KR20160081940A - 이종 각막 이식재의 제조방법 - Google Patents

이종 각막 이식재의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이종 각막 이식재의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 제조 전체 과정에서, 이종 각막 이식편의 투명성, 비세포 및 비바이러스적 특성을 달성하고자 다른 농도의 글리세롤이 이용되었고; 퇴화에 대한 저항성 및 콜라겐의 면역성은 콜라겐의 가교에 의해 더욱 감소될 수 있으며; 상기 안구 전체가 유지되는 조건 하에서, 가교제인 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (N-hydroxy sulfosuccinimide, NHS)가 가교를 위해 이용되었는바, 본래의 각막과 유사한 각막 이식재를 형성할 수 있게 하였고, 생물 기계학적 특성을 향상시킬 수 있었다. 상기 방법은 높은 투명도, 낮은 면역원성 및 우수한 생물학적 활성 및 생체 적합성을 가지는 이종 각막 이식재를 제조할 수 있고, 본래의 각막과 유사한 콜라겐의 3차원적 구조를 유지할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 각막 이식재는 각막 콜라겐 섬유 구조의 유지 및 이식 후의 투명도를 향상시킬 수 있고, 이는 의약 분야에서 널리 이용될 수 있을 것이다.

Description

이종 각막 이식재의 제조방법 {Method for preparing heterogenous corneal material}
본 발명은 의약 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 층판각막이식술 (Lamellar keratoplasty)에 직접적으로 적용될 수 있는 이종 이식재의 제조방법에 관한 것이다.
각막 (Cornea)은 안구 벽의 앞쪽에 위치하는 투명한 막으로써, 섬유 벽 앞쪽의 약 1/6을 차지한다. 각막은 뒤쪽을 보는 경우 원형, 앞쪽을 보는 경우 납작한 타원형을 이룬다. 각막은 안구의 가장 앞쪽에 위치하는 투명한 부분으로, 홍채, 동공, 및 전 안방을 덮는다. 이는 안구에 대한 대부분의 굴절력을 제공하며, 수정체의 굴절력과 함께 망막 위에 빛의 정확한 초점이 맺히도록 한다.
한편, 각막 투명성의 상실에 따른 각막 실명 (corneal blindness)은 시력 상실의 주요한 원인이며, 시력 상실의 두 번째 원인으로 백내장 (cataract)을 꼽고 있다. 안구 창상 및 각막 궤양은 매년 1.5 내지 2 백만의 환자를 실명에 이르게 한다. 이러한 종류의 실명에 효과적인 유일한 치료법으로는 각막이식술 (human corneal transplantation, keratoplasty 라고도 명명함.)이 있다.
현재, 임상에서는 각막 이식재의 공급과 수요간 큰 차이를 보이고 있다. 동종 이계 (allogenic)의 각막이 매우 부족하고, 단기간 내 이러한 상황을 변화시키기 어려운 환경 하에서, 연구자들은 각막 부족의 문제를 해결하기 위하여 대안적인 새로운 이식재를 개발하는데 다각적인 노력을 하고 있다.
보고되거나 입증된 새로운 이식재로는 주로 생물학적 이식재 및 이종 각막 이식재가 있다. 종래의 보고에 따르면, 생물학적 이식재는 불만족스런 조직 적합성을 가지므로 대규모 조건에서는 이용될 수 없다. 이와 비교하여, 이종 각막 이식재는 보다 넒은 응용 가능성을 가지고 있다. 현재 기술은 단백질 분해 효소 (trypsin) 또는 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2) 및 다른 화학적 수단을 이용하여 이종 각막에서 세포를 제거하는 것에 주력하고 있다.
이러한 효소들은 콜라겐 구조에도 영향을 미치고, 이에 따라, 이식 후 각막 세포의 성장을 어느 정도로 저해시킨다는 점이 문제시된다. 또한, 종래의 문헌은 이식 후 초기 단계에서 이식편의 불투명화가 이종 각막 이식재의 주요한 문제임을 밝힌 바 있다. 따라서, 상기의 구체적인 치료방법 및 제조방법을 최적화시킬 수 있는 여지가 여전히 존재한다.
이에, 종전 기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명의 목적은 매우 높은 투명성, 낮은 면역원성, 우수한 생물학적 활성, 및 우수한 생체 적합성을 가지는 이종 각막 이식재를 제조할 수 있는, 이종 각막 이식재의 제조방법을 제공하는 것이다. 상기 방법에 따른 이종 각막 이식재는 본래의 각막과 유사한 콜라겐 3차원적 구조를 가지고 있으며, 나아가 면역원성 및 콜라겐 가교에 의한 콜라겐의 퇴화를 감소시킬 수 있다.
이에, 본 발명은 하기의 연속적인 단계를 포함하는, 기술적 해결 방안을 제공한다.
단계 Ⅰ. 준비 (Preparation): 죽은 후 4시간 이내의 동물로부터 수득한 안구가 이종 각막 이식재로 이용될 수 있다. 상기 안구 전체는 2% 포비돈요드 및 0.9% saline 용액으로 순차적으로 세척될 수 있다. 이후, 안구 주변의 근막이 제거될 수 있으며, 상기 안구 전체는 다시 2% 포비돈요드 및 0.9% saline 용액으로 순차적으로 세척될 수 있다.
단계 Ⅱ. 멸균 (Sterilization): 상기 안구 전체는 40mg의 토브라마이신 (tobramycine)을 함유하는 10ml 50% 고-글루코스 용액에 적어도 20분 동안 침지될 수 있으며, 이후, 0.9% saline으로 세척될 수 있다.
단계 Ⅲ. 세포 불활성화 (Cell inactivation): 상기 안구 전체는 밀봉된 보존을 위하여, 보존 과정 동안 2 내지 3℃/min의 온도 하강률로 점진적으로 냉각시키면서, 85% 내지 95%의 글리세롤 및 5% 내지 15%의 완충 용액을 함유하는, 용액에 침지될 수 있고, 최종적으로 -78℃에서 적어도 4주의 장기간 동안 보존될 수 있다.
단계 Ⅳ. 바이러스 불활성화 (Virus inactivation): 상기 밀봉 보존된 안구 전체는 -20℃의 일정한 온도의 용기에 옮겨질 수 있고, 25kGy 조사 선량의 감마선이 조사될 수 있다.
단계 Ⅴ. 가교 (Crosslinking): 상기 조사 후 안구 전체는 20% 내지 80%의 글리세롤을 함유하는 가교제 용액으로 옮겨질 수 있고, 4℃의 온도에서 1 내지 72시간 보존될 수 있다. 상기 가교제 용액은 1:1 내지 3:1의 질량비인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (N-hydroxy sulfosuccinimide, NHS)일 수 있으며, 상기 용액 내 EDC의 최종 농도가 1.0% 내지 10.0%일 수 있다.
단계 Ⅵ. 이식편 준비 (Graft preparation): 상기 가교 후 안구 전체는 밖으로 꺼내질 수 있으며, 링거 (Ringer's) 용액으로 각각 5 분씩 두 번 세척될 수 있다. 이후, 상기 안구 전체의 뒤편에서 절개 라인에 따라 상기 안구의 각막윤부로부터 2mm 떨어진 부위를 절개하여 각막 시트를 수득할 수 있고, 이후, 상기 각막 시트를 층판 각막 커터 (lamellar corneal cutter)에 위치시켜 200 내지 550μm의 두께로 각막을 절개할 수 있다.
본 발명에 따른 이종 각막 이식재의 제조방법은 4 가지의 특별한 특성을 가진다.
첫 번째 특성은 보존 과정에서 안구 전체의 이용에 관한 것으로, 하기와 같은 장점을 가진다: (1) 단계 Ⅲ에서, 상기 안구 전체의 보존은 각막 콜라겐 섬유의 3차원적 구조와 본래 각막의 고유의 형태가 효과적으로 유지될 수 있고, 각막의 글리세롤 탈수과정이 보다 온화하고, 느리고, 고르게 진행되어 콜라겐 섬유의 3차원적 구조는 빠른 붕괴 및 강한 탈수로부터 보호된다. (2) 단계 Ⅴ, 즉, 상기 안구 전체 가교 단계에서, 상기 안구는 어떠한 농도의 글리세롤 내 보존 동안 탈수되지 않으며, 본래의 각막과 매우 유사한 각막 콜라겐 섬유의 배열 및 구조를 가진, 본래의 형태, 두께, 및 각막의 곡률이 효과적으로 유지된다. 이러한 상태에서 안구 전체의 가교는 그 강도 및 속도를 효과적으로 조절할 수 있게 한다. 각막 형태와 가장 가까운 조건 하에서 느리고 고른 가교가 가능하게 된다. 따라서, 각막 형태 및 콜라겐 섬유의 입체구조는 효과적으로 보존될 수 있다. 이러한 이유로, 상기 안구 전체 보존 단계는 본래의 각막과 유사한 콜라겐 섬유의 입체구조 및 각막 형태를 제공할 수 있고, 그 결과, 보다 투명한 각막 층판 (Cornea lamellar) 이식재를 제공할 수 있다.
두 번째 특성은 보존, 조사, 및 가교 과정에서 글리세롤의 이용에 관한 것이다. 높은 농도의 글리세롤 (85% 내지 95% 농도, 나머지 5% 내지 15%는 완충 용액)은 단계 Ⅲ에서 사용될 수 있으며, 하기와 같은 장점을 가진다: (1) 우선, 글리세롤 자체는 동결방지제로서, 동결 및 해동 과정에서 아이스 결정에 의해 야기되는 손상으로부터 세포 및 조직을 보호할 수 있고, 각막 콜라겐 섬유에 대한 동결 및 해동의 영향을 효과적으로 방지할 수 있다. 아울러, 글리세롤은 비-세포독성, 적은 분자량, 수 용해성을 가지며, 쉽게 용출된다: (2) 글리세롤은 흡수력이 강력하므로 각막 콜라겐을 효과적으로 탈수시킬 수 있다. 콜라겐 보존을 위한 최선의 방법은 탈수이다. 전통적인 동결-건조 과정과 비교하여, 고-농도 글리세롤은 유사한 탈수 효과를 가진다. 이는 각막 콜라겐의 형태, 각막 상피세포, 간질세포, 및 내피세포의 불활성화, 세포에 의해 촉진되는 면역 반응의 감소를 효과적으로 유지시킬 수 있다. 그 결과, 상기 이유와 같이, 탈수 효과 가지는 글리세롤을 이용한 본 발명의 방법은 동결-건조 방법을 뛰어 넘는 이점을 갖는다; (3) 글리세롤은 또한 항균 및 바이러스 불활성화 효과를 가진다. 글리세롤의 바이러스 불활성화 효과는 보존 기간 및 글리세롤의 농도와 포지티브 관계에 놓여 있다고 보고된 바 있다. 85% 글리세롤에서 2주간 보존은 동물 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 >85% 글리세롤에서 4주 이상의 보존은 바이러스를 효과적으로 불활성화시킬 수 있고, 이에 따라, 상기 이종 각막 이식재는 보다 안전해 질 수 있다. (4) 글리세롤은 콜라겐 섬유를 보호할 수 있다. 감마선은 콜라겐 섬유에 심각한 손상을 일으킬 수 있고, 콜라겐 섬유의 입체구조를 변화시킬 수 있다고 알려져 있다. 비록 25KGy 감마선은 효과적으로 세균과 바이러스를 불활성화시킬 수 있으나, 일반적으로 알려진 바와 같이, 감마선 조사의 이러한 강도는 각막 콜라겐 섬유에 심각한 손상을 초래할 수 있다. 보존을 위해 글리세롤이 사용된 본 발명은, 높은-강도 감마선에 따른 각막 콜라겐 섬유의 손상을 방지할 수 있고, 동일한 시점에서, 상기 각막 이식재를 보다 투명하게 유지할 수 있다; (5) 물을 흡수하는 배지 농도에 대한 글리세롤의 용도는 가교 과정 동안 각막 콜라겐의 팽창을 효과적으로 방지할 수 있다. 팽창은 각막 콜라겐 섬유의 직경과 이들간 간격의 증가를 야기할 수 있고, 이는 각막의 불투명화로 이어질 수 있다. 이는 각막의 투명성은 섬유들 사이의 콜라겐 섬유 직경과 간격과 높은 연관이 있기때문이다. 팽창의 심화는 콜라겐 섬유들간 결합을 쉽게 끊어지게 한다. 각막 부종은 회복이 어렵다. 적당한 농도의 글리세롤은 효과적으로 팽창을 제한시킬 수 있고, 각막의 일정한 두께를 유지시킬 수 있다. 이는 콜라겐 섬유가 가교 과정의 섬유들간 간격에서, 본래 각막의 간격과 유사한 상태로 유지될 수 있도록 하고, 콜라겐의 3차원적 구조를 효과적으로 보호할 수 있도록 한다. 그 결과, 이식 후 부종은 지속기간이 감소될뿐만 아니라, 그 증상이 완화되며, 따라서, 각막 이식재는 보다 투명해진다.
세 번째 특성은 선택된 가교제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (NHS)에 관한 것이다. 이들은 각막 콜라겐 섬유들간 및 이들 내부의 가교를 느리게 한다. 또한, 이러한 가교제는 본래부터 매우 온화하다. 콜라겐 가교 반응의 산물로서, 잔존하는 수-용해성 아이소우레아 (isourea)는 쉽게 용출된다. 아울러, 상기 안구 전체 가교는 보다 온화한 가교 과정이 진행되도록 하고, 각막 콜라겐 섬유 기질 및 각막 콜라겐 섬유 자체에 대한 가교제의 침투를 늦추어, 조직의 고르고 완전한 가교를 가능하게 한다.
네 번째 특성은 종전 기술과 비교한 것으로서, 본 발명의 방법은 상대적으로 간단하고, 저 비용이며, 쉽게 조작 가능하고, 산업상 적용이 용이하다.
본 발명에 따른 각막 이식재의 제조방법에 의하여, 상기 각막 콜라겐 섬유 구조가 유지될 수 있으며, 이식 후, 각막 이식재의 투명도가 현저하게 증진될 수 있다. 따라서, 이러한 본 발명의 방법으로 제조된 각막 이식재는 의약 분야에 널리 이용될 수 있다.
본 실시예는 예시적 목적을 위하여 이하 상세하게 서술되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(1) 준비: 죽은 지 2시간 이내의 돼지로부터 안구를 수득하였다. 상기 안구 전체는 2% 포비돈요드 및 0.9% saline 용액으로 순차적으로 세척되었다. 이후, 안구 주변의 근막이 제거되었고, 상기 안구 전체는 다시 2% 포비돈요드 및 0.9% saline으로 순차적으로 세척되었다.
(2) 멸균: 상기 안구 전체는 40mg의 토브라마이신을 함유하는 10ml 50% 고-글루코스 용액에 적어도 20분 동안 침지되었고, 이후 0.9% saline에 세척되었다.
(3) 세포 불활성화: 상기 안구 전체는, 밀봉된 보존을 위하여 보존 용액을 함유하는 용기 내로 침지되었고, 점진적으로 2 내지 3℃/min의 온도 하강률로 냉각시키고, 최종적으로 -78℃에서 8주 동안 장기간 보존하였다. 상기 보존 용액은 95% 멸균 글리세롤 및 5% 완충 용액을 함유하였으며, 상기 완충 용액은 인산염 완충 용액이었다.
(4) 바이러스 불활성화: 밀봉 보존된 상기 안구 전체는 -20℃의 일정한 온도의 용기에 옮겨졌고, 25kGy 조사 선량의 감마선이 조사되었다.
(5) 가교: 상기 보존 용액을 해동시킨 후, 상기 안구는 80% 글리세롤을 함유하는 가교제 용액에 옮겨졌고, 4℃의 온도에서 48시간 보존되었다. 상기 가교제 용액은 3:1의 질량비인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (NHS)로 이루어지고, 상기 가교제 용액 내 EDC의 최종농도는 10.0%였다 (여기서, 가교제는 내부 또는 외부 가교제일 수 있다는 점이 중요하다. 다양한 형태의 가교제가 존재하고, 본 실험에서는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (NHS)를 글리세롤과 조합하여 각막 이식재를 제조한 경우, 최적의 효과를 보여주었다).
(6) 이식편 준비: 상기 가교 후 안구 전체는 밖으로 꺼내어졌으며, 링거 용액으로 각각 5 분씩 두 번 세척되었다. 이후, 각막 시트를 수득하기 위하여 상기 안구 전체의 뒤편에서 절개 라인에 따라 상기 안구의 각막윤부로부터 2mm 떨어진 부위가 절개되었다. 상기 각막 시트를 층판 각막 커터 (lamellar corneal cutter)에 위치시켜 200μm의 두께로 각막을 절개하였다. 상기 이식편은 rabbit의 각막이식술을 위해 사용되었다.
(7) 동물의 준비 : 2.5 내지 3.0kg의 New zealand White Rabbit이 본 실험을 위해 선택되었다. 3% 펜토바비탈나트륨 (sodium pentobarbital) (1ml/kg i.e., 30mg/kg) 및 Sumianxin Ⅱ (0.25ml/kg)으로 마취를 실시하였다.
(8) 층판각막이식술 (Lamellar keratoplasty) : 각막 두께의 약 2/3 깊이에 존재하는 라멜라 시트를 제거하기 위하여 7.5mm 각막 관상톱이 이용되었다. 7.75mm 각막 관상톱은 상기 이종 각막 이식편의 제조를 위하여 사용되었다. 상기 이종 각막 이식편은 병렬 봉합에 의해 수여자의 각막 면에 이식되었다. 각막 이식편의 투명도 및 거부 반응의 존재 여부는 수술 후 1일, 1주, 8주, 6달째 관찰되었다.
실시예 2
(1) 준비: 죽은 지 2시간 이내의 돼지로부터 안구를 수득하였다. 상기 안구 전체는 2% 포비돈요드 및 0.9% saline 용액으로 순차적으로 세척되었다. 이후, 안구 주변의 근막이 제거되었고, 상기 안구 전체는 다시 2% 포비돈요드 및 0.9% saline으로 순차적으로 세척되었다.
(2) 멸균: 상기 안구 전체는 40mg의 토브라마이신을 포함하는 10ml 50% 고-글루코스 용액에 적어도 20분 동안 침지되었고, 이후 0.9% saline에 세척되었다.
(3) 세포 불활성화: 상기 안구 전체는, 밀봉된 보존을 위하여 글리세롤 용액을 함유하는 용기 내로 침지되었고, 점진적으로 2 내지 3℃/min의 온도 하강률로 냉각시키고, 최종적으로 -78℃에서 10주 동안 장기간 보존하였다. 상기 보존 용액은 90% 멸균 글리세롤 및 10% 완충 용액을 함유하였으며, 상기 완충 용액은 인산염 완충 용액이었다.
(4) 바이러스 불활성화: 밀봉 보존된 상기 안구 전체는 -20℃의 일정한 온도의 용기에 옮겨졌고, 25kGy 조사 선량의 감마선이 조사되었다.
(5) 가교: 상기 보존 용액을 해동시킨 후, 상기 안구는 50% 글리세롤을 함유하는 가교제 용액에 옮겨졌고, 4℃의 온도에서 48시간 보존되었다. 상기 가교제 용액은 2:1의 질량비인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (NHS)로 이루어지고, 상기 가교제 용액 내 EDC의 최종농도는 10.0%였다 (여기서, 가교제는 내부 또는 외부 가교제일 수 있다는 점이 중요하다. 다양한 형태의 가교제가 존재하고, 본 실험에서는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (NHS)를 글리세롤과 조합하여 각막 이식재를 제조한 경우, 최적의 효과를 보여주었다).
(6) 이식편 준비: 상기 가교 후 안구 전체는 밖으로 꺼내어졌으며, 링거 용액으로 각각 5 분씩 두 번 세척되었다. 이후, 각막 시트를 수득하기 위하여 상기 안구 전체의 뒤편에서 절개 라인에 따라 상기 안구의 각막윤부로부터 2mm 떨어진 부위가 절개되었다. 상기 각막 시트를 층판 각막 커터 (lamellar corneal cutter)에 위치시켜 200μm의 두께로 각막을 절개하였다. 상기 이식편은 rabbit의 각막이식술을 위해 사용되었다.
(7) 동물의 준비 : 2.5 내지 3.0kg의 New zealand White Rabbit이 본 실험을 위해 선택되었다. 3% 펜토바비탈나트륨 (sodium pentobarbital) (1ml/kg i.e., 30mg/kg) 및 Sumianxin Ⅱ (0.25ml/kg)으로 마취를 실시하였다.
(8) 층판각막이식술 (Lamellar keratoplasty) : 각막 두께의 약 7/12 깊이에 존재하는 라멜라 시트를 제거하기 위하여 7.75mm 각막 관상톱이 이용되었다. 8.00mm 각막 관상톱은 상기 이종 각막 이식편의 제조를 위하여 사용되었다. 상기 이종 각막 이식편은 병렬 봉합에 의해 수여자의 각막 면에 이식되었다. 각막 이식편의 투명도 및 거부 반응의 존재 여부는 수술 후 1일, 1주, 8주, 6달째 관찰되었다.
실시예 3
(1) 준비: 죽은 지 2시간 이내의 돼지로부터 안구를 수득하였다. 상기 안구 전체는 2% 포비돈요드 및 0.9% saline 용액으로 순차적으로 세척되었다. 이후, 안구 주변의 근막이 제거되었고, 상기 안구 전체는 다시 2% 포비돈요드 및 0.9% saline으로 순차적으로 세척되었다.
(2) 멸균: 상기 안구 전체는 40mg의 토브라마이신을 함유하는 10ml 50% 고-글루코스 용액에 적어도 20분 동안 침지되었고, 이후 0.9% saline에 세척되었다.
(3) 세포 불활성화: 상기 안구 전체는, 밀봉된 보존을 위하여 글리세롤 용액을 함유하는 용기 내로 침지되었고, 점진적으로 2 내지 3℃/min의 온도 하강률로 냉각시키고, 최종적으로 -78℃에서 12주 동안 장기간 보존하였다. 상기 보존 용액은 85% 멸균 글리세롤 및 15% 완충 용액을 함유하였으며, 상기 완충 용액은 saline 용액이었다.
(4) 바이러스 불활성화: 밀봉 보존된 상기 안구 전체는 -20℃의 일정한 온도의 용기에 옮겨졌고, 25kGy 조사 선량의 감마선이 조사되었다.
(5) 가교: 상기 보존 용액을 해동시킨 후, 상기 안구는 20% 글리세롤을 함유하는 가교제 용액에 옮겨졌고, 4℃의 온도에서 48시간 보존되었다. 상기 가교제 용액은 1:1의 질량비인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (NHS)로 이루어지고, 상기 가교제 용액 내 EDC의 최종농도는 1.0%였다
(6) 이식편 준비: 상기 가교 후 안구 전체는 밖으로 꺼내어졌으며, 링거 용액으로 각각 5 분씩 두 번 세척되었다. 이후, 각막 시트를 수득하기 위하여 상기 안구 전체의 뒤편에서 절개 라인에 따라 상기 안구의 각막윤부로부터 2mm 떨어진 부위가 절개되었다. 상기 각막 시트를 층판 각막 커터 (lamellar corneal cutter)에 위치시켜 150μm의 두께로 각막을 절개하였다. 상기 이식편은 rabbit의 각막이식술을 위해 사용되었다.
(7) 동물의 준비: 2.5 내지 3.0kg의 New zealand White Rabbit이 본 실험을 위해 선택되었다. 3% 펜토바비탈나트륨 (sodium pentobarbital) (1ml/kg i.e., 30mg/kg) 및 Sumianxin Ⅱ (0.25ml/kg)으로 마취를 실시하였다.
(8) 층판각막이식술 (Lamellar keratoplasty): 12시 방향으로 각막 두께의 약 1/2 깊이에 각막의 intralamellar dialysis를 실시하기 위하여 10.0mm 각막 관상톱이 이용되었다. 5.5mm-사이즈 이종 각막 이식편은 층 사이에 삽입되었다. 각막 이식편의 투명도 및 거부 반응의 존재 여부는 수술 후 1일, 1주, 8주, 6달째 관찰되었다.

Claims (5)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 이종 각막 이식재 (heterogenous corneal material)의 제조 방법:
    (1) 세포의 불활성화: 죽은 동물로부터 이종 각막 이식재로 사용될 수 있는 안구를 수득하고, 밀봉 상태에서 상기 안구 전체를 85% 내지 95%의 글리세롤, 5% 내지 15%의 완충 용액을 함유하는 용액에 침지하고, 점진적으로 상기 안구가 침지된 용액을 2 내지 3℃/min의 온도 하강률로 냉각하며, 최종적으로 -78℃에서 안구를 적어도 4주간 보존함;
    (2) 바이러스의 불활성화: 상기 단계 (1)의 밀봉 상태에서 보존된 안구 전체를 -20℃의 일정한 온도의 용기에 옮기고, 상기 안구 전체를 포함하는 용기에 25kGy 조사 선량의 감마선을 조사함;
    (3) 가교 (Crosslinking): 상기 단계 (2)의 안구 전체를 20% 내지 80%의 글리세롤을 함유하는 가교제 용액에 옮기고, 이를 4℃의 온도에서 1 내지 72시간 보존함; 및
    (4) 이식편의 제조: 상기 단계 (3)의 안구 전체 뒤편에서 절개 라인에 따라 상기 안구의 각막윤부 (Corneal limbus)로부터 2mm 떨어진 위치를 절개하여 각막 시트를 수득하고, 상기 각막 시트를 층판 각막 커터 (lamellar corneal cutter)에 위치시켜 200 내지 550μm의 두께로 각막을 절개함.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가교제 용액은 1:1 내지 3:1의 질량비인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드 (NHS)로 이루어지며, 상기 가교제 용액 내 EDC의 최종 농도가 1.0% 내지 10.0%인, 이종 각막 이식재의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 안구는 동물이 죽은 후, 4시간 이내에 수득된 것이며; 밀봉 상태에서 상기 안구 전체를 용액에 침지하기 전, 상기 안구 전체는 2% 포비돈요드 (povidone-iodine) 및 0.9% saline 용액으로 순차적으로 세척되고, 안구 주변 근막이 제거되며, 상기 안구 전체는 다시 2% 포비돈요드 및 0.9% saline 용액으로 순차적으로 세척되는 것인, 이종 각막 이식재의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    밀봉 상태에서 상기 안구 전체를 용액에 침지하기 전, 상기 안구 전체는 추가적으로 40mg의 토브라마이신 (tobramycin)을 함유하는 50% 고-글루코스 용액에 적어도 20분간 침지시키고, 이후 0.9% saline 용액으로 세척되는 것인, 이종 각막 이식재의 제조방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    뒤편에서 절개 라인에 따라 상기 안구의 각막윤부 (Corneal limbus)로부터 2mm 떨어진 위치를 절개하기 전, 상기 안구 전체는 링거 (Ringer's) 용액으로 각각 5 분씩 두 번 세척되는 것인, 이종 각막 이식재의 제조방법.
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