KR20160119687A - 녹차씨 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

녹차씨 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 녹차씨 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 하고, 이로 인해 0.01%의 낮은 농도에서도 우수한 항효모 활성 효과를 나타냄과 동시에 천연 성분만을 포함하므로 인체에 대해서는 전혀 부작용이 없다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 항효모성 조성물은 장기간 항효모활성 효과를 발휘할 수 있고, 친환경적이기 때문에 식품, 화장료 및 약품 등의 다양한 분야에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항효모성 조성물은 폐기되어지는 녹차씨 또는 녹차씨박을 이용하여 물, C1 내지 C4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매 중에서 선택되는 어느 하나로 추출하는 간단한 공정을 통해 제조가 가능하기 때문에 경제성이 매우 우수하다.

Description

녹차씨 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물 및 이의 제조방법{composition comprising green tea seed or defatted green tea seed extracts having antiyeast activity and manufacturing method thereof}
본 발명은 녹차씨 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
식품 안정성 및 식품의 부패 방지는 식품 산업의 중요한 부분을 차지하는 근심사이다. 따라서 이러한 식품의 변패 방지 혹은 지연을 위해 첨가하는 보존료(preservative)에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다.
보존료로는 미량만 사용해도 보존효과가 확실해야 하며, 효과가 지속적이고 사용방법이 간단해야 할 뿐만 아니라 다양한 미생물에 대해 효과를 발휘해야 하며 독성이 없어야 하는 등의 조건을 만족시킬 필요가 있다.
특히, 식품 변패 미생물 중에서도 효모류를 포함한 곰팡이는 식품 전반에 걸쳐서 오염되어 제품의 품질을 저하시키며 증식 억제가 어려운 동시에 다른 미생물에 비해서 특히 천연 보존료로 제어하기가 힘든 미생물로, 막대한 경제적인 손실을 입힌다.
식품 보존의 목적으로 사용되는 보존료의 종류로는 데히드로초산 및 그 염류, 소르빈산 및 그 염류, 안식향산 및 그 염류, 파라옥시안식향산, 프로피온산 등 모두 18종이다(식품의약품안전청, 식품공전, 2008, p597). 이중에서도 효모류는 솔빈산, 안식향산, 파라옥시안식향산에틸, 파라옥시안식향산메틸과 같은 합성방부제를 사용하거나, 주정, 유카추출물, 겨자정유와 같은 천연 소재를 사용하여 제어한다.
다만 주정, 겨자 정유 및 유카추출물은 소재 특성상 제한적으로 사용되며, 합성방부제는 섭취시 체내 지방조직에 축적되어 장기적으로 독성을 유발할 가능성이 크고 일부는 발암성물질 형성에 참여하기도 하며, 세포벽 파괴, 원형질과의 반응 등 세포기능을 저하 또는 파괴하는 등의 문제들이 알려져 있으므로 다양한 식품에 적용이 용이한 천연 항효모제제의 개발이 요구되고 있다.
녹차나무(Camellia sinensis)는 높은 폴리페놀 성분을 가져 항산화, 항비만, 항암 등의 다양한 생리활성을 지니고 있다고 알려져 있다. 이로 인해 녹차에 대한 사람들의 관심이 증가함에 따라 녹차 잎차의 소비가 늘고 있는 반면, 녹차씨는 녹차 수확이 끝난 후 거의 폐기되고 있어. 이에 대한 연구는 국내외 모두 미미한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 녹차씨 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 효모에 대해 우수한 항효모활성을 갖는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항효모성 조성물을 대량생산할 수 있는 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물을 제공한다.
상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물은 물 또는 20 내지 80% 에탄올 수용액으로 추출된 추출물일 수 있다.
상기 녹차씨 추출물은 녹차씨의 과피가 제거된 속씨를 이용한 것일 수 있다.
상기 녹차씨박 추출물은 녹차씨의 과피가 제거된 속씨를 착유하고 남은 기름이 제거된 녹차씨 속씨 잔여물을 이용한 것일 수 있다.
상기 녹차씨 추출물은 7 내지 12% 수분함량을 갖는 녹차씨를 이용한 것일 수 있다.
상기 녹차씨박 추출물은 600 내지 650 ㎏f/㎠로 유착기를 사용하여 녹차씨 기름을 제거한 녹차씨 속씨 잔여물을 이용한 것일 수 있다.
상기 녹차씨박 추출물은 Candida albicans(칸디다 알비칸스), Candida krusei(칸디다 크루세이), Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이), Kluyveromyces fragilis(클루이베로마이세스 프라질리스) 및 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 효모에 대해 항효모 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 다른 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 상기 항효모성 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품보존제를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 아래 단계들을 포함하는 항효모성 조성물의 제조방법을 제공한다.
Ⅰ) 녹차씨 또는 녹차씨박을 물, C1 내지 C4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매 중에서 선택되는 어느 하나의 용매로 추출하여 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 수득하는 단계; 및
Ⅱ) 상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 여과 및 농축하는 단계.
상기 Ⅰ) 단계의 상기 녹차씨는 녹차씨의 과피가 제거된 속씨일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계의 상기 녹차씨박은 녹차씨의 과피가 제거된 속씨를 착유하고 남은 기름이 제거된 녹차씨 속씨 잔여물일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계의 상기 녹차씨는 7 내지 12% 수분함량을 갖는 것일 수 있다.
상기 녹차씨박은 600 내지 650 ㎏f/㎠로 유착기를 이용하여 녹차씨 기름을 제거된 잔여물일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계에서 상기 녹차씨는 평균 입경이 1.0 내지 2.0 ㎜일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계에서 용매로 물을 이용할 경우, 20 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간동안 수행될 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계에서 용매로 C1 내지 C4의 저급알코올을 이용할 경우, 60 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 하고, 이로 인해 1%의 낮은 농도에서도 우수한 항효모 활성 효과를 나타냄과 동시에 천연 성분만을 포함하므로 인체에 대해서는 전혀 부작용이 없다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 항효모성 조성물은 장기간 항효모활성 효과를 발휘할 수 있고, 친환경적이기 때문에 식품, 화장료 및 약품 등의 다양한 분야에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항효모성 조성물은 폐기되어지는 녹차씨 또는 녹차씨박을 이용하여 물, C1 내지 C4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매 중에서 선택되는 어느 하나로 추출하는 간단한 공정을 통해 제조가 가능하기 때문에 경제성이 매우 우수하다.
도 1은 순차적으로 본 발명에 사용된 녹차잎, 녹차씨, 녹차씨박의 실제사진이다.
도 2는 실시예 1(a), 실시예 2(b), 실시예 3(c), 실시예 4(d), 실시예 5(e) 및 실시예 6(f) 추출물의 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스)에 대한 항효모 활성을 입증한 디스크 페이퍼(disk paper method) 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 비교예 10(a), 비교예 11(b), 비교예 12(c), 비교예 13(d), 비교예 14(f) 천연 추출물 및 실시예 26 녹차씨박 추출물(e)의 Kluyveromyces fragilis(클루이베로마이세스 프라질리스)에 대한 항균활성을 입증한 디스크 페이퍼법(disk paper method) 실험 결과를 보여주는 사진이다. 이때, 상기 시료들의 농도는 모두 2%(w/v)인 것을 사용하였다.
도 4a는 본 발명에 따른 추출물에 함유되어 있는 나린제닌(naringenin) 성분을 검출하기 위한 HPLC 분석 조건을 나타낸 표이다.
도 4b는 본 발명에 따른 추출물에 함유되어 있는 카테킨(catechins) 성분을 검출하기 위한 HPLC 분석 조건을 나타낸 표이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 명세서에서, 용어 '녹차씨박(defatted green tea seed)'은 녹차씨로부터 외피, 중피 및 과피를 제거하여 분리된 속씨를 볶거나 볶지 않은채로 압착하여 기름을 얻고 난 후의 잔여물로 정의된다.
또한 '녹차씨 열수추출물 또는 녹차씨박 열수추출물'은 녹차씨 또는 녹차씨박으로부터 물을 넣고 가열하여 추출한 것이고, '녹차씨 주정추출물 또는 녹차씨박 주정추출물'은 상기 녹차씨 또는 녹차씨박으로부터 주정을 이용하여 추출하여 얻은 것이며, 본 발명에서는 상기 녹차씨 열수추출물과 녹차씨 주정추출물을 통틀어 '녹차씨 추출물'이라 칭하고, 상기 녹차씨박 열수추출물과 녹차씨박 주정추출물을 통틀어 '녹차씨박 추출물'이라 칭하였다.
본 발명에서 항효모(antiyeast)라 함은 효모의 성장을 억제하거나 사멸작용을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 측면은 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물에 관한 것으로, 일반적으로 녹차잎을 채취하고나서 버려지는 녹차씨와 녹차씨 기름을 추출하고 난 후 버려지는 녹차씨박을 이용하여 얻은 것으로, 이는 녹차의 일반적인 항균활성을 갖는 물질(카테킨, 폴리페놀 등)을 포함되어 있지 않은데도 불구하고, 항효모 활성이 탁월함을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
특히 녹차씨 또는 녹차씨박은 효모의 생장을 억제하고 저해하는 항효모 효과에 대해서 어떠한 개시 또는 교시된 바가 없고, 녹차잎과 녹차씨 기름에서는 상기 녹차씨 또는 녹차씨박에서 발견된 항효모 활성에 대해 전혀 개시되거나 교시된 바가 없었다.
상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물운 추출 원재료에 추출용매를 처리하여 얻은 추출물뿐만 아니라, 조추출물의 가공물도 포함하는데, 일예로 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 가공물이나, 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.
본 발명은 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물을 제공함과 동시에, 녹차씨 및 녹차씨박의 분말도, 용매의 투입량, 추출온도 및 시간을 조절하여 항효모 활성을 나타내는 성분을 다량 함유하면서도 수율이 가장 뛰어난 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 녹차씨 추출물의 원재료인 녹차씨는 과피 및 속씨를 모두 포함하는 것이거나, 과피가 제거된 녹차씨의 속씨일 수 있는데, 바람직하게는 녹차씨의 속씨일 수 있다. 상기 녹차씨의 과피는 혼합여부가 항효모 활성에 영향을 미치지 않기 때문에 녹차씨의 속씨와 혼합되어 사용되어도 특별히 이에 제한되지 않으나, 항효모 활성을 전혀 가지고 있지 않으므로, 수율이 낮아지고, 불필요한 성분이 혼합될 수 있다는 점을 들어 녹차씨의 속씨만을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 녹차씨박 추출물의 경우에도 앞서 언급한 바와 같이 재료인 녹차씨박은 녹차씨 과피 및 속씨를 모두 포함하는 것으로부터 기름이 제거되고 남은 잔여물일 수 있고, 녹차씨 과피가 제거된 녹차씨의 속씨만으로부터 기름이 제거되고 남은 잔여물일 수 있다.
상기 녹차씨의 과피는 혼합여부가 항효모 활성에 영향을 미치지 않기 때문에 녹차씨의 속씨와 혼합되어 사용되어도 특별히 이에 제한되지 않으나, 항효모 활성을 전혀 가지고 있지 않으므로, 수율이 낮아지고, 불필요한 성분이 혼합될 수 있다는 점을 들어, 상기 녹차씨박은 녹차씨의 속씨만을 사용하여, 이로부터 기름이 제거되고 남은 잔여물인 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 항효모성 조성물의 항효모 활성은 녹차씨 기름에서는 관찰되지 않는 것으로, 녹차씨 기름 성분이 포함되어 있는 녹차씨 추출물과 녹차씨 기름 성분이 포함되어 있지 않은 녹차씨박 추출물은 항효모 활성에 큰 차이가 없었다. 이는 녹차씨 기름에 의해 항효모 활성이 영향받지 않는다는 것을 알 수 있다. 다만 녹차씨 기름을 포함하는 녹차씨 추출물의 경우 불필요한 성분이 다량 함유되어 있어 수율이 낮기 때문에, 다량 폐기되어지는 녹차씨박을 이용한 녹차씨박 추출물이 환경적·경제적 측면에서 보다 바람직하다.
상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매의 추출물로, 바람직하게는 물 또는 20 내지 80% 에탄올 수용액으로 추출되는 것일 수 있다. 실험예에서 후술하겠지만, 80%를 초과한 혼합용매로 추출하면 고형 수율이 낮아질뿐만 아니라, 항효모 활성도 상대적으로 2 배 이상 저하되는 문제가 발생하며, 에탄올(C2의 저급알코올)을 제외한 유기용매의 경우 용도가 제한적이다. 다만 추출방법은 특별히 한정할 필요가 없다.
추출용매로 물을 사용하는 경우, 90 ℃ 미만에서 수행될 수 있는데, 90 ℃를 초과하여 수행할 경우 항효모활성이 급격히 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 90 ℃ 미만의 온도에서는 0.5 내지 6 시간 동안 수행되는 것이 바람직하나, 가장 바람직하게는 20 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간동안 수행될 수 있는데, 80 ℃를 초과한 온도 또는 5 시간 초과한 시간동안 수행하게 되면 유효성분이 파괴되어 손실되어 항효모 활성이 저하되는 문제가 발생하고, 20 ℃보다 낮은 온도에서 수행하거나, 0.5 시간 미만에서 수행하게 되면 유효성분이 완전히 추출되지 못하므로, 다시 말해 추출시간 대비 수율이 가장 우수하기 때문에 온도 조절과 시간을 상기 범위 내에서 수행하는 것이 바람직하다.
또한 추출하는 단계(Ⅰ) 단계)에서, 추출용매로 20 내지 80% 에탄올 수용액을 이용할 경우, 90 ℃ 미만에서 수행될 수 있는데, 90 ℃를 초과하여 수행할 경우 항효모 활성이 급격히 저하되는 문제가 발생할 수 있다.
추출하는 단계(Ⅰ) 단계)에서, 추출용매로 20 내지 80% 에탄올 수용액을 이용할 경우 90 ℃ 미만에서 수행되면, 0.5 내지 6 시간 동안 수행되는 것이 바람직하나, 가장 바람직하게는 60 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간동안 수행될 수 있는데, 80 ℃를 초과한 온도 또는 5 시간 초과한 시간동안 수행하게 되면 유효성분이 파괴되어 손실되어 항효모 활성이 저하되는 문제가 발생하고, 60 ℃보다 낮은 온도에서 수행하거나, 0.5 시간 미만에서 수행하게 되면 유효성분이 완전히 추출되지 못하므로, 다시 말해 추출시간 대비 수율이 가장 우수하기 때문에 온도 조절과 시간을 상기 범위 내에서 수행하는 것이 바람직하다.
상기 항효모성 조성물은 녹차씨 추출물과 녹차씨박 추출물은 각각 또는 혼합되어 포함되어 있는 것일 수 있고, 바람직하게는 각각 단독으로 사용되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에서 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물은 넓은 의미로는 녹차씨 분말 또는 녹차씨박 분말을 희석한 희석액을 포함한다.
하기 실험예에서 후술하겠지만 본 발명의 항효모성 조성물은 종래 녹차잎 추출물 또는 녹차씨 기름과 달리, Candida albicans(칸디다 알비칸스), Candida krusei(칸디다 크루세이), Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이), Kluyveromyces fragilis(클루이베로마이세스 프라질리스) 및 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 효모에 대해 우수한 항효모 활성을 갖는다.
또한 본 발명의 항효모성 조성물은 기존에 공개되어 있는 다양한 미생물에 대해 항균활성을 가지고 있는 안식향산나트륨, 소르빈산칼륨 등의 합성보존제와 동등하거나, 우수한 항효모 활성을 갖고 있어, 효모에 대해서 높은 항효모 활성이 요구되는 분야에서 대체하여 사용이 가능하다.
종래 합성보존제는 고농도에서 항균활성이 발휘되는 단점이 있고, 아울러 이러한 합성보존제는 인체에 자극을 주거나, 부작용을 일으킬 수 있다는 문제가 존재한다. 또한, 효모의 성장만을 저해하거나 방지해야하는 식품 또는 약품 등의 분야에 용이하지 않다는 단점이 있다.
본 발명에 따른 항효모성 조성물은 종래 천연보존제 또는 합성보존제와 동등하거나, 더 우수한 항효모 활성을 가지고, 인체친화적이면서 일반적으로 폐기되어지던 녹차씨 또는 녹차씨박을 이용한다는 점에서 환경적·경제적 측면에서 종래 천연보존제 또는 합성보존제보다 현저히 우수한 효과를 갖는다.
상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물의 고형분 함량은 특별히 한정할 필요가 없으나, 0.01%(w/v%), 바람직하게 0.0156%(w/v%)에서도 유의적으로 효모의 성장을 저해 및 방지하고 있음을 확인하였는 바, 0.01% 이상, 0.02% 이상 바람직하게는 0.03 내지 15%(w/v%) 포함되어 있다면 충분히 항효모 활성을 나타낼 수 있다.
상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물은 액상의 추출물을 그 자체로 사용할 수도 있고 이를 건조하여 분말화할 수도 있다.
특히 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물은 과량의 카테킨, 폴리페놀 성분을 포함하고 있는 녹차잎 추출물과 녹차의 주요 성분으로 알려진 나린제닌에서는 검출되지 않았던 항효모 활성을 발견하였다.
실시예에서 후술하겠지만, 본 발명의 녹차씨박 추출물은 Escherichia coli(이콜라이), Listeria monocytogenes(리스테리아 모노사이토제니스) 및 Aspergillus niger(아스레프길루스 니게르)을 비롯한 다양한 미생물에 대해서 약하지만 항균활성이 확인되었으나, 효모균인 Kluyveromyces fragilis(클루이베로마이세스 프라질리스), candida krusei(칸디다 크루세이), Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이), Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스)에 대한 항균활성 보다는 현저히 낮거나 검출되지 않을 정도로 미미한 것을 확인하였는데, 일예로 상기 녹차씨박 추출물은 디스크 페이퍼법으로 측정한 생육저해환의 크기(㎜)에 있어서, Kluyveromyces fragilis(클루이베로마이세스 프라질리스) 또는 candida krusei(칸디다 크루세이) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 효모균이 Escherichia coli(이콜라이) 또는 Listeria monocytogenes(리스테리아 모노사이토제니스) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 세균보다 1.5 내지 13 배 더 큰 것을 확인하였다.
다시 말해 동일조건에서 동일농도의 항효모성 조성물로 처리하였을 때, 효모균에 대한 항균활성이 일반 세균 균주에 대한 항균활성보다 1.5 내지 13 배 더 높다는 것을 나타내는 것이다. 아울러, 동일농도의 합성보존제 및 천연보존제로 효모균을 처리한 것보다 본 발명의 항효모성 조성물로 처리한 것이 항균활성이 더욱 높았다. 따라서, 본 발명의 녹차씨박 추출물은 종래 합성보존제 및 천연보존제보다 동등하거나, 우수한 항효모 활성을 갖는다.
본 발명의 항효모성 조성물은 상기 유효성분 이외에 사용되는 용도에 따라 특정 균에 대해 항균활성을 갖는 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 항효모 조성물은 그 제형에 특별히 한정되지 않으나 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무규느 발열물질이 게저된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 경구용 제형, 항균제, 사료첨가제, 식품 첨가물, 화장품 첨가물 또는 방부제 등의 용도로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식품 첨가물로는 음료수, 제빵, 드링크, 유지류, 아이스크림, 과자, 떡, 스넥류, 이유식, 주류, 조미료류, 레토르트 또는 통조림 등 각종 조리가공식품류를 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이 항효모성 조성물은 인체에 무해하여 의약품, 화장품, 식품, 섬유, 생활용품 등에서 항효모 활성을 요구하는 분야에 광범위하게 사용될 수 있으며 이들 제품에 사용되어 제품의 품질과 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 항효모성 조성물은 종래 합성방부제와는 달리 인체에 나타내는 부작용을 전혀 나타내지 않으면서 우수한 항효모활성을 갖기 때문에 바람직하게는 식품보존제나 식품부패방지제로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 다른 측면으로, 본 발명은 상기 항효모성 조성물을 포함하는 식품보존제를 제공할 수 있는데, 이러한 식품보존제는 식품의 주, 부원료 및 식품첨가제로서 사용이 가능하다.
본 발명의 식품보존제는 식품에 분무 또는 첨가함으로써 이용될 수 있고, 식품에 있어서 상기 식품보존제의 첨가량은 대상인 식품의 종류에 따라 일률적으로 규정할 수는 없으나, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 20 중량%의 범위일 수 있다.
상기 식품 보존제는 소비자의 요구나 제조자의 필요에 따라 식품첨가용 계면활성제(녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물의 용해력을 증가시키기 위함)를 더 포함하여 사용할 수 있고, 상기 식품첨가용 계면활성제는 비이온성계면 활성제인 설탕에스테르계 계면활성제 또는 식품첨가용 모노글릴세라이드 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 녹차씨박 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 상기 녹차씨박 추출물은 아래 단계들을 포함한다.
Ⅰ) 녹차씨 또는 녹차씨박을 물, C1 내지 C4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매 중에서 선택되는 어느 하나의 용매로 추출하여 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 수득하는 단계; 및
Ⅱ) 상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 여과 및 농축하는 단계.
<단계 Ⅰ>
상기 녹차씨는 녹차씨의 과피 및 속씨를 모두 포함하거나, 과피가 제거된 녹차씨의 속씨일 수 있는데, 바람직하게는 녹차씨의 속씨일 수 있다. 상기 녹차씨의 과피는 혼합여부가 항효모 활성에 영향을 미치지 않기 때문에 녹차씨의 속씨와 혼합되어 사용되어도 특별히 이에 제한되지 않으나, 항효모 활성을 전혀 가지고 있지 않으므로, 수율이 낮아지고, 불필요한 성분이 혼합될 수 있다는 점을 들어 녹차씨의 속씨만을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 녹차씨박의 경우에도 앞서 언급한 바와 같이 녹차씨 과피 및 속씨를 모두 포함하는 것으로부터 기름이 제거되고 남은 잔여물일 수 있고, 녹차씨 과피가 제거된 녹차씨의 속씨만으로부터 기름이 제거되고 남은 잔여물일 수 있다.
상기 녹차씨의 과피는 혼합여부가 항효모 활성에 영향을 미치지 않기 때문에 녹차씨의 속씨와 혼합되어 사용되어도 특별히 이에 제한되지 않으나, 항효모 활성을 전혀 가지고 있지 않으므로, 수율이 낮아지고, 불필요한 성분이 혼합될 수 있다는 점을 들어, 상기 녹차씨박은 녹차씨의 속씨만을 사용하여, 이로부터 기름이 제거되고 남은 잔여물인 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 녹차씨는 수분함량이 7 내지 12%인 것을 사용하는 것이 바람직한데, 상기 녹차씨의 수분함량이 7% 미만이거나, 12%를 초과할 경우 수율이 15 미만으로 현저히 낮아지는 문제가 발생하기 때문이다.
일반적으로 녹차씨는 수확방법에 따라 녹차씨의 수분함량에 차이가 생기게 되는데, 하동 녹차씨는 생과 상태로 수확되어 수분함량이 높고, 보성 녹차씨는 건조씨 상태로 수확되므로 수분함량이 낮으므로, 이에 따가 적절히 처리하여 사용하는 것이 바람직한데, 일예로 하동 녹차씨의 경우 수분함량이 높기 때문에, 7 내지 12% 수분함량을 갖도록 60 내지 70 ℃에서 적정시간동안 건조처리한 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 녹차씨 또는 상기 녹차씨박은 분쇄도에 따라서 항효모 활성은 변화하지 않으나, 고형수율이 최대 0.7배 이상 낮아지게 되므로, 상기 녹차씨는 평균 입경이 2.0 ㎜ 이하, 바람직하게는 1.0 내지 2.0 ㎜인 것일 수 있는데, 상기 녹차씨 또는 녹차씨박의 평균 입도가 2.0 ㎜를 초과할 경우 동일한 추출온도 및 동일한 추출시간동안 충분히 활성성분을 추출하지 못해 수율이 저하되는 문제가 발생한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 녹차씨박은 녹차씨를 통상의 다양한 방법으로 녹차씨 기름을 제거하고 남은 잔여물이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 볶거나 볶지않은 녹차씨를 600 내지 650 ㎏f/㎠에서 유착기로 녹차씨 기름을 추출하고 남은 잔여물일 수 있다. 왜냐하면 이를 이용하여 추출물을 추출할 경우 헥산을 이용하여 지용성 성분을 제거한 녹차씨박을 이용한 경우보다 1.3배 더 우수한 수율을 가질 수 있기 때문이다.
다시 말해 유착기를 이용하지 않은 다른 방법으로 지용성 성분을 제거한 녹차씨박으로 추출물을 제조할 경우 수율이 최대 0.3 배 이상 낮아지는 문제가 발생하므로, 상기 녹차씨박은 유착기를 이용하여 녹차씨 기름 즉 지용성 성분이 제거된 것을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
만일 상기 녹차씨박 추출물의 불순물을 더 최소화하고자 한다면, 상기 녹차씨박으로 볶은 녹차씨를 유착기로 이용해 녹차씨 기름을 추출하고 남은 잔여물을 이용하는 것이 바람직하다.
종합하면 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 고수율(25% 이상, 최대 27%)로 얻기 위해서는 녹차씨는 1.0 내지 2.0 ㎜ 평균 입경 및 수분함량 7 내지 12%를 갖는 녹차씨의 속씨를 이용하는 것이 바람직하고,
녹차씨박으로는 수분함량 7 내지 12%를 갖는 녹차씨의 속씨를 볶은 후, 유착기를 이용하여 녹차씨 기름을 제거하고 남은 잔여물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매 중에서 선택되는 어느 하나를 이용하여 추출할 수 있는데, 바람직하게는 물 또는 20 내지 80% 에탄올 수용액으로 추출되는 것일 수 있다. 실험예에서 후술하겠지만, 80%를 초과한 혼합용매로 추출하면 고형 수율이 낮아질뿐만 아니라, 항효모 활성도 상대적으로 2 배 이상 저하되는 문제가 발생하며, 에탄올(C2의 저급알코올)을 제외한 유기용매의 경우 용도가 제한적이다.
따라서 가장 우수한 항효모활성과 우수한 수율을 동시에 가지면서 용도에 제한이 없는 인체 친화적인 추출물을 제조하기 위해서, 물 또는 20 내지 80% 에탄올 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
추출물은 건조 또는 비건조된 원재를 분쇄하고 분쇄된 원재 1 중량부를 기준으로 용매 5 내지 20 중량부 혼합되는 것이 바람직하다.
또한, 추출하는 단계(Ⅰ) 단계)는 추출용매로 물을 이용할 경우 90 ℃ 미만에서 수행될 수 있는데, 90 ℃를 초과하여 수행할 경우 항효모활성이 급격히 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 가장 바람직하게는 20 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간동안 수행될 수 있는데, 80 ℃를 초과한 온도 또는 5 시간 초과한 시간동안 수행하게 되면 유효성분이 파괴되어 손실되어 항효모 활성이 저하되는 문제가 발생하고, 20 ℃보다 낮은 온도에서 수행하거나, 0.5 시간 미만에서 수행하게 되면 유효성분이 완전히 추출되지 못하므로, 다시 말해 추출시간 대비 수율이 가장 우수하기 때문에 온도 조절과 시간을 상기 범위 내에서 수행하는 것이 바람직하다.
또한 추출하는 단계(Ⅰ) 단계)에서 추출용매로 C1 내지 C4의 저급알코올 바람직하게는 20 내지 80% 에탄올 수용액을 이용할 경우, 90 ℃ 미만에서 수행될 수 있는데, 90 ℃를 초과하여 수행할 경우 항효모활성이 급격히 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 가장 바람직하게는 60 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간동안 수행될 수 있는데, 80 ℃를 초과한 온도 또는 5 시간 초과한 시간동안 수행하게 되면 유효성분이 파괴되어 손실되어 항효모 활성이 저하되는 문제가 발생하고, 60 ℃보다 낮은 온도에서 수행하거나, 0.5 시간 미만에서 수행하게 되면 유효성분이 완전히 추출되지 못하므로, 다시 말해 추출시간 대비 수율이 가장 우수하기 때문에 온도 조절과 시간을 상기 범위 내에서 수행하는 것이 바람직하다.
(단계 Ⅱ)
최종적으로, 수득한 상기 녹차씨박 추출물을 여과 및 농축하는데, 이는 추출물 내에 부유하는 고체입자를 제거하기 위한 것으로, 통상적으로 사용되는 여과법을 사용할 수 있고, 예컨대 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 냉동 여과법 등을 이용하여 여과할 수 있다.
여과된 추출물은 그대로 사용하거나, 추출물로부터 유효성분의 손실은 최소화하면서 용매만을 효율적으로 제거하기 위해, 동결건조, 진공건조, 열풍건조 및 분무건조로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용해 건조시켜 사용할 수 있는데, 바람직하게는 - 40 내지 - 10 ℃에서 동결건조하여 농축할 수 있다.
본 발명에 따른 항효모성 조성물은 조성물의 총 중량에 대해 1 내지 30 중량%, 바람직하게는 1 내지 5 중량% 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 항효모성 조성물은 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 사용하는 것으로, 녹차잎을 비롯한 녹차가지 및 뿌리와 같은 다른 녹차부위와는 주요성분에 차이가 있으며, 녹차씨의 주요성분이라 알려진 나린제닌은 항효모활성을 나타내지 않는 것으로 확인되었기 때문에 표기하지 않은 다른 유효성분의 역할에 의해 나타난 항효모활성 효과라고 볼 수 있다. 그러므로 성분은 여기에 언급된 것에 한정되지 않는다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
< 실시예 1 내지 6> 녹차씨박 추출물
생녹차씨를 건조하고, 3회 롤분쇄로 평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝로 파쇄하고, 과피를 제거하여 속씨를 분리하였다. 상기 분리된 녹차씨 속씨를 110 ℃, 10 분동안 볶은 후 600 내지 650 ㎏f/㎠으로 10 내지 15 분 동안 착유하여 녹차씨 기름을 추출하고, 남은 녹차씨박 100 g을 회수한다.
상기 회수된 녹차씨박 100 g을 1 중량부로 하고, 이에 대해 10 중량부에 해당하는 물(1 ㎏) 또는 25%, 50%, 75%, 100% 에탄올(1 ㎏) 또는 100% 메탄올(1 ㎏)을 가하여, 25 ℃에서 16 시간 동안 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 55 ㎛ 사이즈의 여과지로 여과하여 여과액을 수득하였다.
다음 상기 여과액을 40 ℃에서 150 rpm으로 감압 농축하여 농축액을 수득하였다. 농축된 추출물을 - 30 ℃에서 동결건조하여 녹차씨박 추출물을 수득하는데, 각 추출물의 구체적인 추출 조건 및 추출 수율을 아래 표 1에 나타내었다.
시료 번호 추출
용매		 추출량
(ml)		 추출액
brix(%)		 농축량(ml) 농축액
brix(%)		 고형
수율(%)
실시예 1 물 850 2.4 　- -　 17.5
실시예 2 25% EtOH 860 11.8 614 6.2 13.0
실시예 3 50% EtOH 880 18.3 260 6.3 12.8
실시예 4 75% EtOH 900 20.4 24 27.5 6.5
실시예 5 100% EtOH 925 19.7 36 4.7 2.0
실시예 6 100% MtOH 910 -　 36 12.6 4.1
< 실시예 7 내지 14> 녹차씨박 추출물
생녹차씨를 건조하고, 3회 롤분쇄로 평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝로 파쇄하고, 과피를 제거하여 속씨를 분리하였다. 상기 분리된 녹차씨 속씨를 110 ℃, 10 분동안 볶은 후 600 내지 650 ㎏/㎠으로 10 내지 15 분 동안 착유하여 녹차씨 기름을 추출하고, 남은 녹차씨박 100 g을 회수한다.
상기 회수된 녹차씨박 50 g을 1 중량부로 하고, 이에 대해 15 중량부에 해당하는 물(750 g) 또는 75% 에탄올(750 g)을 가하여, 각 온도에서 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 55 ㎛ 사이즈의 여과지로 여과하여 여과액을 수득하였다.
다음 상기 여과액을 40 ℃에서 150 rpm으로 감압 농축하여 농축액을 수득하였다. 농축된 추출물을 - 30 ℃에서 동결건조하여 녹차씨박 추출물을 수득하는데, 각 추출물의 구체적인 추출 조건 및 추출 수율을 아래 표 2에 나타내었다.
시료 번호 추출
용매		 추출조건 추출량
(ml)		 추출액
brix(%)		 고형
수율(%)
온도 시간
실시예 7 물 25 16 680 1.6 16.4
실시예 8 50 6 680 1.7 23.2
실시예 9 70 6 670 1.8 23.6
실시예 10 90 6 665 2.0 26.9
시료 번호 추출
용매		 추출조건 농축액량
(ml)		 농축액
brix(%)		 고형
수율(%)
온도 시간
실시예 11 75% EtOH 25 16 37 9.9 8.3
실시예 12 50 6 67 12.2 15.7
실시예 13 70 6 72 13.9 17.4
실시예 14 90 6 194 9.1 14.0
< 실시예 15, 16> 녹차씨박 추출물.
생녹차씨를 건조하고, 3회 롤분쇄로 평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝로 파쇄하고, 과피를 제거하여 속씨를 분리하였다.
상기 분쇄된 녹차씨 속씨로부터 녹차씨 기름(지용성 성분)을 제거하는데, 실시예 15는 상기 분쇄된 녹차씨 속씨 100 g을 1 중량 기준으로 15 중량부의 헥산으로 2 일간 처리한 다음, 용매를 제거하고 1일 실온에서 건조하는 헥산 탈지과정을 통해 지용성 성분을 제거하고 남은 녹차씨박을 회수하였다.
반면 실시예 16은 상기 분쇄된 녹차씨 속씨 100 g을 100 ℃, 15 분 동안 볶은 후(로스팅) 600 내지 650 ㎏f/㎠으로 10 내지 15 분 동안 유착기로 착유하여 녹차씨 기름을 추출하는 압착 탈지 과정을 통해 지용성 성분을 제거하고, 남은 녹차씨박을 회수한다.
상기 회수된 녹차씨박 50 g을 1 중량부로 하고, 이에 대해 15 중량부에 해당하는 물(750 g)을 가하여, 각각으로 50 ℃ 온도에서 4 시간동안 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 55 ㎛ 사이즈의 여과지로 여과하여 여과액을 수득하였다.
다음 상기 여과액을 40 ℃에서 150 rpm으로 감압 농축하여 농축액을 수득하였다. 농축된 추출물을 - 30 ℃에서 동결건조하여 녹차씨박 추출물을 수득하였다.
< 실시예 17, 18.> 녹차씨 열수추출물
우선, 생녹차씨를 건조하고, 3회 롤분쇄로 평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝로 파쇄하고, 과피를 제거하여 속씨를 분리한다. 상기 분쇄된 녹차씨의 속씨를 각기 다른 분쇄공정을 통해 분쇄된 녹차씨 중량을 기준으로 15 배의 물을 가하여, 50 ℃에서 4 시간동안 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 0.40 ㎛ 여과지를 이용하여 여과액을 얻어 진공하에서 농축시킨 후, 동결건조하여 녹차씨 열수추출물을 수득하였다.
실시예 17은 상기 분쇄공정으로 3회 롤 분쇄공정을 실시하였고(평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝), 실시예 18은 3회 롤 분쇄 공정 이후, 3분 믹서 분쇄를 추가하여 실시한 것(평균 입경 1.0 내지 2.0 ㎜)이다.
< 실시예 19 내지 24> 녹차씨 추출물
우선, 서로 다른 수확방법으로 수확된 녹차씨 즉, 녹차씨의 수분함량 조건이 추출수율에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
우선 수확된 녹차씨를 수세하고, 이를 60 내지 70 ℃ 온도에서 다양한 수분함량을 갖도록 건조하였다. 이후, 3회 롤분쇄로 평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝로 파쇄하고, 과피를 제거하여 속씨를 분리한다. 상기 분쇄된 녹차씨의 속씨(100 kg), 중량 대비 15 배의 물을 가하여, 50 ℃에서 4 시간동안 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 0.40 ㎛ 여과지를 이용하여 여과액을 얻어 40 ℃에서 150 rpm으로 감압 농축시킨 후, 동결건조하여 녹차씨 열수추출물을 수득하였다.
상기 실시예 19는 52% 수분함량을 갖도록 건조된 녹차씨를 이용하여 수득한 녹차씨 추출물이고, 실시예 20은 27% 수분함량을 갖도록 건조된 녹차씨를 이용하여 수득한 녹차씨 추출물이며, 실시예 21은 11.6% 수분함량을 갖도록 건조된 녹차씨를 이용하여 수득한 녹차씨 추출물이며, 실시예 22는 7.3% 수분함량을 갖도록 건조된 녹차씨를 이용하여 수득한 녹차씨 추출물이며, 실시예 23은 3.6% 수분함량을 갖도록 건조된 녹차씨를 이용하여 수득한 녹차씨 추출물이며, 실시예 24는 2.5% 수분함량을 갖도록 건조된 녹차씨를 이용하여 수득한 녹차씨 추출물이다.
이때, 상기 녹차씨는 과피, 중피, 내피를 제거한 속씨를 이용하였다.
< 실시예 25> 최적화된 조건으로 수득된 녹차씨 열수 추출물.
생녹차씨를 수세한 다음 11% 수분함량을 갖도록 건조하고, 3회 롤분쇄로 평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝로 파쇄하고, 과피를 제거하여 속씨를 분리하고, 분리된 녹차씨 50 g을 1 중량부로 하고, 이에 대해 15 중량부에 해당하는 물(750 g)을 가하여, 50 ℃에서 4 시간 동안 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 55 ㎛ 사이즈의 여과지로 여과하여 여과액을 수득하였다.
다음 상기 여과액을 40 ℃에서 150 rpm으로 감압 농축하여 농축액을 수득하였다. 농축된 추출물을 - 30 ℃에서 동결건조하여 녹차씨 열수추출물을 수득하였다.
< 실시예 26> 최적화된 조건으로 수득된 녹차씨박 열수 추출물.
생녹차씨를 건조하고, 3회 롤분쇄로 평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝로 파쇄하고, 과피를 제거하여 속씨를 분리한다. 상기 분리된 녹차씨 속씨를 110 ℃, 10 분동안 볶은 후 600 내지 650 ㎏f/㎠으로 10 내지 15 분 동안 착유하여 녹차씨 기름을 추출하고, 남은 녹차씨박 50 g을 회수한다.
상기 회수된 녹차씨박 50 g을 1 중량부로 하고, 이에 대해 15 중량부에 해당하는 물(750 g)을 가하여, 50 ℃에서 4 시간 동안 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 55 ㎛ 사이즈의 여과지로 여과하여 여과액을 수득하였다.
다음 상기 여과액을 40 ℃에서 150 rpm으로 감압 농축하여 농축액을 수득하였다. 농축된 추출물을 - 30 ℃에서 동결건조하여 녹차씨박 열수추출물을 수득하였다.
< 실시예 27> 녹차씨 추출물.
생녹차씨로부터 외피, 과피 및 중피를 제거하지 않은 녹차씨를 이용한 것을 제외하고는 실시예 25와 모두 동일하게 녹차씨 열수추출물을 수득하였다.
< 실시예 28> 최적화된 녹차씨박 주정추출물
물 대신에 75% EtOH를 이용하여 추출한 것을 제외하고는 실시예 26과 모두 동일하게 녹차씨 추출물을 수득하였다.
< 비교예 1> 녹차잎 열수추출물
생녹차잎을 수세하고, 건조하여 평균 입경 250 내지 290 ㎛이 되도록 분쇄되었다. 상기 분쇄된 녹차잎 50 g을 1 중량부로 하고, 이에 대해 15 중량부에 해당하는 물(750 g)을 가하여, 90 ℃에서 2 시간 동안 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 55 ㎛ 사이즈의 여과지로 여과하여 여과액을 수득하였다.
다음 상기 여과액을 70-80 ℃에서 500 rpm으로 농축하여 농축액을 수득하였다. 농축된 추출물을 - 30 ℃에서 동결건조하여 녹차잎 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 2> 녹차씨 기름( 녹차씨 기름)
생녹차씨를 건조하고, 외피를 제거하고, 3회 롤분쇄로 평균 입경 1.0 내지 1.5 ㎝로 파쇄하고, 과피를 제거하여 속씨를 분리한다. 상기 분리된 녹차씨 속씨를 110 ℃, 10 분동안 볶은 후 600 내지 650 ㎏/㎠으로 30 분동안 착유하여 녹차씨 기름을 추출하였다.
< 비교예 3> 녹차씨의 과피 열수추출물
생녹차씨의 과피만을 이용한 것을 제외하고는 실시예 25와 모두 동일하게 녹차씨 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 4> 자몽종자 추출물
우선, 자몽종자의 과육을 제거하여 종자를 분리하고, 이를 수세하여 60 내지 70 ℃ 온도에서 30 내지 60 분동안 건조하였다. 상기 건조된 자몽종자를 평균 입경 290 내지 250 ㎛이 되도록 분쇄한 후, 중량 대비 5 배 부피의 글리세린을 첨가 및 혼합하여 추출한 다음, 0.40 ㎛ 여과지를 이용하여 여과액을 얻어 진공하에서 농축시킨 후, 동결건조하여 자몽종자 추출물을 수득하였다.(자몽종자추출물은 ㈜이에스기술연구소(Gunpo, Korea)로부터 구입)
< 비교예 5> 연잎혼합 추출물
연잎혼합 추출물을 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입하였다.
< 비교예 6 내지 8> 합성보존제
안식향산나트륨(비교예 6), 소르빈산칼륨(비교예 7), 파라옥신안식향산에틸(비교예 8)을 ㈜이에스기술연구소(Gunpo, Korea)로부터 구입하였다.
< 비교예 9> 미나리 열수추출물
우선, 미나리를 수세하여 60 내지 70 ℃ 온도에서 30 내지 60 분 동안 건조하였다. 상기 건조된 미나리를 평균 입경 290 내지 250 ㎛이 되도록 분쇄한 후, 중량 대비 5 배 부피의 물을 가하여, 90 ℃에서 2 시간동안 순환펌프를 사용하여 침출하고, 이를 분리하여 0.40 ㎛ 여과지를 이용하여 여과액을 얻어 진공하에서 농축시킨 후, 동결건조하여 미나리 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 10> 미나리 50%(v/v) 주정추출물
우선, 미나리를 수세하여 60 내지 70 ℃ 온도에서 30 내지 60 분 동안 건조하였다. 상기 건조된 미나리를 평균 입경 290 내지 250 ㎛이 되도록 분쇄한 후, 중량 대비 5 배 부피의 50%(v/v) 주정을 부어 70 ℃에서 2 시간동안 추출하였다. 추출하여 나온 현탁액을 분리하여 0.40 ㎛ 여과지로 여과액을 얻어 진공하에서 농축시킨 후, 동결건조하여 미나리 50%(v/v) 주정추출물을 수득하였다.
< 비교예 11> 미나리 70%(v/v) 주정추출물
50%(v/v) 주정 대신에 70%(v/v) 주정을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 10과 모두 동일하게 제조하여, 미나리 70%(v/v) 주정추출물을 수득하였다.
< 비교예 12> 갓 열수추출물
미나리 대신에 갓을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 9과 모두 동일하게 제조하여, 갓 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 13> 갓 80%(v/v) 주정추출물
미나리 대신에 갓을 사용하였다는 점과 50%(v/v) 주정 대신에 80%(v/v) 주정을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 10과 모두 동일하게 제조하여, 갓 80%(v/v) 주정추출물을 수득하였다.
< 비교예 14> 다시마 열수추출물
미나리 대신에 다시마를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 9과 모두 동일하게 제조하여, 다시마 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 15> 양파 껍질 열수추출물
미나리 대신에 양파 껍질을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 9과 모두 동일하게 제조하여, 양파 껍질 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 16> 마늘 열수추출물
미나리 대신에 껍질이 제거된 마늘 과육을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 9과 모두 동일하게 제조하여, 마늘 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 17> 마늘 70%(v/v) 주정추출물
미나리 대신에 껍질이 제거된 마늘 과육을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 11과 모두 동일하게 제조하여, 마늘 70%(v/v) 주정추출물을 수득하였다.
< 비교예 18> 생강 열수추출물
미나리 대신에 생강을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 9과 모두 동일하게 제조하여, 생강 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 19> 생강 70%(v/v) 주정추출물
미나리 대신에 생강을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 11과 모두 동일하게 제조하여, 생강 70%(v/v) 주정추출물을 수득하였다.
< 비교예 20> 대파 열수추출물
미나리 대신에 대파를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 9과 모두 동일하게 제조하여, 대파 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 21> 대파 70%(v/v) 주정추출물
미나리 대신에 대파를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 11과 모두 동일하게 제조하여, 대파 70%(v/v) 주정추출물을 수득하였다.
< 비교예 22> 차조기 열수추출물
미나리 대신에 차조기를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 9와 모두 동일하게 제조하여, 차조기 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 23> 차조기 70%(v/v) 주정추출물
미나리 대신에 차조기를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 11과 모두 동일하게 제조하여, 차조기 70%(v/v) 주정추출물을 수득하였다.
< 비교예 24> 차조기씨 열수추출물
미나리 대신에 차조기씨를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 9와 모두 동일하게 제조하여, 차조기씨 열수추출물을 수득하였다.
< 비교예 25> 차조기씨 70%(v/v) 주정추출물
미나리 대신에 차조기씨를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 비교예 11과 모두 동일하게 제조하여, 차조기씨 70%(v/v) 주정추출물을 수득하였다.
< 실험예 1> 녹차씨박 추출조건에 따른 수율 및 항효모활성 비교(1)-용매 선정.
실시예 1 내지 6으로부터 제조된 녹차씨박 추출물(열수 또는 유기용매)의 항효모활성을 디스크 페이퍼법(disk paper method)과 spot-on-lawn 분석을 통해 표 3 및 도 2에 나타내었다.
디스크 페이퍼법(disk paper method)을 이용하였다. Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스) 균주를 전배양하여 640 nm의 파장에 대한 흡광도(A640)가 0.6 내지 0.7로 일정하게 현탁된 배양액 100 ㎕를 상기 평판배지에 분주한 후, 도말하였다.
이후, 멸균된 직경 8.0 ㎜ 페이퍼 디스크(ADVANTEC, Japan)에 각 추출물 0.5% 수용액을 50 ㎕씩 2회에 걸쳐 흡수시키고, 상기 균주가 도말된 배지에 밀착시킨 다음, 30 ℃ 세균 배양기에서 48 시간동안 배양하였다. 배양 후, 상기 필터 페이퍼 디스크 주변에 형성된 투명한 생육저해환(inhibition clear zone)의 유무 및 크기(㎜)를 통해 항균효과의 여부를 확인하였다.
spot-on-lawn 분석은 각 추출물의 활성 역가(AU, activity unit)를 측정하는 것으로, 각 추출물(2% 각 추출물)을 순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역을 취하고, 이 값에 1 ㎖에 대하여 환산해주는 환산계수를 곱하여 AU(activity unit)/㎖로 나타내었다.
시료 번호 저해환(mm) AU/ml
실시예 1 14 400
실시예 2 14 400
실시예 3 16 400
실시예 4 18 800
실시예 5 8.5 100
실시예 6 18 800
표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 녹차씨박 열수추출물은 우수한 항효모활성과 더불어 우수한 수율을 가지고 있음을 확인하였다.
한편 C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들과 물의 혼합용매를 이용하여 추출할 경우에는 20 내지 80% 에탄올을 이용한 경우(실시예 2 내지 4) 6% 이상의 고형수율을 가지면서 저해환의 크기가 14 ㎜ 이상인데 반해, 실시예 5 또는 6과 같이 100% 유기용매로 추출한 녹차씨박 추출물은 고형수율이 4.1% 이하이고, 실시예 5의 추출물의 경우 저해환의 크기고 8.5 ㎜로 크게 줄어들고 있음을 확인할 수 있다.
또한 실시예 6의 추출물의 경우 식품용도로 사용이 어렵다는 한계가 있기 때문에 본 실험예를 통해 녹차씨박 추출물의 추출용매로 바람직한 것은 물 또는 20 내지 80% 에탄올 수용액이라는 것을 확인할 수 있었다.
이들 중에서도 실시예 1과 실시예 4로부터 추출된 녹차씨박 추출물이 가장 우수한 항효모활성과 우수한 수율을 동시에 가지면서도 식품 용도로 사용이 가능한 용매를 사용하고 있다는 점에서 가장 바람직하다.
< 실험예 2.> 녹차씨박 추출조건에 따른 수율 및 항효모활성 비교(2)-추출온도 및 추출시간 선정.
실시예 7 내지 14 녹차씨박 추출물(열수 또는 유기용매)의 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스)에 대한 항효모활성을 디스크 페이퍼법(disk paper method)과 spot-on-lawn 분석을 통해 표 4에 나타내었다.
이때, 디스크 페이퍼법(disk paper method)과 spot-on-lawn 분석은 실험예 1에서와 동일하게 수행하였다.
시료 번호 저해환(mm) AU/ml
실시예 7 13.9 400
실시예 8 13.3 400
실시예 9 11.5 400
실시예 10 8.5 200
실시예 11 15.5 800
실시예 12 15.8 800
실시예 13 13.5 800
실시예 14 9.5 400
표 4에 나타난 바와 같이, 열수를 이용하여 추출할 경우 실시예 7 내지 9와 같이 90 ℃ 미만에서 수행되는 것이 바람직하고, 20 내지 80% 에탄올 수용액을 이용하여 추출할 경우 실시예 11 내지 13과 같이 90 ℃ 미만에서 수행되는 것이 바람직하다. 실온이하에서 추출할 경우 원하는 수율을 얻기위해 추출시간이 길어져야 하기 때문에 경제적으로 비효율적이다.
가장 바람직하게 열수 추출의 경우 20 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간인 경우가 가장 바람직하고, 20 내지 80% 에탄올 수용액을 이용할 경우 60 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간인 경우가 가장 바람직한데, 추출시간 대비 수율이 가장 우수한 조건이기 때문이다.
< 실험예 3.> 탈지과정에 따른 녹차씨박 추출물의 수율 및 항효모활성 비 교(3)
실시예 15 및 16 녹차씨박 추출물(열수)의 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스) 및 Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이)에 대한 항효모활성을 MIC(최소저해농도)를 사용함으로써 측정하였고, 이의 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
MIC(minimum inhubition concentration) 실험 방법은 다음과 같다.
항효모 실험은 효모 배양액과 지시균 희석액으로 Yeast Mold 배지(yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, peptone 0.5%, dextrose 1%, pH 6.2)를 사용하였다.
각 추출물에 대하여 2 셋트씩 연속적인(serial) 희석물을 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 2% 농도범위에서 준비하였다. 각 균주의 배양액을 하룻밤 배양한 후에, 각 배양액의 탁도를 0.5 맥팔랜드 표준액(McFarland standard)과 비교함으로써 각 배양액의 미생물최종 농도를 2×107 CFU/㎖로 조정하였다. 배양액(100 μl)을 실시예 15 및 16으로부터 제조된 추출물의 각 희석액(100 ㎕)에 첨가하여 최종 200 ㎕로 제조하였으며, 플레이트는 세균에 대해서는 37 ℃에서 24시간 그리고 효모에 대해서는 30℃에서 48시간 배양하였다.
MIC는 탁도에 의해서 표시되어지는데, 미생물이 가시적인 성장을 나타내지 않는 즉, 생육을 저해하는 샘플의 최소 농도이다.
시료번호 고형 수율(%) MIC (ppm)
Pichia membranifaciens Zygosaccharomyces rouxii
실시예 15 18.2 313 313
실시예 16 23.8 313 313
표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 15로부터 제조된 녹차씨박 추출물보다 실시예 16으로부터 제조된 녹차씨박 추출물의 추출수율이 더 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
다시 말해 실시예 15 및 실시예 16의 녹차씨박 추출물은 항효모활성은 동등하지만, 녹차씨로부터 압착 과정을 통해 기름을 추출하고 남은 녹차씨박(실시예 16)을 이용할 경우 보다 우수한 추출 수율을 가질 수 있음을 확인하였다.
따라서, 녹차씨박 추출물은 녹차씨 속씨를 유착기로 기름을 추출하고 남은 잔여물을 녹차씨박으로 이용한 것이 가장 바람직하다.
< 실험예 4.> 녹차씨 추출조건에 따른 수율 및 항효모활성 비교(1)- 녹차씨 분쇄조건
실시예 17 및 18 녹차씨 추출물(열수)의 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스) 및 Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이)에 대한 항효모활성을 MIC(최소저해농도)를 사용함으로써 측정하였고, 이의 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 이때 MIC 실험 방법은 실험예 3에서와 동일하게 수행하였다.
시료번호 고형 수율(%) MIC (ppm)
Pichia membranifaciens Zygosaccharomyces rouxii
실시예 17 19.0 313 313
실시예 18 27.4 313 313
표 6에 나타난 바와 같이, 녹차씨의 분쇄도가 증가할수록 추출수율이 증가하는 것을 확인할 수 있는 바, 평균 입경 1.0 내지 2.0 ㎜이면 수율이 향상되는 것을 알 수 있다.
< 실험예 5.> 녹차씨 추출조건에 따른 수율 및 항효모활성 비교(2)-수분함량
실시예 19 내지 24 녹차씨 추출물(열수)의 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스) 및 Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이)에 대한 항효모활성을 MIC(최소저해농도)를 사용함으로써 측정하였고, 이의 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 이때 MIC 실험 방법은 실험예 3에서와 동일하게 수행하였다.
시료번호 고형 수율(%) MIC (ppm)
Pichia membranifaciens Zygosaccharomyces rouxii
실시예 19 9.1 313 625
실시예 20 12.5 313 625
실시예 21 17.1 313 625
실시예 22 17.5 313 625
실시예 23 14.7 313 625
실시예 24 14.7 313 625
표 7에 나타난 바와 같이, 20% 이상의 수분함량을 갖는 녹차씨를 이용하여 녹차씨 추출물을 얻거나, 3.6% 이하의 수분함량을 갖는 과건조된 녹차씨를 이용하여 녹차씨 추출물을 얻을 경우, 항효모활성의 최소저해농도는 영향을 받지 않으나, 수율이 15% 미만으로 현저히 낮아지는 것을 확인할 수 있다.
이에 반해, 실시예 21-22의 녹차씨 추출물과 같이, 수분함량이 7 내지 12%인 녹차씨를 이용할 경우 17% 이상의 우수한 추출수율을 얻는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 녹차씨 추출물에 있어, 녹차씨 속씨의 수분함량이 7 내지 12%가 되도록 건조한 것을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
< 실험예 6.> 녹차잎 / 녹차씨 / 녹파씨박 열수추출물의 항효모 활성 비교(1).
실시예 25 및 26과 비교예 1 및 2로부터 제조된 추출물의 MIC (최소저해농도)는 통상적인 배양액 희석법을 사용함으로써 측정하였다.
실시예 25, 26 및 비교예 1, 2로부터 제조된 추출물의 항미생물 활성은 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스), Candida albicans(칸디다 알비칸스), Escherichia coli(이콜라이) 및 Bacillus cereus(바실러스 세레우스)의 네가지 미생물 종에 대하여 측정하여 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
MIC(minimum inhubition concentration) 실험 방법은 실험예 3에서와 동일하게 수행하였다.
MIC (ppm)
효모 세균
Pichia membranifaciens Candida albicans E. coli Bacillus cereus
비교예 1 - - - 391
비교예 2 - - 6,250 12,500
실시예 25 313 625 - 2,500
실시예 26 313 625 - 2,500
- : not tested.
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 녹차잎(비교예 1)은 항세균 활성만을 가지고 있음을 확인할 수 있고, 녹차씨유(비교예 2)도 우수한 항세균 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있는데 반해, 본 발명에 따른 실시예 25 내지 26 녹차씨 또는 녹차씨박 열수추출물은 항세균 활성은 거의 나타내지 않으면서, 매우 우수한 항효모 활성을 가짐을 확인할 수 있다.
즉, 녹차씨와 녹차씨박 추출물은 녹차잎과 녹차씨유와 달리 항효모활성을 가지고 있음을 알 수 있다.
< 실험예 7.> 녹차잎 / 녹차씨 / 녹파씨박 열수추출물의 항효모 활성 비교(2).
녹차씨박 녹차잎 및 녹차씨 추출물의 항효모 활성을 비교 분석하기 위해서, 본 발명에 따른 녹차씨 추출물(실시예 25)과 녹차씨박 추출물(실시예 26), 녹차잎 추출물(비교예 1)의 각종 미생물에 대한 항균활성을 분석하였다.
상기 각각의 시료에 대한 항균활성을 확인하기 위하여 사용된 균주(candida krusei(칸디다 크루세이))는 한국생명공학연구원 유전자 은행으로부터 분양받아 이용하였다. 상기 균주의 배양을 위해 YM-배지(Yeast Mold broth)를 사용하여 액체배지와 평판배지를 제조하였다.
항균 활성은 디스크 페이퍼법(disk paper method)를 이용하였다. 각 균주를 전배양하여 640 ㎚의 파장에 대한 흡광도(A640)가 0.6 내지 0.7로 일정하게 현탁된 배양액 100 ㎕를 상기 평판배지에 분주한 후, 도말하였다.
이후, 멸균된 직경 8.0 ㎜ 페이퍼 디스크(ADVANTEC, Japan)에 수용액에 1% 와 5%로 희석한 시료를 50 ㎕씩 2회에 걸쳐 흡수시키고, 상기 균주가 도말된 배지에 밀착시킨 다음, 30 ℃ 세균 배양기에서 48 시간동안 배양하였다. 배양 후, 상기 필터 페이퍼 디스크 주변에 형성된 투명한 생육저해환(inhibition clear zone)의 유무 및 크기(㎜)를 통해 항균효과의 여부를 확인하였다.
상기 실시예 25, 실시예 26, 비교예 1 각각의 추출물의 항효모 활성을 확인하여 생육저해환이 형성된 것을 '+', 형성되지 않은 것을 '-'로 하였으며, 상기 디스크 주변의 생육저해환의 직경(㎜)을 측정하여 표 9에 나타내었다.
시료변호 농도 %(concentration, w/v%) 생육저해환의 직경(㎜)
C. krusei
비교예 1 1 -
5 -
실시예 25 1 + (10)
5 + (18)
실시예 26 1 + (11)
5 + (20)
표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 녹차씨박 열수추출물(실시예 26)과 녹차씨 열수추출물(실시예 25)은 Candida krusei(칸디다 크루세이)에 대해서는 강한 항효모 활성을 나타냄을 알 수 있다.
한편, 비교예 1의 녹차잎 추출물은 항효모활성이 관측되지 않았다.
< 실험예 8> 녹차씨박 / 녹차씨 / 녹차씨 과피 / 녹차씨 속씨의 항효모활성 비교.
실시예 25 내지 27 및 비교예 3으로부터 제조된 추출물의 MIC (최소저해농도)는 통상적인 배양액 희석법을 사용함으로써 측정하였다.
실시예 25 내지 27 및 비교예 3으로부터 제조된 추출물의 항효모 활성은 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스)에 대하여 측정하여 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
시료 번호 MIC (ppm)
실시예 25 313
실시예 26 313
실시예 27 313
비교예 3 0
표 10에 나타난 바와 같이, 녹차씨와 녹차씨 박의 활성은 큰 차이가 없으나, 녹차씨 과피 추출물에서는 항효모 활성이 전혀 관측되지 않는데, 녹차씨 속씨 추출물에서는 항효모 활성이 관측되는 것으로 보아, 본 발명에 따른 항효모 활성은 녹차씨 속씨 부분에 존재하는 성분에 의한 것임을 알 수 있다.
< 실험예 9> 종래 보존제와 본 발명의 항효모성 조성물의 활성비교
(1) 녹차씨박 열수추출물과 종래 천연보존제/합성보존제와의 항효모 활성 비 교
녹차씨박 열수추출물과 천연보존제 및 합성보존제와의 항균활성을 비교 분석하기 위해서, 본 발명에 따른 녹차씨박 추출물(실시예 26)과 종래 천연보존제인 비교예 4(자몽종자추출물) 및 비교예 5(연잎혼합추출물)과 종래 합성보존제인 비교예 6(안식향산나트륨), 비교예 7(소르빈산칼륨) 및 비교예 8(파라옥신안식향산에틸)의 각종 미생물에 대한 항균활성을 분석하였다.
항균 활성은 각각의 시료를 이용한 디스크 페이퍼법(disk paper method)를 이용하였고, 실험과정은 실험예 1과 동일하게 수행하였으며, 필터 페이퍼 디스크 주변에 형성된 투명한 생육저해환(inhibition clear zone)의 유무 및 크기(㎜)를 통해 항균효과의 여부를 확인하였다.
다만, 상기 비교예 8의 파라옥신안식향산에틸은 50%(v/v) 에탄올로 희석하는데, 에탄올 용매가 항균활성 측정에 방해되지 않도록 디스크 페이퍼에 흡수시킨 후 용매를 완전히 휘발한 다음 평판배지에 사용하였다.
상기 각각의 시료에 대한 항균력을 확인하여 생육저해환이 형성된 것을 '+', 형성되지 않은 것을 '-'로 하였으며, 상기 디스크 주변의 생육저해환의 직경(㎜)을 측정하여 표 11에 나타내었다.
생육저해환의 직경()
1% 농도(concentration (W/v);%)
실시예 25 비교예 4 비교예 5 비교예 6 비교예 7 비교예 8
K. fragilis + (15) + (22) + (11.7) - - -
C. krusei + (11) + (17) + (8.3) - + (8.4) -
생육저해환의 직경()
5% 농도(concentration (W/v);%)
실시예 25 비교예 4 비교예 5 비교예 1 비교예 2 비교예 3
K. fragilis + (29.2) + (28) + (16) + (12) + (10) + (13)
C. krusei + (20) + (24) + (13.5) + (11) + (10) + (19)
표 11에 나타난 바와 같이, Kluyveromyces fragilis(클루이베로마이세스 프라질리스), Candida krusei(칸디다 크루세이)에 대한 항효모 활성을 비교해본 결과, 본 발명의 녹차씨박 열수추출물(실시예 26)은 합성보존제(비교예 6 내지 8)보다 우수하며 종래 천연보존제(비교예 4, 5)와 동등한 정도의 항효모 효과를 갖는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과들을 종합하여 보면 합성보존제는 고농도에서 다양한 미생물에 대해 우수한 항균활성을 나타내고, 종래 천연보존제는 낮은 농도에서 다양한 미생물에 대해 항균활성을 가지고 있으나, 본 발명에 따른 녹차씨박 열수추출물(실시예 26)은 Kluyveromyces fragilis(클루이베로마이세스 프라질리스) 및 Candida krusei(칸디다 크루세이) 효모균에 대해서 매우 우수한 항효모 활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.
(2) 녹차씨박 추출물/ 녹차씨 추출물/합성보존재의 공동배양을 통한 생육저해활성 평가( Pichia membranifaciens ( 피치아 멤브라니파시엔스 ))
5 ㎖ LB 액체배지에 Pichia membranifaciens (피치아 멤브라니파시엔스) 균주의 전배양액을 50 ㎕와 추출물(실시예 25, 26, 28 및 비교예 6)을 각 ppm 농도에 맞는 양으로 첨가하여 37 ℃에서 24 시간동안 배양기에서 진탕배양하였다.
24 시간 후, 600 ㎚에서 흡광도의 측정으로 상기 균주의 생장정도를 조사하여 상기 추출물의 생육저해여부(항균활성정도)를 판단한다. 이를 측정한 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
이때, 상기 추출물을 첨가하지 않고 동일한 조건으로 배양시킨 균주를 대조구로 하였다.
　 대조구 실시예 25
(녹차씨 열수추출물)		 실시예 26
(녹차씨박 열수추출물)		 실시예 28
(녹차씨박 주정추출물)		 비교예 6
(안식향산나트륨)
ppm - 500 500 1000 1500 2000 500 500 1000
흡광도
(A600)		 5.183 4.608 4.288 0.292 0.041 0.053 0.129 2.630 1.438
표 12에 나타난 바와 같이, 대조구과 비교하였을 때, 실시예 26(녹차씨박 열수추출물)과 공동배양된 배양액은 실시예 26의 농도가 증가할수록 생육이 억제되는 것을 알 수 있다. 한편 실시예 26과 동일 농도에서의 실시예 28(녹차씨박 주정추출물)은 항균활성이 더 우수하였고, 실시예 25(녹차씨 열수추출물)은 낮은 항균활성을 나타내었다.
다만, 비교예 6 합성 보존제인 안식향나트륨과 동일 농도에서 비교하였을 때, 500 ppm에서는 비교예 6이 실시예 26보다 더 강한 항균활성을 가지지만, 1000 ppm 에서는 비교예 6보다 실시예 26이 더 우수한 항균활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 10> 녹차씨박 열수추추물과 다른 천연물질로부터 회수한 추출물의 항효모 활성 비교
녹차씨박 열수추출물과 미나리, 갓, 다시마, 마늘, 생강, 대파, 차조기 및 차조기씨 열수 또는 주정추출물의 항균활성을 비교 분석하기 위해서, 본 발명에 따른 녹차씨박 추출물(실시예 26)과 비교예 9(미나리 열수추출물), 비교예 10(미나리 50%(v/v) 주정추출물), 비교예 11(미나리 70%(v/v) 주정추출물), 비교예 12(갓 열수추출물), 비교예 13(갓 80%(v/v) 주정추출물), 비교예 14(다시마 열수추출물), 비교예 15(양파 껍질 열수추출물), 비교예 16(마늘 열수추출물), 비교예 17(마늘 70%(v/v) 주정추출물), 비교예 18(생강 열수추출물), 비교예 19(생강 70%(v/v) 주정추출물), 비교예 20(대파 열수추출물), 비교예 21(대파 70%(v/v) 주정추출물), 비교예 22(차조기 열수추출물), 비교예 23(차조기 70%(v/v) 주정추출물), 비교예 24(차조기씨 열수추출물) 및 비교예 25(차조기씨 70%(v/v) 주정추출물)의 각종 미생물에 대한 항균활성을 분석하였다.
항균 활성은 각각의 시료를 이용한 디스크 페이퍼법(disk paper method)를 이용하였고, 실험과정은 실험예 1과 동일하게 수행하였으며, 필터 페이퍼 디스크 주변에 형성된 투명한 생육저해환(inhibition clear zone)의 유무 및 크기(㎜)를 통해 항균효과의 여부를 확인하였다.
상기 각각의 시료에 대한 항균력을 확인하여 생육저해환이 형성된 것을 '+', 형성되지 않은 것을 '-'로 하였으며, 상기 디스크 주변의 생육저해환의 직경(㎜)을 측정하여 표 13에 나타내었다. 이때, 상기 각각의 시료는 모두 5% 농도(concentration (㎎/㎖);%)인 것을 사용하였다.
K. fragilis C. krusei
실시예 26 + (29.2) + (20)
비교예 9 - -
비교예 10 - -
비교예 11 - -
비교예 12 - -
비교예 13 - -
비교예 14 - -
비교예 15 - -
비교예 16 - -
비교예 17 - -
비교예 18 - -
비교예 19 - -
비교예 20 - -
비교예 21 - -
비교예 22 - -
비교예 23 - -
비교예 24 - -
비교예 25 - -
표 13 및 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 녹차씨박 열수추출물(실시예 26)외에 다른 천연물질로부터 회수한 열수추출물 또는 주정추출물에서는 항효모 활성이 전혀 관찰되지 않았다.
< 실험예 11> 녹차잎 , 녹차잎 추출물 및 녹차씨와 녹차씨 추출물의 화학성분 분석.
비교예 1의 녹차잎 열수추출물과 원료인 녹차잎의 화학성분과 실시예 25의 녹차씨 추출물과 이의 원료인 녹차씨의 화학성분을 분석하여 하기 표 14에 나타내었다.
화학성분은 아래 방법을 통해 각각의 성분을 HPLC로 분석하였다.
(1) Naringenin
우선 비교예 1의 녹차잎 열수추출물 분말, 녹차잎, 실시예 25의 녹차씨 추출물 분말 및 녹차씨의 분말 0.1 g을 각각 정밀히 취하여 Sodium acetate buffer 1 ㎖, Novozym 33095, Pectinex Ultra SP-L, Viscozyme 각각 1 ㎖씩 첨가하여 배양기(37℃, 150 rpm)에서 24 시간 효소 가수분해 후 가수분해가 종료된 용액 200 ㎕를 Ethanol 800 ㎕와 혼합하고 원심분리(10000 rpm, 4℃, 10 min)한 후 0.45 ㎛ PTFE syringe filter로 여과한 용액을 HPLC로 분석하였다. 이때 HPLC 분석은 도 4a에 기재된 조건으로 수행하였다.
HPLC 분석시 표준물질 Naringnin 10 ㎎을 정밀히 달아 메탄올 10 ㎖(1000 ㎍/㎖)에 녹인 후 메탄올로 희석하여 working solution으로 사용하였다.
(2) 조사포닌
우선 비교예 1의 녹차잎 열수추출물 분말, 녹차잎, 실시예 25의 녹차씨 추출물 분말 및 녹차씨의 분말 5 g을 각각 플라스크에 취하고 메탄올(Methanol) 50 ㎖를 가하여 상온에서 약 1시간동안 교반 추출한 다음 농축플라스크에 여과하였다. 잔류물에 대하여 위의 조작을 반복한 다음 여과지는 메탄올 50 ㎖로 세척 후 합쳐진 메탄올을 감압농축한 후, 증류수 50 ㎖로 용해하여 분액여두에 넣고 여기에 수포화부탄올용액 50 ㎖을 가한 다음 격렬히 흔들어 물과 부탄올층이 완전 분리될 때까지 정치하였다. 부탄올층을 따로 모으고 다시 물층에 대하여 수포화부탄올 추출조작을 위와 동일한 방법으로 2회 더 반복한다. 회수된 부탄올 용액 전액을 분액여두에 옮긴 후 증류수 50 ㎖를 가하여 흔들어 물층과 부탄올층을 완전히 분리시켰다. 물층을 제거하고 부탄올층을 미리 항량된 농축플라스크에 옮겨 감압 농축 후 농축잔류물에 에테르 50 ㎖를 가하고 46 ℃ 수욕에서 30분간 환류냉각하고 에테르를 제거한 다음, 항량이 될 때까지 건조하고 데시케이터에서 방냉하여 제조된 수기 무게(㎎)를 달아 하기 수학식 1에 따라 조사포닌 함량을 구하였다.
Figure pat00001
상기 수학식에서,
건조 후 수기 무게는 시료를 수기 내에 옮겨 감압 농축 후 농축잔류물을 포함하는 수기의 총 무게이고,
항량된 수기 무게는 미리 항량한, 농축잔류물을 포함하지 않는 수기의 무게를 의미한다.
(3) total phenol
우선 비교예 1의 녹차잎 열수추출물 분말, 녹차잎, 실시예 25의 녹차씨 추출물 분말 및 녹차씨의 분말 각각을 적당량 정밀히 달아 각각 물을 1 ㎖에 넣어 녹인 후 원심분리(3,000 rpm, 10 min)하여 상층액을 시험용액으로 사용하였다.
상기 시험용액(100 ㎕)에 정제수 900 ㎕를 혼합한 희석액 1 ㎖에 Folin-ciocalteu reagent(Fluka, 47641, Buchs, Switzerland)를 100 ㎕를 가하고 5 분간 방치한 다음 7%(w/v) Na2CO3 용액을 1 ㎖ 첨가 후 정제수 400 ㎕를 첨가해 잘 혼합한 후 90 분간 실온에 방치한 다음 750 ㎚에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
총 페놀 함량은 chlorogenic acid(0-1000 ㎍/㎖; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 분석시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였으며 시료 g 당 ㎎ gallic acid equivalent로 나타내었다.
(4) Catechins 분석
식품공전에 의한 방법에 의하여 분석하였다. 구체적으로 우선 비교예 1의 녹차잎 열수추출물 분말, 녹차잎, 실시예 25의 녹차씨 추출물 분말 및 녹차씨의 분말 각각을 일정량(0.2 g)으로 정밀히 달아 각각 메탄올 50 ㎖에 녹인 후 여과(0.45 ㎛ PTFE)하여 HPLC 분석을 진행하였다.
표준품은 에피갈로카테긴(EGC), 에피카테킨(EC), 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨 갈레이트(ECG)를 1000 ㎍/㎖ stock용액을 희석하여 사용하였다. 이때, HPLC 분석조건은 도 4b에 기재된 조건으로 수행하였다.
화학성분 녹차잎 비교예 1 녹차씨 실시예 25
Naringenin (㎎/g) - - 1.77 4.23
Catechin (㎎/g) 52.64 121.13 - -
총 페놀 (㎎/g) 111.1 185.1 7.7 23.9
조사포닌 (%) 11.45 31.59 13.02 9.44
표 14에 나타난 바와 같이, 녹차씨는 녹차잎과 화학성분에 차이가 있는 것으로 확인되었다. 구체적으로 나린제닌(naringenin) 성분을 녹차씨는 더 포함하고 있으며, 페놀이나 조사포닌과 같은 성분은 현저히 낮았으며, 특히 항균활성을 갖고 있다고 알려진 카테킨(catechin)은 녹차씨에서는 관찰되지 않았다.
즉, 본 발명에 따른 녹차씨 추출물 특히, 녹차씨로부터 지용성 성분이 제거된 녹차씨박을 이용해 수득된 녹차씨박 추출물은 녹차의 일반적인 항균 활성을 갖는다고 알려진 화학성분들이 관찰되지 않거나 현저히 낮은 함량으로 포함되어 있고, 본 발명에 따른 녹차씨 또는 녹차씨박 추출물의 항효모 활성은 녹차잎 추출물과 녹차씨 기름에서는 관찰되지 않았으므로, 녹차씨 또는 녹차씨박 추출물의 항효모 활성은 상기 페놀과 조사포닌에 의한 것은 아님을 알 수 있다.
< 실험예 12> 나린제닌에 의한 항효모활성 분석.
본 발명에 따른 녹차씨 또는 녹차씨박 추출물의 항효모 활성이 나린제닌에 의한 항효모 활성이 아님을 확인하고자 하면서, 화학성분에 차이를 갖는 녹차잎은 녹차씨 또는 녹차씨박 추출물과 달리 항효모 활성을 나타내지 않음을 다시 한번 확인하였다.
본 발명에 따른 녹차씨 추출물(실시예 25), 녹차씨박 추출물(실시예 26), 녹차잎 추출물(비교예 1) 및 폴라보노이드 성분인 나린제닌(naringenin) 수용액(25 ㎍/㎖)의 Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이) 및 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스)에 대한 항효모 활성을 분석하였다.
상기 각각의 시료에 대한 항균활성을 확인하기 위하여 사용된 균주(Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이) 및 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스))는 한국생명공학연구원 유전자 은행으로부터 분양받아 이용하였다. 상기 균주의 배양을 위해 YM-배지(Yeast Mold broth)를 사용하여 액체배지와 평판배지를 제조하였다.
항균 활성은 디스크 페이퍼법(disk paper method)을 이용하였다. 각 균주를 전배양하여 640 nm의 파장에 대한 흡광도(A640)가 0.6 내지 0.7로 일정하게 현탁된 배양액 100 ㎕를 상기 평판배지에 분주한 후, 도말하였다.
이후, 멸균된 직경 8.0 ㎜ 페이퍼 디스크(ADVANTEC, Japan)에 시료를 50 ㎕씩 2회에 걸쳐 흡수시키고, 상기 균주가 도말된 배지에 밀착시킨 다음, 37 ℃ 세균 배양기에서 48 시간동안 배양하였다. 배양 후, 상기 필터 페이퍼 디스크 주변에 형성된 투명한 생육저해환(inhibition clear zone)의 유무 및 크기(㎜)를 통해 항균효과의 여부를 확인하였다.
상기 실시예 25, 실시예 26, 비교예 1 및 나린제닌 수용액의 항효모 활성을 확인하여 생육저해환이 형성된 것을 '+', 형성되지 않은 것을 '-'로 하였으며, 상기 디스크 주변의 생육저해환의 직경(㎜)을 측정하여 표 15에 나타내었다.
농도(concentration (W/v);%)
실시예 26 실시예 28 비교예 25 비교예 1 나린제닌
1 5 1 5 1 5 1 5 5/ 50/
Bacillus sb(된장 유래) - - - - - - + (8.7) + (10.3) - -
L. monocytogenes - + (9.5) - + (10) - + (9) - + (12.3) - -
Z. myces rouxii + (9.7) + (17) + (12) + (20.5) + (8.6) + (14.7) - - - -
P. membranifaciens + (9.4) + (15.3) + (11.8) + (18.5) + (8.8) + (13) - - - -
표 15에 나타난 바와 같이, 상술한 실험결과와 동일하게 바실러스 서브틸러스에 대하여 녹차잎 추출물에서만 뚜렷한 활성을 나타내었고, Listeria monocytogenes(리스테리아 모노사이토제니스)에 대해서는 모든 추출물에서도 뚜렷한 활성이 관찰되지 않았지만 미약한 저해활성은 관찰되었다.
녹차씨 박에 주로 존재하는 주요 폴라보노이드 성분인 나린제닌은 5~50 ㎍에서 모두 항균활성을 갖고 있지 않음이 확인되었으므로 본 발명의 녹차씨 박 열수 또는 주정추출물은 나린제닌외 다른 성분에 의해 발생하는 항효모 활성임을 알 수 있다.
또한, Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이) 및 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스) 효모균에 대해서 본 발명의 실시예 25, 26 및 28의 녹차씨박 열수 또는 주정추출물을 비롯한 녹차씨 열수추출물은 활성을 가지나, 녹차잎 열수추출물은 활성을 나타내지 않았다.

Claims (12)

  1. 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 유효성분으로 포함하는 항효모성 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물은 물 또는 20 내지 80% 에탄올 수용액으로 추출된 추출물인 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 녹차씨 추출물은 녹차씨의 과피가 제거된 속씨를 이용한 것을 특징으로 하고,
    상기 녹차씨박 추출물은 녹차씨의 과피가 제거된 속씨를 착유하고 남은 기름이 제거된 녹차씨 속씨 잔여물을 이용한 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 녹차씨 추출물은 7 내지 12% 수분함량을 갖는 녹차씨를 이용한 것을 특징으로 하고,
    상기 녹차씨박 추출물은 600 내지 650 ㎏f/㎠로 유착기를 사용하여 녹차씨 기름을 제거한 녹차씨 속씨 잔여물을 이용한 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 녹차씨박 추출물은 Candida albicans(칸디다 알비칸스), Candida krusei(칸디다 크루세이), Zygosaccharomyces rouxii(지고사카로미세스 록시이), Kluyveromyces fragilis(클루이베로마이세스 프라질리스) 및 Pichia membranifaciens(피치아 멤브라니파시엔스)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 효모에 대해 항효모 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물.
  6. 제1항에 따른 항효모성 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품보존제.
  7. Ⅰ) 녹차씨 또는 녹차씨박을 물, C1 내지 C4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매 중에서 선택되는 어느 하나의 용매로 추출하여 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 수득하는 단계; 및
    Ⅱ) 상기 녹차씨 추출물 또는 녹차씨박 추출물을 여과 및 농축하는 단계;.를 포함하는 항효모성 조성물의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 Ⅰ) 단계의 상기 녹차씨는 녹차씨의 과피가 제거된 속씨인 것을 특징으로 하고,
    상기 Ⅰ) 단계의 상기 녹차씨박은 녹차씨의 과피가 제거된 속씨를 착유하고 남은 기름이 제거된 녹차씨 속씨 잔여물인 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 Ⅰ) 단계의 상기 녹차씨는 7 내지 12% 수분함량을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 녹차씨박은 600 내지 650 ㎏f/㎠로 유착기를 이용하여 녹차씨 기름을 제거된 잔여물인 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 Ⅰ) 단계에서 상기 녹차씨 또는 녹차씨박은 평균 입경이 1.0 내지 2.0 ㎜인 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 Ⅰ) 단계에서 용매로 물을 이용할 경우, 20 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물의 제조방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 Ⅰ) 단계에서 용매로 C1 내지 C4의 저급알코올을 이용할 경우, 60 내지 80 ℃에서 0.5 내지 5 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 항효모성 조성물의 제조방법.
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