KR20160084990A - 아까시나무 추출물을 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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곽종환
박봉균
전유경
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구을리주식회사
문치웅
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Abstract

본 발명은 아까시나무 추출물을 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아까시나무 추출물이 함유된 조성물은 HMG-CoA reductase assay실험, 지질 측정 실험, 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 TNF-α과 IL-6의 분비능 측정실험, 혈관 세포분자인 ICAM-1과 VCAM-1의 mRNA 발현 측정 실험뿐만 아니라, 화학 주성인자인 CCL2와 CCL5의 mRNA 발현 억제능 측정 실험과 지방 합성 인자인 HMG-CoA, SREBP-2, LXR, LOX-1의 mRNA 발현 억제능 측정 실험을 통하여, 본 발명의 시료가 TNF-α에 의해 유도되는 세포부착분자의 발현을 억제시킴으로써, 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.

Description

아까시나무 추출물을 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물 {A composition comprising a extract of Robinia pseudoacacia for prevention and treatment of Atherosclerosis, myocardial infarction, stroke, vascular dementia, liver disease, dyslipidemia or thrombosis}
본 발명은 아까시나무 추출물을 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
[문헌 1] Peter Libby, Nature, 420, 6917:868-874, 2002
[문헌 2] Sharon J. Hyduk et al., Progress in Flammation Reserah, Part 2, 141-174, 2007
[문헌 3] Judith A. Berliner, et al., circulation, 1995, 91, 2488-2496; Eva Hurt-Camejo, et al., Circ, Res, 2001, 89:9, 298-304
[문헌 4] T. Tikka, et al., J. Neurosci., 2001, 21, 2580-2588
[문헌 5] Mertens A, Holvoet P., 2001, 15, 2073-2084
[문헌 6] 정보섭외, 도해향약대사전,영림사, p706-707, 1998년
[문헌 7] 한국특허등록 제 10-0902338호
[문헌 8] Koning, A.J., et al., Mol. Biol. Cell, 1996, 7, 769-789
본 발명은 아까시나무(Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 물, 알코올 또는 이들의 혼합액을 용매로 하여 추출되는 아까시나무 추출물의 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환 또는 혈전증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
죽상동맥경화증(atherosclerosis)은 지방을 포함한 끈적끈적한 액체가 점차 동맥 내벽 표면에 축적되어 조직으로 도달하는 혈류를 막아 조직의 괴사를 일으키는 혈관질환으로 그 조직이 뇌나 심근일 경우 뇌졸증 및 심장마비를 유발하게 된다. 이러한 동맥경화증은 어떤 특정한 원인에 의해 발병되는 단일 질환이 아니라, 연령, 성별, 유전적 환경, 스트레스, 비만, 흡연, 음주, 불포화 지방의 섭취, 당뇨병, 다이어트 등의 다양한 원인들이 복합적으로 작용하여 일어나는 질환이다.
죽상동맥경화증의 시작은, 동맥의 혈관벽 내의 지질과 섬유요소의 축적이 특징인 염증 반응으로 뚜렷해지는 것이 특징이고, 이것은 심혈관 질병의 주요 원인이 된다. 이에, 최근 들어 동맥경화는 일종의 염증성 질환으로 여겨지고 있다. 동맥경화증에서 가장 먼저 관찰되는 반응은 동맥의 내막에 존재하는 내피세포(endothelial cell)의 손상으로 인한 기능이상이다. 내피세포의 기능 이상은, 주위 자극에 대하여 가역적인 변화를 나타내는 것을 말하며 내피세포에 혈중 단핵세포(monocyte)와 혈소판의 부착이 증가하는 현상으로 나타난다. 내피세포의 손상을 일으키는 유발 물질로는 각종 사이토카인(cytokine), 박테리아 생성물, 바이러스 보체, 산소결핍 등이 알려져 있다.
손상된 내피세포에서 발현되는 세포부착분자(cell adhesion molecule)인 세포간 부착분자-1(intracellular adhesion molecule-1; 이하, ICAM-1이라 함), 혈관 포부착분자-1(vascular cell adhesion molecule-1; 이하 VCAM-1이라 함), E-selectin, P-selectin 등은 단핵세포의 표면에 부착되어 수용체로서의 역할을 하게 된다. 이후 세포부착분자와 결합한 단핵세포는 내피세포 사이를 투과해 동맥의 내막으로 이동하여 대식세포로 분화한다.
이 과정에 내피세포와 대식세포로부터 분비되는 M-CSF(macrophage colony stimulation factor)가 관여하며, 분화한 대식세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 사이토카인이 병의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Peter Libby, Nature, 420, 6917:868-874, 2002).
TNF-α(tumor necrosis factor-α)는 면역계에서 염증을 일으키는 주요 사이토카인으로 면역세포들에 의해 분비되며, 특히 자극받은 대식세포에서 다량이 분비된다. 또한, 이 사이토카인은 세포를 자극할 경우, 세포사멸을 일으키는 신호와 NF-κB의 활성을 통해서 세포 사멸을 억제하는 두 가지 모순적인 신호를 보내게 된다. 동맥경화에 있어서는 신생혈관의 생성, 혈전생성의 증가와 출혈성 괴사 등을 유발하여 죽상경화의 진행에 관여하며, 심근의 염증반응도 유도한다.
또한, 세포부착분자는 고혈압과 동맥경화와 같은 다양한 혈관 질환에 관여하며, 세포의 표면에 발현하여 다른 세포나 세포외기질에 부착시키는 역할을 한다. 그 중 ICAM-1과 VCAM-1은 immunoglobulin gene superfamily에 속하는 막투과성 당단백질로, 급성 또는 만성 염증상태나 질병의 유발과정에서 TNF-α 등과 같은 염증성 사이토카인에 의해 조절되며, 초기 동맥경화가 유발된 곳의 내피세포에서 발현이 증가되는 반면, 동맥경화가 유발되지 않은 부위에서는 관찰되지 않기 때문에 동맥 경화에 있어서 작용을 한다고 알려져 있다(Sharon J. Hyduk et al., Progress in Flammation Reserah, Part 2, 141-174, 2007).
또한 ICAM-1은 leukocytes에서 발현되는 LFA-1과 같은 integrin에 결합하고, VCAM-1은 mononuclear leukocytes, eosinophils and basophils에서 발현되는 integrin VLA4와 결합하므로, 혈관벽 내로 유입된 leukocytes의 축적을 용이하게 한다. 즉, 동맥경화에 있어서, ICAM-1 및 VCAM-1은 염증성 질환을 유발시키는 주요 인자로 볼 수 있다. 이에, 상기 ICAM-1, VCAM-1 등의 세포부착분자의 발현을 억제하면 혈관 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.
축적된 LDL (Low-density lipoprotein)은 산화 작용이 일어나게 되는데, 이를 oxidized-LDL (oxLDL)이라 한다. oxLDL은 내피세포의 활성화, 기능 장애 그리고 손상을 통해 동맥경화에 영향을 미친다고 알려져 있다. oxLDL은 monocyte에서 chemokine으로 작용함과 동시에 endothelial cell(내피세포)가 chemokine을 분비하도록 도와주며, monocyte adhesion molecule의 발현을 증가시켜 다양한 동맥경화증상을 나타낸다. 이 oxLDL은 여러 scavenger receptor에 의해 대식세포뿐만 아니라 평활근세포 내로 흡수 되며, 여러 receptor 중 LOX-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1)이 동맥경화의 진행과 밀접한 연관이 있다는 것은 많은 연구를 통해 알려져 있다. oxLDL이 VCAM-1과 ICAM-1의 발현을 증가시키며, 그 작용은 LOX-1을 통해 이루어진다고 보고되어 있다.
이와 관련된 질환으로는 심근경색, 뇌졸중, 혈관성 치매, 혈전용해 등이 있는데, 심근경색은 고콜레스테롤 혈증에 의해 혈류를 방해하여 유발될 수 있는 심혈관 질환이다. 현대인의 식생활 환경의 향상에 따른 과다한 영양 섭취로 인해 과다 섭취된 콜레스테롤은 신체 내의 세포 요구를 충족시키고 남게 된다. 이러한 콜레스테롤은 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein, LDL)을 통해 떠돌다가 변형된 형태로 바뀌어 혈관 내막에 흡착되고, 포말세포(foam cell), 지방반(fatty streak), 아테롬(atherom)으로 전환되기도 하며, 이들은 혈관의 수축, 팽창 능력을 떨어뜨려 관상 동맥 질환, 뇌졸중, 말초혈관 협착, 고혈압 등을 일으키는 원인이 되고 있다. 포말 세포들은 염증 반응과 세포성장을 반복하면서 혈관벽을 파괴하거나 비후하여, 혈액중의 혈소판이 점착됨으로 혈전을 형성하게 한다. 이러한 진행과정은 결국, 동맥경화에 의한 혈관의 협착과 혈전에 의한 혈관의 완전 폐쇄로 심장으로의 혈액 공급이 순간적으로 차단되어, 심근경색에 의한 사망을 유도하거나, 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등으로 진행되고 있다. 이러한 동맥경화로 인한 질병은 현대 사회에 있어, 특히 50∼60대의 남성들에게 가장 큰 사망요인으로 나타나고 있다(Judith A. Berliner, et al., circulation, 1995, 91, 2488-2496; Eva Hurt-Camejo, et al., Circ, Res, 2001, 89:9, 298-304).
뇌졸중(stroke 또는 cerebrovascular accident)은 흔히 중풍이라고 하며, 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터져서 손상 받은 부위의 뇌세포가 죽게 되어 그에 따른 의식소실, 언어장애, 반신마비 등 신체장애가 나타나는 신경학적 증상이다. 동맥의 벽이 두꺼워지거나 딱딱해지고, 이로 인해 혈관이 좁아지며 혈관의 안벽이 상처받기 쉽고 매끄럽지 못해서 피가 엉겨 붙으면서 결국 막히게 되고 혈액의 공급이 현저히 줄거나 중단되어 뇌세포로 가는 산소 및 영양공급이 부족하여 뇌기능의 장애를 초래하게 된다. 뇌졸중은 암에 이어 국내 사망원인 2위의 질환으로, 2002년 세계 의약품 시장 동향에서 뇌졸중의 치료에 사용되는 항응고제, 혈전용해제, 항혈소판제 등의 혈액 관련 의약품의 시장 규모는 전 세계 의약품 시장 규모의 18% 정도인 872억 달러로 추정된다. 뇌졸중 환자의 수도 2005년 44만2699명이 발생해 2001년 대비 43.9% 증가하였고, 고령화 인구의 증가와 함께 인구 10만명 당 뇌졸중 환자수도 2001년 640명에서 2005년에는 908명으로 늘어났으며 진료비는 5625억원이 들어 2001년 대비 42.8%가 증가하였다. 그러나 뇌졸중은 병의 원인이 아직 확실치 않아 수술요법, 약물요법, 세포요법, 면역요법 등이 시도되고 있으나, 만성적이고 퇴행적이어서 치료가 쉽지 않다. 현재 치료방법으로서는 항혈전제, 항응고제, 항혈소판제제, 혈전용해제를 이용한 약물요법이 사용되고 있으나, 현재 유일하게 허가된 약물인 항혈전제(tPA)는 출혈성 뇌졸중의 경우 병을 더욱 악화시키게 되며, 알러지 등의 부작용을 유발하게 된다. 즉, 뇌졸중은 진단도 쉽지 않고 조기 발견이 어려우며 아직까지도 근본적인 치료법이 없는 상태이다. 한편, 미세신경교세포 활성의 과발현은 시냅스 기능장애 및 신경세포 사멸에 결정적인 역할을 하므로, 뇌졸중의 치료적 중재의 표적이 되어 왔다. 이 세포에서의 전염증 사이토카인(TNF-α, NF-κB)의 생성 억제효과를 통해 뇌졸중의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다(T. Tikka, et al., J. Neurosci., 2001, 21, 2580-2588).
혈관성 치매는 주로 뇌경색 또는 뇌졸중 등의 발생에 의하여 발병 부위 주변의 뇌세포가 손상을 입어 기억력 상실 등의 증상이 유발된다고 알려져 있다. 미세신경교세포에서의 전염증 사이토카인(TNF-α, NF-κB)의 생성 억제효과를 통해 뇌졸중을 예방하면 혈관성 치매에도 예방 및 개선효과를 가질 수 있다. 한편, 알츠하이머성 치매는 뇌세포 파괴에 의한 퇴행성 뇌질환으로, 초기에는 기억력 감퇴, 성격의 변화 및 사고력 저하 등의 증상을 보이며 서서히 진행되지만, 대부분의 환자는 8∼10년 내에 폐렴 등으로 사망하는 것으로 알려져 있다. 최근의 역학 연구에 의하면 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 및 심장질환 등의 뇌혈관 질환의 위험인자들이 혈관성 치매뿐만 아니라 알츠하이머성 치매의 발병률을 증가시킨다는 보고는 있었지만, 아직까지 정확한 병인이나 치료법은 알려지지 않은 실정이다.
동맥경화에서 중요한 요인은 LDL의 산화 즉, oxLDL의 생성인데 이는 염증반응과 관련 있고 동맥석회화(arterial calcification)를 유발한다. 이 oxLDL로 인해 형성된 동맥석회화는 내피의 기능이상을 촉진하고 내피세포에서 단핵구 화학주성 단백(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)을 분비시켜, 내피하 공간으로 단핵구의 침윤을 유발하여 지방 선조(fatty streak)를 형성하여 동맥혈관내벽의 성질을 변화시킨다. 이런 기능장애는 혈소판 유착의 증가, 혈액응고능의 증가, 섬유소용해의 장애 등을 동반한다. oxLDL은 혈관내벽에서의 산화질소 생성 감소와 prostacyclin(PGI2) 생성의 증가, prostaglandin과 prostaglandin 전구물질의 합성 자극을 통해 혈소판 유착 및 응집을 자극한다. 또한 oxLDL은 내피세포와 평활근 세포에서 조직인자를 유리시켜 혈관내피의 혈액응고능을 증가시킨다. 조직인자는 인자 IX, X를 활성화시키는데, 이는 트롬빈을 생성하는 인자 VIIa의 보조인자이다. oxLDL은 조직형 플라스미노겐 활성인자(tPA)의 분비를 감소시키고 플라스미노겐 활성인자 억제인자 1(PAI-1)의 분비를 증가시키므로 내피세포의 섬유소 용해능을 감소시킨다.
또한 Metaloproteinase 9 (MMP-9)의 발현을 증가시키고 단핵구들에서 분비되는 MMP-9의 조직 억제제인 TIMP-1의 발현을 감소시켜 죽종의 파열과 혈관의 재형성에도 영향을 미친다(Mertens A, Holvoet P., 2001, 15, 2073-2084). 즉, 혈전은 고콜레스테롤에 과잉 혈소판 응집이 매개 되는 병리현상으로 지금까지 개발된 항혈소판제로는 데오필린(theopylline), 몰시도민(molsidomin), 베라파밀(verapamil), 니페디핀(nifedipine) 등이 있다. 이들은 cAMP와 cGMP의 생성을 촉진하여 동맥석회화를 유발하는 Ca2 +의 동원을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Mertens A, Holvoet P., 2001, 15, 2073-2084).
또한 아스피린, 이미다졸, 인도메타신 등의 비스테로이드계 화합물들은 트롬복산 A2의 생성을 저해함으로써 항혈소판 작용을 가지는 약물들로 알려져 있다. 그러나 상기 약물들은 화학 물질로 의약품이긴 하지만 인체에 지혈과다억제, 불임, 소화기 장애 등의 여러 부작용을 야기하는 문제점이 있다. 따라서 혈중 총 콜레스테롤, 고밀도 콜레스테롤(HDL), 저밀도 콜레스테롤(LDL)의 수치를 감소시키고 동시에 oxLDL의 수치를 감소시킴으로서 동맥석회화를 억제하여 그로인해 혈전생성 억제의 효과를 볼 수 있을 것으로 사료된다.
한편 아까시나무 (Robinia pseudoacacia)는 콩과(Leguminosae)에 속하는 북미원산의 낙엽교목으로서, 전국야산에 분포하며, 꽃에는 카날린(canaline), 탄닌(tannin), 플라보노이드(flavonoid), 리신( ricin) 등의 성분을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 하혈, 각혈 등의 치료에 사용되어 왔다(정보섭외, 도해향약대사전,영림사, p706-707, 1998년).
이와 유사한 유사 동속식물로는 민둥아까시나무(Robinia pseudoacacia var. umbraculifera), 꽃아까시나무(Robinia hispida L.), 붉은 꽃아까시나무(Robinia x margaretta), 등의 동속식물이 알려진 바가 있으며, 이중 민둥아까시나무(Robinia pseudoacacia) var. umbraculifera) 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물들이 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, PPAR)를 활성화시켜서 비만, 당뇨, 염증, 피부노화, 주름 등에 대한 치료효과가 알려져 있다 (한국특허등록 제 10-0902338호).
그러나 상기 문헌의 어디에도 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물의 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환 또는 혈전증 질환에 대한 치료효능에 대한 내용이 개시되거나 교시된 바는 없다.
이에, 본 발명자들은 TNF-α를 유도하는 세포부착분자의 발현을 억제하는 물질에 대하여 조사하던 중, 아까시나무 (Robinia pseudoacacia)의 추출물을 대상으로 HMG-CoA reductase assay실험, 지질 측정 실험, 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 TNF-α과 IL-6의 분비능 측정실험, 혈관 세포분자인 ICAM-1과 VCAM-1의 mRNA 발현 측정 실험뿐만 아니라, 화학 주성인자인 CCL2와 CCL5의 mRNA 발현 억제능 측정 실험과 지방 합성 인자인 HMG-CoA, SREBP-2, LXR, LOX-1의 mRNA 발현 억제능 측정 실험을 통하여, 본 발명의 시료가 TNF-α에 의해 유도되는 세포부착분자의 발현을 억제시킴으로써, 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환 또는 혈전증을 억제시켜, TNF-α에 의해 유도되는 세포부착분자의 발현을 억제시킨다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 "추출물"은 아까시나무의 줄기, 엽 및 뿌리 등의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 에탄올 또는 수용성 에탄올 용매, 보다 바람직하게는 수용성 에탄올 용매, 보다 더 바람직하게는 30 내지 90% 수용성 에탄올에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 비극성용매 가용 추출 분획물은 본원의 조추출물로부터 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물만을 정제한 비극성 용매에 가용한 추출 분획물들을 포함한다.
본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물로부터 비극성용매 가용분획물들을 제거하고 남은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올, 보다 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출 분획물을 포함한다.
본원에서 정의되는 간질환은 급성, 간염, 만성 간염, 지방간, 또는 간경화증을 포함한다.
바람직하게는, TNF-α를 유도하는 세포부착분자인 ICAM-1 또는 VCAM-1의 발현의 억제; 화학 주성인자인 CCL2와 CCL5의 발현의 억제; 또는 지방 합성 인자인 HMG-CoA, SREBP-2, LXR와 LOX-1의 발현 억제하는 것을 특징으로 하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환 또는 혈전증을 치료, 예방 또는 개선함을 특징으로 한다.
또한, 추가적으로 본 발명은 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포부착분자인 ICAM-1 또는 VCAM-1의 발현 억제제를 제공한다.
또한, 추가적으로 본 발명은 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화학 주성인자인 CCL2와 CCL5의 발현 억제제를 제공한다.
또한, 추가적으로 본 발명은 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 합성 인자인 HMG-CoA, SREBP-2, LXR와 LDLR의 발현 억제제를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 추출물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.
예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 상기 단계에서 얻은 건조 재료인 아까시나무 뿌리, 줄기 등을 세척하여, 상기 시료의 1 내지 20배 (w/v) 중량, 바람직하게는 1 내지 10배 (w/v) 중량의 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 수용성 에탄올 혼합용매로 50 내지 120℃, 바람직하게는 약 80-100℃에서 1시간 내지 5시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간 동안 열수 추출법, 냉침 추출법 또는 초음파 추출법, 바람직하게는 열수 추출법을 수행하는 제 1단계; 상기 단계에서 얻은 추출액을 여과지로 여과하여 여과물을 수득하는 제 2단계; 상기 여과물을 동결건조, 상온건조 또는 열풍건조, 바람직하게는 동결건조를 수행하여 건조상태의 조추출물을 수득하는 제 3단계 공정을 통하여 본 발명의 생약 추출물을 제조가능하다.
또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 수용성 에탄올 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 5배, 바람직하게는 0.05 내지 0.5배 부피 (v/w%)의 물을 가한 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 수득할 수 있다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 시료를 대상으로 한, HMG-CoA reductase assay실험, 지질 측정 실험, 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 TNF-α과 IL-6의 분비능 측정실험, 혈관 세포분자인 ICAM-1과 VCAM-1의 mRNA 발현 측정 실험뿐만 아니라, 화학 주성인자인 CCL2와 CCL5의 mRNA 발현 억제능 측정 실험과 지방 합성 인자인 HMG-CoA, SREBP-2, LXR, LOX-1의 mRNA 발현 억제능 측정 실험을 통하여, 본 발명의 시료가 TNF-α에 의해 유도되는 세포부착분자의 발현을 억제시킴으로써, 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 아까시 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명의 시료는 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.
본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.
본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아까시나무 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리 세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 추출물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (intracere broventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능 식품을 제공한다.
본 발명의 추출물을 포함하는 건강기능식품은 목적 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 목적 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량 백분율로 포함한다.
또한, 목적 질환의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
또한, 본 발명은 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 및 개선용 건강보조식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 및 개선용 식품 또는 식품첨가물을 제공한다.
또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 추출물이 포함된 기능성 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 정제물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 추출물은 목적 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출 정제물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖ 을 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g 의 비율로 가할 수 있다.
상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 추출물을 대상으로 한, HMG-CoA reductase assay실험, 지질 측정 실험, 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 TNF-α과 IL-6의 분비능 측정실험, 혈관 세포분자인 ICAM-1과 VCAM-1의 mRNA 발현 측정 실험뿐만 아니라, 화학 주성인자인 CCL2와 CCL5의 mRNA 발현 억제능 측정 실험과 지방 합성 인자인 HMG-CoA, SREBP-2, LXR, LOX-1의 mRNA 발현 억제능 측정 실험을 통하여, 본 발명의 시료가 TNF-α에 의해 유도되는 세포부착분자의 발현을 억제시킴으로써, 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.
도 1는 아까시나무 추출물 및 용매분획물의 in vitro HMG-CoA reductase 억제활성을 나타낸 도이며;
도 2는 시료를 고 콜레스테롤 사료를 먹인 마우스에 경구 투여 후 염증성 싸이토카인(TNF-α, IL-6)을 측정한 표이며;
도 3는 시료의 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 혈관 세포분자(ICAM-1, VCAM-2)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 4는 시료의 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 화학 주성인자(CCL2, CCL5)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 5는 시료의 간 조직 내에서 고 콜레스테롤에 의해 증가되는 지방 합성인자(HMG-CoA) 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아까시나무 추출물 (A11) 의 제조
건조된 아까시나무 줄기와 뿌리를 추출용기(Ilshin Lab Co., Ltd, FD8512)에 넣고 80% 에탄올 1 L를 가하여 증류순환 장치에서 가열추출 (추출온도는 70℃)을 1회 수행하였고, 여과지(3M paper)로 여과하여 이후 얻어진 추출액 용매를 감압농축기(Sunil EYELA, Rotatory evaporator, N-1N)로 감압 농축하여 5.26g의 80% 에탄올 추출물을 수득하였다 (이하, “A11라 함).
실시예 2. 아까시나무 추출물의 분획물 제조
실시예 1의 50.98g의 에탄올 추출물을 증류수 600ml에 현탁하고 동량의 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, n-부탄올로 각각 3회 상법에 따라 차례로 분획하여 헥산 분획(4.06g. 이하 A11-Hex라 함), 메틸렌 클로라이드 분획(3.19g, 이하 A11-MC라 함), 에틸 아세테이트 분획(이하A11-EA라 함, 8.93g), n-부탄올 분획(14.44g, 이하 A11-BuOH라 함) 및 물 분획(20.17g, 이하 A11-H2O라 함)을 수득하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다.
실험예 1: 시험관내 실험 ( HMG - CoA reductase assay )
상기 실시 예에서 수득한 시료들의 지질혈증에 대한 효능을 확인하기 위하여, 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Koning, A.J., et al., Mol. Biol. Cell, 1996, 7, 769-789).
키트(HMG-CoA reductase kit, Sigma-Aldrich, catalog number CS1090)를 사용하였으며 방법은 사용설명서에 기재된 방법에 따랐다. 그 방법은 먼저 분광기(spectrophotometer)를 37℃로 세팅하고 흡광도 340nm로 맞춰놓았으며 1X assay buffer를 디자인된 모든 시료(sample)군에 넣고 저해제(inhibitor)인 프라바스타틴(pravastatin, Sigma-Aldrich, catalog number CS1090) 또는 시료(100, 10, 1 μg/ml)를 저해 시료(inhibition sample) 군에 넣었다. 모든 샘플 군에 NADPH(Sigma-Aldrich, catalog number CS1090)와 HMG-CoA(Sigma-Aldrich, catalog number CS1090)를 넣고, 활성(Activity)과 저해(inhbition) 샘플 군에 HMG-CoA reductase를 넣었다. 그리고 전체 시료를 10초간 진탕(shaking) 해주고 340nm에서 10분 동안 20초 간격으로 흡광도를 측정하였다.
상기 실험 결과, A11은 양성대조물질인 프라바스타틴과 비교하여 100 μg/ml의 농도에서 77%의 HMG-CoA reductase 억제활성을 보였고, A11의 용매분획에 대한 실험에서는 특히, 에틸 아세테이트분획이 양성대조약물인 프라바스타틴과 100 μg/ml 농도에서 거의 동일한 정도의 강력한 HMG-CoA reductase 억제활성을 보였다. (표 1 및 도 1 참조)
아까시나무추출물 및 용매분획물의 in vitro HMG-CoA reductase 억제활성
HMG-CoA reductase inhibitory activity ( % of pravastatin)
106 μg/ml 1.2 μg/ml 1 μg/ml 10 μg/ml 100 μg/ml
Pravastatin 100 - - - -
HMG-CoA reductase - 38.1 - - -
A11 39.9 67.4 77.0
A11-Hex - - 39.8 39.0 40.2
A11-MC - - 40.7 39.8 40.7
A11-EA 42.3 80.9 96.7
A11-BuOH - - 42.7 37.8 41.7
A11-H2O - - 38.9 37.0 39.4
실험예 2: 고 콜레스테롤 사료를 먹인 마우스에서 아까시나무 추출물(A11)의 동맥경화 및 관련 질환에 대한 효과 확인
(1) 실험 동물
본 연구에 사용된 실험동물은 1 주일간 순화 시킨 체중 16~18g 의 5주령 C57BL/6 마우스와 ApoE -/- knockout 마우스로 ㈜ 중앙 실험동물에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 다음 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기 12시간(명주기: 08:00~20:00)이 자동 설정된 동물 사육실에서 실험을 진행하였으며, 매주 150g 정량의 30% 고 cholesterol 포함된 사료와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험동물은 control 군(CTR), 음성 대조군과(ApoE -/-), 양성 대조군 (pravastatin), 추출물인 A11 두 농도군 (A11 10/20), 총 네 군이고, 각 군당 6마리의 마우스를 사용하였다. A11은 3차 증류수에 녹여 사용하였으며, 투여량은 200 μL/mouse/days이며 투여 농도는 10, 20 mg/kg으로 주 3회 16주간 경구 투여하였다.
(2) 통계학적 분석
모든 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었다. 대조군과 처리군 과의 통계학적인 차이는 Student’s t-test 분석법을 이용하여 유의성을 결정하였으며, P 값이 5% 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
(3) 고 콜레스테롤 사료를 먹인 ApoE -/- 마우스에 A11를 경구 투여 후 마우스 무게 측정.
매주 150g 정량의 30% 고 cholesterol 포함된 사료를 16주 공급 하는 동안 매주 한번 씩 마우스의 무게를 측정 하였다. 실험동물은 control 군(CTR), 음성 대조군과(ApoE -/-), 양성 대조군 (pravastatin), 추출물인 A11 두 농도군 (A11 10/20), 총 다섯 군이고, 각 군당 6마리의 마우스를 사용하였다. 무게변화는 16주간 관찰 기간 동안의 체중 증감에 있어 음성 대조군인, ApoE -/- 마우스 군이 대조군 (CTR)에 비해 무게의 변화가 유의적이지 못하였다. 그리고 음성 대조군과 양성대조군 뿐만 아니라 추출물인 A11 약물을 경구 투여한 두 마우스 군의 무게 차이도 유의성이 없었다. 이 실험결과로부터 A11은 마우스 무게 증가 또는 감소에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
실험기간의 5주와 21주에서 마우스의 체중 변화
5 weeks (g) 21 weeks (g)
CTR 18.23 ± 0.66 26.75 ± 1.75
ApoE (-/-) 17.33 ± 0.75 24.13 ± 1.5
pravastatin 16.63 ± 0.85 24.43 ± 0.75
A11 10 17.27 ± 0.76 24.1 ± 1.8
A11 20 17.2 ± 0.75 23.53 ± 1.5
(4) 고 콜레스테롤 사료를 먹인 ApoE -/- 마우스에 A11를 경구 투여 후 혈청 내 지질 측정 및 염증성 사이토카인 측정
실험 최종일 12시간 금식시킨 다음 ethyl ether로 가볍게 마취시킨 뒤에 70% 에탄올로 복부를 소독 후 해부 하였다. 개복 후 1 ml 주사기로 복부 대동맥에서 채혈 한 후 채취한 혈액은 ice에서 3시간 보관 뒤 원심분리기로 3000rpm에서 20분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다.
분리한 혈청에서 lactate dehydrogenase (LDH), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), calcium (Ca), low density lipoprotein (LDL), high density lipoprotein cholesterol (HDL) 생화학적 분석은 라온 바이오에 의뢰하였다. 분석 결과 LDH, TG, TC, Ca, LDL, HDL 모두 control 군 보다 음성 대조군인 ApoE 가 결손 된 마우스 군에서 유의성 있게 증가 하였고, 반면에 음성 대조군과 양성 대조군을 비교 하였을 경우, pravastatin (5mg/kg)를 경구 투여한 양성 대조군에서 유의성 있게 모든 인자가 감소되었다.
그리고 추출물질인 A11 10mg/kg 군에서는 TG를 제외한 다른 인자들은 유의성 있게 감소되었고, A11 20mg/kg 군에서는 모든 인자 들이 유의성 있게 감소되었다. 그리고 특별히 LDL의 경우는 양성 대조군 보다 A11 10/20 mg/kg 군 모두에서 현저히 감소함을 나타내었다. 반면에 인체에 유익한 HDL은 A11 추출물을 투여한 2개 군에서 모두 대조군에 비해 우수한 결과를 보여주고 있다.
이 결과에서 혈관 질환의 주 인자인 LDL에 대해 천연 추출물 A11은 뛰어난 효능을 보임과 동시에 HDL은 안정적으로 유지시켜 줌을 알 수 있다. 또한 TG에 대해 A11 10mg/kg 군에서 다소 낮게 나오지만, 투여량을 높인 A11 10/20 mg/kg 군에서 현저히 떨어지는 것을 보면 투여량에 영향을 받는 것으로 나타나며, 이러한 부분은 양을 높였을 때 해결이 가능함을 보여주고 있다. 동맥경화, 심근경색, 뇌졸중의 주요 인자인 LDL/HDL에서는 본 기술의 A11에 의한 결과가 pravastatin (5mg/kg)를 경구 투여한 양성 대조군보다 우수한 결과를 보이고 있다.
이것은 pravastatin (5mg/kg)이 유익한 HDL도 LDL과 함께 감소시켜 버리는데 반해, 본 기술에 의한 A11 10mg/kg과 A11 10/20 mg/kg은 HDL은 유지하면서 심혈관 질환의 주요 인자인 LDL은 크게 감소시키는 이상적인 결과를 보여주고 있다.
ApoE 결손 마우스에서 A11 투여에 따른 LDH, TG, TC, Ca, LDL 및 HDL의 변화
LDH (U/L) TG (mg/dl) TC (mg/dl) Ca (mg/dl) LDL (mg/dl) HDL (mg/dl) AI LDL/HDL TC/
HDL
CTR 635 ± 36.09 73 ± 11.02 250 ± 5.00 10 ± 0.25 143 ± 7.02 160 ± 18.93 0.57 0.89 1.56
ApoE (-/-)
 935 ± 41.88 108 ± 5.57 1328 ± 11.55 17 ± 0.58 211 ± 6.66 544 ± 33.05 1.44 0.39 2.44
ApoE (-/-) + pravastatin (5 mg/kg) 635 ± 32.23* 76 ± 18.82* 1024 ± 2.65* 11 ± 0.56* 127 ± 19.66* 455 ± 4.93* 1.24* 0.30 2.25
ApoE (-/-) + A11 10
 662 ± 22.37* 106 ± 11.50 1115 ± 11.27* 13 ± 0.1* 107 ± 10.12* 482 ± 8.33* 1.31* 0.22 2.31
ApoE (-/-) + A11 20 654 ± 46.54* 87 ± 4.16* 1066 ± 24.88* 13 ± 0.32* 107 ± 8.14* 463 ± 4.16* 1.30* 0.23 2.30
AI (atherosclerosis index)=(total cholesterol-HDL cholesterol)/(HDL cholesterol)
values are mean ± S.E. (n=6)
또한, 30% 고 콜레스테롤 사료에 의해 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 의 발현에 대한 추출물인 A11 의 영향을 확인하기 위하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 측정하였다. ELISA는 Mo SJ 등이 사용한 방법을 이용하였다(Mo SJ et al., J.Ethnopharmacol, 109:78-86, 2007). 분리된 혈청과 commercial kit에 주어진 표준 cytokine을 cytokine-specific monoclonal antibody로 도포된 ELISA plate (Biolegend)에 넣고 plate를 37℃ 에서 2시간 동안 배양한 뒤 세척하였다. 효소가 결합된 cytokine specific polyclonal antibody를 다시 plate에 넣고 37℃ 에서 2시간 동안 배양하고 세척하였다. 기질 용액을 넣고 상온에서 30분 동안 방치하여 반응하도록 한 뒤, ELISA plate의 각 well의 흡광도는 650 nm에서 microplate reader로 측정하였다.
그 결과, TNF-α, IL-6 의 혈청 내 발현은 30% 고 콜레스테롤 사료에 의해 유도 되는 것으로 나타났다. 그러나 양성 대조군인 pravastatin 의 경우, 유의성 있게 TNF-α 와 IL-6의 발현 양을 유의성이 있게 감소시켰고, A11 군의 경우, A11 10mg/kg 군에서는 유의성을 찾을 수 없었으나, 투여량을 늘린 A11 20mg/kg 군에서는 유의성 있게 두 염증성 사이토카인을 억제시켰다. (도 2 참조). 염증의 억제는 동맥경화증, 혈전생성, 심근경색, 뇌졸중을 포함한 심혈관계 질환의 치료를 위한 가장 중요한 요소 중의 하나이다.
(5) 30% 고 콜레스테롤에 의해 증가 되는 혈관 세포분자의 mRNA 발현 및 억 제능 측정
30% 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 VCAM-1 과 ICAM-1 의 mRNA 발현에 대해 추출물인 A11의 영향을 측정하였다. mRNA의 유전자 전사 농도를 측정하기 위해, ApoE -/- 마우스에 A11를 10, 20mg/kg/day 양으로 주 3회 총 16주를 경구 투여한 다음 마우스의 대동맥(aorta) 에서 RNA를 추출하고 VCAM-1 과 ICAM-1의 primer를 사용하여 Real-time PCR(real time-polymerase chain reaction)을 수행하였다.
각 마우스 군의 대동맥 조직은 Homogenizer 분쇄를 하고, 단일단계 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 방법으로 RNA를 추출하였고, RNA의 수율과 순도는 260nm 내지 280nm 에서 흡광도 비율로 측정하였다. PCR은 각각의 특이적인 cDNA를 식별하기 위하여 하기와 같은 VCAM-1 과 ICAM-1 의 primer를 사용하였다.
다음과 같이 VCAM-1 primer를 합성하였다.
Forward primer: 5’- CTC AGG TGG CTG CAC AAG TT-3’
Reverse primer: 5’- AGA GCT CAA CAC AAG CGT GG-3’
또한, 다음과 같이 ICAM-1 primer를 합성하였다.
Forward primer: 5’- GTG GGT CGA AGG TGG TTC TT-3’
Reverse primer: 5’- GCA GTT CCA GGG TCT GGT TT-3’
그 결과, 양성 대조군인 pravastatin (5mg/kg) 의 경우, 증가된 VCAM-1 과 ICAM-1 의 mRNA 발현 양이 유의성이 있게 감소되었으며, A11 군의 경우, 10, 20 mg/kg 군 모두 VCAM-1 과 ICAM-1의 mRNA 발현이 유의성 있게 억제시켰다 (도 3 참조).
(6) 30% 고 콜레스테롤에 의해 증가 되는 화학 주성인자의 mRNA 발현 및 억제능 측정
30% 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 CCL2와 CCL5의 mRNA 발현에 대해 추출물인 A11의 영향을 측정하였다. mRNA의 유전자 전사 농도를 측정하기 위해, ApoE -/- 마우스에 A11를 10, 20mg/kg/day 양으로 주 3회 총 16주를 경구 투여한 다음 마우스의 대동맥(aorta) 에서 RNA를 추출하고 CCL2와 CCL5의 primer를 사용하여 Real-time PCR(real time-polymerase chain reaction)을 수행하였다.
각 마우스 군의 대동맥 조직은 Homogenizer로 분쇄를 하고, 단일단계 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 방법으로 RNA 를 추출하였고, RNA 의 수율과 순도는 260nm 내지 280nm 에서 흡광도 비율로 측정하였다. PCR은 각각의 특이적인 cDNA를 식별하기 위하여 하기와 같은 CCL2와 CCL5의 특정 primer를 사용하였다.
다음과 같이 CCL2 primer를 합성하였다.
Forward primer: 5’- AGG TCC CTG TCA TGC TTC TGG-3’
Reverse primer: 5’- CTG CTG CTG GTG ATC CTC TTG-3’
또한, 다음과 같이 CCL5 primer를 합성하였다.
Forward primer: 5’- AGA TCT CTG CAG CTG CCC TCA-3’
Reverse primer: 5’- GGA GCA CTT GCT GCT GGT GTA G-3’
그 결과, 양성 대조군인 pravastatin 의 경우, 증가된 CCL2 과 CCL5 의 mRNA 발현 양이 유의성이 있게 감소되었고, A11 군의 경우, 10, 20 mg/kg 군 모두 화학 주성인자인 CCL2 과 CCL5의 mRNA 발현을 유의성 있게 억제시켰다 (도 4 참조).
(7) 간 조직 내에서 30% 고 콜레스테롤에 의해 증가 되는 지방 합성 인자의 mRNA 발현 및 억제능 측정
간 조직 내에서 30% 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A), SREBP-2 (Sterol Regulatory Element-Binding Protein-2), LXR (liver X receptor) 와 LOX-1 (lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1)의 mRNA 발현에 대해 추출물인 A11의 영향을 측정하였다. mRNA의 유전자 전사 농도를 측정하기 위해, ApoE -/- 마우스에 A11를 10, 20mg/kg/day 양으로 주 3회 총 16주를 경구 투여한 다음 마우스의 간(liver) 조직에서 RNA를 추출하고 HMG-CoA, SREBP-2, LXR의 primer를 사용하여 Real-time PCR(real time-polymerase chain reaction)을 수행 하였다. 또한 마우스의 대동맥(aorta)에서 RNA를 추출하고 LOX-1의 primer를 사용하여 Real-time PCR(real time-polymerase chain reaction)을 수행 하였다.
각 마우스 군의 간 조직은 cell strainer를 이용하여 분쇄를 하고, 단일단계 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 방법으로 RNA를 추출하였고, 대동맥 조직은 Homogenizer 분쇄를 하고, 단일 단계 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 방법으로 RNA를 추출하였다. 각각의 RNA의 수율과 순도는 260nm 내지 280nm 에서 흡광도 비율로 측정하였다. PCR은 각각의 특이적인 cDNA를 식별하기 위하여 하기와 같은 HMG-CoA, SREBP-2, LXR, LOX-1의 특정 primer를 사용 하였다.
다음과 같이 HMG-CoA primer를 합성하였다.
Forward primer: 5’- GTG GCA GAA AGA GGG AAA GG -3’
Reverse primer: 5’- CGC CTT TGT TTT CTG GTT GA -3’
다음과 같이 SREBP-2 primer를 합성하였다.
Forward primer: 5’- GGC CTC TCC TTT AAC CCC TT-3’
Reverse primer: 5’- CAC CAT TTA CCA GCC ACA GG-3’
다음과 같이 LXR primer를 합성하였다.
Forward primer: 5’- TCC TAC ACG AGG ATC AAG CG -3’
Reverse primer: 5’- AGT CGC AAT GCA AAG ACC TG -3’
다음과 같이 LOX-1 primer를 합성하였다.
Forward primer: 5’- CAA GAT GAA GCC TGC GAA TGA -3’
Reverse primer: 5’- ACC TGG CGT AAT TGT GTC CAC -3’
그 결과, 양성 대조군인 pravastatin (5mg/kg)의 경우, 증가 된 HMG-CoA, SREBP-2, LXR, LOX-1 의 mRNA 발현 양을 유의성이 있게 감소시킨 반면, A11 10mg/kg 군의 경우, HMG-CoA mRNA 발현을 억제시키지 않았으나, SREBP-2와 LXR 그리고 LOX-1 mRNA 발현은 유의성 있게 감소시켰고, 투여량을 늘린 A11 20 mg/kg 군에서 HMG-CoA, SREBP-2, LXR, LOX-1 의 mRNA 발현 모두 억제되었다. 따라서 A11이 동맥경화와 간기능 개선에 효과가 있음을 알 수 있다. (도 5 참조)
결론적으로 지질 측정 실험, 고 콜레스테롤에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 TNF-α과 IL-6의 분비능 측정실험, 혈관 세포분자인 ICAM-1과 VCAM-1의 mRNA 발현 측정 실험뿐만 아니라, 화학 주성인자인 CCL2와 CCL5의 mRNA 발현 억제능 측정 실험과 지방 합성 인자인 HMG-CoA, SREBP-2, LXR, LOX-1의 mRNA 발현 억제능 측정 실험을 통하여, 본 발명의 시료가 TNF-α에 의해 유도되는 세포부착분자의 발현을 억제시킴으로써, 동맥경화증과 염증성 만성질환, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 혈전증 등의 예방 및 치료, 간기능 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
실험예 3: 경구투여 독성시험
A11 추출물 및 분획물에 대한 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 5주령의 마우스와 10일령의 닭 그리고 10~15cm 크기의 양식 어류를 대상으로 독성 실험을 실시하였다. A11 추출물 및 분획물을 5 g/kg의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상 증상, 체중 변화를 1주일 이상 관찰하였다.
실험 결과, 실험물질을 투여한 모든 동물(마우스, 닭, 양식 어류)에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다. 그 결과, 마우스, 닭, 양식 어류에서 5 g/kg까지 독성 변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소 치사량(LD50)은 5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.
본 발명의 추출물 및 분획물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
A11 ----------------------------------------- 300 mg
유당수화물 ---------------------------------- 100 mg
탤크 ----------------------------------------- 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
A11-EA -------------------------------------- 300 mg
옥수수전분 ---------------------------------- 100 mg
유당수화물 ---------------------------------- 100 mg
스테아르산 마그네슘 --------------------------- 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
A11 ----------------------------------------- 300 mg
미결정셀룰로오스 ------------------------------ 3 mg
유당수화물 --------------------------------- 14.8 mg
스테아르산 마그네슘 ------------------------- 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
A11-EA -------------------------------------- 300 mg
디-만니톨 ----------------------------------- 180 mg
주사용 멸균 증류수 ------------------------- 2974 mg
Na2HPO412H2O ---------------------------------- 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
A11 ----------------------------------------- 300 mg
이성화당 -------------------------------------- 10 g
디-만니톨 -------------------------------------- 5 g
정제수 ---------------------------------------- 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
A11 ---------------------------------------- 1000 ㎎
비타민 혼합물 --------------------------------- 적량
비타민 A 아세테이트 -------------------------- 70 ㎍
비타민 E ------------------------------------ 1.0 ㎎
비타민 B1 ----------------------------------- 0.13 ㎎
비타민B2 ------------------------------------ 0.15 ㎎
비타민B6 ------------------------------------- 0.5 ㎎
비타민B12 ------------------------------------ 0.2 ㎍
비타민 C ------------------------------------ 10 ㎎
비오틴 -------------------------------------- 10 ㎍
니코틴산아미드 ----------------------------- 1.7 ㎎
엽산 ---------------------------------------- 50 ㎍
판토텐산 칼슘 ------------------------------ 0.5 ㎎
무기질 혼합물 -------------------------------- 적량
황산제1철 --------------------------------- 1.75 ㎎
산화아연 ---------------------------------- 0.82 ㎎
탄산마그네슘 ------------------------------ 25.3 ㎎
제1인산칼륨 --------------------------------- 15 ㎎
제2인산칼슘 --------------------------------- 55 ㎎
구연산칼륨 ---------------------------------- 90 ㎎
탄산칼슘 ----------------------------------- 100 ㎎
염화마그네슘 ------------------------------ 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
A11-EA -------------------------------------- 300 ㎎
비타민 C -------------------------------------- 15 g
비타민 E(분말) ------------------------------- 100 g
젖산철 ------------------------------------- 19.75 g
산화아연 ------------------------------------- 3.5 g
니코틴산아미드 ------------------------------- 3.5 g
비타민 A ------------------------------------- 0.2 g
비타민 B1 ------------------------------------ 0.25 g
비타민 B2 ------------------------------------- 0.3 g
물 --------------------------------------------- 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동 안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (10)

  1. 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서
    상기 추출물은 아까시나무의 줄기, 엽 또는 뿌리의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제 2항에 있어서
    상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
  4. 제 2항에 있어서
    상기 비극성용매 가용 추출 분획물은 제 3항의 조추출물로부터 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물만을 정제한 비극성 용매에 가용한 추출 분획물임을 특징으로 하는 약학조성물.
  5. 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포부착분자인 ICAM-1 또는 VCAM-1의 발현 억제제.
  6. 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화학 주성인자인 CCL2와 CCL5의 발현 억제제.
  7. 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  8. 제 7항에 있어서
    상기 건강기능식품은 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강기능성 식품류 형태인 건강기능식품.
  9. 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 및 개선용 건강보조식품.
  10. 아까시나무 (Robinia pseudoacacia) 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 혈관성치매, 간질환, 이상지질혈증 또는 혈전증의 예방 및 개선용 식품첨가물.
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