KR20160088318A - 항체 선택 장치 및 방법 - Google Patents

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Abstract

항체를 선택하기 위한 장치, 시스템, 컴퓨터 판독가능 매체, 제조품 및 방법. 선택된 항체를 생산하기 위한 장치, 시스템, 컴퓨터 판독가능 매체, 제조품 및 방법. 선택은 항체의 하나 이상의 물리화학적 특징을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 결정은 항체 구조적 파라미터에 기반할 수 있다.

Description

항체 선택 장치 및 방법{ANTIBODY SELECTION APPARATUS AND METHODS}
다른 관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그 내용 전부가 본원에 참고로 포함된, 2013년 11월 29일 출원된 미국 특허 가출원 61/910,200에 관한 것이고, 이를 기초로 한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 개시내용의 측면은 하나 이상의 바람직한 특성, 특히 치료제를 위한 바람직한 특성을 갖는 항체를 선택하기 위한, 및 항체 또는 항체를 포함하는 치료제의 제조를 위한 장치, 시스템, 컴퓨터 판독가능 매체, 제조품 및 방법에 관한 것이다.
모노클로날 항체 ("모노클로날 Ab" 또는 "mAb")는 암, 자가면역 장애 및 감염을 포함한 다양한 질환의 치료를 위한 중요한 클래스의 치료제로서 계속 떠오르고 있다. 사용 용이성, 환자 편의성 및 보다 적은 투여 빈도를 위해, 그의 저장 수명 (대개 2년) 동안 안정하고 치료 mAb 자체가 정상 클리어런스 및 혈장 반감기 (대개 3주)를 갖는 수성 약제의 개발이 바람직하다.
특정 만성 질병, 예를 들어, 류마티스 관절염의 치료를 위해 의도된 mAb-기반 치료를 위해, 프리필드 시린지 (prefilled syringe)/오토-인젝터 (auto-injector)와 같은 장치를 사용하는 피하 경로를 통한 전달이 환자의 가정에서 사용/자가-투여 및 순응도를 위해 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Eisenstein, M. Something new under the skin. Nat Biotech 29, 107-109 (2011)] 참조). 몇몇 mAb 제품, 예를 들어, 애보트 (Abbott)의 휴미라(Humira)®, 및 센터코 (Centocor)의 심퍼니(Simponi)® 등이 가정에서 사용을 위한 장치 내에 상업적으로 이용가능하고, 몇몇은 현재 임상 시험에서 평가받고 있다. 장치를 사용하여 적은 부피 (~1 mL) 내에서 수백 밀리그램의 활성 약물을 전달하기 위해, 고농도의 mAb를 함유하는 액체 제제가 요구된다 (예를 들어, 문헌 [Eisenstein, M. Something new under the skin. Nat Biotech 29, 107-109 (2011)]; [Shire, S.J., Shahrokh, Z. & Liu, J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 93, 1390-1402 (2004)] 참조). 보다 고점도 용액은 제조 및 투여가 어렵고, 보다 큰 게이지 (gauge)의 바늘 및 수반된 힘이 필요하기 때문에 주사가 통증을 유발할 수 있으므로, 상기한 전달 시스템에서는 용액이 저점도인 것을 필요로 한다 (예를 들어, 문헌 [Shire, S.J., Shahrokh, Z. & Liu, J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 93, 1390-1402 (2004)] 참조). 또한, 항체는 충분한 저장 수명을 얻기 위해 안전성을 유지하면서, 효능을 잃지 않으면서 용액 내에서 안정하게 유지되는 (최소의 화학적 또는 물리적 분해) 것이 필요하다. 추가로, 필수적인 저부피 피하 투여 경로에서 용량당 다수 주사 또는 보다 빈번한 투여를 피하기 위해, 충분한 생체이용률을 갖고 또한 긴 혈장 반감기와 연관된 정상 클리어런스 프로파일을 보이는 mAb 후보물질을 개발하는 것이 유리하다 (예를 들어, 문헌 [Wang, W., Wang, E.Q. & Balthasar, J.P. Monoclonal Antibody Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Clin Pharmacol Ther 84, 548-558 (2008)]; [Zheng, Y. et al. Minipig as a potential translatable model for monoclonal antibody pharmacokinetics after intravenous and subcutaneous administration. mAbs 4, 243-255] 참조; 또한 [Chennamsetty, N., Voynov, V., Kayser, V., Helk, B. & Trout, B.L. Design of therapeutic proteins with enhanced stability. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 11937-11942 (2009)] 참조). 따라서, 바람직한 특성을 갖는 Ab의 예측을 용이하게 하는 방법 또는 장치가 필요하다.
발명의 개요
항체 선택 및 제조를 돕는 신규한 장치 및 방법에 관한 측면 및 실시양태를 본원에서 제공한다. 규정된 농도에서 mAb 용액의 점도, 생체내, 예컨대 시노몰거스 (Cyno) 원숭이 내에서 클리어런스율, 트립토판 (Trp) 산화 및 아스파르트산 (Asp) 이성질체화를 최적 제조가능성, 개발, 주사가능성, 저장 수명 및 약동학적 거동을 위한, 및 따라서 약물 전달, 효능 및 환자의 사용 용이성을 가능하게 하는 중요한 예시적인 mAb 특성으로서 연구하였다. 분자 동역학 (MD) 시뮬레이션을 통해 본 발명에 의해 확인된 구조적 파라미터를 이용하여, mAb의 바람직한 속성을 합리적으로 잘 예측하고 최종 선택을 위한 mAb 후보물질을 위험도-순위결정할 (risk-rank) 수 있음이 본원에서 나타났다.
본원에서 설명될 때, Ab 아미노산 서열로부터 추출된 특성 ("서열 추출 특성", "서열-기반 특성", "구조적 파라미터" 또는 "서열-기반 구조적 파라미터"), 예컨대 전하, 전하 비대칭, 및 소수성은, 다변량 분석 도구 (tool)와 함께, 다양한 점도-농도 프로파일의 mAb 사이, 정상 클리어런스 및 신속한 클리어런스 값을 갖는 mAb 사이, 및 예컨대 Trp 산화 및 Asp 이성질체화에 관하여 바람직한 및 바람직하지 않은 안정성의 mAb 사이를 구별하기 위해 충분하다. 점도, 클리어런스 및 안정성에 기여하는 분자간 및 분자내 상호작용이 3차원 구조 및 연관된 동역학을 포함하지만, 본원에서 설명되는 서열-기반 구조적 파라미터는 점도, 클리어런스율 및 안정성과 같은 Ab 특성을 충분하게 결정하거나 예측할 수 있다는 사실은 본 발명의 작업의 예기치 않은 결과이다. 추가로, 서열-기반 구조적 파라미터가 다수의 Ab, 특히 동일한 클래스 내의 Ab 사이에서 Ab 특성을 충분하게 예측하고 구별할 수 있다는 사실은 본 발명의 작업의 예기치 않은 결과이다.
Trp 산화 또는 Asp 이성질체화와 같은 부위-특이적 특성에 대해, 국소 동역학 및 입체배위 속성이 중요한 역할을 하는 것으로 보이고; 따라서 구조-기반 MD 분석이 요구될 수 있다. 구조적 MD를 모델링하는 컴퓨터를 이용한 인-실리코 (in-silico) 도구의 포함은 습식 (wet) 방안 및 다른 실험적 방안에 비해 최소의 시간 및 자원을 소모하면서 매우 많은 후보물질의 스크리닝을 가능하게 할 수 있고, 따라서 항체 후보물질 선택에서 효율을 증가시킬 수 있다. MD 시뮬레이션을 이용하는 분자 운동의 주의깊은 분석을 통해 및 관련 구조적 특성의 추출을 통해, Ab-함유 치료제의 저장 수명에 관련된 반응성 및 비-반응성 부위 사이를 구별할 수 있음을 본 발명에서 나타낸다. 반응 메카니즘에 따라, 상이한 세트의 파라미터를 평가하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, Trp 산화에 대해, Trp 잔기 (측쇄)의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적 (SASA)이 반응성 및 비-반응성 부위 사이를 구별하기 위해 충분하였지만; Asp 이성질체화 부위 사이를 구별하기 위해 다변량 분석과 함께 추가의 구조적 파라미터가 요구되었다. 본 발명은 바람직한 개발 속성을 갖는 선도 (lead) 후보물질을 선택하기 위해 mAb에 대해 인-실리코 서열-기반 구조 분석을 수행할 수 있음을 보여준다. 상기 능력은 신규한 mAb-기반 치료제를 효율적으로 임상 개발에 이르게하고 궁극적으로 환자에게 이익이 되도록 하는 기술 성공의 가능성을 개선할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 본원에서 설명되는 방법에 의해 특정 설계 기준을 충족하도록 선택되고/되거나, 생산되고/되거나 결정된 항체를 제공한다.
도 1a 및 b는 높은 이온 강도 (IS)에서 10개의 mAb (도 1a) 및 낮은 IS에서 10개의 부분적으로 겹치는 mAb (도 1b)의 결과로부터 점도 예측을 위한 주성분 회귀 분석에 대한 파라미터의 표이다.
도 2는 13개의 mAb의 훈련 세트 (training set)에 대한 Cyno 원숭이에서 클리어런스 값 및 계산된 서열-기반 구조적 파라미터의 표이다. 표 컬럼 HI 합계, Fv 전하 pH 5.5 및 클리어런스에서 음영은 각각 도 3의 표 컬럼 HI 합계 값, 전하 및 클리어런스의 범위에 상응한다. 도 2 표 항목의 우측 슬래시 (forward-slash) 음영은 항목의 값이 도 3의 상부 열의 값에 제공된 범위 내에 놓인다는 것을 지시한다. 도 2 표 항목의 좌측 역슬래시 (back-slash) 음영은 항목의 값이 도 3의 하부 열의 값에 제공된 범위 내에 놓인다는 것을 지시한다.
도 3은 Cyno 원숭이에서 신속한 클리어런스와 정상 클리어런스 사이를 구별하기 위해 도 2에 제시된 13개의 mAb의 훈련 세트에 기반한 배정된 기준의 표이다.
도 4는 도 3에 열거된 기준에 기반한 45개 mAb의 세트 상에서 실험적 클리어런스 대 예측된 클리어런스 배정의 표이고, 여기서 도 4의 표 컬럼 CI는 도 2의 표 컬럼 클리어런스에 대응하고, 도 4의 음영은 도 2에서와 같고 도 4의 실험적 및 예측된 배정 컬럼으로 확장시켰다.
도 5는 13개의 mAb의 훈련 세트 내의 중쇄 (HC) 또는 경쇄 (LC)를 따라 다양한 잔기 수 (Resnum)의 Trp에 대한 Trp 측쇄 SASA을 이용하는 Trp 산화 핫 스팟 (Hot Spot) 예측의 표이다. (다른 표 컬럼 표제에 대해서는 아래의 상세한 설명 참조). 표 항목의 우측 슬래시 음영은 항목의 값이 목적하는 범위 내에 놓임을 나타낸다. 표 항목의 좌측 역슬래시 음영은 항목의 값이 목적하는 범위 밖에 놓임을 나타낸다.
도 6은 훈련 세트의 일부의 mAb의 HC 및 LC을 따라 다양한 위치 "n"에서 Asp 잔기 (표 컬럼 Asp에 제공된), 및 n+1에서 잔기 (표 컬럼 Seq (N+1) 잔기에 제공된)의 MD 시뮬레이션으로부터 추출된 분자 특성의 표이다. 특성은 Asp의 SASA (SASA_Asp), Asp α-탄소 요동 (fluctuation)의 평균 제곱근 (RMSF), n+1에서 잔기의 SASA (SASA(N+1,N)), 및 한 개의 유효 숫자 (2진수 (Binary))로 반올림한 측정된 및 예측된 값을 포함한다. (다른 표 컬럼 표제에 대해서는 아래의 상세한 설명 참조). 표 항목의 우측 슬래시 음영은 항목의 값이 목적하는 범위 내에 놓임을 나타낸다. 표 항목의 좌측 역슬래시 음영은 항목의 값이 목적하는 범위 밖에 놓임을 나타낸다.
도 7은 pH 5.5에서 높은 이온 강도 (200 mM 아르기닌 HCl) 완충된 용액 내에서 몇몇 mAb의 점도-농도 프로파일을 보여준다. 특유한 형상의 데이터 점의 각각의 세트는 특정 mAb에 대응하는 실험 데이터를 나타낸다. 프로파일 도표 선은 다음 형태의 식을 이용하여 생성하였다: y=a+beCX, 식에서, y 축은 점도 (센티푸아즈, cP)이고, x 축은 단백질 농도 (mg/mL)이다.
도 8a-8c는 아래 실시예 섹션에 설명된 바와 같이 계산된 몇몇 mAb에 대한 서열-기반 파라미터의 분석을 보여준다: 도 8a는 pH 5.5에서 Fv 전하를 나타내고; 도 8b는 pH 5.5에서 Fv 전하 비대칭 파라미터 (FvCAP)를 나타내고; 도 8c는 소수성 (또는 소수성 지수, HI)을 나타낸다. 전하는 도 8a에 대해 전체 가변 단편 (Fv) 서열을 이용하여, 및 도 8b에 대해 FvCAP의 계산을 위해 중쇄 가변 (VH) 도메인 서열 및 경쇄 가변 (VL) 도메인 서열을 이용하여 계산하였다. HI는 도 8c에 대해 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 조성을 이용하여 계산하였다.
도 9a-9c는 로그 점도와 계산된 서열-기반 구조적 파라미터의 상관성의 도표이다: 파라미터는 도 9a에서 소수성이고; 도 9b에서 pH 5.5에서의 Fv 전하이고; 도 9c에서 pH 5.5에서의 FvCAP이다. 점도 값은 pH 5.5에서 20 mM 완충제 농도에서 낮은 이온 강도의 완충된 용액 내에서 얻었다.
도 10a-10c는 로그 점도와 계산된 서열-기반 구조적 파라미터와의 상관성의 도표이다: 파라미터는 도 10a에서 소수성이고; 도 10b에서 pH 5.5에서의 Fv 전하이고; 도 10c에서 pH 5.5에서의 FvCAP이다. 점도 값은 pH 5.5에서 200 mM 아르기닌 HCl 완충제 농도에서 높은 이온 강도의 완충된 용액 내에서 얻었다.
도 11a-e는 다양한 조건 하에 다양한 상이한 mAb에 대한 실험에 의해 관찰된 점도 값에 비해 예측된 점도 값을 보여주는 주성분 회귀 (PCR) 분석 도표를 보여준다: 도 11a, 11b 및 11e는 10개의 상이한 mAb의 세트의 PCR 분석을 보여준다. 도 11c 및 11d는 14개의 상이한 mAb의 세트의 PCR 분석을 보여준다. 도 11a, 11b, 11c 및 11d에 제시된 결과는 높은 이온 강도 완충제 용액 상태 하에 얻어졌다. 도 11e에 제시된 결과는 낮은 이온 강도 완충제 용액 상태 하에 얻어졌다. 도 11a 및 11e는 150 mg/mL의 mAb 농도에서 도표이다. 도 11b, 11c 및 11d는 180 mg/mL의 mAb 농도에서 도표이다. 예측된 점도 값은 PCR 분석으로부터 출력 값이고, 150 mg/mL 및 180 mg/mL의 mAb에 대해 아래 실시예 섹션에 기재된 식에 의해 설명된다. 각각의 데이터 점은 mAb를 나타내고, 곡선은 존재하는 경우에 90% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 12a-12d는 그들의 각각의 실험 데이터에 비교할 때 4가지 mAb (a-d)의 예측된 점도-농도 프로파일을 보여준다. 데이터 점은 높은 이온 강도의 완충된 용액 (200 mM 아르기닌 HCl을 함유한 pH 5.5에서 20 mM 완충된 용액) 내에서 실험에 의해 결정된 점도 값을 나타낸다. 선은 예측된 값에 대한 최적화된 피트 (optimized fit)를 나타낸다. 예측된 값은 150 mg/mL 및 180 mg/mL의 mAb 농도에 대해 실시예 섹션에 설명된 바와 같은 식을 이용하여 얻었다. 선은 다음 형태의 식을 이용하여 생성하였다: y=a+beCX, 식에서, y는 점도이고, x는 단백질 농도이다. 상기 식 형태는 실험 데이터를 몇몇 mAb에 대해 200 mg/mL (데이터를 제시하지 않음) 및 200 cP만큼 높은 점도 값까지 피팅하기 위해 사용되었다. 피트는 150 mg/mL, 180 mg/mL에서 예측된 값, 및 25 mg/mL 단백질 농도에 대해 1.2의 점도 값을 이용하여 생성하였다.
도 13a 및 13b는 Cyno 원숭이에서 항체 클리어런스 및 계산된 항체 파라미터 사이의 관계를 보여준다: 도 13a는 Cyno 원숭이에서 항체 클리어런스 및 계산된 항체 등전점 (대수 형태로, pI) 사이의 관계를 보여주고; 도 13b는 Cyno 원숭이에서 항체 클리어런스 및 mAb CDR H1 서열을 이용하여 계산된 소수성 지수 사이의 관계를 보여준다.
도 14a-e는 불안정한 (labile) (좌측 역슬래시 음영, 각각의 도면의 좌측 상에) 대 안정한 Asp 잔기 (우측 슬래시 음영, 각각의 도면의 우측 상에)에 대한 MD 시뮬레이션으로부터 추출된 다양한 특성의 평균값 및 표준 편차의 비교를 보여준다. 각각의 도표는 평균값 및 표준 편차를 포함한다. 계산된 p-값을 각각의 도표 상에 제시한다. RMSF, Asp SASA 및 SASA (N+1, N)는 모두 불안정한 잔기 및 안정한 잔기 사이에 유의한 차이 (80% 신뢰 구간 (CI))를 나타낸다. 잔기내 상호 정보 (MI) 및 샤논 (Shannon) 엔트로피 특성은 안정한 잔기 대 불안정한 잔기의 평균 사이에 유의하게 상이하지 않다.
도 15a-15c는 (A) 6.5 (도 15a에 제시된); (B) 7.5 (도 15b에 제시된); 및 (C) 9.2 (도 15c에 제시된)의 Fab pI의 3가지 상이한 mAb의 항원-결합 단편 (Fab) 도메인의 서열-기반 및 구조-기반 전하-pH 프로파일의 비교를 보여준다. 서열-기반 전하-pH 프로파일은 아래의 예시적인 방법 섹션에 설명된 바와 같이 계산하였다. 구조-기반 전하-pH 프로파일은 실험적 방법, PROPKA, 및 Fab 구조를 이용하여 계산하였다. 각각의 하전된 아미노산 측쇄의 개별 회합 상수 (대수 형태로, pKa)를 얻고, 핸더슨-하셀발크 (Henderson-Hasselbalch) 식에서 사용하여 주어진 pH에서 측쇄의 전하를 얻었다. 이어서, 전하를 합하여 주어진 pH에서 순 전하를 얻었다.
도 15d는 도표 A에서 사용된 Fab 내의 하전된 측쇄의 pKa 분포를 보여준다. y-축은 D, E, H, Y, K, 및 R의 아미노산 측쇄의 표준의 비-구조 기반 pKa 값을 보여준다 (연합된 수직선의 x-축을 따른 값에 의해 표지된 바와 같이). 주어진 아미노산 측쇄에 대한 각각의 수평 데이터 점은 그 아미노산에 대한 PROPKA로부터 얻어진 구조-기반 pKa 값이다. 도 15d는 각각의 아미노산 측쇄에 대해 얻어진 pKa 값의 분포를 보여주는 한편, 구조-기반 전하 계산에 기반한 전체 전하-pH 프로파일은 도 15a-15c에 제시된 서열-기반 계산과 대등하였고, 여기서, 서열 및 구조 사이의 전하-pH 프로파일의 유사성은 Fab pI에 독립적이었다.
도 16은 서열-기반 소수성 지수 (HI) 값과 구조로부터 계산된 값의 비교를 보여준다. 서열-기반 HI는 아래의 예시적인 방법 섹션에 설명된 바와 같이 계산하였고, 소수성 아미노산 대 친수성 아미노산의 상대적인 비에 기반하며, 여기서 각각의 아미노산은 그의 아이젠버그 (Eisenberg) 소수성 스케일 (scale) 값에 의해 가중치를 둔다. 구조-기반 소수성 지수도 유사하게 계산되는데, 다만 구조로부터 결정된 SASA가 각각의 아미노산에 대한 계산에 포함된다. 지수는 다음과 같이 정의된다:
HI (구조) =∑ (SiEi/SjEj)
식에서, i는 소수성 아미노산, 즉, A, F, I, L, V, W, Y를 나타내고, j는 친수성 아미노산, 즉, D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, T를 나타낸다. (아미노산에 대한 약어를 확인하는 1-문자에 대한 기호는 문서 아래 표 1을 참조한다). S는 SASA 값이고, E는 각각의 아미노산의 아이젠버그 스케일 값이다. 계산은 주어진 서열/구조 내에 존재하는 모든 아미노산에 걸쳐 이루어진다. 구조-기반 HI와 서열-기반 HI 사이에서 합리적인 상관성이 얻어진다 (피어슨 (Pearson) r = 0.9).
도 17은 연구의 서브/클래스의 몇몇 mAb, IgG1에 대한 CDR 단독으로부터 계산된 서열-기반 HI 값을 그들의 각각의 Fv 도메인으로부터 계산된 값에 비교한 것을 보여준다. CDR을 사용하여 계산된 HI 값은 Fv를 사용하여 얻어진 값과 양호한 상관성이 있었다 (피어슨 r = 0.9).
도 18은 본 발명의 원리에 따라 구성될 수 있는 예시적인 장치를 보여준다.
도 19a 및 19b는 본 발명의 원리에 따른 예시적인 공정의 흐름도이다.
발명의 상세한 설명
항체가 하나 이상의 대응하는 설계 기준을 충족하는 하나 이상의 물리화학적 특징을 갖는지 결정하기 위한 장치, 방법, 제조품, 및 상응하는 컴퓨터 판독가능 매체가 제공된다. 하나 이상의 물리화학적 특징 중 어느 하나에 대해, 상기 결정은 물리화학적 특징의 값에 대한 경험적 결정의 대용값 (proxy)일 수 있다. 이 대용값은 경험적 결정의 부재 하에, 경험적 결정 전에 또는 경험적 결정 대신의 예측값일 수 있다. 경험적 결정의 값과 예측의 값 및 결정과 예측이 수행될 수 있는 용액 상태는 근사값일 수 있다.
하나 이상의 설계 기준은 항체를 포함하는 치료제에 대한 것일 수 있다. 하나 이상의 설계 기준은 임의의 시험관내 또는 생체내 사용을 위한 항체에 대한 것일 수 있다. 하나 이상의 설계 기준은 항체를 포함하는 조성물, 제약 제제 또는 제약 조성물에 대한 것일 수 있다. 결정은 항체가 치료제에 포함되기 위해 또는 제약 제제 또는 제약 조성물에 포함되기 위해 적절성 또는 적합성인지의 결정이다.
용어 "치료제"는 유효량에서 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 영장류, 가장 바람직하게는 인간에서 바람직한 치료 효과를 발휘하는 작용제를 의미한다. 치료제는 하나 초과의 종류의 치료제를 포함할 수 있는 제약 조성물 내에서 제제화될 수 있다.
항체를 포함하는 치료제는 정맥내 주사, 피하 주사, 복강내 주사 또는 임의의 다른 투여 형태를 위한 것일 수 있다. 치료제는 분배 장치를 이용하는 피하 주사를 위해 작은 부피에 고농도로 존재할 수 있다. 치료제는 낮은 점도를 필요로 할 수 있다. 치료제는 저빈도 투여를 위해 설계될 수 있고, 긴 혈장 반감기를 필요로 할 수 있다.
치료제에 대한 "설계 기준"은 치료제가 가져야 하는 물리적, 화학적 또는 물리화학적 표적 특징을 의미할 수 있다.
치료제에 사용하기 위한 항체를 선택하기 위한 장치 및 방법, 및 대응하는 컴퓨터 판독가능 매체가 제공된다. 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 비-일시적인 파 (transitory wave)을 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 비-일시적인 신호를 포함할 수 있다. 항체는 2 이상의 항체 후보물질로부터 선택될 수 있다.
항체를 생산 또는 제조하기 위한 장치 및 방법, 및 대응하는 컴퓨터 판독가능 매체가 제공된다. 얻은 항체는 치료제에 사용될 수 있다. 얻은 항체는 기존재하는 항체로부터 변형될 수 있다. 기존재하는 항체는 하나 이상의 설계 기준을 충족하는 표적-항체를 생산하도록 변형될 수 있다. 설계 기준은 치료제에 대한 것일 수 있다.
장치는 방법의 하나 이상의 단계를 수행할 수 있다. 장치는 논리 처리 (logical processing) 장치를 포함할 수 있다. 장치는 데이터 수신 장치를 포함할 수 있다. 장치는 데이터 전송 장치를 포함할 수 있다. 장치는 기기 판독가능 기억장치를 포함할 수 있다. 2 이상의 장치는 서로 전자적으로 통신될 수 있다.
매체는 하나 이상의 비-일시적인 컴퓨터 사용가능 매체일 수 있다. 컴퓨터 사용가능 매체는 그 내부에 구현된 컴퓨터 판독가능 프로그램 코드를 가질 수 있다. 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 컴퓨터 판독가능 프로그램 코드는 컴퓨터 시스템이 방법의 단계를 수행하도록 할 수 있다.
항체가 치료제 내에 포함되기에 적절성 또는 적합성인지를 결정하기 위한 단계가 실시될 수 있다. 몇몇의 항체 후보물질로부터 항체를 선택하기 위한 단계가 실시될 수 있다. 항체 제조를 위한 단계가 실시될 수 있다. 단계는 기존재하는 항체를 변형하도록 실시될 수 있다. 단계는 표적-항체를 생산하기 위해 기존재하는 항체를 변형하도록 실시될 수 있다.
일부 또는 모든 단계는 다음 중 하나 이상을 조합하기 위해 물리화학적 특징 중의 하나 또는 2 이상의 물리화학적 특징의 조합을 기초로 하여 서로 협력하여 실시될 수 있다: 치료제에 포함하기 위한 항체의 적절성 결정; 몇몇의 항체 후보물질로부터 항체의 선택; 항체의 제조; 표적 항체를 생성하기 위한 기존재하는 항체의 변형; 및 표적-항체의 생산.
항체 물리화학적 특징; 항체 구조적 정보; 항체 구조적 파라미터; 설계 기준; 목적 함수 (objective function); 목적 함수 스케일링 계수 (scaling factor); 물리화학적 특징 지수; 항체; 항체 생산; 논리 처리 장치, 데이터 전송 장치 및 데이터 수신 장치; 및 본 발명의 특징 및 원리의 조합이 이제 논의될 것이다.
항체 물리화학적 특징
예시적인 물리화학적 특징은 점도, 클리어런스, 안정성, 아스파르트산 불안정성 및 트립토판 불안정성을 포함한다.
물리화학적 특징은 점도일 수 있다. 물리화학적 특징은 약동학적 클리어런스율일 수 있다. 물리화학적 특징은 불안정성일 수 있다. 불안정성은 항체의 안정성에 대응할 수 있다. 불안정성은 항체의 저장 수명에 대응할 수 있다.
물리화학적 특징은 안정성일 수 있다. 물리화학적 특징은 저장 수명일 수 있다. 물리화학적 특징은 아스파르트산 (Asp) 불안정성일 수 있다. 물리화학적 특징은 트립토판 (Trp) 불안정성일 수 있다. Asp 불안정성은 Asp 이성질체화에 대응할 수 있다. Trp 불안정성은 Trp 산화에 대응할 수 있다. 불안정성은 항체의 안정성 및 저장 수명에 영향을 줄 수 있다.
물리화학적 특징은 용액 상태에 따라 결정될 수 있다. 용액 상태는 수성 용액 상태일 수 있다. 용액 상태는 온도일 수 있다. 용액 상태는 pH일 수 있다. 용액 상태는 이온 강도일 수 있다. 용액 상태는 항체 농도일 수 있다. 항체의 수성 용액의 이온 강도는 전적으로 또는 부분적으로 항체가 존재하는 이온성 완충제 용액의 농도에 의해 설정될 수 있다. 이온성 완충제 용액의 예는 히스티딘 아세테이트 완충제 용액일 수 있다. 용액 상태는 용질 농도를 포함할 수 있다. 용질 농도는 항체 농도를 포함한다.
항체 구조적 정보
항체 구조적 정보는 구조적 파라미터를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 구조적 파라미터를 항체 구조적 정보로부터 계산하는 것을 포함할 수 있다.
구조적 정보는 3차원 구조에 상응할 수 있다. 구조적 정보는 1차 구조에 상응할 수 있다. 1차 구조는 1차 아미노산 서열을 나타낼 수 있다. 1차 구조는 항체의 가변 도메인의 1차 구조를 포함할 수 있다. 1차 구조는 오직 가변 도메인 1차 구조일 수 있다. 1차 구조는 가변 도메인 경쇄 (VL) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 1차 구조는 가변 도메인 중쇄 (VH) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 1차 구조는 하나 이상의 CDR 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 1차 구조는 항체의 불변 영역의 1차 구조를 포함할 수 있다. 불변 영역의 1차 구조는 불변 영역 경쇄 (CL) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 불변 영역의 1차 구조는 불변 영역 중쇄 (CH) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 불변 영역의 1차 구조는 하나 이상의 불변 영역 중쇄 CH1, CH2 및 CH3 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
구조적 파라미터는 1차 구조적 정보로부터 계산할 수 있고, 1차 구조 이외의 다른 구조로부터의 정보를 포함하지 않을 수 있다. 1차 서열은 DNA 서열결정에 의해 얻은 DNA 서열로부터 유도될 수 있다. DNA 서열결정 기술은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다.
항체 구조적 정보는 전자적으로 코딩될 수 있다. 전자적으로 코딩되는 정보는 기기 판독가능 기억장치에 저장될 수 있다. 논리 처리 장치는 기기 판독가능 기억장치로부터 항체 구조적 정보를 검색할 수 있다. 데이터 수신 장치는 항체 구조적 정보를 수신할 수 있다. 논리 처리 장치는 물리화학적 파라미터를 항체 구조적 정보로부터 계산할 수 있다. 데이터 전송 장치는 항체 구조적 정보를 전송할 수 있다. 데이터 전송 장치는 계산 결과에 대응하는 신호를 전송할 수 있다.
용어 "전자적으로 코딩되는"은 전자 데이터베이스에 저장하거나 이로부터 검색하기에 및/또는 전자 계산 장치에 의한 조작에 적합한 정보의 형태를 의미한다.
항체 구조적 파라미터
구조적 파라미터는 항체의 순 전하일 수 있다. 구조적 파라미터는 항체의 전하 비대칭일 수 있다. 구조적 파라미터는 항체의 소수성일 수 있다. 구조적 파라미터는 항체 구조적 정보로부터 계산할 수 있다.
항체 구조적 정보는 1차 구조적 정보, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 항체의 구조적 요소의 아미노산 서열일 수 있다. 각각의 구조적 요소는 아미노산 서열일 수 있다. 구조적 요소는 항체 아미노산 서열에서 서로 인접할 수 있다. 구조적 요소는 항체 서열에서 서로 가까이 존재할 수 있다. 구조적 요소는 항체에서 서로 회합될 수 있다. 구조적 요소는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 경쇄 가변 도메인 (VL)일 수 있다. 구조적 요소는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)일 수 있다. 구조적 요소는 하나 이상의 불변 영역 (예를 들어, CH1, CL, CH2 및 CH3)일 수 있다. 구조적 요소는 중쇄 및 경쇄 (항체의 절반)일 수 있다. 구조적 요소는 전체 항체일 수 있다. 1차 아미노산 서열은 중쇄 가변 도메인 (VH), 및/또는 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열일 수 있다. 1차 아미노산 서열은 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열일 수 있다. 1차 아미노산 서열은 항체의 하나 이상의 불변 영역의 아미노산 서열일 수 있다. 항체 구조적 정보는 또한 2차 구조적 정보 및 보다 높은 수준의 구조적 정보, 예컨대 점도, 클리어런스 및 안정성에 기여할 수 있는 3차원 분자 상호작용에 대한 정보를 포함할 수 있다.
구조적 파라미터는 순 전하를 포함할 수 있다. 순 전하는 항체의 구조적 요소 내의 모든 아미노산의 전하의 합일 수 있다. 순 전하는 특정 pH에서 항체의 구조적 요소 내의 모든 아미노산의 전하의 합일 수 있다. pH는 pH 4 내지 pH 9의 pH일 수 있다. pH는 pH 5.5일 수 있다. 구조적 요소는 VH 및 VL 도메인일 수 있다. 순 전하는 VH 및 VL 도메인 내의 모든 아미노산의 전하의 합일 수 있다. 순 전하는 하나 이상의 CDR 내의 모든 아미노산의 전하의 합일 수 있다. 순 전하는 하나 이상의 불변 영역 내의 모든 아미노산의 전하의 합일 수 있다.
구조적 파라미터는 전하 비대칭을 포함할 수 있다. 전하 비대칭은 항체의 하나의 구조적 요소의 순 전하와 항체의 적어도 하나의 다른 구조적 요소의 순 전하의 곱일 수 있다. 전하 비대칭은 항체의 VH의 순 전하와 VL의 순 전하의 곱일 수 있다. 또한, 전하 비대칭은 예를 들어 Fv 및 Fc, 또는 Fv 및 CH3 도메인, 또는 Fab 및 Fc의 순 전하의 곱 등일 수 있다.
구조적 파라미터는 소수성을 포함할 수 있다. 소수성은 하나 이상의 CDR에 대응하는 소수성 값의 총 합산 함수 (summation function)를 포함할 수 있다. 각각의 합산 함수는 (1) CDR의 소수성 잔기의 소수성의 값의 합계 대 (2) CDR의 친수성 잔기의 소수성의 값의 합계의 비일 수 있다. CDR의 각각의 아미노산 잔기에 대한 소수성의 값은 아이젠버그 소수성 스케일 값일 수 있다. 별법으로, 소수성은 Fv의 소수성 값을 포함할 수 있다.
구조적 파라미터는 분자 동역학 (MD) 시뮬레이션을 이용함으로써 계산할 수 있다. MD 시뮬레이션은 시뮬레이션된 용액 상태의 세트에 대응할 수 있다. 세트는 가상 용액의 용액 상태를 포함할 수 있다. 시뮬레이션된 용액 상태는 온도를 포함할 수 있다. MD 시뮬레이션은 온도에서 유지될 수 있다. 시뮬레이션된 용액 상태는 가상 물 분자를 포함할 수 있다. MD 시뮬레이션은 명시적 (explicit) 물 용매화를 이용할 수 있다. 시뮬레이션된 용액 상태는 중립성을 유지하기 위해 가상 용해질 이온을 포함할 수 있다.
MD 시뮬레이션은 아미노산 잔기 ("N" 위치에서)의 알파-탄소 (α-탄소)의 요동의 평균 제곱근 (RMSF)를 계산할 수 있다. 아미노산 잔기는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열 내의 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 CDR 아미노산 서열 내의 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 프레임워크 영역 (FR) 내의 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 트립토판 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 임의의 잠재적으로 불안정한 잔기일 수 있다.
구조적 파라미터는 아미노산 잔기의 시간 평균한 SASA를 포함할 수 있다. MD 시뮬레이션은 잔기의 시간 평균한 SASA를 계산할 수 있다. 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 트립토판 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 잠재적으로 불안정한 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기일 수 있다.
구조적 파라미터는 N 위치를 점유하는 아미노산 잔기에 바로 인접한 주쇄 질소 원자의 시간 평균한 SASA를 포함할 수 있다. MD 시뮬레이션은 아미노산 서열을 따른 N 위치의 잔기에 바로 인접한 주쇄 질소 원자의 시간 평균한 SASA를 계산할 수 있다. N 위치의 아미노산 잔기는 Asp 잔기일 수 있다. "바로 인접한"은 아미노산 서열의 아미노-말단 (N-말단) 또는 카르복실-말단 (C-말단)을 향한 방향의 아미노산 서열을 따라 인접하는 것으로 규정될 수 있다. N 위치의 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 C-말단을 향한 방향으로 아미노산 서열을 따라 인접할 수 있다 (즉, "N+1" 위치). 예를 들어, 잔기가 위치 "N"을 점유하는 아스파르트산 잔기일 경우, 위치 "N+1"은 아미노산 서열의 C-말단을 향한 방향으로 아미노산 서열을 따라 아스파르트산 잔기에 바로 인접한 잔기의 위치일 수 있다. "N+1"의 잔기는 글라이신일 수 있다. "N+1"의 잔기는 트레오닌일 수 있다. "N+1"의 잔기는 아스파르트산 잔기일 수 있다. "N+1"의 잔기는 알라닌일 수 있다. "N+1"의 잔기는 임의의 잔기일 수 있다.
MD 시뮬레이션은 상이한 용액 상태에 대한 구조적 파라미터의 상이한 값을 계산할 수 있다.
설계 기준
각각의 물리화학적 특징은 대응하는 설계 기준을 가질 수 있다. 설계 기준은 한계, 역치 또는 컷-오프 (cut-off) 값일 수 있다. 아래 설명되는 바와 같이, 물리화학적 특징 및 상응하는 목적 함수에 따라, 물리화학적 특징에 대응하는 지수가 한계 미만일 때, 한계 초과일 때, 한계를 초과하지 않을 때, 또는 한계보다 작지 않을 때, 설계 기준은 충족된 것으로 간주될 수 있다. 특정 실시양태에서, 물리화학적 특징에 대응하는 지수는 한계 미만이다. 물리화학적 특징 및 목적 함수에 따라, 지수는 예를 들어 항체의 물리화학적 특징이 설계 기준을 충족하는지에 대한 신호를 보내는 2진수 표시를 제시하기 위해 추가로 전환될 수 있다.
설계 기준은 점도 한계일 수 있다. 설계 기준은 약동학적 클리어런스율 한계일 수 있다. 설계 기준은 불안정성 한계일 수 있다. 설계 기준은 아스파르트산 불안정성 한계일 수 있다. 설계 기준은 트립토판 불안정성 한계일 수 있다. 설계 기준은 안정성 한계일 수 있다. 설계 기준은 저장 수명 한계일 수 있다. 설계 기준은 치료제에 대한 것일 수 있다. 설계 기준은 비-치료제에 대한 것일 수 있다. 설계 기준은 항체를 포함하는 조성물에 대한 것일 수 있다. 조성물은 생체내 또는 시험관내 적용을 위한 조성물일 수 있다.
설계 기준은 항체의 특정 클래스 (또는 서브클래스)에 대한 것일 수 있다. 클래스는 IgG일 수 있다. 클래스 (서브클래스)는 IgG1 또는 IgG4일 수 있다.
설계 기준은 항체의 체조와 연관된 기준일 수 있다. 설계 기준은 항체의 유체 이송과 연관된 기준일 수 있다. 설계 기준은 항체의 저장과 연관된 기준일 수 있다. 설계 기준은 항체의 저장 수명과 연관된 기준일 수 있다. 설계 기준은 항체의 투여와 연관된 기준일 수 있다. 설계 기준은 항체의 혈장 반감기와 연관된 기준일 수 있다. 설계 기준은 항체의 클리어런스율과 연관된 기준일 수 있다. 설계 기준은 항체의 분배와 연관된 기준일 수 있다. 설계 기준은 항체를 포함하는 치료제에 대한 것일 수 있다. 치료제의 투여 또는 분배는 환자에 의해 자가-투여될 수 있다. 투여는 정맥내, 복강내, 또는 피하 투여일 수 있다.
목적 함수
특정 측면에서, 본 발명은 항체가 설계 기준을 충족하는 물리화학적 특징을 갖는지 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 물리화학적 특징에 대응하는 목적 함수로부터 지수를 정량 또는 계산하는 것을 포함할 수 있다. 목적 함수는 본원 전체에서 설명된 바와 같이 계산된 구조적 파라미터의 값을 포함할 수 있다.
목적 함수는 목적 함수 스케일링 계수와 대응하는 구조적 파라미터의 값과의 곱셈 결과의 합산을 포함할 수 있다. 합산은 목적 함수에서 지수항의 독립변수에 포함될 수 있다. 목적 함수는 설계 기준과 비교될 수 있는 물리화학적 특징의 값의 예측값을 산출할 수 있다. 예를 들어, 점도 목적 함수는 본 발명에 따른 서열-기반 구조적 파라미터의 값과 대응하는 목적 함수 스케일링 계수와의 곱셈 결과의 합산을 포함할 수 있고, 여기서 점도에 기여하는 mAb 구조적 속성은 항체 가변 도메인의 적어도 일부의 순 전하, 전하 비대칭 및 소수성일 수 있다. 목적 함수의 계산은 점도 지수를 산출한다. 지수는 점도 값으로 전환될 수 있고, 점도 값과 설계 기준에 의해 설정된 점도 한계의 비교는 항체가 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는지 결정하기 위해 사용될 수 있다.
특정 목적 함수의 구조적 파라미터 및 대응하는 스케일링 계수는 항체의 클래스 (또는 서브클래스)에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 선행 문단에서 설명된 점도 목적 함수는 IgG1 항체의 점도의 예측을 위해 사용되는 반면, IgG4 항체에 대해, 합산은 관심 항체의 물리화학적 특징에 따라 불변 영역 순 전하 또는 불변 영역 전하 비대칭과 상응하는 목적 함수 스케일링 계수와의 곱을 추가로 포함할 수 있다.
목적 함수는 물리화학적 특징에 직접 관련시킬 수 있거나 또는 그로 전환가능한 값에 대응하지 않는 값을 산출할 수 있지만; 이 값은 그럼에도 불구하고 항체가 설계 기준을 충족하는 물리화학적 특징을 갖는지 나타낼 수 있다. 값은 항체가 설계 기준을 충족하는 물리화학적 특징을 갖는지를 나타내는 2진수 코드로 전환될 수 있다. 예를 들어, 아스파르트산 불안정성 목적 함수로부터 계산된 0과 1 사이의 지수는 제2 지수를 생성하기 위해 한 개의 유효 숫자로 반올림할 수 있고, 여기서 항체는 제2 지수가 0일 때 아스파르트산 불안정성 설계 기준을 충족하고 제2 지수가 1일 때 아스파르트산 불안정성 설계 기준을 충족하지 않는 것으로 결정된다.
논리 처리 장치는 목적 함수의 계산을 처리함으로써 지수를 유도할 수 있다.
목적 함수는 본원에서 실행되는 수리 분석 방법에 의해 사용, 변형 및/또는 유도된 임의의 적합한 다항식 (polynomial) 또는 확률 밀도 함수의 형태를 가질 수 있다.
상이한 물리화학적 특징에 상응하는 목적 함수는 상이한 함수 형태를 가질 수 있다.
목적 함수 스케일링 계수
방법은 스케일링 계수를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 스케일링 계수의 선택은 스케일링 계수의 세트로부터 스케일링 계수를 선택하는 것을 포함할 수 있다. "스케일링 계수"는 또한 "계수"로 언급될 수 있다.
스케일링 계수 세트는 각각의 하나 이상의 항체 클래스에 대한 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 항체 클래스는 IgG, IgA, IgE, IgM 및 IgD를 포함할 수 있다. 항체 클래스는 또한 서브클래스를 포함할 수 있고; 서브클래스의 비제한적인 예는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 항체 클래스는 IgG일 수 있다. 항체 클래스는 IgG1일 수 있다. 항체 클래스는 IgG4일 수 있다.
스케일링 계수 세트는 각각의 클래스 (또는 서브클래스)에 대해 각각의 하나 이상의 용액 상태에 대한 스케일링 계수의 세트를 포함할 수 있다. 용액 상태는 MD 시뮬레이션에서 사용될 수 있는 시뮬레이션된 용액 상태일 수 있다. 용액 상태는 실제의, 습식 용액 상태일 수 있다.
스케일링 계수 세트는 각각의 클래스 (또는 서브클래스)에 대해, 및 각각의 용액 상태에 대해 각각의 구조적 파라미터에 대응하는 스케일링 계수를 포함할 수 있다.
스케일링 계수 세트는 기기 판독가능 기억장치에 저장될 수 있다. 논리 처리 장치는 스케일링 계수를 선택할 수 있다. 스케일링 계수의 선택은 기기 판독가능 기억장치로부터 스케일링 계수의 검색을 포함할 수 있다. 논리 처리 장치는 기기 판독가능 기억장치로부터 스케일링 계수를 검색할 수 있다.
스케일링 계수의 선택은 스케일링 계수의 유도를 포함할 수 있다. 스케일링 계수는 목적 함수를 시험 항체의 세트의 물리화학적 특징의 경험적 값에 피팅함으로써 유도될 수 있다. 스케일링 계수는 각각의 상이한 용액 상태 하에서 항체의 훈련 세트 (또한 본원에서 "시험 항체"로서 칭함)의 물리화학적 특징의 측정된 값에 대해 목적 함수를 포함하는 구조적 파라미터의 계산된 값을 회귀시킴으로써 얻은 계수 또는 상수일 수 있다. 스케일링 계수는 목적 함수를 포함하는 구조적 파라미터를 물리화학적 특징의 측정된 값에 피팅하는 임의의 다른 수단에 의해 유도될 수 있다. 논리 처리 장치는 목적 함수의 구조적 파라미터를 물리화학적 특징의 측정된 값에 피팅할 수 있다. 일단 유도되면, 동일한 스케일링 계수 세트는 동일한 조건 하에 동일한 클래스 또는 서브클래스의 항체의 점도 또는 Asp 이성질체화 또는 다른 물리화학적 특징의 예측에 적용될 수 있다.
측정된 값은 경험적 값일 수 있다. 측정된 값은 공개적으로 문헌에 게시되거나 발표된 값일 수 있다. 측정된 값은 전자적으로 코딩될 수 있다. 측정된 값은 기기 판독가능 기억장치에 저장될 수 있다.
물리화학적 특징 지수
하나 이상의 물리화학적 특징에 대해, 지수는 대응하는 목적 함수로부터 산출될 수 있다. 지수는 물리화학적 특징에 대응할 수 있다. 지수는 설계 기준과 비교될 수 있다.
지수는 전자적으로 계산될 수 있다. 용어 "전자적으로 계산된" 또는 "전자적으로 정량된"은 전자적 컴퓨팅 (electronic computing) 장치, 예컨대 논리 처리 장치에 의한 연산 유도 (computational derivation)를 의미할 수 있다.
논리 처리 장치는 계산을 수행할 수 있다. 논리 처리 장치는 비교를 수행할 수 있다. 데이터 전송 장치는 지수가 설계 기준을 충족함을 나타내는 표시를 출력할 수 있다.
논리 처리 장치는 항체 후보물질에 대응하는 지수를 기초로 하여 2 이상의 항체 후보물질로부터 선택할 수 있다. 선택은 그의 지수가 물리화학적 특징 또는 설계 기준의 한계에 순응하거나 보다 더 순응하는 항체 후보물질을 선택할 수 있다.
지수는 항체의 제조 또는 생산을 결정하기 위한 기초일 수 있다.
지수는 기존재하는 항체의 변형 여부 또는 변형 방법을 결정하기 위한 기초일 수 있다. 지수는 기존재하는 항체로부터 개선된 및/또는 하나 이상의 설계 기준을 충족하는 하나 이상의 물리화학적 특징을 갖는 표적 항체를 생산하기 위해 기존재하는 항체를 변형하기 위한 기초일 수 있다.
항체
하나 이상의 항체, 시험 항체, 항체 후보물질, 기존재하는 항체 및 표적 항체는 모노클로날 항체 (mAb), 폴리클로날 항체, 클래스-전환된 항체 또는 임의의 다른 종류의 항체를 포함할 수 있다.
하나 이상의 항체, 시험 항체, 항체 후보물질, 기존재하는 항체 및 표적 항체는 항체 단편, 단일쇄 단편 가변 항체, 단일-도메인 항체, 또는 임의의 다른 종류의 단편 또는 항체를 포함할 수 있다.
하나 이상의 항체, 시험 항체, 항체 후보물질, 기존재하는 항체 및 표적 항체는 인간 항체, 비-인간 항체, 키메라 (chimeric) 항체, 인간화 항체, 조작된 항체, 인공 항체 또는 임의의 다른 종류의 항체를 포함할 수 있다.
하나 이상의 항체, 시험 항체, 항체 후보물질, 기존재하는 항체 및 표적 항체는 항체 클래스에 속할 수 있다. 클래스는 IgG, IgM 또는 임의의 다른 적합한 클래스일 수 있다. 클래스는 전환된 클래스일 수 있다. 클래스는 하나 이상의 서브클래스를 포함할 수 있다. 서브클래스는 IgG1일 수 있다. 서브클래스는 IgG4일 수 있다. 서브클래스는 임의의 서브클래스일 수 있다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. "항체 단편"은 무손상 (intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 다른 분자를 의미한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR 또는 CDR)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기 위해 충분할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 각각 서열이 초가변인 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 및/또는 구조상 규정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 및/또는 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 일반적으로, 항체는 다음과 같은 6개의 HVR을 포함한다: VH 내의 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3).
"프레임워크" 또는 "FR"은 HVR 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 다음과 같은 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 내에 다음 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 또는 인간 항체 레퍼토리 (repertoire) 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 배제한다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 의미한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)이 비-인간 항체의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 항체의 것에 대응하는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하고, 즉, 집단을 이루는 개개의 항체는 동일하고/하거나, 예를 들어 천연 발생 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고 동일한 에피토프에 결합하고, 상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 일반적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 작용한다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
항체의 "클래스"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 종류를 의미한다. 포유동물 항체의 5개의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이 중 몇몇은 다시 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 구분될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체의 "클래스"는 항체의 클래스 및 서브클래스를 광범하게 포함한다.
항체 생산
특정 측면에서, 본 발명은 추가로 항체 생산 방법을 제공하고, 여기서 얻어진 항체는 하나 이상의 설계 기준을 충족하는 하나 이상의 물리화학적 특징을 갖는지 결정된다. 본 발명은 변형된 항체, 즉, 생산된 표적 항체가 하나 이상의 설계 기준을 충족하는 하나 이상의 물리화학적 특징을 갖도록, 설계 기준을 충족하지 않는 기존재하는 항체로부터 변형된 표적 항체의 생산 방법을 제공할 수 있다. 생산은 소규모 항체 제조 또는 대규모 항체 제조를 위한 것일 수 있다.
생산된 항체는 제약 조성물에 포함될 수 있다. 항체의 제약 제제는 상기 목적하는 순도를 갖는 항체를 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태로 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체와 혼합함으로써 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). "제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 의미한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분을 포함할 수 있고, 바람직하게는 이들 성분은 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는다. 상기 활성 성분은 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합물에 적합하게 존재한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
본 발명에 따라 사용할 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 (transgenic) 동물을 이용하는 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
항체는 관련 기술 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 항체는 항체를 발현하기에 적합한 조건 하에 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 방법에 의해 생산될 수 있다. 항체는 숙주 세포에서 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 숙주 세포는 원핵 세포 (비제한적으로 이. 콜라이(E. coli) 세포 포함) 또는 진핵 세포 (비제한적으로 곤충 세포, 예컨대 SF9 세포 또는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 (Chinese Hamster) 난소 세포 포함)일 수 있다. 항체는 일시적으로 형질감염된 세포 또는 안정적으로 형질감염된 세포주에 의해 생산될 수 있다. 항체는 트랜스제닉 동물에서 생산될 수 있다. 항체는 관련 기술 분야에 알려진 임의의 합성 방법에 의해 생산될 수 있다. 항체는 크로마토그래피 방법과 같은 표준 방법을 이용하여 정제에 의해 얻을 수 있다.
용어 "기존재하는 항체"는 그의 아미노산 서열이 본 발명에 따라 결정된 하나 이상의 물리화학적 특징이 개선되고/되거나 하나 이상의 설계 기준을 충족하도록 변형된 항체를 의미할 수 있다. 기존재하는 항체는 허용되는 항원-결합 특이성, 친화도 및 다른 이펙터 활성을 가질 수 있다. 기존재하는 항체는 본 발명에 의해 결정되는 바람직하지 않은 또는 허용되지 않는 물리화학적 특징을 가질 수 있다.
용어 "표적 항체", "변형된 항체" 또는 "돌연변이 유발된 항체"는 교환가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 표적, 변형된 또는 돌연변이 유발된 항체가 하나 이상의 설계 기준을 충족하는 하나 이상의 물리화학적 특징을 갖고, 이와 동시에 기존재하는 항체의 항원-결합 친화도, 특이성 및 다른 바람직한 활성, 예컨대 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및 다른 이펙터 활성을 적어도 실질적으로 보유하도록, 기존재하는 항체의 아미노산 서열에 하나 이상의 변화를 갖는 항체를 의미할 수 있다. 표적, 변형된 또는 돌연변이 유발된 항체는 기존재하는 항체보다 우수한 하나 이상의 특성, 예를 들어 개선된 항원-결합 친화도, 특이성 및/또는 다른 목적하는 활성을 보일 수 있다.
기존재하는 항체의 변형은 기존재하는 항체의 아미노산 서열의 변형을 포함할 수 있다. 기존재하는 항체의 아미노산 서열은 설계 기준에 부합하는 표적 아미노산 서열에 부합하도록 변형될 수 있다.
기존재하는 항체의 아미노산 서열의 변형은 기존재하는 항체 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산의 조정을 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 잔기의 조정은 하나 이상의 잔기의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 하나 이상의 잔기의 화학적 변형은 하나 이상의 잔기의 키랄성 (chirality)의 변화를 포함할 수 있다. 하나 이상의 잔기의 화학적 변형은 하나 이상의 잔기의 하나 이상의 원자의 변화를 포함할 수 있다.
기존재하는 항체의 아미노산 서열의 변형은 기존재하는 항체 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 교체 또는 치환하는 것을 포함할 수 있다. 기존재하는 항체의 아미노산 서열의 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기를 기존재하는 항체 아미노산 서열로부터 제거하는 것을 포함할 수 있다. 기존재하는 항체의 아미노산 서열의 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기를 기존재하는 항체 아미노산 서열에 부가 또는 삽입하는 것을 포함할 수 있다.
아미노산 치환은 보존적 치환 또는 비-보존적 치환일 수 있다. 무엇이 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환을 구성하는지는 일반적으로 관련 기술 분야에서 이해되고 있다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 하기 표 1에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하에 표 1에 제시되고, 아미노산 측쇄 클래스에 대해 아래에서 추가로 설명된다. 아미노산 치환은 변형된 항체, 즉, 표적 항체를 생산하기 위해 기존재하는 항체에 도입될 수 있다. 변형된 항체는 그의 기존재하는 항체의 목적하는 속성의 보유에 추가로 목적하는 속성, 예를 들어, 목적하는 물리화학적 특징에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 멤버를 또 다른 클래스의 멤버로 교체하는 것을 수반할 것이다.
항체가 설계 기준을 충족하는 물리화학적 특성을 가질 수 있도록 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 본 발명에 따라 순 전하 또는 소수성을 증가시키거나 감소시키는 것은 연구자의 능력 내에 있을 것이다. 예를 들어, 염기성 아미노산 잔기로부터 산성 또는 중성 아미노산 잔기로의 치환은 항체가 특정 설계 기준을 충족하는지 결정하기 위한 기초로서 관련 지수의 계산된 순 전하를 감소시킬 수 있고, 친수성 아미노산 잔기로부터 소수성 아미노산 잔기로의 치환은 계산된 소수성을 증가시킬 수 있다. 표적, 변형된 또는 돌연변이 유발된 항체는 표적, 변형된 또는 돌연변이 유발된 항체가 설계 기준을 충족하는 적어도 하나의 물리화학적 특성을 갖는지 확인하기 위해 추가의 인-실리코 분석 또는 습식 실험 분석에 적용될 수 있다.
표적 항체, 변형된 항체 또는 돌연변이 유발된 항체는 관련 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 변형된 항체가 기존재하는 항체의 목적하는 활성, 예컨대 항원-결합 특이성 또는 친화도를 적어도 실질적으로 보유하는 것을 보장하기 위해 추가의 분석에 적용될 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 특이성, 친화도 및 결합 동역학은 ELISA, 형광-기반 면역검정, 방사성면역검정 또는 BIACORE® 검정 (비아코어 에이비 (Biacore AB, 스웨덴 웁살라))에 의해 측정될 수 있다.
용어 활성을 "실질적으로 보유하다"는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 활성을 보유함을 의미할 수 있다.
논리 처리 장치, 데이터 전송 장치, 데이터 수신 장치
하나 이상의 논리 처리 장치, 데이터 전송 장치 및 데이터 수신 장치는 컴퓨팅 기기 (computing machine)로서 또는 그의 일부로서 실행할 수 있다.
계산 기기는 클라이언트 (client), 서버 (server), 클라이언트와 서버, 프로그램가능 논리 컨트롤러 ("PLC"), 또는 임의의 다른 적합한 처리 장치일 수 있다. 컴퓨팅 기기는 중앙 처리 장치 ("CPU"), 기억장치 (memory) 및 입력/출력 ("I/O") 회로, 및/또는 임의의 다른 적합한 장치를 포함할 수 있다.
CPU는 하나 이상의 마이크로프로세서, 마이크로컴퓨터 및 마이크로컨트롤러 (microcontroller)를 포함할 수 있다. 마이크로프로세서, 마이크로컴퓨터 및 마이크로컨트롤러는 게이트 (gate) 및 플립-플랍 (flip-flop)과 같은 디지털 회로 구성요소를 포함할 수 있다. CPU는 플립-플랍 및 게이트와 같은 하나 이상의 독립적인 디지털 회로 구성요소를 사용하여 구성될 수 있다.
마이크로프로세서, 마이크로컴퓨터 및 마이크로컨트롤러는 하나 이상의 아키텍쳐 (architecture), 예컨대 축약 명령어 세트 컴퓨터 ("RISC") 또는 복합 명령어 세트 컴퓨터 ("CISC") 또는 매우 큰 명령 워드 ("VLIW") 또는 임의의 다른 적합한 아키텍쳐에 부합할 수 있다. 아키텍쳐는 하나 이상의 데이터 경로, 컨트롤 (control) 회로, 클럭 (clock) 회로, 기억장치 회로의 구성, 및 임의의 다른 적합한 경로 또는 회로 구성을 규정할 수 있다.
데이터 경로는 파이프라인 처리될 (pipelined) 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 데이터 경로는 산술 논리연산 장치 ("ALU")를 포함할 수 있다. 컨트롤 회로는 명령어를 해독할 수 있다. 컨트롤 회로는 데이터 경로를 제어할 수 있다. 클럭 회로는 하나 이상의 컨트롤 장치 및 데이터 경로의 타이밍 (timing)을 지배할 수 있다. 컨트롤 회로는 하나 이상의 유한 상태 (finite state) 기기, 읽기 전용 (read-only) 기억장치 및 내부 처리 장치를 임의의 적합한 조합으로 포함할 수 있다.
기억장치 회로는 스케일링 계수와 같은 컴퓨터 변수 값을 제공할 수 있다. 기억장치는 명령어, 예컨대 목적 함수를 계산하기 위해 요구되는 것을 제공할 수 있다. 기억장치는 하나 이상의 레지스터 (register)를 포함할 수 있다. 기억장치는 하나 이상의 수준의 캐시 (cache)를 포함할 수 있다. 기억장치는 주소지정 (addressing) 구성요소를 포함할 수 있다. 주소지정 구성요소는 가상 기억장치 시스템을 통제할 수 있다. 주소지정 구성요소는 외부 기억장치 및/또는 기억장치에 대한 접근을 통제할 수 있다.
마이크로프로세서는 레지스터 및 일부 또는 모든 캐시와 함께 단일 실리콘 다이 (die) 상에 집적될 수 있다. 하나 이상의 수준의 캐시는 마이크로프로세서 다이의 외부에 있을 수 있다.
기억장치는 하나 이상의 임의 접근 기억장치 ("RAM"), 읽기 전용 기억장치 ("ROM"), 플래시 (Flash) 기억장치, 전기적 소거가능 프로그램가능 기억장치 ("EEPROM"), 전기적 프로그램가능 기억장치 ("EPROM"), 자기 디스크, 자기 테이프, 드럼 (drum), 광 디스크 및 임의의 다른 적합한 기억장치를 포함할 수 있다.
기억장치는 마이크로프로세서 다이 상에 포함될 수 있는 "기판 상 (on board)" 구성요소 (예를 들어, 레지스터 기억장치 및 캐시로서 지정된 기억장치), 및 마이크로프로세서 다이의 외부에 있을 수 있는 "외부 기억장치" 구성요소로 나누어질 수 있다. 외부 기억장치는 물리적 주소지정가능 기억장치 (예를 들어, 주 기억장치/코어 (core) 기억장치로서 지정될 수 있는 기억장치) 또는 가상 주소지정가능 기억장치의 일부일 수 있다. 자기 디스크 기억장치는 비휘발성 저장을 위해 사용될 수 있다. 자기 디스크 기억장치는 가상 기억장치 시스템의 일부일 수 있다.
I/O 회로는 마이크로프로세서 다이의 내부 또는 외부에 있을 수 있다. I/O 접속성 (connectivity)은 하드웨어 구성요소 (예를 들어, 프린터, 프로세스-제어 요소 및 다른 적합한 하드웨어 구성요소)에 직접 접속을 포함할 수 있다. I/O 접속성은 네트워크와 통신하기 위한 하나 이상의 네트워킹 (networking) 구성요소 (예컨대 유선 모뎀, 무선 (wireless) 접속 WIFI, 근거리장 (near-field) 접속 및 다른 적합한 네트워킹 구성요소)을 포함할 수 있다. 네트워크는 유선 통신 내의 노드 (node)를 포함할 수 있다. 네트워크는 무선 통신 내의 노드를 포함할 수 있다. 네트워크는 광역 네트워크 ("WAN"), 근거리 (local area) 네트워크 ("LAN"), WIFI 네트워크, 또는 임의의 다른 적합한 종류의 네트워크를 포함할 수 있다.
I/O 접속의 종류에 대해, 정보는 전송장치 (transmitter)를 이용하여 보내질 수 있다. I/O 접속의 종류에 대해, 정보는 수신장치 (receiver)를 이용하여 받을 수 있따. 일부 경우에, 전송장치 및 수신장치는 송수신기 (transceiver) 내에 합쳐질 수 있다. 대개 정보는 패킷 (packet) 내에 조직화된 디지털 정보이다. 그러나, 정보는 단일 전송된 비트 (bit), 예컨대 기계를 켜는 또는 프로세스 또는 계산의 상태를 나타내는 것, 또는 단일 수신된 비트, 예컨대 센서, 프로세스 또는 계산의 상태를 나타내는 것일 수 있거나, 아날로그 전압 또는 전류를 포함할 수 있다.
전송장치는 하드웨어 구성요소를 포함할 수 있다. 전송장치는 소프트웨어 구성요소를 포함할 수 있다. 하드웨어는 유선 접속성과 또는 그를 통해 라디오 주파수 에너지가 전파하는 무선 매체와 물리적으로 상호작용하도록 포함될 수 있다. 전송장치 하드웨어는 라디오 전송장치를 포함할 수 있다. 전송장치는 하드웨어 구성요소만을 가질 수 있다. 하드웨어의 일부는 마이크로프로세서, 마이크로컴퓨터 및 마이크로컨트롤러의 외부에 있을 수 있다. 예를 들어, 단일 비트 출력은 기기를 제어하기 위해 레벨 시프팅 (level shifting) 증폭기를 이용할 수 있다. 일부 전송장치 프로토콜은 소프트웨어 업데이트를 통해 업데이트될 수 있다.
수신장치는 하드웨어 구성요소를 포함할 수 있다. 수신장치는 소프트웨어 구성요소를 포함할 수 있다. 하드웨어는 유선 접속성과 또는 그를 통해 라디오 주파수 에너지가 전파하는 무선 매체와 물리적으로 상호작용하도록 포함될 수 있다. 수신장치 하드웨어는 라디오 수신장치를 포함할 수 있다. 수신장치는 하드웨어 구성요소만을 가질 수 있다. 하드웨어의 일부는 마이크로프로세서, 마이크로컴퓨터 및 마이크로컨트롤러의 외부에 있을 수 있다. 예를 들어, 단일 비트 출력은 센서로부터 데이터를 수신하기 위해 레벨 시프팅 증폭기를 이용할 수 있다. 일부 수신장치 프로토콜은 소프트웨어 업데이트를 통해 업데이트될 수 있다.
계산 기기는 항체의 하나 이상의 물리화학적 특징에 상응하는 목적 함수를 선택하는 수단을 포함하도록 구성될 수 있다.
계산 기기는 기기 판독가능 기억장치 (기계 기억장치) 내에 항체 용액 상태 하에 목적 함수 스케일링 계수의 값을 확인하는 수단을 포함하도록 구성될 수 있다. 계산 기기는 확인된 스케일링 계수 값을 검색하는 수단을 포함하도록 구성될 수 있다.
계산 기기는 항체 구조적 파라미터를 처리하기 위한 수단을 포함하도록 구성될 수 있다. 처리는 논리 처리일 수 있다. 처리는 수치적 처리일 수 있다. 처리는 파라미터를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 처리는 파라미터의 값을 생성할 수 있다. 처리는 항체 구조 특징에 기반할 수 있다. 처리는 용액 상태에 기반할 수 있다.
계산 기기는 목적 함수를 평가하기 위한 수단을 포함하도록 구성될 수 있다. 평가는 파라미터의 값 및 스케일링 계수의 값에 기반할 수 있다. 목적 함수의 평가는 용액 상태 하에 항체의 하나 이상의 물리화학적 특징의 값의 예측을 생성할 수 있다.
계산 기기는 예측을 하나 이상의 물리화학적 특징에 상응하는 설계 기준에 비교하기 위한 수단을 포함하도록 구성될 수 있다.
계산 기기는 비교에 기반하여 항체를 선택하는 수단을 포함하도록 구성될 수 있다. 항체는 예측이 설계 기준에 부합하는 경우에 선택될 수 있다. 항체는 항체 생산을 위해 선택될 수 있다.
본 발명의 특징 및 원리의 조합
상기 설명된 본 발명의 특징 및 원리를 예시적인 물리화학적 특징에 적용하는 방법을 이제 설명할 것이다. 예시적인 물리화학적 특징은 점도, 클리어런스, 아스파르트산 불안정성 및 트립토판 불안정성을 포함한다.
방법은 상기 설명된 특징 및 원리를 물리화학적 특징의 하나에 또는 서로 임의의 조합의 2 이상의 물리화학적 특징의 조합에 적용하는 것을 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
방법은 장치, 매체, 또는 둘 모두의 특징의 임의의 조합에 의해 실행할 수 있다.
점도
물리화학적 특징은 항체의 점도일 수 있다. 설계 기준은 점도 한계일 수 있다. 설계 기준은 항체의 점도가 점도 한계와 동일할 경우 충족된 것으로 간주될 수 있다. 설계 기준은 항체의 점도가 점도 한계 미만일 경우 충족된 것으로 간주될 수 있다. 점도 한계는 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 cP일 수 있다. 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성 결정, 몇몇의 항체 후보물질로부터 항체의 선택, 항체의 제조, 기존재하는 항체의 변형 및 표적-항체의 생산을 위한 점도-기반 방법을 아래에서 논의한다. 하나의 방법의 하나 이상의 단계는 다른 방법의 하나 이상의 단계와 조합하여 수행될 수 있음이 이해될 것이다.
점도: 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성 또는 적합성 결정 방법
방법은 항체의 점도를 기초로 하여 치료제에 포함되기 위한 적절성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 (a) 항체 구조적 정보로부터 (1) 순 전하; 및 (2) 전하 비대칭을 계산하고; (b) 항체를 순 전하에 대응하는 제1 스케일링 계수 (또는 순 전하 스케일링 계수), 및 전하 비대칭에 대응하는 제2 스케일링 계수 (또는 전하 비대칭 스케일링 계수)에 대해 선택하고; (c) 스케일링 계수를 포함하는 목적 함수로부터 점도에 대응하는 지수를 계산하고; (d) 지수를 설계 기준과 비교하고; (e) 항체가 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는지 결정하는 것을 포함할 수 있다.
구조적 정보로부터의 계산은 1차 구조의 정보로부터의 계산을 포함할 수 있다. 1차 구조는 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 방법은 가변 도메인의 구조적 정보로부터 순 전하의 계산을 포함할 수 있다. 순 전하는 VL 아미노산 서열의 순 전하 및 VH 아미노산 서열의 순 전하의 합계를 포함할 수 있다. 방법은 가변 도메인의 구조적 정보로부터 전하 비대칭의 계산을 포함할 수 있다. 전하 비대칭은 VL 아미노산 서열의 순 전하와 VH 아미노산 서열의 순 전하와의 산술적인 곱을 포함할 수 있다. 방법은 (3) 하나 이상의 상보성 결정 영역으로부터 소수성을 계산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
방법은 항체의 아미노산 서열을 서열결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 항체 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
방법은 가변 도메인의 단일 상보성 결정 영역의 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 단일 상보성 결정 영역은 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 임의의 하나일 수 있다. 방법은 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 상보성 결정 영역은 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다. 하나 이상의 상보성 결정 영역은 6개의 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다. 소수성은 하나 이상의 상보성 결정 영역의 소수성 값의 합계로서 계산될 수 있다. 소수성은 하나 이상의 CDR의 소수성의 값의 합산 함수의 총계를 포함할 수 있다. 각각의 합산 함수는 CDR의 소수성 잔기의 값의 합계 대 CDR의 친수성 잔기의 값의 합계의 비일 수 있다. 방법은 Fv 도메인의 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 항체의 훈련 세트가 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체를 포함할 때 Fv 도메인의 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 소수성 잔기 또는 친수성 잔기의 값은 주어진 아미노산 잔기에 대한 아이젠버그 소수성 스케일 값일 수 있다.
점도는 비제한적으로 원뿔 평판식 (cone-and-plate) 및 낙구식 (falling ball) 점도계를 포함하는 점도계를 사용함으로써 실험에 의해 측정할 수 있다.
방법은 지수를 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 지수는 목적 함수로부터 정량될 수 있다. 목적 함수는 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 지수는 점도에 대응할 수 있다.
방법은 항체가 설계 기준 점도 한계를 충족하는 점도를 갖는지 결정하기 위해 지수를 설계 기준 점도 한계와 비교하는 것을 포함할 수 있다.
목적 함수에서, 지수의 log10은 다음 합계에 따라 결정될 수 있다: (순 전하 X 제1 스케일링 계수) + (전하 비대칭 X 제2 스케일링 계수) + (소수성 X 제3 스케일링 계수). 목적 함수는 지수=10상수10합계의 일반적인 형태를 가질 수 있다.
방법은 스케일링 계수를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 스케일링 계수는 제1 스케일링 계수 (또는 순 전하 스케일링 계수)를 포함할 수 있다. 제1 스케일링 계수는 순 전하에 대응할 수 있다. 스케일링 계수는 제2 스케일링 계수 (또는 전하 비대칭 스케일링 계수)를 포함할 수 있다. 제2 스케일링 계수는 전하 비대칭에 대응할 수 있다. 스케일링 계수는 제3 스케일링 계수 (또는 소수성 스케일링 계수)를 포함할 수 있다. 제3 스케일링 계수는 소수성에 대응할 수 있다. 스케일링 계수는 다수의 제1 스케일링 계수, 다수의 제2 스케일링 계수 및 다수의 제3 스케일링 계수를 포함할 수 있는 스케일링 계수의 세트로부터 선택될 수 있다. 방법은 적어도 하나의 시험 항체의 적어도 하나의 점도 측정의 데이터로부터 스케일링 계수를 유도하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 항체 및 시험 항체는 동일한 항체 클래스의 것이다. 스케일링 계수는 유도된 스케일링 계수일 수 있다.
용액 상태는 이온 강도를 포함할 수 있다. 낮은 이온 강도 용액에 대해, 제3 스케일링 계수는 0일 수 있다. 낮은 이온 강도 용액의 예는 20-30 밀리몰 농도의 완충제 용액일 수 있다.
낮은 이온 강도 용액에 대해, 방법은 항체 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 것을 포함하지 않을 수 있고, 합계 및 스케일링 계수는 제3 스케일링 계수를 포함하지 않을 수 있다. 낮은 이온 강도 용액에 대해, 방법은 제3 스케일링 계수를 선택하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 낮은 이온 강도 용액에 대한 목적 함수에서, 지수의 log10은 다음 합계에 따라 결정될 수 있다: (순 전하 X 제1 스케일링 계수) + (전하 비대칭 X 제2 스케일링 계수).
높은 이온 강도 용액에 대해, 물리화학적 특징에 대한 지수의 밀접한 대응성은 소수성을 계산할 때 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 높은 이온 강도 용액의 예는 약 200 밀리몰 농도의 이온성 완충제일 수 있다.
예를 들어, 약 25℃ 및 약 pH 5.5에서 약 200 밀리몰의 완충제 용액 내의 모노클로날 IgG1에 대해, 제1, 제2 및 제3 스케일링 계수는 다음과 같이 항체 농도를 추적할 수 있다:
약 150 밀리그램/밀리리터의 항체 농도에 대해, 제1 스케일링 계수는 약 -0.036일 수 있고, 제2 스케일링 계수는 약 -0.012일 수 있고, 제3 스케일링 계수는 약 0.34일 수 있고; 약 180 밀리그램/밀리리터의 항체 농도에 대해, 제1 스케일링 계수는 약 -0.05일 수 있고, 제2 스케일링 계수는 약 -0.017일 수 있고, 제3 스케일링 계수는 약 0.42일 수 있다.
주어진 값 또는 범위 앞의 용어 "약"은 해당 값에서 또는 범위 내에서 얻은 것과 실질적으로 유사한 결과를 얻기 위한 값 또는 범위가 충분히 근접함을 나타낼 수 있다. "실질적으로 유사한" 결과는 해당 값에서 또는 범위 내에서 얻은 결과의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 내일 수 있다.
상기 높은 이온 강도 예에 대해, 각각의 예시적인 항체 농도에 대한 지수의 정량은 센티푸아즈로 측정된 점도에 밀접하게 대응하는 지수를 생성할 수 있다. 일부 항체 클래스 및 서브클래스에 대해, 방법은 항체의 불변 영역 구조적 정보로부터 불변 영역 전하 비대칭의 계산을 포함할 수 있다. 이들 클래스 및 서브클래스에 대해, 스케일링 계수의 세트는 다수의 불변 영역 전하 비대칭 스케일링 계수를 포함할 수 있고, 방법은 항체에 대해 불변 영역 전하 비대칭에 대응할 수 있는 항체 불변 영역 전하 비대칭 스케일링 계수 (또는 제4 스케일링 계수)를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 이들 클래스 및 서브클래스에 대해, 목적 함수는 불변 영역 전하 비대칭 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 항체 클래스 (또는 서브클래스)는 IgG4일 수 있다.
이들 클래스 및 서브클래스에 대해, 지수의 log10은 다음 합계에 따라 결정될 수 있다: (순 전하 X 제1 스케일링 계수) + (가변 도메인 전하 비대칭 X 제2 스케일링 계수) + (소수성 X 제3 스케일링 계수), 및 (클래스 (또는 서브클래스)에 따라 불변 영역 전하 비대칭 X 불변 영역 전하 비대칭 스케일링 계수).
이들 클래스 및 서브클래스에서, 낮은 이온 강도 용액에 대해, 제3 스케일링 계수는 0일 수 있다. 낮은 이온 강도 용액에 대해, 방법은 항체 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 것을 포함하지 않을 수 있고, 합계 및 스케일링 계수는 제3 스케일링 계수를 포함하지 않을 수 있다. 낮은 이온 강도 용액에 대해, 방법은 제3 스케일링 계수의 선택을 포함하지 않을 수 있다. 낮은 이온 강도 용액에 대한 목적 함수에서, 지수의 log10은 다음 합계에 따라 결정될 수 있다: (순 전하 X 제1 스케일링 계수) + (가변 도메인 전하 비대칭 X 제2 스케일링 계수) + (불변 영역 전하 비대칭 X 불변 영역 전하 비대칭 스케일링 계수).
그에 대해 방법이 불변 영역 전하 비대칭을 계산하고 이용할 수 있고 방법이 대응하는 불변 영역 전하 비대칭 스케일링 계수를 선택하고 이용할 수 있는 클래스 및 서브클래스는 IgG4를 포함할 수 있다.
점도: 치료제에 포함되기 위한 항체 후보물질의 선택 방법
방법은 점도를 기초로 하여 2 이상의 항체 후보물질로부터 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있고, 점도 적절성을 결정하기 위한 방법의 단계를 포함하지 않거나, 단계의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
방법은 제1 항체 후보물질의 제1 구조적 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 제1 구조적 정보는 제1 항체 후보물질의 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 방법은 제2 항체 후보물질의 제2 구조적 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 제2 구조적 정보는 제2 항체 후보물질의 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법은 제1 구조적 정보로부터 다음과 같은 제1 세트의 구조적 파라미터를 수치적으로 계산하는 것을 포함할 수 있다: (1) 제1 순 전하; (2) 제1 전하 비대칭; 및 (3) 제1 소수성. 방법은 제2 구조적 정보로부터 다음과 같은 제2 세트의 구조적 파라미터를 수치적으로 계산하는 것을 포함할 수 있다: (1) 제2 순 전하; (2) 제2 전하 비대칭; 및, (3) 제2 소수성.
방법은 제1 지수를 제1 목적 함수로부터 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 제1 목적 함수는 제1 세트의 물리화학적 파라미터에 대응하는 제1 세트의 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 제1 지수는 제1 항체 후보물질에 대응할 수 있다. 제1 지수는 제1 항체 후보물질의 제1 점도에 대응할 수 있다. 방법은 제2 지수를 제2 목적 함수로부터 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 제2 목적 함수는 제2 세트의 구조적 파라미터에 대응하는 제2 세트의 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 제2 지수는 제2 항체 후보물질에 대응할 수 있다. 제2 지수는 제2 항체 후보물질의 제2 점도에 대응할 수 있다. 제1 및 제2 세트의 스케일링 계수 및 목적 함수는 동일할 수 있다. 제1 및 제2 세트의 스케일링 계수 및 목적 함수는 상이할 수 있다.
스케일링 계수의 각각의 세트는 순 전하에 대응하는 순 전하 스케일링 계수, 전하 비대칭에 대응하는 전하 비대칭 스케일링 계수 및 소수성에 대응하는 소수성 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 항체 후보물질의 일부 클래스 및 서브클래스에 대해, 제1 세트의 전하 비대칭 스케일링 계수 및/또는 제2 세트의 스케일링 계수는 가변 도메인 전하 비대칭 스케일링 계수일 수 있다.
특정 클래스 및 서브클래스에 대해 of 항체 후보물질, 방법은 제1 항체 후보물질의 및/또는 제2 항체 후보물질의 불변 영역 구조적 정보로부터 각각 제1 세트의 구조적 파라미터에 대한 제1 불변 영역 전하 비대칭 및/또는 제2 세트의 구조적 파라미터에 대한 제2 불변 영역 전하 비대칭을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 클래스 및 서브클래스의 예는 IgG4일 수 있다.
제1 목적 함수 및 제2 목적 함수는 각각 제1 항체 후보물질 및 제2 항체 후보물질에 대한 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 낮은 이온 강도 용액 내의 항체 후보물질에 대해, 소수성 스케일링 계수는 0일 수 있다. 낮은 이온 강도 용액 내의 항체 후보물질에 대해, 방법은 소수성의 계산을 포함하지 않을 수 있다. 낮은 이온 강도 용액 내의 항체 후보물질에 대해, 목적 함수는 소수성 스케일링 계수를 포함하지 않을 수 있다.
제1 항체 후보물질의 클래스 또는 서브클래스가 제2 항체 후보물질의 클래스 또는 서브클래스일 경우, 제1 세트의 스케일링 계수는 제2 세트의 스케일링 계수와 동일할 수 있다. 제1 항체 후보물질의 용액 상태가 제2 항체 후보물질의 용액 상태일 경우, 제1 세트의 스케일링 계수는 제2 세트의 스케일링 계수와 동일할 수 있다.
제1 지수는 설계 기준 점도 한계를 충족할 수 있다. 제2 지수는 설계 기준 점도 한계를 충족할 수 있다.
방법은 제1 지수 및 제2 지수의 상대적인 값을 기초로 하여 치료제에 사용하기 위한 항체인 제1 항체 후보물질 또는 제2 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제1 지수가 제2 지수보다 낮으면 제1 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제2 지수가 제1 지수보다 낮으면 제2 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제1 및 또는 제2 지수를 설계 기준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 선택된 항체는 설계 기준을 충족하는 점도를 가질 수 있다.
점도: 치료제의 제조 방법
제조 방법은 제조 또는 치료제 분배 용기를 기초로 하여 항체에 대한 점도 한계를 설정하는 것을 포함할 수 있다. 치료제의 제조 방법은 점도 적절성을 결정하기 위한 방법의 단계를 포함하지 않거나, 단계의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
제조 방법은 제조 용기 또는 분배 용기 내의 유체 전달 요소 (conducting element)의 확인을 포함할 수 있다. 유체 전달 요소는 파이프, 밸브, 다공성 플러그 (plug) 또는 임의의 다른 유체 전달 요소를 포함할 수 있다. 임의의 다른 유체 전달 요소는 튜브, 크로마토그래프 매질 또는 필터를 포함할 수 있다. 유체 전달 요소는 유체 유동 저항을 가질 수 있다. 유체 유동 저항은 제조 및/또는 분배의 수성 용액 상태의 설정 하의 항체의 점도에 따라 결정될 수 있다.
제조 방법은 항체의 구조적 정보로부터 항체의 점도에 대응하는 지수를 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 정량은 항체의 점도 적절성의 결정 방법을 따를 수 있다.
방법은 지수가 한계를 초과하지 않을 경우에만 항체를 유체 전달 요소를 통해 전송하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 지수가 한계를 초과하지 않을 경우에만 항체를 제조하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 치료제의 점도가 점도 한계를 초과하지 않도록 표적-항체를 구축하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 표적-항체의 아미노산 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 점도 한계 미만의 점도 지수에 대응할 수 있다.
아미노산 서열의 결정은 기존재하는 항체의 시험-항체 아미노산 서열로부터 시험 점도를 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 정량은 항체의 점도 적절성을 결정하기 위한 방법의 단계를 포함하지 않거나, 단계의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 제조 용기 내의 유체 전달 요소의 유체 유동 저항을 기초로 하여 항체에 대한 점도 한계를 설정하고, 여기서 유체 유동 저항은 유체 전달 요소를 통해 유동하는 유체의 점도에 따라 결정되고; 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고; 구조적 정보로부터 계산된 항체의 점도의 지수를 네트워크를 통해 수신하고; 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만, 조성물의 제조를 위해 항체를 전달 요소를 통해 전송하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 제조 용기 내의 유체 전달 요소의 유체 유동 저항을 기초로 하여 항체에 대한 점도 한계를 설정하고, 여기서 유체 유동 저항은 유체 전달 요소를 통해 유동하는 유체의 점도에 따라 결정되고; 항체의 점도의 지수를 항체의 구조적 정보로부터 계산하고; 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만, 조성물의 제조를 위해 항체를 전달 요소를 통해 전송하는 것을 포함할 수 있다.
점도: 항체의 생산 방법
설계 기준을 충족하는 점도를 갖는 항체의 생산 방법은 (a) 항체에 대한 점도 한계를 설정하는 단계; (b) 본원 전체에 걸쳐 설명되는 방법에 따라 항체의 구조적 정보로부터 항체의 점도에 대응하는 지수를 계산하고; 항체가 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는지 결정하는 단계; (c) 지수가 점도 한계를 초과하지 않을 경우 항체를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
설계 기준을 충족하는 점도를 갖는 항체의 생산 방법은 설계 기준을 충족하는, 항체에 대한 점도 한계를 설정하는 단계; 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하는 단계; 구조적 정보로부터 계산된, 항체의 점도에 대응하는 지수를 네트워크를 통해 수신하는 단계; 항체가 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는지 결정하는 단계; 및 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만 항체를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 각각의 실시양태에 대해, 지수는 항체의 구조적 정보로부터 순 전하 및 전하 비대칭을 계산하는 단계; 항체를 순 전하에 대응하는 제1 스케일링 계수, 및 전하 비대칭에 대응하는 제2 스케일링 계수에 대해 선택하는 단계; 스케일링 계수를 포함하는 목적 함수로부터 점도에 대응하는 지수를 계산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 계산된다. 구조적 정보로부터의 계산은 1차 구조의 정보로부터의 계산을 포함할 수 있다. 1차 구조는 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 순 전하는 VL 아미노산 서열의 순 전하 및 VH 아미노산 서열의 순 전하의 합계를 포함할 수 있다. 전하 비대칭은 VL 아미노산 서열의 순 전하와 VH 아미노산 서열의 순 전하와의 산술적인 곱을 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 시험 항체의 적어도 하나의 점도 측정 데이터로부터 스케일링 계수를 유도하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 항체 및 시험 항체는 동일한 항체 클래스의 것이다. 스케일링 계수의 선택은 각각의 하나 이상의 수성 용액 상태에 대한 스케일링 계수의 세트로부터 제1 스케일링 계수 및 제2 스케일링 계수를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 목적 함수, 지수의 log10은 (순 전하 X 제1 스케일링 계수) + (전하 비대칭 X 제2 스케일링 계수)의 합계를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 각각의 실시양태에 대해, 방법은 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 정보로부터, 항체의 구조적 정보로부터 소수성을 계산하고; 소수성에 대응하는 제3 스케일링 계수를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 목적 함수는 제3 스케일링 계수를 추가로 포함한다. 소수성은 하나 이상의 CDR의 소수성의 값의 합산 함수의 총계를 포함할 수 있다. 각각의 합산 함수는 CDR의 소수성 잔기의 값의 합계 및 CDR의 친수성 잔기의 값의 합계의 비일 수 있다. 값은 아이젠버그 소수성 스케일 값일 수 있다. 하나 이상의 CDR은 1, 2, 3, 4, 5개 또는 6개 모두의 CDR을 포함할 수 있다. 스케일링 계수의 선택은 각각의 하나 이상의 수성 용액 상태에 대한 스케일링 계수의 세트로부터 제1 스케일링 계수, 제2 스케일링 계수 및 제3 스케일링 계수를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 목적 함수에서, 지수의 log10은 (순 전하 X 제1 스케일링 계수) + (전하 비대칭 X 제2 스케일링 계수) + (소수성 X 제3 스케일링 계수)의 합계를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 각각의 실시양태에 대해, 방법은 지수가 점도 한계를 초과할 때 표적 항체를 생성하기 위해 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열에 돌연변이를 유발하는 단계는 표적 항체의 지수가 점도 한계를 초과하지 않도록 소수성을 감소시키고/시키거나, 순 전하를 증가시키고/시키거나 전하 비대칭을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 방법은 표적 항체의 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 방법 및 장치에 의해 점도의 설계 기준을 충족하도록 선택, 생산 및/또는 결정된 항체를 제공한다.
클리어런스
물리화학적 특징은 항체의 약동학적 클리어런스율일 수 있다. 설계 기준은 약동학적 클리어런스율 한계일 수 있다. 설계 기준은 항체의 클리어런스율이 클리어런스율 한계와 동일하면 충족된 것으로 간주될 수 있다. 설계 기준은 항체의 클리어런스율이 클리어런스율 한계보다 더 작으면 충족된 것으로 간주될 수 있다. 클리어런스율 한계는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 mL/kg/일일 수 있다. 클리어런스율 한계는 Cyno 원숭이에서 10 mL/kg/일일 수 있다.
치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성 결정, 몇몇의 항체 후보물질로부터 항체의 선택, 항체의 제조, 기존재하는 항체의 변형 및 표적-항체의 생산을 위한 클리어런스율-기반 방법을 아래에서 논의한다. 하나의 방법의 하나 이상의 단계는 다른 방법의 하나 이상의 단계와 조합하여 수행될 수 있음이 이해될 것이다.
클리어런스 : 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성 또는 적합성을 결정하는 방법
방법은 클리어런스를 기초로 하여 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 순 전하를 항체 구조적 정보로부터 계산하는 것을 포함할 수 있다. 순 전하 범위는 수성 용액 상태에 따라 결정될 수 있다. 순 전하는 순 전하 범위에 부합될 수 있다. 순 전하 범위는 -4 내지 12일 수 있다. 순 전하 범위는 -2 내지 6.2일 수 있다. 순 전하 범위는 0 내지 6.2일 수 있다. 순 전하 범위는 항체의 훈련 세트의 용액 상태 및 샘플 크기에 따라 상이할 수 있다.
방법은 (a) 순 전하가 순 전하 범위에 부합될 수 있을 경우, 하나 이상의 CDR의 구조적 정보로부터 소수성을 계산하고, (i) 소수성이 소수성 한계를 초과하지 않을 때 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는다고 결정하거나 또는 (ii) 소수성이 소수성 한계보다 더 높을 때 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고; (b) 순 전하가 순 전하 범위에 부합되지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하는 것을 포함할 수 있다. 구조적 정보는 1차 구조의 정보일 수 있다. 1차 구조는 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 순 전하는 pH 5.5에서 VH 및 VL의 순 전하일 수 있다. 순 전하 범위는 약 -2.0 내지 약 6.2일 수 있다. 소수성 한계는 약 4일 수 있다.
방법은 가변 도메인의 단일 상보성 결정 영역의 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 본원에서 설명되는 하나 이상의 상보성 결정 영역의 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 다수의 상보성 결정 영역은 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다. 소수성은 하나 이상의 상보성 결정 영역의 소수성 값의 합계로서 계산될 수 있다. 하나 이상의 CDR은 경쇄 (LC) CDR1, LC CDR3 및 중쇄 (HC) CDR3일 수 있다. 방법은 항체 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 결과 섹션 및 도면은 클리어런스율에 대한 지수의 대응성을 개시한다.
클리어런스 : 치료제에 포함되기 위한 항체 후보물질의 선택 방법
방법은 2 이상의 항체 후보물질 중에서 클리어런스율을 기초로 하여 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있고, 클리어런스 적절성을 결정하기 위한 방법의 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항체는 치료제에 포함되기 위한 2개의 항체 후보물질로부터 선택될 수 있다. 선택 방법은 제1 항체 후보물질의 제1 구조적 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 제1 구조적 정보는 제1 항체 후보물질의 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택 방법은 제2 항체 후보물질의 제2 구조적 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 제2 구조적 정보는 제2 항체 후보물질의 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 방법은 제1 구조적 정보로부터 제1 순 전하를, 제1 항체 후보물질의 하나 이상의 CDR로부터 제1 소수성을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제2 구조적 정보로부터 제2 순 전하를, 제2 항체 후보물질의 하나 이상의 CDR로부터 제2 소수성을 계산하는 것을 포함할 수 있다.
제1 순 전하 범위 및 제2 순 전하 범위는 수성 용액 상태에 따라 결정될 수 있다. 제1 순 전하 범위 및 제2 순 전하 범위는 각각 제1 항체 후보물질의 클래스 또는 서브클래스 및 제2 항체 후보물질의 클래스 또는 서브클래스에 따라 결정될 수 있다. 제1 및 제2 순 전하 범위는 동일할 수 있다. 제1 및 제2 순 전하 범위는 상이할 수 있다.
방법은 제1 지수 및 제2 지수의 상대적인 값을 기초로 하여 치료제에 사용하기 위한 항체로 제1 항체 후보물질 또는 제2 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 다른 항체 후보물질 또는 항체 후보물질들보다 더 낮은 소수성을 갖는 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
클리어런스 : 치료제의 제조 방법
제조 방법은 유지 용량을 기초로 하여 항체에 대한 클리어런스율 한계를 설정하는 것을 포함할 수 있다. 치료제의 제조 방법은 클리어런스율 적절성을 결정하기 위한 방법의 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
제조 방법은 치료제에 대한 유지 용량을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 유지 용량은 항체의 약동학적 클리어런스율에 따라 결정될 수 있다. 클리어런스율은 생리학적 조건의 세트 하의 항체의 클리어런스율일 수 있다. 생리학적 조건은 항체의 치료 용도에서 발생할 수 있다.
방법은 항체가 한계를 초과하지 않는 클리어런스율을 갖는 경우에만 항체를 제조 또는 생산하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고; 구조적 정보로부터 계산된 항체의 순 전하를 네트워크를 통해 수신하고; 순 전하가 순 전하 범위에 부합될 경우, 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 정보로부터, 구조적 정보로부터 계산된 소수성을 네트워크를 통해 수신하고, (i) 소수성이 소수성 한계를 초과하지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는다고 결정하거나 또는 (ii) 소수성이 소수성 한계를 초과할 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고; 순 전하가 순 전하 범위에 부합되지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고; 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는 것으로 결정된 경우에만 항체를 생산하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는 항체 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 항체의 순 전하를 항체의 구조적 정보로부터 계산하고; 순 전하가 순 전하 범위에 부합될 경우, 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 정보로부터, 구조적 정보로부터 소수성을 계산하고, (i) 소수성이 소수성 한계를 초과하지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는다고 결정하거나 또는 (ii) 소수성이 소수성 한계를 초과할 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고; 순 전하가 순 전하 범위에 부합되지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고; 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는 것으로 결정된 경우에만 항체를 생산하는 것을 포함한다.
본원에서 설명되는 각각의 실시양태에 대해, 구조적 정보로부터의 계산은 1차 구조의 정보로부터의 계산을 포함할 수 있다. 1차 구조는 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 순 전하는 VL 아미노산 서열의 순 전하 및 VH 아미노산 서열의 순 전하의 합계를 포함할 수 있다. 순 전하는 약 pH 5.5에서 VH의 순 전하 및 VL의 순 전하의 합계를 포함할 수 있다. 소수성은 하나 이상의 CDR의 소수성의 값의 합산 함수의 총계를 포함할 수 있다. 합산 함수는 CDR의 소수성 잔기의 값의 합계 및 CDR의 친수성 잔기의 값의 합계의 비일 수 있다. 값은 아이젠버그 소수성 스케일 값일 수 있다. 하나 이상의 CDR은 1, 2, 3, 4, 5개 또는 6개 모두의 CDR을 포함할 수 있다. 하나 이상의 CDR은 경쇄 (LC) CDR1, LC CDR3 및 중쇄 (HC) CDR3일 수 있다. 클리어런스율은 시노몰거스 원숭이 모델에서 측정시에 약 10 mL/kg/일 이하일 수 있다. 순 전하 범위는 약 -2.0 내지 약 6.2일 수 있다. 소수성 한계는 약 4일 수 있다.
방법은 지수가 표적 핵산의 클리어런스율이 클리어런스율 한계를 초과하지 않도록 표적 항체를 생성하기 위해 기존재하는 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 표적 항체의 순 전하가 순 전하 범위에 부합되도록 순 전하를 증가 또는 감소시키고/시키거나 표적 항체의 소수성이 소수성 한계를 초과하지 않도록 소수성을 증가 또는 감소시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
방법은 표적-항체의 아미노산 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 표적 항체의 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 방법 및 장치에 의해 클리어런스의 설계 기준을 충족하도록 선택, 생산 및/또는 결정된 항체를 제공한다.
아스파르트산 불안정성
물리화학적 특징은 항체의 아스파르트산 (Asp) 불안정성일 수 있다. Asp 불안정성은 Asp 잔기의 이성질체화에 대응할 수 있다. Asp 잔기는 항체의 CDR에 존재할 수 있다. 설계 기준은 Asp 불안정성 한계일 수 있다. 설계 기준은 항체의 Asp 불안정성이 Asp 불안정성 한계와 동일할 경우 충족된 것으로 간주될 수 있다. 설계 기준은 항체의 Asp 불안정성이 Asp 불안정성 한계 미만일 경우 충족된 것으로 간주될 수 있다. Asp 불안정성 한계는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 또는 그 미만일 수 있다. Asp 불안정성 한계는 40℃에서 2주에 걸쳐 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 또는 그 미만일 수 있다. Asp 불안정성 한계는 40℃에서 2주에 걸쳐 5% 이하일 수 있다.
치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성 결정, 몇몇의 항체 후보물질로부터 항체의 선택, 항체의 제조, 기존재하는 항체의 변형 및 표적-항체의 생산을 위한 Asp-불안정성-기반 방법을 아래에서 논의한다. 하나의 방법의 하나 이상의 단계는 다른 방법의 하나 이상의 단계와 조합하여 수행될 수 있음이 이해될 것이다.
Asp 불안정성: 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성의 결정 방법
방법은 Asp 불안정성을 기초로 하여 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 (a) 항체 구조적 정보로부터 (1) Asp α-탄소의 요동, (2) Asp 잔기의 시간 평균한 SASA 및 (3) Asp 잔기에 바로 인접한 잔기와 회합된 주쇄 질소 원자의 시간 평균한 SASA를 계산하고, 여기서 주쇄 질소 원자는 서열에서 Asp 잔기에 바로 인접한 잔기와 회합할 수 있고; (b) 항체에 대해 (i) 요동 스케일링 계수, (ii) 아스파르트산 잔기 표면적 스케일링 계수, 및 (iii) 주쇄 질소 원자 표면적 스케일링 계수를 선택하고; (c) 스케일링 계수를 포함하는 목적 함수로부터 아스파르트산 불안정성에 대응하는 지수를 계산하고; (d) 항체가 설계 기준을 충족하는 아스파르트산 불안정성을 갖는지 결정하는 것을 포함할 수 있다. 계산은 MD 시뮬레이션을 이용할 수 있다. MD 시뮬레이션은 시뮬레이션된 용액 상태의 세트를 이용할 수 있고, 명시적 물 용매화를 이용할 수 있다.
Asp 잔기는 CDR에 존재할 수 있다. 아스파르트산 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기는 N 위치의 아스파르트산 잔기에 비해 N+1 위치에 존재한다.
방법은 스케일링 계수의 선택을 포함할 수 있다. 스케일링 계수는 유도된 스케일링 계수일 수 있다. 스케일링 계수는 Asp α-탄소 요동에 대응하는 요동 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 스케일링 계수는 Asp SASA에 대응하는 Asp SASA 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 스케일링 계수는 주쇄 질소 원자 SASA에 대응하는 주쇄 질소 원자 SASA 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 스케일링 계수는 다수의 요동 스케일링 계수, 다수의 Asp SASA 스케일링 계수 및 다수의 주쇄 질소 원자 SASA 스케일링 계수를 포함할 수 있는 스케일링 계수의 세트로부터 선택될 수 있다.
방법은 지수를 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 지수는 목적 함수로부터 정량될 수 있다. 목적 함수는 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 지수는 Asp 불안정성에 대응할 수 있다.
방법은 항체가 설계 기준 Asp 불안정성 한계를 충족하는 Asp 불안정성을 갖는지 결정하기 위해 지수를 설계 기준 Asp 불안정성 한계와 비교하는 것을 포함할 수 있다.
목적 함수에서, 지수는 다음 합계만큼 거듭제곱되는 오일러 수 (Euler's number) (밑수 e)에 따라 결정될 수 있다: (Asp α-탄소 요동 X 요동 스케일링 계수) + (시간 평균한 Asp SASA X Asp SASA 스케일링 계수) + (주쇄 질소 원자의 시간 평균한 용매 접근가능 SASA X 주쇄 질소 원자 SASA 스케일링 계수). 목적 함수는 목적 함수는 지수=e상수e합계의 일반적인 형태를 가질 수 있다. 목적 함수는 지수=1/(e상수e합계)의 일반적인 형태를 가질 수 있다. 목적 함수는 지수=1/(1+e상수e합계)의 일반적인 형태를 가질 수 있다.
예를 들어, 예시적인 방법 섹션에 설명된 바와 같이 명시적 물 용매화 및 다른 시뮬레이션된 용액 상태를 사용하는 약 300 K의 시뮬레이션된 온도에서 모노클로날 IgG1에 대해, 요동 스케일링 계수는 약 3.3일 수 있고; Asp SASA 스케일링 계수는 약 -22.2일 수 있고; 주쇄 질소 원자 SASA 스케일링 계수는 약 16.0일 수 있다.
방법은 제1 지수인 지수를 포함할 수 있고, 제1 지수는 제2 지수를 생성하기 위해 한 개의 유효 숫자로 반올림된다. 제2 지수는 1 또는 0일 수 있다. 0인 제2 지수는 제1 지수가 설계 기준 불안정성 한계를 충족한다는 표시에 대응할 수 있다.
Asp 불안정성: 치료제에 포함되기 위한 항체를 후보물질 중에서 선택하는 방법
방법은 Asp 불안정성을 기초로 하여 2 이상의 항체 후보물질 중에서 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있고, Asp 불안정성 적절성을 결정하기 위한 방법의 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
선택 방법은 제1 항체 후보물질의 제1 구조적 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 제1 구조적 정보는 제1 항체 후보물질의 제1 가변 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택 방법은 제2 항체 후보물질의 제2 구조적 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 제2 구조적 정보는 제2 항체 후보물질의 제2 가변 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법은 (1) 제1 항체 후보물질의 제1 Asp α-탄소의 제1 요동, (2) 제1 Asp 잔기의 제1 시간 평균한 SASA 및 (3) 제1 Asp 잔기에 바로 인접한 잔기와 회합된 제1 주쇄 질소 원자의 제1 시간 평균한 SASA를 포함하는 제1 세트의 물리화학적 파라미터를 제1 구조적 정보로부터 계산하는 것을 포함할 수 있다. 제1 Asp 잔기는 제1 항체 후보물질의 CDR에 존재할 수 있다. 제1 주쇄 질소 원자는 서열에서 제1 Asp 잔기에 바로 인접한 잔기와 회합될 수 있다.
방법은 (1) 제2 항체 후보물질의 제2 Asp α-탄소의 제2 요동, (2) 제2 Asp 잔기의 제2 시간 평균한 SASA 및 (3) 제2 Asp 잔기에 바로 인접한 잔기와 회합된 제2 주쇄 질소 원자의 제2 시간 평균한 SASA를 포함하는 제2 세트의 물리화학적 파라미터를 제2 구조적 정보로부터 수치적으로 계산하는 것을 포함할 수 있다. 제2 Asp 잔기는 제2 항체 후보물질의 CDR에 존재할 수 있다. 제2 주쇄 질소 원자는 서열에서 제2 Asp 잔기에 바로 인접한 잔기와 회합될 수 있다.
방법은 제1 지수를 제1 목적 함수로부터 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 제1 목적 함수는 제1 세트의 물리화학적 파라미터에 대응하는 제1 세트의 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 제1 지수는 제1 항체 후보물질에 대응할 수 있다. 제1 지수는 제1 항체 후보물질의 제1 Asp 불안정성에 대응할 수 있다. 제1 Asp 불안정성은 제1 아스파르트산 이성질체화에 대응할 수 있다.
방법은 제2 지수를 제2 목적 함수로부터 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 제2 목적 함수는 제2 세트의 물리화학적 파라미터에 대응하는 제2 세트의 스케일링 계수를 포함할 수 있다. 제2 지수는 제2 항체 후보물질에 대응할 수 있다. 제2 지수는 제2 항체 후보물질의 제2 Asp 불안정성에 대응할 수 있다. 제2 Asp 불안정성은 제2 아스파르트산 이성질체화에 대응할 수 있다.
스케일링 계수의 각각의 세트는 α-탄소 요동에 대응하는 α-탄소 요동 스케일링 계수, Asp SASA에 대응하는 Asp SASA 스케일링 계수 및 주쇄 질소 SASA에 대응하는 주쇄 질소 원자 SASA 스케일링 계수를 포함할 수 있다.
제1 목적 함수 및 제2 목적 함수는 각각 제1 항체 후보물질 및 제2 항체 후보물질에 대한 스케일링 계수를 포함할 수 있다. Asp 불안정성 적절성을 결정하는 방법이 적용되는 항체와 동일한 시뮬레이션된 용액 상태 하에서, 항체 후보물질에 대한 목적 함수는 동일한 클래스 또는 서브클래스의 항체 후보물질에 대해 Asp 불안정성 적절성을 결정하기 위한 방법에서 이용되는 목적 함수와 동일할 수 있다.
제1 항체 후보물질의 서브클래스가 제2 항체 후보물질의 클래스 또는 서브클래스일 경우, 제1 세트의 스케일링 계수는 제2 세트의 스케일링 계수와 동일할 수 있다. 제1 항체 후보물질의 용액 상태가 제2 항체 후보물질의 용액 상태일 경우, 제1 세트의 스케일링 계수는 제2 세트의 스케일링 계수와 동일할 수 있다. 제1 항체 후보물질 및 제2 항체 후보물질에 대한 물 용매화의 값이 동일할 경우, 제1 세트의 스케일링 계수는 제2 세트의 스케일링 계수와 동일할 수 있다.
제1 지수는 설계 기준 Asp 불안정성 한계를 충족할 수 있다. 제2 지수는 설계 기준 Asp 불안정성 한계를 충족할 수 있다.
방법은 제1 지수 및 제2 지수의 상대적인 값을 기초로 하여 치료제에 사용하기 위한 항체인 제1 항체 후보물질 또는 제2 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제1 지수가 제2 지수보다 더 낮으면 제1 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제2 지수가 제1 지수보다 더 낮으면 제2 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 선택된 항체의 Asp 불안정성을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 선택된 항체의 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Asp 불안정성: 치료제의 제조 방법
제조 방법은 예를 들어 항체에 대한 저장 수명을 기초로 하여 항체에 대한 Asp 불안정성 한계를 설정하는 것을 포함할 수 있다. 항체의 제조 방법은 Asp 불안정성 적절성을 결정하기 위한 방법의 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 항체는 치료제일 수 있거나, 치료제 내에 포함될 수 있다.
제조 방법은 저장 수명의 확인을 포함할 수 있다. 저장 수명은 치료제 내에 포함될 수 있는 항체의 Asp 불안정성에 따라 결정될 수 있다. 아스파르트산 불안정성은 아스파르트산 이성질체화에 대응할 수 있다. 설계 기준는 불안정성 한계일 수 있다. 불안정성 한계는 저장 수명을 기초로 할 수 있다. 불안정성 한계는 약 2.5%/주의 아스파르트산 이성질체화일 수 있다.
방법은 지수가 한계를 초과하지 않을 경우에만 항체를 제조하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열은 아스파르트산 잔기를 포함한다. 방법은 설계 기준을 충족하는, 항체에 대한 아스파르트산 불안정성 한계를 설정하고; 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고; 구조적 정보로부터 계산된, 항체의 아스파르트산 불안정성에 대응하는 지수를 네트워크를 통해 수신하고; 항체가 설계 기준을 충족하는 아스파르트산 불안정성을 갖는지 결정하고; 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만 항체를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 설계 기준을 충족하는, 항체에 대한 아스파르트산 불안정성 한계를 설정하고; 항체의 아스파르트산 불안정성에 대응하는 지수를 항체의 구조적 정보로부터 계산하고; 항체가 설계 기준을 충족하는 아스파르트산 불안정성을 갖는지 결정하고; 지수가 아스파르트산 불안정성 한계를 초과하지 않는 경우에만 항체를 생산하는 것을 포함할 수 있다.
제조 방법은 항체의 구조적 정보로부터 항체의 Asp 불안정성에 대응하는 지수를 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 정량은 항체의 Asp 불안정성 적절성의 결정 방법을 따를 수 있다.
지수는 CDR의 아미노산 서열로부터 (i) 아스파르트산 잔기와 회합된 알파 탄소의 평균 제곱근 요동, (ii) 아스파르트산 잔기의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적, 및 (iii) 아스파르트산 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기와 회합된 주쇄 질소 원자의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 계산하는 단계; 항체에 대해 (i) 요동 스케일링 계수, (ii) 아스파르트산 잔기 표면적 스케일링 계수, 및 (iii) 주쇄 질소 원자 표면적 스케일링 계수를 선택하는 단계; 스케일링 계수를 포함하는 목적 함수로부터 아스파르트산 불안정성에 대응하는 지수를 계산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 계산할 수 있다. 아스파르트산 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기는 N 위치의 아스파르트산 잔기에 비해 N+1 위치에 존재할 수 있다. 스케일링 계수는 적어도 하나의 시험 항체의 적어도 하나의 아스파르트산 불안정성 측정치의 데이터로부터 유래될 수 있다. 적어도 하나의 시험 항체의 아스파르트산 불안정성 측정은 특정 온도에서 적어도 하나의 시험 항체의 인큐베이션, 이어서 질량 분광분석법 및 HPLC-기반 기술의 적용을 포함할 수 있다. 스케일링 계수의 선택은 각각의 하나 이상의 수성 용액 상태에 대해 (i) 요동 스케일링 계수, (ii) 아스파르트산 잔기 표면적 스케일링 계수; 및 (iii) 주쇄 질소 원자 표면적 스케일링 계수를 포함하는 스케일링 계수의 세트로부터 선택하는 것을 포함할 수 있다. 목적 함수에서, 지수는 (요동 X 요동 스케일링 계수) + (아스파르트산 잔기의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적 X 아스파르트산 잔기 표면적 스케일링 계수) + (주쇄 질소 원자의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적 X 주쇄 질소 원자 표면적 스케일링 계수)의 합계만큼 거듭제곱되는 오일러 수를 포함한다. 수성 용액 상태는 온도, pH, 완충제 종류 및 이온 강도를 포함할 수 있다. 수성 용액 상태는 20 mM 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함할 수 있다. 수성 용액 상태는 약 313 K의 온도를 포함할 수 있다. 지수는 제1 지수이고, 제1 지수는 제2 지수를 생성하기 위해 한 개의 유효 숫자로 반올림할 수 있고, 0인 제2 지수는 점도 한계를 초과하지 않는 제1 지수에 대응하고, 1인 제2 지수는 점도 한계를 초과하는 제1 지수에 대응한다. 아스파르트산 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기는 글라이신, 트레오닌, 아스파르트산 및 알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 방법은 치료제의 Asp 불안정성이 Asp 불안정성 한계를 초과하지 않도록 표적-항체를 구축하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 각각의 실시양태에 대해, 방법은 표적 항체의 지수가 설계 기준을 충족하도록 표적 항체를 생성하기 위해 기존재하는 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 표적 항체의 Asp 불안정성을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 표적 항체의 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
방법은 표적-항체의 아미노산 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 Asp 불안정성 한계 미만의 Asp 불안정성 지수에 대응할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 방법 및 장치에 의해 아스파르트산 불안정성의 설계 기준을 충족하도록 선택, 생산 및/또는 결정된 항체를 제공한다.
트립토판 불안정성
물리화학적 특징은 항체의 트립토판 (Trp) 불안정성일 수 있다. Trp 불안정성은 Trp 잔기의 산화에 대응할 수 있다. Trp 잔기는 항체의 CDR에 존재할 수 있다. 설계 기준은 Trp 불안정성 한계일 수 있다. 설계 기준은 항체의 Trp 불안정성이 Trp 불안정성 한계와 동일할 경우 충족된 것으로 간주될 수 있다. 설계 기준은 항체의 Trp 불안정성이 Trp 불안정성 한계 미만일 경우 충족된 것으로 간주될 수 있다. Trp 불안정성 한계는 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10% 산화일 수 있다. Trp 불안정성 한계는 규정된 조건의 세트 하에 항체에 대해 규정될 수 있다.
치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성 결정, 몇몇의 항체 후보물질로부터 항체의 선택, 항체의 제조, 기존재하는 항체의 변형 및 표적-항체의 생산을 위한 Trp-불안정성-기반 방법을 아래에서 논의한다. 하나의 방법의 하나 이상의 단계는 다른 방법의 하나 이상의 단계와 조합하여 수행될 수 있음이 이해될 것이다.
Trp 불안정성: 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성의 결정 방법
방법은 Trp 불안정성을 기초로 하여 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 항체 구조적 정보로부터 CDR 내의 Trp 잔기의 시간 평균한 SASA를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 계산에서는 MD 시뮬레이션을 이용할 수 있다. MD 시뮬레이션에서는 시뮬레이션된 용액 상태의 세트를 이용할 수 있고, 명시적 물 용매화를 이용할 수 있다.
방법은 (a) 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열로부터 트립토판 잔기의 시간 평균한 SASA를 계산하는 단계; (b) 시간 평균한 SASA를 컷오프 값에 비교하는 단계; (c) 시간 평균한 SASA가 컷오프 값 미만일 때 항체가 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는다고 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 컷오프 값은 80 Å2 트립토판 측쇄 SASA일 수 있다. 중쇄 가변 도메인 (VH)의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열은 단지 1개의 트립토판 잔기를 함유할 수 있다.
별법으로, 방법은 지수를 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 지수는 목적 함수로부터 정량될 수 있다. 지수는 Trp 불안정성에 대응할 수 있다.
방법은 항체가 설계 기준 Trp 불안정성 한계를 충족하는 Trp 불안정성을 갖는지 결정하기 위해 지수를 설계 기준 Trp 불안정성 한계와 비교하는 것을 포함할 수 있다.
목적 함수에서, 지수는 시간 평균한 Trp SASA에 따라 결정될 수 있다.
방법은 설계 기준을 충족하는 Trp 불안정성을 갖는 항체의 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Trp 불안정성: 치료제에 포함되기 위한 항체를 후보물질 중에서 선택하는 방법
방법은 2 이상의 항체 후보물질 중에서 항체를 Trp 불안정성을 기초로 하여 선택하는 것을 포함할 수 있고, Trp 불안정성 적절성을 결정하기 위한 방법의 단계를 포함하지 않거나, 단계의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
선택 방법은 제1 항체 후보물질의 제1 구조적 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 제1 구조적 정보는 제1 항체 후보물질의 제1 가변 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택 방법은 제2 항체 후보물질의 제2 구조적 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 제2 구조적 정보는 제2 항체 후보물질의 제2 가변 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법은 제1 구조적 정보로부터 제1 Trp 잔기의 제1 시간 평균한 SASA를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 제1 Trp 잔기는 제1 항체 후보물질의 CDR에 존재할 수 있다.
방법은 제2 구조적 정보로부터 제2 Trp 잔기의 제2 시간 평균한 SASA를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 제2 Trp 잔기는 제2 항체 후보물질의 CDR에 존재할 수 있다.
방법은 제1 또는 제2 항체의 Trp 잔기의 시간 평균한 SASA가 가 컷-오프 값 미만인 경우, 제1 또는 제2 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 제1 지수를 제1 목적 함수로부터 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 제1 지수는 제1 항체 후보물질에 대응할 수 있다. 제1 지수는 제1 항체 후보물질의 제1 Trp 불안정성에 대응할 수 있다. 제1 Trp 불안정성은 제1 트립토판 산화에 대응할 수 있다.
방법은 제2 지수를 제2 목적 함수로부터 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 제2 지수는 제2 항체 후보물질에 대응할 수 있다. 제2 지수는 제2 항체 후보물질의 제2 Trp 불안정성에 대응할 수 있다. 제2 Trp 불안정성은 제2 트립토판 산화에 대응할 수 있다.
제1 지수는 설계 기준 Trp 불안정성 한계를 충족할 수 있다. 제2 지수는 설계 기준 Trp 불안정성 한계를 충족할 수 있다.
방법은 제1 지수 및 제2 지수의 상대적인 값을 기초로 하여 치료제에 사용하기 위한 항체인 제1 항체 후보물질 또는 제2 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제1 지수가 제2 지수보다 더 낮으면 제1 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제2 지수가 제1 지수보다 더 낮으면 제2 항체 후보물질을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
Trp 불안정성: 치료제의 제조 방법
제조 방법은 항체에 대한 Trp 불안정성 한계를 설정하는 것을 포함할 수 있다. 치료제의 제조 방법은 Trp 불안정성 적절성을 결정하기 위한 방법의 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. Trp 불안정성 한계는 항체에 대한 저장 수명을 기초로 할 수 있다. 트립토판 불안정성은 트립토판 산화에 대응할 수 있다. 항체는 치료제일 수 있다.
제조 방법은 저장 수명의 확인을 포함할 수 있다. 저장 수명은 치료제 내에 포함될 수 있는 항체의 Trp 불안정성에 따라 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는 항체의 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고; 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열로부터 CDR의 트립토판 잔기의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 네트워크를 통해 수신하고, 여기서 시간 평균한 용매 접근가능 표면적은 구조적 정보로부터 계산되고; 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 컷오프 값에 비교하고; 시간 평균한 용매 접근가능 표면적이 컷오프 값 미만일 때 항체가 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는다고 결정하고; 항체가 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는다고 결정된 경우에만 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
방법은 트립토판 잔기의 시간 평균한 SASA를 계산하는 단계; 시간 평균한 SASA를 컷오프 값에 비교하는 단계; 시간 평균한 SASA가 컷오프 값 미만일 때 항체가 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는다고 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 설계 기준을 충족하는 항체를 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 각각의 실시양태에 대해, 물 용매화의 값은 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 계산하는 기초일 수 있다. 물 용매화는 분자 동역학 시뮬레이션의 컴퓨터 모델링의 파라미터일 수 있다. 분자 동역학 시뮬레이션은 앰버 (AMBER) 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 컷오프 값은 약 80 Å2 트립토판 측쇄 용매 접근가능 표면적일 수 있다. 트립토판 측쇄 용매 접근가능 표면적은 아레아이몰 (AREAIMOL) 소프트웨어를 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 6개의 모든 CDR의 아미노산 서열은 단지 1개의 트립토판 잔기를 함유할 수 있다. 방법은 항체가 설계 기준을 충족하는 Trp 불안정성을 갖는 것으로 결정될 때 Trp 불안정성을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 항체의 구조적 정보로부터 항체의 Trp 불안정성에 대응하는 지수를 전자적으로 정량하는 것을 포함할 수 있다. 정량은 항체의 Trp 불안정성 적절성의 결정 방법을 따를 수 있다.
방법은 지수가 한계를 초과하지 않을 경우에만 항체를 제조하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 Trp 잔기를 기존재하는 항체 내의 또 다른 비-Trp 잔기로 치환하여 표적 항체를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 표적 항체의 생산 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 방법 및 장치에 의해 트립토판 불안정성의 설계 기준을 충족하도록 선택, 생산 및/또는 결정된 항체를 제공한다.
실시예
예시적인 방법
시험 항체는 아래에 논의한 항체의 훈련 세트 내에 포함될 수 있음이 이해될 것이다.
스케일링 계수는 아래의 논의에서 "계수"로서 칭할 수 있음이 이해될 것이다.
예시적인 방법 또는 설명적인 결과와 연관하여 설명된 특징은 특징이 그를 이용하여 설명되는 예시적인 방법 또는 설명적인 결과에 제한되는 것으로 의도되지 않음이 이해될 것이다.
mAb
사용된 mAb는 차이니즈 햄스터 난소 세포 내에서 발현에 의해 얻고 단백질 A 크로마토그래피 및 이온-교화 크로마토그래피에 의한 친화도 정제를 포함한 일련의 크로마토그래피 방법에 의해 정제한 예시적인 IgG1 모노클로날 항체이었다.
서열-기반 구조적 파라미터
전하
주어진 pH에서 주어진 서열에 대한 순 전하는 측쇄의 공지의 pKa (예를 들어, 문헌 [Berg, J.M., Tymoczko, J.L. & Stryer, L. Biochemistry. (W.H. Freeman, Basingstoke)] 참조) 및 핸더슨-하셀발크 식을 이용하여 모든 하전된 아미노산에 대한 기여도를 합함으로써 계산하였다. 모든 Cys가 디술피드 형성에 관연되는 것을 가정하여, Cys pKa를 고려하지 않았다.
Fv 전하 비대칭 파라미터 ( FvCAP )
FvCAP는 VH 및 VL 도메인 사이의 전하 비대칭을 포획하기 위해 개발되었다. FvCAP는 VH 도메인 및 VL 도메인 상의 순 전하 사이의 곱을 얻음으로써 간단히 계산하였다. 따라서, 음성 곱은 2개의 도메인 사이의 전하 비대칭을 나타내는 반면, 양성 곱은 2개의 도메인 상의 전하의 유사한 기호를 나타낼 것이다.
소수성 지수 (HI)
HI는 소수성 아미노산 대 친수성 아미노산의 상대적인 비를 나타내도록 개발되었다. 각각의 아미노산의 상대적인 소수성 강도는 이들 계산에서 아이젠버그 소수성 스케일을 이용하여 가중하였다 (예를 들어, 문헌 [Eisenberg, D., Weiss, R.M., Terwilliger, T.C. & Wilcox, W. Hydrophobic moments and protein structure. Faraday Symposia of the Chemical Society 17, 109-120 (1982)] 참조). 양성 스케일 값을 갖는 모든 아미노산을 소수성으로서 분류한 반면, 음성 스케일 값을 갖는 것을 친수성으로서 분류하였다.
HI는 다음과 같이 정의하였다: HI = (niEi/njEj), 여기서 i는 소수성 아미노산, 즉, A, F, I, L, V, W, Y를 나타내고, j는 친수성 아미노산, 즉, D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, T를 나타내고; n은 각각의 아미노산의 수이고, E는 각각의 아미노산의 아이젠버그 스케일 값이다. 단백질의 3-D 구조에 대해 계산을 수행할 수 있고, 여기서, 상기 계산에서, 파라미터 n을 S로 치환하고, 여기서 S는 각각의 아미노산의 SASA로서 정의한다 (도 16).
물리화학적 특징
점도
점도 측정은 안톤 파아르 (Anton Paar) 피지카 (Physica) MCR 501 동심 (concentric) 원통형 원뿔 평판식 점도계 (안톤 파아르, 오스트리아 그라츠)를 사용하여 수행하였다. 항체 용액을 표적 농도로 조정한 후, 70 ㎕의 각각의 샘플 단백질 용액을 샘플 평판 상에 분배하고, 원뿔을 낮추었다. 샘플을 증발을 차단시키고, 온도를 25+/-5℃에서 제어하였다. 샘플 점도는 1000 s-1의 불변 전단율 (shear rate)을 사용하여 60 s 동안 매초 회전력 (torque every second)을 측정함으로써 결정하였다. 점도 측정치는 3개의 샘플 복제물을 사용하는 안정화된 점도 측정치의 평균으로서 기록하였다. 샘플 분석 및 데이터 기록은 안톤 파아르 레오플러스 (RheoPlus) 소프트웨어를 사용하여 이루어졌다.
클리어런스
본 연구에서 사용된 Cyno 원숭이에서 클리어런스 값은 이전에 공개된 데이터 (예를 들어, 문헌 [Hotzel, I. et al. A strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance. mAbs 4, 753-760)] 참조)로부터 얻었다.
MD 시뮬레이션
MD 출발 구조
Fab의 구조는 3-D 결정 구조 (이용가능하다면), 또는 모델러 (Modeller)의 국소 채택을 이용하여 생성된 상동성 모델로부터 얻었다 (예를 들어, 문헌 [Sali, A. & Blundell, T.L. Comparative Protein Modeling by Satisfaction of Spatial Restraints. J Mol Biol 234, 779-815 (1993)] 참조). Fab 도메인을 이온 (필요한 경우에) 및 분명한 용매 분자의 첨가 이전에 MD를 위한 출발 구조로서 사용하였다.
아스파르테이트 이성질체화 분석을 위한 그로맥스 ( GROMACS )를 이용하는 MD.
Fab의 MD 시뮬레이션을 그로맥스 (Gromacs) 4.0 시뮬레이션 소프트웨어 패키지를 이용하여 수행하였다 (예를 들어, 문헌 [Hess, B., Kutzner, C., van der Spoel, D. & Lindahl, E. GROMACS 4: Algorithms for highly efficient, load-balanced, and scalable molecular simulation. Journal of Chemical Theory and Computation 4, 435-447 (2008)] 참조). OPLSAA 힘장 (force field) (예를 들어, 문헌 [Jorgensen, W.L., Maxwell, D.S. & TiradoRives, J. Development and testing of the OPLS all-atom force field on conformational energetics and properties of organic liquids. J Am Chem Soc 118, 11225-11236 (1996)]; [Xu, Z.T., Luo, H.H. & Tieleman, D.P. Modifying the OPLS-AA force field to improve hydration free energies for several amino acid side chains using new atomic charges and an off-plane charge model for aromatic residues. J Comput Chem 28, 689-697 (2007)] 참조)을 이용하여 원자 운동을 계산하였다. 적정가능한 잔기의 전하 상태는 실험적 방법 PROPKA를 이용하여 평가하였다 (예를 들어, 문헌 [Li, H., Robertson, A.D. & Jensen, J.H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values. Proteins 61, 704-721 (2005)]; [Bas, D.C., Rogers, D.M. & Jensen, J.H. Very fast prediction and rationalization of pKa values for protein-ligand complexes. Proteins 73, 765-783 (2008)] 참조). 모든 잔기를 그들의 기준 양성자화 상태로 설정하였다.
Fab 및 Fv 단편을 TIP3P (예를 들어, 문헌 [Jorgensen, W.L., Chandrasekhar, J., Madura, J.D., Impey, R.W. & Klein, M.L. Comparison of Simple Potential Functions for Simulating Liquid Water. J Chem Phys 79, 926-935 (1983)] 참조) 물 분자로 완전히 용매화시켰다. 약 10,000개의 물 분자를 사용하여 Fv를 용매화시키고, 25,500개의 물 분자를 사용하여 Fab를 용매화시켰다. 클로라이드 또는 나트륨 원자를 첨가하여 필요한 경우에 시스템의 전체 전하를 중화시켰다. 8면 주기적 경계 조건을 각각의 시뮬레이션에서 사용하였다. 정전기적 상호작용은 1.0 nm의 실제 공간 정전기적 컷오프를 갖는 PME (예를 들어, 문헌 [Darden, T., York, D. & Pedersen, L. Particle Mesh Ewald - an N.Log(N) Method for Ewald Sums in Large Systems. J Chem Phys 98, 10089-10092 (1993)] 참조)를 사용하여 계산하였다. 반데어발스 (van der Waals) 상호작용을 설명하는 레너드-존스 (Lennard-Jones) 포텐셜은 1.0 nm에서 컷오프이었다. 세틀 (Settle) 알고리즘 (예를 들어, 문헌 [Miyamoto, S. & Kollman, P.A. Settle - an Analytical Version of the Shake and Rattle Algorithm for Rigid Water Models. J Comput Chem 13, 952-962 (1992)] 참조)을 물 분자의 결합 길이 및 각을 제약하기 위해 사용하고, 링크스 (Lincs)를 모든 다른 결합 길이를 제약하기 위해 사용하고 (예를 들어, 문헌 [Hess, B., Bekker, H., Berendsen, H.J.C. & Fraaije, J.G.E.M. LINCS: A linear constraint solver for molecular simulations. J Comput Chem 18, 1463-1472 (1997)] 참조), 그로맥스 4.0에서 vsite 알고리즘을 이용하여, 4 펨토초 (fs) 시간-단계를 허용하기 위해 알킬 및 아미드 수소 운동을 제거하였다. 이들 시뮬레이션 내내, V-rescale 알고리즘 (예를 들어, 문헌 [Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. Canonical sampling through velocity rescaling. J Chem Phys 126, (2007)] 참조)을 이용하여 시스템을 300 K의 온도조에 연결함으로써 온도를 일정하게 유지하였다. 시스템의 밀도가 수렴하도록 허용하는 200 피코초 (ps) 평형화 동안, 시스템을 1.0 atm의 압력조에 연결시킴으로써 압력을 일정하게 유지하였다 (예를 들어, 문헌 [Berendsen, H.J.C, Postma, J.P.M., Vangunsteren, W.F., Dinola, A. & Haak, J.R. Molecular-Dynamics with Coupling to an External Bath. J Chem Phys 81, 3684-3690 (1984)] 참조). 평형화 이후, 시뮬레이션을 불변 부피에서 유지하였다. 이들 시뮬레이션으로부터 운동궤적 (trajectory)을 그로맥스 프로그램 스위트에서 이용가능한 다양한 도구를 사용하여 분석하였다. 모든 SASA는 그로맥스의 g_sas를 이용하여 계산하고 (예를 들어, 문헌 [Eisenhaber, F., Lijnzaad, P., Argos, P., Sander, C. & Scharf, M. The double cube lattice method: efficient approaches to numerical integration of surface area and volume and to dot surface contouring of molecular assemblies. J. Comp. Chem. 16, 273-284 (1995)] 참조); 상호 정보 계산은 레인지 및 그럽뮐러 (Lange and Grubmuller)에 유사하게 국소적으로 실행하고 (예를 들어, 문헌 [Kortkhonjia, E. et al. Solution dynamics of monoclonal antibodies: Experimental and computational approach. mAb In Press (2013)]; [Lange, O.F. & Grubmuller, H. Full correlation analysis of conformational protein dynamics. Proteins-Structure Function and Genetics 70, 1294-1312 (2008)] 참조); φ-ψ 분포에 대한 샤논 엔트로피는 다음과 같이 계산된다: S = -∑{φi,ψj빈]p(i,j)log(p(i,j)), 여기서 p(i,j)는 빈(bin){φi,ψj} 내의 발견 {φ,ψ}의 확률이고, 빈은 3°그리드에 의해 규정되고, φ-ψ 분포는 g_rama로부터의 것이고; 그로맥스의 g_rsmf, g_hbond, 및 dssp를 사용하여 각각 평균 제곱근 요동, 수소 결합, 및 2차 구조 상태를 계산하였다. 샤논 엔트로피 및 상호 정보에 대한 분석 방법의 상세한 내용은 이전에 발표된 바 있다 (예를 들어, 문헌 [Kortkhonjia, E. et al. Solution dynamics of monoclonal antibodies: Experimental and computational approach. mAb In Press (2013)] 참조).
트립토판 산화 분석에 대한 앰버를 사용하는 MD
Fab 단편의 MD 시뮬레이션은 앰버 (Amber) 11 시뮬레이션 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [D.A. Case, T.A.D., T.E. Cheatham, III, C.L. Simmerling, J. Wang, R.E. Duke, R. Luo, R.C. Walker, W. Zhang, K.M. Merz, B. Roberts, B. Wang, S. Hayik, A. Roitberg, G. Seabra, I.K., K.F. Wong, F. Paesani, J. Vanicek, X. Wu, S.R. Brozell, T. Steinbrecher, H. Gohlke, Q. Cai, X. Ye, J. Wang, M.-J. Hsieh, G. Cui, D.R. Roe, D.H. & Mathews, M.G.S., C. Sagui, V. Babin, T. Luchko, S. Gusarov, A. Kovalenko, and P.A. Kollman University of California, San Francisco; 2011)] 참조). FF99SB 고정-전하 힘장을 사용하였다. 모든 잔기를 그들의 열동역학 pKa에 기반한 기준 양성자부가 상태로 설정하였다.
Fab 단편을 TIP3P 물 분자로 완전히 용매화시켰다. 약 35,000개의 물 분자를 사용하여 Fab를 용매화시켰다. 클로라이드 또는 나트륨 원자를 첨가하여 시스템의 전체 전하를 중화시켰다. 8면 주기적 경계 조건을 각각의 시뮬레이션에서 사용하였다. 정전기적 상호작용은 0.8 nm의 정전기적 컷오프를 갖는 PME를 사용하여 계산하였다. SHAKE 알고리즘을 이용하여, 3 fs의 시간-단계의 사용을 허용하는 알킬 및 아미드 수소 운동을 제거하였다 .
이들 시뮬레이션 내내, 시스템을 3/psec의 충돌 주파수를 갖는 랑제방 (Langevin) 동역학을 이용하여 300 K의 온도조에 연결시킴으로써 온도를 일정하게 유지하였다. 에너지 최소화, 평형화, 및 후속적인 생산 실행 동안, 시스템을 1.0 atm의 압력조에 연결함으로써 압력을 일정하게 유지하였다.
MD 시뮬레이션으로부터 운동궤적을 공용 도구를 이용하여 분석하였다. 모든 SASA는 아레아이몰 (CCP4 프로그램의 일부인 프로그램)을 사용하여 계산하였다 (예를 들어, 문헌 [Bailey, S. The Ccp4 Suite - Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallogr D 50, 760-763 (1994)] 참조). SASA를 펩티드 백본 원자를 포함하지 않는, 각각의 트립토판 측쇄에 대해 결정하였다.
2,2'- 아조비스 (2- 아미디노프로판 ) 디히드로클로라이드 ( AAPH )-유도된 Trp 산화
AAPH-유도된 산화는 mAb 용액을 AAPH와 각각 1 mg/ml 및 1 mM의 최종 농도로 혼합함으로써 수행하였다 (예를 들어, 문헌 [Ji, J.A., Zhang, B., Cheng, W. & Wang, Y.J. Methionine, tryptophan, and histidine oxidation in a model protein, PTH: Mechanisms and stabilization. Journal of Pharmaceutical Sciences 98, 4485-4500 (2009)] 참조). 용액을 40℃에서 16시간 동안 인큐베이팅하였다. 20 mM Met를 첨가한 후 PD-10 탈염 컬럼을 이용하여 pH 5.5에서 20 mM 완충제 내로 완충제 교환함으로써 반응을 켄칭시켰다. 이어서, 부위 특이적 Trp 산화에 대해, 트립신에 의한 소화에 이어 LC-MS/MS를 이용하여 용액을 분석하였다. 대응하는 펩티드의 추출된 이온 크로마토그램을 엑스칼리버 큐얼 브라우저 (Xcalibur Qual Browser)를 사용하여 수동으로 통합하였다. 상대적인 산화 백분율은 후속적으로 산화된 펩티드 이온의 피크 면적을 산화된 펩티드 및 대응하는 비-산화된 펩티드의 피크 면적의 합으로 나눔으로써 계산하였다.
Asp 분해 속도의 실험적 결정
mAb 용액을, pH 5.5에서 20 mM 완충된 용액, 240 mM 수크로스 내의 5 mg/ml의 단백질의 최종 제제를 갖는 센트리콘 (Centricon) 한외여과 튜브를 사용하여 완충제 교환하였다. 샘플을 40℃에 놓고, t=0, 14일 및 28일에서 꺼냈다.
LC-MS/MS 트립신에 의한 펩티드 매핑 (mapping)
열 스트레스를 가한 샘플을 트립신에 의한 펩티드 소화에 이어 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 단백질 샘플을 근소하게 변형시킨 공개된 프로토콜에 따라 소화시켰다 (예를 들어, 문헌 [Yu, X.C. et al. Accurate determination of succinimide degradation products using high fidelity trypsin digestion peptide map analysis. Analytical chemistry 83, 5912-5919 (2011)] 참조).
펩티드 매핑은 쥬피터 (Jupiter) C18 컬럼 (페노메넥스 (Phenomenex), 2.0x250 mm, 5 ㎛ 입자 크기)이 장치되고 써모 피셔 (Thermo Fisher) LTQ Orbitrap 질량 분광분석기에 연결된 애질런트 (Agilent) 1200 HPLC 시스템 상에서 수행하였다. 용매 A는 물 중 0.1% TFA로 이루어지고, 용매 B는 90% 아세토니트릴 중 0.09% TFA로 이루어졌다. 2-단계 구배를 사용하였다; 20분 내에 0 - 10% B, 이어서 137분에 걸쳐 10 내지 40% B. 유속은 0.25 mL/min이고, 컬럼 온도는 55℃이고, 단백질 로드 (load)는 22 ㎍이었다. 각각의 부위에서 분해 수준을 Xcalibur 소프트웨어를 이용하여 추출된 이온 크로마토그래피 (EIC)에 의해 결정하였다 (예를 들어, 문헌 [Yu, X.C. et al. Accurate determination of succinimide degradation products using high fidelity trypsin digestion peptide map analysis. Analytical chemistry 83, 5912-5919 (2011)] 참조).
회귀 분석
주성분 회귀 및 로지스틱 (Logistic) 회귀 분석은 XLSTAT® (애딘소프트 (Addinsoft, 미국 뉴욕주 뉴욕))을 이용하여 수행하였다.
예시적인 결과
점도
점도는 고농도 mAb 용액의 제조 및 전달을 위해 중요할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shire, S.J., Shahrokh, Z. & Liu, J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 93, 1390-1402 (2004)] 참조). 주로 상보성 결정 영역 (CDR) 서열에서만 상이한 mAb는 전단 응력의 유사한 조건 하에 다양한 점도-농도 프로파일을 보일 수 있음이 관찰되었다 (도 7). 유사한 이소형 IgG에 대해, 가변 도메인 Fv (및 CDR)는 점도의 차이를 일으키는 분자간 상호작용을 규정하는데 중요한 역할을 할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kanai, S., Liu, J., Patapoff, T. & Shire, S.J. Reversible self-association of a concentrated monoclonal antibody solution mediated by Fab-Fab interaction that impacts solution viscosity. Journal of Pharmaceutical Sciences (2008)]; [Liu, J., Nguyen, M.D.H., Andya, J.D. & Shire, S.J. Reversible self-association increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody in aqueous solution. Journal of Pharmaceutical Sciences 94, 1928-1940 (2005)] 참조). 본 발명의 목표 중 하나는 기여하는 소수성 및 정전기적 요소를 포획하기 위해 CDR 및 Fv로부터 어떤 파라미터가 추출될 수 있는지 결정하기 위한 것이다 (예를 들어, 문헌 [Du, W. & Klibanov, A.M. Hydrophobic salts markedly diminish viscosity of concentrated protein solutions. Biotechnology and Bioengineering 108, 632-636]; [Yadav, S., Liu, J., Shire, S.J. & Kalonia, D.S. Specific interactions in high concentration antibody solutions resulting in high viscosity. Journal of Pharmaceutical Sciences 99, 1152-1168] 참조). 이것은 가장 단순한 데이터 생성 및 분석 수단을 제공하였으므로 초점은 서열 상에 있다. 그러나, 서열로부터 계산될 때 아래에 논의된 바와 같은 임의의 파라미터는 또한 구조로부터 쉽게 계산될 수 있음을 주지한다 (도 15 및 16).
계산된 파라미터는 a) 주어진 pH (예를 들어, pH 5.5)에서 Fv의 순 전하, b) Fv 전하 비대칭 파라미터 (FvCAP), 및 c) CDR 또는 Fv의 소수성 지수 (HI)이었다. 순 전하는 잠재적으로 반발 상호작용에 기여할 수 있는 반면, FvCAP 및 HI는 유인 상호작용에 기여할 수 있다. FvCAP 파라미터는 VH 및 VL 도메인 사이의 전하 비대칭을 나타낸다. VH 및 VL 도메인 사이의 반대 순 전하 (음성 FvCAP)는 Fv 도메인이 쌍극자 (dipole)-유사 상호작용을 통해 또 다른 Fv 도메인과, 또는 mAb 상에 존재하는 또 다른 전하 패치 (patch)와 상호작용하는 기회를 제공할 것으로 가정되었다 (예를 들어, 문헌 [Yadav, S., Liu, J., Shire, S.J. & Kalonia, D.S. Specific interactions in high concentration antibody solutions resulting in high viscosity. Journal of Pharmaceutical Sciences 99, 1152-1168]; [Yadav, S. et al. Establishing a Link Between Amino Acid Sequences and Self-Associating and Viscoelastic Behavior of Two Closely Related Monoclonal Antibodies. Pharmaceutical Research 28, 1750-1764] 참조). 보다 큰 음성 FvCAP 값은 보다 작은 음성 또는 양성 값에 비해 보다 강한 유인 상호작용을 일으키는 것으로 예상되었다. 실제 구조적 입체배위가 서열에 의해 상기 규정된 바와 같이 포확될 수 없는 방식으로 전하 비대칭을 분포시킬 수 있음이 주지된지만, 계산에서, 제1 근사치로서 서열-기반 방안이 적어도 한 차원에서 전하 대칭의 결여를 포획하기 위해 보다 단순한 수단을 제공하였다. 많은 mAb에 대해 비교할 때 (도 8a-8c), 서열에서 주요한 차이가 CDR 영역 내에 있더라도 (IgG1 이소형의 모든 mAb) 매우 다양한 이들 파라미터가 관찰되었다. CDR로부터 계산된 HI 값은 Fv로부터 계산된 것과 동일한 경향이 있고 (도 17), 따라서 전자를 추가의 분석을 위해 사용하였다.
이어서, 10개의 mAb의 훈련 세트를 사용하여 2가지 상이한 용액 상태 하에 이들 파라미터 및 실험적 점도 값 사이의 상관성을 검사하였다. 2가지 상이한 용액 상태는 pH 5.5에서 낮은 이온 강도 20 mM 완충된 용액 (히스티딘 아세테이트) (도 9a-9c) 및 pH 5.5에서 높은 이온 강도 20 mM 완충된 용액 (+ 200 mM 아르기닌 HCl) (도 10a-10c)이었다. 낮은 이온 강도 완충제에 대해, Fv 전하 및 점도 사이에 (피어슨 r = -0.8) 및 FvCAP 및 점도 사이에 (피어슨 r = -0.9) 타당한 상관성이 관찰되었다. 그러나, HI 및 점도 사이에 단지 약한 상관성이 관찰되었다. 따라서, 정전기적 상호작용이 점도를 조정하는데 우세한 역할을 하는 것으로 보였고, 여기서 소수성은 이들 mAb의 전체 점도에 대해 더 적은 정도로 기여한다. FvCAP 및 점도 사이에 보다 강한 상관성은 VH 및 VL 도메인 사이의 전하 비대칭이 또한 점도를 조정하는데 잠재적으로 역할을 한다는 사실을 지적하였다. 높은 이온 강도 완충제 (도 10a-10c)에 대해, Fv 전하 및 점도 사이에 (피어슨 r = -0.9) 및 FvCAP 및 점도 사이에 (피어슨 r = -0.8) 상관성이 존재하였다. HI 및 점도 사이에 보다 약한 상관성이 관찰되었고, 이것은 이들 조건 하에 모든 파라미터가 점도 조정에 기여함을 시사하였다.
이어서, PCR 분석을 점도에 대한 예측 모델을 개발할 수 있는 그의 효용성을 평가하기 위해 다변량 (multiple variable) 회귀 도구로서 사용하였다. 높은 이온 강도 완충제이 조건 하의 점도 데이터를 이론적으로 얻어진 파라미터와 함께 예시 사례로서 사용하였다 (도 1a). 25℃에서 150 mg/mL 및 180 mg/mL에서 점도 데이터를 독립 변수로서 사용한 반면, pH 5.5에서 Fv 전하 (또한 q로서 표현할 수 있음), pH 5.5에서 Fv CAP (또한 qCAP로서 표현할 수 있음) 및 HI (또한 φ로서 표현할 수 있음)를 종속 변수로서 사용하였다. 도 1b는 점도 데이터 및 계산된 파라미터를 보여주고, 이것은 10개의 mAb의 훈련 세트 (10개의 mAb의 높은 이온 강도 훈련 세트에 부분적으로 겹치는)에 대한 25℃에서 150 mg/mL에서 낮은 이온 강도의 조건에 대해 HI를 포함하지 않는다. 도 11a 및 11b는 각각 150 mg/mL 및 180 mg/mL에 대한 상기 언급된 높은 이온 강도 훈련 세트를 사용하는 PCR 분석의 결과를 보여주고, 여기서, 관찰된 실험적 점도 값을 90% 신뢰 구간을 갖는 최적 적합 방정식 (best fit equation)을 통해 얻어질 때 예측된 점도 값에 대해 그래프로 그렸다. 최적 적합 방정식을 아래에 설명한다:
<식 1>
η(180 mg/mL, 25℃) = 10∧(1.19 + 0.42φ - 0.05*q - 0.017*qCAP)
<식 2>
η(150 mg/mL, 25℃) = 10∧(0.90 + 0.34φ - 0.036*q - 0.012*qCAP)
추가의 실험에서, 14개의 mAb의 훈련 세트를 시험하였다. 이들 실험에서 CDR의 HI를 계산하는 대신에, Fv의 HI를 계산하였다. PCR 분석을 점도에 대한 예측 모델을 개발할 수 있는 그의 효용성을 평가하기 위해 다변량 회귀 도구로서 사용하였다. 도 11c는 PCR 분석의 결과를 보여주고, 여기서, 다양한 mAb에 대해 180 mg/mL에서 관찰된 실험적 점도 값을 90% 신뢰 구간을 갖는 최적 적합 방정식을 통해 얻어질 때 예측된 점도 값에 대해 그래프로 그렸다. 최적 적합 방정식을 아래에 설명한다:
<식 1-1>
η(180 mg/mL, 25℃)= 10∧(0.15 + 1.26φ - 0.043*q - 0.020*qCAP)
<식 2-1>
η(150 mg/mL, 25℃) = 10∧(0.06 + 1.13φ - 0.034*q - 0.014*qCAP)
계수는 상기 완충제 시스템 및 각각의 단백질 농도에 특이적일 수 있음이 주지된다. 종합하면, 관찰된 값 및 예측된 값 사이에 180 mg/mL에서 강한 상관성 (피어슨 r = 0.9) 및 7 ± 9의 평균 절대 오차는 모델이 항체 서열로부터 계산된 이론적 파라미터를 사용하여 점도 값을 얻는데 잘 작용하였음을 입증한다. 모델의 유효성을 추가로 시험하기 위해, 하나 남기기 교차 검증 (LOOCV: leave-one-out cross-validation) 방안을 이용하였고, 여기서, 각각의 mAb에 대한 점도 값을 검증 데이터 점으로서 사용한 한편, 나머지 mAb에 대한 점도 값을 훈련 세트로서 사용하였다. PCR 분석을 훈련 세트에 대해 수행하고, "남겨진 (left-out)" mAb의 점도를 예측하기 위해 파라미터를 이용하는 모델 출력을 사용하였고; 이어서, 단계를 각각의 mAb에 대해 반복하였다. 도 11d는 LOOCV 예측에 대해 그래프로 그린 180 mg/mL에서 관찰된 실험적 점도 값의 플롯을 보여준다. 예측된 점도 값 및 관찰된 점도 값 사이에 9 ± 10의 평균 절대 오차를 갖는 강한 상관성이 관찰된다 (피어슨 r = 0.8).
유사하게, PCR 분석을 낮은 이온 강도 완충제의 조건 하에 점도에 대한 예측 모델을 개발하기 위해 다변량 회귀 도구로서 사용하였다. 훈련 세트는 낮은 이온 강도 완충제 (20 mM 히스티딘 완충제) 내에서 150 mg/mL의 농도에서 10개의 mAb를 포함하였다. 도 11e는 150 mg/mL에서 10개의 mAb 훈련 세트를 사용하는 PCR 분석의 결과를 보여주고, 여기서, 관찰된 실험적 점도 값을 90% 신뢰 구간을 갖는 최적 적합 방정식을 통해 얻어질 때 예측된 점도 값에 대해 그래프로 그렸다. 최적 적합 방정식을 아래에 설명한다:
<식 3>
η(150 mg/mL, 25℃) = 10∧(0.81 + 0.21*q - 0.15*qCAP)
계수는 상기 완충제 시스템 및 각각의 단백질 농도에 특이적일 수 있음이 주지된다. 종합하면, 관찰된 값 및 예측된 값 사이의 강한 상관성 (r2 = 0.8)은 모델이 항체 서열로부터 계산된 이론적 파라미터를 사용하여 점도 값을 얻는데 잘 작용하였음을 입증한다. 모델의 유효성을 시험하기 위해, 훈련 세트 외에 4개의 상이한 항체에 대해 모델을 실행하였다. 이론적 파라미터 및 방정식 1 및 2를 이용하여, 각각 180 mg/mL 및 150 mg/mL에서 점도를 계산하고, 25 mg/mL에서 1.2 cP 및 0 mg/mL에서 0.8의 점도를 가정하여, 4-지점 이론적 점도-농도 곡선을 생성하고, 실험적 점도 데이터에 비교하였다. 도 12a-12d는 4개의 mAb에 대한 상기 비교를 보여준다. 이론적 모델은 실험 데이터와 비교할 때 점도-농도를 잘 예측하였다. 따라서, 서열-유래 이론적 파라미터를 이용하여, 일부 최소 제곱 회귀 분석을 통해 얻어진 모델 방정식은 IgG1 이소형의 항체를 포함한 상기 단백질-완충제 시스템에 대한 점도-농도 곡선을 예측하는데 효과적이었다.
클리어런스
동일한 이소형의 상이한 항체는 인간에서 및 Cyno 원숭이에서 혈장 클리어런스에서 현저한 차이를 보일 수 있다. (Cyno 원숭이에서 혈장 클리어런스 (Cyno 클리어런스)는 mAb의 약동학적 프로파일을 평가하기 위해 확립된 전임상 모델이다 (예를 들어, 문헌 [Hotzel, I. et al. A strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance. mAbs 4, 753-760)] 참조)). 몇몇 연구는 그러한 차이가 pI 또는 서열에서 특이적 돌연변이와 관련됨을 보여주었다 (예를 들어, 문헌 [Igawa, T. et al. Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region. Protein Engineering Design and Selection 23, 385-392]; [Wu, H. et al. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. Journal of Molecular Biology 368, 652-665 (2007)] 참조). mAb의 임의의 관찰가능한 특성에서의 차이는 바람직하게는 Fv 또는 CDR (동일한 프레임워크 내에서)에서의 차이와 관련되어야 한다는 가설에 기반하여, 임의의 서열 특성이 Cyno 클리어런스에서의 차이를 예측할 것인지 결정하는지 연구되었다. 기반 가설은 보다 신속한 클리어런스는 성질이 소수성 및/또는 정전기성인 단백질-단백질 상호작용의 증가를 통해 생체 내에서 표면/또는 단백질에 대한 mAb의 표적을 벗어난 (off-target) 결합 때문이라는 것이었다. 따라서, 가변 도메인에서 그러한 특성, 예컨대 pI, 전하 또는 소수성의 임의의 극치 (extreme)는 보다 신속한 Cyno 클리어런스를 보이는 항체로 번역될 것으로 추측되었다. 공개된 데이터에 기반하여, Cyno 원숭이에서 >/= 10 mL/kg/일의 클리어런스 값은 보다 신속한 클리어런스로서 지정되고, < 10 mL/kg/일의 값은 정상 클리어런스로서 지정되었다 (예를 들어, 문헌 [Hotzel, I. et al. A strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance. mAbs 4, 753-760] 참조).
큰 세트의 IgG1 클래스의 mAb (45개 mAb)를 평가하고, mAb의 계산된 pI 및 CDR 서열의 HI 값 (도 13a 및 13b)을 갖는 최대 투여된 용량 (10 mg/kg 내지 100 mg/kg 범위)에서 Cyno 클리어런스에 비교하였다. 문헌에 기록된 바와 같이 (예를 들어, 문헌 [Hotzel, I. et al. A strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance. mAbs 4, 753-760] 참조), 계산된 mAb pI 및 클리어런스 사이 또는 HI (CDR 또는 Fv로부터 계산된) 및 클리어런스 (데이터를 제시하지 않음) 사이에 명백한 상관성이 관찰되지 않았다. pI 및 클리어런스 사이 또는 HI 및 클리어런스 사이에 명백한 상관성이 관찰되지 않았지만, 높은 pI 값 (~ 8.7 - 9.5) 및 낮은 pI 값 (~ 6.4 - 7.1)에서 및 높은 HI 값 (>1.2)에서 보다 많은 mAb가 높은 클리어런스 값을 갖는 것이 알려졌다. pH 7.4 (생리학적 pH)에서 Fv 도메인의 계산된 전하 및 클리어런스 값 (데이터를 제시하지 않음) 사이에 상관성은 보이지 않았다.
이어서, pI (및/또는 전하) 및 소수성이 보다 신속한 클리어런스 대 정상 클리어런스를 규정하는데 있어서 서로 상보적인지 결정하기 위해 검사하였다. 특정 pH에서 전하가 클리어런스 값에 관하여 보다 더 구분할 것이지 또한 연구하였다 (항체 클리어런스는 낮은 pH, pH 5 - 6를 갖는 엔도솜 환경을 통한 신생 Fc 수용체 구제를 포함한다 (여기서, Fc는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역이다)) (예를 들어, 문헌 [Wang, W., Wang, E.Q. & Balthasar, J.P. Monoclonal Antibody Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Clin Pharmacol Ther 84, 548-558 (2008)] 참조). 따라서, 5.0 - 7.4의 pH 범위에 걸쳐 클리어런스에 대한 Fv 전하의 상관성이 존재하는지 연구하였다. 특정 CDR의 소수성이 전체 CDR 서열 소수성보다는 클리어런스와 보다 잘 상호 연관될 것인지 또한 검사하였다. 이들 다수의 변수 중에서, 이들 변수의 특정 조합이 클리어런스를 보다 더 구분할 것으로 결정되었다.
분석을 단순화하기 위해, 클리어런스 값의 전체 범위를 포괄하기 위해 13개의 mAb의 훈련 세트를 생성하였다 (도 2). 훈련 세트 내의 mAb는 클리어런스 값의 감소 순서로 배열하였다. 2개의 군의 mAb, 즉, >/= 10 mL/kg/일의 클리어런스 값을 갖는 mAb의 군 및 < 10 mL/kg/일의 클리어런스 값을 갖는 mAb의 군의 분리를 허용하는 기준을 평가하였다. 언급된 바와 같이, 모든 CDR의 전체 소수성은 구별을 위해 충분하지 않았다. 또한, LC CDR2, HC CDR1 및 HC CDR2의 소수성이 또한 정상 클리어링되는 mAb에 대해 보다 신속하게 클리어링되는 mAb에 대해 계산된 평균 HI 값에 의해 제시된 바와 같이 그러한 구별을 제공하지 않았다. 그 반면에, 보다 신속하게 클리어링되는 mAb가 나머지 3개의 CDR (LC CDR1, LC CDR3, 및 HC CDR3) 사이에서 보다 높은 소수성을 갖는 경향이 있다는 일반적인 경향이 주지되었다. 신속하게 클리어링되는 mAb에 대한 평균 HI 값은 정상 클리어링되는 mAb에 비해 일반적으로 더 높았다. 이것은 이들 3개의 CDR의 HI 값의 계산된 합계를 이용하여 추가로 명백해졌다. 보다 신속하게 클리어링되는 군 내의 mAb에 대한 평균 HI 합계 (LC CDR1, LC CDR3, 및 HC CDR3)는 정상 클리어링되는 mAb에 비해 유의하게 더 높았다 (각각 3.9 +/- 1.4 대 2.5 +/- 0.7, p = 0.005). 전하에 관하여, pH 5.5에서, 정상 클리어런스 값을 갖는 mAb는 0.4 - 6.1의 전하 값을 갖는 경향이 있는 한편, 보다 신속하게 클리어링되는 7개의 mAb 중 4는 상기 범위를 벗어나는 전하 값을 갖는 것에 유의하였다. 추가로, CDR의 전하 및 선택적 HI는 보다 신속하게 클리어링되는 mAb를 구별하는데 있어서 서로 상보적인 것으로 보였고, 즉, 신속한 클리어런스 군 내에서 0.4 내지 6.1의 전하 값을 갖는 mAb는 비교적 더 높은 HI 합계를 가졌다. 상기 데이터 분석은 특정 CDR의 소수성의 두 극치 및 전하 값의 극치 (음성 또는 고도 양성)는 보다 신속한 클리어런스율을 갖는 mAb를 예측하기 위해 사용될 수 있음을 나타냈다.
상기 분석은 보다 신속하게 클리어링되는 mAb를 정상 클리어런스율을 갖는 것과 구별하기 위한 기준의 개발을 이끌었다 (도 3). >4.0의 HI 합계 값 및/또는 </= -2.0 또는 >/= 6.2의 Fv 전하 값을 갖는 mAb (도 2, 좌측 역슬래시 음영의 배경)가 </= 4.0의 소수성 합계 값 및 -2.0 내지 6.2의 Fv 전하 값을 갖는 것 (도 2, 우측 슬래시 음영의 배경)으로부터 구분되면, 보다 신속하게 클리어링되는 mAb는 정상 클리어링되는 mAb에 비해 명백하게 뚜렷해졌다.
이론적 기준을 그의 유효성을 시험하기 위해 45개 mAb의 완전한 세트로 확장하였다. 상기 분석의 시각화를 용이하게 하기 위해, 상기 설명된 배경 음영 코딩 계획을 사용하였다. HI 합계 > 4.0의 모든 값을 좌측 역슬래시 음영의 배경에 지정하고, 나머지를 우측 슬래시 음영의 배경에 지정하였다. </= -2.0 또는 >/= 6.2의 모든 전하 값을 좌측 역슬래시 음영의 배경에 지정하고, 나머지를 우측 슬래시 음영의 배경에 지정하였다. >/= 10의 모든 Cyno 클리어런스 값을 좌측 역슬래시 음영의 배경에 지정하고, 나머지를 우측 슬래시 음영의 배경에 지정하였다. 이어서, 음영 패턴이 일치하는지 (및 따라서 기준이 옳은 결과를 예측할 것인지) 결정하기 위해, 데이터를 증가하는 측정된 클리어런스 값을 기반으로 분류하였다 (도 4). 실제로, 기준이 45개 mAb의 완전한 세트에 대해 잘 견뎌졌다. 높은 HI 합계 또는 Fv 전하 극치에 기반하여, 15/16 (94%) mAb (기원 훈련 세트 내의 6/6 포함)에 대한 보다 신속한 Cyno 클리어런스, 및 24/29 (83%) mAb (기원 훈련 세트 내의 7/7 포함)에 대한 정상 Cyno 클리어런스가 정확하게 예측되었다.
추가의 실험에서, 보다 신속하게 클리어링되는 mAb를 정상 클리어런스를 갖는 것과 구별하기 위한 기준을 개발하기 위해, 훈련 세트를 14개 mAb로 확장하였다. >4.0의 HI 합계 값 및/또는 ≤0 또는≥6.2의 Fv 전하 값을 갖는 mAb는 보다 신속한 클리어런스를 보일 위험이 있을 반면, ≤4.0의 HI 합계 값 및 0 내지 6.2의 Fv 전하 값을 갖는 것은 정상 클리어런스를 보일 것으로 기준이 설정될 때, 상기 훈련 세트에서 보다 신속하게 클리어링되는 mAb는 정상 클리어링되는 mAb로부터 명백하게 분리되었다. 그의 유효성을 시험하기 위해 기준을 61개 mAb의 세트로 확장하였다. 높은 HI 합계 또는 Fv 전하 극치에 기반하여, 10/13 (77%) mAb (기원 훈련 세트 내에서 8/8를 배제하고, 86%는 훈련 세트 mAb를 포함함)에 대해 보다 신속한 Cyno 클리어런스, 및 24/34 (70%) mAb (기원 훈련 세트 내에서 6/6를 배제하고, 75%는 훈련 세트 mAb를 포함함) (데이터를 제시하지 않음)에 대해 정상 Cyno 클리어런스의 정확한 예측이 달성되었다.
이들 분석은 본 경우에 클리어런스와 같은 생물학적 특성을 평가하는데 있어서 전하 및 소수성과 같은 근본적인 분자 특성을 이용하는 능력을 확립하였다. 소수성 또는 전하의 극치를 갖는 가변 도메인은 표적화된 항원 이외의 표면과 잠재적으로 상호작용할 수 있으므로, 상기 분석은 비-특이적 결합이 혈장으로부터 보다 신속한 클리어런스의 원인이 된다는 가설을 지지하였다.
Trp 산화 및 Asp 이성질체화
Trp 산화 및 Asp 이성질체화와 같은 화학적 변형, 및 연관된 효력 상실은 수성 용액 내에서 mAb 생성물의 저장 수명을 제한할 수 있다. Trp 산화 및 Asp 이성질체화의 상대적인 불안정도를 위험도-순위결정을 가능하게 하도록 명시적 물을 사용하는 전원자 (all-atom) MD 시뮬레이션을 이용하였다.
Trp 산화에 대해, MD 생성된 시간 평균한 SASA, 및 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드 (AAPH, 불안정한 아미노산 측쇄를 산화시키는 것으로 공지된 화학물질)의 존재 하에 Trp 잔기의 산화 정도 사이의 상관성을 검사하였다 (예를 들어, 문헌 [Ji, J.A., Zhang, B., Cheng, W. & Wang, Y.J. Methionine, tryptophan, and histidine oxidation in a model protein, PTH: Mechanisms and stabilization. Journal of Pharmaceutical Sciences 98, 4485-4500 (2009)] 참조). AAPH는 유기 유리 라디칼을 생성하여, 노출된 측쇄의 산화를 일으켰다. 따라서, SASA는 제조 또는 저장 동안 산화 화학종이 용액 내에 도입되면 용액 내에서 산화하는 Trp의 경향의 직접적인 표시를 제공할 수 있는 것으로 가정되었다. 도 5는 17개의 상이한 mAb 내의 38개의 Trp 잔기를 나열한다. 불변 영역 내에 존재하는 마지막 9 개Trp를 제외하고는, 이들 모든 Trp는 CDR 내에 존재하였다.
AAPH의 존재 하에 >35% 산화하는 Trp를 산화 불안정한 Trp로 지정한 한편, 상기 백분율 미만은 비-불안정한 Trp로서 지정한 기준을 규정하였다. Trp 잔기는 배경 음영으로 코딩하고, 여기서 >35% 산화는 좌측 역슬래시 음영의 배경에 지정하고, 그 미만의 것은 우측 슬래시 음영의 배경에 지정하였고, 모든 Trp를 산화에 기초하여 분류하였다 (도 5). 패턴은 쉽게 인식가능하고, 불안정한 Trp 잔기의 평균 시간 평균한 SASA는 비-불안정한 (37 A2 +/-41)에 비해 유의하게 더 높았다 (122 A2 +/-40) (0.0001의 p-값). 상기 분석에 기반하여, 및 위음성의 수를 최소화하기 위해, > 80 A2 측쇄 SASA (Trp 측쇄에 대해 > 30% SASA)의 컷오프 값을 불안정한 Trp 부위와 상호 연관되고, 반응성 및 비-반응성 부위 사이를 구분할 수 있는 것으로 지정하였다. 상기 기준은 13/14 (93%) 불안정한 Trp 잔기 및 20/24 (83%) 비-불안정한 Trp 잔기를 정확하게 확인하였다. 상기 언급된 기준을 이용하여 위양성이 확인된 분자에 대해, 3개의 mAb 중 적어도 2개, 즉, mAb12 Trp HC109, mAb7 TRP HC33에 대해, 이들 분자는 거의 동일하게 용매 노출된 단일 Fv 도메인 상에 2개의 Trp를 갖는 경향이 있는 것으로 주지되었다. 실험에 의해, 단일 Fv 상의 2개의 노출된 Trp를 산화시키는 통계적 확률이 다수 Fv 도메인 (및 따라서 mAb) 상의 단일 Trp 부위에 비해 낮은지 질문이 제기되었고, 이것은 단지 1개의 Trp가 비록 용매 노출이 유사할 때에도 산화제에 노출될 때 우선적으로 산화되도록 할 것이다. 이것이 참이면, 이것은 용매-접근가능성에 기반하여 확인된 위양성을 얻는 것에 대한 잠재적인 원인 중 하나일 수 있다. 종합하면, Trp 측쇄의 시간 평균한 SASA는 불안정한 및 비-불안정한 Trp 잔기 사이를 구별할 수 있기 위해 충분한 것으로 결론지어졌고, 충분한 용매 접근가능성을 갖는 2개의 Trp가 단일 Fv 도메인 내에 존재할 때, 상기 기준은 신중하게 사용되어야 한다.
Asp 이성질체화에 대해, 잠재적으로 불안정한 Asp 잔기에 관련된 다변량을 MD 운동궤적으로부터 생성하였다. Asp 이성질체화 메카니즘에 일치하게 (예를 들어, 문헌 [Wakankar, A.A. et al. Aspartate isomerization in the complementarity determining regions of two closely related monoclonal antibodies. Biochemistry 46, 1534-1544 (2007)] 참조) (N+1 잔기의 N-말단 펩티드 결합 질소에 의한 Asp 카르보닐의 친핵성 공격), 다음 특성을 검사하였다: (1) 모든 Asp 잔기 (SASA_Asp), Asp 잔기의 n+1 잔기의 주쇄 N 원자 (SASA (n+1), N), 및 n+1 잔기의 H 원자 (SASA (n+1), H)에 대한 시간 평균한 SASA; (2) Asp 잔기에 대한 잔기내 상호 정보 (MI); (3) φ-ψ 분포에 대한 샤논 엔트로피; 및 (4) Cα 원자에 대한 평균 제곱근 요동 (RMSF). 공지의 불안정한 및 안정한 Asp 잔기를 모두 함유하는 많은 Fab를 MD 계산을 위해 선택하였다. 저장 수명에 영향을 미치는 시간 척도 상에서 이성질체화하는 것으로 이전에 입증된 모티프 (motif)에 집중하고 (DG, DS, DT, DD, DA) (예를 들어, 문헌 [Radkiewicz, J.L., Zipse, H., Clarke, S. & Houk, K.N. Neighboring Side Chain Effects on Asparaginyl and Aspartyl Degradation: An Ab Initio Study of the Relationship between Peptide Conformation and Backbone NH Acidity. J. Am. Chem. Soc. 123, 3499-3506 (2001)]; [Yi, L. et al. Isomerization of Asp-Asp motif in model peptides and a Monoclonal Antibody Fab Fragment. Journal of Pharmaceutical Sciences 102, 947-959] 참조), 나머지 Asp를 제외하였다.
모든 mAb를 유사한 조건 (pH 5.5) 하에 제제화하고, 열 스트레스를 가하고 (40℃), Asp 잔기에 대한 분해 속도를 계산하기 위해 펩티드 맵 분석한 실험 데이터 세트를 컴파일링하였다. 도 6은 실험 결과, 및 MD 시뮬레이션으로부터 결정된 특성을 모두 보여준다. 모든 잠재적으로 불안정한 Asp 잔기를 도 6에 포함시키지만, 단, 이들 비-CDR Asp 잔기를 반복하는 것은 불필요할 것이므로 단일 단백질에 대해 열거된 비-CDR Asp 잔기 (프레임워크 잔기)를 제외하였다.
데이터 분석은 이중이었다. 먼저, 불안정한 잔기 (>/= 2.5%/wk)를 안정한 잔기 (<2.5%/wk)로부터 분리시키고, Asp 잔기의 2개의 군 사이에서 각각의 특성의 평균값을 비교하였다 (도 14). 상기 단계는 특성이 2개의 군 사이에 그 실질적인 차이를 보여주는 특성의 확인을 가능하게 하였다. p-값에 의해 보여지는 바와 같이, 시험한 6개의 특성 중에서, 4개의 특성, 즉, SASA_Asp, RMSF, SASA (n+1, N) 및 (n+1, H)이 Asp 잔기의 2개의 군 사이에서 유의한 차이 (80% CI)를 보였다. 이들 4가지 특성 중 어느 것도 스스로 Asp 이성질체화 속도를 예측하지 않았으므로, 이어서 다변량 분석을 사용하였다. 주성분 회귀 또는 일부 최소 제곱 회귀의 다변량 회귀 도구을 이용하여 직접적인 상관성은 확립될 수 없었다. 따라서, 질문은 2진수 상관성이 확립될 수 있는지, 즉, ≥2.5%/wk의 속도를 갖는 부위가 <2.5%/wk의 속도를 갖는 것과 구별될 수 있는지 문의하였다. 이를 위해, 1의 값을 >2.5%/wk의 속도에 지정하고, 0의 값을 <2.5%/wk의 속도에 지정하였다 (도 6). 이어서, 독립 변수로서 SASA_Asp, RMSF, SASA (n+1, N)를, 및 종속 변수로서 2진수 속도 출력을 사용하여 로지스틱 회귀를 수행하였다. 파라미터 SASA (n+1, H)은 회귀 분석에서 추가의 이익을 제공하지 않았으므로 제외하였다. 상기 회귀의 결과로서 방정식 출력을 아래에 제시한다:
<식 4>
Y1 = 1/(1 + exp(-(-22.2+0.13*SASA_ASP+3.3*RMSF+16.0*SASA(n+1,N))))
상기 방정식의 출력은 한 개의 유효 숫자로 반올림하여 0 (비-반응성) 또는 1 (반응성)의 결과를 제공하였고, 이는 도 6에 제시된다.
로지스틱 회귀는 5/6 불안정한 부위 및 모든 9/9 비-반응성 부위를 정확하게 예측한다. 본질적으로, 로지스틱 모델링을 통해 생성된 방정식은 시험한 실험 조건 하에 2.5%/wk보다 더 큰 속도로 분해하는 것에 관한 Asp 잔기의 감수성을 예측하기 위해 3개의 파라미터 (SASA_Asp, RMSF 및 SASA (n+1, N))을 사용할 수 있도록 허용하였다.
모델의 유효성을 LOOCV 방안을 사용하여 시험하였다. 1개의 mAb를 남기고, 로지스틱 회귀 분석을 위한 나머지 mAb를 훈련 세트로서 사용하여, 5/6 불안정한 부위 및 7/9 비-반응성 부위가 예측되었다 (도 6). 정확한 예측 결과는 약간 감소하였지만, 총 12/15 부위 (80%)를 여전히 정확하게 예측하고 따라서 만족스러웠다. LOOCV 방안을 이용하여 정확하게 예측된 부위의 %의 저하는 기원 훈련 세트의 특정 mAb가 고도의 정확한 예측 결과를 유지하는데 불균형하게 기여할 수 있다는 가능성을 시사한다. 상기 모델링 방안이 특이적 세트의 실험 조건에 대해 특이적일 수 있지만, 근본적인 방안은 아마도 임의의 세트의 실험 조건으로 확장될 수 있고, 또한 실험 속도는 Asp 잔기의 세트에 대해 공지되어 있음을 주목한다.
도 18은 예시적인 장치 1800을 보여준다. 장치 1800은 계산 기기일 수 있다. 장치 1800는 칩 모듈 (chip module) 1802를 포함할 수 있고, 이것은 하나 이상의 집적 회로를 포함할 수 있고, 예를 들어, 생산을 위한 또는 치료제 내에 포함시키기 위한 항체의 적합성을 결정하거나; 치료제에 포함되기 위한 후보물질-항체들 사이에서 항체를 선택하거나; 항체를 포함하는 치료제의 제조를 지지하거나; 인-실리코 항체 선택과 연관된 또는 다른 관련 활성과 연관된 임의의 다른 적합한 논리 운영을 수행하기 위해 항체의 계산된 물리화학적 특징에 기반하여 구성되는 논리 (logic)를 포함할 수 있다.
장치 1800은 하나 이상의 다음 구성요소를 포함할 수 있다: I/O 회로 1804 (이것은 전송장치 및 수신장치를 포함할 수 있고, 광섬유 케이블 (cable), 동축 케이블, 전화선, 무선 장치, PHY 계층 (layer) 하드웨어, 키패드/디스플레이 컨트롤 장치 또는 임의의 다른 적합한 매체 또는 장치와 접속할 수 있다); 주변 장치 1806 (이것은 계수 타이머 (counter timer), 실시간 타이머, 파워-온 리셋 (power-on reset) 생성기 또는 임의의 다른 적합한 주변 장치를 포함할 수 있다); 논리 처리 장치 1808 (이것은 항체 구조적 정보로부터 항체의 구조적 파라미터를 산출하고; 항체의 구조적 파라미터에 대응하는 스케일링 계수를 선택하고; 항체의 물리화학적 특징에 대응하는 지수를 정량하고; 제조 및 분배 용기의 유동 저항을 정량할 수 있다); 및 기기 판독가능 기억장치 1810.
기기 판독가능 기억장치 1810은 기계 판독가능 데이터-구조: 항체 구조적 정보; 항체의 구조적 파라미터에 대응하는 스케일링 계수; 및 임의의 다른 적합한 정보 또는 데이터를 내부에 저장하도록 구성될 수 있다.
구성요소 1802, 1804, 1806, 1808 및 1810은 시스템 버스 (bus) 또는 다른 상호접속 (interconnection) 1812에 의해 함께 연결될 수 있고, 하나 이상의 회로 기판, 예컨대 1820 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 구성요소들은 단일 실리콘-기반 칩 내로 집적될 수 있다.
프로그램 및 데이터를 포함한 소프트웨어 구성요소는 원하는 경우에 CD-ROM, EPROM 및 EEPROM을 포함한 ROM (읽기 전용 기억장치) 형태로 실행될 수 있거나, 임의의 다른 적합한 컴퓨터 판독가능 매체, 예컨대 비제한적으로 다양한 종류의 디스크, 다양한 종류의 카드 및 RAM에 저장될 수 있음이 이해될 것이다다. 소프트웨어로서 본원에서 설명된 구성요소는 별법으로 및/또는 추가로, 원하는 경우에 통상의 기술을 이용하여 하드웨어 내에서 전적으로 부분적으로 실행될 수 있다.
본원에서 설명된 정보를 나타내는 다양한 신호는 신호-전도 매체, 예컨대 금속선, 광섬유, 및/또는 무선 전송 매체 (예를 들어, 공기 및/또는 공간)을 통해 이동하는 전자기파의 형태로 소스 (source)와 목적지 (destination) 사이에 전송될 수 있다.
장치 1800은 근거리 네트워크 (LAN), 광역 네트워크 (WAN), 또는 다른 적합한 네트워크를 통해 하나 이상의 원격 컴퓨터에 접속을 지지하는 네트워킹된 환경에서 작동할 수 있다. LAN 네트워킹 환경에서 사용될 때, 장치 1800은 I/O 회로 1804 내에서 네트워크 인터페이스 (interface) 또는 어댑터 (adapter)를 통해 LAN에 연결될 수 있다. WAN 네트워킹 환경에서 사용될 때, 장치 1800은 모뎀, 또는 WAN에 걸친 통신을 확립하는 다른 수단을 포함할 수 있다. 제시된 네트워크 연결은 설명적이고, 컴퓨터들 사이에 통신 연결을 확립하는 다른 수단이 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 다양한 잘 공지된 프로토콜, 예컨대 TCP/IP, 이더넷 (Ethernet), FTP, HTTP 등의 존재가 추정되고, 시스템은 사용자 (user)가 예를 들어 인터넷 (Internet)을 거쳐 논리 처리 장치 1808을 작동시킬 수 있도록 클라이언트-서버 구성으로 작동할 수 있다.
장치 1800은 수많은 일반 목적 또는 특수 목적 전산 시스템 환경 또는 구성 내에 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 잘 공지된 전산 시스템, 환경 및/또는 구성의 예는 임의의 상기 시스템 또는 장치를 포함하는 개인용 컴퓨터, 서버 컴퓨터, 휴대용 (hand-held) 또는 랩탑 (laptop) 장치, 이동 전화 및/또는 다른 개인 휴대 정보 단말기 ("PDA"), 멀티프로세서 시스템, 마이크로프로세서-기반 시스템, 태블릿 (tablet), 프로그램가능 소비자 가전장치 (consumer electronics), 네트워크 개인용 컴퓨터, 미니컴퓨터, 메인프레임 (mainframe) 컴퓨터, 분산형 전산 환경 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
도 19a 및 19b는 본 발명의 원리에 따른 인-실리코 항체 선택을 제공하기 위한 예시적인 공정 1900을 보여준다. 예시를 위해, 예시된 공정의 단계는 "시스템"에 의해 수행되는 것으로 설명할 것이다. "시스템"은 도 18에 제시된 장치 및/또는 임의의 다른 적합한 장치, 예컨대 계산 기기 또는 방안의 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다. "시스템"은 인-실리코 항체 선택을 실행하는 독립체 (entity)에 의해 또는 임의의 다른 적합한 개인, 조직 또는 체계 (modality)에 의해 제공될 수 있다.
도 19a 및 19b에서, 실선 화살표는 공정 제어의 흐름 및 정보의 흐름을 나타낸다. 파선 화살표는 정보의 흐름을 나타낸다.
도 19a 및 19b에서 공정의 단계의 수행 및/또는 설명 순서는 단지 예시적인 것이다. 각각의 설명된 단계는 전혀 예시된 순서로 완료될 필요가 없다. 공정 1900은 제시하지 않은 단계를 포함할 수 있다.
공정 1900은 알고리즘으로서 구현될 수 있다. 알고리즘은 공정 1900의 단계 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
공정 1900은 단계 1920 (도 19a에 제시된)에서 시작할 수 있다. 단계 1920에서, 시스템은 데이터의 세트를 수신할 수 있다. 정보 1922는 단계 1920에서 수신된 데이터의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
정보 1922는 용액 상태 1924 하에 항체 (Ab) 1926에 관련된 정보를 포함할 수 있다. 시스템은 설계 기준 (DC) 1958의 충족을 위해 상태 1924 하에 Ab 1926을 분석하기 위해 공정 1900을 수행할 수 있다.
Ab 1926은 Ab 서브/클래스 1948의 것일 수 있다. Ab 서브/클래스 1948은 항체 클래스, 예컨대 IgA 또는 IgE일 수 있다. Ab 서브/클래스 1948은 항체 서브클래스, 예컨대 IgA1일 수 있다. Ab 서브/클래스 1948은 항체 서브클래스, 예컨대 IgG1 또는 IgG4일 수 있다. Ab 서브/클래스 1948은 임의의 항체 클래스, 서브클래스 또는 변이형일 수 있다.
Ab 1926은 구조를 가질 수 있다. Ab 1926의 구조는 Ab 구조 1950으로 표현할 수 있다. Ab 구조 1950은 Ab 1926의 구조에 대응하는 디지털 코드일 수 있다.
Ab 구조 1950은 항체 1926의 아미노산 서열에 관한 정보를 포함할 수 있다. 서열 1952는 서열 정보를 나타낼 수 있다. 서열 1952는 Ab 1926의 서열에 대응하는 디지털 코드일 수 있다. 서열 1952는 1차 구조를 나타낼 수 있다.
서열 1952는 Ab 1926의 완전 서열 1954를 포함할 수 있다. 완전 서열 1954는 중쇄 HC, 경쇄 LC, 가변 도메인 Fv, 불변 도메인 Fc, 임의의 또는 모든 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, 등 및 Ab 1926의 임의의 다른 구조적 특징을 포함한, Ab 1926의 모든 섹션, 도메인, 영역 및/또는 특징의 서열 정보를 함유할 수 있다.
서열 1952는 Ab 1926의 구획 (section) 서열 1956을 포함할 수 있다. 구획 서열 1956은 완전 서열 1954보다 덜 완전할 수 있다. 구획 서열 1956은 Ab 1926의 부분 서열일 수 있다. 구획 서열 1956은 중쇄 HC, 경쇄 LC, 가변 도메인 Fv, 불변 도메인 Fc, 임의의 또는 모든 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 등 및/또는 Ab 1926의 임의의 다른 구조적 특징을 포함한, Ab 1926의 하나 이상의 구획, 도메인, 영역 및/또는 특징의 서열 정보를 함유할 수 있다.
정보 1922는 상태 1924에 관련된 정보를 포함할 수 있다. 상태 1924는 완충제+염 용액 (BSS) 1930에 관련된 정보를 포함할 수 있다. BSS 1930은 Ab 1926을 함유하는 용액의 상태의 일부에 대응하는 디지털 코드일 수 있다. 용액의 상태는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 온도 (T) 1932; 완충제+염 용액의 화학 조성 1934 (이것은 완충제+염 용액의 화학 물질종의 확인을 포함할 수 있고, 이것은 완충제 내의 것 이외의 염을 함유할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다); 및 용액 내에 존재할 수 있는 화학 물질종의 농도 1936. 농도 1936은 완충제 농도 1938; 염 농도 1940; Ab 농도 1942; pH 1944; 및 이온 강도 1946 (IS) 중 하나 이상에 관련된 정보를 포함할 수 있다.
BSS 1930은 가상 용액을 나타낼 수 있다. 가상 용액은 MD 시뮬레이션과 연관될 수 있다. BSS 1930은 실제 용액을 나타낼 수 있다. Ab 1926은 가상 항체를 나타낼 수 있다. 가상 항체는 MD 시뮬레이션과 연관될 수 있다. 가상 항체는 실제 항체에 기반할 수 있고, 여기서 서열의 가정적 변동에 의해 실제 항체와 상이하다. Ab 1926은 실제 항체를 나타낼 수 있다.
정보 1922는 물리화학적 특징 (PC) 1928에 관련된 정보를 포함할 수 있다. PC 1928은 하나 이상의 물리화학적 특징, 예컨대 점도, 클리어런스율, 안정성, 아스파르트산 불안정성 및 트립토판 불안정성을 포함할 수 있다. PC 128은 Ab 용액 또는 Ab의 임의의 다른 물리화학적 특징, 예컨대 색상 또는 등전점을 포함할 수 있다. PC 128은 DC 1958을 결정하는데 역할을 할 수 있다. 예를 들어, PC 128이 점도이면, DC 1958은 점도에 관련될 수 있고; DC 1958은 예를 들어 점도 한계를 포함할 수 있다.
정보 1922는 BSS 출력 1931을 포함할 수 있다. BSS 출력 1931은 상태 1924에 관련된 데이터를 포함할 수 있다. BSS 출력 1931은 BSS 1930에 관련된 데이터를 포함할 수 있다.
정보 1922는 Ab 출력 1927을 포함할 수 있다. Ab 출력 1927은 Ab 1926에 관련된 데이터를 포함할 수 있다.
정보 1922는 PC 출력 1929를 포함할 수 있다. PC 출력 1929는 PC 1928에 관련된 데이터를 포함할 수 있다.
정보 1922는 DC 출력 1959를 포함할 수 있다. DC 출력 1959는 DC 1958에 관련된 데이터를 포함할 수 있다.
시스템은 단계 1920으로부터 단계 1960까지 진행할 수 있다. 단계 1960에서, 시스템은 목적 함수를 선택할 수 있다. 목적 함수는 스케일링 계수 (sf) 및 파라미터 (P)를 포함할 수 있다. 파라미터 P는 하나 이상의 구조-관련 특성, 예컨대 전하, 전하 비대칭, 및 소수성을 포함할 수 있다. 파라미터 P는 임의의 다른 구조-관련 특성, 예컨대 자기 모멘트 (moment) 및 쌍극자 모멘트를 포함할 수 있다. 시스템은 파라미터 Pi를 스케일링 계수 sfi와 곱할 수 있다. 곱셈 결과 sfiPi는 목적 함수 내의 항 (term)일 수 있다.
시스템은 PC 출력 1929로부터의 정보에 기반하여 목적 함수를 선택할 수 있다. PC 출력 1929로부터의 정보는 PC 1928에 관한 정보를 포함할 수 있다. PC 1928에 관한 정보는 목적 함수를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, PC 128이 점도이면, 시스템은 목적 함수를 선택할 수 있고, 여기서, 상태 1924 하에 Ab 1926에 대한 평가 시에, BSS 1930 내의 Ab 1926의 점도에 대응하는 지수를 얻을 수 있다. 목적 함수의 수학적 형태는 sfiPi 항을 PC 1928에 관련시킬 수 있다.
시스템은 단계 1962로 진행할 수 있다. 단계 1962에서, 시스템은 목적 함수 내에 포함되도록 파라미터를 선택할 수 있다. 파라미터는 파라미터 P1...Pn을 포함할 수 있고, 식에서, n은 목적 함수 내에 포함되는 파라미터의 총 수일 수 있다. 시스템은 Ab 출력 1927로부터의 정보에 기초하여 파라미터 P1...Pn을 선택할 수 있다. Ab 출력 1927로부터의 정보는 Ab 1926에 관한 정보를 포함할 수 있다. Ab 1926에 관한 정보는 파라미터 P1...Pn을 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단계 1962에서 선택된 목적 함수가 sfiPi 항을 점도에 관련시키면, 파라미터 P1...Pn의 선택은 Ab 서브/클래스 1948에 의존할 수 있다. Ab 서브/클래스 1948이 IgG4이면, 시스템은 Fc의 특성에 관한 목적 함수 파라미터에 포함될 수 있고; Ab 서브/클래스 1948이 IgG1이면, 시스템은 Fc의 특성에 관한 목적 함수 파라미터로부터 제외될 수 있다.
시스템은 BSS 출력 1931로부터의 정보에 기초하여 파라미터 P1...Pn을 선택할 수 있다. BSS 출력 1931로부터의 정보는 BSS 1930에 관한 정보를 포함할 수 있다. BSS 1930에 관한 정보는 파라미터 P1...Pn을 선택하는데 사용될 수 있다. BSS 출력 1931로부터의 정보는 이온 강도 (IS) 1946에 관한 정보를 포함할 수 있다. IS 1946에 관한 정보는 파라미터 P1...Pn을 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단계 1960에서 선택된 목적 함수가 sfiPi 항을 점도에 관련시키면, 파라미터 P1...Pn의 선택은 IS 1946에 의존할 수 있다. IS 1946이 높은 이온 강도이면, 시스템은 소수성에 관한 목적 함수 파라미터 내에 포함될 수 있고; IS 1946이 낮은 이온 강도이면, 시스템은 소수성에 관한 목적 함수 파라미터로부터 제외될 수 있다.
시스템은 단계 1964로 진행할 수 있다. 단계 1964에서, 시스템은 sf 값을 선택할 수 있다. sf 값의 선택은 단계 1966에서 sf 값 sf1...sfn을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 각각의 값 sf1...sfn은 각각 파라미터 P1...Pn 중 하나의 승수 (multiplier)로서 역할을 할 수 있다. 단계 1966에서, 값 sf1...sfn을 확인하는 것은 기계 기억장치 1910 (도 19b에 도시된) 내의 각각의 스케일링 계수 값을 확인하는 것을 포함할 수 있다.
기계 기억장치 1910은 기억장치 1810 (도 18에 도시된)의 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다. 기계 기억장치 1910은 스케일링 계수 값을 저장할 수 있다. 기계 기억장치 1910은 온도 (TA 내지 TX) 1911에 의해 설정된 기억장치에 의해 제시되는 바와 같이 온도에 의해 스케일링 계수 값을 저장할 수 있다. 기계 기억장치 1910은 이온 강도 (ISα 내지 ISω) 1913에 의해 설정된 기억장치에 의해 제시되는 바와 같이 이온 강도에 의해 스케일링 계수 값을 저장할 수 있다. 기계 기억장치 1910은 IgG 서브클래스 (IgG1 내지 IgG4) 1915에 의해 설정된 기억장치에 의해 제시되는 바와 같이 서브/클래스에 의해 스케일링 계수 값을 저장할 수 있다. 기계 기억장치 1910은 완충제+염 용액 (BSS1 내지 BSSm) 1916에 의해 설정된 기억장치에 의해 제시되는 바와 같이 완충제+염 용액 조성물에 의해 스케일링 계수 값을 저장할 수 있다. 기계 기억장치 1910은 pH (pH1 내지 pHx) 1917에 의해 설정된 기억장치에 의해 제시되는 바와 같이 pH에 의해 스케일링 계수 값을 저장할 수 있다.
기계 기억장치 1910, 예컨대 기계 기억장치 구성 1919에 제시된 것은 데이터를 저장할 수 있다. 구성 1919는 I/O 회로 1804 (도 18에 도시된)에 의해 제어되는 데이터-시청 (viewing) 도구, 예컨대 디스플레이에 의해 제공되는 기계 기억장치 1910의 가시적인 화면을 제시할 수 있다. 구성 1919는 특정 Ab 구조적 특징 (예를 들어, 완전 서열, Fv, Fc)을 기초로 한, 특정 조건 (180 mg/mL Ab, 25℃, pH 5.5 및 높은 IS; 20 mM 완충제 + 200 mM 아르기닌 HCl 내, 각각 값 근사치) 하의 IgG1에 대한 다양한 스케일링 계수 값을 포함한다.
데이터베이스 1905는 다양한 조건 하에서 다양한 서브/클래스의 측정된 항체의 PC 값을 저장할 수 있다. 시스템은 스케일링 계수를 유도하기 위해 측정된 PC 값을 분석할 수 있다. 시스템은 스케일링 계수 값을 기계 기억장치 1910에 저장할 수 있다.
단계 1964에서, 시스템은 BSS 출력 1931로부터의 정보에 기초하여 값 sf1...sfn을 선택할 수 있다. BSS 출력 1931로부터의 정보는 T 1932, 조성물 1934 및 농도 1936을 포함할 수 있다. T 1932, 조성물 1934 및/또는 농도 1936은 값 sf1...sfn을 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단계 1960에서 선택된 목적 함수에 대해 단계 1962에서 선택된 파라미터 P1...Pn의 세트에 대해, 값 sf1...sfn은 T 1932에 따라 결정될 수 있고; 값 sf1...sfn의 한 세트는 25℃의 용액에 대해 선택될 수 있는 반면, 값 sf1...sfn의 상이한 세트는 제2 용액이 35℃라는 점에서만 제1 용액과 상이한 제2 용액에 대해 선택될 수 있다. 단지 온도만 상이한 2개의 용액에 대한 값 sf1...sfn의 2개의 세트는 기계 기억장치 1910 내의 2개의 별개의 위치에 존재할 수 있다.
시스템은 Ab 출력 1927로부터의 정보에 기초하여 값 sf1...sfn을 선택할 수 있다. Ab 출력 1927로부터의 정보는 단계 1964에서 사용될 수 있다.
Ab 출력 1927로부터의 정보는 Ab 구조 1950을 포함할 수 있다. Ab 구조 1950은 값 sf1...sfn를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단계 1960에서 선택된 목적 함수에 대해 단계 1962에서 선택된 파라미터 P1...Pn의 세트에 대해, 값 sf1...sfn은 서열 1952에 따라 결정될 수 있고; 값 sf1...sfn의 한 세트는 완전한 서열 1954를 갖는 항체에 대해 선택될 수 있는 반면, 값 sf1...sfn의 상이한 세트는 구획 서열 1956을 갖는 동일한 항체에 대해 선택될 수 있다. 2개의 상이한 서열 1952을 갖는 동일한 항체에 대한 값 sf1...sfn의 2개의 세트는 기계 기억장치 1910 내의 2개의 별개의 위치에 존재할 수 있다.
단계 1966에서, 기계 기억장치 1910 내의 스케일링 계수의 위치는 BSS 출력 1931로부터의 및/또는 Ab 출력 1927로부터의 정보에 따라 확인될 수 있다.
단계 1968에서, 시스템은 값 sf1...sfn을 검색할 수 있다. 값 sf1...sfn은 단계 1966에서 확인된 기계 기억장치 위치로부터 검색될 수 있다.
시스템은 단계 1970으로 진행할 수 있다. 단계 1970에서, 시스템은 각각 파라미터 P1...Pn에 대해 값 P1'...Pn'을 산출할 수 있다. 값 P1'...Pn'는 Ab 출력 1927로부터의 정보에 기초하여 산출될 수 있다. Ab 출력 1927로부터의 정보는 단계 1970에서 사용될 수 있다. 값 P1'...Pn'는 BSS 출력 1931로부터의 정보에 기초하여 산출될 수 있다. BSS 출력 1931로부터의 정보는 단계 1970에서 사용될 수 있다.
시스템은 단계 1972로 진행할 수 있다. 단계 1972에서, 시스템은 목적 함수를 평가할 수 있다. 목적 함수의 값은 값 sf1...sfn 및 값 P1'...Pn'에 기초하여 산출될 수 있다. 목적 함수에 대해 계산된 값은 상태 1924 하의 Ab 1926에 대한 PC 1928의 값의 예측에 대응할 수 있다.
시스템은 단계 1974로 진행할 수 있다. DC 1958에 관련된 DC 출력 1959로부터의 정보는 단계 1974에서 사용될 수 있다. 단계 1974에서, 시스템은 조건 1924 하의 Ab 1926이 DC 1958을 충족하는지 여부를 결정하기 위해 PC 1928의 값의 예측을 DC 1958에 비교할 수 있다.
DC 1958이 충족되면, 시스템은 단계 1976으로 진행할 수 있다. 단계 1976에서, Ab 생산을 수행할 수 있다. Ab 생산은 Ab 1926의 유체 이송을 포함할 수 있다. Ab 생산은 Ab 1926의 저장을 포함할 수 있다. Ab 생산은 Ab 1926의 제조를 포함할 수 있다. Ab 1926의 제조는 가상 항체 1926을 실제 항체로 조작하는 것을 포함할 수 있다. Ab 생산은 항체의 생산과 연관된 임의의 단계 및 활동을 포함할 수 있다.
시스템은 단계 1976으로부터 단계 1978로 진행할 수 있다. 시스템은 단계 1974에서 DC 1958이 충족되지 않으면, 단계 1978로 진행할 수 있다.
단계 1978에서, 시스템은 BSS 출력 1931, Ab 출력 1927, PC 출력 1929 및/또는 DC 출력 1959로부터의 하나 이상의 데이터가 리셋되어야 하는지 문의할 수 있다. 예를 들어, DC 1958이 단계 1974에서 충족될 수 있고 Ab 1926이 현재 단계 1976에서 생산될 수 있는 동안, 현재 생산되는 Ab 농도 1942와 상이한 항체 농도에서 Ab 1926을 생산하거나; 현재 생산되는 조성물 1934과 상이한 화학적 조성의 완충제에서 Ab 1926을 생산하거나; 또는 현재 생산되는 Ab 1926과 상이한 항체를 생산할 필요가 발생할 수 있다.
단계 1978의 문의에 대한 반응이 부정적이면, 시스템은 종료 1980으로 진행할 수 있다. 시스템은 일부 설정된 시간 경과 후에 또는 일부 다른 기준에 따라 단계 1978에서 반응의 부재 하에 종료 1980으로 이행되지 않을 수 있다.
단계 1978의 문의에 대한 반응이 긍정적이면, 시스템은 단계 1982로 진행할 수 있다. 단계 1982에서, BSS 출력 1931, Ab 출력 1927, PC 출력 1929 및 DC 출력 1958로부터의 하나의 데이터 또는 하나 초과의 데이터는 리셋될 수 있다. 예를 들어, 서열 1950의 하나의 데이터 또는 하나 초과의 데이터는 리셋될 수 있거나 (예를 들어 단일 아미노산 잔기를 변경하고; 서열을 완전으로부터 구획으로 바꾸고; Ab 1926을 서열이 Ab 1926과 실질적으로 상이한 항체로 교체함으로써); 또는 농도 1936의 하나의 데이터 또는 하나 초과의 데이터가 리셋될 수 있다 (예를 들어: pH 또는 IS를 변화시킴으로써). 유사하게, 변화는 Ab 서브/클래스 1948, BSS 1930, PC 1928 및 DC 1958에 관련된 데이터 내에서 이루어질 수 있다.
시스템은 단계 1982로부터 단계 1920으로 역 진행할 수 있다. 단계 1982에서의 데이터 리셋은 단계 1920에서 수신될 수 있다.
통상의 기술자는 본원에서 제시되고 설명되는 장치, 매체 및 코드의 요소들이 언급된 구성과 다르게 구성될 수 있고 하나 이상의 요소가 선택적일 수 있음을 이해할 것이다. 통상의 기술자는 본원에서 제시되고 설명되는 공정 및 방법의 단계가 언급된 순서와 다르게 수행될 수 있고 제시된 하나 이상의 단계가 선택적일 수 있음을 이해할 것이다.
따라서, 항체의 계산된 물리화학적 특징을 기초로 하여 치료제에 포함되기 위한 항체의 적절성을 결정하고; 치료제에 포함되기 위한 항체 후보물질 중에서 항체의 계산된 물리화학적 특징을 기초로 하여 선택하고; 항체의 계산된 물리화학적 특징을 기초로 하여 치료제를 제조하는 것 중 하나 이상을 수행하기 위한 장치, 방법 및 컴퓨터 판독 코드를 포함하는 매체가 제공된다. 통상의 기술자는 본 발명이 제한이 아니라 예시의 목적으로 제시된 설명된 실시양태 이외의 다른 양태로 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 아래의 청구의 범위에 의해 규정된다.

Claims (100)

  1. (a) 제조 용기 내의 유체 전달 요소의 유체 유동 저항을 기초로 하여 항체에 대한 점도 한계를 설정하며, 여기서 유체 유동 저항은 유체 전달 요소를 통해 유동하는 유체의 점도에 따라 결정되고;
    (b) 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고;
    (c) 구조적 정보로부터 계산된 항체의 점도의 지수를 네트워크를 통해 수신하고;
    (d) 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만, 조성물의 제조를 위해 항체를 전달 요소를 통해 전송하는 것
    을 포함하는, 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법.
  2. (a) 설계 기준을 충족하는, 항체에 대한 점도 한계를 설정하고;
    (b) 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고;
    (c) 구조적 정보로부터 계산된, 항체의 점도에 대응하는 지수를 네트워크를 통해 수신하고;
    (d) 항체가 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는지 결정하고;
    (e) 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만 항체를 생산하는 것
    포함하는, 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는 항체의 생산 방법.
  3. (a) 제조 용기 내의 유체 전달 요소의 유체 유동 저항을 기초로 하여 항체에 대한 점도 한계를 설정하며, 여기서 유체 유동 저항은 유체 전달 요소를 통해 유동하는 유체의 점도에 따라 결정되고;
    (b) 항체의 점도의 지수를 항체의 구조적 정보로부터 계산하고;
    (c) 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만, 조성물의 제조를 위해 항체를 전달 요소를 통해 전송하는 것
    을 포함하는, 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법.
  4. (a) 설계 기준을 충족하는, 항체에 대한 점도 한계를 설정하고;
    (b) 항체의 점도에 대응하는 지수를 항체의 구조적 정보로부터 계산하고;
    (c) 항체가 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는지 결정하고;
    (d) 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만 항체를 생산하는 것
    을 포함하는, 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는 항체의 생산 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 지수가
    (a) 항체의 구조적 정보로부터 순 전하 및 전하 비대칭을 계산하는 단계;
    (b) 항체에 대해 순 전하에 대응하는 제1 스케일링 계수, 및 전하 비대칭에 대응하는 제2 스케일링 계수를 선택하는 단계;
    (c) 스케일링 계수를 포함하는 목적 함수(objective function)로부터 점도에 대응하는 지수를 계산하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 계산되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 구조적 정보로부터의 계산이 1차 구조의 정보로부터의 계산을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 1차 구조가 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 순 전하가 VL 아미노산 서열의 순 전하 및 VH 아미노산 서열의 순 전하의 합계를 포함하는 것인 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 전하 비대칭이 VL 아미노산 서열의 순 전하와 VH 아미노산 서열의 순 전하의 산술적인 곱을 포함하는 것인 방법.
  10. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 시험 항체의 적어도 하나의 점도 측정 데이터로부터 스케일링 계수를 유도하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 항체 및 시험 항체는 동일한 항체 클래스의 것인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 스케일링 계수의 선택이 각각의 하나 이상의 수성 용액 상태에 대한 스케일링 계수의 세트로부터 제1 스케일링 계수 및 제2 스케일링 계수를 선택하는 것을 포함하는 것인 방법.
  12. 제6항 또는 제11항에 있어서, 목적 함수에서, 지수의 log10이 (순 전하 X 제1 스케일링 계수) + (전하 비대칭 X 제2 스케일링 계수)의 합계를 포함하는 것인 방법.
  13. 제6항에 있어서,
    (a') 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 정보로부터, 구조적 정보로부터 소수성을 계산하는 단계; 및
    (b') 소수성에 대응하는 제3 스케일링 계수를 선택하는 단계
    를 추가로 포함하며, 여기서 목적 함수가 제3 스케일링 계수를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 소수성이 하나 이상의 CDR의 소수성의 값의 합산 함수의 총계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 각각의 합산 함수가 CDR의 소수성 잔기의 값의 합계와 CDR의 친수성 잔기의 값의 합계의 비인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 값이 아이젠버그(Eisenberg) 소수성 스케일 값인 방법.
  17. 제13항 또는 제14항에 있어서, 하나 이상의 CDR이 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 것인 방법.
  18. 제13항 또는 제14항에 있어서, 하나 이상의 CDR이 6개의 모든 CDR을 포함하는 것인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 스케일링 계수의 선택이 각각의 하나 이상의 수성 용액 상태에 대한 스케일링 계수의 세트로부터 제1 스케일링 계수, 제2 스케일링 계수 및 제3 스케일링 계수를 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  20. 제13항 또는 제19항에 있어서, 목적 함수에서, 지수의 log10이 (순 전하 X 제1 스케일링 계수) + (전하 비대칭 X 제2 스케일링 계수) + (소수성 X 제3 스케일링 계수)의 합계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제5항 또는 제20항에 있어서, 지수가 점도 한계를 초과할 때, 표적 항체를 생성하기 위해 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열에 돌연변이를 유발하는 단계가, 표적 항체의 점도에 대응하는 지수가 점도 한계를 초과하지 않도록 소수성을 감소시키고/시키거나, 순 전하를 증가시키고/시키거나, 전하 비대칭을 감소시키는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 표적 항체의 점도에 대응하는 지수가 표적 항체의 구조적 정보로부터 계산되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 표적 항체의 생산 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제5항에 있어서, 항체가 치료 항체이거나 또는 제약 조성물에 존재하는 것인 방법.
  26. (a) 항체가 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 따른 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는지 결정하는 단계;
    (b) 항체가 설계 기준을 충족하는 점도를 갖는 것으로 결정될 때 항체를 생산하는 단계
    를 포함하는, 항체의 생산 방법.
  27. 제26항에 있어서, 항체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 항체가 적어도 하나의 정제 단계에 의해 얻어지는 것인 방법.
  29. (a) 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고;
    (b) 구조적 정보로부터 계산된 항체의 순 전하를 네트워크를 통해 수신하고;
    (c) 순 전하가 순 전하 범위에 부합될 경우, 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 정보로부터, 구조적 정보로부터 계산된 소수성을 네트워크를 통해 수신하고, (i) 소수성이 소수성 한계를 초과하지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는다고 결정하거나 또는 (ii) 소수성이 소수성 한계를 초과할 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고;
    (d) 순 전하가 순 전하 범위에 부합되지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고;
    (e) 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는다고 결정된 경우에만 항체를 생산하는 것
    을 포함하는, 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는 항체의 생산 방법.
  30. (a) 항체의 순 전하를 항체의 구조적 정보로부터 계산하고;
    (b) 순 전하가 순 전하 범위에 부합될 경우, 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 정보로부터, 구조적 정보로부터 소수성을 계산하고, (i) 소수성이 소수성 한계를 초과하지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는다고 결정하거나 또는 (ii) 소수성이 소수성 한계를 초과할 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고;
    (c) 순 전하가 순 전하 범위에 부합되지 않을 경우, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는다고 결정하고;
    (d) 항체가 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는다고 결정된 경우에만 항체를 생산하는 것
    을 포함하는, 설계 기준을 충족하는 클리어런스율을 갖는 항체의 생산 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 항체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 항체가 적어도 하나의 정제 단계에 의해 얻어지는 것인 방법.
  33. 제29항 또는 제30항에 있어서, 구조적 정보로부터의 계산이 1차 구조의 정보로부터의 계산을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 1차 구조가 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 순 전하가 VL 아미노산 서열의 순 전하 및 VH 아미노산 서열의 순 전하의 합계를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 순 전하가 약 pH 5.5에서 VH의 순 전하 및 VL의 순 전하의 합계를 포함하는 것인 방법.
  37. 제33항에 있어서, 소수성이 하나 이상의 CDR의 소수성의 값의 합산 함수의 총계를 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 각각의 합산 함수가 CDR의 소수성 잔기의 값의 합계와 CDR의 친수성 잔기의 값의 합계의 비인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 값이 아이젠버그 소수성 스케일 값인 방법.
  40. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 CDR이 1, 2, 3, 4, 5개 또는 6개 모두의 CDR을 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 CDR이 경쇄 (LC) CDR1, LC CDR3 및 중쇄 (HC) CDR3인 방법.
  42. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 클리어런스율이 시노몰거스 원숭이 모델에서 측정시에 약 10 mL/kg/일 이하인 방법.
  43. 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 순 전하 범위가 약 -2.0 내지 약 6.2인 방법.
  44. 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 한계가 약 4인 방법.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 클리어런스율을 갖는 것으로 결정될 경우, 표적 항체를 생성하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열에 돌연변이를 유발하는 단계가 표적 항체의 순 전하를 순 전하 범위에 부합하게 하고/하거나 표적 항체의 소수성을 소수성 한계로 또는 그 미만으로 설정하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 표적 항체의 순 전하 및/또는 표적 항체의 소수성이 표적 항체의 구조적 정보로부터 계산되는 것인 방법.
  48. 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 항체가 IgG1 항체인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 항체가 치료 항체이거나 또는 제약 조성물 내에 존재하는 것인 방법.
  51. (a) 설계 기준을 충족하는, 항체에 대한 아스파르트산 불안정성 한계를 설정하고;
    (b) 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고;
    (c) 구조적 정보로부터 계산된, 항체의 아스파르트산 불안정성에 대응하는 지수를 네트워크를 통해 수신하고;
    (d) 항체가 설계 기준을 충족하는 아스파르트산 불안정성을 갖는지 결정하고;
    (e) 지수가 점도 한계를 초과하지 않는 경우에만 항체를 생산하는 것
    을 포함하며, 여기서 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열이 아스파르트산 잔기를 포함하는 것인, 설계 기준을 충족하는 아스파르트산 불안정성을 갖는 항체의 생산 방법.
  52. (a) 설계 기준을 충족하는, 항체에 대한 아스파르트산 불안정성 한계를 설정하고;
    (b) 항체의 아스파르트산 불안정성에 대응하는 지수를 항체의 구조적 정보로부터 계산하고;
    (c) 항체가 설계 기준을 충족하는 아스파르트산 불안정성을 갖는지 결정하고;
    (d) 지수가 아스파르트산 불안정성 한계를 초과하지 않는 경우에만 항체를 생산하는 것
    을 포함하며, 여기서 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열이 아스파르트산 잔기를 포함하는 것인, 설계 기준을 충족하는 아스파르트산 불안정성을 갖는 항체의 생산 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 지수가
    (a) CDR의 아미노산 서열로부터 (i) 아스파르트산 잔기와 회합된 알파 탄소의 평균 제곱근 요동, (ii) 아스파르트산 잔기의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적, 및 (iii) 아스파르트산 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기와 회합된 주쇄 질소 원자의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 계산하는 단계;
    (b) 항체에 대해 (i) 요동 스케일링 계수, (ii) 아스파르트산 잔기 표면적 스케일링 계수, 및 (iii) 주쇄 질소 원자 표면적 스케일링 계수를 선택하는 단계; 및
    (c) 스케일링 계수를 포함하는 목적 함수로부터 아스파르트산 불안정성에 대응하는 지수를 계산하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 계산되는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 아스파르트산 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기가 N 위치의 아스파르트산 잔기에 비해 N+1 위치에 존재하는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 적어도 하나의 시험 항체의 적어도 하나의 아스파르트산 불안정성 측정 데이터로부터 스케일링 계수를 유도하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 적어도 하나의 시험 항체의 아스파르트산 불안정성 측정이 특정 온도에서의 적어도 하나의 시험 항체의 인큐베이션, 이어서 질량 분광분석법 및 HPLC-기반 기술의 적용을 포함하는 것인 방법.
  57. 제51항 또는 제52항에 있어서, 아스파르트산 불안정성이 아스파르트산 이성질체화에 대응하는 것인 방법.
  58. 제51항 또는 제52항에 있어서, 설계 기준이 불안정성 한계인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 불안정성 한계가 저장 수명을 기초로 하는 것인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 불안정성 한계가 약 2.5%/주의 아스파르트산 이성질체화인 방법.
  61. 제53항에 있어서, 목적 함수에서, 지수가 (요동 X 요동 스케일링 계수) + (아스파르트산 잔기의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적 X 아스파르트산 잔기 표면적 스케일링 계수) + (주쇄 질소 원자의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적 X 주쇄 질소 원자 표면적 스케일링 계수)의 합계만큼 거듭제곱되는 오일러 수(Euler's number)를 포함하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 지수가 제1 지수이고, 제1 지수는 제2 지수를 생성하기 위해 한 개의 유효 숫자로 반올림할 수 있으며, 0인 제2 지수는 점도 한계를 초과하지 않는 제1 지수에 대응하고, 1인 제2 지수는 점도 한계를 초과하는 제1 지수에 대응하는 것인 방법.
  63. 제54항에 있어서, 아스파르트산 잔기에 바로 인접한 아미노산 잔기가 글라이신, 트레오닌, 아스파르트산 및 알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 제51항 또는 제52항에 있어서, 스케일링 계수의 선택이 각각의 하나 이상의 수성 용액 상태에 대해 (i) 요동 스케일링 계수, (ii) 아스파르트산 잔기 표면적 스케일링 계수; 및 (iii) 주쇄 질소 원자 표면적 스케일링 계수를 포함하는 스케일링 계수의 세트로부터의 선택을 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 수성 용액 상태가 온도, pH, 완충제 종류 및 이온 강도를 포함하는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 수성 용액 상태가 20 mM 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함하는 것인 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 수성 용액 상태가 약 313 K의 온도를 포함하는 것인 방법.
  68. 제51항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  69. 제51항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1 항체인 방법.
  70. 제51항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 설계 기준이 치료제 또는 제약 조성물에 대한 것인 방법.
  71. 제51항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 설계 기준을 충족하면, 항체의 Asp 불안정성을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제51항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 설계 기준을 충족하는 것으로 결정되면, 항체의 생산 단계를 추가로 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 항체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 항체가 적어도 하나의 정제 단계에 의해 얻어지는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 항체를 포함하는 제약 제제를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  76. 제51항 또는 제52항에 있어서, 항체가 기존재하는 항체이고, 기존재하는 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 아스파르트산 불안정성을 가질 때 지수가 아스파르트산 불안정성 한계를 초과하면, 설계 기준을 충족하는 아스파르트산 불안정성을 갖는 표적 항체를 생성하기 위해 기존재하는 항체의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형, 제거 또는 치환하는 단계; 및 표적 항체를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 아스파르트산 잔기를 포함하는 것인 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 생산된 표적 항체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 표적 항체가 적어도 하나의 정제 단계에 의해 얻어지는 것인 방법.
  80. (a) 항체의 구조적 정보를 네트워크를 통해 전송하고;
    (b) 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열로부터 CDR의 트립토판 잔기의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 네트워크를 통해 수신하며, 여기서 시간 평균한 용매 접근가능 표면적은 구조적 정보로부터 계산되고;
    (c) 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 컷오프 값에 비교하고;
    (d) 시간 평균한 용매 접근가능 표면적이 컷오프 값 미만일 때 항체가 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는다고 결정하고;
    (e) 항체가 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는다고 결정된 경우에만 항체를 생산하는 것
    을 포함하는, 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는 항체의 생산 방법.
  81. (a) 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열로부터 CDR의 트립토판 잔기의 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 계산하고;
    (b) 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 컷오프 값에 비교하고;
    (c) 시간 평균한 용매 접근가능 표면적이 컷오프 값 미만일 때 항체가 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는다고 결정하고;
    (d) 항체가 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는다고 결정된 경우에만 항체를 생산하는 것
    을 포함하는, 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는 항체의 생산 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 트립토판 불안정성이 트립토판 산화에 대응하는 것인 방법.
  83. 제80항 또는 제81항에 있어서, 물 용매화의 값이 시간 평균한 용매 접근가능 표면적을 계산하는 기초인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 물 용매화가 분자 동역학 시뮬레이션의 컴퓨터 모델링의 파라미터인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 분자 동역학 시뮬레이션이 앰버 (AMBER) 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  86. 제80항 또는 제81항에 있어서, 컷오프 값이 약 80 Å2 트립토판 측쇄 용매 접근가능 표면적인 방법.
  87. 제80항 또는 제81항에 있어서, 트립토판 측쇄 용매 접근가능 표면적이 아레아이몰 (AREAIMOL) 소프트웨어를 사용하여 결정되는 것인 방법.
  88. 제80항 또는 제81항에 있어서, 항체의 6개의 모든 CDR의 아미노산 서열이 단지 1개의 트립토판 잔기를 함유하는 것인 방법.
  89. 제80항 또는 제81항에 있어서, 항체가 설계 기준을 충족하는 Trp 불안정성을 갖는 것으로 결정될 때 Trp 불안정성을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  90. 제80항 또는 제81항에 있어서, 생산된 항체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 항체가 적어도 하나의 정제 단계에 의해 얻어지는 것인 방법.
  92. 제80항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 포함하는 제약 조성물의 제조 단계를 추가로 포함하는 방법.
  93. 제80항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  94. 제80항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1 항체인 방법.
  95. 제80항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 설계 기준이 치료제에 대한 것인 방법.
  96. 제80항 또는 제81항에 있어서, 항체가 기존재하는 항체이고, 기존재하는 항체가 설계 기준을 충족하지 않는 트립토판 불안정성을 가지면, 설계 기준을 충족하는 트립토판 불안정성을 갖는 표적 항체를 생성하기 위해 기존재하는 항체의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형, 제거 또는 치환하고; 표적 항체를 생산하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 트립토판 잔기를 포함하는 것인 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 생산된 표적 항체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 표적 항체가 적어도 하나의 정제 단계에 의해 얻어지는 것인 방법.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 표적 항체가 항체 또는 표적 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체 또는 표적 항체 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 방법에 따라 생산되는 것인 방법.
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