로 CH3 도메인이 본 발명의 다량체 융합 단백질의 단량체 단위들의 중합을 조절하는 데서 상당한 역할을 수행한다는 것을 발견하였다. 중합은 예상외로 Fc 영역이 유래된 IgG 서브클래스에 따라 달라지는 것으로 확인되었다. IgG1로부터 유래된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc-다량체는 육량체로 매우 효율적으로 조립되었고, 이때 대략 80%의 분자들이 육량체 형태로 존재하였다. 대조적으로, IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc-다량체는 보다 더 낮은 수준의 육량체를 형성하였다. CH2 도메인이 한 특정 IgG 서브클래스로부터 유래되었고 CH3 도메인이 상이한 IgG 서브클래스로부터 유래된 하이브리드 Fc 영역을 포함하는 Fc-다량체의 연구는 육량체를 형성하는 능력이 주로 CH3 도메인에 의해 코딩된다는 것을 보여주었다. IgG1로부터 유래된 CH3 도메인의 존재는 육량체화를 상당히 증가시킨다. CH3 도메인이 IgG1로부터 유래되고 CH2 도메인이 IgG4로부터 유래된 하이브리드 Fc-다량체는 단지 IgG1 야생형만큼 효율적으로 조립되었고, 이때 대략 80%의 분자들이 육량체로서 확인되었다(실시예 4 및 도 3). 따라서, IgG1의 CH3 도메인에 의한 IgG4의 CH3 도메인의 교체는 야생형 IgG4 Fc-다량체에 비해 육량체화의 수준을 개선한다. 생성된 하이브리드는 IgG4의 바람직한 성질들 중 많은 바람직한 성질들을 보유하면서 고수준의 육량체 형성이라는 장점을 갖는다.
추가로, IgG1의 CH3 도메인은 열적 안정성을 부여하는 것으로 공지되어 있다(Garber and Demarest, Biochem and Biophys Res Comm, Vol 355 p751-757 2007). 따라서, IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드 Fc-다량체는 개선된 안정성도 가질 것이다.
따라서, 한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함하는 다량체 융합 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 중쇄 Fc 영역들을 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함하고; 각각의 중쇄 Fc 영역은, 위치 309의 시스테인 잔기를 포함하고, 그 C-말단에서, 단량체 단위들이 다량체로 조립되게 하는 테일피스에 융합되며; 각각의 중쇄 Fc 영역은 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하고, 경우에 따라 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 가변 영역을 포함하지 않는 것인 다량체 융합 단백질을 제공한다.
이 다량체 융합 단백질은 본원에 후술되어 있는 바와 같이 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함하는 다량체 융합 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 중쇄 Fc 영역들을 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함하고; 각각의 중쇄 Fc 영역은, 위치 309의 시스테인 잔기, 및 FcR 결합 및/또는 보체 결합을 변경시키는 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함하고, 그의 C-말단에서, 단량체 단위가 다량체로 조립되게 하는 테일피스에 융합되며; 각각의 중쇄 Fc 영역은 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하고, 경우에 따라 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 가변 영역을 포함하지 않는 것인 다량체 융합 단백질을 제공한다.
본 발명자들은 CH3 도메인의 위치 355의 아미노산이 육량체화를 위해 매우 중요하다는 것을 입증한다. IgG1 CH3 도메인의 위치 355에서 통상적으로 발견되는 아르기닌 잔기는 특히 효율적인 육량체화를 촉진하는 것으로 확인되었다. 본원에 후술되어 있는 실시예 4를 참조한다.
따라서, 한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 위치 355에서 아르기닌 잔기를 포함한다.
IgG1 CH3 도메인의 위치 355에서 통상적으로 발견되는 아르기닌 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 것(R355C)은 야생형 IgG1의 육량체 형성을 능가하는 수준까지 육량체 형성을 증가시켰다. 본원에 후술되어 있는 실시예 4를 참조한다.
따라서, 한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 위치 355에서 시스테인 잔기를 포함한다.
IgG4로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 본 발명의 Fc-다량체에서, 아르기닌 잔기에 의한 위치 355의 글루타민 잔기의 치환(Q355R)은 육량체화를 상당히 증가시킨다. 따라서, IgG4 Fc-다량체의 보다 더 낮은 육량체화라는 문제점은 단일 아미노산 치환에 의해 해결될 수 있다. 이것은 생성된 Fc-다량체가 IgG4의 특징적인 성질을 보유하면서 고효율로 육량체로 조립된다는 장점을 갖는다.
따라서, 한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 위치 355의 글루타민 잔기가 다른 아미노산으로 치환된, IgG4로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 위치 355의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환되거나(Q355R) 시스테인 잔기로 치환된(Q355C), IgG4로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함하는 다량체 융합 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 중쇄 Fc 영역들을 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함하고; 각각의 중쇄 Fc 영역은, 위치 309에서 시스테인 잔기를 포함하고, 그 C-말단에서, 단량체 단위들이 다량체로 조립되게 하는 테일피스에 융합되며; 각각의 중쇄 Fc 영역은 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인, 및 위치 355의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기 또는 시스테인 잔기로 치환된, IgG4로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하고, 경우에 따라 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 가변 영역을 포함하지 않는 것인 다량체 융합 단백질을 제공한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgM으로부터 유래된 CH4 도메인을 포함한다. IgM CH4 도메인은 전형적으로 CH3 도메인과 테일피스 사이에 위치한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인, 및 IgM으로부터 유래된 CH4 도메인을 포함한다.
본 발명의 중쇄 Fc 영역을 생성하는 데 사용되는 중쇄 불변 도메인은 전술된 천연 생성 불변 도메인의 변이체를 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이러한 변이체는 야생형 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 변이를 포함할 수 있다. 일례에서, 본 발명의 중쇄 Fc 영역은 서열에서 야생형 불변 도메인과 상이한 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 변이체 불변 도메인은 야생형 불변 도메인보다 더 길 수 있거나 더 짧을 수 있다는 것이 인식될 것이다. 바람직하게는, 변이체 불변 도메인은 야생형 불변 도메인과 50% 이상 동일하거나 유사하다. 본원에서 사용된 용어 "동일성"은 정렬된 서열들 내의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 동일하다는 것을 표시한다. 본원에서 사용된 용어 "유사성"은 정렬된 서열들 내의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 유사한 유형의 아미노산 잔기라는 것을 표시한다. 예를 들면, 류신은 이소류신 또는 발린을 치환시킬 수 있다. 종종 또 다른 한 아미노산을 치환시킬 수 있는 다른 아미노산은 하기 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산들);
- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산들);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산들);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산들); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산들).
동일성 및 유사성의 정도는 용이하게 계산될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 일례에서, 변이체 불변 도메인은 야생형 불변 도메인과 60% 이상 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 70% 이상 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 80% 이상 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 90% 이상 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 95% 이상 동일하거나 유사하다.
각각의 중쇄 Fc 영역은, 그 C-말단에서, 폴리펩티드 단량체 단위들이 다량체로 조립되게 하는 테일피스에 융합된다.
IgM 및 IgA는 공통된 H2L2 항체 단위의 공유 다량체로서 인간에 천연적으로 존재한다. IgM은 J 쇄를 포함할 때 오량체로서 존재하거나, J 쇄를 결여할 때 육량체로서 존재한다. IgA는 단량체 및 이량체 형태로서 존재한다. IgM 및 IgA의 중쇄는 테일피스으로서 공지되어 있는, C-말단 불변 도메인에 대한 18 아미노산 연장부(extension)를 갖는다. 이 테일피스는 중합체에서 중쇄들 사이에 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하고 중합에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 여겨진다. 테일피스는 글리코실화 부위도 함유한다.
본 발명의 테일피스는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 테일피스는 천연 생성 항체에서 발견되는 테일피스일 수 있거나, 대안적으로 길이 및/또는 조성에서 천연 테일피스과 상이한 변경된 테일피스일 수 있다. 다른 변경된 테일피스는 전체적으로 합성 테일피스일 수 있고 다량체화를 위해 요구된 성질, 예컨대, 길이, 유연성 및 시스테인 조성을 갖도록 디자인될 수 있다.
테일피스는 임의의 적합한 종으로부터 유래될 수 있다. 항체 테일피스는 진화적으로 보존되어 있고 원시 종, 예컨대, 경골어류를 비롯한 대다수의 종들에서 발견된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 테일피스는 인간 항체로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 테일피스는 표 1에 표시된 바와 같이 인간 IgM 또는 IgA로부터 유래된 18 아미노산 테일피스 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.
테일피스는 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 직접적으로 융합될 수 있다. 대안적으로, 상기 테일피스는 개재 아미노산 서열에 의해 간접적으로 융합될 수 있다. 예를 들면, 테일피스과 중쇄 Fc 영역 사이에 짧은 링커 서열이 제공될 수 있다.
본 발명의 테일피스는 전술된 천연 서열의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. IgM 또는 IgA 테일피스의 변이체는 전형적으로 표 1에 표시된 18개의 아미노산 위치들 중 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 아미노산 위치들에서 천연 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 단편은 전형적으로 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 아미노산들을 포함한다. 테일피스는 하이브리드 IgM/IgA 테일피스일 수 있다. 변이체의 단편도 고려된다.
Figure pct00001
본 발명의 각각의 중쇄 Fc 영역은 경우에 따라 그의 N-말단에서 천연 또는 변경된 힌지 영역을 가질 수 있다.
천연 힌지 영역은 통상적으로 천연 생성 항체에서 Fab 도메인과 Fc 도메인 사이에서 발견될 힌지 영역이다. 변경된 힌지 영역은 길이 및/또는 조성에서 천연 힌지 영역과 상이한 임의의 힌지이다. 이러한 힌지는 다른 종으로부터 유래된 힌지 영역, 예컨대, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 상어, 돼지, 햄스터, 낙타, 라마 또는 염소 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 변경된 힌지 영역은 중쇄 Fc 영역의 클래스 또는 서브클래스와 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체로부터 유래된 완전한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 변경된 힌지 영역은 천연 힌지 또는 반복 단위의 일부를 포함할 수 있고, 이때 반복부 내의 각각의 단위는 천연 힌지 영역으로부터 유래된다. 추가 대안에서, 천연 힌지 영역은 하나 이상의 시스테인 또는 다른 잔기를 중성 잔기, 예컨대, 세린 또는 알라닌으로 전환시키거나 적절하게 배치된 잔기를 시스테인 잔기로 전환시킴으로써 변경될 수 있다. 이러한 수단에 의해 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 증가될 수 있거나 감소될 수 있다. 다른 변경된 힌지 영역은 전체적으로 합성 힌지 영역일 수 있고 원하는 성질, 예컨대, 길이, 시스테인 조성 및 유연성을 갖도록 디자인될 수 있다.
다수의 변경된 힌지 영역들이 예를 들면, 미국 특허 제5677425호, 국제 특허출원 공보 제WO9915549호, 국제 특허출원 공보 제WO2005003170호, 국제 특허출원 공보 제WO2005003169호, 국제 특허출원 공보 제WO2005003170호, 국제 특허출원 공보 제WO9825971호 및 국제 특허출원 공보 제WO2005003171호에 이미 기재되어 있고, 이들은 본원에 참고로 도입된다.
적합한 힌지 서열들의 예는 표 2에 제시되어 있다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 그의 N-말단에서 온전한 힌지 영역을 갖는다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역 및 힌지 영역은 IgG4로부터 유래되고, 힌지 영역은 돌연변이된 서열 CPPC(서열번호 11)를 포함한다. 인간 IgG4의 코어 힌지 영역은 서열 CPPC를 함유하는 IgG1에 비해 서열 CPSC(서열번호 12)를 함유한다. IgG4 서열에 존재하는 세린 잔기는 이 영역에서 증가된 유연성을 이끌어내므로, 분자들의 일부는 IgG 분자 내의 다른 중쇄와 가교결합하여 쇄간 디설파이드를 형성하기보다는 오히려 동일한 단백질 쇄 내에서 디설파이드(쇄내 디설파이드) 결합을 형성한다(Angal S. et al., Mol Immunol, Vol 30(1), p105-108, 1993). IgG1과 동일한 코어 서열을 제공하기 위해 세린 잔기를 프롤린으로 교체한 것은 IgG4 힌지 영역에서 쇄간 디설파이드의 완전한 형성을 가능하게 함으로써, 정제된 생성물에서 불균질성을 감소시킨다. 이 변경된 아이소타입은 IgG4P로서 지칭된다.
Figure pct00002
본 발명의 다량체 융합 단백질은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 이상의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함할 수 있다. 이러한 단백질들은 대안적으로 각각 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체, 십일량체, 십이량체 등으로서 지칭될 수 있다.
다량체 융합 단백질은 다양한 수의 폴리펩티드 단량체 단위들을 가진, 상이한 크기의 다량체 융합 단백질들의 혼합물을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 6개 또는 12개의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함한다.
일례에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 육량체이다.
따라서, 일례에서, 본 발명은 6개의 폴리펩티드 단량체 단위들로 구성된 다량체 융합 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 Fc 도메인 및 테일피스 영역으로 구성되고; 각각의 항체 Fc 도메인은 2개의 중쇄 Fc 영역들로 구성되고, 이때 각각의 중쇄 Fc 영역에서 위치 309의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기이고 각각의 중쇄 Fc 영역이 FcR 결합 및/또는 보체 결합을 변경시키는 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함하고; 경우에 따라, 각각의 중쇄 Fc 영역은 N-말단에서 힌지 영역을 갖고; 테일피스 영역은 각각의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 융합되고 단량체 단위들이 다량체로 조립되게 하는 것인 다량체 융합 단백질을 제공한다.
일례에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 정제된 육량체이다. 일례에서, 용어 '정제된'은 80% 초과의 육량체, 예를 들면, 90% 또는 95% 초과의 육량체를 의미한다.
본원에 후술되어 있는 바와 같이 임의의 적합한 방법, 예컨대, 분석 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 샘플 중의 육량체의 양을 측정할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
일례에서, 본 발명은 1종 초과의 다량체 형태, 예를 들면, 육량체 및 십이량체로 본 발명의 다량체 융합 단백질을 포함하는 혼합물로서, 상기 다량체 융합 단백질의 육량체 형태가 농후한 혼합물을 제공한다.
일례에서, 이러한 혼합물은 80% 초과의 육량체를 포함할 수 있다. 일례에서, 이러한 혼합물은 85%, 90% 또는 95% 초과의 육량체를 포함할 수 있다.
본 발명의 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 개별 폴리펩티드 쇄들을 포함한다. 특정 폴리펩티드 단량체 단위 내의 2개의 폴리펩티드 쇄들은 서로 동일할 수 있거나 서로 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 2개의 폴리펩티드 쇄들은 서로 동일하다.
유사하게, 특정 다량체 융합 단백질 내의 폴리펩티드 단량체 단위들은 서로 동일할 수 있거나 서로 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드 단량체 단위들은 서로 동일하다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄는 경우에 따라 대안적 힌지 또는 테일피스 서열을 갖는, 도 2에 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 일례에서, 본 발명은 2개 이상, 바람직하게는 6개의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함하거나 이들로 구성된 다량체 융합 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위가 서열번호 26∼32 및 50∼64 중 어느 하나로 제공된 서열을 각각 포함하거나 이러한 서열로 각각 구성된 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄들을 포함하고, 상기 폴리펩티드 단량체 단위가 항체 가변 영역을 포함하지 않는 것인 다량체 융합 단백질도 제공한다.
일례에서, 힌지 및 테일피스가 서열번호 26∼32 및 50∼64로 제공된 서열들과 상이할 수 있는 경우, 본 발명은 2개 이상의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함하는 다량체 융합 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 중쇄 Fc 영역들을 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함하고; 각각의 중쇄 Fc 영역은 서열번호 26∼29 및 32 중 어느 하나의 아미노산 6∼222 또는 서열번호 50∼64 중 어느 하나의 아미노산 6∼222로 제공된 서열, 또는 서열번호 30 또는 31의 아미노산 6∼333으로 제공되어 있고 단량체 단위들이 다량체로 조립되게 하는 테일피스에 그의 C-말단에서 융합되는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 상기 폴리펩티드 단량체 단위가 항체 가변 영역을 포함하지 않는 것인 다량체 융합 단백질을 제공한다.
전형적으로, 각각의 중쇄 Fc 영역은 C-말단에 존재하는 테일피스 이외에 N-말단에서 힌지 서열도 포함한다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 본원에 후술되어 있는 바와 같이 단백질의 기능적 성질, 예를 들면, Fc 수용체, 예컨대, FcRn 또는 백혈구 수용체에의 결합, 보체에의 결합, 변경된 디설파이드 결합 구조 또는 변경된 글리코실화 패턴을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 돌연변이들 중 임의의 돌연변이들이 원하는 기능적 성질을 달성하기 위해 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있고/있거나, 단백질의 기능적 성질을 변경시키기 위해 다른 돌연변이와 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
본 발명에서, 면역 장애의 치료에 사용되기에 특히 적합한 Fc-다량체가 생성되었다. 상기 Fc-다량체는 하기 성질들을 갖도록 조작되었다:
면역 장애의 치료에 사용되기 위해 Fc-다량체 단백질의 효능이 가능한 높아야 한다. 효능은 실시예 6에 기재된 바와 같이 항체로 피복된 표적 세포의 대식세포 식작용(식세포작용)의 억제를 측정함으로써 측정될 수 있다.
원치 않는 부작용은 가능한 낮아야 한다. 원치 않는 부작용은 각각 실시예 8, 15 및 16에 기재된 바와 같이 사이토카인 방출, C1q 결합 및 혈소판 활성화를 측정함으로써 측정될 수 있다.
임의의 추가 돌연변이 없이 IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG1 Fc-다량체는 식세포작용 억제의 높은 효능을 나타내지만 사이토카인 방출, C1q 결합 및 혈소판 활성화에 의해 측정된 고수준의 원치 않는 부작용도 보이기 때문에 면역 장애의 치료에 사용되기에 덜 적합할 수 있다.
IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG4 Fc-다량체는 그의 효능이 IgG1의 효능에 비해 낮지만 매우 낮은 수준의 원치 않는 부작용을 생성한다. 그럼에도 불구하고, 야생형 IgG4 Fc-다량체의 효능은 도 7에 나타낸 바와 같이 IVIG의 효능보다 여전히 상당히 더 높다.
일례에서, 본 발명은 바람직하지 않은 성질 없이 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들 둘 다의 바람직한 성질들을 겸비하도록 조작되어 있는 Fc-다량체 단백질도 제공한다. 이 Fc-다량체들은 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 원치 않는 부작용을 허용 가능한 수준까지 감소시키면서 효과적인 수준의 효능을 나타낸다. 이 Fc-다량체들은 면역 장애의 치료에 사용되기에 특히 유용할 것으로 예측된다.
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일례에서, 본 발명은 변경되지 않은 모 다량체 융합 단백질과 비교될 때 사이토카인 방출을 감소시키고/시키거나, 혈소판 활성화를 감소시키고/시키거나 C1q 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질을 제공한다. 일례에서, 비변경된 모 다량체 융합 단백질은 IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인들을 함유하는 본 발명의 다량체 융합 단백질이다.
사이토카인 방출, 혈소판 활성화 및 C1q 결합은 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 일례에서, 사이토카인 방출은 전혈 사이토카인 방출 분석에서 측정된다.
일례에서, 혈소판 활성화는 CD62p를 활성화 마커로서 사용하는 유동 세포 계수법(flow cytometry)에 의해 측정된다.
일례에서, C1q 결합은 ELISA에 의해 측정된다.
일례에서, 본 발명은 변경되지 않은 모 다량체 융합 단백질과 비교될 때 항체로 피복된 표적 세포의 대식세포 식작용의 억제 효능을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질을 제공한다. 일례에서, 변경되지 않은 모 다량체 융합 단백질은 IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인, 또는 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 함유하는 본 발명의 다량체 융합 단백질이다.
항체로 피복된 표적 세포의 대식세포 식작용의 억제를 측정하기에 적합한 분석은 당분야에서 공지되어 있고 본원의 실시예에 기재되어 있다.
따라서, 일례에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질의 각각의 중쇄 Fc 영역은, 위치 234의 류신 잔기 및/또는 위치 331의 프롤린 잔기 및/또는 위치 327의 알라닌 및/또는 위치 296의 티로신이 다른 아미노산으로 치환된, IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 234의 류신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환되고 위치 331의 프롤린 잔기가 세린 잔기로 치환된(L234F/P331S), IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인과 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드이다.
일례에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질의 각각의 중쇄 Fc 영역은, 위치 234의 페닐알라닌 잔기, 위치 296의 페닐알라닌 잔기, 위치 327의 글리신 잔기, 위치 330의 세린 잔기 및 위치 331의 세린 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된, IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG4 또는 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
일례에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질의 각각의 중쇄 Fc 영역은, F234; F234 및 F296; G327; G327 및 S331; S330 및 S331; 및 G327 및 S330으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 아미노산들의 쌍이 다른 아미노산으로 치환된, IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG4 또는 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 234의 페닐알라닌 잔기가 류신 잔기로 치환된(F234L), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 234의 페닐알라닌 잔기가 류신 잔기로 치환되고 위치 296의 페닐알라닌 잔기가 티로신 잔기로 치환된(F234L/F296Y), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 327의 글리신 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 330의 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된(G327A/S330A), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 327의 글리신 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 331의 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된(G327A/S331P), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 330의 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 331의 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된(S330A/S331P), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 234의 페닐알라닌 잔기가 류신 잔기로 치환된(F234L), IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드이다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 234의 페닐알라닌 잔기가 류신 잔기로 치환되고 위치 296의 페닐알라닌 잔기가 티로신 잔기로 치환된(F234L/F296Y), IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드이다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 327의 글리신 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 330의 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된(G327A/S330A), IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드이다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 327의 글리신 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 331의 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된(G327A/S331P), IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드이다.
한 실시양태에서, 중쇄 Fc 영역은, 위치 330의 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 331의 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된(S330A/S331P), IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드이다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 상응하는 폴리펩티드 단량체 단위 및/또는 천연 면역글로불린에 비해 하나 이상의 Fc 수용체(FcR)에의 변경된 결합을 보일 수 있다. 임의의 특정 Fc 수용체에의 결합은 증가될 수 있거나 감소될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 그의 Fc 수용체 결합 프로파일을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "돌연변이"는 하나 이상의 아미노산의 치환, 추가 또는 결실을 포함할 수 있다.
인간 세포는 FcαR, FcεR, FcγR, FcRn 및 글리칸 수용체로부터 선택된 다수의 막 결합된 FcR들을 발현할 수 있다. 일부 세포들은 가용성 (엑토도메인) FcR도 발현할 수 있다(검토를 위해서는 문헌(Fridman et al., (1993) J Leukocyte Biology 54: 504-512) 참조). FcγR은 IgG 결합의 친화력(높음/낮음) 및 생물학적 효과(활성화/억제)에 의해 더 나누어질 수 있다. 인간 FcγRI은 단독 '고친화성' 수용체인 것으로 널리 간주되는 반면, 나머지 전부는 중간 내지 낮은 친화성 수용체로서 간주된다. FcγRIIb는 그의 세포내 ITIM 모티프에 의해 '억제' 기능성을 갖는 단독 수용체인 반면, 나머지 전부는 ITAM 모티프 또는 공통된 FcγR - γ 쇄와의 페어링에 의해 '활성화 수용체'로서 간주된다. FcγRIIIb는 활성화 수용체이지만 GPI 앵커(anchor)를 통해 세포에 결합한다는 점에서 독특하다. 종합하건대, 인간은 6종의 '표준' FcγR들, 즉 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb를 발현한다. 이 서열들 이외에 이 패밀리들 전체에 걸쳐 분포된 다수의 서열 또는 알로타입(allotypic) 변이체들이 있다. 이들 중 일부는 중요한 기능적 결과를 갖는 것으로 발견되었으므로, 종종 그들 자신의 수용체 서브타입인 것으로 간주된다. 예로는 FcγRIIaH134R, FcγRIIbI190T, FcγRIIIaF158V, FcγRIIIbNA1, FcγRIIIbNA2 및 FcγRIIIbSH가 있다. 각각의 수용체 서열은 IgG의 4종의 서브클래스들, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대한 상이한 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Bruhns Blood (1993) Vol 113, p3716-3725). 다른 종들은 4종의 FcγR들, 즉 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV를 포함하는, 다소 상이한 수 및 기능성의 FcγR을 갖고, 마우스 시스템이 현재까지 가장 잘 연구되어 있다(Bruhns, Blood (2012) Vol 119, p5640-5649). 세포 상의 인간 FcγRI은 통상적으로 IgG1/IgG3/IgG4에 대한 그의 친화성(약 10-8 M) 및 혈청 중의 이 IgG들의 농도(약 10 mg/㎖)로 인해 정상 혈청 조건에서 단량체 IgG에 의해 '점유되어' 있는 것으로 간주된다. 따라서, 그들의 표면 상에서 FcγRI을 보유하는 세포들은 결합된 다중특이적 IgG를 통해 간접적으로 그들의 항원성 환경의 '스크리닝' 또는 '샘플링'에 유능한 것으로 간주된다. IgG 서브클래스에 대한 (약 10-5∼10-7 M의 범위 내의) 보다 더 낮은 친화성을 갖는 다른 수용체들은 통상적으로 '점유되지 않은' 것으로 간주된다. 따라서, 저친화성 수용체는 항체 수반된 면역 복합체의 검출 및 이러한 면역 복합체에 의한 활성화에 본질적으로 민감하다. 항체 면역 복합체에서의 증가된 Fc 밀도는 저친화성 FcγR에 대한 기능적 결합 친화성 '결합력'의 증가로 이어진다. 이것은 다수의 방법들의 이용을 통해 시험관내에서 입증되었다(Shields R.L. et al., J Biol Chem, Vol 276(9), p6591-6604, 2001; Lux et al., J Immunol (2013) Vol 190, p4315-4323). 또한, 이것은 인간에서 ITP를 치료하기 위한 항-RhD의 사용에서 일차 작용 모드들 중 하나인 것으로서 암시되어 있다(Crow Transfusion Medicine Reviews (2008) Vol 22, p103-116).
많은 유형의 세포들이 다수의 유형의 FcγR을 발현하므로, 항체 면역 복합체와 FcγR을 보유하는 세포의 결합은 생물학적 환경에 따라 다수의 복잡한 결과들을 가질 수 있다. 가장 단순하게는, 세포는 활성화, 억제 또는 혼합된 신호를 수용할 수 있다. 이것은 식작용(예를 들면, 대식세포 및 호중구), 항원 프로세싱(예를 들면, 수지상세포), 감소된 IgG 생성(예를 들면, B 세포) 또는 탈과립화(예를 들면, 호중구, 비만 세포)와 같은 사건을 초래할 수 있다. FcγRIIb로부터의 억제 신호가 활성화 신호보다 우세할 수 있다는 것을 뒷받침하는 데이터가 존재한다(Proulx Clinical Immunology (2010) 135:422-429).
사이토카인은 면역 시스템의 세포를 조절하거나 표적 세포, 예컨대, 바이러스에 의해 감염된 또는 전구암성 숙주 세포의 사멸을 달성하는 고효능 단백질들의 패밀리이다. 그들 자체를 치료 단백질로서 사용하거나 표적화 모이어티와의 융합 후 치료 단백질로서 사용하기 위해 고수준의 효능이 연구되고 있다. IL-2, TNFα, G-CSF, GM-CSF, IFNα, IFNβ 및 IFNγ 모두가 인간에서의 사용을 위해 연구되고 있다. 그들의 극도의 효능은 심각한 또는 삶을 위협하는 상태를 갖는 환자에서 다소 제한된 사용을 초래하는 광범위한 부작용 또는 불리한 사건에 의해 입증되었다.
생체내에서의 사이토카인의 생성은 치료 단백질, 예컨대, 항체 또는 면역글로불린의 전신 투여 후 유발될 수 있다. 사이토카인 생성은 짧게 지속될 수 있고 일시적으로, 예컨대, 주입 또는 피하 주사에 의한 투여 동안 및 직후에 일어날 수 있다. 예를 들면, 정맥내 면역글로불린의 주입은 흔한 주입 관련 사건들, 즉 발열, 오한 및 구역과 관련되어 있는 TNFα, IL-6, IL-8 및 IFNγ의 생성을 야기하는 것으로 공지되어 있다(Aukrust P et al., Blood, Vol 84, p2136-2143, 1994). 사이토카인 생성은 보다 더 오래 지속될 수 있고, 예를 들면, 소위 '종양 용해 증후군'에서와 같이 이펙터 세포의 활성화로 인한 약물 작용 모드와 관련될 수 있다. 극단적인 예는 약물의 투여가 '사이토카인 폭풍'을 야기할 때 생명을 위협하는 것이다(Suntharalingam G et al., N Engl J Med, Vol 355, p1018-1028, 2006).
조작된 재조합 단백질의 사이토카인 방출 위험을 이해하고 최소화할 분명한 필요성이 존재한다. 항체의 Fc 도메인을 함유하고 기능적으로 다가 단백질이 될 수 있는 재조합 단백질은 특별한 주의를 요구한다.
다량체 Fc 도메인의 본 연구에서, 사이토카인 방출을 최소화할 목적으로 돌연변이유발의 효과를 연구하기 위해 전혈 사이토카인 방출 분석을 활용하였다(실시예 7).
혈소판(트롬보사이트(thrombocyte))은 혈액에 매우 풍부한 작은 무핵 세포이다. 혈소판은 응고 인자 및 다른 세포들과 함께 혈액 응괴의 형성에 의한 지혈에 관여한다. 혈소판은 다수의 질환들에 관여한다. 낮은 혈소판 카운트 "혈소판감소증"은 다수의 인자들에 의해 야기될 수 있고 증가된 타박상 및 출혈을 초래한다. 우발적인 응고 "혈전증"은 졸중 및 심정맥 혈전증과 같은 사건들을 포함한다. 인간 및 비인간 영장류 혈소판들은 그들의 표면 상에서 FcγRIIa를 발현하나, 마우스 혈소판은 그러하지 않는다. 혈소판은 미리 형성된 '조밀한 과립' 및 '알파 과립'에 의한 혈관 손상, 및 강력한 이뮤노카인 및 다른 분자, 예컨대, 히스타민, 세로토닌, 트롬복산, PAF, PDGF, TGFγ IL1β 및 기타 다수의 방출에 매우 신속히 반응할 수 있다(Semple Nature Reviews Immunology 2011 11: 265-274).
혈소판은 인간에게 투여된 약물의 독성학에 역학적으로 관여되어 있다. 일부 항체들은 그들의 표적 항원 및 Fc 도메인 둘 다가 혈소판과 상호작용할 수 있고 그들을 활성화시킬 수 있고 혈전증을 야기할 수 있기 때문에 특히 관심을 끄는 것으로 확인되었다(Horsewood 1991 78(4):1019-1026). 항-CD40 Mab들에 대한 직접적인 이중 결합 메커니즘이 제안되어 있다(Langer Thrombosis and Haemostasis 2005 93:1127-1146). 대안적으로, 혈전증은 'HIT 증후군'(헤파린 유도된 혈소판감소증)에서와 같이 혈소판과 상호작용할 수 있는 표적 분자와 교차연결되는 항체에 의해 간접적으로 야기될 수 있다. 분획화되지 않은 헤파린은 대략 12%의 수용자들에서 정맥 혈전증과 관련되어 있었다(Levine Chest 2006 130: 681-687). 다른 예, 예컨대, VEGF를 표적화하는 Mab들에서, 작용 메커니즘은 VEGF, 항체 및 혈소판 사이에 가교로서 작용하는 헤파린을 수반할 가능성이 있다(Scappaticci 2007 J National Cancer Institute 99:1232-1239; Meyer J. Thrombosis and Haemostasis 2009 7:171-181). 혈전증은 응집된 IgG에 의해 야기될 수도 있으므로, 생성물 품질은 IgG를 제조할 때 중요하고 다량체 Fc 도메인을 제조할 때 아마도 특히 중요하다(Ginsberg J. Experimental Medicine 1978 147:207-218).
혈소판 활성화는 혈전증을 일으키기 위한 전구체이지만 반드시 그러한 것은 아니다. 혈소판 활성화는 세로토닌 방출 분석에 의해, 또는 활성화 마커, 예컨대, CD62p, CD63 또는 PAC-1을 추적함으로써 시험관내에서 추적될 수 있다. 혈소판 응집은 전혈, 혈소판 풍부 혈장 또는 세척된 혈소판 응집 분석에 의해 시험관내에서 직접적으로 관찰될 수 있다. 혈소판 상에서의 인간 FcγRIIa 발현에 대한 형질전환 마우스도 생체내에서 혈전증 또는 감소된 응고를 연구하는 데 사용될 수 있다. 다량체 Fc 도메인 단백질의 구축은 혈전증에 대한 예측가능한 위험을 제기하므로, 본 발명에서 Fc 조작 및 혈소판 활성화 분석이 Fc-다량체의 안전성을 이해하고 보장하는 데 활용되었다.
FcRn은 성인 및 소아의 혈청에서 IgG의 긴 반감기를 유지하는 데서 중요한 역할을 갖는다. 상기 수용체는 분해로부터 IgG 분자를 보호한 후 보다 더 높은 7.4의 pH에서 상기 분자를 혈액에 방출하는 산성화된 소포(pH<6.5)에서 IgG에 결합한다.
FcRn은 백혈구 Fc 수용체와 유사하지 않고, 그 대신에 MHC 클래스 I 분자와의 구조적 유사성을 갖는다. 이것은 3개의 세포외 도메인들을 포함하는 막 결합된 쇄에 비공유적으로 부착된 β2-마이크로글로불린 쇄로 구성된 이종이량체이다. 탄수화물 쇄를 포함하는, 이 도메인들 중 하나는 β2-마이크로글로불린과 함께 Fc의 CH2 도메인과 CH3 도메인 사이의 부위와 상호작용한다. 상기 상호작용은 pH<6.5에서 양성으로 하전되는, IgG 상의 히스티딘 잔기들에 대해 만들어진 염 가교를 포함한다. 보다 더 높은 pH에서, His 잔기들은 그들의 양전하를 상실하고, FcRn-IgG 상호작용은 약해지고, IgG는 해리된다.
IVIG 요법에 대한 잠재적인 대체 요법으로서 사용하기 위한 중합체 Fc 융합 단백질은 문헌에 기재되어 있으나, 이 단백질은 인간 FcRn에 결합하지 않는다. 따라서, 상기 단백질은 생체내에서 감소된 기능성을 갖는다(Mekhaiel et al.; Nature Scientific Reports 1:124, published 19th October 2011).
상기 문헌(Mekhaiel et al.)에는 중합체 인간 Fc 융합 단백질인 육량체 hIgG1-Fc-LH309/310CL-테일피스가 기재되어 있다. 이 단백질은 위치 309의 류신이 시스테인으로 치환되어 있고 위치 310의 히스티딘이 류신으로 치환되어 있는 이중 돌연변이를 포함한다. H310이 인간 FcRn에의 결합에 매우 중요하기 때문에, 상기 문헌(Mekhaiel)에 기재된 상기 단백질은 인간 FcRn에 결합할 수 없다.
본 발명 당시, H310L 돌연변이가 인접하는 L309C 변화를 위한 공간을 만드는 데 필수적이라고 여겨졌는데, 이는 이 위치의 히스티딘이 디설파이드 결합 형성을 방해함으로써 중합체 조립을 억제할 것이기 때문이다(Mekhaiel et al.; 2011). 그러나, 일례에서, 본 발명자들은 놀랍게도 H310L 돌연변이의 부재 하에서 다량체로 효율적으로 조립되는 다량체 융합 단백질을 생성하였다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 위치 310 및 바람직하게는 또한 위치 435에서 히스티딘 잔기를 보유함으로써 인간 FcRn에 결합할 수 있고 분해로부터 보호되어, 보다 더 긴 반감기 및 보다 더 큰 기능성을 갖는다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 인간 FcRn에 결합한다.
한 실시양태에서, 상기 다량체 융합 단백질은 위치 310 및 바람직하게는 또한 위치 435에서 히스티딘 잔기를 갖는다. 이 히스티딘 잔기들은 인간 FcRn 결합에 중요하다. 한 실시양태에서, 위치 310 및 435의 히스티딘 잔기들은 천연 잔기들이다. 즉, 위치 310 및 435는 돌연변이되어 있지 않다. 대안적으로, 이 히스티딘 잔기들 중 하나 또는 둘 다가 돌연변이의 결과로서 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 폴리펩티드 단량체 단위들을 포함하는 다량체 융합 단백질로서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 중쇄 Fc 영역들을 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함하고; 각각의 중쇄 Fc 영역은, 위치 309의 시스테인 잔기 및 위치 310의 히스티딘 잔기를 포함하고, 그 C-말단에서, 단량체 단위가 다량체로 조립되게 하는 테일피스에 융합되며; 각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 가변 영역을 포함하지 않는 것인 다량체 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 FcRn에의 그의 결합을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 변경된 결합은 증가된 결합 또는 감소된 결합일 수 있다.
한 실시양태에서, 다량체 융합 단백질은 상응하는 천연 면역글로불린보다 더 큰 친화력(affinity) 및 결합력(avidity)으로 FcRn에 결합하도록 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 250의 트레오닌 잔기를 글루타민 잔기로 치환시킴으로써(T250Q) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 252의 메티오닌 잔기를 티로신 잔기로 치환시킴으로써(M252Y) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 254의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로 치환시킴으로써(S254T) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 256의 트레오닌 잔기를 글루탐산 잔기로 치환시킴으로써(T256E) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 307의 트레오닌 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(T307A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 307의 트레오닌 잔기를 프롤린 잔기로 치환시킴으로써(T307P) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 308의 발린 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킴으로써(V308C) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 308의 발린 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환시킴으로써(V308F) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 308의 발린 잔기를 프롤린 잔기로 치환시킴으로써(V308P) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 311의 글루타민 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(Q311A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 311의 글루타민 잔기를 아르기닌 잔기로 치환시킴으로써(Q311R) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 428의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 치환시킴으로써(M428L) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 433의 히스티딘 잔기를 라이신 잔기로 치환시킴으로써(H433K) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 434의 아스파라긴 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환시킴으로써(N434F) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 434의 아스파라긴 잔기를 티로신 잔기로 치환시킴으로써(N434Y) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 252의 메티오닌 잔기를 티로신 잔기로 치환시키고 위치 254의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로 치환시키고 위치 256의 트레오닌 잔기를 글루탐산 잔기로 치환시킴으로써(M252Y/S254T/T256E) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 308의 발린 잔기를 프롤린 잔기로 치환시키고 위치 434의 아스파라긴 잔기를 티로신 잔기로 치환시킴으로써(V308P/N434Y) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 252의 메티오닌 잔기를 티로신 잔기로 치환시키고 위치 254의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로 치환시키고 위치 256의 트레오닌 잔기를 글루탐산 잔기로 치환시키고 위치 433의 히스티딘 잔기를 라이신 잔기로 치환시키고 위치 434의 아스파라긴 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환시킴으로써(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, 다량체 융합 단백질은 상응하는 천연 면역글로불린보다 더 낮은 친화력 및 결합력으로 FcRn에 결합하도록 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 위치 310의 히스티딘 잔기는 또 다른 아미노산 잔기로 돌연변이된다. 일례에서, 위치 310의 히스티딘 잔기는 류신 잔기로 치환된다(H310L).
FcRn 결합을 변경시기 위해 상기 나열된 돌연변이들 중 임의의 돌연변이들을 조합할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 FcγRIIb에의 그의 결합을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. FcγRIIb는 인간에서 유일한 억제 수용체이고 B 세포 상에서 발견된 유일한 Fc 수용체이다. B 세포 및 그의 병원성 항체는 많은 면역 질환들의 중심에 놓여 있으므로, 상기 다량체 융합 단백질은 이 질환들에 대한 개선된 요법을 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 238의 프롤린 잔기를 아스파르트산 잔기로 치환시킴으로써(P238D) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 258의 글루탐산 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(E258A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 267의 세린 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(S267A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 267의 세린 잔기를 글루탐산 잔기로 치환시킴으로써(S267E) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 328의 류신 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환시킴으로써(L328F) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 258의 글루탐산 잔기를 알라닌 잔기로 치환시키고 위치 267의 세린 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(E258A/S267A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 267의 세린 잔기를 글루탐산 잔기로 치환시키고 위치 328의 류신 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환시킴으로써(S267E/L328F) 돌연변이된다.
FcγRIIb 결합을 증가시키기 위해 상기 나열된 돌연변이들 중 임의의 돌연변이들을 조합할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명자들은 FcγR에의 감소된 결합을 나타내는 다량체 융합 단백질을 제공한다. FcγR에의 감소된 결합은 병원성 항체를 수반하는 면역 질환의 치료에 사용될 개선된 요법을 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 FcγR에의 그의 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, FcγR에의 결합을 감소시키는 돌연변이는 IgG1로부터 유래된 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 다량체 융합 단백질에서 사용된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 234의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(L234A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 234의 페닐알라닌 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(F234A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 235의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(L235A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 236의 글리신 잔기를 아르기닌 잔기로 치환시킴으로써(G236R) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 297의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기로 치환시키거나(N297A) 글루탐산 잔기로 치환시킴으로써(N297Q) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 298의 세린 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(S298A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 328의 류신 잔기를 아르기닌 잔기로 치환시킴으로써(L328R) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 234의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시키고 위치 235의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(L234A/L235A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 234의 페닐알라닌 잔기를 알라닌 잔기로 치환시키고 위치 235의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(F234A/L235A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 236의 글리신 잔기를 아르기닌 잔기로 치환시키고 위치 328의 류신 잔기를 아르기닌 잔기로 치환시킴으로써(G236R/L328R) 돌연변이된다.
FcγR 결합을 감소시키기 위해 상기 나열된 돌연변이들 중 임의의 돌연변이들을 조합할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 FcγRII에의 그의 결합에 영향을 미치지 않으면서 FcγRIIIa에의 그의 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 239의 세린 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(S239A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 269의 글루탐산 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(E269A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 293의 글루탐산 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(E293A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 296의 티로신 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환시킴으로써(Y296F) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 303의 발린 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(V303A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 327의 알라닌 잔기를 글리신 잔기로 치환시킴으로써(A327G) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 338의 라이신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(K338A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 376의 아스파르트산 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(D376A) 돌연변이된다.
FcγRIIIa 결합을 감소시키기 위해 상기 나열된 돌연변이들 중 임의의 돌연변이들을 조합할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 보체에의 그의 결합을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 변경된 보체 결합은 증가된 결합 또는 감소된 결합일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 단백질은 C1q에의 그의 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 고전적인 보체 경로의 시작은 육량체 C1q 단백질과 항원에 결합된 IgG 및 IgM의 CH2 도메인의 결합으로 출발한다. 본 발명의 다량체 융합 단백질은 항원 결합 부위를 갖지 않으므로, C1q에의 유의한 결합을 보일 것으로 예측되지 않을 것이다. 그러나, C1q 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이의 존재는 상기 단백질이 항원 개입의 부재 하에서 보체를 활성화시키지 않는다는 것을 보장할 것이므로, 보다 더 큰 안전성을 갖는 개선된 요법을 제공할 것이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 C1q에의 그의 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 234의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(L234A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 235의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(L235A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 235의 류신 잔기를 글루탐산 잔기로 치환시킴으로써(L235E) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 237의 글리신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(G237A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 322의 라이신 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(K322A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 331의 프롤린 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(P331A) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 331의 프롤린 잔기를 세린 잔기로 치환시킴으로써(P331S) 돌연변이된다.
한 실시양태에서, 다량체 융합 단백질은 IgG4로부터 유래된 Fc 도메인을 포함한다. IgG4는 IgG1보다 천연적으로 더 낮은 보체 활성화 프로파일을 갖지만, FcγR의 보다 더 약한 결합도 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, IgG4를 포함하는 상기 다량체 융합 단백질은 FcγR 결합을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이도 포함한다.
C1q 결합을 감소시키기 위해 상기 나열된 돌연변이들 중 임의의 돌연변이들을 조합할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 시스테인 잔기를 생성하거나 제거하기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 시스테인 잔기들은 폴리펩티드 단량체 단위들의 개별 쌍들 사이에 디설파이드 가교를 형성함으로써 다량체 융합 단백질의 자발적인 조립에서 중요한 역할을 갖는다. 대안적으로, 이들은 유리 SH 기의 화학적 변경을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 시스테인 잔기의 수 및/또는 위치를 변경시킴으로써 다량체 융합 단백질의 구조를 변경시켜 개선된 치료적 특성을 갖는 단백질을 생성할 수 있다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 위치 309에서 시스테인 잔기를 포함한다. 한 실시양태에서, 위치 309의 시스테인 잔기는 돌연변이에 의해 생성되는데, 예를 들면, IgG1로부터 유래된 Fc 도메인의 경우 위치 309의 류신 잔기는 시스테인 잔기로 치환되고(L309C); IgG2로부터 유래된 Fc 도메인의 경우 위치 309의 발린 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다(V309C).
한 실시양태에서, 항체 Fc 도메인은 위치 308의 발린 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킴으로써(V308C) 돌연변이된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명자들은 보다 더 적은 수의 디설파이드 결합 및/또는 글리코실화 부위를 포함하는, 개선된 제조용이성을 갖는 다량체 융합 단백질을 제공한다. 이 단백질은 덜 복잡한 디설파이드 결합 구조 및 번역 후 글리코실화 패턴을 가지므로, 제조하기에 더 단순하고 덜 비싸다.
한 실시양태에서, 힌지 영역 내의 2개의 디설파이드 결합들은 코어 힌지 서열 CPPC를 SPPS로 돌연변이시킴으로써 제거된다.
한 실시양태에서, 테일피스 내의 디설파이드 결합은 위치 575의 시스테인 잔기를 세린, 트레오닌 또는 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(C575S, C575T 또는 C575A) 제거된다.
한 실시양태에서, 코어 힌지 서열 CPPC는 SPPS로 돌연변이되고, 위치 575의 테일피스 시스테인 잔기는 세린, 트레오닌 또는 알라닌 잔기로 치환된다(C575S, C575T 또는 C575A).
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 실질적으로 비공유적인 도메인간 상호작용을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 상당한 비율의 생성물이 육량체이도록 세포에서 발현된다.
상당한 비율은 바람직하게는 50% 이상, 예를 들면, 50%∼60%, 60%∼70%, 70%∼80%, 80%∼90%, 또는 90%∼100%이다.
한 실시양태에서, CH2 도메인 내의 글리코실화 부위는 위치 297의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기로 치환시키거나(N297A) 글루타민 잔기로 치환시킴으로써(N297Q) 제거된다. 개선된 제조용이성 이외에, 이 아글리코실(aglycosyl) 돌연변이체는 본원에 전술된 바와 같이 FcγR 결합도 감소시킨다.
한 실시양태에서, 테일피스 내의 글리코실화 부위는 위치 563의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기로 치환시키거나(N563A) 글루타민 잔기로 치환시킴으로써(N563Q) 제거된다.
한 실시양태에서, CH2 도메인 내의 글리코실화 부위 및 테일피스 내의 글리코실화 부위는 위치 297의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기 또는 글루타민 잔기로 치환시키고 위치 563의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기 또는 글루타민 잔기로 치환시킴으로써(N297A/N563A 또는 N297A/N563Q 또는 N297Q/N563A 또는 N297Q/N563Q) 둘 다 제거된다.
상기 나열된 돌연변이들 중 임의의 돌연변이들을 조합할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄 또는 이의 구성 부분을 코딩하는 단리된 DNA 서열도 제공한다. 상기 DNA 서열은 예를 들면, 화학적 프로세싱에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 결정된 DNA 서열로부터, 또는 상응하는 아미노산 서열에 기초하여 원하는 대로 합성될 수 있다.
분자생물학의 표준 기법이 본 발명의 폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 DNA 서열을 제조하는 데 이용될 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 이용함으로써 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법이 적절한 경우 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄 또는 이의 구성 부분을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터가 제공된다.
벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 이에 대하여, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing)을 참조한다.
본 발명의 다량체 융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 다량체 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 세균, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 미생물 시스템, 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 피키아(Pichia)가 사용될 수 있거나, 진핵, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템도 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포를 포함한다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 유형의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 DHFR 선별 마커와 함께 사용될 수 있는 dhfr- CHO 세포, 예컨대, CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포, 또는 글루타민 합성효소 선별 마커와 함께 사용될 수 있는 CHOK1-SV 세포를 포함하는 CHO 및 CHO-K1 세포를 포함할 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 NS0 세포를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 다량체 융합 단백질의 제조 방법으로서, 상기 융합 단백질의 발현 및 다량체로의 조립에 적합한 조건 하에서 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 다량체 융합 단백질을 단리하고 경우에 따라 정제하는 단계를 포함하는 제조 방법도 제공한다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 숙주 세포로부터 우수한 수준으로 발현된다. 따라서, 상기 다량체 융합 단백질의 성질은 상업적인 프로세싱에 도움이 된다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 다량체 융합 단백질은 응집을 최소화하는 조건 하에서 생성될 수 있다. 일례에서, 응집은 보존제를 배양 배지, 배양 상청액 또는 정제 배지에 첨가함으로써 최소화될 수 있다. 적합한 보존제의 예는 티올 캡핑제, 예컨대, N-에틸 말레이미드, 요도아세트산, β-머캡토에탄올, β-머캡토에틸아민, 글루타티온 또는 시스테인을 포함한다. 다른 예는 디설파이드 억제제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌글리콜테트라아세트산(EGTA), 또는 pH 6.0 미만으로의 산성화를 포함한다.
한 실시양태에서, 불순물이 컬럼 상에 보유되고 항체가 용출되도록 비결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 본 발명의 다량체 융합 단백질을 정제하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 정제는 FcRn, FcγR 또는 C-반응성 단백질 컬럼 상에서의 친화성 포획을 이용한다.
한 실시양태에서, 정제는 단백질 A를 이용한다.
상기 방법에서 사용되기에 적합한 이온 교환 수지는 Q.FF 수지(지이-헬쓰케어(GE-Healthcare)에 의해 공급됨)를 포함한다. 상기 단계는 예를 들면, 약 8의 pH에서 수행될 수 있다. 상기 방법은 예를 들면, 약 4∼5, 예컨대, 4.5의 pH에서 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 초기 포획 단계를 더 포함할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들면, 수지, 예컨대, CaptoS 수지 또는 SP 세파로스 FF(지이-헬쓰케어에 의해 공급됨)를 이용할 수 있다. 그 다음, 이온성 염 용액, 예컨대, 염화나트륨을 예를 들면, 200 mM의 농도로 사용함으로써 항체 또는 단편을 수지로부터 용출할 수 있다.
따라서, 크로마토그래피 단계 또는 단계들은 적절한 경우 하나 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다.
정제 방법은 하나 이상의 여과 단계, 예컨대, 정용여과 단계도 포함할 수 있다.
요구된 수의 폴리펩티드 단량체 단위를 갖는 다량체는 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분자 크기에 따라 분리될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA로부터 실질적으로 정제된, 특히 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA를 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는 본 발명에 따른 정제된 다량체 융합 단백질이 제공된다.
상기 사용된 바와 같이 정제된 형태는 90%(중량/중량) 이상의 순도, 예컨대, 91%(중량/중량), 92%(중량/중량), 93%(중량/중량), 94%(중량/중량), 95%(중량/중량), 96%(중량/중량), 97%(중량/중량), 98%(중량/중량) 또는 99%(중량/중량) 이상의 순도를 지칭하기 위한 것이다.
내독소를 실질적으로 갖지 않는다는 것은 일반적으로 항체 생성물 mg당 1 EU 이하, 예컨대, 생성물 mg당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 지칭하기 위한 것이다.
숙주 세포 단백질 또는 DNA를 실질적으로 갖지 않는다는 것은 일반적으로 항체 생성물 mg당 400 ㎍ 이하, 예컨대, mg당 100 ㎍ 이하, 특히 적절한 경우 mg당 20 ㎍의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량을 지칭하기 위한 것이다.
본 발명의 다량체 융합 단백질이 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하기 때문에, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 다량체 융합 단백질을 포함하는 약학 또는 진단 조성물도 제공한다. 따라서, 의약의 제조를 위한 본 발명의 단백질의 용도가 제공된다. 상기 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 정상적으로 포함할 멸균 약학 조성물의 일부로서 제공될 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 다량체 융합 단백질을 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 첨가하고 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 또는 진단 조성물의 제조 방법도 제공한다.
다량체 융합 단백질은 약학 또는 진단 조성물에서 유일한 활성 성분일 수 있거나, 다른 항체 성분 또는 비항체 성분, 예컨대, 스테로이드 또는 다른 약물 분자를 포함하는 다른 활성 성분을 동반할 수 있다.
약학 조성물은 적절하게는 치료 유효량의 본 발명의 다량체 융합 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 표적화된 질환 또는 상태를 치료하거나, 완화시키거나 예방하거나, 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내기 위해 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 의약의 경우, 치료 유효량은 세포 배양 분석 또는 동물 모델, 통상적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 먼저 추정될 수 있다. 동물 모델은 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는 데 이용될 수도 있다. 그 다음, 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하는 데 이용될 수 있다.
인간 대상체를 위한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식습관, 투여의 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 요법에 대한 내성/반응에 의존할 것이다. 이 양은 관용적인 실험에 의해 결정될 수 있고 임상의의 판단 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg∼500 mg/kg, 예를 들면, 0.1 mg/kg∼200 mg/kg, 예컨대, 100 mg/kg일 것이다. 약학 조성물은 용량당 소정량의 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 용량 제형으로 편리하게 제공될 수 있다.
본 개시내용에 따른 다량체 융합 단백질의 치료 용량은 생체내에서 명확한 독성 효과를 보이지 않는다.
본 발명에 따른 다량체 융합 단백질의 한 실시양태에서, 1회 용량은 순환 IgG 수준의 최대 90% 감소를 제공할 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 다른 물질, 약물 또는 호르몬과 함께(예를 들면, 동시적으로, 순차적으로 또는 개별적으로) 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다량체 융합 단백질은 면역억제제 요법, 예컨대, 스테로이드, 특히 프레드니손과 함께 사용된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다량체 융합 단백질은 리툭시맙(Rituximab) 또는 다른 B 세포 요법과 함께 사용된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다량체 융합 단백질은 임의의 B 세포 또는 T 세포 조절제 또는 면역조절제와 함께 사용된다. 예로는 메토트렉세이트, 마이코페닐레이트 및 아자티오프린이 있다.
본 발명의 다량체 융합 단백질이 투여되는 용량은 치료하려는 상태의 성질, 존재하는 질환의 정도, 및 다량체 융합 단백질이 예방 목적으로 사용되는지 아니면 기존 상태를 치료하기 위해 사용되는지에 의존한다.
용량의 빈도는 다량체 융합 단백질의 반감기 및 그의 효과의 지속시간에 의존할 것이다. 다량체 융합 단백질이 짧은 반감기(예를 들면, 2시간∼10시간)를 갖는 경우, 일당 1회분 이상의 용량을 제공할 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 다량체 융합 단백질이 긴 반감기(예를 들면, 2일∼15일) 및/또는 오래 지속되는 약력학적 효과를 갖는 경우, 일당 1회, 주당 1회 또는 심지어 1개월 또는 2개월마다 1회 용량을 제공할 필요만이 있을 수 있다.
한 실시양태에서, 용량은 2주마다, 즉 월당 2회 전달된다.
본원에서 사용된 반감기는 순환계, 예를 들면, 혈청/혈장에서의 분자의 지속시간을 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 약력학은 본 개시내용에 따른 다량체 융합 단백질의 프로파일, 특히 생물학적 작용의 지속시간을 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 그 자체가 조성물을 제공받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고 독성을 나타내지 않아야 한다. 적합한 담체는 느리게 대사되는 큰 거대분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들면, 무기산 염, 예컨대, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산 염, 예컨대, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 사용될 수 있다.
치료 조성물 중의 약학적으로 허용 가능한 담체는 액체, 예컨대, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대, 습윤화제, 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 환자에 의한 섭취를 위해 약학 조성물이 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제제화될 수 있게 한다.
투여에 적합한 제형은 비경구 투여, 예를 들면, 주사 또는 주입, 예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 투여에 적합한 제형을 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입을 위한 것인 경우, 생성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유액의 형태를 취할 수 있고, 제제화제, 예컨대, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 단백질은 나노입자의 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체로 재구성되기 위한 건조된 제형으로 존재할 수 있다.
일단 제제화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시양태에서, 조성물은 인간 대상체에게 투여되도록 맞춰진다.
적절하게는, 본 개시내용에 따른 제제에서, 최종 제제의 pH는 다량체 융합 단백질의 등전점의 값과 유사하지 않은데, 예를 들면, 단백질의 pI가 8∼9의 범위 내에 있거나 이를 초과하는 경우, 7의 제제 pH가 적절할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 이것은 궁극적으로 개선된 안정성, 예를 들면, 용액에 남아있는 다량체 융합 단백질을 갖는 최종 제제를 제공할 수 있다고 생각된다.
일례에서, 4.0∼7.0의 범위 내의 pH에서 약학 제제는 1∼200 mg/㎖의 본 개시내용에 따른 단백질 분자, 1∼100 mM의 완충제, 0.001%∼1%의 계면활성제, a) 10∼500 mM의 안정화제, b) 10∼500 mM의 안정화제 및 5∼500 mM의 긴장성 물질, 또는 c) 5∼500 mM의 긴장성 물질을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 연수내, 척추강내, 심실내, 경진피, 경피(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 코내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(Hyposprays)도 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 데 이용될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사가능한 조성물로서 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 제형도 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 달성될 것이거나, 조직의 사이질 공간으로 전달될 것이다. 조성물은 병변 내로 투여될 수도 있다. 용량 치료는 단회 용량 일정 또는 다회 용량 일정일 수 있다.
조성물 중의 활성 성분은 단백질 분자일 것이라는 것이 인식될 것이다. 따라서, 상기 활성 성분은 위장관에서의 분해에 민감할 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 조성물은 분해로부터 단백질을 보호하되, 일단 위장관으로부터 흡수되면 단백질을 방출하는 물질을 함유할 필요가 있을 것이다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 철저한 고찰은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991))에서 입수가능하다. 한 실시양태에서, 제제는 흡입을 포함하는 국소 투여용 제제로서 제공된다.
적합한 흡입가능한 제제는 흡입가능한 분말, 추진제 기체를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진제 기체를 함유하지 않는 흡입가능한 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 본 개시내용에 따른 흡입가능한 분말은 전술된 활성 물질만으로 구성될 수 있거나 전술된 활성 물질과 생리학적으로 허용 가능한 부형제의 혼합물로 구성될 수 있다. 이 흡입가능한 분말은 단당류(예를 들면, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예를 들면, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당류 및 다당류(예를 들면, 덱스트란), 폴리알코올(예를 들면, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들면, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적절하게 사용되고, 락토스 또는 글루코스가 특히(그러나, 배타적이지 않음) 그들의 수화물 형태로 사용된다.
폐에서의 침착을 위한 입자는 10 ㎛ 미만, 예컨대, 1∼9 ㎛, 예를 들면, 1∼5 ㎛의 입자 크기를 요구한다. 활성 성분(예컨대, 항체 또는 단편)의 입자 크기는 가장 중요하다.
흡입가능한 에어로졸을 제조하는 데 사용될 수 있는 추진제 기체는 당분야에서 공지되어 있다. 적합한 추진제 기체는 탄화수소, 예컨대, n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예컨대, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 염소화(chlorinated) 및/또는 불소화(fluorinated)된 유도체로부터 선택된다. 전술된 추진제 기체들은 그들 자체로 또는 그들의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진제 기체는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227로부터 선택된 할로겐화된(halogenated) 알칸 유도체이다. 전술된 할로겐화된 탄화수소들 중 TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이들의 혼합물이 특히 적합하다.
추진제 기체 함유 흡입가능한 에어로졸은 다른 성분, 예컨대, 보조용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH를 조절하기 위한 수단도 함유할 수 있다. 이 성분들 모두가 당분야에서 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진제 기체 함유 흡입가능한 에어로졸은 최대 5 중량%의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들면, 0.002∼5 중량%, 0.01∼3 중량%, 0.015∼2 중량%, 0.1∼2 중량%, 0.5∼2 중량%, 또는 0.5∼1 중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐에의 국소 투여는 예를 들면, 장치, 예컨대, 분무기, 예를 들면, 압축기에 연결된 분무기(예를 들면, 파리 레스퍼레이토리 이퀴프먼트 인코포레이티드(Pari Respiratory Equipment, Inc.)(미국 버지니아주 리치몬드 소재)에 의해 제조된 파리 마스터(Pari Master)(R) 압축기에 연결된 파리 LC-제트 플러스(Pari LC-Jet Plus)(R) 분무기)를 이용한 액체 용액 또는 현탁액 제제의 투여에 의해 달성될 수도 있다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 용매에 분산된 형태, 예를 들면, 용액 또는 현탁액의 형태로 전달될 수 있다. 상기 융합 단백질은 적절한 생리학적 용액, 예를 들면, 식염수 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 용매 또는 완충된 용액에 현탁될 수 있다. 당분야에서 공지된 완충된 용액은 약 4.0∼5.0의 pH를 달성하도록 물 1 ㎖당 0.05 mg∼0.15 mg 이나트륨 에데테이트, 8.0 mg∼9.0 mg NaCl, 0.15 mg∼0.25 mg 폴리소르베이트, 0.25 mg∼0.30 mg 무수 시트르산 및 0.45 mg∼0.55 mg 나트륨 시트레이트를 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들면, 동결건조된 단백질을 사용할 수 있다.
치료 현탁액 또는 용액 제제는 하나 이상의 부형제도 함유할 수 있다. 부형제는 당분야에서 잘 알려져 있고 완충제(예를 들면, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 바이카보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들면, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생체분해가능한 마이크로스피어(microsphere) 내에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 멸균 제조 과정을 이용함으로써 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이것은 제제화를 위해 사용된 완충된 용매/용액의 여과, 멸균 완충된 용매 용액에의 단백질의 무균 현탁, 및 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에게 익숙한 방법에 의한 멸균 용기 내로의 제제의 분배에 의한 제조 및 멸균을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따른 분무가능한 제제는 예를 들면, 금박 봉투로 포장된 단회 용량 단위(예를 들면, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 일정한 부피, 예를 들면, 2 ㎖의 용매/용액 완충제 중에 단위 용량을 함유한다.
본원에 개시된 다량체 융합 단백질은 분무를 통한 전달에 적합할 수 있다.
본 발명의 단백질은 유전자 요법의 이용에 의해 투여될 수 있다는 것도 고려된다. 이를 달성하기 위해, 폴리펩티드 쇄가 DNA 서열로부터 발현되고 제자리에서 조립되도록 적절한 DNA 성분의 조절 하에서 단백질 분자의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 DNA 서열을 환자 내로 도입한다.
한 실시양태에서, 본 발명자들은 요법에서 사용될 본 발명의 다량체 융합 단백질을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명자들은 면역 장애의 치료에 사용될 본 발명의 다량체 융합 단백질을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명자들은 면역 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 다량체 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 다량체 융합 단백질을 사용함으로써 치료될 수 있는 면역 장애의 예는 면역 혈소판감소증(ITP), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 가와사키병 및 길랑-바레 증후군(GBS)을 포함한다.
본 발명은 자가면역 질환, 예를 들면, 급성 파종 뇌척수염(ADEM), 급성 괴사 출혈성 백색질뇌염, 애디슨병(Addison's disease), 무감마글로불린혈증, 원형탈모증, 아밀로이드증, ANCA 관련 혈관염, 강직척추염, 항-GBM/항-TBM 신장염, 항인지질 증후군(APS), 자가면역 혈관부종, 자가면역 재생불량빈혈, 자가면역 자율신경기능이상, 자가면역 간염, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막병증, 자가면역 저혈소판자색반증(ATP), 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 두드러기, 축삭 & 날(nal) 신경병증, 발로병(Balo disease), 베체트병(Behcet's disease), 물집유사천포창, 심근병증, 캐슬만병(Castleman disease), 복강 질환, 샤가스병(Chagas disease), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 흉터유사천포창/양성 점막 유사천포창, 크론병(Crohn's disease), 코간스(Cogans) 증후군, 저온 응집소 질환, 선천성 심장 차단, 콕사키(Coxsackie) 심근염, CREST 질환, 본태 혼합 한랭글로불린혈증, 탈수초 신경병증, 포진피부염, 피부근염, 데빅병(Devic's disease)(시신경척수염), 확장 심근병증, 원반모양 루푸스, 드레슬러(Dressler's) 증후군, 자궁내막증, 호산구 혈관중심성 섬유증, 호산구 근막염, 결절홍반, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 에반스(Evans) 증후군, 섬유화 폐포염, 거대세포 동맥염(측두 동맥염), 사구체신장염, 굿파스처(Goodpasture's) 증후군, 다발혈관염을 갖는 육아종증(GPA)(베게너 육아종증 참조), 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인(Henoch-Schonlein) 자색반증, 임신헤르페스, 저감마글로불린혈증, 특발성 저보체혈성 요세관사이질 신장염, 특발성 저혈소판자색반증(ITP), IgA 신장병증, IgG4 관련 질환, IgG4 관련 경화 질환, 면역조절 지단백질, 염증성 대동맥류, 염증성 가성종양, 봉입체 근염, 인슐린 의존성 당뇨병(1형), 사이질 방광염, 소아 관절염, 소아 당뇨병, 가와사키 증후군, 쿠트너(Kuttner's) 종양, 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 증후군, 백혈구파괴 혈관염, 편평태선, 경화태선, 목질 결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 루푸스(SLE), 라임병(Lyme disease), 만성 종격 섬유증, 메니에르병(Meniere's disease), 현미경 다발혈관염, 미쿨리치(Mikulicz's) 증후군, 혼합 결합 조직 질환(MCTD), 무렌(Mooren's) 궤양, 뮤샤-하버만병(Mucha-Habermann disease), 다초점 섬유경화증, 다발경화증, 중증근육무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염(데빅), 호중구감소증, 안구 흉터유사천포창, 시신경염, 오르몬드병(Ormond's disease)(후복막 섬유증), 재발 류마티즘, PANDAS(스트렙토코커스와 관련된 소아 자가면역 신경정신병성 장애), 신생물딸림 소뇌 변성, 파라단백혈증성 다발신경병증, 발작 야간 헤모글로빈뇨(PNH), 패리 롬베르그(Parry Romberg) 증후군, 파르손네이지-터너(Parsonnage-Turner) 증후군, 부분 포도막염(주변 포도막염), 보통천포창, 대동맥주위염, 동맥주위염, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절다발동맥염, I형, II형 & III형 자가면역 다분비선 증후군, 류마티스성 다발근육통, 다발근염, 심근경색후 증후군, 심장막절개수술후 증후군, 프로게스테론 피부염, 원발성 담관경화증, 원발성 경화담관염, 건선, 건선성 관절염, 특발성 폐 섬유증, 괴저화농피부증, 순수 적혈구 무형성, 레이노드(Raynauds) 현상, 반사교감 신경이상증, 레이터(Reiter's) 증후군, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군, 후복막 섬유증(오르몬드병), 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 리이델(Riedel's) 갑상선염, 사르코이드증, 슈미트(Schmidt) 증후군, 공막염, 피부경화증, 쇼그렌(Sjogren's) 증후군, 정자 & 고환 자가면역, 강직 인간 증후군, 아급성 세균성 심내막염(SBE), 수삭(Susac's) 증후군, 교감 안염, 다카야수(Takayasu's) 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 혈전성 저혈소판자색반증(TTP), 톨로사-헌트(Tolosa-Hunt) 증후군, 횡단척수염, 궤양성 결장염, 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 수포성 피부염, 백반증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 온난 특발성 용혈성 빈혈 및 베게너 육아종증(현재 다발혈관염을 갖는 육아종증(GPA)으로서 지칭됨)의 조절에 사용하기 위한 다량체 융합 단백질(또는 이를 포함하는 조성물)도 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다량체 융합 단백질 및 단편은 간질 또는 발작의 치료 또는 예방에 사용된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다량체 융합 단백질 및 단편은 다발경화증의 치료 또는 예방에 사용된다.
실시양태에서, 본 개시내용의 다량체 융합 단백질 및 단편은
Figure pct00004
항-HLA 항체로 인한 이식 기증자 불일치; 및
Figure pct00005
태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증인 FNAIT(또는 신생아 동종면역 혈소판감소증, NAITP 또는 NAIT 또는 NAT, 또는 태아-모체 동종면역 혈소판감소증, FMAITP 또는 FMAIT)
를 포함하는 동종면역 질환/적응증의 치료 또는 예방에 사용된다.
추가 적응증은 인간 환자로부터의 Fc 함유 생체약학적 약물의 신속한 제거 및 다량체 융합 단백질 요법과 다른 요법 - IVIg, 리툭산, 혈장분리교환술의 조합을 포함한다. 예를 들면, 다량체 융합 단백질 요법은 리툭산 요법 후 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다량체 융합 단백질은 신경학 장애, 예컨대, 하기 장애들의 치료 또는 예방에 사용된다:
Figure pct00006
만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP),
Figure pct00007
길랑-바레 증후군,
Figure pct00008
파라단백혈증성 다발신경병증,
Figure pct00009
시신경척수염(NMO, NMO 스펙트럼 장애 또는 NMO 스펙트럼 질환), 및
Figure pct00010
중증근육무력증.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다량체 융합 단백질은 피부과학 장애, 예컨대, 하기 장애들에서 사용된다:
Figure pct00011
물집유사천포창,
Figure pct00012
보통천포창,
Figure pct00013
ANCA 관련 혈관염, 및
Figure pct00014
확장 심근병증.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다량체 융합 단백질은 면역학 또는 혈액학 장애, 예컨대, 하기 장애들에서 사용된다:
Figure pct00015
특발성 저혈소판자색반증(ITP),
Figure pct00016
혈전성 저혈소판자색반증 (TTP),
Figure pct00017
온난 특발성 용혈성 빈혈,
Figure pct00018
굿파스처 증후군, 및
Figure pct00019
항-HLA 항체로 인한 이식 기증자 불일치.
한 실시양태에서, 장애는 중증근육무력증, 시신경척수염, CIDP, 길랑-바레 증후군, 파라단백혈증성 다발신경병증, 불응성 간질, ITP/TTP, 용혈성 빈혈, 굿파스처 증후군, ABO 불일치, 루푸스 신장염, 신장 혈관염, 피부경화증, 섬유화 폐포염, 확장 심근병증, 그레이브스병, 1형 당뇨병, 자가면역 당뇨병, 천포창, 피부경화증, 루푸스, ANCA 혈관염, 피부근염, 쇼그렌병 및 류마티스성 관절염으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 장애는 자가면역 다내분비선 증후군 1형(APECED 또는 휘타커(Whitaker's) 증후군) 및 2형(슈미트 증후군); 전신탈모증; 근육무력증성 발작; 갑상선 발작; 갑상선 관련 눈 질환; 갑상선 눈병증; 자가면역 당뇨병; 자가항체 관련 뇌염 및/또는 뇌병증; 낙엽천포창; 물집표피박리증; 포진피부염; 시덴함무도병; 급성 운동 축삭 신경병증(AMAN); 밀러-피셔(Miller-Fisher) 증후군; 다초점 운동 신경병증(MMN); 눈간대경련; 염증성 근육병증; 이삭(Isaac's) 증후군(자가면역 신경근육긴장증), 신생물딸림 증후군 및 둘레 뇌염으로부터 선택된다.
본 개시내용에 따른 다량체 융합 단백질은 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 치료 유효 용량의 본원에 기재된 다량체 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 원치 않는 항체의 농도를 감소시키는 방법도 제공한다.
본 발명의 다량체 융합 단백질은 Fc 수용체를 수반하는 질환 상태, 예컨대, B 세포 관련 림프종의 진단, 예를 들면, 생체내 진단 및 영상화에 사용될 수도 있다.
도면의 간단한 설명
도 1 : 본 발명에 따른 발현 구성체 및 다량체 융합 단백질의 예. SP는 신호 펩티드이고, CH2 및 CH3은 중쇄 불변 도메인이고, TP는 테일피스이다.
도 2 : 예시적 서열.
2a: 폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄의 예시적 아미노산 서열. 각각의 서열에서, 테일피스 서열은 밑줄로 표시되어 있고, 임의의 돌연변이는 굵은 글자체 및 밑줄로 표시되어 있다. 힌지는 굵은 글자체로 표시되어 있다. IgM으로부터 유래된 CH4 도메인을 포함하는 구성체에서 이 영역은 이탤릭체로 표시되어 있다.
2b: IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인 또는 IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc-다량체 폴리펩티드 쇄에 대한 예시적 아미노산 서열. 각각의 서열에서, IgG1과 IgG4 사이의 차이의 위치는 굵은 글자체로 표시되어 있고 강조되어 있다.
2c: IgG1의 일부 선택된 성질들 및 IgG4의 일부 선택된 성질들을 겸비하도록 디자인된 Fc-다량체에 대한 예시적 아미노산 서열. 돌연변이는 굵은 글자체 및 밑줄로 표시되어 있다.
2d: 도메인 교환에 의해 조작된 하이브리드 중쇄 Fc 영역을 갖는 Fc-다량체에 대한 예시적 아미노산 서열.
2e: IgG1의 일부 선택된 성질들 및 IgG4의 일부 선택된 성질들을 겸비하도록 조작되어 있는, 하이브리드 중쇄 Fc 영역 및 추가 돌연변이를 갖는 Fc-다량체에 대한 예시적 아미노산 서열.
2f: B72.3 신호 펩티드의 DNA 및 아미노산 서열. (i) DNA 서열, (ii) 아미노산 서열.
2g: 위치 309에서 시스테인 잔기를 포함하는, 도 2b∼2e에 예시된 Fc-다량체에 대한 예시적 아미노산 서열.
도 3 : Fc-다량체 조립에서의 CH3 도메인의 역할.
3a: Fc-다량체의 육량체화에 대한 IgG1/IgG4 CH3 도메인 교환의 효과를 보여주는 크기 배제 크로마토그래피 기록선(traces).
3b: IgG1 Fc IgM tp의 육량체화에 대한 CH3 도메인 내의 점 돌연변이의 효과.
3c: IgG4 Fc IgM tp의 높은 육량체화 수준은 점 돌연변이 Q355R에 의해 달성된다.
3d: IgG1 Fc IgM tp에서 모든 다른 아미노산들로의 R355의 돌연변이유발의 효과.
도 4 : 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정된, Fc-다량체와 FcRn의 결합. 기록선은 다량체 농도 범위에 대한 결합을 나타낸다: 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM, 0.3125 μM, 0.15625 μM, 0.078125 μM, 0.0390625 μM. 나타낸 Fc-다량체들 모두가 위치 310에서 히스티딘을 포함하였다.
4(a): 저밀도 FcRn에 결합하는 hIgG1 Fc-다량체 IgM tp L309C.
4(b): 저밀도 FcRn에 결합하는 hIgG1 Fc-다량체 IgM tp.
4(c): 고밀도 FcRn에 결합하는 hIgG1 Fc-다량체 IgM tp L309C.
4(d): 고밀도 FcRn에 결합하는 hIgG1 Fc-다량체 IgM tp.
도 5 : 대식세포 식작용의 Fc-다량체 억제. 데이터는 육량체 또는 십이량체로 중합된, 인간 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 Fc-다량체들이 IgM 테일피스 단독 또는 IgM 테일피스 및 L309C에 의해 형성되고, 이들 모두가 인간 IVIG보다 상당히 더 우수한 효능 및 최대 수준의 억제를 나타낸다는 것을 보여준다.
도 6 : 대식세포 식작용의 Fc-다량체 억제. 데이터는 IgG1과 IgG4 Fc 영역 사이의 차이의 선택된 위치에서 단일 교차 돌연변이를 포함하는 Fc-다량체의 억제 효과를 보여준다.
도 7 : 대식세포 식작용의 Fc-다량체 억제. 데이터는 면역 장애의 치료에 사용되도록 디자인된 Fc-다량체의 억제 효과를 보여준다.
도 8 : Fc-다량체에 의한 사이토카인 방출의 자극. 데이터는 야생형 IgG1 Fc-다량체들(L309C를 갖는 Fc-다량체 및 L309C를 갖지 않은 Fc-다량체 둘 다)이 매우 높은 수준의 사이토카인 방출을 자극한다는 것을 입증하였다. 사이토카인의 관찰된 수준은 양성 대조군 항-CD52 항체인 캄패쓰(Campath)에 의해 생성된 사이토카인의 수준보다 더 높았다. 현저히 대조적으로, FcγR 및 C1q 불활성 "LALA" 돌연변이(L234A L235A)를 포함하는 IgG4 Fc-다량체 및 IgG1 Fc-다량체는 사실상 제로 사이토카인 방출을 야기하였다.
도 9 : Fc-다량체에 의한 사이토카인 방출의 자극. 데이터는 IgG1과 IgG4 Fc 영역 사이의 차이의 선택된 위치에서 단일 교차 돌연변이를 포함하는 Fc-다량체의 효과를 보여준다.
도 10 : Fc-다량체에 의한 사이토카인 방출의 자극. 데이터는 사이토카인 방출을 조절하기 위해 돌연변이로 조작된 Fc-다량체의 효과를 보여준다.
도 11 : Fc-다량체에 의한 FcRn 매개 IgG 리사이클링의 억제.
도 12 : Fc-다량체에 의한 급성 혈소판감소증의 생체내 모델에서의 혈소판 손실의 예방. 그래프는 Balb/c 마우스들을 사용한 5회 독립적인 실험들에 대한 집계된 결과를 보여준다.
도 13 : Fc-다량체에 의한 만성 혈소판감소증의 생체내 모델에서의 혈소판 손실의 예방.
(a): 3일째 날에 투여된 단회 용량의 10 mg/kg Fc-다량체.
(b): 3일째 날, 4일째 날, 5일째 날 및 6일째 날에 투여된 4회 연속 매일 용량, 용량당 10 mg/kg.
그래프 상의 각각의 점에 대한 군 크기는 n=6이었다.
도 14 : Fc-다량체와 C1q의 결합.
도 15 : Fc-다량체에 의한 혈소판 활성화.
실시예
실시예 1: 분자생물학
PCR, 제한-라이게이션(restriction-ligation) 클로닝, 점 돌연변이유발(퀵체인지(Quikchange)) 및 생거(Sanger) 서열결정을 포함하는 표준 분자생물학 방법을 이용하여 Fc-다량체 DNA 서열을 조립하였다. 발현 구성체를 CHO 세포에서의 일시적인 발현 및 안정한 발현 둘 다에 적합한 발현 플라스미드(pNAFL, pNAFH) 내로 클로닝하였다. 적합한 발현 벡터의 다른 예는 pCDNA3(인비트로겐(Invitrogen))을 포함한다.
본 발명에 따른 발현 구성체 및 다량체 융합 단백질의 도식은 도 1에 제시되어 있다.
폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄의 예시적 아미노산 서열을 보여주는 도식은 도 2a∼2e에 제공되어 있다. 각각의 서열에서, 테일피스 서열은 밑줄로 표시되어 있고, 임의의 돌연변이는 굵은 글자체 및 밑줄로 표시되어 있다. IgM으로부터 유래된 CH4 도메인을 포함하는 구성체에서, 이 영역은 이탤릭체로 표시되어 있다.
IgG1/IgG4 교차 돌연변이
Fc 도메인 내의 일부 핵심 아미노산 잔기들이 IgG1에서 발견된 아미노산 잔기들과 일치하도록 디자인된 반면, 다른 핵심 아미노산 잔기들은 IgG4에서 발견된 아미노산 잔기들과 일치하도록 디자인된 다양한 Fc-다량체 변이체들을 구성하였다. 표 4에 요약된 바와 같이, IgG1과 IgG4는 CH2 도메인 내의 7개 위치들 및 CH3 도메인 내의 6개 위치들에서 서로 상이하다.
Figure pct00020
IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인 또는 IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc-다량체 폴리펩티드 쇄에 대한 예시적 아미노산 서열을 보여주는 도식은 도 2b에 제공되어 있다. 각각의 서열에서, IgG1과 IgG4 사이의 차이의 위치는 굵은 글자체로 표시되어 있고 강조되어 있다.
IgG1의 일부 선택된 성질들과 IgG4의 일부 선택된 성질들을 겸비하도록 디자인된 Fc-다량체에 대한 예시적 아미노산 서열을 보여주는 도식은 도 2c에 제공되어 있다. 돌연변이는 굵은 글자체 및 밑줄로 표시되어 있다.
IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인 서열을 출발점으로서 사용하고 관련 돌연변이를 만들어 관심 있는 특정 서열을 생성할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, 돌연변이 F234L을 갖는 IgG4 CH2 도메인은 돌연변이 H268Q, K274Q, Y296F, A327G, A330S 및 P331S를 갖는 IgG1 CH2 도메인과 동일하다.
Fc 영역 도메인 교환
CH2 도메인이 한 특정 IgG 서브클래스로부터 유래되었고 CH3 도메인이 상이한 IgG 서브클래스로부터 유래된 하이브리드 중쇄 Fc 영역을 포함하는 Fc-다량체 변이체도 구성하였다. 하이브리드 중쇄 Fc 영역을 갖는 Fc-다량체에 대한 예시적 아미노산 서열을 보여주는 도식은 도 2d에 제공되어 있다.
IgG1의 일부 선택된 성질들과 IgG4의 일부 선택된 성질들을 겸비하도록 디자인된, 하이브리드 중쇄 Fc 영역 및 추가 돌연변이를 갖는 Fc-다량체에 대한 예시적 아미노산 서열을 보여주는 도식은 도 2e에 제공되어 있다.
실시예 2: 발현
리포펙타민(lipofectamine) 또는 전기천공을 이용하여 형질감염시킨 HEK293 또는 CHO 세포의 '일시적' 발현을 이용하여 소규모 발현을 수행하였다. CD-CHO(론자(Lonza)) 또는 ProCHO5(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 배지에서 진탕 플라스크 또는 교반된 백(bags) 내에서 5일∼10일 동안 50∼2000 ㎖의 규모로 배양물을 생장시켰다. 세포를 원심분리로 제거하고 배양 상청액을 정제될 때까지 4℃에서 저장하였다. 세포를 제거한 후, 보존제를 일부 배양물에 첨가하였다.
결과는 다량체 융합 단백질이 잘 발현된다는 것을 입증하였다.
다량체 융합 단백질을 발현하는 데 사용된 신호 펩티드는 달성된 발현 수준에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 항체 B72.3으로부터의 신호 펩티드는 종래기술에 기재된 IL-2 신호 펩티드 서열보다 더 높은 발현 수준을 야기하였다.
B72.3 신호 펩티드의 DNA 및 아미노산 서열은 도 2f에 표시되어 있다.
실시예 3: 정제 및 분석
pH가 6.5 이상이 되도록 pH를 점검/조절한 후 pH 3.4 완충제를 사용한 단계 용출을 이용한 단백질 A 크로마토그래피로 Fc-다량체를 배양 상청액으로부터 정제하였다. 4℃에서 저장하기 전에 1 M 트리스(Tris) pH 8.5를 사용하여 용출물을 약 pH 7.0까지 즉시 중화시켰다. S200 컬럼 및 분획 수집을 이용한 분석 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 Fc 도메인의 다양한 다량체 형태들을 분리하였다. G3000 HPLC, 및 환원 및 비환원 SDS-PAGE 분석 후 분획을 분석하고 모았다. 리뮬러스 아메바모양세포(limulus amoebocyte) 용해물(LAL) 분석을 이용하여 내독소를 시험하였고, 상기 분석에서 사용된 샘플은 1 EU/mg 미만이었다.
일부 단백질은 십이량체 및 다른 형태로 발현되고 정제되지만, 다량체 융합 단백질은 대부분 육량체 형태로 발현되고 정제되는 것으로 확인되었다.
보존제의 존재 하에서 다량체 융합 단백질의 정제는 응집하는 경향을 감소시킴으로써, 보다 더 균일한 구조를 갖는 개선된 제제를 생성하였다. 효과적인 것으로 밝혀진 보존제의 예는 티올 캡핑제, 예컨대, N-에틸말레이미드(NEM) 및 글루타티온(GSH); 및 디설파이드 억제제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함한다.
실시예 4: Fc-다량체 조립에서의 CH3 도메인의 역할
다량체화의 정도는 예상외로 Fc 영역이 유래된 IgG 서브클래스에 따라 달라지는 것으로 확인되었다. IgG1로부터 유래된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc-다량체는 매우 효율적으로 육량체로 조립되었고, 이때 대략 80%의 분자들이 육량체 형태로 존재하였다. 대조적으로, IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc-다량체는 보다 더 낮은 수준의 육량체를 형성하였다. CH2 도메인이 한 특정 IgG 서브클래스로부터 유래되었고 CH3 도메인이 상이한 IgG 서브클래스로부터 유래된 하이브리드 Fc 영역을 포함하는 Fc-다량체의 연구는 육량체를 형성하는 능력이 주로 CH3 도메인에 의해 코딩된다는 것을 보여주었다. IgG1로부터 유래된 CH3 도메인의 존재는 육량체화를 상당히 증가시킨다. CH3 도메인이 IgG1로부터 유래되고 CH2 도메인이 IgG4로부터 유래된 하이브리드 Fc-다량체는 IgG1 야생형만큼만 효율적으로 육량체화되었고, 이때 대략 80%의 분자들이 육량체로서 확인되었다. 따라서, IgG1의 CH3 도메인에 의한 IgG4의 CH3 도메인의 교체는 야생형 IgG4 Fc-다량체에 비해 육량체화의 수준을 개선한다. 생성된 하이브리드는 IgG4의 바람직한 성질들 중 많은 바람직한 성질들을 보유하면서 고수준의 육량체 형성이라는 장점을 갖는다(도 3a).
IgG1의 CH3 도메인과 IgG4의 CH3 도메인은 실시예 1에 기재된 바와 같이 6개의 위치들에서 상이하다. IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc-다량체로 출발하여, 이 위치들 각각을 IgG1 잔기에서 IgG4 잔기로 차례로 돌연변이시켰다. 결과는 위치 355의 아미노산이 육량체화를 위해 매우 중요하다는 것을 입증하였다. 야생형 IgG1에서 위치 355에서 발견된 아미노산인 아르기닌은 효율적인 육량체화를 촉진한다. 야생형 IgG4에서 발견된 아미노산인 글루타민은 보다 더 낮은 육량체화를 야기한다. IgG1 CH3 도메인과 IgG4 CH3 도메인 사이의 차이의 다른 위치는 육량체화에 영향을 미치지 않았다(도 3b).
IgG4로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 Fc-다량체에서, 아르기닌 잔기에 의한 위치 355의 글루타민 잔기의 치환(Q355R)은 고수준의 육량체화를 야기하였다. 따라서, IgG4 Fc-다량체의 보다 더 낮은 육량체화라는 문제점은 단일 아미노산 치환에 의해 해결될 수 있다. 이것은 생성된 Fc-다량체가 IgG4의 특징적인 성질을 보유하면서 고효율로 육량체로 조립된다는 장점을 갖는다(도 3c).
IgG1 Fc-다량체에서, 시스테인에 의한 위치 355의 아르기닌의 치환(R355C)은 야생형 IgG1의 육량체 형성을 능가하는 수준까지 육량체 형성을 증가시켰다. 본 발명자들은 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 이 결과는 위치 355의 시스테인 잔기가 테일피스 내의 시스테인과 디설파이드 결합을 형성할 수 있다는 것을 암시한다. 모든 다른 아미노산들로의 R355의 돌연변이유발은 IgG1 Fc-다량체에서 육량체 형성의 추가 향상을 야기하지 않았다(도 3d).
실시예 5: Fc - 다량체와 FcR의 상호작용에 대한 친화력 측정
Fc 수용체(FcR) 보유 세포주에 대한 표면 플라스몬 공명, 경쟁 ELISA 및 경쟁 결합 연구를 비롯한 잘 알려진 방법을 이용하여 다량체 융합 단백질과, FcγR 및 FcRn을 비롯한 FcR의 상호작용에 대한 친화력/결합력 측정을 수행할 수 있다. 비아코어(Biacore) T200 상의 비아코어 센서 칩 상으로의 비특이적 고정 또는 태그 특이적 포획으로 FcR들의 가용성 세포외 도메인들(ECD들)을 표면 플라스몬 공명 실험에서 사용하였다. 인간 FcRn 세포외 도메인을 인간 FcRn 알파 쇄 세포외 도메인과 β2 마이크로글로불린 사이의 비공유 복합체로서 제공하였다. 상호작용의 강도를 가장 잘 측정하기 위해 다양한 농도 및 유속에서 상기 수용체에 대해 다량체 융합 단백질을 적정하였다. 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
도 4는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정된, 다량체 융합 단백질과 FcRn의 결합에 대한 데이터를 보여준다. 기록선은 다량체 농도 범위에 대한 결합을 나타낸다: 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM, 0.3125 μM, 0.15625 μM, 0.078125 μM, 0.0390625 μM. 나타낸 Fc-다량체들 모두가 위치 310에서 히스티딘을 포함하였다.
(a): 저밀도 FcRn에 결합하는 인간 IgG1 Fc-다량체 IgM tp L309C.
(b): 저밀도 FcRn에 결합하는 인간 IgG1 Fc-다량체 IgM tp.
(c): 고밀도 FcRn에 결합하는 인간 IgG1 Fc-다량체 IgM tp L309C.
(d): 고밀도 FcRn에 결합하는 인간 IgG1 Fc-다량체 IgM tp.
(a) 및 (c)에서 사용된 구성체들은 위치 309에서 시스테인으로의 류신 치환을 함유한다.
결과는 위치 310에서 히스티딘을 포함하는 Fc-다량체가 인간 FcRn에 결합한다는 것을 입증하였다.
인간 FcRn에의 결합을 증가시키는 것으로 생각되는 돌연변이를 포함하는 다수의 Fc-다량체들도 생성하였다.
표 5는 pH 6.0에서 돌연변이된 단량체 인간 IgG1 Fc 단편과 인간 FcRn의 결합에 대한 해리상수를 보여준다. 돌연변이는 인간 FcRn에의 결합을 증가시켰다. 그러나, 단량체 단편들의 상호작용의 강도는 마이크로몰 범위 내의 해리상수를 가지면서 여전히 약하다. 본 발명에 기재된 바와 같이, 돌연변이된 Fc 도메인들의 다량체화는 결합력 이익을 부여하여, 상호작용의 강도를 크게 개선할 수 있다.
Figure pct00021
실시예 6: B 세포 표적의 대식세포 식작용
인간 대식세포에 의한 B 세포의 항체 의존적 식작용을 측정하기 위해 분석을 디자인하였다. 대식세포를 준비하기 위해, 먼저 밀도 구배 원심분리로 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)를 신선한 혈액으로부터 단리하였다. 그 다음, PBMC들을 37℃의 6웰 조직 배양 코팅 플레이트에서 1시간 동안 인큐베이트한 후 부착되지 않은 세포를 제거함으로써 단핵세포를 선별하였다. 부착된 단핵세포를 대식세포 콜로니 자극 인자(MCSF)의 존재 하에서 5일 동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다. 그 다음, PBMC를 단리한 후 MACS(B 세포 단리 키트 II, 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotech))를 사용한 음성 선별로 B 세포를 정제함으로써 인간 B 세포를 별개의 (동종이계(allogeneic)) 기증자로부터 준비하였다. 일부 분석들에서, B 세포를 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSF)(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))로 표지하였다. 분화된 대식세포 및 B 세포를 항-CD20 mAb(리툭시맙)의 존재 하에서 1:5 비로 공배양하여 B 세포의 항체 의존적 식작용을 유도하였다. 다량체 융합 단백질 또는 대조군을 표시된 농도로 첨가하고 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 1시간∼24시간 동안 인큐베이트하였다. 각각의 시점의 말기에서, 세포를 원심분리하고 4℃의 FACS 완충제에 재현탁하여 추가 식세포작용을 중단시키고 B 세포를 유동 세포 계수법에 의한 분석 전에 항-CD19 알로파이코시아닌(APC)으로 표면 염색하였다. 대식세포들은 그들의 자가형광/측방향 산란 성질에 의해 구별되었고 B 세포들은 그들의 CFSE/CD19 표지부착에 의해 구별되었다. CD9 표지부착에 대한 음성을 나타내는 CFSE 양성 대식세포는 삼켜진 B 세포를 함유하는 것으로 추정되었다.
결과는 본 발명의 다량체 융합 단백질이 인간 대식세포에 의한 B 세포 고갈을 억제한다는 것을 입증하였다(도 5). 데이터는 IgM 테일피스 단독, 또는 IgM 테일피스 및 L309C에 의해 육량체 또는 십이량체 형태로 중합된, 인간 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 Fc-다량체들 모두가 인간 IVIG보다 상당히 더 우수한 효능 및 최대 수준의 억제를 나타낸다는 것을 보여준다.
IgG4가 대식세포 식작용의 분명한 차단을 보인다는 것에 대한 입증은 저친화성 FcγR들에의 강력한 결합을 갖는 다가 종의 생성에 의해 제공된 이익의 증거이다.
십이량체 형태와 육량체 형태가 동등하게 유효하다는 것의 입증은 육량체로부터 미량의 십이량체를 제거하기 위한 추가 정제에 대한 필요성이 없기 때문에 생성물 제조 및 안전성에 있어서 이익이다.
CFSE로 염색된 B 세포를 사용한 유동 세포 계수 분석은 작용 메커니즘이 대식세포 식작용의 억제이고 다른 수단에 의한 B 세포 사멸 또는 아폽토시스가 아니라는 것을 확인시켜주었다.
대식세포 식작용을 억제하는 임의의 주어진 Fc-다량체 구성체의 능력을 평가하기 위해, 그의 활성을 본원에 전술되어 있는 분석에서 측정하였고 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들의 활성과 비교하였다. 그 다음, 돌연변이체의 농도 대 효과 곡선과 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들에 대해 얻은 농도 대 효과 곡선의 시각적 비교를 기초로 각각의 돌연변이체의 활성을 "IgG1 유사", "높음", "중간", "낮음" 또는 "IgG4 유사"로서 요약하였다.
IgG1 및 IgG4 Fc 영역 내의 상이한 8개의 위치들 각각에서 단일 교차 돌연변이를 포함하는 Fc-다량체들에 대한 결과는 도 6에 표시되어 있고 표 6에 요약되어 있다.
IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG1 Fc-다량체는 항체로 피복된 표적 세포의 대식세포 식작용을 강력히 억제한다. IgG1 Fc-다량체 내의 단일 돌연변이들 중 2개의 단일 돌연변이들(A330S, K409R)은 식작용의 억제 효능에 영향을 미치지 않는다. 단일 돌연변이들 중 6개의 단일 돌연변이들(L234F, H268Q, K274Q, Y296F, A327G 및 P331S)은 식작용의 억제 효능을 다소 감소시킨다. 잔기 L234F 및 A327G는 이들의 돌연변이가 식세포작용의 억제에서 상대적으로 높은 효능을 유지하면서 사이토카인 방출을 상당히 감소시키기 때문에 특히 관심을 끈다(실시예 8 참조). 성질들의 이 조합은 자가면역 장애의 치료에 유용할 것이다.
야생형 IgG4 Fc-다량체는 항체로 피복된 표적 세포의 대식세포 식작용을 억제하지만, IgG1 Fc-다량체보다 덜 강력하게 억제한다. IgG4 Fc-다량체 내의 단일 돌연변이들 중 2개의 단일 돌연변이들(F234L 및 G327A)은 식작용 억제 효능을 다소 증가시킨다. IgG4 내의 돌연변이들 중 6개의 돌연변이들(Q268H, Q274K, F296Y, S330A, S331P, R409K)은 개별적으로 돌연변이될 때 식작용의 억제에 영향을 미치지 않는다. 잔기 F234L 및 G327A는, 이 위치들 중 어느 하나의 개별적인 돌연변이가 식작용의 억제에서 IgG4 Fc-다량체의 효능을 향상시키지만, 이들이 사이토카인 생성의 증가에 영향을 미치지 않기 때문에 특히 관심을 끈다(실시예 8 참조). 이러한 특성들의 조합은 자가면역 질환의 치료에 유용할 것이다.
Figure pct00022
면역 장애의 치료에 사용되도록 디자인된 추가 Fc-다량체 구성체들에 대한 결과는 도 7에 표시되어 있고 표 7에 요약되어 있다.
야생형 IgG1 및 IgG4 Fc-다량체들은 항체로 피복된 표적 세포의 대식세포 식작용을 IVIG보다 더 강력하게 억제한다.
L234F(사이토카인 생성을 감소시킴) 또는 L234F 및 P331S(사이토카인 생성 및 C1Q 결합을 감소시킴, 실시예 8 및 15 참조)를 포함하는 IgG1 Fc-다량체는 식작용의 억제에서 야생형 IgG1 Fc-다량체에 비해 다소 감소된 효능을 갖지만, 야생형 IgG4 Fc-다량체 또는 IVIG에 비해 여전히 매우 강력하다.
돌연변이 F234L; F234L및 F296Y; G327A 및 S331P; S330A 및 S331P; 또는 G327A 및 S330A를 포함하는 IgG4 Fc-다량체는 식작용의 억제에서 야생형 IgG4 Fc-다량체에 비해 향상된 효능을 갖는다.
Figure pct00023
실시예 7: IgG FITC 비드의 THP1 세포 식작용
THP1 세포를 계대배양 7에서 플레이팅하고 카운팅하고 5x105개 세포/㎖의 밀도로 재현탁하였다. 200 ㎕의 세포를 96웰 평저 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다(웰당 1x105개 세포). 토끼 IgG(캠브리지 바이오사이언스(Cambridge bioscience) CAY500290-1 ea)로 코팅된 비드를 각각의 웰에 직접 첨가하고 혼합하고(1/10 희석, 10 ㎕/웰) 1시간, 2시간, 4시간 또는 8시간 동안 방치하였다. 0시간 시점은 비드를 얼음 상의 빙냉 완충제 중의 세포에 첨가함으로써 설정되었다. 각각의 시점의 말기에, 세포를 300g에서 3분 동안 원심분리하였다. 세포를, 2분 동안 트립판 블루(trypan blue) 원액의 1:20 희석물을 함유하는 FACS 완충제에 재현탁하였다. 세포를 150 ㎕의 FACS 완충제로 세척하고 원심분리하고 200 ㎕ FACS 완충제에 재현탁하고 FACS용으로 준비된 환저 플레이트에 옮겼다. 세포를 1회 더 원심분리하고 유동 세포계수법에 의한 분석 전에 200 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하였다. THP1 세포를 정방향 및 측방향 산란에 대해 게이팅하였고 비드의 섭취를 FITC 형광으로서 측정하였다.
실시예 8: 인간 전혈 사이토카인 방출 분석
신선한 혈액을 기증자로부터 리튬 헤파린 배큐테이너(vacutainer) 내에 수집하였다. 관심 있는 Fc-다량체 구성체 또는 대조군을 표시된 농도까지 멸균 PBS에서 연속적으로 희석하였다. 12.5 ㎕의 Fc-다량체 또는 대조군을 분석 플레이트에 첨가한 후, 237.5 ㎕의 전혈을 첨가하였다. 상기 플레이트를 CO2 보충 없이 24시간 동안 37℃에서 인큐베이트하였다. 플레이트를 5분 동안 1800 rpm에서 원심분리하였고 사이토카인 분석을 위해 혈청을 제거하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 메소 스케일 디스커버리 사이토카인 멀티플렉스(Meso Scale Discovery cytokine multiplex)로 사이토카인 분석을 수행하였고 섹터 이미저(Sector Imager) 6000 상에서 판독하였다.
결과는 도 8에 표시되어 있다. 데이터는 L309C를 갖는 야생형 IgG1 Fc-다량체 및 L309C를 갖지 않은 야생형 IgG1 Fc-다량체 둘 다가 매우 높은 수준의 사이토카인 방출을 자극한다는 것을 입증하였다. 사이토카인의 관찰된 수준은 양성 대조군인 캄패쓰에 의해 생성된 사이토카인의 수준보다 더 높았다. 현저히 대조적으로, FcγR 및 C1q 불활성 "LALA" 돌연변이(L234A L235A)를 포함하는 IgG4 Fc-다량체 및 IgG1 Fc-다량체는 사실상 제로 사이토카인 방출을 야기하였다.
사이토카인 방출에 대한 임의의 주어진 Fc-다량체 구성체의 효과를 평가하기 위해, 본원에 전술되어 있는 분석에서 그의 활성을 측정하였고 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들의 활성과 비교하였다. 그 다음, 돌연변이체의 농도 대 효과 곡선과 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들에 대해 얻은 농도 대 효과 곡선의 시각적 비교를 기초로 돌연변이체의 활성을 "IgG1 유사", "높음", "중간", "낮음" 또는 "IgG4 유사"로서 요약하였다.
IgG1 및 IgG4 Fc 영역 내의 상이한 선택된 위치들에서 단일 교차 돌연변이를 포함하는 Fc-다량체에 대한 결과는 도 9에 표시되어 있고 표 8에 요약되어 있다.
결과는 IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG1 Fc-다량체가 매우 상당한 수준의 사이토카인의 방출을 자극한다는 것을 입증하였다. 표시된 결과는 IFNγ에 대한 결과이다. TNFα에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
단일 돌연변이들 중 2개의 단일 돌연변이들(L234F, A327G)은 IgG1 Fc-다량체에서 사이토카인 방출을 상당히 감소시켰다. 단일 돌연변이들 중 하나(Y296F)는 사이토카인 방출의 다소 감소를 야기하였다. 돌연변이들 중 하나(P331S)는 사이토카인 방출을 상당히 증가시켰다. 돌연변이들 중 3개의 돌연변이들(H268Q, K274Q, A330S)은 사이토카인 방출에 영향을 미치지 않았다.
현저히 대조적으로, IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG4 Fc-다량체는 사실상 사이토카인 방출을 야기하지 않았다. 단일 교차 돌연변이들 중 어느 것도 IgG4 Fc-다량체에 의한 사이토카인 방출에 어떠한 영향도 미치지 않았고, IgG1 Fc-다량체에서 사이토카인 방출에 중요한 것으로 밝혀진 위치들에서의 단일 교차 돌연변이들조차도 어떠한 영향을 미치지 않았다.
Figure pct00024
사이토카인 방출을 조절하도록 디자인된 추가 Fc-다량체 구성체들에 대한 결과는 도 10에 표시되어 있고 표 9에 요약되어 있다.
데이터는 IgG1 Fc-다량체에 의한 사이토카인 방출이 L234F를 단독으로 또는 P331S와 함께 포함함으로써 IVIG와 거의 동등한 수준까지 감소될 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 Fc-다량체는 면역 장애의 치료에 유용할 수 있다. 다른 유용한 성질, 예를 들면, 식작용에서의 향상된 효능(실시예 6)을 갖는 것으로 밝혀진 돌연변이를 포함하는 모든 IgG4 Fc-다량체들은 사실상 제로 수준의 사이토카인 방출을 보유하므로, 면역 장애의 치료에 유용할 수 있다.
Figure pct00025
실시예 9: 배양물 중의 세포에서 IgG 리사이클링에 대한 효과
제네티신(Geneticin) 선별 마커를 갖는 인간 FcRn 및 인간 β2M 이중 유전자 벡터로 안정하게 형질감염된 마딘-다비(Madin-Darby) 개 신장(MDCK) II 세포를 사용하여 세포 기반 분석을 수행하였다. 인간 IgG를 리사이클링하고 트랜스사이토시스(transcytosis)할 수 있는 안정한 세포 클론을 선별하고 이것을 모든 후속 연구들에서 사용하였다. 이것은 MDCK II 클론 15로서 지칭될 것이다. 사이노몰구스 원숭이("클론 40") 또는 마우스 FcRn으로 형질감염된 동등한 MDCK 세포주를 상기 분석과 동등한 분석에서 사용하기 위해 유사한 방식으로 생성하였다.
FcRn의 IgG 리사이클링 능력을 억제하는 본 발명의 다량체 융합 단백질의 능력을 조사하기 위해 시험관내 분석을 확립하였다. 요약하건대, MDCK II 클론 15 세포를 산성 완충제(pH 5.9) 중의 상기 다량체 융합 단백질의 존재 또는 부재 하에서 바이오티닐화된 인간 IgG(1 ㎍/㎖)와 함께 인큐베이트하여 FcRn에의 결합을 허용하였다. 60분의 펄스(pulse) 시간 후, 모든 여분의 단백질을 제거하였고 세포를 중성 pH 완충제(pH 7.2)에서 인큐베이트하여, 표면에 노출되고 결합된 IgG가 상청액 내로 방출될 수 있게 하였다. MSD 분석을 이용하여 FcRn의 억제를 추적함으로써, 리사이클링되어 상청액 내로 방출된 IgG의 양을 검출하였다.
MDCK II 클론 15 세포를 96웰 플레이트 내에 웰당 15,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 동안 인큐베이트하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 HBSS+(Ca/Mg)(pH 5.9) + 1% BSA 중의 다량체 융합 단백질의 존재 및 부재 하에서 1 ㎍/㎖의 바이오티닐화된 인간 IgG(잭슨(Jackson))와 함께 인큐베이트하였다. 세포를 HBSS+(pH 5.9)로 세척한 후, HBSS+(pH 7.2)에서 2시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이트하였다. 용해물 및 상청액을 제거하였고 (항-인간 IgG 포획 항체(잭슨) 및 스트렙타비딘-황 태그 노출 항체(MSD)를 사용한) MSD 분석을 이용하여 총 IgG에 대해 분석하였다. 억제 곡선을 비선형 회귀(그래프패드 프리즘(Graphpad Prism))로 분석하여 EC50을 측정하였다.
결과는 본 발명의 다량체 융합 단백질이 FcRn 매개 IgG 리사이클링을 억제한다는 것을 입증하였다(도 11). 위치 310에서 천연 히스티딘 잔기를 보유하는 인간 IgG1 Fc/IgM 테일피스 다량체는 위치 309에서 시스테인을 갖는 경우 및 갖지 않은 경우 둘 다에서 농도 의존적 방식으로 FcRn 매개 IgG 트랜스사이토시스 및 리사이클링을 차단한다.
표 10은 Fc-다량체의 차단 활성에 대한 돌연변이의 효과를 보여준다. FcRn에의 결합을 증가시키는 3개의 돌연변이들인 V308F, V308P 및 T307A를, IgG1 Fc/IgM 테일피스 또는 IgG4 Fc/IgM 테일피스를 포함하는 Fc-다량체들에서 시험하였다. 결과는 FcRn 매개 IgG 세포내 섭취 및 IgG 리사이클링을 차단하는 Fc-다량체의 능력의 상당한 개선을 보여주었다. 데이터는 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역을 포함하는 Fc-다량체의 효능을 개선하는 데 있어서 이 돌연변이들의 유용성을 입증한다.
류신에 의한 위치 310의 히스티딘의 치환(H310L)은 FcRn 매개 IgG 세포내 섭취 및 IgG 리사이클링을 차단하는 Fc-다량체의 능력을 파괴하는 것으로 밝혀졌다. 결과는 위치 310에서 히스티딘 잔기를 보유하는 Fc-다량체가 FcRn에의 훨씬 더 우수한 결합을 갖고 IgG 세포내 섭취 및 IgG 리사이클링의 보다 더 효능있는 차단제라는 것을 입증한다. 데이터는 본 발명의 Fc-다량체가 보다 더 긴 반감기 및 보다 더 큰 효능을 갖는 신규 개선된 치료 조성물을 제공할 수 있다는 것을 확인시켜준다.
Figure pct00026
실시예 10: 급성 ITP에서의 Fc-다량체의 효능
혈소판 손실이 항-CD41의 투여에 의해 유도되는 ITP의 마우스 모델에서 Fc-다량체의 효능을 연구하였다. 이 항체는 혈소판들의 표면 상의 당단백질 IIb에 결합하여, 파괴를 위해 이들을 표적화한다.
ITP 생체내 프로토콜
베이스라인 혈소판 수를 얻기 위해 투여 전에 마우스의 꼬리로부터 5 ㎕의 혈액 샘플을 채취하였다.
1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Fc-다량체를 마우스에게 정맥내로 투여하였다. 1시간 후, 1 ㎍/마우스의 래트 항-마우스 CD41 IgG1 항체(MWReg30)를 복강내로 투여하였다.
항-CD41 투여 후 24시간에서 말단 심장 천자를 수행하였다.
FACs 염색 프로토콜
꼬리 정맥으로부터 5 ㎕의 혈액을 채취하였다. 말단 샘플을 위해 심장 천자로 혈액을 헤파린 튜브 내에 채취하였고 염색을 위해 5 ㎕를 채취하였다.
100 ㎕의 항체 칵테일을 5 ㎕의 혈액 샘플에 첨가하고 20분 동안 4℃의 암실에서 인큐베이트하였다.
5 ㎖의 FACs 완충제를 첨가하였다.
각각의 샘플을 1:4로 희석하여 'V자형(vee)' 바닥 플레이트에서 200 ㎕의 최종 부피를 만들고 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson) FACs 캔토(Canto) 상에서 획득할 준비가 될 때까지 얼음 상에서 보관하였다.
Figure pct00027
FACS 획득
설정된 부피 150 ㎕의 샘플을 1.5 ㎕/초의 유속으로 수집하였다. 역치를 200으로 설정하였다.
플로우조(FlowJo) 소프트웨어 상에서 분석을 수행하였다. CD45-/CD42d+ 게이팅된 세포로부터 혈소판 카운트를 유도하였다.
초기 5 ㎕의 혈액 샘플을 1/4000으로 희석하고 분석되는 원래 샘플의 0.1875 ㎕에 해당하는 150 ㎕의 이 희석된 혈액 샘플을 FACs 기계에 통과시킨다는 사실을 기초로 샘플 희석에 대해 세포 카운트를 보정하였다. 5/0.1875 = 혈소판/㎕에 대한 x26.7의 증배율.
시약
정제된 래트 항-마우스 CD41 기능성 등급(이바이오사이언시스(Ebiosciences), MWReg30, 로트 #E11914-1632)
내독소 무함유 PBS(시그마(Sigma), D8537)
FACs 완충제: 0.1% FCS, 2 mM EDTA
결과
1 mg/kg 용량의 인간 다량체 융합 단백질('Fc-다량체')은 우수한 내용성을 가졌다. 그러나, 이것은 상기 모델에서 이 용량에서 효율적이지 않았다. 10 mg/kg의 인간 Fc-다량체를 사용하여 양성 결과를 관찰하였다. IgM 또는 IgA 테일피스를 갖는 Fc-다량체는 1 ㎍/마우스 항-CD41의 주사에 의해 야기된 혈소판 감소를 상당히 억제하였다.
결과는 Fc-다량체가 급성 면역 혈소판감소증의 생체내 모델에서 혈소판 손실을 예방한다는 것을 입증하였다. 인간 IgG1 Fc/IgM 테일피스 다량체(L309C를 갖는 것 및 L309C를 갖지 않은 것 둘 다) 및 L309C를 갖는 인간 IgG4 Fc/IgM 테일피스 다량체를 10 mg/kg의 용량으로 사용하여 혈소판 손실의 통계학적으로 유의한 감소를 달성하였다(도 12). 따라서, 테일피스만을 통해, 또는 L309C 디설파이드 및 테일피스를 통해 육량체화된 다량체 융합 단백질은 생체내에서 효과적이다. 인간 IVIG는 1000 mg/kg의 훨씬 더 높은 용량에서만 이 모델에서 활성을 나타낸다. 10 mg/kg의 동등한 용량에서 IVIG는 혈소판 손실을 예방하는 데 있어서 불활성 상태인 것으로 확인되었다.
데이터는 L309C를 갖는 인간 IgG4-Fc-IgM 테일피스 다량체를 10 mg/kg으로 사용하였을 때 혈소판 손실의 통계적으로 유의한 감소도 보여준다. IgG4가 단량체로서 불활성 아이소타입인 것으로서 널리 간주된다는 점을 고려할 때 IgG4-Fc-다량체의 효능은 놀랄만하다. IgG4 단량체는 통상적으로 저친화성 FcγR에의 균일하게 약한 결합을 갖는 것으로서 기재되어 있다(Bruhns et al.; Blood Vol 113(16); p3716-3725; 2009). 따라서, 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 본 발명에서 관찰된 생체내 효능은 육량체화의 결합력 이익으로부터 비롯될 수 있다.
실시예 11: 만성 ITP에서의 Fc-다량체의 효능
미니펌프를 이용하여 지속된 시간 동안 항-CD41을 투여함으로써 혈소판 손실을 유도하는 만성 ITP의 마우스 모델에서 Fc-다량체의 효능을 연구하였다.
ITP 생체내 프로토콜
베이스라인 혈소판 수를 얻기 위해 투여 전에 5 ㎕의 꼬리 혈액을 채취하였다. 82.5 ㎍/㎖의 농도(57.75 ㎕ 래트 항-마우스 CD41 Ab + 642.25 ㎕ PBS/BSA(1.5 mg/㎖))로 래트 항-마우스 CD41을 함유하는 알젯(alzet) 미니펌프를 피하 이식하였다. 상기 펌프는 일당 0.99 ㎍의 당량의 항-CD41을 투여하는 0.5 ㎕/시간의 유속을 갖는다.
혈소판 카운트를 얻기 위한 5 ㎕ 꼬리 채혈을 매일 수행하였다.
정상 상태 혈소판 카운트가 도달된 시점에서, 1 g/kg의 IVIg, 또는 다양한 용량의 Fc-다량체를 마우스에게 정맥내로 투여하였다.
7일째 날, 말단 심장 천자를 수행하였다.
FACs 염색 프로토콜
꼬리 정맥을 통해 5 ㎕의 혈액을 채취한다. 말단 샘플을 위해 심장 천자로 혈액을 헤파린 튜브 내에 채취하고 염색을 위해 5 ㎕를 채취한다.
100 ㎕의 항체 칵테일을 첨가하고 20분 동안 4℃의 암실에서 인큐베이트한다.
5 ㎖의 FACs 완충제를 첨가한다.
각각의 샘플을 1:4로 희석하여 v-바닥 플레이트에서 200 ㎕의 최종 부피를 만들고 BD FACs 캔토 상에서 획득할 준비가 될 때까지 얼음 상에서 보관한다.
Figure pct00028
FACS 획득
설정된 부피 150 ㎕의 샘플을 1.5 ㎕/초의 유속으로 수집할 것이다. 역치를 200으로 설정할 것이다.
플로우조 소프트웨어 상에서 분석을 수행할 것이다. CD45-CD42d+ 게이팅된 세포로부터 혈소판 카운트를 유도할 것이다.
초기 5 ㎕의 혈액 샘플을 1/4000으로 희석하고 분석되는 원래 샘플의 0.1875 ㎕에 해당하는 150 ㎕의 이 희석된 혈액 샘플을 FACs 기계에 통과시킨다는 사실을 기초로 샘플 희석에 대해 세포 카운트를 보정할 것이다. 5/0.1875 = 혈소판/㎕에 대한 x26.7의 증배율.
시약
정제된 래트 항-마우스 CD41 기능성 등급(이바이오사이언시스, MWReg30, 로트 #E11914-1632)
내독소 무함유 PBS(시그마, D8537)
FACs 완충제: 0.1% FCS, 2 mM EDTA
10 mg/kg IgG1 IgM tp, (ID:PB0000238), EWBE-017553, 5.69 mg/mg, 내독소<0.35 EU/mg
IgG1 Fc IgM tp L309C, (ID:PB0000198), EWBE-017400, 6.49 mg/㎖, 내독소<0.46 EU/mg
IVIg: 감뮤넥스(Gammunex) 로트 #26NK1N1.
결과는 다량체 융합 단백질이 만성 혈소판감소증의 생체내 모델에서 혈소판 손실을 예방한다는 것을 입증하였다. 도 13은 (a) 3일째 날에 투여된 단회 용량의 10 mg/kg Fc-다량체; 및 (b) 3일째 날, 4일째 날, 5일째 날 및 6일째 날에 투여된 4회 연속 매일 용량(용량당 10 mg/kg)을 사용함으로써 달성된 효과를 보여준다. 다회 용량의 Fc-다량체는 혈소판 손실의 예방에서 그의 효능을 증가시켰다. 인간 IVIG는 1000 mg/kg의 훨씬 더 높은 용량에서만 효과적이었다.
실시예 12: 질량 분광측정에 의한 육량체 Fc - 다량체의 디설파이드 결합 및 글리칸 분석
방법
육량체 Fc-다량체의 정제된 샘플(100 ㎍)을 55 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 중의 8 M 우레아의 존재 하에서 변성시키고 37℃에서 60분 동안 22 mM 요오도아세트아미드(IAM)와 함께 인큐베이트함으로써 유리 티올을 캡핑하였다. 한외여과를 이용하여 우레아 농도를 6 M까지 감소시켰고 단백질을 37℃에서 3시간 동안 LysC/트립신 혼합물(프로메가(Promega))로 분해하였다. 샘플을 5 부피의 완충제로 더 희석하였고 37℃에서 하룻밤 동안 분해를 계속 수행하였다. 펩티드를 수집하고 워터스 오아시스(Waters Oasis) HLB 카트리지로 탈염하고 원심분리 증발기를 이용하여 건조하고 0.2% 포름산을 함유하는 물(용매 A)에서 재구성하였다.
샘플(7.5 ㎕, 약 7 ㎍)을 용매 A로 평형화되었고 40℃에서 작동되는 2.1 x 150 mm C18 컬럼(워터스 1.7u PST 300A) 상에 150 ㎕/분의 속도로 적재하였다. 50% 용매 B(4:4:1 아세토니트릴:1-프로판올:물/0.2% 포름산)까지의 60분 구배를 이용하여 펩티드를, MSE +ve-이온 모드로 작동되는 워터스 제보(Waters Xevo) 질량 분광계 내로 용출하였다. 낮은 충돌 에너지와 높은 충돌 에너지의 교대 스캔으로 구성된 MSE 데이터를 용출 동안 100∼1900 m/z의 범위에 걸쳐 수집하였다. 실시 후, 10 mM 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THP) 용액을 오토샘플러(autosampler) 바이알에 직접 첨가하고 실온에서 1시간 초과의 시간 동안 인큐베이트함으로써 분해물을 환원시켰다. 그 다음, 환원된 샘플을 다시 분석하였다.
워터스 바이오파마링스(Waters BiopharmaLynx)™(BPL)를 이용하여 관련 Fc-다량체 서열에 대해 MSE 데이터를 검색하였다. THP에 의해 환원된 분해물에서 IAM으로 표지된 펩티드 대 유리 펩티드의 비로부터 유리 디설파이드 티올의 비율을 계산하였다. 분해물에서 검출된 다양한 글리코펩티드 동형체들로부터 글리칸 프로파일을 결정하였다.
결과
L309C를 갖는 Fc-다량체(IgG1Fc/IgM 테일피스) 및 L309C를 갖지 않은 Fc-다량체(IgG1Fc/IgM 테일피스)의 글리칸 분석에 대한 결과는 표 13에 표시되어 있다. 글리칸 구조는 표 8에 표시되어 있다.
데이터는 IgG1 Fc 영역 내의 글리코실화 부위인 N297의 높은 점유를 입증하는데, 이때 10% 미만의 유리 아스파라긴 잔기가 이 위치에서 발견된다. N297에서의 글리코실화는 주로 푸코실화된 바이안테나리(biantennary) 복합체, 주로 G0F이었다. IgM 테일피스 부위인 N563의 점유는 천연 IgM에서 발견되는 약 20%의 수준보다 더 높은 약 50%이었다. N563에서의 글리코실화는 주로 높은 만노스였다.
Figure pct00029
쇄간 디설파이드 결합의 분석에 대한 결과는 표 14에 표시되어 있다. 쇄내 디설파이드 결합에 대해서도 유사한 결과를 얻었다. 데이터는 Fc-다량체에서 높은 비율의 시스테인 잔기들이 디설파이드 결합된다는 것을 입증하였다. 상당한 양의 뒤섞인 디설파이드 결합에 대한 증거는 없었고, 모든 예측된 디펩티드들이 환원 전에 고수준으로 확인되었다.
Figure pct00030
실시예 13: Fc-다량체와 C1q의 결합
애브노바 코포레이션(Abnova Corporation)(카탈로그 번호: KA1274, 로트 번호: V14-111723527)으로부터 입수한 C1q ELISA 키트를 사용하여 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)으로 Fc-다량체와 C1q의 결합을 측정하였다. Fc-다량체 구성체를 500 ㎍/㎖부터 4 ㎍/㎖까지 5배 희석물로 적정하였다. 100 ㎕의 각각의 Fc-다량체 구성체를 적절한 웰에 첨가하고 1시간 동안 교반하여 결합할 수 있게 하였다. 그 다음, 제조자의 프로토콜에 따라 분석을 수행하고 450 nm의 흡광도에서 플레이트 판독기 상에서 분석하였다.
임의의 주어진 Fc-다량체 구성체과 C1q의 결합을 평가하기 위해, 그의 활성을 측정하였고 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들의 활성과 비교하였다. 그 다음, 돌연변이체의 농도 대 효과 곡선과 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들에 대해 얻은 농도 대 효과 곡선의 시각적 비교를 기초로 돌연변이체의 활성을 "IgG1 유사", "높음", "중간", "낮음" 또는 "IgG4 유사"로서 요약하였다.
결과는 도 14에 표시되어 있고 표 15에 요약되어 있다.
결과는 IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG1 Fc-다량체가 C1q에 강하게 결합한다는 것을 입증하였다. 대조적으로, IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG4 Fc-다량체는 C1q에 매우 약하게 결합한다. Fc-다량체에서 C1q 결합을 규정하는 우성 잔기는 위치 331의 프롤린(P331)인 것으로 확인되었다. 세린에 의한 이 프롤린 잔기의 치환(P331S)은 IgG1로부터 유래된 CH2 도메인을 갖는 Fc-다량체에서 C1q 결합을 효과적으로 감소시켰다. 정반대 돌연변이체인 S331P는 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인을 갖는 Fc-다량체에서 C1q 결합을 증가시켰다.
Figure pct00031
실시예 14: 혈소판 활성화
Fc-다량체에 의한 혈소판 활성화를 유동 세포 계수법으로 분석하였다. Fc-다량체의 2배 희석물을 RMPI 배지에서 제조하고 FACS 튜브에 옮겼다. 최종 농도는 100 ㎍/㎖∼3.12 ㎍/㎖이었다. 튜브당 5 ㎕의 신선한 전혈(최소 2명의 인간 기증자들로부터 입수됨)을 첨가하였다. 항-CD42b 표지된 Mab를 사용하여 혈소판을 게이팅하였고 마커 CD62p, CD63 및 PAC-1에 대한 Mab들로 활성화를 추적하였다. (벡톤 딕킨슨, BD CD42b APC Cat:551061, BD CD62p PE Cat:550561, BD CD63 PE-Cy-7 Cat:561982, BD PAC-1 FITC Cat:340507). 유동 세포 계수법에 의한 분석 전에 500 ㎕ 파라포름알데하이드 1%를 첨가하여 세포를 고정시켰다.
CD62p는 시험된 3개의 마커들 중 가장 민감한 마커인 것으로 확인되었다.
임의의 주어진 Fc-다량체 구성체에 의한 혈소판 활성화를 평가하기 위해, 그의 활성을 측정하였고 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들의 활성과 비교하였다. 그 다음, 돌연변이체의 농도 대 효과 곡선과 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들에 대해 얻은 농도 대 효과 곡선의 시각적 비교를 기초로 돌연변이체의 활성을 "IgG1 유사", "높음", "중간", "낮음" 또는 "IgG4 유사"로서 요약하였다.
CD62p 발현의 유도에 대한 결과는 도 15에 표시되어 있고 표 16에 요약되어 있다.
결과는 IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG1 Fc-다량체가 상당한 수준의 혈소판 활성화를 야기한다는 것을 입증하였다.
본 발명자들은 2개의 돌연변이들인 L234F 및 A327G가 IgG1 Fc-다량체로부터의 사이토카인 방출을 감소시키는 데 유용하다는 것을 실시예 8에서 보여주었다. 이 2개의 돌연변이들 중 L234F는 IgG1 야생형 Fc 도메인에 비해 훨씬 감소된 수준의 혈소판 활성화를 갖는 반면, A327G 돌연변이를 갖는 Fc-다량체는 상당한 수준의 혈소판 활성화를 보유한다. 따라서, L234F는 매우 유용한 돌연변이이다 - 이 돌연변이는 대식세포 식작용 억제 효능을 단지 약간 손실시키면서 사이토카인 방출 및 혈소판 활성화를 감소시킨다.
L234F에의 P331S(유용한 C1q 감소 돌연변이인 것으로 실시예 13에서 밝혀짐)의 추가(L234F P331S)는 저수준의 혈소판 활성화를 야기한다. 이 이중 돌연변이체는 낮은 사이토카인, 낮은 혈소판 활성화 및 제로 C1q 결합을 달성하는 수단이다. 따라서, 돌연변이들의 이 조합이 특히 유용하고 면역 장애의 치료를 위한 신규 요법을 제공할 것으로 예측된다.
삼중 L234F A327G P331S 돌연변이체가 낮은 혈소판 활성화를 갖기 때문에 L234F는 A327G에 비해 우성 돌연변이일 수 있다.
IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG4 Fc-다량체는 사실상 혈소판 활성화를 야기하지 않는다.
IgG1의 CH3 도메인으로의 CH3 도메인의 전환은 이 감소된 수준의 혈소판 활성화를 유지한다.
F234L 돌연변이는 저수준의 혈소판 활성화(및 향상된 효능)를 갖지만, 혈소판 활성화는 야생형 IgG4 Fc-다량체에 비해 증가된다.
F296Y는 혈소판 활성화를 더 증가시키지 않으면서 F234L과 조합될 수 있다. 이 관찰결과는 F234L F296Y가 IgG4 야생형 Fc-다량체에 비해 증가된 효능을 갖기 때문에 중요하다. 따라서, 돌연변이들의 이 조합이 특히 유용하고 면역 장애의 치료를 위한 신규 요법을 제공할 것으로 예측된다.
G327A 돌연변이는 혈소판 활성화를 증가시키지 않는다. 이 관찰결과는 고수준의 혈소판 활성화를 유지하는, IgG1 Fc-다량체에서의 역 돌연변이 A327G에 대한 결과에 비추어 볼 때 놀랄만하다.
IgG4 WT에 비해 향상된 효능도 갖는 일부 이중 돌연변이체들(G327A S330A, G327A S331P 및 S330A S331P)은 매우 낮은 수준의 혈소판 활성화(IgG4 유사)를 갖고 면역 장애의 치료를 위한 신규 요법을 제공할 것으로 예측된다.
Figure pct00032
실시예 15: Fc-다량체 변이체의 조작
이전 실시예들은 특히 면역 장애의 치료에 사용되기에 적합한 Fc-다량체가 생성되었다는 것을 예증한다. 하기 성질들을 갖는 Fc-다량체를 생성할 목적으로 Fc-다량체를 조작하였다:
항체로 피복된 표적 세포의 대식세포 식작용의 억제
Fc-다량체의 효능은 가능한 높아야 한다.
사이토카인 방출
Fc-다량체에 의한 사이토카인 방출의 자극은 가능한 낮아야 한다.
C1q 결합
Fc-다량체와 C1q의 결합은 가능한 낮아야 한다.
혈소판 활성화
Fc-다량체에 의한 혈소판 활성화는 가능한 낮아야 한다.
그러나, 이전 실시예들에서의 실험은 감소된 부작용을 달성하기 위해 최대 효능과 약간 더 낮은 효능 사이에 절충할 필요가 있을 수 있다는 것을 예증하였다.
임의의 추가 돌연변이 없이 IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG1 Fc-다량체는 사이토카인 방출, C1q 결합 및 혈소판 활성화에 의해 측정될 때 고효능의 식작용 억제를 나타내지만 고수준의 원치 않는 부작용도 보이기 때문에 면역 장애의 치료에 사용되기에 덜 적합할 수 있다.
IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 야생형 IgG4 Fc-다량체는 그의 효능이 IgG1의 효능에 비해 낮지만 매우 낮은 수준의 원치 않는 부작용을 생성한다. 그럼에도 불구하고, 야생형 IgG4 Fc-다량체의 효능은 도 7에 표시된 바와 같이 IVIG의 효능보다 여전히 상당히 더 높다.
바람직하지 않은 성질을 갖지 않으면서 IgG1 및 IgG4 야생형 Fc-다량체들 둘 다의 바람직한 성질들을 겸비한 Fc-다량체들을 디자인하였다. 이 Fc-다량체들은 하기 표 17에 표시된 바와 같이 원치 않는 부작용을 허용 가능한 수준까지 감소시키면서 효과적인 수준의 효능을 나타낸다. 이 Fc-다량체들은 면역 장애의 치료에 사용되기에 특히 유용할 것으로 예측된다.
Figure pct00033
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SPRL <120> Multimeric Fc Proteins <130> G0220 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tailpiece IgM <400> 1 Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr 1 5 10 15 Cys Tyr <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tailpiece IgA <400> 2 Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr 1 5 10 15 Cys Tyr <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge Human IgA1 <400> 3 Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ser <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge Human IgA2 <400> 4 Val Pro Pro Pro Pro Pro 1 5 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge Human IgD <400> 5 Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Gly 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Claims (74)

  1. 2개 이상의 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하는 다량체 융합 단백질로서,
    각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 중쇄 Fc 영역을 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함하고;
    각각의 중쇄 Fc 영역은, 위치 309의 시스테인 잔기, 및 FcR 결합 및/또는 보체 결합을 변경시키는 하나 이상의 다른 돌연변이를 포함하고, 그 C-말단에서, 단량체 단위가 다량체로 조립되게 하는 테일피스(tailpiece)에 융합되며;
    각각의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 가변 영역을 포함하지 않는 것인 다량체 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 항체 Fc 도메인이 IgG로부터 유래되는 것인 다량체 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 355에서 아르기닌 잔기를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 355에서 시스테인 잔기를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 355의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환되거나(Q355R) 시스테인 잔기로 치환된(Q355C), IgG4로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이 IgM으로부터 유래된 CH4 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 테일피스가 IgM 또는 IgA로부터 유래된 것인 다량체 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이 그의 N-말단에서 힌지(hinge) 영역을 갖는 것인 다량체 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 힌지 영역이 돌연변이된 서열 CPPC를 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 6개 또는 12개의 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제6항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 234의 류신 잔기 및/또는 위치 331의 프롤린 잔기가 다른 아미노산으로 치환된, IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 234의 류신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환되고 위치 331의 프롤린 잔기가 세린 잔기로 치환된(L234F/P331S), IgG1로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 234의 페닐알라닌 잔기, 위치 296의 페닐알라닌 잔기, 위치 327의 글리신 잔기, 위치 330의 세린 잔기 및 위치 331의 세린 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된, IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제12항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 234의 페닐알라닌 잔기가 류신 잔기로 치환된(F234L), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제12항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 234의 페닐알라닌 잔기가 류신 잔기로 치환되고 위치 296의 페닐알라닌 잔기가 티로신 잔기로 치환된(F234L/F296Y), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  18. 제1항 내지 제12항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 327의 글리신 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 330의 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된(G327A/S330A), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제12항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 327의 글리신 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 331의 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된(G327A/S331P), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제12항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, 위치 330의 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환되고 위치 331의 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된(S330A/S331P), IgG4로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이, IgG4로부터 유래된 CH2 도메인과 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드인 다량체 융합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역에서, 위치 234의 페닐알라닌 잔기, 위치 296의 페닐알라닌 잔기, 위치 327의 글리신 잔기, 위치 330의 세린 잔기 및 위치 331의 세린 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것인 다량체 융합 단백질.
  23. 제21항에 있어서, 위치 234의 페닐알라닌 잔기가 류신 잔기로 치환되고 위치 296의 페닐알라닌 잔기가 티로신 잔기로 치환된(F234L/F296Y) 것인 다량체 융합 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체로 피복된 표적 세포의 대식세포 식작용의 억제 효능을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, F234L, F234L과 F296Y, G327A, G327A와 S331P, S330A와 S331P, 및 G327A와 S330A로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 중쇄 Fc 영역이 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 방출을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, L234F, L234F와 P331S, A327G, 및 Y296F로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 중쇄 Fc 영역이 IgG1로부터 유래된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 혈소판 활성화를 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  31. 제30항에 있어서, L234F, 및 L234F와 P331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  32. 제31항에 있어서, 중쇄 Fc 영역이 IgG1로부터 유래된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 수용체 결합 프로파일을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn에 결합하는 다량체 융합 단백질.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn에의 결합을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  36. 제35항에 있어서, T250Q, M252Y, S254T, T256E, T307A, T307P, V308C, V308F, V308P, Q311A, Q311R, M428L, H433K, N434F 및 N434Y로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, FcγRIIb에의 결합을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  38. 제37항에 있어서, E258A, S267A, S267E 및 L328F로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, FcγR에의 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, L234A, L235A, G236R, N297A, N297Q, S298A 및 L328R로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, C1q에의 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  42. 제41항에 있어서, K322A, P331A, P331S, 및 L234F와 P331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  43. 제42항에 있어서, 중쇄 Fc 영역이 IgG1로부터 유래된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이, IgG4로부터 유래되고, FcγR 결합을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 위치 308의 발린 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킴으로써(V308C) 돌연변이되는 것인 다량체 융합 단백질.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 영역 내의 2개의 디설파이드 결합이, 코어 힌지 서열 CPPC를 SPPS로 돌연변이시킴으로써 제거되는 것인 다량체 융합 단백질.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 테일피스 내의 디설파이드 결합이, 위치 575의 시스테인 잔기를 세린, 트레오닌 또는 알라닌 잔기로 치환시킴으로써(C575S, C575T 또는 C575A) 제거되는 것인 다량체 융합 단백질.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 힌지 서열 CPPC가 SPPS로 돌연변이되고, 위치 575의 테일피스 시스테인 잔기가 세린, 트레오닌 또는 알라닌 잔기로 치환되는(C575S, C575T 또는 C575A) 것인 다량체 융합 단백질.
  49. 제48항에 있어서, 실질적으로 비공유적인 도메인간 상호작용을 포함하는 다량체 융합 단백질.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, CH2 도메인 내의 글리코실화 부위가, 위치 297의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기로 치환시키거나(N297A) 글루타민 잔기로 치환시킴으로써(N297Q) 제거되는 것인 다량체 융합 단백질.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 테일피스 내의 글리코실화 부위가, 위치 563의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기로 치환시키거나(N563A) 글루타민 잔기로 치환시킴으로써(N563Q) 제거되는 것인 다량체 융합 단백질.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, CH2 도메인 내의 글리코실화 부위 및 테일피스 내의 글리코실화 부위 둘 다가, 위치 297의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기 또는 글루타민 잔기로 치환시키고 위치 563의 아스파라긴 잔기를 알라닌 잔기 또는 글루타민 잔기로 치환시킴으로써(N297A/N563A 또는 N297A/N563Q 또는 N297Q/N563A 또는 N297Q/N563Q) 제거되는 것인 다량체 융합 단백질.
  53. 제1항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이 서열번호 26∼29 및 32 중 어느 하나의 아미노산 6∼222 또는 서열번호 50∼64 중 어느 하나의 아미노산 6∼222로 제공된 서열, 또는 서열번호 30 및 31의 아미노산 6∼333으로 제공된 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 것인 다량체 융합 단백질.
  54. 제53항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이 서열번호 3∼25 중 어느 하나로 제공된 서열을 갖는 힌지 영역을 더 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  55. 제1항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄를 포함하거나 이것으로 구성되며, 각각의 폴리펩티드쇄는 서열번호 26∼32 및 50∼64 중 어느 하나로 제공된 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 것인 다량체 융합 단백질.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 육량체이거나 대부분 육량체인 다량체 융합 단백질.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이 위치 310에서 류신 잔기를 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄 Fc 영역이 위치 310에서 히스티딘 잔기를 포함하는 것인 다량체 융합 단백질.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 육량체인 다량체 융합 단백질.
  60. 1종 초과의 형태로 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질을 포함하는 혼합물로서, 상기 다량체 융합 단백질의 육량체 형태가 농후한 혼합물.
  61. 제60항에 있어서, 혼합물의 80% 초과가 육량체인 혼합물.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질의 폴리펩티드 단량체 단위의 폴리펩티드 쇄 또는 이의 구성 부분을 코딩하는 단리된 DNA 서열.
  63. 하나 이상의 제62항에 따른 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  64. 하나 이상의 제63항에 따른 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  65. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질의 제조 방법으로서, 단백질 발현 및 다량체로의 조립에 적합한 조건 하에서 제64항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 다량체 융합 단백질을 단리하고, 경우에 따라 정제하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  66. 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 다량체 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 다른 활성 성분을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  68. 제1항 내지 제59항, 제66항 및 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 다량체 융합 단백질 또는 약학 조성물.
  69. 제1항 내지 제59항, 제66항 및 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 장애의 치료에 사용하기 위한 다량체 융합 단백질 또는 약학 조성물.
  70. 면역 장애 치료용 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 다량체 융합 단백질의 용도.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 면역 장애가 면역 혈소판감소증, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 가와사키병(Kawasaki disease) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증으로부터 선택되는 것인 용도.
  72. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 방출을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  73. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, C1q에의 결합을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
  74. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 혈소판 활성화를 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 다량체 융합 단백질.
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