KR20160119236A

KR20160119236A - 3'',5''-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물, 및 그 제조법

Info

Publication number: KR20160119236A
Application number: KR1020167025781A
Authority: KR
Inventors: 히사키 타나카; 카즈야 이시게
Original assignee: 야마사 쇼유 가부시키가이샤
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2015-03-12
Publication date: 2016-10-12
Also published as: EP3118207A4; CN106061989A; US20170096439A1; WO2015137469A1; US10836783B2; JP6321135B2; EP3118207A1; KR102008279B1; CA2942283C; CA2942283A1; CN110256507B; CN110256507A; US20190382426A1; EP3118207B1; JPWO2015137469A1

Abstract

종래, 3',5'-사이클릭　디아데닐산은 동결 건조품으로서만 제공되고 있었지만 동결 건조품　이외의 고형 및 그 제조법을 얻는다.　3',5'-사이클릭　디아데닐산　수용액에 산을 첨가하고 pH 1~3까지 저하시키는 공정에 의해, 3',5'-사이클릭 디아데닐산의 포접 화합물을 얻을 수 있다.　해당　제조법은 아주 용이한 제조법이며 특수한 기계　등을 필요로 하지 않는다.

Description

3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물, 및 그 제조법{INCLUSION COMPOUND OF 3',5'-CYCLICDIADENYLIC ACID, AND METHOD FOR PRODUCING SAME}

본 발명은 아쥬반트로서 유용한 물질이 될 수 있다고 생각되는 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물　및 그 제조법에 관한 것이다.

3',5'-사이클릭　디아데닐산은 세균의 세컨드 메신저로서 발견된 물질이다. 최근이 되어 본　물질은 1형 인터페론을 유발할 수 있는 것이 보고되는　등, 의약품으로서의 이용이 기대되고 있다(비특허문헌 1).

지금까지 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 제조방법으로서는 화학합성법(비특허문헌 2, 3)이나, 바실러스(Bacillus)속이나 스트렙토코쿠스(Streptococcus)속 등에서 유래하는 디아데닐레이트　싸이클라아제(고리화효소)를 이용한 효소합성법(특허문헌 4, 5)이 알려져 있고, 형태로서는 동결 건조품으로서 제공되고 있다.

비특허문헌 1: Science, 328, 1703-1705(2010) 비특허문헌 2: SYNTHESIS, 24, 4230-4236(2006) 비특허문헌 3: Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 32, 1-16(2013) 비특허문헌 4: Molecular Cell, 30, 167-178(2008) 비특허문헌 5: Nagoya J. Med. Sci., 73, 49-57(2011)

종래 3',5'-사이클릭　디아데닐산은 동결 건조품으로서 제공되고 있지만, 동결 건조품 이외의 조제품은 알려지지 않았다. 하지만, 동결 건조품은 그 제조 과정에서 동결 건조기가 필요하고, 대량생산을 위하여 스케일업을 하려 해도 자체적으로 한계가 있었다.

따라서, 본 발명의 과제는 특수한 장치나 공정을 이용하지 않고, 동결 건조품과는 다른 완전히 새로운 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 조제품을 제공하는 것에 있다.

그래서 본 발명자들은 동결 건조품과는 다른 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 조제품에 대하여 검토를 했다. 결과, 3',5'-사이클릭　디아데닐산　수용액에 산을 첨가하여 pH 1~3까지 저하시키는 아주 간단한 방법에 의해, 동결 건조품과는 완전히 다른 물성을 가지는 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물을 제조할　수 있는 것을　알아냈다.

본 발명은 종래의 동결 건조품과는 완전히 다른, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명의 포접 화합물은 결정성의 물질이며 취급이 용이하다(예를 들면, 흡습성이 없고, 또한　안정성, 용해성도 뛰어난　등). 또한, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산　포접 화합물의 제조법은, 조제하기 위한 특수한 장치나 공정을 필요로 하지 않는 것이며, 3',5'-사이클릭　디아데닐산을 대량으로 생산하기에 유효하다.

도 1은 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(비결정성)의 사진을 나타낸다.
도 2는 3',5'-사이클릭　디아데닐산 나트륨염의 동결 건조품의 사진을 나타낸다.
도 3은 3',5'-사이클릭　디아데닐산 암모늄염의 동결 건조품의 사진을 나타낸다.
도 4는 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(비결정성)의 열중량측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 5는 3',5'-사이클릭　디아데닐산 나트륨염의 동결 건조품의 열중량측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 6은 3',5'-사이클릭　디아데닐산 암모늄 염의 동결 건조품의 열중량측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 7은 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 핵자기 공명 스펙트럼(¹H)을 나타낸다.
도 8은 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 핵자기 공명 스펙트럼 (¹³C)을 나타낸다.
도 9는 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 핵자기 공명 스펙트럼(³¹P)을 나타낸다.
도 10은　3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 3',5'-사이클릭　디아데닐산 나트륨염의 동결 건조품의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 3',5'-사이클릭　디아데닐산 암모늄염의 동결 건조품의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(결정성)의 사진을 나타낸다.
도 14는 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(결정성)의 열중량측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 15는 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(결정성)의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 다음의 구조식으로 나타내는 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명에서 말하는 포접 화합물이란, 화합물과 용매가 약한 상호작용에 의해 복합체를 형성하는　등, 고형화(固形化)에서 용매가 보조적인 역할을 다하고 있는 상태의 고형물을 가리키고, 포접의 형태와 고형의 구조에 대해서는 제한되지 않는다. 특히 본 발명에서는, 용매로서 물을 이용하고 있으므로, 부기(付記)하지 않는 한, 본 발명에서의 포접 화합물은 물과의 포접 화합물을 가리킨다. 한편, 본 발명의 포접 화합물은 결정성 물질과 비결정성 물질을 포함한다.

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 3',5'-사이클릭 디아데닐산 수용액에 산을 첨가하여 pH 1~3까지 저하시키는 것에 의해 얻을 수 있다.

본 발명의 포접 화합물의 취득에 사용하는 3',5'-사이클릭　디아데닐산은 효소합성법이나 화학합성법 등 공지의 방법에 의해 합성하면 되고, 효소합성법에 의해 합성한 것이 바람직하다. 효소합성을 하는 때에는 기지(旣知)의 방법에 따라 하면 되고, 예를 들면 비특허문헌 4, 5에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 반응 후, 반응액 중에 생성한 3',5'-사이클릭　디아데닐산은 활성탄이나 이온교환 수지 등을 이용한 통상의 크로마토그래피 처리법에 의해 단리정제(單離精製)할 수 있다.

본 발명의 포접 화합물을 취득하기 위해서는 3',5'-사이클릭　디아데닐산 수용액에 산을 첨가하여 pH 1~3, 바람직하게는 pH 1.5~2.0까지 저하시키면 된다. 사용하는 산으로서는, 상기 pH로 조정할 수 있는 것이면 되고, 구체적으로는 염산, 황산, 질산 등의 무기산을 예시할 수 있다. 한편, 산을 급격하게 첨가하는 것에 의한 아몰퍼스화나 급격한 석출을 막기 위해, 첨가는 천천히 하는 것이 바람직하다.

또한, 포접 화합물의 취득율이 낮을 경우에는, 상기 포접 화합물의 여액에 대하여 같은 처리를 수회 반복하는 것에 의해 재차 포접 화합물을 취득해도 된다.

또한, 본 발명의 포접 화합물을 취득하기 위해서는, (1) 3',5'-사이클릭　디아데닐산 수용액에 산을 첨가하여 pH 1~3까지 저하시키는 공정, (2) 해당 3',5'-사이클릭　디아데닐산 수용액을 50~70℃까지 가열하는 공정, (3) 해당 3',5'-사이클릭　디아데닐산 수용액을 1~10℃로 될 때까지 냉각하는 공정을 포함하는 방법에 의해 실시해도 된다. 또한, (1), (2)의 공정, (2), (3)의 공정은 동시에 실시할 수도 있다. 또한, (1) 희석한 3',5'-사이클릭　디아데닐산 수용액에 산을 첨가하여 pH 1~3까지 저하시키는 공정, (2) pH를 조정한 해당 3',5'-사이클릭　디아데닐산 수용액을 50~70℃까지 가열하는 공정, (3) 해당 3',5'-사이클릭　디아데닐산 수용액을 1~10℃로 될 때까지 냉각하는 공정으로 이루어지는 방법에 의해 실시해도 된다. 보다 확실하게 포접 화합물을 취득하기 위하여 (3)의 냉각은 천천히 실시하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 온도 구배 -3~-11℃/hr로 냉각하는 것이 바람직하다.

상기 제조법에 의해 얻어진 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 여취(濾取)한 후, 실온(25℃)~70℃에서 1~10시간 건조시킴으로써 제품으로 할 수 있다. 본 발명의 포접 화합물은 건조 시의 온도를 실온(25℃)~40℃의 저온하에서 건조시킴으로써 결정성 물질이 되고, 40~70℃의 고온조건하에서 건조시키면 비결정성 물질로서 얻을 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 포접 화합물은 건조 시의 온도를 실온(25℃) 이상~40℃ 미만의 저온하에서 건조시킴으로써 결정성 물질이 되고, 40℃ 이상~70℃ 이하의 고온조건하에서 건조시키면 비결정성 물질로서 얻을 수 있다. 또한, 수득한 포접 화합물은 여취한 후, 건조시키기 전에 적당히 에탄올 등으로 세정해도 된다. 건조시킬 때에는 감압건조 등의 방법을 적당히 이용해도 된다.

이와 같은 방법으로 얻어진 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 고속액체 크로마토그래피법으로 순도 검정했을 때, 97% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가지고, 이하의 물성을 가지는 것이다. 한편, 하기의 물성 중, 특히 한정하지 않는 기재는 결정성 물질, 비결정성 물질의 양쪽에 공통하는 성질이다.

(1) 수분함량

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 건조 정도에 의해 다르지만, 열중량측정/시차 열분석(TG/DTA)장치에 의해 측정했을 때의 수분은 3.5~17%의 범위다. 다시 말해 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물에는 3',5'-사이클릭　디아데닐산 1분자에 대하여 1~7분자의, 보다 상세하게는 1.1~6.1분자의 물분자가 결합 또는 부착되어 있다.

(2) 열분석

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 열중량측정/시차 열분석(TG/DTA)장치(승온속도 5℃/분)로 분석했을 때, 포접 화합물이 결정성 물질일 때에는 193℃ 부근, 비결정성 물질일 때에는 220℃ 부근에 흡열 피크를 가진다.

(3) 형상

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 침(針)의 형상을 나타낸다.

(4) 적외선 흡수 스펙트럼

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(비결정성)은 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때, 3087, 1686, 1604, 1504, 1473, 1415, 1328, 1213(cm^-1) 부근에 특징적인 피크를 가진다.

한편, 적외선 흡수 스펙트럼 측정에서는, 일반적으로 2(cm^-1) 미만의 오차범위를 포함하는 경우가 있으므로, 상기 수치와 적외선 흡수 스펙트럼에서의 피크의 위치가 완전히 일치하는 포접 화합물외에, 피크가 2cm^-1미만의 오차로 일치하는 포접 화합물도, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물에 포함된다. 예를 들면, 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때, 3087±1.9, 1686±1.9, 1604±1.9, 1504±1.9, 1473±1.9, 1415±1.9, 1328±1.9, 1213±1.9(cm^-1)에 특징적인 피크를 가진다.

(5) 분말 X선 해석

특히 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물이 결정성 물질일 때, 본 발명의 포접 화합물은 분말 X선 분석에서 특징적인 피크를 가진다. 예를 들면 본 발명의 포접 화합물을 Cu-Kα선을 이용한 분말 X선 회절장치로 분석하면, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 회절각(2θ)이 9.2, 10.2, 10.9, 11.1, 13.7, 15.2, 19.0, 20.6, 22.4, 23.1, 24.3, 26.6, 26.8(°) 부근, 그 중에서도 특히 회절각(2θ)이 9.2, 15.2, 19.0, 20.6, 26.8(°) 부근에 특징적인 피크를 나타낸다.

한편, 일반적으로, 분말 X선 회절에서의 회절각(2θ)은 5% 미만의 오차범위를 포함하는 경우가 있으므로, 분말 X선　회절에서의 피크의 회절각이 완전히 일치하는 포접 화합물 외에, 피크의 회절각이 5% 미만의 오차로 일치하는 포접 화합물도 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물에 포함된다. 예를 들면, 분말 X선 회절에서 회절각(2θ)은 9.2±0.45, 10.2±0.50, 10.9±0.54, 11.1±0.55, 13.7±0.68, 15.2±0.75, 19.0±0.94, 20.6±1.02, 22.4±1.11, 23.1±1.15, 24.3±1.21, 26.6±1.32, 26.8±1.33(°)에, 특히 회절각(2θ)이 9.2±0.45, 15.2±0.75, 19.0±0.94, 20.6±1.02, 26.8±1.33(°)에 특징적인 피크를 가진다.

포접 화합물이 비결정성 물질일 때에는 분말 X선　회절에서 명료한 피크는 생기지 않는다.

실시예

이하, 실시예를 제시하여, 본 발명을 구체적으로 설명하지만 본 발명이 이것에 한정되지 않는 것은 분명하다．

(실시예 1)　3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(비결정성)의 제조

공지의 방법에 따라 3',5'-사이클릭　디아데닐산을 합성하고 정제를 했다.

정제하여　얻어진 OD257이 709의 3',5'-사이클릭　디아데닐산 용액(141mL)을, OD257이 20이 되도록 물로 희석했다. 교반하면서 1N의 염산 용액을 천천히 가하여　pH 1.8이 되도록 조정했다. 결과, 수용액　중에 백색 고체가 석출되었다.

포접 화합물을 더욱 효율적으로 취득하기 위하여 프로그램 인큐베이터를 이용하여 해당　용액을 60℃로 가온했다. 그 후, 온도 구배 -4℃/hr로 액체 온도가 4℃로 될 때까지 냉각했다. 석출물을 글라스 필터(17G3)로 여취하여 백색 고체를 얻었다. 해당 백색 고체를 60℃에서 6시간 건조시켜 포접 화합물(비결정성) 2.169g을 얻었다.

(참고예) 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 동결 건조품의 제조

효소합성한 3',5'-사이클릭　디아데닐산 1g를 20mL의 물에 현탁한 후, 1N NaOH 용액으로 pH 7.0으로, 또는 5% 암모니아수로 7.4로 조정함으로써, 현탁한 3',5'-사이클릭　디아데닐산을 용해했다.

용해한 3',5'-사이클릭　디아데닐산 용액을 물로 35mL까지 희석한 후, 동결 건조기로 동결 건조를 실시함으로써, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 나트륨염 또는 암모늄 염의 동결 건조품을 얻었다.

(실시예 2) 3',5'-사이클릭　디아데닐산 포접 화합물(비결정성)의 물성

상기 실시예 1에서 조제한 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물에 대한 기기 분석의 결과를 나타낸다.

(기기 분석)

(A) 순도 검정

상기 실시예 1에서　얻어진 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 순도를 고속액체 크로마토그래피법으로 분석했다. 결과, 3',5'-사이클릭　디아데닐산 순도는 99.8%이었다. 한편, 고속액체 크로마토그래피법은 이하의 조건에서　실시했다.

(조건)

칼럼:　하이드로스피어(Hydrosphere) C18(YMC사제)

용출액:　0.1M TEA-P(pH 6.0)

검출법:　UV 260nm에 의한 검출

(B) 형상

3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 대표적인 사진을 도 1에 나타낸다. 도 1에 도시한 바와　같이, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 침상(針狀)을 나타내는 것이 명확하게 되었다.

또한, 3',5'-사이클릭　디아데닐산 나트륨염　및 3',5'-사이클릭　디아데닐산 암모늄염의 동결 건조품은　사진을　도 2, 3에 도시한　바와　같이　포접 화합물과는 완전히 다른 형상이었다.

(C) 수분

열중량측정/시차 열분석(TG/DTA)장치(승온속도 5℃/분)로 분석한 바, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물 중의 수분은 재건조 전의 포접 화합물에서 8.7~9.5%, 100℃의 감압건조에 의한 재건조 후의 포접 화합물에서 3.5~3.6%, 재건조한 포접 화합물을 실온, 습도 40~50%에서 밤새 방치한 포접 화합물에서 10.3%, 재건조한 포접 화합물을 온도 30℃, 습도 70%에서 밤새 방치한 포접 화합물에서 15.0%, 20℃에서 2시간 진공건조시킨 포접 화합물에서 17.0%이었다.

다시 말하면 계산에 의해, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 건조의 정도에 따라 3',5'-사이클릭　디아데닐산 1분자에 대하여 각각 1.1~6.1분자의 물분자가 결합 또는 부착되어 있는 것이 명확하게 되었다.

한편, 3',5'-사이클릭　디아데닐산 나트륨염의 동결 건조품, 3',5'-사이클릭 디아데닐산 암모늄염의 동결 건조품에 대해서도 동일하게 열중량 측정을 한 바, 재건조 전의 측정치에서 나트륨염의 동결 건조품은 16~17%, 암모늄염의 동결 건조품은 13~15%의 수분을 함유하고 있었다.

(D) 시차주사 열량분석

열중량측정/시차 열분석(TG/DTA)장치(승온속도 5℃/분)로 분석한 바, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 220℃ 부근에서 특징적 흡열 피크를 나타냈다(도 4).

이에 대하여, 3',5'-사이클릭　디아데닐산 나트륨염의 동결 건조품은 267℃ 부근을 나타내고(도 5), 암모늄염의 동결 건조품은 228~229℃ 부근에 흡열 피크를 나타냈다(도 6).

(E) 핵자기 공명 스펙트럼(spectrum)

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물에 6N의 NaOH 용액을 2μL 첨가하여 용해시키고, 중수(重水)를 이용하여 농도 6mg/0.6ml이 되도록 희석하고 핵자기 공명 스펙트럼　측정 (¹H, ¹³C, ³¹P)을 실시했다. 측정 결과를 각각 도 7~9에 나타낸다.

결과, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 ¹H의 때는 8.37, 7.96, 6.08, 4.98-5.02, 4.86, 4.51-4.55, 4.17(ppm) 부근에 피크를 가지고 있었다. 또한, ¹³C의 때는, 157.9, 155.4, 150.0, 141.6, 121.3, 93.1, 82.8, 76.7, 73.3, 65.2(ppm)　부근에 피크를 가지고 있었다. ³¹P의 때는, -0.91(ppm)　부근에 피크를 가지고 있었다.

(F) 적외선 흡수 스펙트럼

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물, 3',5'-사이클릭　디아데닐산 나트륨염의 동결 건조품, 3',5'-사이클릭　디아데닐산 암모늄염의 동결 건조품에 대하여 푸리에 변환 적외 분광광도계 스펙트럼 원(Spectrum One)(페르킨 엘머(Perkin Elmer))을 이용하여 ATR(Attenuated Total Reflectance, 감쇠전반사)법에 의해 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했다.

각각의 포접 화합물에서 관찰된 특징적인 피크(cm^-1)의 값을 표 1에 나타낸다. 또한, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물, 3',5'-사이클릭 디아데닐산 나트륨염의 동결 건조품, 3',5'-사이클릭　디아데닐산 암모늄염의 적외선 흡수 스펙트럼을 각각 도 10~12에 나타낸다.

결과, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 3087, 1686, 1604, 1504, 1473, 1415, 1328, 1213(cm^-1)　부근에 특징적인 피크를 가지고 있었다.

(G) 분말 X선 회절

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산　포접 화합물에 대하여, 이하의 측정조건에서 X선　회절 스펙트럼을 측정했다.

(측정 조건)

타겟:　Cu

X선관 전류:　40mA

X선관 전압:　45kV

주사 범위:　2θ=4.0~40.0°

전처리:　마노제　유발을 이용하여 분쇄

측정의 결과, X선　회절 스펙트럼의 패턴에 명료한 피크는 관찰되지 않고. 본　포접 화합물은 비결정성인 것이 나타났다.

(실시예 3)

[1] 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 제조(1)

공지의 방법에 의해, 효소적으로 3',5'-사이클릭　디아데닐산을 합성하고 정제를 했다. 정제해서 얻어진 OD257이 473의 3',5'-사이클릭　디아데닐산　용액(280mL)을, OD257이 40이 되도록 물로 희석했다. 교반하면서 2N의 염산 용액을 가하여 pH 1.8이 되도록 조정했다. 결과, 수용액　중에 백색 고체가 석출했다.

포접 화합물을 보다　효율적으로 취득하기 위하여 프로그램 인큐베이터를 이용하여 해당 용액을 50℃로 가온했다. 그 후, 온도 구배 -3℃/hr로, 액체 온도가 4℃로 될 때까지 냉각하여 고체를 석출시켰다. 석출물을 글라스 필터(17G3)로 여취하여 백색 고체를 얻었다.　해당　백색 고체를 실온에서 진공건조시켜 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물을 얻었다.

[2]　3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 제조(2)

공지의 방법에 의해, 효소적으로 3',5'-사이클릭　디아데닐산을 합성하고 정제를 했다. 정제하여 얻어진 OD257이 758의 3',5'-사이클릭　디아데닐산　용액(400mL)을, OD257이 100이 되도록 물로 희석했다. 포접 화합물을 보다　효율적으로 취득하기 위하여 프로그램 인큐베이터를 이용하여 해당　용액을 50℃로 가온하고 교반하면서 2N의 염산 용액을 가하여 pH 1.8이 되도록 조정했다.

그 후, 온도 구배 -4℃/hr로 액체 온도가 4℃로 될 때까지 냉각하여 고체를 석출시켰다. 석출물을 글라스 필터(17G3)로　여취하여 백색 고체를 얻었다. 해당 백색 고체를 실온에서 진공건조시켜 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물을 8.5g 얻었다.

(실시예 4)　3',5'-사이클릭　디아데닐산포접 화합물(결정성)의 물성

(H) 형상

상기 실시예 3에서 조제한 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(결정성)의 사진을 도 13에 나타낸다. 도 13에 도시한　바와　같이, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(결정성)은 침상의 형상을 나타냈다.

(I) 시차주사 열량분석

열중량측정/시차 열분석(TG/DTA)장치(승온속도 5℃/분)로 분석한 바, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물은 193℃ 부근에서 특징적　흡열피크를 나타냈다(도 14).

(J) 수분

열중량측정/시차 열분석(TG/DTA)장치(승온속도 5℃/분)로 분석한 바, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물　중의 수분을 온도 20℃의 조건에서 2시간 진공건조시켰을 때의 수분함량은 17.0%이었다.

(K) 분말 X선 회절

본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산 포접 화합물에 대하여 (G)와 동일한 측정 조건에서 X선　회절 스펙트럼을 측정했다.

결과, 도 15　및 표 2에 도시한　바와　같이, 본 발명의 3',5'-사이클릭　디아데닐산포접 화합물은 회절각(2θ)이 9.2, 10.2, 10.9, 11.1, 13.7, 15.2, 19.0, 20.6, 22.4, 23.1, 24.3, 26.6, 26.8(°)　부근에 특징적인 피크를 나타냈다.

또한, X선 회절 스펙트럼의 패턴으로부터, 본　실시예에서 취득한 3',5'-사이클릭　디아데닐산　포접 화합물은 결정성 물질인 것이 판명되었다.

(L) 순도 검정

3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물(결정성)의 순도를 고속액체 크로마토그래피법으로 분석했다. 결과, 3',5'-사이클릭　디아데닐산　순도는 99.7%이었다. 한편, 고속액체 크로마토그래피법의 조건은 실시예 1과　같게 했다.

Claims

3',5'-사이클릭　디아데닐산　수용액에 산을 첨가하여 pH 1~3까지 저하시키는 공정을 포함하는, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 제조법.
하기 (1)~ (3)의 공정을 포함하는 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물의 제조법.
(1) 3',5'-사이클릭　디아데닐산　수용액에 산을 첨가하여 pH 1~3까지 저하시키는 공정,
(2) 3',5'-사이클릭　디아데닐산　수용액을 50~70℃까지 가열하는 공정,
(3) 3',5'-사이클릭　디아데닐산을 1~10℃로 될 때까지 냉각하는 공정.
3',5'-사이클릭　디아데닐산 1분자에 대하여, 물 1~7분자가 부착 또는 결합하는, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물.
제３항에　있어서，
고속액체 크로마토그래피에 있어서의 순도가 97% 이상인,　3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물.
제３항　또는　제４항에　있어서，
고속액체 크로마토그래피에 있어서의 순도가 99% 이상인, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물.
제３항　내지　제５항의　어느　한　항에　있어서，
상기 포접 화합물이 결정인, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물.
제６항에　있어서，
분말 X선 분석에서 회절각(2θ)이 9.2, 15.2, 19.0, 20.6, 26.8(°)　부근에 특징적인 피크를 나타내는, 3',5'-사이클릭　디아데닐산의 포접 화합물.