KR20160079355A

KR20160079355A - 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법

Info

Publication number: KR20160079355A
Application number: KR1020140190606A
Authority: KR
Inventors: 홍주헌; 양수진; 이래현
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2016-07-06
Also published as: KR101696429B1

Abstract

본 발명은 (a) 백미 및 아마란스를 혼합한 혼합곡물에 물을 첨가한 후 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 제조한 혼합물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물 및 상기 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물을 함유하는 가공식품에 관한 것이다.

Description

바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법{Method for producing fermented white rice and amaranth mixture with increased functionality using Bacillus subtilis strain}

최근 소비자들의 건강 증진 인식이 높아지면서 질병 예방 및 건강유지, 나아가 평균 수명의 연장 등에 기여하는 기능성 식품에 대한 관심이 확대되고 있으며, 수요도 증가하고 있다. 이에 따라 기능성 식품을 개발하기 위해 건강 관련 기능성 물질의 탐색, 기능성 소재 및 식품에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.

효소식품은 식품유형상 기타식품류로 곡류 효소 함유 제품, 배아 효소 함유 제품, 과채류 효소 함유 제품 및 기타 식물 효소 함유 제품으로 분류하고 있으며, 식품공전에서 식물성 원료에 식용 미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것이라고 정의하고 있다. 현재까지 효소를 생산하는 수많은 미생물들이 보고되어져 있는데 이러한 미생물 중에서도 특히, 안전성이 확보된 식용가능 미생물 유래의 효소는 중요한 생물자원으로서 다양한 생물 산업에서 활용 가치가 점차 높아지고 있어 주목을 받고 있다.

이 중 바실러스 속 미생물은 아밀라아제를 생산하는 대표적인 세균 중 하나로 현재 많은 산업분야에서 활용되고 있으며 이들 효소에 대한 특성 또한 다양한 연구에서 지속적으로 검토되어져 왔다. 미생물에 의한 아밀라아제는 다른 효소원에 비해 생산이 용이하고 효소의 균일성 및 대량생산 등의 조건이 유리하기 때문에 그 이용도가 높다. 이러한 아밀라아제는 전분을 분해하여 제약, 식품을 비롯하여 섬유산업 분야에서 다양하게 활용되고 있으며, 1984년 이후로 바실러스를 이용하여 아밀라아제가 소화 장애 개선을 위한 목적으로 생산되어 급속한 성장을 보인 산업적으로 중요한 미생물이다.

곡류 효소식품으로 활용가능한 여러 가지 곡물 중 쌀은 주성분이 전분으로 중요한 에너지 공급원인 동시에 밀이나 감자 등과 같은 전분질 식품과 비교할 때 비만과 당뇨병을 예방하는데 효과적이며, 쌀에 함유되어 있는 단백질은 다른 곡류에 비하여 양질의 단백질로서 체내에서 이용률이 높다.

아마란스(Amaranth)는 비름과(Amaranthus spp. L.)에 속하는 일년생 유사 화곡류이고 쌍자옆 식물로 영양성분을 보면 조단백질은 17~18%, 지방은 7~8% 정도로 옥수수나 밀보다 높으며, 섬유소는 비슷하거나 높게 함유하고 있다. 아마란스의 단백질은 특히 화곡류에 부족한 라이신 함량이 단백질 100 g 당 5.2 g으로 옥수수(3.4 g), 밀(3.2 g)에 비해 높으며, 두피 작물에서 부족한 황 함유 아미노산 함량도 단백질 100 g당 4.4 g으로 많이 함유하고 있다. 이와 같이 아마란스는 영양 생리학 측면에서 유용 성분을 함유하고 있어 지질대사에 효과가 있으며 또한 독특한 맛과 영양가치가 높아 국수, 비스킷 등의 식품개발에도 이용되고 있다.

한국등록특허 제1157867호에는 프로바이오틱 곡류발효물의 제조방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0124976호에는 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 9207 균주를 이용한 백미 발효물이 개시되어 있으나, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자는 백미와 아마란스의 소비 촉진과 이용의 극대화 및 기능성이 증진된 혼합 발효물을 제조하기 위해, 백미와 아마란스 혼합비, 균주 선정, 발효조건 등의 제조조건을 최적화하여 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물과 상기 백미 및 아마란스 혼합 발효물을 이용한 가공식품을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 백미 및 아마란스를 혼합한 혼합곡물에 물을 첨가한 후 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 제조한 혼합물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물을 함유하는 가공식품을 제공한다.

본 발명의 방법으로 제조된 백미 및 아마란스 혼합 발효물은 유리당 및 유리아미노산 함량이 높고, 항산화, 항고혈압 및 항당뇨 활성이 우수할 뿐만 아니라 소화 흡수율 및 기호도가 증진되어, 상기 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물을 이용하여 다양한 가공식품을 제조할 경우 소비자들의 영양적 요구 및 기호도에 부합하는 식품을 제공할 수 있다.

도 1은 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 백미 발효물과 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 발효시간에 따른 생균수(A) 및 pH 변화(B)를 나타낸 그래프이다.
R100: 백미 100% 발효물, R90: 백미 90% 및 아마란스 10% 혼합 발효물, R80: 백미 80% 및 아마란스 20% 혼합 발효물, R70: 백미 70% 및 아마란스 30% 혼합 발효물
도 2는 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 백미(R100) 발효물 및 백미와 아마란스(R80) 혼합 발효물과 각각의 발효물의 동결건조분말의 발효시간에 따른 아밀라아제 활성을 측정한 결과이다.
(A): 발효물, (B) 발효물의 동결건조분말
도 3은 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 발효 전(0hr)과 후(48hr)의 백미 발효물의 동결건조분말(A)과 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 동결건조분말(B)의 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 발효 전(0hr)과 후(48hr)의 백미 발효물의 동결건조분말(A)과 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 동결건조분말(B)의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.
도 5는 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 발효 전(0hr)과 후(48hr)의 백미 발효물의 동결건조분말(R100) 및 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 동결건조분말(R80)의 ACE 저해활성(A) 및 α-글루코시다아제 저해활성(B)을 비교한 그래프이다.
도 6은 바실러스 서브틸리스 CBD2 균주를 이용한 곡물 발효물의 발효시간에 따른 생균수 및 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
(A) R100: 백미 100% 발효물, ■: 세포 생장, □: pH
(B) RA10: 백미 90% 및 아마란스 10% 혼합 발효물, RA20: 백미 80% 및 아마란스 20% 혼합 발효물, RA30: 백미 70% 및 아마란스 30% 혼합 발효물, ■,▲,●: 세포 생장, □,△,○: pH
(C) RQ10: 백미 90% 및 퀴노아 10% 혼합 발효물, RQ20: 백미 80% 및 퀴노아 20% 혼합 발효물, RQ30: 백미 70% 및 퀴노아 30% 혼합 발효물, ■,▲,●: 세포 생장, □,△,○: pH
도 7은 바실러스 서브틸리스 CBD2 균주를 이용한 곡물 발효물의 발효시간에 따른 아밀라아제 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
(A) R100: 백미 100% 발효물
(B) RA10: 백미 90% 및 아마란스 10% 혼합 발효물, RA20: 백미 80% 및 아마란스 20% 혼합 발효물, RA30: 백미 70% 및 아마란스 30% 혼합 발효물
(C) RQ10: 백미 90% 및 퀴노아 10% 혼합 발효물, RQ20: 백미 80% 및 퀴노아 20% 혼합 발효물, RQ30: 백미 70% 및 퀴노아 30% 혼합 발효물
도 8은 바실러스 서브틸리스 CBD2 균주를 이용한 발효시간에 따른 곡물 발효물 분말의 락토바실러스 플란타룸(A) 및 락토바실러스 애시도필러스(B)의 균 증식도를 비교한 그래프이다.
control: 멸균수, R100: 백미 100% 발효물의 동결건조분말, RA20: 백미 80% 및 아마란스 20% 혼합 발효물의 동결건조분말, RQ20: 백미 80% 및 퀴노아 20% 혼합 발효물의 동결건조분말
도 9는 바실러스 서브틸리스 CBD2 균주를 이용한 발효 전(Non fermentation)과 후(Fermentation) 곡물 발효물 분말의 α-글루코시다아제 저해활성을 비교한 그래프이다.
R100: 백미 100% 발효물의 동결건조분말, RA20: 백미 80% 및 아마란스 20% 혼합 발효물의 동결건조분말, RQ20: 백미 80% 및 퀴노아 20% 혼합 발효물의 동결건조분말
도 10은 바실러스 서브틸리스 CBD2 균주를 이용한 발효 전(Non fermentation)과 후(Fermentation) 곡물 발효물 분말의 ACE 저해활성을 비교한 그래프이다.
R100: 백미 100% 발효물의 동결건조분말, RA20: 백미 80% 및 아마란스 20% 혼합 발효물의 동결건조분말, RQ20: 백미 80% 및 퀴노아 20% 혼합 발효물의 동결건조분말

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 백미 및 아마란스를 혼합한 혼합곡물에 물을 첨가한 후 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계의 제조한 혼합물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법에서, 상기 (a)단계의 혼합곡물은 바람직하게는 백미 및 아마란스를 7.5~8.5:1.5~2.5 중량비율로 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 백미 및 아마란스를 8:2 중량비율로 혼합할 수 있다. 상기와 같은 비율로 백미 및 아마란스를 혼합하여 발효하는 것이 발효가 더 잘 진행되고, 기능성이 증진될 뿐만 아니라 구수한 맛 및 단맛이 향상되어 기호도가 우수한 발효물로 제조할 수 있었다.

또한, 본 발명의 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법에서, 상기 (b)단계의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주일 수 있는데, 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주 또는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 11월 08일자로 기탁하였다(바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis) CBD2 균주 기탁번호: KACC91904P, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주 기탁번호: KACC91905P).

또한, 본 발명의 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법에서, 상기 기능성의 증진은 항산화, 항고혈압 및 항당뇨 활성의 증진 효과일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법은, 보다 구체적으로는

(a) 백미 및 아마란스를 7.5~8.5:1.5~2.5 중량비율로 혼합한 혼합곡물에 물을 첨가한 후 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계의 제조한 혼합물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종한 후 34~40℃에서 36~80시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 구체적으로는

(a) 백미 및 아마란스를 8:2 중량비율로 혼합한 혼합곡물에 물을 첨가한 후 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계의 제조한 혼합물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종한 후 37℃에서 48~72시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법에서, 상기 (b)단계의 발효조건으로 발효한 발효물은 아밀라아제 활성이 높고, 유리당 및 유리아미노산 함량이 향상될 뿐만 아니라, 다양한 생리활성도 증진되어 품질이 우수한 발효물로 제조할 수 있었다.

본 발명은 또한, 상기 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물을 함유하는 가공식품을 제공한다. 상기 가공식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 혼합 발효물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 떡류, 누룽지, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 가공식품을 모두 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 실험재료

본 실험에 사용된 백미(경상북도 의성군 재배)는 건식분쇄한 다음 표준망체(200 mesh)를 통과한 분말을 사용하였으며, 아마란스(강원도 원주 재배) 및 퀴노아(평창군 재배)는 이물질을 제거하고 분쇄기(J-NCM, Jisico, Korea)로 분쇄하여 표준망체(40 mesh)를 통과한 분말을 사용하였다. 곡물 발효를 위하여 사용된 미생물은 김치로부터 분리 동정한 바실러스 서브틸리스 KMKW4(기탁번호 KACC91905P)와 된장으로부터 분리 동정한 바실러스 서브틸리스 CBD2(기탁번호 KACC91904P)를 이용하였다.

2. 곡물 발효물 제조

(가) 바실러스 서브틸리스 KMKW4를 이용한 곡류 발효물 제조

백미와 아마란스는 백미 100%(R100), 백미 90%에 아마란스 10%(R90), 백미 80%에 아마란스 20%(R80) 및 백미 70%에 아마란스 30%(R70)로 아마란스 혼합 비율을 달리하였으며, 각각 20 g씩 삼각플라스크에 넣고 살균 후 멸균수 40 mL를 가한 다음 진탕하였다. 또한, 백미 및 아마란스 발효에 이용한 바실러스 서브틸리스 KMKW4는 영양 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 스타터액으로 사용하였다. 백미 및 아마란스의 혼합비를 달리한 R100, R90, R80 및 R70에 바실러스 서브틸리스 KMKW4를 이용하여 제조한 스타터액을 2% 접종하였다. 접종 후 37℃ 항온기에서 120시간까지 발효하였으며, 발효물의 배양적 특성은 배양이 진행되는 동안 매 시간마다 측정하였고, 생리활성 분석에 사용된 시료는 발효물을 동결건조한 다음 -72℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

(나) 바실러스 서브틸리스 CBD2를 이용한 곡류 발효물 제조

백미, 아마란스 및 퀴노아는 백미를 100% 사용한 실험구(R100)와 백미 90%에 아마란스 10%를 혼합한 실험구(RA10), 백미 80%에 아마란스 20%를 혼합한 실험구(RA20) 및 백미 70%에 아마란스 30%를 혼합한 실험구(RA30)로 제조하였으며, 퀴노아 또한, 백미와 아마란스 혼합비율과 동일하게 각각 RQ10, RQ20, RQ30을 제조하였다. 실험구는 각각 20 g씩 삼각플라스크에 넣고 멸균 후 40 mL의 멸균수를 가한 다음 진탕하여 사용하였으며, 바실러스 서브틸리스 CBD2는 영양 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 스타터액으로 사용하였다. 곡류별 혼합비율에 따라 혼합한 원료에 미리 배양된 바실러스 서브틸리스 CBD2 스타터액을 2% 접종 후 37℃ 배양기에서 96시간까지 발효하였으며, 발효물의 배양적 특성은 배양이 진행되는 동안 매 시간마다 측정하였다. 배양이 완료된 실험구는 동결건조하였으며, 동결건조분말은 -72℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

3. 생균수 측정

배양시간대 별로 회수한 시료는 1분 동안 균질화시킨 후 일정량을 취하여 실험에 사용하였다. 생균수는 배양액 1 mL에 0.85% NaCl 용액 9 mL를 혼합하여 10배 희석법으로 희석하였고 희석액 100 ㎕를 플레이트 접종하고 1.5% 한천이 첨가된 영양 배지를 이용한 평판측정법으로 생균수를 측정하였다. 각각의 플레이트는 37℃ 배양기에서 24시간 배양 후 형성된 콜로니 수를 계측하고 그 콜로니에 희석배수를 곱하여 시료 mL당 CFU(colony forming unit)로 나타내었다.

4. pH 측정

pH는 pH 미터(CH-8603, Mettler-Toledo Inc., Schwarzenbach, Switzerland)를 사용하여 10 mL의 시료를 채취하여 3회 반복 측정 후 평균값을 나타내었다.

5. 아밀라아제 활성 측정

아밀라아제 활성은 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)에 용해한 0.5% 수용성 전분 0.5 mL를 기질로 이용하여 발효물의 상층액 0.5 mL를 효소액으로 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이때 생성된 환원당의 함량은 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 방법으로 측정하였으며, 본 실험에서의 효소 활성 1 unit은 1분에 1 μmol의 글루코스를 생산하는 효소량으로 정의하였다.

6. 유리당 함량 분석

유리당 함량은 발효물 동결건조분말 100 ㎎에 10 mL 증류수를 가한 다음 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한 후 HPLC(Waters 2996, Waters Co., Milford, Massachusetts, USA)로 분석하였다. 이때 컬럼은 탄수화물 컬럼(ID 4.6×250 mm, Waters Co., Milford, Massachusetts, USA)을 사용하였으며, 컬럼 오븐 온도는 35℃, 이동상은 85% 아세토나이트릴, 유속은 1.2 mL/min 이었고, 시료주입량은 20 ㎕로 하여 RI(refractive index) 검출기를 이용하여 검출하였다. 표준품은 글루코스, 말토오스(Sigma, saint Louis, Missouri, USA)를 증류수에 녹여 표준용액으로 사용하였다. 표준품과 시료의 당성분은 머무른 시간을 직접 비교하여 확인하였고, 유리당 함량 계산은 각 표준품의 검량 곡선을 작성한 후 피크의 면적으로 산출하였다.

7. 유리아미노산 조성 분석

유리아미노산 조성은 시료 0.2 g에 94% 에탄올 10 mL를 가하여 24시간 교반한 다음 원심분리(4,000 rpm, 15분)하여 상층액과 고형분을 분리하였다. 분리된 상층액을 40℃ 이하에서 감압 농축하였으며 농축한 시료는 0.02 N HCl 5 mL로 정용하여 여과(0.22 ㎛, 멤브레인 필터)한 다음 아미노산 분석기(L-8900, Hitachi Co., Tokyo, Japan)로 분석하였다.

8. DPPH 라디칼 소거활성 측정

전자공여능은 DPPH(1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 환원력을 이용하여 측정하였다. 즉, 농도별로 희석한 시료 0.5 mL에 4×10^-4 M DPPH 용액(99.9% 에틸 알코올에 용해) 4.5 mL를 가하여 총액의 부피가 5 mL가 되도록 하였다. 이 반응액을 약 10초간 혼합하고 실온에 30분간 방치한 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Buckinghamshire, Sweden)를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료 첨가 전후의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능(%) = 1 - (샘플 흡광도/대조구 흡광도) × 100

9. 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성 측정

슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성은 시료 500 ㎕에 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.5) 100 ㎕, 100 μM PMS(phenazine methosulfate) 200 ㎕를 혼합하여 반응시킨 후 500 μM NBT(nitro blue tetrazolium) 200 ㎕ 및 500 μM β-NADH(β-nicotinamide adenine dinucleotide) 400 ㎕를 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 다음 분광광도계를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 시료 첨가 전후의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

슈퍼옥사이드 라디칼 소거능(%) = 1 - (샘플 흡광도/대조구 흡광도) × 100

10. ACE(Angiotensin converting enzyme) 저해활성 측정

조효소액은 토끼 허파 아세톤 분말(Sigma Co., St Louis, Mo, USA)를 1 g/10 mL(w/v)의 농도로 4℃에서 24시간 추출한 후, 원심분리(4℃, 10,000 rpm, 40분)하여 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 기질은 0.3 M NaCl이 함유된 0.1 M 소듐보레이트 완충액(pH 8.3)에 HHL(hippuryl-histidyl-leucine, Sigma Co., St. Louis, Mo, USA)을 5 mg/mL(w/v)의 농도로 녹인 후 기질로 사용하였다. ACE 저해활성은 시료액 50 ㎕에 ACE 조효소액 50 ㎕를 가한 다음 37℃에서 5분간 예비반응을 시킨 후, 기질 50 ㎕를 가하고 다시 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 1 N HCl 150 ㎕를 가하여 반응을 정지시키고 750 ㎕의 에틸 아세테이트를 가한 다음, 1분간 교반하고 원심분리(4℃, 5,000 rpm, 10분)하여 500 ㎕의 상등액을 얻었다. 이 상등액을 120℃에서 30분간 완전히 건조시켜 2 mL의 메탄올을 넣은 후 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 50 ㎕를 가하여 측정하였으며, ACE 저해활성은 아래와 같이 나타내었다.

ACE 저해율(%) = {1 - (대조구 흡광도 - 샘플 흡광도)/(대조구 흡광도 - 블랭크 흡광도)} × 100

11. 유익균의 생육에 미치는 영향

인체 장내 유익균의 생육에 미치는 영향은 장내유익균으로 알려져 있는 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus) 2종을 선정하여 실험에 사용하였다. 멸균된 8.5 mL MRS 배지에 시험균액(멸균식염수로 균 현탁액을 만들어 균 농도를 660 nm에서 흡광도가 0.4가 되게 한 시험균액) 0.5 mL를 접종한 후 시료의 농도가 100 ㎎/mL인 배양물을 1 mL 가하여 37℃에서 24시간 동안 배양하면서 균 증식도를 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Buckinghamshire, Sweden)를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 1 mL의 멸균수를 가하여 동일하게 측정하였다.

12. α-글루코시다아제 저해활성 측정

α-글루코시다아제 저해활성은 α-글루코시다아제(0.2 U/mL)와 ρ-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(3 mM, ρNPG)는 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 용해하여 사용하였으며, 각각의 시료액 50 ㎕를 0.2 U/mL α-글루코시다아제 효소액 100 ㎕와 혼합하여 37℃에서 20분간 전배양한 후 3 mM ρNPG 50 ㎕를 가하여 37℃에서 20분간 반응하였다. 반응 후 분광광도계를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하고 저해율(%)을 계산하였다.

13. FRAP(Ferric reducing antioxidant power) 측정

FRAP 용액은 25 mL 아세테이트 완충액(300 mM, pH 3.6)을 37℃에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 2.5 mL와 20 mM 염화제2철(FeCl₃) 2.5 mL를 첨가하여 제조하였다. FRAP 시약 175 ㎕를 시료 25 ㎕에 혼합하여 섞고, 37℃에서 15분간 반응시키고 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Buckinghamshire, Sweden)를 사용하여 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP는 FeSO₄·H₂O(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

14. 통계처리

실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었으며, SPSS 19.0을 이용하여 각 시료군간의 유의성을 검증한 후 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test에 따라 분석하였다.

실시예 1: 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 곡물 발효물의 생균수 및 pH 변화

백미와 아마란스의 혼합비율에 따라 미생물 생장에 미치는 영향을 검토하기 위하여 R100, R90, R80 및 R70에 대해 120시간 발효 후 발효 시간별 생균수를 도 1의 (A)에 나타내었다. 초기 0시간에서의 생균수는 5.33~5.37 log CFU/mL이었으며 발효 12시간 및 24시간 경과함에 따라 R100은 7.48 log CFU/mL와 7.37 log CFU/mL이었고 R90은 7.16 log CFU/mL와 7.18 log CFU/mL, R80은 7.67 log CFU/mL와 7.52 log CFU/mL 및 R70은 7.09 log CFU/mL와 7.01 log CFU/mL로 측정되어 아마란스 혼합비율에 따른 4개의 시료 중 R80에서 가장 높은 생육활성을 나타내었다. 발효물의 생육은 12시간 동안 가장 많이 증식하였으며 발효 24시간 이후부터는 점차 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 바실러스 서브틸리스 KMKW4가 백미와 아마란스를 효과적으로 자기 증식에 이용하였으며 발효가 잘 진행되었음을 확인하였다.

백미 및 아마란스의 발효 정도를 확인하기 위하여 발효 시간별 곡류 발효물의 pH 변화를 도 1의 (B)에 나타내었다. 발효 시간에 따른 pH값은 0시간에서 R100, R90, R80 및 R70이 각각 6.58, 6.69, 6.73 및 6.75를 나타내어 아마란스가 첨가됨에 따라 pH가 약간 증가함을 확인하였으며, 12시간 발효 시 pH는 각각 5.59, 5.79, 5.53 및 5.88로 나타나 R80에서 가장 낮은 pH를 나타내었다. 백미 및 아마란스 혼합비율에 따른 발효물의 pH는 발효시간이 경과함에 따라 pH가 낮아져 모든 실험군에서 발효가 일어났음을 확인하였고 R80이 가장 낮게 분석되었다. 따라서 본 실험에서는 발효시간에 따른 생균수 및 pH 변화를 고려할 때 아마란스를 20% 첨가한 R80 구간을 선정하였고 대조구로는 백미 100%(R100)로 하여 발효시간에 따른 아밀라아제활성을 분석하였다.

실시예 2: 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 곡물 발효물의 아밀라아제 활성

백미(R100) 및 백미와 아마란스(R80) 혼합 발효물 및 동결건조분말의 발효시간에 따른 아밀라아제 활성을 측정한 결과는 도 2와 같다. 발효물의 경우 발효 0시간에서의 아밀라아제 활성은 R100과 R80이 각각 7.34 Unit/mL와 6.18 Unit/mL으로 나타났으며, 발효 24시간까지는 아밀라아제 활성의 변화가 크게 나타나지 않았으나 발효 24시간 이후부터 아밀라아제 활성이 급격하게 증가하여 발효 48시간 째 가장 높은 아밀라아제 활성을 나타내었다. 발효 48시간 때 R100과 R80의 아밀라아제 활성은 각각 19.91 Unit/mL와 57.77 Unit/mL로 나타났으며 백미만을 영양원으로 한 발효물보다 아마란스를 혼합하여 발효한 발효물에서 더 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 A).

또한, 발효물 동결건조분말의 아밀라아제 활성을 측정한 결과 발효물과 유사한 결과를 나타내었다(도 2의 B). 발효물 동결건조분말은 발효 후 48시간에서 R80이 24.31 Unit/g로 측정되어 발효물에 대한 아밀라아제 활성의 약 42%를 나타내었다. 따라서, 본 실험에서는 백미와 아마란스 발효물을 곡류 효소함유 제품용 소재로 활용 가능함을 확인하였으며 아밀라아제 활성이 가장 높은 구간인 발효 48시간을 발효 조건으로 선정하였다.

실시예 3: 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 곡물 발효물의 유리당 함량 및 유리아미노산 조성

백미(R100) 발효물과 백미와 아마란스(R80) 혼합 발효물의 동결건조분말의 유리당 함량을 분석한 결과는 표 1과 같다. R100 및 R80에 함유되어 있는 유리당은 글루코스와 말토오스로 분석되었고, 발효 전 R100은 글루코스 765.33 ㎍/100 g, 말토오스 159.98 ㎍/100 g을 함유하고 있었으며, 발효 48시간에서 글루코스 4,274.85 ㎍/100 g으로 나타나 글루코스 함량이 증가함을 확인하였으며, 말토오스는 검출되지 않았다. R80은 발효 전 글루코스 1,828.81 ㎍/100 g, 말토오스 147.35 ㎍/100 g으로 나타나 R100보다 초기 글루코스 함량이 높았는데 아마란스에는 유리되기 용이한 단당류가 많이 함유되어 있는 결과로 사료되며 미생물 생육에 영향을 주는 관계로 R80에서 생육도가 더 높은 것으로 판단된다. 발효 후 R80은 말토오스는 검출되지 않았으며, 글루코스는 5,454.15 ㎍/100 g으로 함량이 증가하였는데, R100보다 글루코스 함량이 높음을 확인하였다. 글루코스 함량은 R100 및 R80 모두 발효 후 증가하여 유사한 결과를 보여주었는데 이는 바실러스 서브틸리스 KMKW4가 생성하는 아밀라아제에 의해 전분이 분해되어 글루코스가 생성되었음을 알 수 있다.

곡물 발효물의 동결건조분말의 유리당 함량

샘플	발효시간	유리당 함량(㎍/100 g)
샘플	발효시간	글루코스	말토오스
R100	0시간	765.33	159.98
R100	48시간	4,274.85	ND
R80	0시간	1,828.81	147.35
R80	48시간	5,454.15	ND

ND: 검출되지 않음

백미(R100) 발효물과 백미와 아마란스(R80) 혼합 발효물의 동결건조분말의 유리아미노산 조성을 표 2에 나타내었다. 유리아미노산 함량은 발효 전보다 발효 후 증가하였는데, R100은 발효 전 665.07 ㎎/100 g에서 48시간 발효 후 834.01 ㎎/100 g으로 증가하였으며, R80은 발효 전 868.73 ㎎/100 g에서 발효 후 1,085.44 ㎎/100 g으로 증가하였다. 이는 바실러스 서브틸리스 KMKW4의 프로테아제 활성에 의하여 백미 및 아마란스에 함유되어 있는 단백질이 아미노산으로 분해된 것으로 사료된다. 또한, 아마란스는 백미와 비교시 단백질 함량이 높기 때문에 아마란스가 혼합되어 있는 R80에서의 유리아미노산 함량이 높아졌을 것으로 판단되며 다양한 영양원이 공급됨에 따라 발효가 더 잘 일어난 것으로 사료된다. 발효물 동결건조분말의 주요 유리아미노산으로는 아스파라긴, 글루탐산, 알라닌, γ-아미노-n-부티르산 등이 분석되었는데 구수한 맛을 내는 글루탐산은 발효 후 R100보다 R80에서 더 높게 나타났으며, 쓴맛을 지닌 발린, 류신, 이소류신 등은 R80보다 R100에서 더 높은 것을 알 수 있었고, 단맛을 내는 리신의 경우 발효 전보다 발효 후 다량 증가하는 것을 확인하였으며 R80이 R100보다 높은 함량을 나타내었다.

곡물 발효물의 동결건조분말의 유리아미노산 조성(㎎/100 g)

유리아미노산	R100		R80
유리아미노산	발효 0시간	발효 48시간	발효 0시간	발효 48시간
타우린	1.44	3.79	2.58	7.50
O-포스포에탄올아민	1.34	4.76	10.80	65.75
요소	7.52	28.30	29.14	91.98
L-아스파르트산	59.19	0.00	96.06	0.00
L-트레오닌	5.52	3.40	11.63	0.00
L-세린	19.24	6.52	23.05	0.00
L-아스파라긴	246.81	13.67	226.90	163.48
L-글루탐산	118.51	6.60	152.57	40.22
L-사르코신	22.31	21.35	49.27	11.84
L-프롤린	0.00	31.58	0.00	32.34
글리신	10.69	2.79	20.80	7.27
L-알라닌	46.67	15.56	57.53	41.94
L-시트룰린	0.00	25.21	0.00	6.07
L-α-아미노-n-부티르산	3.31	28.93	3.28	31.03
L-발린	9.75	60.68	18.13	19.52
L-시스틴	0.00	0.76	0.65	1.82
L-메티오닌	1.12	23.24	5.93	18.18
시스타티오닌	0.00	10.05	0.00	9.24
L-이소류신	2.22	17.66	8.33	3.83
L-류신	4.01	69.38	9.15	21.27
L-타이로신	4.73	63.63	10.43	33.14
β-알라닌	0.00	4.03	0.00	0.00
L-페닐알라닌	3.56	62.38	7.71	23.20
D,L-β-아미노이소부티르산	0.00	1.11	0.00	0.00
L-호모시스틴	0.00	5.01	0.00	4.27
r-아미노-n-부티르산	29.74	31.19	32.86	51.72
에탄올아민	5.39	20.48	5.58	19.32
염화암모늄	27.11	44.32	32.84	151.82
δ-히드록시리신	0.00	4.89	0.00	0.32
L-오르니틴	0.00	21.19	0.35	37.10
L-라이신	7.80	73.59	15.41	103.11
1-메틸-L-히스티딘	0.00	0.00	0.00	1.59
L-히스티딘	3.50	28.64	6.12	17.34
L-트립토판	0.00	7.64	0.00	13.67
L-카르노신	0.00	2.68	0.00	0.00
L-아르기닌	23.59	89.00	31.63	55.56
총 아미노산 함량	665.07	834.01	868.73	1,085.44

실시예 4: 바실러스 서브틸리스 KMKW4 균주를 이용한 곡물 발효물의 생리활성

(1) 곡물 발효물의 항산화 활성

곡물 발효물 동결건조분말에 대한 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 모든 실험구에서 발효 전보다 발효 48시간 경과 후 항산화 활성이 증가하였는데 발효 후 5 ㎎/mL 농도에서 R100(도 3의 A)과 R80(도 3의 B)은 각각 36.21%와 44.21%를 나타났으며 R80이 높게 분석되었다(도 3).

발효물 동결건조분말의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 발효 전 R100의 경우 1, 2.5, 5 ㎎/mL 농도에서 각각 2.77%, 17.51% 및 38.36%로 나타났으나 발효 후 각각 8.50%, 58.40% 및 78.93%로 증가함을 확인하였다(도 4의 A). R80의 경우 R100과 유사하게 발효 후 항산화 활성이 증가되었으며 1, 2.5, 5 ㎎/mL 농도에서 각각 13.63%, 70.06% 및 89.76%로 나타나 R100보다 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4의 B).

(2) 곡물 발효물의 ACE 및 α-글루코시다아제 저해활성

곡물 발효물 동결건조분말의 발효 전과 후 ACE(Angiotensin converting enzyme) 저해활성 분석 결과는 도 5의 (A)에 나타내었다. 발효 전 R100과 R80은 각각 30.12%와 40.22%로 나타났으며, 발효 후에는 각각 59.13%와 78.57%로 나타나 발효 후 크게 증가하는 경향을 보였고 R80의 경우 R100보다 더 높은 ACE 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다.

발효물 동결건조분말의 α-글루코시다아제 저해활성은 모든 실험군에서 발효 전보다 발효 후에 높은 저해 활성을 나타내었으며, R100보다 R80에서 발효 48시간 경과 후 더 높은 저해활성을 나타내었다(도 5의 B).

따라서, 본 실험 결과를 종합할 때 백미와 아마란스 혼합 발효물은 아밀라아제 활성은 물론 다양한 생리활성을 보여주어 향후 곡류 발효물 함유 제품 개발에 활용이 가능할 것으로 사료된다.

실시예 5: 바실러스 서브틸리스 CBD2를 이용한 곡물 발효물의 생균수 및 pH 변화

백미와 아마란스 및 퀴노아의 혼합비율에 따른 미생물 생육에 미치는 영향을 확인하기 위하여 백미만을 발효한 실험구(R100)와 백미와 아마란스 및 퀴노아를 비율별로 혼합한 실험구를 제조하여 바실러스 서브틸리스 CBD2를 2% 접종하였으며, 96시간 발효 후 발효 시간마다 생균수 및 pH를 측정하였다. 발효에 따른 초기 균수는 5.10~5.17 log CFU/mL로 모든 구간에서 비슷한 균수를 나타내었으나 곡류 종류 및 배합비에 따라 발효 후 생균수는 차이를 나타내었다. R100의 경우 발효 24시간 째 생균수는 7.65 log CFU/mL로 나타났으며(도 6의 A), RA10, RA20, RA30의 생균수는 각각 7.76 log CFU/mL, 8.03 log CFU/mL 및 7.85 log CFU/mL로 나타나 모든 실험구에서 R100보다 높은 생육정도를 나타내었는데(도 6의 B), 특히 RA20에서 높은 생육도를 보여주었다. 백미와 퀴노아 비율에 따른 생균수는 RQ10, RQ20, RQ30이 발효 24시간 경과 후 각각 7.92 log CFU/mL, 7.87 log CFU/mL 및 7.97 log CFU/mL로 나타나 R100보다 생육도가 향상되었음을 확인하였으나 퀴노아의 경우 첨가량에 따른 생육도 차이는 크지 않았다(도 6의 C). 따라서 곡류를 이용하여 발효하였을 때 미생물들이 곡류를 효과적으로 자기 증식에 이용함으로 인해 발효가 진행됨에 따라 생균수가 증가하는 것을 확인하였으며, 아마란스가 퀴노아보다 미생물의 생육에 영향을 주는 것을 알 수 있었다.

미생물에 의한 발효 정도를 확인하기 위하여 발효 시간별로 곡류 발효물의 pH 변화를 측정한 결과 모든 실험구에서 발효 초기 pH는 6.37~6.56로 나타났으나, 발효 24시간 경과 후 R100의 경우 pH 5.58로 감소하였고 아마란스 및 퀴노아를 첨가한 실험구인 RA10, RA20, RA30, RQ10, RQ20, RQ30에서도 각각 pH 5.61, pH 5.36, pH 5.37, pH 5.58, pH 5.43 및 pH 5.59로 나타나 감소됨을 확인하였다(도 6).

실시예 6: 바실러스 서브틸리스 CBD2를 이용한 곡물 발효물의 아밀라아제 활성

곡물 발효물의 발효시간 및 혼합비율에 따른 아밀라아제 활성은 도 7과 같다. 발효 초기 아밀라아제 활성은 모든 실험구에서 5.12~9.87 Unit/mL로 낮은 활성을 나타내었으며 발효 12시간 이후부터 활성을 나타내었다. R100의 경우 발효 시간이 경과함에 따라 24~96시간까지 각각 300.11, 453.52, 538.59, 749.32 Unit/mL로 지속적으로 아밀라아제 활성이 증가함을 확인하였는데 96시간에서 가장 높은 효소활성을 나타내었다(도 7의 A). 백미와 아마란스를 혼합하여 발효한 실험구의 효소활성은 발효 72시간까지 지속적으로 증가한 다음 감소하는 경향을 나타내었으며, 최고 활성을 나타낸 발효 72시간에서 RA10, RA20 및 RA30은 각각 1,336.15, 1,479.71 및 770.87 Unit/mL로 나타나 R100보다 높은 효소활성을 나타내었고 특히 RA20에서의 효소활성이 가장 우수하였다(도 7의 B). 백미에 퀴노아를 첨가한 실험구에서는 아마란스를 첨가한 실험구와 경향은 비슷하였지만 높은 효소활성을 보인 발효 72시간에서 RQ10, RQ20 및 RQ30이 각각 647.47, 702.59 및 396.87 Unit/mL로 나타나 아마란스를 첨가한 실험구보다 낮은 효소활성을 보였으며 RQ20에서 높은 효소활성은 나타내었다(도 7의 C). 따라서 곡류효소식품 개발을 위해 효소활성이 가장 높은 RA20(발효 72시간), RQ20(발효 72시간) 및 백미만을 발효한 R100(발효 96시간)을 선정하였으며 대조군으로는 발효하지 않은 R100, RA20, RQ20을 시료구로 하여 무발효 및 발효 후의 품질특성을 분석하였다.

실시예 7: 바실러스 서브틸리스 CBD2를 이용한 곡물 발효물의 생균수 및 아밀라아제 활성

발효 시간 및 곡류 혼합 비율에 따라 효소활성을 측정한 결과 우수한 효소활성을 보인 RA20, RQ20 및 R100 곡물 발효물의 동결건조분말의 생균수 및 아밀라아제 활성은 표 3과 같다. R100의 생균수는 6.89±0.01 log CFU/mL로 나타났으며 RA20 및 RQ20은 각각 7.01±0.1 log CFU/mL와 7.14±0.03 log CFU/mL로 나타나 R100보다 RA20과 RQ20에서 높은 생균수를 보여주었다. 아밀라아제 활성은 R100, RA20, RQ20에서 각각 373.46±8.03 unit/g, 506.02±19.88 unit/g, 152.27±14.14 unit/g으로 나타나 RA20에서 높은 아밀라아제 활성이 측정되었는데, 이는 발효물의 효소활성이 높을수록 동결건조 후 효소활성이 높게 유지됨을 확인할 수 있었다. 본 실험 결과, 동결건조 후 일부 아밀라아제 활성이 실활되나 RA20의 경우 약 35% 가량 유지하고 있어 곡류발효 효소식품으로 활용가능할 것으로 사료된다.

곡물 발효물의 동결건조분말의 생균수 및 아밀라아제 활성

샘플	생균수(log CFU/g)	아밀라아제 활성(Unit/g)
R100	6.89±0.01	373.46±8.03
RA20	7.01±0.10	506.02±19.88
RQ20	7.14±0.03	152.27±14.14

실시예 8: 바실러스 서브틸리스 CBD2를 이용한 곡물 발효물의 유리당 함량 및 장내 유익균 생육에 미치는 영향

무발효 및 발효된 곡물분말의 유리당 함량을 분석한 결과는 표 4와 같다. 곡물의 주된 유리당은 글루코스, 말토오스로 나타났으며, 무발효 R100은 글루코스 265.33 ㎍/100 g, 말토오스 39.98 ㎍/100 g을 함유하고 있었으며 96시간 발효에서는 말토오스는 검출되지 않았으며, 글루코스는 1,090.68 ㎍/100 g으로 나타나 발효 후에 유리당 함량이 증가함을 확인하였다. RA20과 RQ20에서도 무발효 구간에서는 글루코스와 말토오스가 분석되었지만 발효 72시간 구간에서는 말토오스는 검출되지 않았으며 글루코스 함량은 RA20, RQ20이 각각 1,285.73 ㎍/100 g, 1,230.96 ㎍/100 g으로 분석되어 글루코스 함량이 증가하였다. 이는 바실러스 서브틸리스 CBD2가 생성하는 아밀라아제에 의해 전분이 분해되어 단당류인 글루코스가 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

곡물발효물의 동결건조분말의 유리당 함량

샘플		유리당 함량(㎍/100 g)
샘플		글루코스	말토오스
무발효	R100	265.33	39.98
	RA20	297.85	34.35
	RQ20	285.15	35.81
발효	R100	1090.68	ND
	RA20	1285.73	ND
	RQ20	1230.96	ND

ND: 검출되지 않음

곡류발효 분말의 장내 유익균의 생육특성은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 애시도필러스 2종을 선정하여 분석하였다(도 8). 발효된 R100, RA20 및 RQ20에서 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 애시도필러스 모두 멸균수를 첨가한 대조군에 비하여 대수기에 도달했을 때의 흡광도 값에 차이가 나타나 생육이 증진되는 결과를 나타내었다. 특히, 락토바실러스 애시도필러스의 경우 발효 8시간 경과 후 멸균수를 첨가한 대조군보다 RA20에서 생육도가 높았으며 20시간까지 증식에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이를 통해 장내 유익균의 생육에 곡류발효 분말을 첨가할 경우 흡광도를 통해 생육이 증진되는 것을 확인하였으며, 이는 발효물에 존재하는 당들이 프로바이오틱스로 작용하여 증진효과가 나타난 것이라 판단된다.

실시예 9: 바실러스 서브틸리스 CBD2를 이용한 곡물 발효물의 생리활성

(1) 곡물 발효물 분말의 α-글루코시다아제 및 ACE 저해활성

본 실험에서는 무발효 및 발효된 R100, RA20, RQ20 곡물 분말의 α-글루코시다아제 저해활성을 측정하였으며 그 결과를 도 9에 나타내었다. 모든 구간에서 발효전보다 발효 후 2배 가량의 저해활성을 나타냈으며, 특히 R20의 α-글루코시다아제 저해 활성이 13.32%로 가장 높게 나타났다. 이는 아마란스를 첨가한 RA20은 R100보다 높은 α-글루코시다아제 저해활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서 본 실험 결과는 백미만을 발효한 R100보다 아마란스 및 퀴노아를 첨가하여 발효한 RA20, RQ20에서 높은 저해활성을 확인하였으며, 특히 RA20에서 가장 높은 저해활성을 나타내어 향후 혈당조절을 위한 기능성식품 소재로 활용가능하다 사료된다.

곡류발효 분말의 ACE 저해활성은 도 10과 같다. 무발효된 대조구의 경우 R100, RA20, RQ20에서 각각 10.39±1.07%, 13.93±1.28%, 14.61±1.87%의 저해활성을 나타내었으나 발효구의 경우 각각 20.36±1.78%, 28.30±2.32%, 29.27±2.17%로 발효를 통해 ACE 저해 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 백미만을 발효한 R100보다 RA20, RQ20에서 높은 ACE 저해활성을 나타내었으며, 아마란스와 퀴노아의 첨가에 따라 유의적으로 증가함을 확인하였다.

(2) 곡물 발효물 분말의 항산화 활성

곡물 발효물 분말의 전자공여능을 측정한 결과, 무발효 R100, RA20 및 RQ20이 10 ㎎/mL 농도에서 각각 8.86±0.25, 8.45±0.25, 6.40±0.10로 낮은 활성을 나타내었지만 바실러스 서브틸리스 CBD2로 발효된 R100, RA20 및 RQ20의 경우 모든 실험구에서 항산화 활성이 증가하여 각각 18.30±0.30%, 27.73±0.34% 및 25.73±0.07%를 나타내었다.

또한, FRAP는 모두 구간에서 RA20>RQ20>R100의 순으로 나타났다. 발효된 RA20의 10 ㎎/mL의 농도에서 200.68±6.58 uM로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었으며 RQ20은 177.52±2.02 uM로 R100보다 높은 활성을 나타내었다(표 5).

곡류발효 분말의 항산화 활성

농도 (㎎/mL)	샘플		DPPH 라디칼 소거능(%)	FRAP (FeSO₄·7H₂O eq uM)
5	무발효	R100	4.18±0.08^j	0.03±0.01^h
		RA20	3.87±0.15^j	0.02±0.01^h
		RQ20	4.10±0.08^j	0.03±0.01^h
	발효	R100	12.15±0.06^f	5.73±3.33^g
		RA20	16.16±0.11^d	13.87±0.88^f
		RQ20	14.10±0.13^e	12.60±1.53^f
10	무발효	R100	8.86±0.25^g	54.59±2.02^e
		RA20	8.45±0.25^h	80.81±2.89^d
		RQ20	6.40±0.10ⁱ	78.52±3.05^d
	발효	R100	18.30±0.30^c	110.33±3.05^c
		RA20	27.73±0.34^a	200.68±6.58^a
		RQ20	25.73±0.07^b	177.52±2.02^b

각각의 열 내의 다른 윗첨자는 유의차가 있음을 의미함(p<0.05)

농업생명공학연구원

KACC91904P

20131108

농업생명공학연구원

KACC91905P

20131108

Claims

(a) 백미 및 아마란스를 혼합한 혼합곡물에 물을 첨가한 후 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 제조한 혼합물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 혼합곡물은 백미 및 아마란스를 7.5~8.5:1.5~2.5 중량비율로 혼합한 혼합곡물인 것을 특징으로 하는 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CBD2 균주(기탁번호 KACC91904P) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMKW4 균주(기탁번호 KACC91905P)인 것을 특징으로 하는 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 기능성의 증진은 항산화, 항고혈압 및 항당뇨 활성의 증진 효과인 것을 특징으로 하는 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서,
(a) 백미 및 아마란스를 7.5~8.5:1.5~2.5 중량비율로 혼합한 혼합곡물에 물을 첨가한 후 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 제조한 혼합물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종한 후 34~40℃에서 36~80시간 동안 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물.
제6항의 기능성이 증진된 백미 및 아마란스 혼합 발효물을 함유하는 가공식품.