KR20160093076A - 암의 치료용 조합 제조물 - Google Patents

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Abstract

암의 치료용 조합 제조물이 기재된다. 조합 제조물은 (a) MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체; 및 (b) 항-종양제를 포함하며, 상기 항-종양제는 백금계 항-종양제 또는 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제이다. 조합 제조물을 이용하는 암의 치료 방법이 또한 기재된다.

Description

암의 치료용 조합 제조물{COMBINED PREPARATIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 조합 제조물 및 약학적 조성물, 및 특히 암의 치료를 위한 약제로서의 그의 용도, 및 암의 치료 방법에 관한 것이다.
암은 표준화된 요법의 일환으로서 하나 이상의 세포독성 항-종양 약물("화학치료제")로 치료될 수 있다. 화학치료법은 환자 치유, 또는 수명 연장, 또는 증상 완화를 목표로 할 수 있다.
통상적인 화학치료제는 대부분의 암 세포의 특성 중 하나를 이용하여 신속히 분열하는 세포를 사멸시킴으로써 작용한다. 그러나, 화학치료법은 정상 상황 하에 신속히 분열하는 세포, 예를 들어 골수, 소화관 및 모낭 내 세포에도 해를 끼친다. 이는 화학치료법의 가장 일반적인 부작용: 골수억제(혈구 생산 감소, 이에 따라 또한 면역억제), 점막염(소화관 내층의 염증), 및 탈모증(모발 손실)을 일으킨다.
보다 유효한 암 치료를 제공하고, 감소된 부작용을 갖는 유효한 암 치료를 제공해야 하는 필요성이 존재한다.
림프구 활성화 유전자 3(LAG-3)은 4 개의 세포외 Ig 수퍼패밀리 도메인을 갖는 CD4 동족체(homolog) Ⅰ형 막 단백질이다. CD4와 유사하게, LAG-3은 T 세포의 표면에서 올리고머화하며 항원-제시 세포(APC) 상에서 MHC 클래스 Ⅱ 분자에, 그러나 CD4보다 유의미하게 더 높은 친화도로 결합한다. LAG-3은 이것이 세포 표면에서 CD3-TCR 복합체와 연합하고 신호 전달을 음성적으로 조절하는 활성화된 CD4-양성 및 CD8-양성 T 림프구 상에서 발현된다. 결과적으로, 이는 T 세포 증식, 기능 및 항상성을 음성적으로 조절한다.
LAG-3-유래 가용성 융합 단백질은 CD4에 비해 훨씬 더 높은 결합력으로 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하여 MHC 클래스 Ⅱ-양성 대식구 및 미성숙 수지상 세포가 시험관내 T 세포 반응을 유도하는 능력을 증가시키고, 바이러스 및 종양-특이적 세포독성 T 세포의 시험관내 유도를 증강시키는 것으로 나타났다. 따라서, LAG-3 융합 단백질은 전신 면역자극제로서 그리고 암 백신에 대한 어주번트로서 이용된다.
WO 2009/044273은 단핵구-매개된 면역 반응의 부양을 위한, 특히 암의 치료를 위해 혈중 단핵구의 수의 증가를 유도하기 위한, 재조합 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체의 용도를 기재한다.
이제 놀랍게도 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 백금계 항-종양제, 또는 토포아이소머라아제(topoisomerase) Ⅰ 저해제의 투여가 종양 성장 감소에서 상승적 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명에 따르면, (a) MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체; 및 (b) 항-종양제를 포함하는 조합 제조물이 제공되며, 여기서 항-종양제는 백금계 항종양제 또는 토포아이소머라아제 I 저해제이다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "조합 제조물(combined preparation)"은 상기 정의된 바와 같은 조합 성분 (a) 및 (b)가 독립적으로 또는 조합 성분 (a) 및 (b)의 구별되는 양을 갖는 상이한 고정된 조합의 사용에 의해 투여될 수 있다는 점에서 "부분 키트"로 불린다. 성분은 동시에 또는 하나씩 투여될 수 있다. 성분이 하나씩 투여되는 경우, 바람직하게는 투여 간 시간 간격은 성분의 조합 이용의 치료 효과가 조합 성분 (a) 및 (b) 중 임의의 하나만의 이용에 의해 수득될 효과보다 크도록 선택된다.
조합 제조물의 성분은 하나의 조합된 단위 투여형 형태에, 또는 성분 (a)의 제1 단위 투여형 형태 및 성분 (b)의 별도의 제2 단위 투여형 형태로서 존재할 수 있다. 조합 제조물에서 투여될 조합 성분 (a) 대 조합 성분 (b)의 총량의 비는, 예를 들어 치료될 환자 하위집단의 필요성, 또는 하나의 환자의 필요성에 대응하기 위해 변할 수 있고, 이는 예를 들어 환자의 특정 질환, 연령, 성별 또는 체중에 기인할 수 있다.
바람직하게는, 적어도 하나의 유익한 효과, 예를 들어 항-종양제의 효과 증강, 또는 예를 들어 조합 성분 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 다의 유효 투여량에 비해 부가 효과를 초과하는 조합 성분 (a) 및 (b) 효과의 상호 증강, 추가적인 유리한 효과, 더 적은 부작용, 더 작은 독성, 또는 조합된 치료 효과, 그리고 매우 바람직하게는 조합 성분 (a) 및 (b)의 상승작용이 존재한다.
본 발명의 조합 제조물은 포유류, 바람직하게는 인간으로의 투여를 위한 약학적 조합 제조물로 제공될 수 있다. LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체에는 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제와 함께 제공될 수도 있거나 및/또는 항-종양제에는 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제가 함께 제공될 수 있다.
LAG-3, 또는 그의 유도체는 LAG-3 유도체 LAG-3Ig 융합 단백질 IMP321의 0.25-30 ㎎, 1-30 ㎎, 또는 6-30 ㎎의 몰 당량인 용량으로 존재할 수 있다. IMP321의 피하(s.c.) 주사 당 6-30 ㎎ 용량이 전이성 신장 세포암 환자에서 수득되는 약동학 데이터 결과에 근거하여 안전하며, 허용 가능한 전신 노출을 제공하는 것으로 나타났다. 6 ㎎을 초과하는 IMP321 용량이 주사된 환자에서 s.c. 주사 후 적어도 24 시간 동안 1 ng/㎖을 초과하는 IMP321의 혈액 농도가 수득된다.
본 발명의 조합 제조물은 복수 용량의 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다.
항-종양제의 용량은 이용되는 특정 항-종양제에 의존할 것이다.
백금계 항-종양제는 암 화학치료법에서 이용되는 백금의 배위 착물이다. 이들은 DNA 보수 및/또는 DNA 합성을 저해하는 DNA 내 가교를 형성하여 세포사를 일으키는 것으로 여겨진다. 백금 화합물을 이용하는 암 치료의 주된 용량 제한 부작용은 말초 신경독성이다. 백금계 항-종양제의 예에는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 피코플라틴, Nedaplatin 및 Triplatin이 포함된다.
카보플라틴, 또는 시스-디아민(사이클로부탄-1,1-디카복실레이트-O,O')백금(Ⅱ)(상표명 Paraplatin 및 Paraplatin-AQ)는 일부 형태의 암에 대해 이용된다(주로 난소암종, 폐암, 두부암 및 경부암뿐만 아니라 자궁내막암, 식도암, 방광암, 유방암 및 자궁경부암; 중추 신경계 또는 생식 세포 종양; 골 육종, 및 줄기 세포 또는 골수 이식용 제조물로서). 이는 그 모계 화합물 시스플라틴에 비해 크게 감소된 부작용을 갖는다. 카보플라틴 투여에 대한 가이드라인은 미국 식약청(FDA)에서 이용 가능하다.
옥살리플라틴, 또는 [(1R,2R-사이클로헥산-1,2-디아민](에탄디오에이토-O,O')백금(Ⅱ)(상표명 Eloxatin)은 사각 평면 백금(Ⅱ) 중심을 포함한다. 시스플라틴 및 카보플라틴과 대조적으로, 옥살리플라틴은 2 개의 한자리 아민 리간드 대신 두자리 리간드 1,2-디아미노사이클로헥산을 포함한다. 이는 또한 두자리 옥살레이트기를 갖는다. 옥살리플라틴은 결장암종에 대해 항-종양 활성을 갖는다. 옥살리플라틴은 DNA에서 가닥-내 및 가닥-간 가교를 모두 형성하여 작용한다. DNA에서의 가교는 DNA 복제 및 전사를 방지하여 세포사를 일으킨다. 어주번트 설정에서 옥살리플라틴의 권장 용량은 12 사이클 동안 2 주마다 반복하여 정맥 내로 85 ㎎/㎡이다. 전이성 결직장암의 치료에서 옥살리플라틴에 대한 권장 용량은 질환 진행 또는 허용 불가능한 독성 전까지 2 주마다 반복하여 정맥 내로 85 ㎎/㎡이다.
토포아이소머라아제 저해제는 토포아이소머라아제 효소(토포아이소머라아제 Ⅰ 및 Ⅱ)의 작용을 방해하도록 설계된 제제이며, 이는 정상 세포 주기 동안 DNA 가닥의 포스포디에스테르 골격의 파손 및 재결합을 촉매함으로써 DNA 구조 내 변화를 제어하는 효소이다. 토포아이소머라아제 저해제는 세포 주기의 결찰 단계를 차단하여 게놈의 온전성에 해를 가하는 단일 및 이중 가닥 파손을 생성하는 것으로 여겨진다. 이들 파손의 도입은 이후 아폽토시스 및 세포사로 이어진다.
인간 DNA 토포아이소머라아제 Ⅰ(Top1)은 복제 및 전사 동안 DNA 슈퍼코일화를 이완시키는 필수 효소이다. Top1은 이중 나선 축 주위로 절단된 가닥의 회전을 허용하는 DNA 단일-가닥 파손을 생성한다. Top1은 또한 절단된 가닥을 재결찰하여 온전한 듀플렉스 DNA를 재구축한다. 절단 복합체로 알려져 있는 Top1-DNA 중간체는 일시적이며, 정상 상황 하에서 낮은 수준으로 존재한다. 그러나, Top1 저해제, 예컨대 캄프토테신의 처리는 절단 가능한 복합체를 안정화하며, DNA 재결찰을 방지하고, 치명적인 DNA 가닥 파손을 유도한다. 암 세포는 이들 DNA 병소의 생성에 대해 선택적으로 민감하다.
토포테칸, 또는 (S)-10-[(디메틸아미노)메틸]-4-에틸-4,9-디하이드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b] 퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온 모노하이드로클로라이드(상표명 Hycamtin)는 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제인 화학치료제이다. 이는 캄프토테신의 수용성 유도체이다. 이는 난소암 및 폐암 뿐만 아니라 다른 암 유형을 치료하기 위해 하이드로클로라이드 형태로 이용된다. 토포테칸은 캄프토테신의 반합성 유도체이다. 캄프토테신은 나무 캄프토테카 아쿠미나타의 껍질에서 추출된 천연 산물이다. 토포아이소머라아제-Ⅰ은 단일 가닥 파손의 개방에 의해 DNA의 비틀림 장력을 완화하는 핵 효소이다. 토포아이소머라아제-Ⅰ이 단일 가닥 파손을 생성하면, DNA는 전방 복제 시작부의 전방에서 회전할 수 있다. 토포테칸은 DNA 염기 사이에 삽입된다. 상기 삽입은 토포테칸이 삽입되는 부위에 도달하면 DNA 복제 기전을 손상시킨다. 상기 손상은 DNA 복제를 방지하며, 궁극적으로 세포사로 이어진다. 포유류 세포는 이들 이중 가닥 파손을 효율적으로 보수할 수 없다. 상기 공정은 DNA 가닥의 파손으로 이어져서 아폽토시스를 일으킨다.
Hycamtin 캡슐의 권장 용량은 매 과정의 시작 사이에 3 주 간격을 가지며 연속 5 일 동안 투여되는 2.3 ㎎/체표면적㎡/일이다.
또 다른 캄프토테신 유도체 이리노테칸(CPT11)은 결장암 치료에 대해 승인되었다.
본 발명의 조합 제조물은 복수 용량의 항종양제를 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질은 단리된 천연 또는 재조합 LAG-3 단백질일 수 있다. LAG-3 단백질은 임의의 적합한 종으로부터의 LAG-3 단백질, 예컨대 영장류 또는 쥐과 LAG-3 단백질, 그러나 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 아미노산을 포함할 수 있다. 인간 및 쥐과 LAG-3 단백질의 아미노산 서열은 Huard 등(Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997)의 도 1에 제공된다. 인간 LAG-3 단백질의 서열은 아래 도 13에서 반복된다(서열번호 1). 인간 LAG-3의 4 개의 세포외 Ig 수퍼패밀리 도메인(D1, D2, D3, 및 D4)의 아미노산 서열은 또한 아미노산 잔기: 1-149(D1); 150-239(D2); 240-330(D3); 및 331-412(D4)에서 Huard 등의 도 1에서 확인된다.
LAG-3 단백질의 유도체에는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질의 단편, 변이체 또는 돌연변이체가 포함된다. MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질의 몇몇 유도체가 알려져 있다. 이러한 유도체의 많은 예는 Huard 등(Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 11: 5744-5749, 1997)에 기재된다. 상기 문헌은 LAG-3 단백질 상에서 MHC 클래스 Ⅱ 결합 부위의 특징을 기재한다. LAG-3 돌연변이체 제조 방법뿐만 아니라 클래스 Ⅱ-양성 Daudi 세포에 결합하는 LAG-3 돌연변이체의 능력을 결정하기 위한 정량적 세포 접착 검정이 기재된다. MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 몇몇 상이한 LAG-3 돌연변이체의 결합이 결정되었다. 일부 돌연변이는 클래스 Ⅱ 결합을 감소시킬 수 있었던 반면, 다른 돌연변이는 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 친화도를 증가시켰다. MHC 클래스 Ⅱ 단백질의 결합을 위해 필수적인 여러 잔기는 LAG-3 D1 도메인에서 큰 30 개 아미노산의 루프-외 구조의 기저부에 클러스터링된다. 인간 LAG-3 단백질의 D1 도메인의 루프-외 구조의 아미노산 서열은 도 13에서 밑줄 친 서열인 GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY(서열번호 2)이다.
LAG-3 단백질 유도체는 인간 LAG-3 D1 도메인의 30 개 아미노산의 루프-외 서열, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 변이체는 인간 LAG-3 D1 도메인의 30 개 아미노산의 루프-외 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95% 아미노산 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, 및 선택적으로 도메인 D2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, 또는 도메인 D1 및 D2와 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, D2, D3, 및 선택적으로 D4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3의 도메인 D1, D2, 및 D3, 또는 도메인 D1, D2, D3, 및 D4와 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
아미노산 서열 간 서열 동일성은 서열 정렬을 비교하여 결정될 수 있다. 비교된 서열 내의 동등 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 동일성 백분율로서의 정렬 스코어링은 비교되는 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일한 아미노산 수의 함수이다. 서열을 비교하는 경우, 최적 정렬은 서열에서 가능한 삽입 및 결실을 고려하여 하나 이상의 서열 내로 갭이 도입되는 것을 필요로 할 수 있다. 서열 비교 방법은 비교되는 서열에서 동일한 분자의 동일한 수에 있어서, 2 개의 비교되는 서열 간 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 적은 갭을 갖는 서열 정렬이 많은 갭을 갖는 정렬보다 높은 스코어를 달성하도록 갭 페널티를 채용할 수 있다. 최대 동일성 백분율 계산에는 갭 페널티를 고려하여 최적 정렬의 생성이 관여된다.
서열 비교를 수행하기 위해 적합한 컴퓨터 프로그램은 상업적 및 공개 섹터에서 폭넓게 이용 가능하다. 예에는 MatGat(Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4: 29; http://bitincka.com/ledion/matgat에서 이용 가능한 프로그램), Gap(Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), FASTA(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; http://www.ebi.ac.uk/fasta에서 이용 가능한 프로그램), Clustal W 2.0 및 X 2.0(Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948; http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2에서 이용 가능한 프로그램) 및 EMBOSS 페어식 정렬 알고리즘(Needleman & Wunsch, 1970, 상기; Kruskal, 1983, In: Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, Sankoff & Kruskal(eds), pp 1-44, Addison Wesley; http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align에서 이용 가능한 프로그램)이 포함된다. 모든 프로그램은 디폴트 파라미터를 이용해서 수행될 수 있다.
예를 들어, 서열 비교는 EMBOSS 페어식 정렬 알고리즘의 "니들" 방법을 이용해서 수행될 수 있고, 이는 이들의 전체 길이에 걸쳐 고려되는 경우, 두 서열의 최적 정렬(갭 포함)을 결정하고 동일성 스코어 백분율을 제공한다. 아미노산 서열 비교를 위한 디폴트 파라미터("단백질 분자" 옵션)은 갭 연장 페널티: 0.5, 갭 개방 페널티: 10.0, 매트릭스: Blosum 62일 수 있다.
서열 비교는 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행될 수 있다.
LAG-3 단백질 유도체는 선택적으로 링커 아미노산 서열에 의해, 면역글로불린 Fc 아미노산 서열, 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 아미노산 서열에 융합될 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체가 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 능력은 Huard 등(상기)에 기재된 바와 같은 정량적 세포 접착 검정을 이용해서 결정될 수 있다. MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3 단백질의 유도체의 친화도는 클래스 Ⅱ 분자에 대한 인간 LAG-3 단백질의 친화도의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%일 수 있다. 바람직하게는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3 단백질의 유도체의 친화도는 클래스 Ⅱ 분자에 대한 인간 LAG-3 단백질 친화도의 적어도 50%이다.
MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질의 적합한 유도체의 예에는 하기를 포함하는 유도체가 포함된다:
인간 LAG-3 서열의 아미노산 잔기 23 내지 448;
LAG-3의 도메인 D1 및 D2의 아미노산 서열;
하나 이상의 하기 위치에서 아미노산 치환을 갖는 LAG-3의 도메인 D1 및 D2의 아미노산 서열: 위치 73(여기서 ARG은 GLU로 치환됨); 위치 75(여기서 ARG은 ALA 또는 GLU로 치환됨); 위치 76(여기서 ARG은 GLU로 치환됨); 위치 30(여기서 ASP는 ALA로 치환됨); 위치 56(여기서 HIS는 ALA로 치환됨); 위치 77(여기서 TYR은 PHE로 치환됨); 위치 88(여기서 ARG는 ALA로 치환됨); 위치 103(여기서 ARG은 ALA로 치환됨); 위치 109(여기서 ASP은 GLU로 치환됨); 위치 115(여기서 ARG은 ALA로 치환됨);
아미노산 잔기 54 내지 66의 결실을 갖는 LAG-3의 도메인 D1의 아미노산 서열;
재조합 가용성 인간 LAG-3Ig 융합 단백질(IMP321) - 인간 IgG1 Fc에 융합된 hLAG-3의 세포외 도메인에 대해 인코딩하는 플라스미드로 전달감염된 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생성되는 200-kDa 이량체.
본 발명에 따르면, (a) MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체; (b) 항-종양제(여기서, 항-종양제는 백금계 항-종양제 또는 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제임); 및 (c) 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다.
본 발명에 따르면, 약제로서 이용하기 위한 본 발명의 조합 제조물, 또는 약학적 조성물이 추가로 제공된다.
본 발명은 또한 암의 예방, 치료 또는 완화를 위한 본 발명의 조합 제조물, 또는 약학적 조성물을 제공한다.
암의 예방, 치료 또는 완화를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 조합 제조물, 또는 약학적 조성의 용도가 본 발명에 따라 추가로 제공된다.
암의 예방, 치료 또는 완화 방법이 본 발명에 따라 또한 제공되며, 이러한 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항-종양제는 백금계 항-종양제 또는 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제이다.
LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 대상체에 순차적으로 투여될 수 있다, 즉 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 항-종양제 전에, 이와 함께, 또는 후에 투여될 수 있다.
LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 서로 96 시간, 72 시간, 48 시간, 24 시간, 또는 12 시간 내에 대상체에 투여될 수 있다.
대안적으로, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 대상체에, 예를 들어 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제를 포함하는 조성물로서, 또는 별도 용량의 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항종양제의 동시 투여에 의해 병용-투여될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 복수 용량의 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및/또는 복수 용량의 항-종양제가 대상체에 투여된다.
일부 구현예에 따르면, 하나의 용량의 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체가 2 개 이상 용량의 항종양제의 각각의 투여 전에, 이와 함께, 또는 후에 투여된다.
예를 들어, 하나의 용량의 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체가 2 개 이상 용량의 항-종양제의 각각의 투여의 96 시간, 72 시간, 48 시간, 24 시간, 또는 12 시간 내에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조합 치료법에서 이용되는 성분의 적절한 투여량의 선택은 숙련된 기술자에 의해, 예를 들어 환자의 전반적 건강 및 조합 치료법에 대한 반응을 포함하는 환자의 관찰에 의해, 결정되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 최적화는 환자가 원하는 치료 효과를 나타내고 있지 않는 것으로 또는 반대로 결정되는 경우, 환자가 수가 너무 많거나 문제가 있는 중증도의 바람직하지 못하거나 유해한 부작용을 겪고 있는 경우 필요할 수 있다.
본 발명에 따른 조합 치료법에서 이용되는 성분의 용량은 조합 내 성분의 치료 유효량을 제공하도록 선택되어야 한다. 조합 치료법의 "유효량"은 암에 연관된 적어도 하나의 병리적 파라미터의 감소를 일으키는 양이다. 예를 들어 일부 구현예에서, 조합 치료법의 유효량은 조합 치료법 없이 암에 연관된 파라미터에서 예상되는 감소에 비해 파라미터에서의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소를 달성하기 위해 유효한 양이다. 예를 들어, 파라미터는 종양 성장일 수 있다.
본 발명에 따르면, 조합 치료는 단일치료법으로서 항-종양제, 또는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체의 효과에 비해 항-종양제, 또는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체의 치료 효과를 증가시키기 위해, 또는 개별 성분의 원치 않거나 유해한 부작용의 위험을 방지하거나 추가로 감소시키면서 생성 조합에서 개별 성분의 용량을 감소시키기 위해 채용될 수 있다.
하나의 구현예에서, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 각각 단일치료법으로서 각각의 화합물에 대해 전형적으로 처방되는 용량 범위 내인 용량으로 처방된다. 화합물은 별도의 투여량 또는 조합 투여량으로서 처방될 수 있다. 이러한 조합은 단일치료법으로서 어느 하나의 화합물의 효과에 비해 증가된 유효성을 제공한다.
또 다른 구현예에서, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 각각 전형적으로 단일치료법으로서 각 성분에 대해 처방되는 용량 미만인 용량이지만 조합에서 치료 유효성을 가지는 용량으로 처방된다. 성분은 별도 투여량으로서 또는 조합 투여량으로서 처방될 수 있다. 조합 내 성분의 투여량은 단일치료법으로서 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 또는 항-종양제와 유사한 수준의 치료 유효성을 제공하도록, 그러나 단일치료법으로서 각각의 화합물의 처방되는 투여량에 비해 더 낮은 용량의 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제가 유해한 부작용의 위험을 감소시키는 장점을 가지고 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항-종양제의 처방된 투여량은 단일치료법에 대해 전형적으로 처방되는 용량 범위 내이며, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 단일치료법에 대해 전형적으로 처방되는 용량 미만인 투여량으로 처방된다.
추가 구현예에서, 항-종양제의 처방된 투여량은 단일치료법에 대해 전형적으로 처방되는 용량 미만이며, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 단일치료법에 대해 전형적으로 처방되는 용량 범위 내인 투여량으로 처방된다.
단일치료법에 대해 전형적으로 처방되는 용량 미만인 바람직한 투여량은 전형적으로 처방되는 용량의 최대 50% 또는 최대 25%인 용량이다.
별도 투여량으로 투여되는 경우, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 실질적으로 동시에(예를 들어, 서로 약 60 분, 약 50 분, 약 40 분, 약 30 분, 약 20 분, 약 10 분, 약 5 분, 또는 약 1 분 내에) 또는 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 72 시간, 또는 약 96 시간, 또는 그 초과만큼 시간이 분리되어 투여될 수 있다.
본 기술분야의 기술자는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제의 특정 조합에 따라, 순차적 투여를 위해 적합한 시간 경과를 결정하고 최적화할 수 있을 것이다. 시간 경과는 바람직하게는 적어도 하나의 유익한 효과, 예를 들어 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 또는 항-종양제의 효과 증강, 또는 조합 성분 효과의 상호 증강, 예를 들어 조합 성분 중 하나 또는 둘 다의 비-유효 투여량에 비해 부가 효과를 초과하는 효과, 추가적인 유리한 효과, 더 적은 부작용, 더 작은 독성, 또는 조합된 치료 효과, 및 매우 바람직하게는 조합 성분의 상승작용이 존재하도록 선택된다.
최적 시간 경과는 요인, 예컨대 투여 후 화합물의 피크 혈장 농도에 도달하는데 걸리는 시간 및 각 화합물의 제거 반감기에 의존할 것임이 이해될 것이다. 바람직하게는 시간 차이는 투여될 제1 성분의 반감기 미만이다.
본 기술분야의 기술자는 또한 투여를 위해 적절한 시간을 결정할 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 항-종양제는 오전에 투여될 수 있고, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 적어도 한 번이 그날 더 늦게 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 항-종양제 및 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 실질적으로 동시에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 항-종양제는 대상체에, 예를 들어 의료 진료인에 의해 투여될 수 있고, 대상체에는 이후에 투여하기 위한 하나의 용량의 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체가, 예를 들어 프리-필드 시린지에 제공될 수 있다(예를 들어 같은 날 더 늦게 또는 다음 날).
대상체는 수 주, 수 개월, 또는 수 년의 기간에 걸쳐 항-종양제 및 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체의 용량을 수여받을 수 있다. 예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 또는 그 초과.
바람직하게는 대상체는 포유류 대상체, 보다 바람직하게는 인간 대상체이다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 암의 예에는 유방암, 난소암, 폐암, 두부암, 경부암, 자궁내막암, 식도암, 방광암, 자궁경부암, 골 육종, 결장암, 결직장암, 림프종 및 중추 신경계 또는 생식 세포 종양이 포함된다.
일반적으로, 본 발명의 조합의 성분 또는 본 발명의 조성물은 공지된 수단에 의해, 임의의 적합한 제형으로, 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 비경구로 투여된다(피하, 정맥내 또는 근육내 주사 포함). 일부 구현예에서, 항-종양제는 정맥내 투여된다. 특정 구현예에서, LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 피하 투여되며, 항-종양제는 정맥내 투여된다.
적합한 약학적 조성물 및 투여량 형태는 약학적 제형 분야의 기술자에게 공지되고 관련 교과서 및 문헌, 예를 들어 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Easton, Pa.: Mack Publishing Co., 1995)]에 기재된 통상적 방법을 이용해서 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여량 형태로 본 발명의 조합 또는 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "단위 투여량 형태"는 치료될 개인에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적 개별 단위를 나타낸다. 즉, 조성물은 각각 필요한 약학적 담체와 연합되어 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 제제의 소정, "단위 투여량"의 양을 함유하는 개별 투여량 단위로 제형화된다. 본 발명의 단위 투여량 형태의 사양은 전달될 활성 제제의 독특한 특징에 의존한다. 투여량은 일반 용량 및 성분 투여 방식을 참조하여 추가로 결정될 수 있다. 일부 경우, 조합 내에 2 개 이상의 개별 투여량 단위가 치료 유효량의 활성 제제를 제공함이, 예를 들어 함께 취해진 2 개의 정제 또는 캡슐은 각각의 정제 또는 캡슐 내 단위 투여량이 치료 유효량의 약 50%이도록 하는 치료 유효 투여량을 제공할 수 있음이 주지되어야 한다.
비경구 투여를 위한 본 발명에 따른 제조물에는 멸균 수성 및 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 주사용 수용액은 수용성 형태로 활성 제제를 함유한다. 비수성 용매 또는 비히클의 예에는 지방 오일, 예컨대 올리브 오일 및 옥수수 오일, 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드, 저분자량 알코올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 합성 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 리포좀 등이 포함된다. 비경구 제형은 또한 어주번트, 예컨대 가용화제, 보존제, 수화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수 있고, 수성 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 및 덱스트란을 함유할 수 있다. 주사용 제형은 멸균제의 도입, 박테리아 보전 필터를 통한 여과, 조사 또는 열에 의해 멸균화될 수 있다. 이들은 또한 멸균 주사용 매질을 이용해서 제조될 수 있다. 활성 제제는 또한 건조, 예로 주사를 통한 투여 직전에 적합한 비히클로 재수화될 수 있는 형태로 동결건조될 수 있다.
전술된 제형에 부가하여, 활성 제제는 활성 제제의 제어 방출, 바람직하게는 연장된 시기에 걸친 지속 방출을 위한 데팟 제조물로 제형화될 수 있다. 이들 지속 방출 투여량 형태는 일반적으로 삽입에 의해 투여된다(예를 들어, 피하 또는 근육내 또는 근육내 주사에 의해).
본 발명의 조합 제조물은 조합에 대한 성분의 투여 설명서와 함께 패키지화될 수 있다. 설명서는 적합한 기록 매체 또는 기재 상에 기록될 수 있다. 예를 들어, 설명서는 기재, 예컨대 종이 또는 플라스틱 상에 인쇄될 수 있다. 설명서는 (즉, 패키지화 또는 서브-패키지화와 연관되어) 용기 또는 이들의 성분의 라벨링에 패키지 삽입물로 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 설명서는 적합한 컴퓨터로 읽을 수 있는 저장 매체, 예를 들어 CD-ROM, 디스켓 상에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로 존재한다. 조합 제조물의 일부 또는 전체 성분은 멸균성을 유지하기 위해 적합한 패키지에 패키지화될 수 있다.
본 발명의 구현예는 하기의 첨부 도면을 참조하여 아래의 실시예에 기재된다:
도 1은 암의 치료에서 LAG-3 유도체 및 토포테칸의 투여 효과를 나타낸다;
도 2는 암의 치료에서 LAG-3 유도체 및 카보플라틴의 투여 효과를 나타낸다;
도 3은 암의 치료에서 (A) LAG-3 유도체 및 카보플라틴, 또는 (B) LAG-3 유도체 및 옥살리플라틴의 투여 효과를 나타낸다;
도 4는 암의 치료에서 LAG-3 유도체 및 옥살리플라틴의 투여 효과를 나타낸다: (A)는 종양 크기에 대한 효과를 나타내며, (B)는 생존에 대한 효과를 나타낸다;
도 5는 면역글로불린 Fc(IgFc) 서열에 융합된 LAG-3 단백질의 유도체의 예시를 나타낸다;
도 6은 MHC 클래스 Ⅱ-양성 세포에 대한 LAG-3 유도체의 결합을 나타낸다;
도 7은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 차단하는 항체에 의한 MHC 클래스 Ⅱ-양성 세포에 대한 LAG-3 유도체의 결합 저해를 나타낸다;
도 8은 CCL4 분비에 의해 결정되는, LAG-3 유도체에 의한 THP-1 세포의 활성화를 나타낸다;
도 9는 TNF-α 분비에 의해 결정되는, LAG-3 유도체에 의한 THP-1 세포의 활성화를 나타낸다;
도 10은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 차단하는 항체에 의한 LAG 유도체-유도된 단핵구 활성화의 저해를 나타낸다;
도 11은 LAG-3 유도체에 의한 항원-제시 세포(APC)의 활성화를 나타낸다;
도 12는 LAG-3 유도체에 의한 CD8-양성 T 세포의 활성화를 나타낸다; 그리고
도 13은 성숙 인간 LAG-3 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 4 개의 세포외 Ig 수퍼패밀리 도메인은 아미노산 잔기: 1-149(D1); 150-239(D2); 240-330(D3); 및 331-412(D4)에 있다. 인간 LAG-3 단백질의 D1 도메인의 루프-외 구조의 아미노산 서열은 진한 글씨체로 밑줄쳐서 나타낸다.
실시예 1
암의 치료에서 LAG-3 유도체 및 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제의 투여 효과
쥐과 동계 피부 종양 모델을 결직장 선암종 세포주 CT26을 이용해서 확립하였다.
최소 발암 용량(MTD)의 1/4의 종양 세포(0.5×105 세포)를 0 일째에 4 개 군의 BALB/c 마우스(5 주령)의 우측 넙적다리에 피하(s.c.) 주사로 이식하였다. 마우스에 인산염 완충 식염수(PBS)(1 군 마우스), LAG-3 유도체 IMP321(2 군 마우스), IMP321 및 토포테칸(3 군 마우스), 또는 토포테칸 단독(4 군 마우스)을 하기 일정에 따라 주사하였다:
1 군(8 마리 마우스): 음성 대조군: D11, D14, D18, D21, D25 및 D28에 PBS s.c. 주사;
2 군(7 마리 마우스): D11, D14, D18, D21, D25 및 D28에 IMP321 s.c. 주사(50 ㎍, 1.9 ㎎/㎖);
3 군(8 마리 마우스): D11, D14, D18, D21, D25 및 D28에 IMP321 s.c. 주사(50 ㎍, 1.9 ㎎/㎖) + D10, D13 및 D17에 토포테칸 i.p. 주사(45 ㎍, 2.5 ㎎/㎏);
4 군(8 마리 마우스): D10, D13 및 D17에 토포테칸 i.p. 주사(45 ㎍, 2.5 ㎎/㎏).
종양 성장을 캘리퍼를 이용해서 2 개의 수직 종양 지름을 측정하여 1 주에 2 회씩 모니터링하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 종양 크기는 단면적 ㎟를 의미한다.
결과는 IMP321 단독이 종양 성장에 효과를 갖지 않았고 토포테칸이 종양 성장 감소에 일부 효과를 가졌지만, IMP321 및 토포테칸을 이용한 조합 치료가 더 큰(즉, 상승) 효과를 가짐을 나타낸다.
실시예 2
암의 치료에서 LAG-3 유도체 및 백금계 항-종양제의 투여 효과
쥐과 동계 피부 종양 모델을 림프종 세포주 EL4를 이용해서 확립하였다.
최소 발암 용량(MTD)의 종양 세포(5×105 세포)를 0 일째에 C57Bl/6 마우스(5 주령)의 우측 넙적다리에 s.c. 주사로 이식하였다. 마우스에 인산염 완충 식염수(PBS)(1 군 마우스), IMP321(2 군 마우스), IMP321 및 카보플라틴(3 군 마우스), 또는 카보플라틴 단독(4 군 마우스)을 하기 일정에 따라 주사하였다:
1 군(8 마리 마우스): 음성 대조군: D7, D11, D14, D19, D21 및 D24에 PBS s.c. 주사;
2 군(8 마리 마우스): D7, D11, D14, D19, D21 및 D24에 IMP321 s.c. 주사(50 ㎍, 3.96 ㎎/㎖);
3 군(8 마리 마우스): D7, D11, D14, D19, D21 및 D24에 IMP321 s.c. 주사(50 ㎍, 3.96 ㎎/㎖) + D6, D10, D13 및 D17에 카보플라틴 i.p. 주사(288 ㎍, 16 ㎎/㎏);
4 군(8 마리 마우스): D6, D10, D13 및 D17에 카보플라틴 i.p. 주사(288 ㎍, 16 ㎎/㎏).
종양 성장을 캘리퍼를 이용해서 2 개의 수직 종양 지름을 측정하여 1 주에 2 회씩 모니터링하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 종양 크기는 단면적 ㎟를 의미한다.
결과는 IMP321 단독이 종양 성장에 효과를 갖지 않았고 카보플라틴 단독이 효과가 있더라도 거의 없다시피하였고, IMP321 및 카보플라틴을 이용한 조합 치료는 종양 성장을 감소시켜서 조합 투여의 상승 효과를 실증함을 나타낸다.
실시예 3
암의 치료에서 LAG-3 유도체 및 상이한 백금계 항-종양제의 투여 효과
쥐과 동계 피부 종양 모델을 림프종 세포주 EL4를 이용해서 확립하였다.
최소 발암 용량(MTD)의 종양 세포(5×105 세포)를 0 일째에 C57Bl/6 마우스(5 주령)의 우측 넙적다리에 s.c. 주사로 이식하였다. 마우스에 인산염 완충 식염수(PBS)(1 군 마우스), IMP321(2 군 마우스), IMP321 및 카보플라틴(3 군 마우스), 카보플라틴 단독(4 군 마우스), IMP321 및 옥살리플라틴(5 군 마우스), 또는 옥살리플라틴 단독(6 군 마우스)을 하기 일정에 따라 주사하였다:
1 군(10 마리 마우스): 음성 대조군: D7, D11, D14, D18, D21 및 D25에 PBS s.c. 주사;
2 군(10 마리 마우스): D7, D11, D14, D18, D21 및 D25에 IMP321 s.c. 주사(50 ㎍, 1.9 ㎎/㎖);
3 군(9 마리 마우스): D7, D11, D14, D18, D21 및 D25에 IMP321 s.c. 주사(50 ㎍, 1.9 ㎎/㎖) + D6, D10, D13 및 D17에 카보플라틴 i.p. 주사(288 ㎍, 16 ㎎/㎏);
4 군(10 마리 마우스): D6, D10, D13 및 D17에 카보플라틴 i.p. 주사(288 ㎍, 16 ㎎/㎏);
5 군(10 마리 마우스): D7, D11, D14, D18, D21 및 D25에 IMP321 s.c. 주사(50 ㎍, 1.9 ㎎/㎖) + D6 및 D10에 옥살리플라틴 i.p. 주사(54 ㎍, 3 ㎎/㎏);
6 군(10 마리 마우스): D6 및 D10에 옥살리플라틴 i.p. 주사(54 ㎍, 3 ㎎/㎏).
종양 성장을 캘리퍼를 이용해서 2 개의 수직 종양 지름을 측정하여 1 주에 2 회씩 모니터링하였다. 결과를 도 3의 A(카보플라틴에 대해) 및 도 3의 B(옥살리플라틴에 대해)에 나타낸다. 종양 크기는 단면적 ㎟를 의미한다.
결과는 IMP321 단독이 효과가 있더라도 거의 없다시피 하였고, 카보플라틴 단독이 일부 효과를 가졌으며, IMP321 및 카보플라틴을 이용한 조합 치료는 더 큰(즉 상승) 효과를 가졌음을 나타낸다. 옥살리플라틴 단독은 효과를 가졌지만, IMP321 및 옥살리플라틴을 이용한 조합 치료가 더 큰(즉 상승) 효과를 가졌고, 종양 성장이 17 일째에 완전 저해되었다.
실시예 4
암의 치료에서 LAG-3 유도체 및 백금계 항-종양제의 투여 효과
C38 결장 선암종 종양 모델에서 LAG-3 유도체 IMP321(hLAG-3Ig로도 불림) 및 옥살리플라틴을 이용한 조합 치료 효과를 평가하였다. 상기 모델에서, 종양 단편을 수술로 피하 이식하였다. 치료가 시작될 때(평균 종양 부피가 200 ㎣인 12 일째에), 종양이 상대적으로 성숙하여 실제 종양의 우수한 모델을 제공한다.
마우스 결장 38(C38) 종양 단편을 Division of Cancer Treatment, Tumor Repository, NCI(Frederick, MD, USA)에서 냉동 입수하였다. C38 단편을 사용 시까지 액체 질소에서 DMSO/SVF/RPMI 1640 배지(10/10/80) 중에 냉동 보관하였다. 단편을 5 분 동안 37℃에서 해동하고, RPMI 1640 배지 중에 2 회 헹군 뒤 마우스에 피하(SC) 이식하였다. C38 종양을 C57Bl/6 마우스에 연속 이식하였다.
작은 C38 종양 단편(20-30 ㎎)을 12 마리 C57BL/6 마우스의 우측 넙적다리에 피하 이식하였다. 종양 크기가 500-1000 ㎣에 도달하면, 종양을 수술로 절제하고, 작은 C38 종양 단편(20-30 ㎎)을 수신체 C57BL/6 마우스의 우측 넙적다리에 피하 이식하였다.
종양이 평균 부피 200-300 ㎣에 도달했을 때 치료를 시작하였다. 치료 일정은 하기와 같았다:
1 군(10 마리 마우스): 연속 4 주 동안 PBS로 주 1 회 SC 주사;
2 군(10 마리 마우스): 연속 4 주 동안 5 ㎎/㎏/inj로 옥살리플라틴을 주 1 회 IV 주사;
3 군(10 마리 마우스): 연속 4 주 동안 20 ㎍ IMP321로 주 1 회 SC 주사;
4 군(10 마리 마우스): 연속 4 주 동안 20 ㎍ IMP321의 주 1 회 SC 주사와 조합된 5 ㎎/㎏/inj 옥살리플라틴의 주 1 회 IV 주사.
상이한 군들이 200 ㎣의 평균 종양 부피를 가졌을 때인 12 일째(D12)에 치료를 시작하였다. PBS 또는 옥살리플라틴을 D12, D19, D26 및 D33에 주사하였다. IMP321은 옥살리플라틴 다음 날, 즉 D13, D20, 27 및 D34에 주사하였다. 피하 종양이 2,000 ㎣의 최대 부피에 도달했을 때 동물을 사망시켰다.
군 치료 용량 투여 경로 투여 일정
1 PBS - SC Q7D×4
2 옥살리플라틴 5 ㎎/㎏/inj IV Q7D×4
3 IMP321 20 ㎍/마우스/inj SC Q7D×4*
4 옥살리플라틴 5 ㎎/㎏/inj IV Q7D×4
IMP321 20 ㎍/마우스/inj SC Q7D×4*
*옥살리플라틴을 이용한 치료 다음 날 수행함
결과를 도 4의 A에 나타낸다. 결과는 IMP321 단독이 종양 성장 지연에 효과를 갖지 않았음을 나타낸다. 옥살리플라틴은 약간의 효과를 가졌다. 옥살리플라틴 및 IMP321의 조합은 더 큰 효과를 가졌다. 동일한 상승 효과가 도 4의 B에 나타낸 생존 곡선에서 나타난다.
실시예 5
MHC 클래스 Ⅱ-양성 세포에 대한 LAG-3 유도체의 결합
LAG-3의 몇몇 유도체를 MHC 클래스 Ⅱ-양성 세포에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다:
i) 제1 링커에 의해 면역글로불린 Fc(Ig Fc) 서열에 연결된 LAG-3의 도메인 D1-D4(LAG-3 D1D4-링커1-Ig, sLAG-3 D1D4-Ig, 또는 IMP321);
ii) 제2 링커에 의해 Ig Fc 서열에 연결된 LAG-3의 도메인 D1-D4(LAG-3 D1D4-링커2-Ig, 또는 sLAG-3 D1D4-링커B-Ig);
iii) 제2 링커에 의해 Ig Fc 서열에 연결된 LAG-3의 도메인 D1 및 D2(LAG-3 D1D2-링커2-Ig, 또는 sLAG-3 D1D2-링커B-Ig); 및
iv) 제1 링커에 의해 Ig Fc 서열에 연결된, 그러나 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 결합을 3-배 이상 증강시키는 위치 R75(R75A)에서 LAG-3의 도메인 D1 도메인의 MHC 클래스 Ⅱ 결합 부위 내 돌연변이를 갖는, LAG-3의 도메인 D1-D4(Huard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:5744)(IMP321 R75A).
유도체를 도 5에 예시한다.
MHC 클래스 Ⅱ+ Raji 세포를 다양한 농도의 LAG-3 유도체와, 또는 음성 대조군으로서 인간 IgG1 항체(hIgG1)와 4℃에서 45 분 동안 인큐베이션하였다. 세포 표면에 결합된 LAG-3 분자를 FITC-접합된 염소 항-마우스 Ig(Coulter)로 드러내었다. 세포를 유세포 측정으로 분석하였다. 형광 세기 단위로 표현되는 결과를 도 6에 나타낸다. 결과는 모든 LAG-3 유도체가 MHC 클래스 Ⅱ-양성 세포에 결합하였음을 나타낸다.
실시예 6
MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 차단하는 항체에 의한 MHC 클래스 Ⅱ-양성 세포에 대한 LAG-3 유도체 IMP321의 결합 저해
17B4 및 11E3은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 차단하는 것으로 알려져 있는 항-LAG-3 모노클로날 항체이다. MHC 클래스 Ⅱ-양성 B 세포(Raji 세포)에 대한 IMP321-표지 콘주게이트(LAG-3Ig-Alexa 488)의 결합을 17B4 또는 11E3 차단 항체, 또는 이소형-매칭된 음성 대조군 모노클로날 항체(mIgG1)와 콘주게이트(4℃에서 4 ㎍/㎖)의 사전-인큐베이션 후에 결정하였다. 세포-결합 형광의 분석을 형광-활성화 세포 정렬(FACS)을 이용해서 수행하였다. 결과를 도 7에 나타낸다.
결과는 Raji 세포에 대한 IMP321의 결합이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 차단하는 LAG-3-특이적 모노클로날 항체에 의해 저해되었음을 나타낸다.
실시예 7
LAG-3 유도체에 의한 단핵구의 활성화
THP-1 세포를 도 5에 예시된 LAG-3 유도체, 또는 음성 대조군으로 인간 IgG1과 함께 4℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 케모카인 CCL4, 및 사이토카인 종양 괴사 인자-α, TNF-α의 THP-1 세포에 의한 분비량을 결정하였고, 단핵구 활성화의 척도로 이용하였다. CCL4 및 TNF-α 분비를 세포측정 비드 어레이를 이용해서 세포 상청액 중에 정량하였다. CCL4 결정 결과를 도 8에 나타내고, TNF-α 결정 결과를 도 9에 나타낸다.
결과는 LAG-3 유도체가 모두 THP-1 단핵구를 활성화할 수 있었음을 나타낸다.
실시예 8
MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 차단하는 항체에 의한 IMP321 -유도된 단핵구의 활성화 저해
IMP321(20 ng/㎖)을 17B4 또는 11E3 항체와 사전 인큐베이션한 후(+37℃에서) 혼합물을 4 시간 동안 THP-1 세포와 인큐베이션하였다. THP-1 세포에 의한 CCL4 분비량을 이용해서 단핵구 활성화 수준을 결정하였다. 두 실험 결과를 도 10에 나타낸다.
결과는 IMP321-유도된 단핵구 활성화가 차단 항-LAG-3 mAb 17B4 및 11E3에 의해 저해됨을 실증한다. 이는 IMP321이 단핵구를 활성화하는 능력이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 IMP321의 결합에 의존함을 시사한다.
실시예 9
LAG-3 유도체에 의한 일차 항원-제시 세포(APC)의 활성화
인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 도 5에 예시된 LAG-3 유도체, 또는 음성 대조군으로 인간 IgG1과 함께 분비 저해제인 브레펠딘의 존재 하에 4 시간 동안 인큐베이션하였다. PBMC에 존재하는 APC의 사이토카인 반응을 Th1 및 CD8-양성 반응을 선호하는 것으로 알려져 있는 케모카인, CCL4 및/또는 종양형성을 직접 저해하는 다기능 사이토카인, TNF-α의 세포내 염색으로 결정하였다. 결과를 세포측정으로 분석하였다. MHC 클래스 Ⅱ-양성 세포에서 CCL4 및/또는 TNF-α를 발현하는 세포 백분율로 나타낸 결과를 도 11에 나타낸다.
결과는 시험한 모든 LAG-3 유도체가 CCL4 및 TNF-α 생산을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 10
LAG-3 유도체에 의한 T 세포의 활성화
인간 PBMC를 도 5에 예시된 LAG-3 유도체, 또는 음성 대조군으로 인간 IgG1과 함께 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 마지막 16 시간 동안 브레펠딘이 존재하였다. LAG-3 유도체에 대한 18 시간 노출 후 CD8-양성 T 세포의 사이토카인 반응에 이어 CCL4, IFN-γ 및 TNF-α를 세포내 염색한 후 세포측정으로 분석하였다. CD3-양성/CD8-양성 T 세포에서 CCL4, IFN-γ 및/또는 TNF-α를 발현하는 세포 백분율로 나타낸 결과를 도 12에 나타낸다.
결과는 시험한 모든 LAG-3 유도체가 1 형 세포독성 CD8-양성 T 세포(Tc1 세포)의 활성화를 유도하였음을 나타낸다. APC에 의해 발현되는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 결합을 통해, LAG-3 유도체가 Tc1 세포의 활성화를 유도하였다고 결론지워진다. Tc1 세포의 활성화는 주요 항-종양 면역 반응을 형성한다.
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Claims (29)

  1. (a) MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체; 및 (b) 항-종양제를 포함하는 조합 제조물로서, 상기 항-종양제는 백금계 항-종양제 또는 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제인 조합 제조물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제의 병용-투여 또는 순차적 투여를 위한 조합 제조물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 상기 항-종양제로부터 분리되는 조합 제조물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 0.25-30 ㎎의 LAG-3Ig 융합 단백질 IMP321의 몰 당량인 용량으로 존재하는 조합 제조물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    복수 용량의 상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체를 포함하는 조합 제조물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    복수 용량의 상기 항-종양제를 포함하는 조합 제조물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백금계 항-종양제는 옥살리플라틴 또는 카보플라틴을 포함하는 조합 제조물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제는 토포테칸을 포함하는 조합 제조물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, 및 선택적으로는 도메인 D2와 적어도 70% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조합 제조물.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, D2, D3, 및 선택적으로는 D4와 적어도 70% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조합 제조물.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질의 유도체는 면역글로불린 Fc 서열과 융합되는 조합 제조물.
  12. (a) MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체; (b) 항-종양제; 및 (c) 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 항-종양제는 백금계 항-종양제 또는 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제인 약학적 조성물.
  13. 약제로서 이용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 조합 제조물, 또는 청구항 12에 따른 약학적 조성물.
  14. 암의 예방, 치료 또는 완화를 위한 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 조합 제조물, 또는 청구항 12에 따른 약학적 조성물.
  15. 암의 예방, 치료 또는 완화를 위한 약제의 제조에서 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 조합 제조물, 또는 청구항 12에 따른 약학적 조성물의 용도.
  16. MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제를 암의 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방, 치료 또는 완화 방법으로서, 상기 항-종양제는 백금계 항-종양제 또는 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 상기 대상체에 순차적으로 투여되는 방법.
  18. 청구항 16에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 상기 항-종양제 후에 투여되는 방법.
  19. 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 서로 96 시간 내에 상기 대상체에 투여되는 방법.
  20. 청구항 16에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체, 및 항-종양제는 상기 대상체에 병용-투여되는 방법.
  21. 청구항 16 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체는 0.25-30 ㎎의 LAG-3Ig 융합 단백질 IMP321의 몰 당량인 용량으로 상기 대상체에 투여되는 방법.
  22. 청구항 16 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    복수 용량의 상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체가 상기 대상체에 투여되는 방법.
  23. 청구항 16 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    복수 용량의 상기 항-종양제가 상기 대상체에 투여되는 방법.
  24. 청구항 22 또는 청구항 23에 있어서,
    하나의 용량의 상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 유도체가 2 개 이상 용량의 상기 항-종양제의 각각의 투여 전에, 이와 함께, 또는 후에 투여되는 방법.
  25. 청구항 16 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백금계 항종양제는 옥살리플라틴 또는 카보플라틴을 포함하는 방법.
  26. 청구항 16 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 토포아이소머라아제 Ⅰ 저해제는 토포테칸을 포함하는 방법.
  27. 청구항 16 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, 및 선택적으로는 도메인 D2와 적어도 70% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  28. 청구항 16 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, D2, D3, 및 선택적으로는 D4와 적어도 70% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  29. 청구항 16 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질의 유도체는 면역글로불린 Fc 서열에 융합되는 방법.
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