KR20160120072A

KR20160120072A - 신규효모 캔디다 균주 및 이의 이용기술

Info

Publication number: KR20160120072A
Application number: KR1020150049111A
Authority: KR
Inventors: 김성훈
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2016-10-17
Also published as: KR101737814B1

Abstract

본 발명은 고농도의 당이 포함되어 있는 꿀에서 순수하게 분리되어 고농도의 자일로스와 환경 스트레스에 내성을 갖는 신규한 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1균주(기탁번호: KCTC12402BP)와 상기의 신규 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase)에 관한 것으로, 상기의 자일로스 리덕테이즈는 326개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 서열 279번에 세린(serine) 잔기로 특징 지워지는 효소로 자일로스를 자일리톨로 효율적으로 전환할 수 있다. 상기의 신규 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주, 신규 캔디다 트로피칼리스 균주 유래의 재조합 리덕테이즈 효소를 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 효소 또는 형질전환체를 제공함으로써, 순수 자일로스, 바이오매스 헤미셀룰로스 가수분해 산물, 또는 바이오에탄올 증류 발효 폐액 등의 바이오매스를 이용한 바이오리파이너리 및 바이오에너지 생산시 발생하는 헤미셀룰로스 부산물 또는 고농도의 자일로스 당밀(xylose molasses) 등의 저가의 당원료를 이용하여 고가의 당알콜인 자일리톨의 발효 또는 자일로스 전환 공정에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규효모 캔디다 균주 및 이의 이용기술{Novel yeast Candida strain and use thereof}

본 발명은 바이오매스 헤미셀룰로스의 산가수분해 산물 또는 고농도의 자일로스를 자일리톨로 발효 가능한 신규 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1(KCTC12402BP) 및 상기 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase)를 이용한 자일리톨 생산 방법에 관한 것이다.

바이오에너지(Bioenergy) 및 바이오화학(Biochemicals) 제품 생산을 위한 바이오 리파이너리(Biorefinery) 산업의 원료가 되는 바이오매스(Biomass)는 초본계(herbaceous biomass)와 목질계(woody biomass)로 나누어지며 100% 건조 중량당 30~40% 셀룰로즈, 20~25% 헤미셀룰로즈, 25~30% 리그닌을 포함하고 있다. 바이오매스의 활용을 위해서는 리그닌과 강하게 결합하고 있는 셀룰로즈와 헤미셀룰로즈의 해리를 위해 물리적, 화학적, 생물학적 전처리 과정이 필요하다. 바이오매스의 전처리 공정은 셀룰로즈 또는 헤미셀룰로즈의 함량을 증가시킬 뿐 아니라, 바이오매스의 조직의 이완 및 폴리머 형태의 셀룰로즈 또는 헤미셀룰로즈에 섬유소 분해효소인 셀룰레이즈(cellulose)와 자일라네이즈(xylanase) 효소의 접근성을 용이하게하여, 셀룰로즈와 헤미세룰로즈로부터 포도당 및 자일로스로 전환을 촉진하는데 그 목적이 있다(Agbor et al. (2011) Biotechnol. Adv. 29: 675).

바이오매스의 특성에 따라 물리적, 화학적, 생물학적 등의 다양한 방법이 사용되고 있으며, 일반적으로 화학적인 방법은 산처리를 통해 바이오매스로부터 산가수분해에 의해 헤미셀룰로즈 성분을 구성하는 자일로스, 아라비노즈 등의 오탄당을 쉽게 액상으로 유리시킬 수 있으며, 알칼리 처리를 통해서는 바이오매스 내에 리그닌 제거를 통해 단위 중량당 셀룰로즈와 헤미셀룰로즈의 함량을 증가시킨다고 알려져있다(Agbor et al. (2011) Biotechnol. Adv. 29: 675; 대한민국특허출원번호 10-2012-0125538). 전처리 과정은 바이오매스의 효율적인 당화(saccharification) 과정에 필수적인 과정으로, 개별적 바이오매스와 적합한 전처리 과정에 따라 효소당화 과정에서 바이오매스로부터 전환되는 당의 함량이 결정된다(Agbor et al. (2011) Biotechnol. Adv. 29: 675; Yang and Wyman (2008) Biofuels Bioprod. Bioref. 2: 26).

화학적 전처리 과정에서 산처리 공정은 황산, 염산, 인산 등의 강산 및 유기산 등의 약산이 이용되고 있으며, 약산-열수, 강산 전처리시에는 액상으로 헤미셀룰로즈의 주성분인 자일로스의 폴리머 형태인 자일란 또는 자일로스가 과량으로 포함한 산성 폐액을 발생시킨다고 알려져 있다(Kumar et al. (2009)Ind. Eng. Chem. DOI:10.1021/ie801542g). 또한 알칼리 처리 공정은 리그닌이 효율적으로 제거되어 셀룰로즈와 헤미셀룰로즈가 주성분으로 구성된 바이오매스가 생산되는데 당화 및 발효공정에서 주로 셀룰로즈 성분인 포도당만이 미생물에 의해 바이오에너지 또는 바이오리파이너리 산물로 전환되기 때문에, 최종 산물을 정제하고 남은 폐액에 자일로스가 과량으로 남게 된다. 바이오매스를 이용한 공정에서 발생하는 폐액은 바이오매스로부터 유리된 자일로스의 오탄당(pentose sugar)과 다양한 방향족 화합물(aromatic compound)을 포함하는 리그닌 계열의 폴리머로 구성되어 있어, 고농도 COD(Chemical Oxygen Demand), BOD(Biological Oxygen Demand), TOC(Total Organic Carbon)의 폐수를 발생시킨다. 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 및 바이오리파이너리공정에서 이와 같은 고농도의 폐수처리는 제품의 생산비용의 약 20%를 차지하고 있어, 바이오매스 유래의 연료 및 화학제품 생산 가격을 저감시키는데 결정적 역할을 한다고 할 수 있다(Hinman et al. (1992) Appl. Biochem. Biotechnol., 34/35:639; Humbird et al. (2011) NREL Technical Report NREL/TP-5100-47764).

바이오매스 기반의 바이오에너지 생산 및 바이오리파이너리 공정에서 발생하는 고농도의 자일로스가 포함되어 있는 폐액은 자일로스(xylose)를 원료로 하는 당제품 생산에 사용될 수 있다. 특히 자일로스를 주원료로 사용하는 당알콜(sugar alcohol)인 자일리톨(xylitol) 생산의 경우 자작나무(Birchwood) 또는 옥수수속대(Corn cobs)를 이용하여 산-금속 촉매반응으로 상업적 생산을 하고 있으나, 산림 파괴라는 원재료의 환경적인 문제와 옥수수 동물 사료가격 경쟁으로 인하여 자일리톨의 가격 경쟁력 확보를 위해 신규 대체 바이오매스를 이용하려는 노력이 진행되고 있다(Da Silva and Chandel Eds. (2012) D-Xylitol: pp.291-306). 따라서 바이오에탄올 및 바이오리파이너리 공정에서 배출되는 폐액에 포함된 고농도 자일로스는 기존의 자일리톨 산업에 대체원료를 제공할 뿐 아니라, 바이오매스 유래의 연료 및 화학제품 생산에 영향을 주는 폐액의 재사용을 통해 가격저감 및 환경친화적 공정개발이 가능하다는 잠재적 이용 가능성을 제시하고 있다.

자일로스를 자일리톨로 전환하는 환원과정은 화학적인 촉매반응 또는 생물학적 전화반응을 통해 이루어지며, 화학적인 공정에 비해 생물학적 공정이 부산물의 저감 및 효율이 뛰어난 것으로 알려져 있으나, 아직 상업적인 자일리톨 생산은 자작나무를 이용한 화학촉매에 의해 생산되고 있다(Da Silva and Chandel Eds. (2012) D-Xylitol: pp.291-306). 생물학적인 방법에 의한 자일리톨의 생산은 미생물 발효 및 효소 전환방법이 있으며 자일로즈를 자일리톨로 대사가능한 미생물은 효모(yeast), 곰팡이(fungi), 박테리아(bacteria) 등이 알려져 있다(Da Silva and Chandel Eds. (2012) D-Xylitol: pp.85-107): 효모균주, Candida boidinii; Candida maltosa; Candida tropicalis HXP2; Candida guilliermondii FT-20037118; Candida intermedia; Petromyces albertensis; Debaromyces hansenii UFV-170; Hansenula polymorpha; Pachysolen tannophilus; Pichia caribica;. 곰팡이균주, Aspergillus nigra; Penicillium brevicompactum; Penicillium citrinum; Penicillium expansum; Penicillium griseoroseum; Penicillium roqueforti; Penicillium purpurogenum; Penicillium janthinellum; Penicillium chrysogenum; Penicillium italicum; Penicillium crustoum. 박테리아, Corynebacterium sp.; Enterobacter liquifaciens; Mycobacterium smegmatis.

정제된 자일로스의 발효를 통한 자일리톨 생산은 캔디다종의 균주 또는 상기의 속에 속하는 균주들이 뛰어난 자일리톨 생산능을 나타낸다고 알려져 있지만, 퓨리퓨랄전구체(furfural, 5-hydroxymethyl furfural (HMF)), 산성물질(formic acid, levulini acid), 페놀류화합물(vanillin, syringaldehyde, 4-hydroxybenaldehyde, phenol) 등의 바이오매스 산가수분해 산물 및 당변성 물질이 포함된 바이오에탄올 및 바이오리파이너리 공정에서 배출되는 폐액을 이용시 발효 효율이 현저히 떨어지거나, 발효 저해물질로 인하여 세포의 성장이 일어나지 않는 것으로 보고되어 있다(Zhang et al. (2012) Bioresour. Technol. 121: 369; Zhang et al. (2012) Bioresour. Technol. 121: 134; Wang et al. (2013) Bioprocess Biosyst. Eng. 36: 1053)

이를 극복하기 위해 산가수분해 산물에서 발효 저해 물질을 활성탄 흡착을 통한 제거방법 또는 발효균주를 해당용액에 적응을 시켜 사용하는 방법 등이 제시되고 있다(Rodrigues et al. (2006) Curr. Microbiol. 53: 53; Zhang et al. (2012) Bioresour. Technol. 121: 134; 대한민국특허출원번호 10-2012-0125538). 해당방법과 관련된 본 발명자의 특허로 국내특허출원번호 10-2011-0119175 “순차적 산/염기 전처리를 통한 셀룰로즈 함량이 증가된 팜열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스의 제조방법”과 10-2012-0125538 “바이오매스 전처리 부산물로부터 자일로스의 회수 및 이의 이용방법”이 있으며, 국내특허로는 공개특허 10-2012-0103660 “저해 화합물로부터 재생 가능한 재료를 제조하기 위한 방법 및 기구”, 공개특허 10-2011-0124781 “자일로스를 탄소원으로 사용할 수 있는 캔디다 유틸리스에 의한 물질의 제조법”, 등록특허 10-11087890000 “열대과일 바이오매스 부산물로부터 제조된 자일로스와 아라비노스를 포함하는 가수분해 당화액을 이용한 자일리톨의 제조방법”이 있다. 하지만 바이오매스 기반의 바이오에탄올 및 바이오리파이너리 공정에서 발생하는 고농도의 자일로스가 포함되어 있는 폐액에 내성을 가지며, 해당폐액을 자일리톨로 전환에 대한 기술에 대한 보고는 없다.

본 발명에서는 이러한 문제를 해결하기 위하여, 바이오매스의 에탄올 발효증류 폐액을 미생물 선별배지로 이용하여, 고농도의 당을 포함하고 있는 꿀에서 환경 스트레스에 내성을 가지며 자일리톨 생산능을 갖는 신규효모를 순수 분리 정제하였으며, 상기의 발효균주를 이용하여 팜열매 껍질 산가수분해 산물 및 거대 억새 에탄올 발효증류 폐액을 이용하여 자일리톨이 생산되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 바이오매스 헤미셀룰로스의 산가수분해 산물 또는 자일로스를 자일리톨로 발효 가능한 신규 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1(KCTC12402BP) 및 상기 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase)를 이용한 자일리톨 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC12402BP로 기탁된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일로스 리덕테이즈 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 제 3항의 발현벡터를 제조하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 숙주세포에 형질 전환시키는 단계를 포함하는, 자일로스 리덕테이즈가 발현되는 재조합 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일로스 리덕테이즈 유전자에 의해 암호화되는 자일로스 리덕테이즈 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 탄소원을 포함하는 배지에서 제 1항의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 또는 제 4항의 형질전환체를 배양한 배양액에서 상층액을 수득하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 상층액에서 자일로스 리덕테이즈를 분리 및 정제하는 단계;

를 포함하는 자일로스 리덕테이즈 생산 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 제 1항의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1, 제 4항의 형질전환체 또는 제 6항의 자일로스 리덕테이즈를 함유하는 조성물을 자일로스, 헤미셀룰로오스 또는 이들을 포함하는 바이오매스 산물과 배양하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 배양액으로부터 자일리톨을 분리 및 정제하는 단계;

를 포함하는 자일리톨(xylitol) 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 고농도의 당이 포함되어 있는 꿀에서 순수하게 분리되어 환경 스트레스에 내성을 가지며 또한 고농도의 자일로스를 자일리톨로 발효할 수 있는 신규 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주(기탁번호: KCTC12402BP)와 상기의 신규 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase)에 관한 것이다. 상기의 자일로스 리덕테이즈는 326개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 서열 279번에 세린(serine) 잔기로 특징지워지는 효소로 자일로스를 자일리톨로 효율적으로 전환할 수 있다. 상기의 신규 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주, 신규 캔디다 트로피칼리스균주 유래의 재조합 리덕테이즈 효소를 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 효소 또는 형질전환체를 제공함으로써, 자일로스의 생물학적 전환반응에 적용될 수 있으며, 또한 순수한 자일로스, 바이오매스 헤미셀룰로스 가수분해산물, 또는 바이오에탄올 증류 발효 폐액 등의 바이오매스를 이용한 바이오리파이너리 및 바이오에너지 생산시 발생하는 헤미셀룰로스 부산물 또는 고농도의 자일로스 당밀(xylose molasses) 등 저가의 당 원료를 이용하여 고가의 당 알콜인 자일리톨을 생산할 수 y있다.

도 1은, C. tropicalis , C. albicans 및 C. krusei를 동정할 수 있는 BBL^TM CHROMagar^TM candida 배지에서 양성대조군 균주로 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94(KCTC7212), 음성대조군 균주로 캔디다 알비칸스( Candida albicans) ATCC^® MYA-682^TM 그리고 캔디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC^® MYA-2876^TM를 도말하여, 본 발명 균주가 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1(KCTC 12402BP) 임을 육안적으로 확인한 도이다.
도 2는, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1(KCTC12402BP) 균주의 부분적인 26S rDNA 염기서열(A)과 5.8S rDNA 염기서열(B)에 기초한 유사 캔디다 균주들(Candida spp.)과 유전학적 상관관계를 나타낸 도이다.
괄호는 NCBI Genbank accession number를 나타낸다.
도 3은, YPD 배지에서 배양한 본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주의 전체적인 모양을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope: SEM)으로 관찰한 도이다.
도 4는, 다양한 스트레스 고상배지에서 배양한 본 발명 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주의 성장을 나타낸 도이다:
(a) 온도(25℃, 30℃, 37℃, 42℃, 45℃);
(b) 염도(Sodium chloride: 0.5 M, 1.0 M, 3.0 M NaCl);
(c) 에탄올농도(EtOH: 8%, 10%, 16%, 20%, 25% (v/v));
(d) 과산화수소(hydrogen peroxide: 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM H₂O₂) 농도;
(e) 칼코플로워화이트(CalcofluorWhite: 0.25 mM, 0.5 mM) 농도;
(f) 카페인(Caffeine: 15 mM) 농도;
(g) 자일로스(xylose) 100 g/L 농도배지;
(h) 자일로스 167 g/L가 포함된 거대억새 에탄올 발효증류(EtOH fermentation/distillation broth) 폐액 배지.
도 5는, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주를 이용하여 자일리톨 생산시, 최소배지에서 자일로스와 함께 이용 가능한 탄소원을 동시에 제공했을 때 생산되는 자일리톨의 농도를 나타낸 도이다.
도 6은, 순수한 자일로스 100 g/L, 200 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500g/L, 600 g/L을 독립탄소원으로 하여, 250 mL 플라스크에서 본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주를 접종하여 30℃에서 배양하여 생산되는 균체의 성장(a) 및 최대 자일리톨의 생산 농도(b)를 나타낸 도이다:
자일로스 100 g/L(●), 200 g/L(▲), 300 g/L(■), 400 g/L(▼), 500 g/L(◆), 600 g/L(★).
도 7은, 순수한 자일로스(a), 팜열매 껍질 산가수분해 산물(b), 거대억새를 이용한 바이오에탄올 발효 증류 폐액(c)을 기본배지로 하여, 1.5 L 생물발효기에서 본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주를 접종하여 30℃에서 배양하여 생산되는 자일리톨의 양 및 감소되는 자일로스의 양을 나타낸 도이다:
● : 감소되는 자일로스의 양; 및
■ : 증가하는 자일리톨의 양.
도 8은, 단백질 3차 구조가 규명된 캔디다 테누이스(Candida tenuis)의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase)를 주형으로 하여, 양성대조군으로 캔디다 트로피칼리스 K22(Candida tropicalis K22) 유래의 자일로스 리덕테이즈와 본 발명에 따른 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈를 단백질 3차 구조 모델링을 통해 상호단백질의 구조를 비교한 도이다.
본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래 자일로스 리덕테이즈 단백질의 아미노산 서열 279번의 serine(Ser, S) 잔기(빨간색)는 캔디다 테누이스(녹색)와 캔디다 트로피칼리스 K22 균주(파란색)에서는 각각 leucine(Leu, L)과 Asparagine(Asn, N)로 구성되어 있으며, 해당 잔기는 NADPH/NADH가 결합하는 부위와 근접하고 있음을 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 재조합 단백질을 발현하는 플라스미드 pET-Ct_xyl1을 모식화한 도이다.
도 10은, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase)와 변이 재조합 단백질을 발현할 수 있는 형질 전환된 대장균에서 발현된 단백질을 SDS-PAGE(좌)와 웨스턴블롯(우)으로 확인한 도이다:
eV: pET28a 벡터를 포함한 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질;
WT: pET-Ct_xyl1 벡터를 포함한 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질;
S279L: pET-Ct_xyl1S279L 벡터를 포함한 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질; 및
S279N: pET-Ct_xyl1S279N 벡터를 포함한 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질.
도 11은, WT인 pET-Ct_xyl1 벡터를 포함한 형질전환된 대장균, pET-Ct_xyl1S279L 벡터를 포함한 형질전환된 대장균 그리고 pET-Ct_xyl1S279N 벡터를 포함한 형질전환된 대장균에서 생산된 재조합 단백질을 HisTrapTM FF칼럼으로 정제한 단백질을 확인한 도이다:
WT: pET-Ct_xyl1 벡터를 포함한 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질;
S279L: pET-Ct_xyl1S279L 벡터를 포함한 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질;
S279N: pET-Ct_xyl1S279N 벡터를 포함한 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질;
Lane 1: Flow Through fraction;
Lane 2: Washing fraction; 및
Lane 3: 정제된 단백질.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 수탁번호 KCTC12402BP로 기탁된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 벌꿀로부터 바이오매스 유래 헤미셀룰로즈 용액에 내성을 갖는 균주를 분리하기 고농도의 자일로스가 포함된 배지에서 균주를 분리하였으며 분리된 신규 균주는 미생물의 지방산 조성분석, BBL^TM CHROMagar^TM Candida 배지(US Patent No. 5,716,799; US Patent No. 5,962,251)를 이용한 균주 확인, 및 분자생물학적으로 26S rDNA 및 5.8S rDNA 분석을 통한 동정을 실시하였다. 지방산 조성분석 결과, C12:0, C14:0, C15:0, C16:1, C16:0, C17:1,C17:0, C18:2, C18:0 및 C18:1의 지방산이 검출되었으며 각각의 조성은 0.27%, 0.86%, 0.35%, 11.57%, 15.33%, 1.57%, 0.62%, 9.79%, 5.37% 및 54.28%로 확인되었다(표 1 참조). 또한, 배지에서 관찰되는 본 발명의 균주는 양성대조군 균주인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94 효모와 유사하게 짙은 금속성 청색이 관찰되었으며, 캔디다 알비칸스 균주는 녹색과 옅은 녹색의 콜로니를 확인할 수 있었다(도 1 참조). 또한, 26S rDNA 염기서열을 이용하여 유사 종과의 관계를 분석한 결과 본 발명의 분리한 신규 균주는 Candida tropicalis strain ATCC 750 28S ribosomal RNA gene partial sequence(NCBI accession number KJ651194.1) 및 Candida tropicalis strain Ph43 28S ribosomal RNA(LSU) gene partial sequence(JN940623.1)와 각각 100% 및 99%의 서열동일성(sequence identify)을 확인하였으며(도 2a 참조), 5.8S rDNA 염기서열을 이용하여 유사 종과의 유연관계를 분석한 결과, Candida tropicalis strain AN1 18S ribosomal RNA gene(HM231275.1) 및 Candida tropicalis strain CBL Cd-3 18S ribosomal RNA gene(EU924133.1)와 각각 99% 및 99%의 서열동일성(sequence identify)을 확인하였다(도 2b 참조). 이에, 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 신규한 균주를 Candida tropicalis YHJ1로 명명하고, 한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC(Korean Collection for Type Culture)에 2013년 4월 22일 기탁번호 KCTC 12402BP로 기탁하였다. 또한, 상기 분리된 신규 균주의 형태를 확인하기 위하여 주사전자현미경(scanning electron microscope: SEM)으로 세포의 표면을 관찰하였으며 그 결과 전형적인 다중출아법(multiple budding) 형태의 효모임을 확인하였다(도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 상기에서 분리한 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 다양한 물리, 화학적 환경스트레스 조건에서의 내성을 확인하기 위하여 온도, 염도(Sodium chloride), 에탄올(ethanol) 농도, 과산화수소(Hydrogen peroxide) 농도, 칼코플로워화이트(CalcofluorWhite) 농도, 카페인(Caffeine) 농도, 100 g/L 자일로스(Xylose), 에탄올 발효 증류 폐액에 대해 세포의 성장을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 30℃ 및 37℃에서 가장 좋은 성장을 나타내었으며, 낮은 온도인 25℃에 비해 높은 온도인 42℃ 및 45℃에서 성장이 뛰어난 것으로 확인되었다(도 4a 참조). 또한, 0.5 M, 1.0 M 염화나트륨이 첨가된 배지에서는 균체가 성장했으나, 3.0 M 농도에서는 성장하지 않는 것으로 나타났다(도 4b 참조). 또한, 8% ~ 25%의 에탄올이 포함되어 있는 모든 배지에서 성장이 잘 되는 것을 확인하였다(도 4c 참조). 또한, 3 mM ~ 5 mM의 과산화수소가 포함되어 있는 배지에서 성장이 잘 되는 것으로 확인되었으나, 10 mM부터는 약간의 성장의 저해가 확인되었다(도 4d 참조). 또한, 칼코플로워화이트가 포함된 배지에서는 균이 성장하지 않는 것을 확인하였다(도 4e 참조). 또한, 카페인이 포함된 배지에서 세포의 성장이 일어나긴 했으나, 일반적인 YPD 배지나 에탄올 또는 염도가 첨가되어 있는 YPD 배지에서의 성장에 비해 균체의 성장이 감소되는 것을 확인하였다(도 4f 참조). 또한, 자일로스 농도가 100 g/L 이상에서도 성장 속도가 느리지만 세포의 성장을 확인하였다(도 4g). 또한, 에탄올 발효 증류 폐액에 존재하는 167 g/L 농도의 자일로스에서도 성장 속도가 느리긴 하지만 세포의 성장을 확인하였다(도 4h 참조).

또한, 본 발명자들은 상기에서 신규 분리된 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 효모 균주의 당 대사능(sugar metabolism) 분석을 위하여 하기와 같은 독립 탄소원(육탄당(Hexose)으로 D-플럭토오스(D-fructose), D-글루코오스(D-glucose), D-갈락토오스(D-galactose), D-만노오스(D-mannose), L-람노오스(L-rhamnose); 오탄당(Pentose)으로 L-아라비노스(L-arabinose), D-아라비노스(D-arabinose), D-자일로스(D-xylose), D-라이보오스(D-ribose); 이탄당(disaccharide)으로 락토오스(lactose), 셀로비오스(cellobiose), 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 멜리비오스(melibiose), 트레할로스(trehalose); 삼산탕(Trisaccharide)으로 D-라피노오스(D-raffinose); 다당류(polysaccharide)로 전분(starch), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose), 아비셀(avicel), 자일란 오트 스펠트밀(xylan oat spelt), 자일란 버치우드(xylan birchwood), 자일란 비치우드(xylan beechwood), 이눌린(inulin); 당알콜(sugar alcohol)로 글리세롤(glycerol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol); 당산(sugar acid)으로 D-글루콘산(D-gluconic acid), D-크실론산(D-xylonic acid), D-글루쿠론산(D-glucuronic acid), D-갈락투론산(D-galacturonic acid); 알코올(alcohol)로 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol); 당아민(sugar amine)으로 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine))을 이용하였다. 그 결과, 육탄당에서는 D-fructose, D-glucose, D-galactose, D-mannose를 독립탄소원으로 사용이 가능했으나, L-rhamnose는 전혀 이용을 하지 못하는 것을 확인하였다. 오탄당의 경우 D-xylose는 이용 가능했으나, L-arabinose, D-arabinose, D-ribose는 거의 소모되지 않는 것을 확인하였다. 이탄당의 경우에는 sucrose, maltose, trehalose의 경우에는 정상적인 성장이 관찰되었으며, cellobiose에서는 낮은 세포성장이 확인되었으나, lactose와 melibiose는 거의 이용하지 못하는 것을 확인하였다. 삼산탕인 D-Raffinose는 성장이 느리긴 하지만 정상적인 세포의 성장이 확인되었으며 다당류의 inulin, starch, avicel, xylan oat spelt, carboxymethyl cellulose는 전혀 활용하지 못하는 것을 확인하였다. 당알콜인 sorbitol, mannitol은 독립탄소원으로 세포의 성장이 우수했으나, xylitol의 경우 세포의 성장이 지체되지만 정상적 성장이 확인되었으며, glycerol에서는 성장이 지체되면서 낮은 세포의 성장이 확인되었다. 당산에 있어서는 D-gluconic acid를 제외한 나머지 탄소원인 D-xylonic acid, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid에서는 전혀 성장이 없었으며, 알코올류의 탄소원에 대해서는 methanol은 거의 활용하지 못하지만 ethanol에 대한 성장은 뛰어난 것을 확인하였다. 또한 당아민인 N-acetylglucosamine에 대해서는 우수한 성장을 확인하였다(표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 상기에서 본 발명의 균주의 성장이 확인된, 독립탄소원으로 사용할 수 있는 당을 자일로스(xylose)와 함께 첨가하여 동시 대사(co-metabolism)를 통해 자일로스로부터 자일리톨(xylitol)의 생산량을 증가시킬 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 12 종의 당(D-글루코오스(D-glucose), D-갈락토오스(D-galactose), D-만노오스(D-mannose), D-플럭토오스(D-fructose), D-자일로스(D-xylose), 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 이눌린(inulin), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 트레할로스(trehalose), 라피노오스(raffinose)) 중에서 xylose 만을 탄소원으로 공급한 플라스크에서 세포배양 72시간 동안 최대 29.7 ±0.6 g/L 자일리톨(xylitol)이 생산됐으며, sorbitol을 공급한 경우는 16.2± 4.7 g/L 자일리톨 생산이 확인되었다(도 5 참조). 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주에서 자일로스와 추가로 첨가한 탄소원의 동시대사 작용을 통한 자일리톨의 생산량은 D-자일로스 > 솔비톨 > 말토오스 > 트레할로스 > 만노오스 > 수크로오스 > 플럭토오스 > 갈락토오스 > 라피노오스 순이었으며, D-글루코오스, 이눌린, 만니톨에서는 세포의 성장은 가능하였으나 자일리톨은 생산하지 않는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 자일로스의 농도가 증가할수록 균체의 성장이 늦게 나타나며 400 g/L부터 초기 성장이 늦게 나타나는 lag phase가 관찰되며 600 g/L에서는 168시간 동안 성장이 지체된 후 천천히 세포의 성장이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 600g/L 이상의 순수 자일로스에서도 균체가 성장하는 것으로 확인되었다(도 6a 참조). 또한, 각 농도에서의 최대 자일리톨 생산은 100 g/L 자일로스에서 39.9 g/L 자일리톨; 200 g/L 자일로스에서는 70.8 g/L 자일리톨; 300 g/L 자일로스에서는 84.5 g/L 자일리톨; 400 g/L의 자일로스에서는 44.7 g/L 자일리톨; 500 g/L의 자일로스에서는 51.1 g/L 자일리톨; 600 g/L의 자일로스에서는 3.1 g/L 자일리톨의 생산이 확인되었다(도 6b 참조).

또한, 본 발명자들은 상기에서 분리 동정한 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주를 이용한 자일리톨 생산을 확인하였으며 그 결과, 순수 자일로스(a)에 대해서는 144시간 동안 100 g/L의 자일로스를 66.9 g/L 자일리톨로 전환할 수 있었으며 이때의 수율은 0.67 g/g의 수율로 확인되었다(도 7a 참조). 배양액 내에 74 g/L 자일로스가 존재하는 팜열매 껍질의 산가수분해 산물(b)에 대해서는 배양 초기의 소비 속도가 느리긴 하지만 배양액 내에 74 g/L 자일로스(xylose)를 빠르게 소모하면서 자일리톨의 발효가 일어나, 54시간에는 자일로스가 완전히 소모되었으며, 배양시간 61시간에는 최대 25.2 g/L의 자일리톨을 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 이때의 수율은 0.41 g/g으로 확인되었다(도 7b 참조). 배양액 내에 97.9 g/L 자일로스가 존재하는 거대 억새를 이용한 바이오에탄올 발효 증류 폐액(c)에 대해서는 배양 초기에 24시간 동안 세포의 성장의 지체와 자일로스 소비 속도가 느린 것이 관찰되었으며, 배양액 내에 97.9 g/L 자일로스를 천천히 소모하면서 자일리톨의 발효가 일어나, 216시간에는 자일로스가 완전히 소모되었다. 216시간 동안 97.9 g/L의 자일로스를 62.2 g/L 자일리톨로 전환할 수 있었으며 이때의 수율은 0.64 g/g의 수율로 확인되었다(도 7c 참조).

따라서, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주는 환경 스트레스에 내성을 가지며 또한 자일로스를 자일리톨로 발효할 수 있어서 자일로스의 생물학적 전환반응에 적용될 수 있으며, 또한 순수한 자일로스, 바이오매스 헤미셀룰로스 가수분해산물, 또는 바이오에탄올 증류 발효 폐액 등의 바이오매스를 이용한 바이오리파이너리 및 바이오에너지 생산시 발생하는 헤미셀룰로스 부산물 또는 고농도의 자일로스 당밀(xylose molasses) 등 저가의 당 원료를 이용하여 고가의 당 알콜인 자일리톨을 생산할 수 있다.

일반적으로 효모 균주에서 자일로스 트랜스포터(xylose transporter)를 통해 수송된 자일로스(xylose)는 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase, XYL1)에 의해 자일리톨(xylitol)로 전환이 되고, 다시 자일리톨 디하이드로게네이즈(xylitol dehydrogenase, XYL2)에 의해 자일룰로즈(xylulose)로 전환이 된 후, 자일룰로즈카이네이즈(xylulose kinase, XYL3)에 의해 자일룰로즈-5-포스페이트(xylulose-5-phosphate)로 변환이 되어 오탄당인 산화경로(pentose phosphate pathway)를 통해 대사되어진다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기에서 분리한 신규 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주에서 자일리톨 생산뿐 아니라, 자일로스의 대사(metabolism)에 관여하는 XYL1, XYL2 및 XYL3 효소를 코딩하는 유전자를 확인하기 위하여, 해당 유전자를 각각 클로닝하였다. 그 결과, 서열번호 16으로 기재되는 XYL1은 NADPH-dependent D-xylose reductase II, III[Candida tropicalis MYA-3404](NCBI accession number: XP_002546500.1)와 99% 서열 동일성(sequence identify)을 나타내었으며, 서열번호 17로 기재되는 XYL2는 xylitol dehydrogenase[Candida tropicalis](NCBI accession number: ABG49459.1)와 99% 서열 동일성을 나타내었고, 서열번호 18로 기재되는 XYL3는 hypothetical protein CTRG_03873[Candida tropicalis MYA-3404](NCBI accession number: XP_002549576.1)와 99% 그리고 D-xylulokinase[Candida maltosa Xu316](NCBI accession number: AAY87404.1)와 80%의 서열동일성을 나타내었다.

또한, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 효소의 아미노산 서열 XYL1은 NADPH-dependent D-xylose reductase II, III[Candida tropicalis MYA-3404](NCBI accession number: XP_002546500.1)과 99% 서열 동일성을 갖지만, Candida tropicalis MYA-3404의 XYL1 서열과 달리 326개로 구성된 단백질의 아미노산 서열 중에서 아스파라진(Asparagine; Asn; N)으로 되어있는 아미노산 279번이 세린(Serine: Ser279 또는 S279)으로, 라이신(Lysine; Lys; K)으로 구성된 아미노산 296번이 글루타민(Glutamine: Gln296 또는 Q296)으로, 또한 아스파테이드(Aspartate; Asp; D)로 구성된 297번이 글루타메이트(Glutamate: Glu297 또는 E297)로 구성되어 있다. 자일로스 리덕테이즈는 자일로스와 NADPH 또는 NADH가 동시에 해당 단백질에 결합하여 환원 작용에 의해 자일리톨로 변환을 시키는 효소로 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 XYL1 단백질 서열의 아미노산 279번, 아미노산 296번, 297번이 단백질 활성에 영향이 있는지를 확인하기 위해 기존에 알려진 XYL1의 단백질 구조를 이용하여 단백질 3차 구조 모델링을 수행하였다. 그 결과, XYL1 단백질 서열(서열번호 16)을 상기의 대조군과 비교한 결과, 아미노산 296번과 297번은 자일로스나 NADPH/NADH가 결합하는 부위와 멀리 떨어져 있어 효소의 활성에 영향을 주지 않는 것으로 확인하였다. 하지만, 아미노산 S279의 경우, 캔디다 테누이스 XYL1 서열에서는 루이신(leucine; Leu; L)으로 구성되어 있고, 캔디다 트로피칼리스 K22 균주의 XYL1 서열에서는 아스파라진(Asparagine; Asn; N)으로 구성되어 있으며, 구조적으로 NADPH/NADH가 결합하는 부위와 근접하여 자일로스를 자일리톨로 전환하는 효소의 활성에 직접적 또는 간접적으로 영향을 줄 것으로 판단되었다(도 8 참조).

본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주로부터 유래한 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터는 순수한 자일로스, 바이오매스 헤미셀룰로스 가수분해산물, 또는 바이오에탄올 증류 발효 폐액 등의 바이오매스를 이용한 바이오리파이너리 및 바이오에너지 생산시 발생하는 헤미셀룰로스 부산물 또는 고농도의 자일로스 당밀(xylose molasses) 등 저가의 당 원료를 이용하여 고가의 당 알콜인 자일리톨을 생산할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 제 3항의 발현벡터를 제조하는 단계; 및

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 대장균에서 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 재조합 자일로스 리덕테이즈 XYL1을 생산하기 위하여 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1를 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 상기 발현벡터에 클로닝되어 대장균 내에서 생산되는 재조합 XYL1 단백질은 1,017 bp의 염기서열(서열번호 21)을 가지며 총 339개의 아미노산(서열번호 22)을 가진다. N-말단 부분에 10개의 히스티딘(histidine) 아미노산 서열이 있어 재조합 XYL1 단백질을 immobilized metal affinity chromatography(IMAC) 컬럼을 통해 용이하게 분리될 수 있다. 유전자 서열이 확인된 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1는 재조합 XYL1 단백질의 생산을 위하여 최종적으로 대장균(Escherichia coli) BL21- CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환시켰다.

또한, 본 발명자들은 상기 단백질 3차 구조 모델링으로 확인된 자일로스 리덕테이즈 XYL1 아미노산 서열 S279, L279, N270 변이 단백질 생산을 위하여, 상기 구축한 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1을 DNA를 주형으로 quick change mutagenesis를 통해 각각의 변이 단백질을 생산할 수 있는 재조합 플라스미드를 제작하였다. 최종적으로 제작된 재조합 플라스미드를 pET-Ct_Xyl1 S279L과pET-Ct_Xyl1 S279N로 명명하였다. 상기의 발현벡터에 클로닝되어 대장균 내에서 생산되는 재조합 XYL1S279L 변이단백질은 1,017 bp의 염기서열(서열번호 27)을 가지며 총 339개의 아미노산 서열(서열번호 28)을 가진다. 또한, 재조합 XYL1S279N 변이단백질은 1,017 bp의 염기서열(서열번호 29)을 가지고 총 339개의 아미노산 서열(서열번호 30)을 가진다. 상기 <실험예 7>에서 동일하게 재조합 단백질은 N-말단 부분에 10개의 히스티딘(histidine) 아미노산 서열이 있어 재조합 XYL1 단백질을 immobilized metal affinity chromatography(IMAC) 컬럼을 통해 용이하게 분리될 수 있다(도 10 참조). 유전자 서열이 확인된 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1S279L 및 pET-Ct_Xyl1S279N은 재조합 단백질의 생산을 위하여 최종적으로 대장균(Escherichia coli) BL21- CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환시켰다.

본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주로부터 유래한 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 유전자를 포함하는 발현 벡터를 형질 전환시킨 형질전환체는 순수한 자일로스, 바이오매스 헤미셀룰로스 가수분해산물, 또는 바이오에탄올 증류 발효 폐액 등의 바이오매스를 이용한 바이오리파이너리 및 바이오에너지 생산시 발생하는 헤미셀룰로스 부산물 또는 고농도의 자일로스 당밀(xylose molasses) 등 저가의 당 원료를 이용하여 고가의 당 알콜인 자일리톨을 생산할 수 있다.

또한, 본 발명은

를 포함하는 자일로스 리덕테이즈 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기에서 제조한 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1, pET-Ct_Xyl1S279L 및 pET-Ct_Xyl1S279N로부터 재조합 단백질을 정제하기 위해 HisTrapTM FF 칼럼크로마토그래피, Superose 12 칼럼크로마토그래피로 분리한 뒤, SDS-PAGE 분석을 실시하였으며, 최종적으로 얻어진 재조합 XYL1 단백질의 크기는 약 40 kDa인 것을 확인하였다(도 11 참조).

또한, 본 발명자들은 상기에서 정제된 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 자일로스 리덕테이즈(XR wt), 및 변이체 XR_S279L 및 XR_S279N 단백질의 활성을 측정하였으며 그 결과, XR_wt의 NADPH에 대한 활성이 10.1± 1.2 U/g protein으로 NADH에대한 활성에 1.3 ± 0.2 U/g protein에 비해 10배 이상 높은 것을 확인하였다. XR_S279L의 경우 NADPH에 대한 활성이 7.3 ± 1.5 U/g protein, NADH에 대한 활성이 1.0 ± 0.3 U/g protein으로 측정되었으며, XR_S279N의 경우는 NADPH에 대한 활성은 6.9 ± 0.6 U/g protein, NADH에 대한 활성은 1.2 ± 0.5 U/g protein으로 확인되었다. 이 결과를 통해 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 자일로스 리덕테이즈는 기존에 보고된 동종의 캔디다 트로피칼리스 균주의 자일로즈 리덕테이즈(XR_S279L 또는 XR S279N)에 비해 약 1.4 배 높은 자일로스 리덕테이즈 효소의 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주로부터 유래한 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 단백질은 순수한 자일로스, 바이오매스 헤미셀룰로스 가수분해산물, 또는 바이오에탄올 증류 발효 폐액 등의 바이오매스를 이용한 바이오리파이너리 및 바이오에너지 생산시 발생하는 헤미셀룰로스 부산물 또는 고농도의 자일로스 당밀(xylose molasses) 등 저가의 당 원료를 이용하여 고가의 당 알콜인 자일리톨을 생산할 수 있다.

아울러, 본 발명은

를 포함하는 자일리톨(xylitol) 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 환경 스트레스에 내성을 가지는 신규 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주, 상기 신규 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 유전자, 상기 유전자로부터 재조합 리덕테이즈 효소를 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 효소 또는 형질전환체는, 자일로스의 생물학적 전환반응에 적용될 수 있으며, 또한 순수한 자일로스, 바이오매스 헤미셀룰로스 가수분해산물, 또는 바이오에탄올 증류 발효 폐액 등의 바이오매스를 이용한 바이오리파이너리 및 바이오에너지 생산시 발생하는 헤미셀룰로스 부산물 또는 고농도의 자일로스 당밀(xylose molasses) 등 저가의 당 원료를 이용하여 고가의 당 알콜인 자일리톨을 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 헤미셀룰로즈 용액에 내성을 갖는 캔디다 트로피칼리스( Candida tropicalis ) 균주의 분리 및 동정

<1-1> 균주의 분리

본 발명자들은 벌꿀로부터 바이오매스 유래 헤미셀룰로즈 용액에 내성을 갖는 균주를 분리하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

구체적으로, 백금이로 꿀 또는 해당 꿀을 보관하던 용기의 벽면에서 꿀을 소량 채취하여 0.67 g/L yeast nitrogen base와 자일로스 농도가 73 g/L 이상으로 포함되어 있는 팜열매 껍질 산가수분해 용액(대한민국특허 10-2011-0119175; 대한민국특허 10-2012-0125538)에 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 일주일간 배양하였으며, 1차 배양된 배양액 1/100을 다시 동일배지에 접종하여 동일 조건하에서 72시간 동안 배양하였고, 최종적으로 배양된 배양액을 백금이로 일부 취하여 YPD(5 g/L Yeast extract; 10 g/L Bacto Peptone; 10 g/L Dextrose) 고체배지에 도말하였다. 도말한 고체배지를 30℃에서 3 일간 배양하여 콜로니(colony)를 최종적으로 선별하였다. 상기 고농도의 자일로스가 포함된 배지에서 분리된 신규 균주는 하기와 같이 미생물의 지방산 조성분석, BBL^TM CHROMagar^TM Candida 배지(US Patent No. 5,716,799; US Patent No. 5,962,251)를 이용한 균주 확인, 및 분자생물학적으로 26S rDNA 및 5.8S rDNA 분석을 통한 동정을 실시하였다.

<1-2> 지방산 조성 확인

상기 실시예 <1-1>에서 분리된 균주의 동정을 위해 세포 내 지방산 조성분석을 실시하였다.

구체적으로, YPD(5g/L Yeast extract; 10 g/L Bacto Peptone; 10 g/L Glucose) 액체배지에서 상기 균주를 배양한 후 균체를 회수하였으며, 한국미생보존센터(KCCM)에 의뢰하여 MIDI/Hewlett Packard Microbial Identification System(MIDI Inc, 독일)을 사용하여 분석하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 C12:0, C14:0, C15:0, C16:1, C16:0, C17:1,C17:0, C18:2, C18:0 및 C18:1의 지방산이 검출되었으며 각각의 조성은 0.27%, 0.86%, 0.35%, 11.57%, 15.33%, 1.57%, 0.62%, 9.79%, 5.37% 및 54.28%로 확인되었다(표 1).

본 발명의 실시예 <1-1>에서 분리한 균주와 다른 캔디다(Candida) 종들과의 지방산 조성 비교

균주명	지방산조성함량										참고문헌
균주명	12:00	14:00	15:00	16:1 cis9 (ω7)	16:00	17:1 cis9 (ω8)	17:00	18:2 cis9, 12/18:0a	18:00	18:1 cis9 (ω9)
실시예 <1-1>에서 분리한 균주	0.27	0.86	0.35	11.57	15.33	1.57	0.62	9.79	5.37	54.28	본발명
C. albicans	-	0.91	-	8.41	14.96	1.66	-	27.85	4.2	41.43	Peltroche-Llacsahuanga et al. J. Clinic Microbiol. 38: 3696 (2000)
C. dubliniensis	-	0.5	-	8.91	15.01	2.22	-	18.65	5.7	47.31	Peltroche-Llacsahuanga et al. J. Clinic Microbiol. 38: 3696 (2000)

<1-3> 콜로니의 육안적 확인

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 분리된 균주를 정성적으로 동정하기 위해 균주의 콜로니를 하기와 같이 육안적으로 확인하였다.

구체적으로, 지방산 조성에서 확인된 상기 균주를 정성적으로 동정하기 위해서 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 그리고 캔디다 크루사이(C. krusei)를 동정할 수 있는 BBL^TM CHROMagar^TM candida 배지(BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA)에 도말하여 고상배지에서 나타나는 콜로니(colony)의 색깔을 확인하였다. 발색시약이 포함된 BBL^TM CHROMagar^TM Candida 배지는 캔디다 알비칸스, 캔디다 트로피칼리스 그리고 캔디다 크루사이의 콜로니가 각각 다른 색을 생성하여 각 효모들을 직접 육안으로 검출할 수 있는 고체배지로, 캔디다 알비칸스의 콜로니는 밝은 녹색 내지 중간 녹색으로 나타나고, 캔디다 트로피칼리스는 짙은 청색 또는 금속성 청색을 나타내며, 캔디다 크루사이는 백색 경계가 있는 밝은 핑크색을 나타낸다. 또한, 다른 효모들은 효모 특유의 옅은 노란 크림색을 나타낸다. 본 발명자들은 양성대조군 균주로 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94(KCTC7212)와 음성대조군 균주로 캔디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC^® MYA-682^TM와 캔디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC^® MYA-2876^TM를 사용하였으며, 상기 실시예 <1-1>에서 분리한 본 발명의 균주를 백금이를 사용하여 단일 콜로니를 상기의 BBL^TM CHROMagar^TM candida 배지에 도말하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 배지에서 관찰되는 본 발명의 균주는 양성대조군 균주인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94 효모와 유사하게 짙은 금속성 청색이 관찰되었으며, 캔디다 알비칸스 균주는 녹색과 옅은 녹색의 콜로니를 확인할 수 있었다(도 1).

<1-4> 분자생물학적 확인

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 분리된 신규 균주의 분자생물학적 동정을 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 선별된 콜로니를 3 mL YPD 배지에서 24시간 배양한 후, DNA 분리를 위해 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 50 mU/mL Lypticase와 cell lysis buffer[50 mM TrisHCl(pH 8.0), 250 mM NaCl]를 첨가한 후, 37℃에서 한 시간 이상 반응하였다. 반응 후 다시 원심분리를 통해 세포를 회수한 후, AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit(바이오니아, 대전, 대한민국)를 이용하여 세포 내의 DNA를 회수하였다. 상기 균주로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 26S rDNA를 증폭하기 위해, 프라이머 NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’; 서열번호 3) 및 프라이머 LR6(5’-CGCCAGTTCTGCTTACC-3’; 서열번호 4)의 프라이머를 이용하여 94℃에서 45초, 55℃에서 1초, 72℃에서 1분 30초의 30회 반복의 DNA 폴리머레이즈 중합반응(polymerase chain reaction)을 통해 1,112 bp의 유전자(서열번호 1)를 증폭하였다. 증폭한 유전자는 pGEM-T easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 또한, 상기 균주의 ITS1-5.8S-ITS4 rDNA 염기서열을 분석하기 위하여, 프라이머 ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’; 서열번호 5) 및 프라이머 ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’; 서열번호 6)를 사용하여 96℃에서 5분간의 denaturation 반응 후에, 94℃에서 denature 30초, 55℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 1분의 30회 반복의 DNA 폴리머레이즈 중합반응을 통해 538 bp(서열번호 2)의 유전자를 증폭하였다. 증폭한 유전자는 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 26S rDNA 염기서열을 이용하여 유사 종과의 관계를 분석한 결과 본 발명의 분리한 신규 균주는 Candida tropicalis strain ATCC 750 28S ribosomal RNA gene partial sequence(NCBI accession number KJ651194.1) 및 Candida tropicalis strain Ph43 28S ribosomal RNA(LSU) gene partial sequence(JN940623.1)와 각각 100% 및 99%의 서열동일성(sequence identify)을 확인하였으며(도 2a), 5.8S rDNA 염기서열을 이용하여 유사 종과의 유연관계를 분석한 결과, Candida tropicalis strain AN1 18S ribosomal RNA gene(HM231275.1) 및 Candida tropicalis strain CBL Cd-3 18S ribosomal RNA gene(EU924133.1)와 각각 99% 및 99%의 서열동일성(sequence identify)을 확인하였다(도 2b).

이에, 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 신규한 균주를 Candida tropicalis YHJ1로 명명하고, 한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC(Korean Collection for Type Culture)에 2013년 4월 22일 기탁번호 KCTC 12402BP로 기탁하였다.

<1-5> 균주의 형태 확인

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 분리된 신규 균주의 형태를 확인하기 위하여, YPD 액상배지에서 균주를 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 24시간 배양 후, 한국생명공학연구원 주사전자현미경(scanning electron microscope: SEM)으로 세포의 표면을 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 전형적인 다중출아법(multiple budding) 형태의 효모임을 확인하였다(도 3).

< 실험예 1> 환경 스트레스조건( Stress condition )에서 캔디다 트로피칼리스( Candida tropicalis ) YHJ1 균주의 내성확인

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리한 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 다양한 물리, 화학적 환경스트레스 조건에서의 내성을 확인하기 위하여 온도, 염도(Sodium chloride), 에탄올(ethanol) 농도, 과산화수소(Hydrogen peroxide) 농도, 칼코플로워화이트(CalcofluorWhite) 농도, 카페인(Caffeine) 농도, 100 g/L 자일로스(Xylose), 에탄올 발효 증류 폐액에 대해 세포의 성장을 확인하였다.

<1-1> 온도에 따른 성장 확인

본 발명자들은 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 온도에 따른 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, YPD 액상배지에서 24시간 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 1 OD_600nm으로 맞춘 후, 균체를 1/10로 연속적으로 희석을 하여 각각의 희석 균을 YPD 고체배지에 접종하고 25℃, 30℃, 37℃, 42℃, 45℃, 50℃, 55℃에서 48시간 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 30℃ 및 37℃에서 가장 좋은 성장을 나타내었으며, 낮은 온도인 25℃에 비해 높은 온도인 42℃ 및 45℃에서 성장이 뛰어난 것으로 확인되었다(도 4a). 그러나, 50℃ 이상에서는 세포의 성장이 관찰되지 않았다(data not shown).

<1-2> 염도( Sodium chloride : NaCl )에 따른 성장 확인

본 발명자들은 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 염도에 따른 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, YPD 액상배지에서 24시간 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 1 OD_600nm으로 맞춘 후, 균체를 1/10로 연속적으로 희석을 하여 각각의 희석 균을 0.5 M, 1.0 M, 3.0 M 염화나트륨(NaCl)이 포함된 YPD 고체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 0.5 M, 1.0 M 염화나트륨이 첨가된 배지에서는 균체가 성장했으나, 3.0 M 농도에서는 성장하지 않는 것으로 나타났다(도 4b).

<1-3> 에탄올( Ethanol ) 농도에 따른 성장 확인

본 발명자들은 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 에탄올에 따른 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, YPD 액상배지에서 24시간 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 1 OD_600nm으로 맞춘 후, 균체를 1/10로 연속적으로 희석을 하여 각각의 희석 균을 8%, 10%, 16%, 20%, 25% (v/v) 에탄올이 포함된 YPD 고체배지에 접종하여 균체를 30℃에서 48시간 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 8% ~ 25%의 에탄올이 포함되어 있는 모든 배지에서 성장이 잘 되는 것을 확인하였다(도 4c).

<1-4> 과산화수소( Hydrogen peroxide ) 농도에 따른 성장 확인

본 발명자들은 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 과산화수소에 따른 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, YPD 액상배지에서 24시간 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 1 OD_600nm으로 맞춘 후, 균체를 1/10로 연속적으로 희석을 하여 각각의 희석 균을 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM 과산화수소(H₂O₂)가 포함된 YPD 고체배지에 접종하여 균체를 30℃에서 48시간 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 3 mM ~ 5 mM의 과산화수소가 포함되어 있는 배지에서 성장이 잘 되는 것으로 확인되었으나, 10 mM부터는 약간의 성장의 저해가 확인되었다(도 5d).

<1-5> 칼코플로워화이트 ( Calcofluor White ) 농도에 따른 성장 확인

본 발명자들은 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 키틴(Chitin) 성분으로 구성되어 있는 효모 세포벽(cell wall) 성장에 영향을 주는 칼코플로워화이트(Calcofluor White) 농도에 따른 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, YPD 액상배지에서 24시간 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 1 OD_600nm으로 맞춘 후, 균체를 1/10로 연속적으로 희석을 하여 각각의 희석 균을 0.25 mM, 0.5 mM 칼코플로워화이트가 포함된 YPD 고체배지에 접종하여 균체를 30℃에서 48시간 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 YPD 배지에서는 균체가 성장하였으나, 칼코플로워화이트가 포함된 배지에서는 균의 성장하지 않는 것을 확인하였다(도 4e).

<1-6> 카페인( Caffeine )에 따른 성장 확인

본 발명자들은 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 퓨린(Purine) 아날로그인 카페인(Caffeine)에 대한 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, YPD 액상배지에서 24시간 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 1 OD_600nm으로 맞춘 후, 균체를 1/10로 연속적으로 희석을 하여 각각의 희석 균을 15 mM 카페인이 포함된 YPD 고체배지에 접종하여 균체를 30℃에서 48시간 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 카페인이 포함된 배지에서 세포의 성장이 일어나긴 했으나, 일반적인 YPD 배지나 에탄올 또는 염도가 첨가되어 있는 YPD 배지에서의 성장에 비해 균체의 성장이 감소되는 것을 확인하였다(도 4f).

<1-7> 자일로스 (Xylose)에 따른 성장 확인

본 발명자들은 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 자일로스에 따른 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, YPD 액상배지에서 24시간 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 1 OD_600nm으로 맞춘 후, 균체를 1/10로 연속적으로 희석을 하여 각각의 희석 균을 자일로스(Xylose)가 100 g/L로 포함되어 있는 최소 고체배지에 접종하여 균체를 30℃에서 48시간 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 자일로스 농도가 100 g/L 이상에서도 성장 속도가 느리지만 세포의 성장을 확인하였다(도 4g).

<1-8> 에탄올 발효 증류 폐액에 따른 성장 확인

본 발명자들은 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주의 에탄올 발효 증류 폐액에 따른 영향을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, YPD 액상배지에서 24시간 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 1 OD_600nm으로 맞춘 후, 균체를 1/10로 연속적으로 희석을 하여 각각의 희석 균을 자일로스가 167 g/L 포함되어 있는 거대억새를 이용한 에탄올 발효 증류 폐액에 0.67% (w/v) YNB를 추가한 고체배지에 접종하여 균체를 30℃에서 72시간 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 에탄올 발효 증류 폐액에 존재하는 167 g/L 농도의 자일로스에서도 성장 속도가 느리긴 하지만 세포의 성장을 확인하였다(도 4h).

< 실험예 2> 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) YHJ1 균주의 당 대사능 확인

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 신규 분리된 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 효모 균주의 당 대사능(sugar metabolism) 분석을 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 0.64%(w/v) yeast nitrogen base w/o amino acid와 2%(w/v)의 독립탄소(sole carbon source) 영양원이 포함된 배지에 YPD 배지에서 배양한 균체를 증류수로 3회 세척한 후, 0.1 OD_600nm으로 각각의 배지에 균주를 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 72시간 배양하여 세포의 성장을 확인하였다. 이때 사용한 독립 탄소원은 다음과 같다(표 2):

육탄당(Hexose)으로 D-플럭토오스(D-fructose), D-글루코오스(D-glucose), D-갈락토오스(D-galactose), D-만노오스(D-mannose), L-람노오스(L-rhamnose);

오탄당(Pentose)으로 L-아라비노스(L-arabinose), D-아라비노스(D-arabinose), D-자일로스(D-xylose), D-라이보오스(D-ribose);

이탄당(disaccharide)으로 락토오스(lactose), 셀로비오스(cellobiose), 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 멜리비오스(melibiose), 트레할로스(trehalose);

삼산탕(Trisaccharide)으로 D-라피노오스(D-raffinose);

다당류(polysaccharide)로 전분(starch), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose), 아비셀(avicel), 자일란 오트 스펠트밀(xylan oat spelt), 자일란 버치우드(xylan birchwood), 자일란 비치우드(xylan beechwood), 이눌린(inulin);

당알콜(sugar alcohol)로 글리세롤(glycerol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol);

당산(sugar acid)으로 D-글루콘산(D-gluconic acid), D-크실론산(D-xylonic acid), D-글루쿠론산(D-glucuronic acid), D-갈락투론산(D-galacturonic acid);

알코올(alcohol)로 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol);

당아민(sugar amine)으로 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine).

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주는 육탄당에서는 D-fructose, D-glucose, D-galactose, D-mannose를 독립탄소원으로 사용이 가능했으나, L-rhamnose는 전혀 이용을 하지 못하는 것을 확인하였다. 오탄당의 경우 D-xylose는 이용 가능했으나, L-arabinose, D-arabinose, D-ribose는 거의 소모되지 않는 것을 확인하였다. 이탄당의 경우에는 sucrose, maltose, trehalose의 경우에는 정상적인 성장이 관찰되었으며, cellobiose에서는 낮은 세포성장이 확인되었으나, lactose와 melibiose는 거의 이용하지 못하는 것을 확인하였다. 삼산탕인 D-Raffinose는 성장이 느리긴 하지만 정상적인 세포의 성장이 확인되었으며 다당류의 inulin, starch, avicel, xylan oat spelt, carboxymethyl cellulose는 전혀 활용하지 못하는 것을 확인하였다. 당알콜인 sorbitol, mannitol은 독립탄소원으로 세포의 성장이 우수했으나, xylitol의 경우 세포의 성장이 지체되지만 정상적 성장이 확인되었으며, glycerol에서는 성장이 지체되면서 낮은 세포의 성장이 확인되었다. 당산에 있어서는 D-gluconic acid를 제외한 나머지 탄소원인 D-xylonic acid, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid에서는 전혀 성장이 없었으며, 알코올류의 탄소원에 대해서는 methanol은 거의 활용하지 못하지만 ethanol에 대한 성장은 뛰어난 것을 확인하였다. 또한 당아민인 N-acetylglucosamine에 대해서는 우수한 성장을 확인하였다(표 2).

캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1의 다양한 탄소원의 이용

탄소원	이용(Utilization)
탄소원	C. tropicalis YHJ1	C. tropicalisCBS92¹ ⁾
Hexose
D-Fructose	+++++	n.d.²⁾
D-Glucose	+++++	+
D-Galactose	+++++	+
D-Mannose	+++++	n.d.²⁾
L-Rhamnose	-	-
Pentose
L-Arabinose	(+)³⁾	-
D-Arabinose	-	-
D-Xylose	+++++	+
D-Ribose	-	-
Disaccharide
Lactose	-	-
Cellobiose	+++⁴⁾	+
Sucrose	+++++	+
Maltose	+++++	+
Melibiose	-	-
Trehalose	++++	+⁴⁾
Trisaccharide
D-Raffinose	++++	-
Polysaccharide
Starch	(+)³⁾	+
Carboxymethylcellulose	-	n.d.²⁾
Avicel	-	n.d.²⁾
Xylan oat spelt	(+)³⁾	n.d.²⁾
Xylan birch wood	-	n.d.²⁾
Xylan beech wood	-	n.d.²⁾
Inulin	(+)³⁾	-
Sugar alcohol
Glycerol	+++⁴⁾	+
Sorbitol	+++++	n.d.²⁾
Mannitol	+++++	+
Xylitol	+++⁴⁾	-
Sugar acid
D-Gluconic acid	++++	+
D-Xylonic acid	(+)³⁾	-
D-Glucuronic acid	-	-
D-Galacturonic acid	-	-
Alcohol
Methanol	-	-
Ethanol	+++++	+
Sugar amine
N-Acetylglucosamine	+++++	n.d.²⁾

¹⁾세포의 성장 데이터 소스(The Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS) Fungal Biodiversity Centre- an institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences(KNAW): http://www.cbs.knaw.nl/collections/BioloMICS.aspx?Table=Yeasts%20species&Name=Candida%20tropicalis&ExactMatch=T)

²⁾세포의 성장 보고되지 않음.

³⁾세포의 성장이 0.01 OD_600nm 미만임.

⁴⁾세포 성장 약함, 늦음(weak, delay)

< 실험예 3> 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) YHJ1 균주의 자일리톨 생산능 분석

본 발명자들은 상기 <실험예 2>에서 본 발명의 균주의 성장이 확인된, 독립탄소원으로 사용할 수 있는 당을 자일로스(xylose)와 함께 첨가하여 동시 대사(co-metabolism)를 통해 자일로스로부터 자일리톨(xylitol)의 생산량을 증가시킬 수 있는지 확인하였다.

구체적으로, 자일리톨 생산을 위한 기본 배양배지로는 2%(w/v) xylose, 0.67%(w/v) yeast nitrogen base w/ amino acid에 추가로 각각의 독립탄소원을 2%(w/v) 추가하였으며 모든 배양배지의 pH는 6.0~6.5로 하였다. 이때 사용한 독립탄소원 12종은 다음과 같다: D-글루코오스(D-glucose), D-갈락토오스(D-galactose), D-만노오스(D-mannose), D-플럭토오스(D-fructose), D-자일로스(D-xylose), 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 이눌린(inulin), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 트레할로스(trehalose), 라피노오스(raffinose). 120 mL의 baffled flask에 15 mL의 최소배지를 넣고 0.1 OD_600nm으로 각각의 배지에 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주를 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 배양하면서 각 24시간마다 일정량의 샘플을 분취하여 캔디다 트로피칼리스 YHJ1에 의해 생산되는 자일리톨과 감소되는 자일로스의 양을 측정하였다.

캔디다 트로피칼리스 YHJ1에 의해 생산되는 자일리톨과 소비하는 자일로스의 양은 고속액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 분석하였다. Refractive index detector와 auto-sampler가 장착된 HPLC 시스템을 이용하였으며, 분석컬럼으로 Aminex HPX-87P(Bio-Rad;Hercules, CA, USA)이용하여, 컬럼 온도를 80℃로 유지하면서 이동상으로 증류수를 0.6 mL/min 유속으로 하여 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 12 종의 당 중에서 xylose 만을 탄소원으로 공급한 플라스크에서 세포배양 72시간 동안 최대 29.7 ±0.6 g/L 자일리톨(xylitol)이 생산됐으며, sorbitol을 공급한 경우는 16.2± 4.7 g/L 자일리톨 생산이 확인되었다(도 5). 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주에서 자일로스와 추가로 첨가한 탄소원의 동시대사 작용을 통한 자일리톨의 생산량은 D-자일로스 > 솔비톨 > 말토오스 > 트레할로스 > 만노오스 > 수크로오스 > 플럭토오스 > 갈락토오스 > 라피노오스 순이었으며, D-글루코오스, 이눌린, 만니톨에서는 세포의 성장은 가능하였으나 자일리톨은 생산하지 않는 것을 확인하였다.

< 실험예 4> 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) YHJ1 를 이용한 자일리톨 발효 생산 확인

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리 동정한 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주를 이용한 자일리톨 생산을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 고농도의 자일로스의 자일리톨 발효를 확인하기 위하여 100, 200, 300, 400, 500, 600 g/L 순수한 자일로스, 0.5%(w/v) yeast extract, 0.5%(w/v) KH₂PO₄, 0.5%(w/v) (NH₄)₂SO₄, 0.04%(w/v) MgSO₄.7H₂O가 포함된 50 mL 배지가 포함된 250 mL 플라스크에 균체를 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 배양하면서, 균체의 성장과 자일로스 감소, 자일리톨의 생산을 모니터링하였다. 균주의 성장은 600nm 파장에서 형광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하고, HPLC 분석을 통해 세포의 성장에 따른 자일로스의 농도 변화와 자일리톨 생산량을 모니터링하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 캔디다 트로피칼리스 YHJ1은 자일로스 농도에 따라 성장 속도가 다른 것으로 확인되었다. 자일로스의 농도가 증가할수록 균체의 성장이 늦게 나타나며 400 g/L부터 초기 성장이 늦게 나타나는 lag phase가 관찰되며 600 g/L에서는 168시간 동안 성장이 지체된 후 천천히 세포의 성장이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다(도 6a). 또한, 600 g/L 이상의 순수 자일로스에서도 균체가 성장하는 것으로 확인되었다. 분광도계 OD_600nm에서 측정한 최대의 균체 성장은 100 g/L 자일로스에서 30.8; 200 g/L 자일로스에서는 28.9 g/L; 300 g/L 자일로스에서는 21.55 g/L; 400 g/L의 자일로스에서는 15.85; 500 g/L의 자일로스에서는 16.1; 600 g/L의 자일로스에서는 13.8의 세포 성장이 확인되었다(도 6a).

또한, 각 농도에서의 최대 자일리톨 생산은 100 g/L 자일로스에서 39.9 g/L 자일리톨; 200 g/L 자일로스에서는 70.8 g/L 자일리톨; 300 g/L 자일로스에서는 84.5 g/L 자일리톨; 400 g/L의 자일로스에서는 44.7 g/L 자일리톨; 500 g/L의 자일로스에서는 51.1 g/L 자일리톨; 600 g/L의 자일로스에서는 3.1 g/L 자일리톨의 생산이 확인되었다(도 6b).

발효기에서의 자일리톨의 생산은 구체적으로, 2%(w/v) 자일로스, 0.67%(w/v) yeast nitrogen base가 포함된 15 mL 배지에 접종하여 24시간 동안 240 rpm의 교반 속도로 30℃에서 배양하였다. 배양된 균체를 원심분리로 회수한 후 1.5리터의 생물 반응기에 1리터의 순수 자일로스 용액(a), 팜열매 껍질 산가수분해 산물(b), 거대 억새를 이용한 바이오에탄올 발효 증류 폐액(c)의 동일 배지를 넣고 전배양된 균체를 접종하였다. 이때 생물 반응기의 운전 조건은 온도, 30℃, pH 6.0~6.5, 교반 속도 150 rpm을 유지하였다. 균주의 성장은 600nm 파장에서 형광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하고, HPLC 분석을 통해 세포의 성장에 따른 자일로스의 농도 변화와 자일리톨 생산량을 모니터링하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 캔디다 트로피칼리스 YHJ1은 순수 자일로스(a)에 대해서는 144시간 동안 100 g/L의 자일로스를 66.9 g/L 자일리톨로 전환할 수 있었으며 이때의 수율은 0.67 g/g의 수율로 확인되었다(도 7a). 배양액 내에 74 g/L 자일로스가 존재하는 팜열매 껍질의 산가수분해 산물(b)에 대해서는 배양 초기의 소비 속도가 느리긴 하지만 배양액 내에 74 g/L 자일로스(xylose)를 빠르게 소모하면서 자일리톨의 발효가 일어나, 54시간에는 자일로스가 완전히 소모되었으며, 배양시간 61시간에는 최대 25.2 g/L의 자일리톨을 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 이때의 수율은 0.41 g/g으로 확인되었다(도 7b). 배양액 내에 97.9 g/L 자일로스가 존재하는 거대 억새를 이용한 바이오에탄올 발효 증류 폐액(c)에 대해서는 배양 초기에 24시간 동안 세포의 성장의 지체와 자일로스 소비 속도가 느린 것이 관찰되었으며, 배양액 내에 97.9 g/L 자일로스를 천천히 소모하면서 자일리톨의 발효가 일어나, 216시간에는 자일로스가 완전히 소모되었다. 216시간 동안 97.9 g/L의 자일로스를 62.2 g/L 자일리톨로 전환할 수 있었으며 이때의 수율은 0.64 g/g의 수율로 확인되었다(도 7c).

< 실험예 5> 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) YHJ1 균주에서 자일로스 대사에 관여하는 xyl1 , xyl2 및 xyl3 유전자 클로닝 및 염기서열 분석

<5-1> xyl1 , xyl2 및 xyl3 유전자 클로닝

일반적으로 효모 균주에서 자일로스 트랜스포터(xylose transporter)를 통해 수송된 자일로스(xylose)는 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase, XYL1)에 의해 자일리톨(xylitol)로 전환이 되고, 다시 자일리톨 디하이드로게네이즈(xylitol dehydrogenase, XYL2)에 의해 자일룰로즈(xylulose)로 전환이 된 후, 자일룰로즈카이네이즈(xylulose kinase, XYL3)에 의해 자일룰로즈-5-포스페이트(xylulose-5-phosphate)로 변환이 되어 오탄당인 산화경로(pentose phosphate pathway)를 통해 대사되어진다. 본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리한 신규 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주에서 자일리톨 생산뿐 아니라, 자일로스의 대사(metabolism)에 관여하는 XYL1, XYL2 및 XYL3 효소를 코딩하는 유전자를 확인하기 위하여, 해당 유전자를 각각 클로닝하였다.

구체적으로, 상기의 <실시예 1>에서와 동일한 방법으로 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 각각의 효소를 코딩하고 있는 유전자를 95℃에서 5분간의 denaturation 반응 후에 94℃에서 denature 30초, 55℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 2분의 30회 반복의 DNA 폴리머레이즈 중합반응(polymerase chain reaction)을 통해 xyl1, xyl2 및 xyl3 각각의 유전자를 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머는 다음과 같다: xyl1 유전자 클로닝을 위한 프라이머(xyl1F:5’-ATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’; 서열번호 7, xyl1R: 5’-TTAAACAAAGATTGGAATGTTGTCCC-3’;서열번호 8), xyl2 유전자 클로닝을 위한 프라이머(xyl2F: 5’-ATGACTGCAAACCCATCATTAGTTC-3’; 서열번호 9, xyl2R: 5’-CTATTCTGGACCATCAATTAAAC-3’서열번호 10), xyl3 유전자 클로닝을 위한 프라이머(xyl3F: 5’-ATGACTACTGATTATTCTGAAAACGAC-3’; 서열번호 11, xyl3R: 5’-TTATTGTTTTAATAAAGTCTCTTCC-3’; 서열번호 12). 상기 프라이머를 이용하여 증폭한 유전자는 pGEM-T easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였으며, 상기 xyl1, xyl2 및 xyl3 DNA 염기서열은 각각 981 bp(서열번호 13), 1,095 bp(서열번호 14) 및 1,854 bp(서열번호 15)로 확인되었다. 상기 xyl1, xyl2 및 xyl3 DNA 염기서열이 코딩하고 있는 효소 XYL1(xylose reductase)는 326개의 아미노산(서열번호 16), XYL2(xylitol dehydrogenase)는 364개의 아미노산(서열번호 17), XYL3(xylulose kinase)는 617개의 아미노산(서열번호 18)의 서열로 구성되어있다. 상기 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열을 이용하여 유사 단백질과의 아미노산 상동성을 NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 서열번호 16으로 기재되는 XYL1은 NADPH-dependent D-xylose reductase II, III[Candida tropicalis MYA-3404](NCBI accession number: XP_002546500.1)와 99% 서열 동일성(sequence identify)을 나타내었으며, 서열번호 17로 기재되는 XYL2는 xylitol dehydrogenase[Candida tropicalis](NCBI accession number: ABG49459.1)와 99% 서열 동일성을 나타내었고, 서열번호 18로 기재되는 XYL3는 hypothetical protein CTRG_03873[Candida tropicalis MYA-3404](NCBI accession number: XP_002549576.1)와 99% 그리고 D-xylulokinase[Candida maltosa Xu316](NCBI accession number: AAY87404.1)와 80%의 서열동일성을 나타내었다.

< 실험예 6> 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) YHJ1 유래의 XYL1 단백질의 3차 구조 모델링

본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 효소의 아미노산 서열 XYL1은 NADPH-dependent D-xylose reductase II, III[Candida tropicalis MYA-3404](NCBI accession number: XP_002546500.1)과 99% 서열 동일성을 갖지만, Candida tropicalis MYA-3404의 XYL1 서열과 달리 326개로 구성된 단백질의 아미노산 서열 중에서 아스파라진(Asparagine; Asn; N)으로 되어있는 아미노산 279번이 세린(Serine: Ser279 또는 S279)으로, 라이신(Lysine; Lys; K)으로 구성된 아미노산 296번이 글루타민(Glutamine: Gln296 또는 Q296)으로, 또한 아스파테이드(Aspartate; Asp; D)로 구성된 297번이 글루타메이트(Glutamate: Glu297 또는 E297)로 구성되어 있다. 자일로스 리덕테이즈는 자일로스와 NADPH 또는 NADH가 동시에 해당 단백질에 결합하여 환원 작용에 의해 자일리톨로 변환을 시키는 효소로 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 XYL1 단백질 서열의 아미노산 279번, 아미노산 296번, 297번이 단백질 활성에 영향이 있는지를 확인하기 위해 기존에 알려진 XYL1의 단백질 구조를 이용하여 단백질 3차 구조 모델링을 수행하였다.

구체적으로, 단백질 3차 구조 모델링은 주형으로써 단백질 결정구조가 규명된 캔디다 테누이스(Candida tenuis) xylose reductase(PDB accession number: 1MI3)(Biochem. J. 373, 319-326 (2003); Biochem. J. 385, 75-83 (2005); Biochem. J. 393. 51-58 (2006))를 활용했으며, 양성 대조군으로 캔디다 트로피칼리스 K22(Candida tropicalis K22) 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase: XYL1) 아미노산 서열(NCBI accession number: AEY80024.1; ACW81465; ACO36737; ACE50477)을 사용했다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 XYL1 단백질 서열(서열번호 16)을 상기의 대조군과 비교한 결과, 아미노산 296번과 297번은 자일로스나 NADPH/NADH가 결합하는 부위와 멀리 떨어져 있어 효소의 활성에 영향을 주지 않는 것으로 확인하였다. 하지만, 아미노산 S279의 경우, 캔디다 테누이스 XYL1 서열에서는 루이신(leucine; Leu; L)으로 구성되어 있고, 캔디다 트로피칼리스 K22 균주의 XYL1 서열에서는 아스파라진(Asparagine; Asn; N)으로 구성되어 있으며, 구조적으로 NADPH/NADH가 결합하는 부위와 근접하여 자일로스를 자일리톨로 전환하는 효소의 활성에 직접적 또는 간접적으로 영향을 줄 것으로 판단되었다(도 8).

< 실험예 7> 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) YHJ1 유래의 자일로스 리덕테이즈( XYL1 ) 생산을 위한 재조합 균주의 제작

대장균에서 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 재조합 자일로스 리덕테이즈 XYL1을 생산하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 5>에서 분석한 서열번호 13으로 기재되는 xyl1의 폴리뉴클레오티드의 유전자 정보를 기초로 XYL1 단백질을 대장균 발현벡터에 클로닝을 하기 위한 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머는 다음과 같다:

Ct_xyl1F His 5’-AAAACATATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’(서열번호 19);

Ct_xyl1R His 5’-TTTTCTCGAGTTAAACAAAGATTGGAATGTTGTCCC-3’(서열번호 20).

상기 <실시예 1>에서와 같이 캔디다 트로피칼리스 YHJ1에서 추출한 DNA를 주형으로 효소 중합 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 xyl1 유전자를 다음과 같은 조건에서 증폭하였다: denaturation(94℃, 30초), annealing(60℃, 20초), extension(72℃, 1분) 40 사이클. 증폭된 유전자는 DNA　분리정제키트(QIAGEN PCR purification kit, Valencia, CA, USA)를 이용해 순수정제하였다. 정제된 유전자와 대장균에서 해당 유전자를 클로닝할 벡터인 pET28a-10xHis를 적절한 제한효소로 처리한 후, 제한효소 처리된 유전자 단편을 아가로즈젤에서 분리하여 상기의 동일 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 유전자의 단편을 pET28a-10xHis 클로닝 벡터와 함께 접합(ligation) 시킨 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 플라스미드를 형질전환된 대장균으로부터 분리하여 DNA　시퀀싱을 수행하였다(제노텍, 대전, 대한민국). 최종적으로 제작된 재조합 플라스미드를 pET-Ct_Xyl1로 명명하였다(도 9).

상기 발현벡터에 클로닝되어 대장균 내에서 생산되는 재조합 XYL1 단백질은 1,017 bp의 염기서열(서열번호 21)을 가지며 총 339개의 아미노산(서열번호 22)을 가진다. N-말단 부분에 10개의 히스티딘(histidine) 아미노산 서열이 있어 재조합 XYL1 단백질을 immobilized metal affinity chromatography(IMAC) 컬럼을 통해 용이하게 분리될 수 있다. 유전자 서열이 확인된 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1는 재조합 XYL1 단백질의 생산을 위하여 최종적으로 대장균(Escherichia coli) BL21- CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환시켰다.

< 실험예 8> 자일로스 리덕테이즈 XYL1 아미노산 서열 S279 , L279 , N279 변이단백질 생산을 위한 재조합 균주제작

본 발명자들은 상기 <실험예 6>에서 단백질 3차 구조 모델링으로 확인된 자일로스 리덕테이즈 XYL1 아미노산 서열 S279, L279, N270 변이 단백질 생산을 위하여, 상기 <실험예 7>에서 구축한 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1을 DNA를 주형으로 quick change mutagenesis를 통해 각각의 변이 단백질을 생산할 수 있는 재조합 플라스미드를 제작하였다.

구체적으로, Quick change mutagenesis를 통해 XYL1 S279L 및 XYL1 S276N 변이단백질을 생산하기 위한 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머는 다음과 같다:

XYL1 S279L: Ct_xyl1F S279L5’-GAA ACA TTG CTG TTA TTC CAA AAT CAA ACC TTC CAG AAA GAT TAG CTC AAA AC-3’(서열번호 23); Ct_xyl1R S279L5’-GTT TTG AGC TAA TCT TTC TGG AAG GTT TGA TTT TGG AAT AAC AGC AAT GTT TC-3’(서열번호 24),

XYL1 S279N: Ct_xyl1F S279N 5’-GAA ACA TTG CTG TTA TTC CAA AAT CAA ACA ATC CAG AAA GAT TAG CTC-3’(서열번호 25); Ct_xyl1R S279N 5’-GAG CTA ATC TTT CTG GAT TGT TTG ATT TTG GAA TAA CAG CAA TGT TTC-3’(서열번호 26).

PfuUltra II fusion HS DNA polymerase(New England BioLabs, USA)와 효소 중합반응을 통해 각각의 변이 단백질을 생산할 수 있는 재조합 플라스미드를 제작하였다. 각각의 변이 단백질을 코딩하는 유전자는 다음과 같은 조건에서 증폭하였다: denaturation(94℃, 10초), annealing(60℃, 50초), extention(72℃, 7분 30초) 20 사이클. 증폭된 유전자를 제한효소 DpnI으로 37℃에서 1 시간 반응을 시킨 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 플라스미드를 형질전환된 대장균으로부터 분리하여 DNA　시퀀싱을 수행하였다(제노텍, 대전, 대한민국). 최종적으로 제작된 재조합 플라스미드를 pET-Ct_Xyl1 S279L과pET-Ct_Xyl1 S279N로 명명하였다.

상기의 발현벡터에 클로닝되어 대장균 내에서 생산되는 재조합 XYL1S279L 변이단백질은 1,017 bp의 염기서열(서열번호 27)을 가지며 총 339개의 아미노산 서열(서열번호 28)을 가진다. 또한, 재조합 XYL1S279N 변이단백질은 1,017 bp의 염기서열(서열번호 29)을 가지고 총 339개의 아미노산 서열(서열번호 30)을 가진다. 상기 <실험예 7>에서 동일하게 재조합 단백질은 N-말단 부분에 10개의 히스티딘(histidine) 아미노산 서열이 있어 재조합 XYL1 단백질을 immobilized metal affinity chromatography(IMAC) 컬럼을 통해 용이하게 분리될 수 있다. 유전자 서열이 확인된 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1S279L 및 pET-Ct_Xyl1S279N은 재조합 단백질의 생산을 위하여 최종적으로 대장균(Escherichia coli) BL21- CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환시켰다.

< 실험예 9> 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) YHJ1 유래의 재조합 자일로스 리덕테이즈 정제

본 발명자들은 상기 <실험예 7>에서 제조한 재조합 플라스미드 pET-Ct_Xyl1 및 <실험예 8>에서 제조한 pET-Ct_Xyl1S279L 및 pET-Ct_Xyl1S279N로부터 재조합 단백질을 정제하기 위해 하기와 같은 단계로 실험하였다.

(단계 1) 재조합 대장균 균주의 배양

재조합 자일리톨 리덕테이즈 단백질 유전자를 코딩하는 발현벡터를 보유한 재조합 대장균들을 적절한 항생제가 포함된 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 배지(트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L)로 37℃에서 10 시간 이상 전배양 하였다. 재조합 대장균의 전배양액을 100분의 1 부피비로 다시 LB 배지에 접종하여 37℃에서 600 nm에서 흡광도가 0.6~0.8 될 때까지 본배양한 후, 재조합 단백질의 발현을 위해 이소프로필-베타-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)를 최종 0.5 mM이 되게 첨가한 후 30℃에서 4시간을 더 배양한 후, 배양액에서 원심분리기를 통해 세포를 회수하였다.

(단계 2) HisTrapTM FF 칼럼크로마토그래피

회수된 균체를 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 균체를 3번 세척한 후 동일 완충용액을 넣고 15분간 초음파처리(sonication)하여 세포를 파쇄하였다. 만들어진 세포추출물에서 파쇄되지 않은 균체와 비용해성 단백질을 제거하기 위해 10,000 rpm에서 30분간 원심분리를 한 후 침전된 세포 잔해물을 제거하고 다음 단계를 진행하였다. (단계1)에서 발현된 재조합 단백질을 확인하기 위하여 SDS-PAGE와 anti-His-HRP antibody를 사용하여 웨스턴블롯(Western-blot analysis)를 수행한 결과 약 40 kDa의 단백질을 확인할 수 있었다(도 10). 아머샴파마시아액타에프피엘시시스템(Amersham-Pharmacia FPLC system)(GE-Healthcare, USA)을 이용하여 10 mM 이미다졸(imidazole)과 0.25 M 염화나트륨(NaCl)이 들어있는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 평형화시킨 HisTrapTM FF칼럼(0.7 × 2.5 cm)에 세포추출물을 주입하고, 동일 완충용액 20배 부피로 세척한 다음, 500 mM 이미다졸과 0.25 M 염화나트륨이 들어있는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 이미다졸을 10mM에서 500 mM까지 점차 증가시키면서 재조합 단백질을 용출시켰다. 이때 용출 속도는 분당 1 ml, 분획 튜뷰당 0.5 mL로 하였으며 단백질의 피크가 나타나는 분획을 모아 용출된 단백질은 Amicon　 Ultra Centrifugal filter 10K을 이용하여 농축시켰다.

(단계 3) Superose 12 칼럼크로마토그래피

HisTrapTM FF 컬럼으로 분리한 재조합 단백질을 좀 더 순수하게 분리하기 위해 50 mM Tris-HCl 완충용액으로(pH 8.0)로 평형시킨 Superose 12 컬럼(1.0 × 30 cm)(GE-Healthcare, USA)에 HisTrapTM FF 칼럼에서 분리된 단백질을 주입하고, 동일 완충용액을 분당 1 ml로 하여 단백질의 크기에 따라 단백질을 용출하였으며, 단백질의 피크가 나타나는 분획을 모아 용출된 단백질은 Amicon　 Ultra Centrifugal filter 10K을 이용하여 농축시켰다.

(단계 4) SDS-PAGE 분석

상기의 각 정제단계에서 얻어진 조효소 용액을 SDS-PAGE를 이용해 분리한 후 코마시에브릴리언트블루(Coommassie Brilliant Blue)로 염색하였으며 Precision Plus ProteinTM Standards(Bio-Rad, USA) 단백질을 표준단백질로 사용하여 정제된 렉틴단백질의 순도 및 크기를 분석하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 최종적으로 얻어진 재조합 XYL1 단백질의 크기는 약 40 kDa인 것을 확인하였다(도 11).

< 실험예 10> 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 자일로스 리덕테이즈(XL)의 활성 측정

상기의 <실험예 9>에서 정제된 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 자일로스 리덕테이즈(XR wt), 및 변이체 XR_S279L 및 XR_S279N 단백질의 활성을 측정하기 위해 하기와 같은 조건에서 측정하였다.

구체적으로, 50 mM TrisHCl(pH6.8) 완충용액을 사용하여 0.2 M 자일로스와 0.15 mM NADPH 또는 NADH를 기질로 하였으며, 여기에 각각의 정제된 10 ug/mL 단백질 XR_wt, XR_S279L 및 XR S279N을 첨가하여 30℃에서 30 분간 효소의 반응을 시킨 후, 감소되는 NADPH 또는 NADH와 증가되는 NADP+ 또는 NAD+를 340 nm에서 분광광도계(Spectrophotometer)로 측정하였다. 이때 자일로스 리덕테이즈의 활성(Unit, U)은 1분당 자일로즈를 자일리톨로 전환하는데 소모되는 1 μmol NADPH 또는 NADH로 정의된다.

그 결과, XR_wt의 NADPH에 대한 활성이 10.1± 1.2 U/g protein으로 NADH에대한 활성에 1.3 ± 0.2 U/g protein에 비해 10배 이상 높은 것을 확인하였다. XR_S279L의 경우 NADPH에 대한 활성이 7.3 ± 1.5 U/g protein, NADH에 대한 활성이 1.0 ± 0.3 U/g protein으로 측정되었으며, XR_S279N의 경우는 NADPH에 대한 활성은 6.9 ± 0.6 U/g protein, NADH에 대한 활성은 1.2 ± 0.5 U/g protein으로 확인되었다. 이 결과를 통해 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 유래의 자일로스 리덕테이즈는 기존에 보고된 동종의 캔디다 트로피칼리스 균주의 자일로즈 리덕테이즈(XR_S279L 또는 XR S279N)에 비해 약 1.4 배 높은 자일로스 리덕테이즈 효소의 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

본 발명은 고농도의 자일로스 또는 바이오매스 미활용 헤미세룰로즈 폐액을 자일리톨로 전환하기 위하여, 고농도의 당이 포함되어 있는 꿀에서 분리한 환경 스트레스에 내성을 갖는 신규 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주(기탁번호: KCTC12402BP)와 상기의 신규 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase)에 관한 것이다. 본 발명의 신규 캔디다 트로피칼리스 YHJ1 균주 및 상기 효모 균주 유래의 자일로스 리덕테이즈 효소는 순수 자일로스, 바이오매스 헤미셀룰로스 가수분해 산물, 또는 바이오에탄올 증류 발효 폐액 등의 바이오매스를 이용한 바이오리파이너리 및 바이오에너지 생산시 발생하는 헤미셀룰로스 부산물 또는 고농도의 자일로스 당밀(xylose molasses) 등의 저가의 당 원료를 이용하여 고가의 당알콜인 자일리톨을 생산하는데 사용될 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC12402BP

20130422

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Novel yeast Candida strain and use thereof <130> 2014P-10-033 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1112 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 1 actagtgatt cgccagttct gcttaccaaa aatggcccac taaaagctct tcattcaatt 60 gtccacgttc aattaagcaa caaggacttc ttacatattt aaagtttgag aataagttaa 120 ggtcatttca accccaatac ttctaatcat tcgctttacc tcataaaact gatacgagct 180 tctgctatcc tgagggaaac ttcggcagga accagctact agatggttcg attagtcttt 240 cgcccctata cccaaattcg acgatcgatt tgcacgtcag aaccgctacg agcctccacc 300 agagtttcct ctggcttcac cctattcagg catagttcac catctttcgg gtcccaacag 360 ctatgctctt actcaaatcc atccgaagac atcaggatcg gtcgatggtg cacccatacg 420 ggcccccacc tacgttcact ttcattacgc gtacgggttt tacacccaaa cactcgcata 480 gacgttagac tccttggtcc gtgtttcaag acgggcgact taagatcatt atgccaacat 540 cctaggtata aaccgcagtc ctcagtctag gctggcagta tcgacgaagg ctataacaca 600 caaccgaagc cgtgccacat tccaacgcaa ttctcctacc gcccaaactg atgctggccc 660 gataaactgt agaggccacc cccgaagaag taacatacaa aataccaagt ctgatctcaa 720 gcccttccct ttcaacaatt tcacgtactt tttcactctc ttttcaaagt tcttttcatc 780 tttccatcac tgtacttgtt cgctatcggt ctctcgccaa tatttagctt tagatggaat 840 ttaccaccca cttagagctg cattcccaaa caactcgact cttcgaagga actttacata 900 ggcctggatc atctcatcgc acgggattct caccctctgt gacgttctgt tccaagaaac 960 atagacaaga gccagaccca aagatacctt cttcaaatta caactcggac tctgaaagag 1020 ccagatttca aatttgagct tttgccgctt cactcgccgc tactaaggca atccctgttg 1080 gtttcttttc ctccgcttat tgatatgcaa tc 1112 <210> 2 <211> 538 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 2 actagtgatt ccgtaggtga acctgcggaa ggatcattac tgatttgctt aattgcacca 60 catgtgtttt ttattgaaca aatttctttg gtggcgggag caatcctacc gccagaggtt 120 ataactaaac caaacttttt atttacagtc aaacttgatt tattattaca atagtcaaaa 180 ctttcaacaa cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgatacg 240 taatatgaat tgcagatatt cgtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccctttg 300 gtattccaaa gggcatgcct gtttgagcgt catttctccc tcaaaccccc gggtttggtg 360 ttgagcaata cgctaggttt gtttgaaaga atttaacgtg gaaacttatt ttaagcgact 420 taggtttatc caaaacgctt attttgctag tggccaccac aatttatttc ataactttga 480 cctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaaatc 538 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NL1 <400> 3 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LR6 <400> 4 cgccagttct gcttacc 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 <400> 5 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 <400> 6 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xyl1F <400> 7 atgtctacta ctcctactat tcctac 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xyl1R <400> 8 ttaaacaaag attggaatgt tgtccc 26 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xyl2F <400> 9 atgactgcaa acccatcatt agttc 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> 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ttgatcagag gtgctactat caaaccagct gttttacaaa ttgaacatca cccatacttg 600 caacaaccaa aattgattga atatgttcaa aaagctggta ttgccattac tggttactct 660 tcatttggtc cacaatcatt cttggaattg gaatccaaga gagctttgaa caccccaact 720 ttatttgaac atgaaactat taaattaatt gctgataaac atggtaaatc tccagctcaa 780 gttttattaa gatggggcta ctcaaagaaa tattgctgtt attccaaaat caaacagtcc 840 agaaagatta gctcaaaact tgtctgttgt tgactttgac ttgactaagg atgatttgga 900 caatattgct aaattggaca ttggtttgag attcaatgat ccatgggact gggacaacat 960 tccaatcttt gtttaaaatc a 981 <210> 14 <211> 1095 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 14 atgactgcaa acccatcatt agttcttaac aaagttgacg atatttcctt tgaagaatac 60 gaagctccaa aactcgaatc accaagagat gtcattgttg aagttaagaa aactggtatc 120 tgtggatcag atatccatta ctatgcccat ggttcaattg gtccatttat tttaagaaaa 180 ccaatggttt taggtcacga atcagcaggt gttgtttctg ctgtcggaag tgaagttacc 240 aacttgaagg ttggtgatag agttgccatt gaacctggtg taccttcaag atttagtgat 300 gagaccaaat ctggtcatta tcatttgtgc ccacatatgt cttttgccgc caccccacca 360 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atttggcaac tattttatcc ttaccattac aaccaaatga ttgtttgatc 960 tcattaggta cttccactac agttttgatt attactgaaa attatcaacc ttcttctcaa 1020 tatcatcttt tcaaacaccc aacaatgcca gatagttaca tgggtatgct ttgttattgt 1080 aatggatcct tagccagaga aaaggcaaga gatgaagtta ataaacaaaa caaagtatct 1140 gattccaaaa gttgggataa atttgatgag attttggaca atagtaaaca cttcaatcat 1200 aaattaggta tttatttccc acttggtgaa atcattcctc aagctcctgc tcaaaccatt 1260 agagctgttt tagaagatgg taagattatt ccttgtgaat taaatactca tggatttagt 1320 attgatgatg atgcaaatgc tattgttgaa tctcaaactt taagttgtag attaagggca 1380 ggtccaatgt tgagtaattc tggtgatagt tcaagtgatg atgaatcacc tgaatctact 1440 aaagaattag agaagattta taaagatttg acaagtaaat ttggtgaatt gtatactgat 1500 ggtaagaaac aaacatttga atcattaact actagaccaa atagatgtta ttatgttgga 1560 ggagcatcaa ataatccaag tattattaag aaaatgggat caatttttgg tccagttaat 1620 ggtaattata aagttgaaat tccaaatgct tgtgcattag gtggtgctta caaagcaagt 1680 tggtcttttg cttgtgaaga aaagggtaaa atgattagtt atgctgatta tattactaaa 1740 ttatttgaca 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Asn Glu Lys Glu Val Gly Glu Gly Ile Asn Arg Ala Ile 65 70 75 80 Lys Glu Gly Leu Val Lys Arg Glu Glu Leu Phe Ile Thr Ser Lys Leu 85 90 95 Trp Asn Asn Phe His Asp Pro Lys Asn Val Glu Thr Ala Leu Asn Lys 100 105 110 Thr Leu Ser Asp Leu Asn Leu Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His 115 120 125 Phe Pro Ile Ala Phe Lys Phe Val Pro Ile Glu Glu Lys Tyr Pro Pro 130 135 140 Gly Phe Tyr Cys Gly Asp Gly Asp Asn Phe His Tyr Glu Asp Val Pro 145 150 155 160 Leu Leu Asp Thr Trp Lys Ala Leu Glu Lys Leu Val Glu Ala Gly Lys 165 170 175 Ile Lys Ser Ile Gly Ile Ser Asn Phe Thr Gly Ala Leu Ile Tyr Asp 180 185 190 Leu Ile Arg Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ala Val Leu Gln Ile Glu His 195 200 205 His Pro Tyr Leu Gln Gln Pro Lys Leu Ile Glu Tyr Val Gln Lys Ala 210 215 220 Gly Ile Ala Ile Thr Gly Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Leu 225 230 235 240 Glu Leu Glu Ser Lys Arg Ala Leu Asn Thr Pro Thr Leu Phe Glu His 245 250 255 Glu Thr Ile Lys Ser Ile Ala Asp Lys His Gly Lys Ser Pro Ala Gln 260 265 270 Val Leu Leu Arg Trp Ala Thr Gln Arg Asn Ile Ala Val Ile Pro Lys 275 280 285 Ser Asn Asn Pro Glu Arg Leu Ala Gln Asn Leu Ser Val Val Asp Phe 290 295 300 Asp Leu Thr Gln Glu Asp Leu Asp Asn Ile Ala Lys Leu Asp Ile Gly 305 310 315 320 Leu Arg Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Asn Ile Ser Asn Leu Cys 325 330 335 Leu Lys Ser

Claims

수탁번호 KCTC 12402BP로 기탁된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 균주.
제 1항의 균주로부터 생산되는 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 자일로스 리덕테이즈(xylose reductase) 유전자.
제 1항의 자일로스 리덕테이즈 유전자를 포함하는 발현 벡터.
제 3항의 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체.
1) 제 3항의 발현벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 자일로스 리덕테이즈가 발현되는 재조합 형질전환체의 제조방법.
제 2항의 자일로스 리덕테이즈 유전자에 의해 암호화되는 자일로스 리덕테이즈 단백질.
제 6항에 있어서, 상기 단백질은 분자량이 40 kDa인 것을 특징으로 하는 자일로스 리덕테이즈 단백질.
제 7항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 자일로스 리덕테이즈 단백질.
제 8항에 있어서, 상기 단백질은 단백질 서열의 279번이 세린(serine) 잔기인 것을 특징으로 하는 자일로스 리덕테이즈 단백질.
1) 탄소원을 포함하는 배지에서 제 1항의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1 또는 제 4항의 형질전환체를 배양한 배양액에서 상층액을 수득하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 상층액에서 자일로스 리덕테이즈를 분리 및 정제하는 단계;
를 포함하는 자일로스 리덕테이즈 생산 방법.
제 10항에 있어서, 상기 단계 1)의 탄소원은 D-자일로스(D-xylose), 솔비톨(sorbitol), 말토오스(maltose), 트레할로스(trehalose), 만노스(mannose), 수크로오스(sucrose), 플럭토오스(fructose), 갈락토오스(galactose) 또는 라피노오스(raffinose)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자일로스 리덕테이즈 생산 방법.
1) 제 1항의 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) YHJ1, 제 4항의 형질전환체 또는 제 6항의 자일로스 리덕테이즈를 함유하는 조성물을 자일로스, 헤미셀룰로오스 또는 이들을 포함하는 바이오매스 산물과 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양액으로부터 자일리톨을 분리 및 정제하는 단계;
를 포함하는 자일리톨(xylitol) 생산 방법.