KR20160072979A - 미생물에 의하여 발효된 캐모마일을 함유하는 항산화 효과를 갖는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 캐모마일을 이용한 항산화 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 캐모마일 꽃잎을 미생물에 의하여 발효시킨 후 건조 및 분말화하고 이를 항산화 작용에 탁월한 효과를 나타냄을 확인함으로써 인체 내 산화로 인해 발생되는 여러 가지 질병의 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

미생물에 의하여 발효된 캐모마일을 함유하는 항산화 효과를 갖는 약제학적 조성물 {A composite of chamomile fermented by microorganisms for pharmaceutical materials with anti-oxidative effects}

본 발명은 캐모마일을 미생물에 의하여 발효시켜 보다 높은 항산화 효과를 갖는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

현대인들은 보다 복잡한 사회와의 관계 속에서 식생활의 변화, 부족한 운동량, 과중한 정신적 스트레스 등으로 인하여 인체 과산화물(peroxides) 등과 같은 노폐물이 인체 내 누적되게 되고 축적된 과산화물은 노화를 촉진하고 인체의 염증 유발하거나 면역력 감소를 가져오며 암을 유발하기도 한다.

즉, 과산화물은 인체 내에 존재하는 지질 중 특히 불포화 지방산에서 쉽게 발생하며 여러 가지 요인에 의하여 촉진되어 진다. 그 요인으로는 식품인 경우 산소, 가열, 자외선, 기계적 충격, 금속이온의 존재 등으로 자동적으로 유래되기도 하나 인체 내에서는 리포옥시게네이즈(lipooxygenase)와 같은 지질산화효소에 의하여 생성되기도 한다. 이 물질들은 매우 불안정하고 반응성이 강하여 세포 내 DNA를 공격하여 손상시키며, 지질이 주성분인 세포막에 공격하여 연쇄적인 지방산화를 일으켜 조직의 노화를 촉진하고 더 나아기 암을 유발시키거나 염증을 일으키기도 한다.

따라서 최근에 항산화에 대한 연구가 최근 활발히 진행되고 있으며 특히 천연물 소재로서의 폴리페놀류(polyphenols)는 자유 라디칼을 페놀 고리(phenol ring)분자 자체에 흡수시킴으로써 공명화(resonance) 구조로서 안정화됨과 동시에 자유 라디칼 형성에 의한 여러 가지 연쇄적인 산화를 억제하는 것으로 알려져 있다. 폴리페놀류는 식물체 종류에 따라 매우 다양하게 존재하며 그 대표적인 예로서 플라보노이드(flavonoid)를 들 수 있다. 플라보노이드는 C₆-C₃-C₆,를 주요 골격으로 하며 자연에서는 하나 이상의 당과 결합된 배당체(glycoside)로서 존재하고 있다. 플라보노이드는 식물의 열매나 꽃 부위에 주로 존재하며 특히 열매나 꽃의 색을 결정 지워주기도 한다. 플라보노이드는 구조에 따른 분류를 보면 기능기의 위치에 따라 플라바놀(flavanol), 플라바논(flavanones), 플라본(flavone), 아이소플라본(isoflavone), 플라보놀(flavonols), 안소시아니딘(fnthocyanidin)의 소그룹으로 나누어진다. 생리 기능성으로는 강력한 항산화력 이외에 항균 작용과 치매 예방, 항염 및 항암 작용이 있는 것으로 연구되어 있으며 이러한 기능성은 플라보노이드의 소그룹에 따라 다소 차이가 있는 것으로 알려져 있다(인용 문헌: Miles, E. A., Zoubouli, P., Calder, P. C., Phil, D. (2005) Differntial anti-inflammatory effects of phenolic compounds from extra virgin olive oil identified in human whole blood cultures. Nutrition 21, 389-394).

그 예로서 녹차 및 송이버섯 추출물의 항염, 항산화용 화장료 조성물이 출원된 바 있고 (대한민국특허 제10-2011-0045662호), 김 등은 섬쑥부쟁이 분획물의 항산화 및 항염증 활성을 연구한 바 있다(김한혁, 박근혜, 박강수, 이진영, 안봉전. (2010) Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 38, 434-442). 특히, 여러 가지 항산화제 중 폴리페놀류 특히 플라보노이드의 산화력이 가장 강한 것으로 알려져 있으며 부가적인 생리 기능성으로 인하여 최근 많은 연구가 진행되고 있다.

그러나 천연물에서의 플라보노이드는 성분량이 실제 기능성을 위한 유효 농도에 못 미치어 산업적으로 추출, 농축, 또는 발효를 통한 생물 전환 등 여러 가지 가공법이 필요하다. 즉, 천연물에 존재하는 유효성분은 대부분 배당체(glycosides)로 존재하거나 다른 성분과 결합되어 있다. 따라서 그 추출수율을 높이기 위하여 미생물에 의한 효소적 추출이나 극성에 따른 여러 가지 용매를 사용하고 있다. 그러나 실제적으로 식품 제조에서의 용매의 사용에 있어서 에탄올(ethanol)만 허가되어 용매선정에 제한이 있다. 그러나 발효법인 경우, 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 효율적으로 배당체로부터 유효성분 만을 분리 추출할 수 있고 더 나아가 생물 전환까지 진행하면 보다 높은 생리기능성을 기대할 수 있다. 예로서 아스퍼질러스(Aspergillus)곰팡이를 이용한 발효를 통하여 기능성을 더욱 부각시킨 특허가 출원된 바 있다(인용 문헌: 대한민국특허 제10-2014-0040611호, 대한민국특허 제 10-2014-0014025호).

본 발명은 캐모마일(Chamomile, 학술명 Matricaria recutica)을 발효시켜 기존의 것 보다 우수한 항산화력을 갖는 조성물을 그 특징으로 한다.

허브(herbs)류 중 캐모마일은 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과에 속하는 풀이며 카모밀, 카모마일, 또는 카밀레 등의 이름으로 불리기도 한다. 원산지는 영국이나, 현재는 전 세계에서 찾아볼 수 있다. 높이는 50 cm ~ 1 m 정도이며, 곧추선 줄기에 곁가지가 많은 것이 특징이다. 꽃은 5~9월에 피며, 사과향이 난다. 캐모마일의 방향유는 긴장 완화, 두통 등의 통증 완화에 효과가 있으며, 몸을 따뜻하게 해주는 효과도 갖고 있다. 현재 위장장애의 완화 및 염증성 질환, 발열, 설사, 소장과 간의 종양을 치료하기 위한 약용 차로 이용되고 있다.

꽃에는 terpenes, flavonoids, coumarin, malicacid, 무기질 성분들이 함유되어 있으며, essential oil에는 28종류의 terpenes(α-bisabolol, chamazulene, bisabolol oxide 등) 과 36가지의 flavonoids(apigenin 등), 52 가지의 유기산 등 120여종의 화합물들이 함유되어 있는 것으로 보고되었다. 이 중 apigenin은 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 천연물에서 유효물질의 농도는 인체 내에서 흡수되어 기능성을 나타내기에 매우 적은 편이며 산업적으로도 그 추출율도 매우 적은 편이다.

한편 발효 공법은 여러 가지 천연물의 추출율 증대, 생물 전환 등을 통한 생리 기능성 증대를 목적으로 많은 연구가 진행되어 왔다. 즉, 미생물을 이용한 곡물 및 식물의 효소 추출방법 및 이 방법에 의해 제조에 대한 특허(대한민국특허 제10-2013-0018140호)가 출원된 바 있으며 조 등은 인삼의 진세노사이드(ginsenosides)를 곰팡이인 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger)를 사용하여 생물 전환 시킨 후 그 생리 기능성을 증가시킨 것을 보고하였다(인용문헌: Jo, M., Jung, J. E., Lee, J. H., Park, S. H. Yoon, H. J. Yoon,, Lim, K. T., Paik, H. D. (2014) Cytotoxicity of the white ginseng extract and red ginseng extract treated with partially purified -glucosidase from Aspergillus usamii KCTC 6954. Food Sci. Biotechnol. 23, 215-219). 또한 김 등은 바실러스 섭틸리스를 이용 인삼꽃의 항산화성 증진에 대한 연구를 진행한 바 있다 (인용 문헌: 김경희, 김다미, 변명우, 윤영식, 육홍선. (2013) 발효 미생물에 따른 인삼꽃의 항산화 활성. 한국식품영양과학회지 42, 5, 663-669).

따라서 이러한 유효 성분이 많은 캐모마일 꽃부위를 인체에 무해한 세균, 즉 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KCCM10104, 락토바실러스 프랜타럼(Lactobacillus plantarum) KCCM11613P 및 페디오코쿠스 애시디락티시(Lactobacillus acidilactici) KCCM11614P를 이용하여 발효시킨 후 기능성으로서 항산화력이 증진됨을 확인한다.

본 발명에 따른 조성물인 발효된 캐모마일은 정제 또는 환, 차류, 또는 항산화력에 대한 시너지 효과(synergistic effect)를 위한 타성분과의 혼합물 등의 형태로 소비자들이 섭취함으로서 인체 내에서 산화를 억제하여 과산화물이나 자유 라디칼 에서 유래되는 노화, 암, 염증 및 심혈관 질환 등을 예방 또는 치료하는데 기존 천연 캐모마일보다 더 높은 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 캐모마일의 발효 전(가)과 발효 후(나)의 모습이다.

실시 예1: 캐모마일의 시료의 발효

본 실험의 균주는 기능성 식품 소재로 하용된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KCCM10104와 대표적인 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) KCCM11613P 및 페디오코쿠스 애시디락티시(Pediococcus. acidilactici) KCCM11614P를 사용하였고 배양법은 액체 배양으로 실시하였다. 즉, 250 mL 용량의 삼각플라스크에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스에는 100 mL의 TSB(trypticase soy broth)배지, 락토바실러스 플랜타럼 및 페디오코쿠스 애시디락티시와 같은 유산균인 경우 250 mL의 MRS배지를 사용하여 균을 접종한 후 7시간 배양하였다. 한편 본 배양에는 1 L 삼각 플라스크에 캐모마일은 20 g, 멸균 증류수 500 mL, (peptone) 2.5 g (총 0.5%, v/v), 포도당 10 g(총 2% v/v)를 혼합한 후 121℃, 1.5기압에서 멸균하고 냉각시켰다. 본 배양액에 앞서 배양한 균주 10 mL (2%, v/v) 접종하고 72시간 동안 30℃에서 발효하되 바실러스인 경우 150 rpm 속도, 유산균은 50 rpm 속도로 각각 진탕 배양하였다. 발효 후 121℃, 1.5기압에서 멸균시키고 1주일 동안 동결 건조시킨 후 실험에 사용하였다. 도 1은 캐모마일의 발효 전과 후의 모습이다.

실시 예2: 발효 캐모마일의 추출

동결건조된 시료 및 대조군 20 g에 70% 에탄올 200 mL (10배)를 혼합한 후 50℃에서 24시간 추출하였다. 추출 후 여과지(Watman No. 1)로 여과하고 회전식 진공 농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축시켜 에탄올 추출물을 얻었다. 농축액은 동결건조 후 분말상태로 하고 실험 시에는 70% 에탄올에 임의의 적정 농도로 다시 용해시켜 기능성(항산화 효과)를 검증하였다.

시험예 1: 캐모마일의 총 폴리페놀 함량

캐모마일의 유효물질로서 70% 에탄올추출물의 총 폴리페놀 함량은 폴린데니스(Folin-Denis)법을 사용하여 비색법으로 측정되었다. 즉, 시료 0.1 mL과 2% aqueous sodium carbonate 용액 2 mL를 혼합하였다. 실온에서 3분간 방치 후, 50% Folin-Ciocalteau 시약 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 0.1 mL에 혼합 후 30분 정치시키고 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid (0, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/mL)룰 표준으로 하여 표준곡선을 만들고, 이를 이용 총 폴리페놀 함량(total polyphenol contents, 단위: mg of gallic acid equivalent, mgGAE)를 계산하였다.

결과로서 대조군의 총 폴리페놀 함량은 19.36 mgGAE/g이며 균주 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KCCM10104, 락토바실러스 플랜타럼 KCCM11613P 및 페디오코쿠스 애시디락티시 KCCM11614P으로 발효시킨 캐모마일의 총 폴리페놀 함량은 21.47 mgGAE/g, 24.23 mgGAE/g, 20.55 mgGAE/g으로 각각 나타났다. 이로써 발효된 캐모마일 시료는 대조군에 비해 각각 1.10, 1.25, 1.06배 높은 수치를 보였다. 표 1은 여러 가지 미생물에 의한 발효 후 캐모마일 추출물의 수율 및 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다. 이때 총 수율은 다음과 같이 계산되었다.

총수율(%) = [추출 후 시료 무게(g)/추출 전 시료의 건조 중량(g)]×100

	대조군	B. polyfermenticus KCCM10104	L. plantarum KCCM11613P	P. acidilactici KCCM11614P
건조 중량(g)	20	20	20	20
추출물 중량(g)	9.26	10.40	11.2	9.6
총수율(%)	46.3	52	58	48
총페놀함량 (mgGAE/g)	19.36 ± 0.09	21.47 ± 0.34	24.23 ± 2.77	20.55 ± 1.01

시험예 2: 캐모마일 추출물의 항산화 효과 검증

1) DPPH 자유 라디칼(free radical) 소거능

항산화 측정법의 하나로서 자유 라디칼의 소거능을 다음과 같이 측정하였다. 시료 및 대조군 0.2 mL를 100 μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 1 mL와 혼합한 후 실온에서 15분간 방치하고 517 nm에서 흡광도(optical density, OD)를 측정하였다. DPPH free radical 소거능에 의한 항산화 효과는 DPPH free radical을 제거하여 DPPH 용액의 색 변화를 관찰하는 것으로 분석되었다. 이때 DPPH 자유 라디칼 소거능은 다음과 같이 계산하였다.

DPPH 자유 라디칼 소거능(%) = [1-(시료의 OD/대조군의 OD)] × 100

각각의 균주로 발효시킨 캐모마일 추출물의 DPPH free radical에 의한 항산화 효과는 모두 확인되었으며, 대조군보다 그 효과가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 표 2는 그 결과로서 발효된 캐모마일 추출물의 항산화 효과를 나타낸 것이다.

농도(mg/mL)	대조군	B. polyfermenticus KCCM10104	L. plantarum KCCM11613P	P.acidilactici KCCM11614P
0.125	8.22 ± 0.78	13.06 ± 2.06	9.8 ± 1.04	12.19 ± 0.71
0.25	12.13 ± 1.19	18.79 ± 4.26	16.52 ± 3.28	17.86 ± 0.38
0.5	13.07 ± 2.91	30.40 ± 0.83	21.55 ± 7.83	30.88 ± 3.81
1.0	34.38 ± 0.65	46.20 ± 2.34	42.31 ± 2.27	45.25 ± 1.99
2.0	44.47 ± 1.53	55.01 ± 0.96	48.29 ± 0.91	59.66 ± 1.62

2) FRAP assay 법에 의한 항산화 효과 측정

프랩 아세이(FRAP assay, ferric reducing antioxidant power)법은 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferric tripyridyltrizaine (Fe³⁺-TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine (Fe²⁺-TPTZ)으로 환원되는 원리로 한 것으로 시료가 Fe³⁺을 Fe²⁺로 환원 시킬 때 Fe²⁺가 나타내는 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 평가하는 방법이다. 즉, 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 전제를 두고 한 실험방법으로 FRAP assay법은 DPPH 및 ABTS (2,2'-azinobis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonate)) 라디칼 소거활성 측정법과는 다른 기작의 항산화 측정법이기도 하다.

방법으로서 FRAP 시약은 25 mL의 acetate buffer(300mM, pH 3.6)를 37℃에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ, Sigma Chemical Co.) 5 mL와 20 mM ferric sulfate(FeSO₄) 2.5 mL를 가하여 제조하였다. 제조된 0.95 mL FRAP 시약에 원하는 농도로 용해시킨 시료 0.05 mL를 넣은 다음 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 비색법으로 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료는 시료 대신 acetate buffer 또는 증류수를 같은 부피 만큼 넣어 측정하였다. 이때 항산화력은 표준 시약인 FeSO₄ㆍ 7H₂O의 농도와 FRAP의 OD 값의 관계를 나타낸 표준곡선에서 시료의 OD값에 대응하는 FeSO₄ㆍ 7H₂O 의 양(단위: μM)으로서 계산되었다. 여기서 측정값이 클수록 환원력이 큰 것을 알 수 있다.

그 결과로서 FRAP assay를 통한 항산화력 효과는 표 3과 같이 나타났다. 즉, 발효한 캐모마일이 균을 넣지 않은 캐모마일 추출물보다 철 이온의 환원능력이 월등히 뛰어난 것을 볼 수 있었다. 여기서 균주 접종한 발효물 중 페디오코쿠스 애시디락티시 KCCM11614P 균주를 사용한 경우 다른 균주 보다 항산화력의 높은 수치를 보였다.

농도(mg/mL)	대조군	B. polyfermenticus KCCM10104	L. plantarum KCCM11613P	P. acidilactici KCCM11614P
0.125	-	-	-	-
0.25	-	-	-	-
0.5	32.13 ± 3.52	67.30 ± 8.45	42.85 ± 5.56	73.33 ± 7.12
1.0	158.0 ± 6.82	238.1 ± 1.51	180.7 ± 5.32	240.70 ± 4.33
2.0	364.8 ± 1.26	436.6 ± 7.03	374.1 ± 1.90	454.48 ± 1.90

본 발명에 따르면 발효된 캐모마일을 함유하는조성물을 적용할 수 있는 약제학적 조성물로서의 적용 예는 다음과 같다.

항산화 효과를 갖는 본 발명의 조성물은 지질 산화로 인해 발생할 수 있는 염증, 노화, 암 및 심혈관 질환 등의 발생을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용할 수 있다. 바람직한 발효 캐모마일 추출물의 농도는 총 조성물 대비 2.0 mg/mL의 범위 내외에서 첨가하여 유통시키는 것이다.

Claims (1)

1. 미생물에 의해 발효된 캐모마일 및 그 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항산화 효과를 갖는 약제학적 조성물
   
   

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