KR20160052363A - 쯔쯔가무시병에 대한 면역 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쯔쯔가무시병 면역 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 쯔쯔가무시병 면역 조성물은 세균 유래 구조를 가져 효과적으로 면역 반응을 유발할 수 있어 종래의 쯔쯔가무시균을 사용하는 면역 조성물보다 면역원성을 효과적으로 유발할 수 있으므로, 쯔쯔가무시병을 예방할 수 있는 면역 조성물을 제공하는 효과가 있다.

Description

쯔쯔가무시병에 대한 면역 조성물 및 이의 제조방법{immunogenic compositions against Scrub typhus and method of producing thereof}

본 발명은 쯔쯔가무시병 면역 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 쯔쯔가무시균 유래 물질을 포함하고, 종래 쯔쯔가무시균보다 안전하고 효과적으로 면역 반응을 유발할 수 있어 임상에서 사용하기 적합한 쯔쯔가무시병 면역 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

쯔쯔가무시병은 국내에서 매년 6,000 여명의 환자가 발생하고 있으며, 항생제 치료가 적절히 이루어지지 않으면 사망에 이르게 된다. 이로 인한 사회 경제적 손실이 매우 크며, 기후변화로 인한 잠재적인 확산에 대한 대비가 요구됨에 따라 쯔쯔가무시병에 대한 백신 개발이 절실히 필요하다.

쯔쯔가무시병은 전세계적으로 발생하며, 특히 말레이지아, 태국, 필리핀 등을 포함하여 중국, 일본 및 호주에서 빈발하고 있는데, 국내에서는 농촌 지방에서 괴질이라 불리어온 병에 걸린 환자 중 다수가 쯔쯔가무시병 환자임이 알려지게 되었다. 쯔쯔가무시병은 주로 가을철에 발생하는데 이는 주로 매개충인 털진드기 유충(chigger)의 밀도와 관련된 것으로, 우리 나라에서도 렙토트롬비디움 팔리둠 (Leptotrombidium pallidum)의 유충이 많이 출현하는 10 ~ 11 월에 전지역에 걸쳐서 많이 발생하고 있다.

또한, 오리엔티아 쯔쯔가무시(O. tsutsugamushi; 쯔쯔가무시균)는 그람음성간균으로 절대세포내(obligated intracellular) 기생생활을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 쯔쯔가무시균은 쯔쯔가무시병(Scrub typhus)의 원인균으로서, 급성만성 감염으로 그 증상으로는 폐렴(pnemonitis), 뇌염(encephalitis), 발진, 발열 및 두통 등을 포함한다. 또한, 쯔쯔가무시병의 증후 및 증상은 다른 치명적인 열병(febrile illness), 예를 들어 렙토스피라증(leptospirosis), 발진열(murine typhus), 말라리아 등과 비슷하기 때문에 이들과 쯔쯔가무시병을 구별하는 것은 매우 어려울 수 있다. 쯔쯔가무시병으로 인한 평균 사망률은 6%이며, 항균제 치료를 하지 않으면 사망률이 60%에 이르는 위중한 질병이다. 효과적인 항균제 치료로 사망률은 개선되었으나, 치료 시작이 늦거나 고령자에서 쇼크, 호흡부전, 뇌염 등의 중증 합병증으로 인해 사망할 수 있으며, 치료 후에도 전신권태감, 근육통이 수개월간 지속되기도 한다. 따라서, 쯔쯔가무시병을 효과적으로 예방할 수 있는 면역 조성물의 개발이 시급한 실정이다.

이에 대한 종래 기술들 중, 공개특허 특2002-0020281(공개일자: 2002년03월15일)에는 오리엔티아쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원결정기로부터 유래된 2 종 이상의 단백의 유전자를 연결한 DNA를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 균주를 배양하여 얻어지는 유전자 재조합 단백질 항원을 이용하여 쯔쯔가무시병을 진단하는 방법을 기재하고 있다.

상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명은 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 세균 유래 구조를 가지면서, 효과적으로 면역 반응을 유발할 수 있는 쯔쯔가무시병 면역 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 상기 쯔쯔가무시병 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 쯔쯔가무시균(O. tsutsugamushi) 유래 외막소포(outer membrane vesicle)를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 면역 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 외막소포는 평균 직경이 20 ~ 200 ㎚일 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 면역 조성물은 쯔쯔가무시균의 20 ~ 110 kDa 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 면역 조성물은 쯔쯔가무시균의 56kDa 단백질(Type specific antigen 56)을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 쯔쯔가무시균 유래 외막소포 단백질과 56kDa 단백질을 포함하는 면역 조성물은 면역원성에 대한 상승효과를 나타내는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 세포에 쯔쯔가무시균(O. tsutsugamushi)을 감염시키고 감염된 세포를 배양하여 배양된 감염 세포를 수득하는 단계; 상기 배양된 감염 세포에서 감염 세포가 없는 배양 상청액을 수득하는 단계; 및 상기 배양 상청액을 여과 및 분리하여 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계; 를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 면역 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계는 배양 상청액을 기공 평균 직경 0.1 ~ 0.3 ㎛인 여과막으로 여과하는 단계; 아지드화 나트륨 첨가 및 한외 여과(ultra-filtration)를 수행하여 농축물을 수득하는 단계; 및 상기 농축물을 여과, 원심분리 및 재부유하여 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계; 를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 농축물을 여과, 원심분리 및 재부유하는 공정을 2 ~ 6회 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포는 쯔쯔가무시균의 20 ~ 110 kDa 단백질을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 쯔쯔가무시균(O. tsutsugamushi) 유래 외막소포(outer membrane vesicle)를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 쯔쯔가무시균(O. tsutsugamushi) 유래 외막소포(outer membrane vesicle) 및 56kDa 단백질(Type specific antigen 56)을 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 쯔쯔가무시병 면역 조성물은 세균 유래 구조를 가져 효과적으로 면역 반응을 유발하며, 종래의 쯔쯔가무시균을 사용하는 면역 조성물보다 면역원성을 효과적으로 유발할 수 있으므로, 쯔쯔가무시병을 예방할 수 있는 면역 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 실시예 4에서 실시예 1의 쯔쯔가무시균에 감염된 세포 펠렛을 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2는 실시예 3에서 수득한 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포의 TEM 사진이다.
도 3은 FS15 단일클론항체를 이용한 쯔쯔가무시균 용해물(O. tsutsugamushi lysates) 및 실시예 3에서 수득·정제된 쯔쯔가무시균 외막소포의 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 4는 쯔쯔가무시 환자 혈청에서 분리한 다클론항체(polyclonal antibody)를 이용한 쯔쯔가무시균 용해물(O. tsutsugamushi lysates) 및 실시예 3에서 수득·정제된 쯔쯔가무시균 외막소포의 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 5는 FS15 단일클론항체를 이용하여 면역침강법(immnoprecipitation)으로 정제한 쯔쯔가무시균 유래 외막소포의 웨스턴블롯 분석(쯔쯔가무시 환자 혈청에서 분리한 다클론항체(polyclonal antibody) 이용) 결과이다.
도 6은 계단 희석된 쯔쯔가무시균 외막소포를 면역형광법으로 관찰한 사진이다.
도 7은 56kDa을 항원으로 처리하여, 각 실험군의 혈청에 대하여 ELISA 분석을 실시한 결과이다(G1 : OMV 투여군, G2 : 56kDa 투여군, G3 : OMV + 56kDa 투여군, G4 : PBS + Alum 투여군).

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 쯔쯔가무시병은 이로 인한 사회 경제적 손실이 매우 크며, 기후변화로 인한 잠재적인 확산에 대한 대비가 요구됨에 따라 이에 대하여 효과적으로 면역력을 조성할 수 있는 면역 조성물 개발이 절실히 필요하다.

이에, 본 발명은 쯔쯔가무시균 유래 외막소포(outer membrane vesicle)를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 면역 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 쯔쯔가무시균은 학명 O. tsutsugamushi로 기재되는 균일 수 있으며, 바람직하게는 실시예 1에 기재된 바와 같이, 쯔쯔가무시균 보령 항원형(NCCP NO. 14794)일 수 있다.

상기 외막 소포는 평균 직경이 20 내지 200nm인 것일 수 있으며, 상기 면역 조성물은 쯔쯔가무시균의 20 내지 110 kDa 단백질을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 쯔쯔가무시균의 외막소포 용해물에 대하여 웨스턴 블롯을 실시하였으며, 42 kDa, 47 kDa, 56 kDa, 70kDa, 80 kDa 및 110 kDa 크기의 단백질을 발견하였다. 또 다른 본 발명의 일실시예에서는 56kDa 단백질을 외막소포단백질과 함께 혼합하여 투여할 경우, 월등히 높은 면역원성 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 쯔쯔가무시균 유래 외막소포에 56kDa 외막단백질을 추가로 포함하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 세포에 쯔쯔가무시균(O. tsutsugamushi)을 감염시키고 감염된 세포를 배양하여 배양된 감염 세포를 수득하는 단계; 상기 배양된 감염 세포에서 감염 세포가 없는 배양 상청액을 수득하는 단계; 및 상기 배양 상청액을 여과 및 분리하여 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계; 를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 면역 조성물 제조방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이로 인해, 쯔쯔가무시균 유래 물질을 포함하고, 내독소(endotoxin)로 작용하는 지질다당류(LPS; lipopolysaccharide) 및/또는 펩티도글리칸(peptidoglycan)를 포함하지 않아 종래 쯔쯔가무시균보다 안전하게 임상에서 사용할 수 있는 쯔쯔가무시병 면역 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

먼저, 세포에 쯔쯔가무시균(O. tsutsugamushi)을 감염시키고 감염된 세포를 배양하여 배양된 감염 세포를 수득하는 단계를 설명한다.

상기 세포는 통상적으로 세균을 배양 및 정제하는데 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 혈관내피세포(ECV304), 섬유아세포(L929), VERO 세포, L-929 세포, HEL 세포, MRC5 세포, HeLa 세포, BHK 세포, McCoy 세포 등의 세포를 이용할 수 있다.

상기 감염은 통상적으로 병원균을 이용하여 세포를 감염시키는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 세포와 쯔쯔가무시균을 혼합하고 35 ~ 40 ℃에서 100 ~ 200시간 동안 배양하여 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 쯔쯔가무시균과 세균을 1 : 3 ~ 10 세포 면적비로 혼합하고 36 ~ 38 ℃에서 150 ~ 180시간 동안 배양하여 수행할 수 있다.

만약, 35 ℃ 미만에서 배양할 경우, 쯔쯔가무시균의 성장 속도가 감소하여 효과적인 배양이 수행되지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 40 ℃를 초과하는 온도에서 배양할 경우, 숙주세포 및 쯔쯔가무시균의 성장에 문제가 발생할 수 있다.

또한, 만약, 100시간 미만으로 배양할 경우, 균증식의 제한에 따른 외막소포의 생산량이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 200 시간을 초과하여 배양할 경우, 생성된 외막소포의 불안정화가 유발되는 문제가 발생할 수 있다.

다음으로, 상기 배양된 감염된 세포에서 감염 세포가 없는 배양 상청액을 수득한다.

상기 배양된 감염세포에서 감염된 세포가 없는 배양 상청액을 수득하는 방법은 통상적으로 배양 배지에서 상청액과 배양 세포를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 10,000 ~ 20,000 rpm으로 10 ~ 60 분 동안 원심분리를 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 11,000 ~ 18,000 rpm으로 15 ~ 40 분 동안 원심분리할 수 있다.

만약, 10,000 rpm 미만으로 원심분리할 경우, 감염세포의 부분적인 파쇄물들이 배양 상청액에 혼합되는 문제가 발생할 수 있으며, 20,000 rpm을 초과하는 회전수로 원심분리할 경우, 쯔쯔가무시균 외막소포 입자들을 수득하기 힘든 문제가 발생할 수 있다.

또한, 만약, 10분 미만으로 원심분리할 경우, 감염세포 또는 감염세포 유래 입자들이 쯔쯔가무시균 외막소포와 혼합되어 쯔쯔가무시균 외막소포 정제가 용이하지 않은 문제가 발생할 수 있으며, 60 분을 초과하는 시간 동안 원심분리할 경우, 쯔쯔가무시균 외막소포 입자들이 유실되는 문제가 발생할 수 있다.

다음으로, 상술한 바와 같이 수득한 감염 세포가 없는 배양 상청액을 여과 및 분리하여 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득한다.

상기 여과는 통상적으로 배양액을 여과하는데 사용할 수 있는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 기공 평균 직경 0.1 ~ 0.3 ㎛인 여과막으로 여과할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 기공 평균 직경 0.15 ~ 0.28 ㎛인 여과막으로 여과할 수 있다.

만약, 여과막의 기공 평균 직경이 0.1 ㎛ 미만일 경우, 쯔쯔가무시균 외막소포 입자들이 유실되는 문제가 발생할 수 있으며, 여과막의 기공 평균 직경이 0.3 ㎛를 초과할 경우, 감염 세포 유래 물질들이 오염되는 문제가 발생할 수 있다.

상기 분리는 통상적으로 혼합물에서 침전물을 수득하기 위해 사용할 수 있는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 100,000 ~ 250,000 g로 원심분리 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 120,000 ~ 220,000 g로 원심분리 할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 여과 및 분리하여 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계는 배양 상청액을 기공 평균 직경 0.1 ~ 0.3 ㎛인 여과막으로 여과하는 단계; 아지드화 나트륨 첨가 및 한외 여과(ultra-filtration)를 수행하여 농축물을 수득하는 단계; 및 상기 농축물을 여과, 원심분리 및 재부유하여 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계; 를 포함할 수 있다.

상기 아지드화 나트륨 첨가는 통상적으로 배양액에 첨가할 수 있는 양이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 용액 전체 부피 대비 0.005 ~ 0.05 부피%로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 용액 전체 부피 대비 0.01 ~ 0.03 부피%로 첨가할 수 있다.

만약, 용액 전체 부피 대비 0.005 부피% 미만의 아지드화 나트륨을 첨가할 경우, 쯔쯔가무시균 이외의 미생물에 의해 오염되는 문제가 발생할 수 있으며, 0.05 부피%를 초과하는 양의 아지드화 나트륨을 첨가할 경우, 다음 단계인 정제 과정에서 과량의 아지드화 나트륨으로 인해 다양한 문제가 발생할 수 있다.

상기 한외 여과(ultra-filtration)은 통상적으로 세균 또는 세포를 분리하는데 사용할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 기공의 평균 직경이 50 ~ 500 kDa의 여과막을 이용하여 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 기공의 평균 직경이 70 ~ 200 kDa의 중공사막을 이용하여 수행할 수 있다.

만약, 기공의 평균 직경이 50 kDa 미만의 여과막을 사용할 경우, 농축 시간이 길어짐으로써 쯔쯔가무시균 외막소포 입자들이 변형되는 문제가 발생할 수 있으며, 기공의 평균 직경이 500 kDa을 초과하는 여과막을 사용할 경우, 쯔쯔가무시균 외막소포 입자들이 유실되는 문제가 발생할 수 있다.

상기 농축물을 여과, 원심분리 및 재부유하여 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 방법은 통상적으로 배양배지 및/또는 배양액에서 세균을 분리 및/또는 정제하는데 사용되는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.

본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 상기 여과, 원심분리 및 재부유는 농축물을 평균 기공 직경이 0.05 ~ 0.4 ㎛인 여과막으로 여과하고, 100,000 ~ 250,000 g로 원심분리한 후 인산완충식염수(PBS)로 재부유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, 상기 농축물을 여과, 원심분리 및 재부유하는 공정은 1회 이상, 바람직하게는 2 ~ 6회 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계는 더욱 순도 높은 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하기 위하여, 면역침강법을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, FS15 마우스 단일클론항체 및 단백질 G 마그네틱비드를 사용하여, 부유물을 제외한 고순도의 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하였다.

상술한 바와 같은 제조방법으로 수득한 쯔쯔가무시균 외막소포는 평균 직경이 20 ~ 200 ㎚일 수 있으며, 쯔쯔가무시균의 20 ~ 110 kDa 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 56kDa 단백질을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 쯔쯔가무시균 외막소포는 쯔쯔가무시균의 주요 항원이며 표면에 가장 많이 존재하는 것으로 알려진 56 kDa 단백질을 포함하며, 지질다당류(LPS; lipopolysaccharide) 및/또는 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 포함하지 않아 임상에서 보다 안전한 면역 조성물로 사용할 수 있을 것으로 예상된다.

본 발명은 쯔쯔가무시균(O. tsutsugamushi) 유래 외막소포(outer membrane vesicle)를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 쯔쯔가무시균(O. tsutsugamushi) 유래 외막소포(outer membrane vesicle) 및 56kDa 단백질(Type specific antigen 56)을 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 쯔쯔가무시균은 학명 O. tsutsugamushi로 기재되는 균일 수 있으며, 바람직하게는 실시예 1에 기재된 바와 같이, 쯔쯔가무시균 보령 항원형(NCCP NO. 14794)일 수 있다.

본 발명의 상기 56kDa 단백질은 쯔쯔가무시균의 외막에 존재하는 56kDa 단백질을 가리키며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 단백질일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 추가로, 제약상 허용되는 담체 및 아주반트로 구성될 수 있다. "아주반트"란 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증강시켜 주는 역할을 하는 물질이다. 면역 아주반트는 예를 들어, 없거나 또는 약한 항체 역가 또는 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것과 같이, 단독 투여시에는 약한 면역원성을 띠는 항원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있고, 항원에 대한 항체 역가를 증가시킬 수 있고, 개체에서 면역 반응을 달성하는 데 효과적인 항원의 용량을 감소시킬 수 있다. 따라서, 아주반트는 대개 면역 반응을 증가시키는 역할을 하며, 이는 당업자에게 주지되어 있다. 조성물의 유효성을 증강시켜 주는 적합한 아주반트로는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:

(1) 알루미늄 염 (명반), 예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등; (2) 수중유 에멀젼 제제 (예를 들어, 무라밀 펩티드 (하기에서 정의됨) 또는 박테리아 세포벽 성분과 같은 다른 특이적인 면역자극제를 함유하거나 함유하지 않음), 예를 들어, (a) 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈(Tween) 80, 및 0.5% 스판(Span) 85 (임의로 다양한 양의 MTP-PE 함유)를 함유하며, 마이크로플루다이저, 예를 들어, 모델 110Y 마이크로플루다이저 (마이크로플루이딕스(Microfluidics: 미국 메사추세츠주 뉴턴))를 사용하여 마이크로미터 미만의 입자로 제제화된 MF59 (국제 특허 출원 공개 공보 번호 WO 90/14837 참조), (b) 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-블럭 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하며, 마이크로미터 미만의 에멀젼으로 미세유동화되거나, 또는 와동에 의해 입자 크기가 더 큰 에멀젼으로 형성된 SAF, (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 (미국 특허 번호 4,912,094에 기술된 3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A (MPL™), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM) 및 세포벽 골격 (CWS)로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL + CWS (디톡스(Detox)™)를 함유하는 리비(Ribi)™ 아주반트 시스템 (RAS) (코릭사(Corixa: 미국 몬태나주 해밀턴)); 및 (d) 몬타니드(Montanide) ISA; (3) 사포닌 아주반트, 예를 들어, 퀼 A(Quil A) 또는 스티뮬론(STIMULON)™ QS-21 (안티제닉스(Antigenics: 미국 메사추세츠주 프레이밍햄)) (예를 들어, 미국 특허 번호 5,057,540 참조) (상기의 것이 사용될 수 있음), 또는 그로부터 생성된 입자, 예를 들어, ISCOM (콜레스테롤, 사포닌, 인지질, 및 양친매성 단백질의 조합에 의해 형성된 면역자극 복합체) 및 (본질적으로 ISCOM과 구조는 동일하지만, 상기 단백질은 포함하지 않는 것인) 이스코매트릭스(Iscomatrix); (4) 박테리아 리포폴리사카라이드 , 합성 지질 A 유사체 (예를 들어, 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 (AGP), 또는 그의 유도체 또는 유사체 (이는 코릭사로부터 이용가능하며, 미국 특허 번호 6,113,918에 기술되어 있다) (상기와 같은 한 AGP로는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3--테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노-b-D-글루코피라노시드가 있으며 이는 또한 529로 알려져 있으며 (이전에는 RC529로 알려짐), 이는 수성 형태 또는 안정한 에멀젼으로서 제제화된다), (5) 합성 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, CpG 모티프(들)를 함유하는 올리고뉴클레오티드 (미국 특허 번호 6,207,646); 및 (6) 시토카인, 예를 들어, 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 공동자극 분자 B7-1 및 B7-2 등; 및 (7) 보체, 예를 들어, 보체 성분 C3d의 삼량체.

백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합될 수 있다. 이러한 부형제는 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올, 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 백신 조성물은 추가의 보조 물질, 예를 들어 습윤제, 유화제, pH 완충제 등을 포함할 수 있다. 상기와 같은 백신 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다.

투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 국소 투여, 점막내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

투여량은 투여형태, 투여경로, 연령, 건강, 체중, 중증도, 현재 치료법의 종류, 치료 횟수 등에 따라 변화될 수 있으며, 면역 조성물이 투여되었을 때 발현되는 면역원성에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 근육 조직에 직접 투여하는 경우, 면역학적 또는 예방학적으로 효과적인 양은 약 1㎍ 내지 5mg, 바람직하게는 약 10㎍ 내지 2mg이다.

본 발명의 백신 조성물은 단독 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있고 병용 투여하는 경우, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 하나 이상의 방법에 의해, 예를 들어, 비경구적으로, 경점막으로, 근육내로, 정맥내로, 진피내로, 비내로, 피하로, 복강내로 대상체에게 투여될 수 있고, 그에 따라 제제화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단일 용량 바이알, 다중 용량 바이알로서, 또는 사전 충전된 주사제로서 제제화될 수 있다.

이하, 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

세포 배양 및 쯔쯔가무시균의 감염

쯔쯔가무시균 보령 항원형(O. tsutsugamushi Boryong serotype), 질병관리본부 자원관리본부 NCCP NO. 14794)을 ECV-304 세포(혈관내피세포주, Cell Line Service, 독일)에 접종한 후, 37 ℃에서 7일 동안 배양하여 균의 증식을 유도하였다. 쯔쯔가무시균에 감염된 ECV-304 세포는 10 %(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum, 미국 corning cellgro사 제품)을 포함하는 M199(한국 웰진사 제품) 배양배지(culture medium)를 이용하여 배양하였다.

상기 감염된 ECV-304 세포의 배양 정도는 간접 면역형광검사 방법(indirect immunofluorescence assay; IFA)으로 측정하였고, 90% 이상의 감염률이 확인되면 5개의 150 ㎜ 조직 배양 접시의 ECV 304 세포에 다시 감염시키고 위의 방법으로 감염이 확인된 세포는 쯔쯔가무시균 외막소포의 대량생산을 위하여 30개의 150 ㎜ 조직 배양 접시(tissue culture dish, 한국 SPL사 제품)에 다시 감염시켰다.

이후 배양된 감염 세포는 배양 배지에서 부유시키고, 4 ℃에서 13,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 감염 세포가 없는 배양 상청액과 쯔쯔가무시균에 감염된 세포 펠렛으로 분리하였다.

쯔쯔가무시균의 정제

실시예 1의 쯔쯔가무시균에 감염된 EVC-304 세포는 33 mM 트리-하이드로클로라이드(tri-hydrochloride)와 250 mM TS-버퍼로 표시한 수크로스(sucrose)를 포함하는 pH 7.4 용액으로 재부유되고, 직경 1㎜의 유리구슬을 이용하여 1분간 세포를 갈아서 세포 내에 있는 쯔쯔가무시 균이 세포 밖으로 나오도록 유도한다. 수득한 쯔쯔가무시균을 4 ℃에서 1200 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고 쯔쯔가무시균 현탁액을 수득하였다. 수득한 쯔쯔가무시균 현탁액은 90 % 퍼콜(percoll; 미국 GE life science사 제품)을 40 % 퍼콜 밀도의 농도가 될 때까지 첨가하고, 14,000 rpm으로 60 분 동안 원심분리하여 세포 유래 찌꺼기 층과 균으로만 구성된 층으로 분리하였다. 수득한 쯔쯔가무시균 층을 모아서 인산완충식염수(Phosphate bufferd saline; PBS)로 2회 세척하고, 살균 인산완충식염수로 재부유시킨 후 액화 질소를 사용하여 동결하여 정제한 쯔쯔가무시균을 수득하였다.

쯔쯔가무시균 외막소포 정제

실시예 1에서 수득한 감염 세포가 없는 배양 상청액 900 ㎖은 기공 평균 직경이 0.22 ㎛인 필터 시스템(미국 corning사 제품)을 사용하여 여과한 후 아지드화 나트륨(Sodium azide) 0.02 부피% 첨가하고 4 ℃에서 QuixStandBenchtop system(미국 GE healthcare life sciences사 제품)과 100 kDa 중공사막(hollow fiber membrane)을 이용하여 50 ㎖까지 농축하였다. 이후 농축물은 0.22 ㎛ 실린지 필터(미국 Pall life science사 제품)을 통해 여과하고, 여과물은 4 ℃에서 3 시간 동안 150,000g로 원심분리하여 쯔쯔가무시균 외막소포 펠렛(O. tsutsugamushi outer membrane vesicle pellet)을 수득하였다. 이후 수득한 쯔쯔가무시균 외막소포 펠렛을 더 정제하기 위해서 1 ㎖ 인산완충식염수(PBS)로 재부유시키고, 0.22 ㎛ 실린지 필터(미국 Pall life science사 제품)로 여과하였다.

총 용량 13.2 ㎖의 한외여과 튜브에 2.5 M의 수크로스 3 ㎖, 1.6 M의 수크로스 3 ㎖, 0.6 M의 수크로스 3 ㎖를 포함하는 수크로스 용액을 순차적으로 적층하였고(sucrose gradient) 이후 인산완충식염수로 재부유된 상기 여과물 1 ㎖을 수크로스 기울기(sucrose gradient)에 조심스럽게 얹어서 이후 튜브는 4 ℃에서 Beckman SW 41 Ti rotor을 이용하여 200,000g로 20 시간 동안 원심분리한 후 상층으로부터 1 ㎖씩 분리하였다. 분리한 용액들은 10% 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 에 120 V 전압으로 1시간 20분간 전기영동(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 수행하였다. 전기영동한 한 장의 젤은 쿠마시 블루 염색 용액(Coomassie blue staining -INVITROGEN)에 30 분간 담그고 이후 증류수에 30 분간 담구어 탈색시킨 후 단백질의 밴드 양상을 확인하였고, 다른 한 장은 1시간 10 분간 110 V 전압으로 폴리플루오린화비닐리덴(PVDF) 막으로 단백질 밴드를 옮긴 후 1차 항체인 쯔즈가무시 항원에 대하여 상보적인 FS15 항체(anti-TSA56, type specific membrane antigen of O. tsutsugamushi, 인하대학교 의과대학 미생물학교실 강재승 교수 연구실)로 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 PBST(Phosphate buffered saline with 0.1% tween20) 버퍼로 3회 세척하고 FS15에 반응하는 2차 항체(FITC conjugated anti mouse IgG, JACKSON Lab.)로 25 ℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 다시 PBST 버퍼로 3회 세척하고 막에 2차 항체의 HRP(horse radish peroxidase)와 반응할 수 있는 기질액인 화학발광(enhanced chemiluminescence; ECL) 용액(미국 GE Life Science사 제품)을 뿌려준 뒤, X-ray(KODAK)필름에 1분간 감광시켜서 밴드의 양상을 관찰하였다.

이후 웨스턴 블롯 분석 결과, 유사 단백질 개요를 보이는 분리 용액들을 혼합한 후 4 ℃에서 150,000g로 3 시간 동안 원심분리하여 쯔쯔가무시균 외막소포(OMV) 펠렛을 수득하였다. 수득한 쯔쯔가무시균 OMV 펠렛은 1X 프로테아제억제제혼합제(protease inhibitor cocktail, 미국 Sigma-Aldrichi사 제품)를 포함하는 인산완충식염수로 재부유하였다. 재부유한 쯔쯔가무시균 OMV 펠렛은 DC 단백질 어세이 시약(DC protein assay reagents, 미국 Bio-Rad사 제품)을 사용하여 정량한 다음, -70 ℃에서 보관하였다.

쯔쯔가무시균 수포 및 쯔쯔가무시균 OMV 관찰

4-1 : 쯔쯔가무시균의 수포(blebbing) 관찰

쯔쯔가무시균의 수포(blebbing)를 관찰하기 위해, 실시예 1의 쯔쯔가무시균에 감염된 세포 펠렛을 0.1 M 인산염(phosphate, pH 7.4)을 포함하는 2.5 % 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 2시간 동안 고정하였다. 쯔쯔가무시균에 감염된 EVC-304 세포 펠렛은 세척한 후 1% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)에 30분 동안 정치하고, 에탄올로 탈수하고, 빔 캡슐(Beam capsule)에 에폭시 수지(영국 Electron Microscope Sciences사 제품, 제품명: Epon 812)와 함께 채웠다. 울트라씬(ultrathin) 구역은 초박편제작기(ultramicrotome, 미국 Reichert-Jung사 제품, 제품명: UltraE)로 절단하고, 아세트산 우라닐(uranyl acetate) 및 구연산염(citrate)으로 착색했다. 이후 전자 현미경(electron microscope, CM200 transmission electron microscope (Phillips, Netherlands))으로 관찰하여 쯔쯔가무시균 감염을 확인하였다. 관찰결과는 도 1에 나타냈다.

도 1을 통해서 확인할 수 있는 바와 같이, 쯔쯔가무시균에 감염된 세포 펠렛을 전자현미경으로 관찰한 결과, 쯔쯔가무시균에 감염된 세포의 표면에서 외막소포(outer membrane vesicle)가 분비되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 쯔쯔가무시균에 감염된 세포 주변에 쯔쯔가무시균으로부터 유래한 것으로 여겨지는 단일막 소포(single membrane vesicle)를 확인할 수 있었다.

나아가, 도 1에서 확인되는 외막소포의 크기는 약 130 ㎚였다.

4-2 : 쯔쯔가무시균의 OMV 관찰

실시예 3에서 수득한 정제된 쯔쯔가무시균의 OMV 관찰을 위해, 상기 실시예 3의 정제된 쯔쯔가무시균 중 일부를 샘플로 200 메쉬(mesh)의 탄소 코팅된 구리 그리드(CF200-Cu carbon film, Electron Microscopy Sciences)에 5 분 동안 정치하였다. 상기 구리 그리드는 1% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)로 착색했다. 이후 공기 중에 건조하고, CM200 투과형 전자현미경(transmission electron microscopy; TEM, 네덜란드 Phillips사 제품)으로 관찰하였다. 관찰 결과인 TEM 사진은 도 2에 나타냈다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 정제한 쯔쯔가무시균 OMV는 구형이며 비교적 다양한 크기인 50 ~ 150 ㎚의 소포체를 확인할 수 있었으며, 단일막으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.

쯔쯔가무시균 외막소포 단백질 확인

실시예 2에서 수득한 정제한 쯔쯔가무시균은 얼음 수조의 인산완충수용액과 초음파 기기(미국 Fisher사 제품, 모델명: Sonic Dismemrator model 300) 30㎑의 초음파를 10초 동안 10번 처리하였다. 이후 5 분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리하고, 쯔쯔가무시균용해물(lysates)의 단백질 농도를 바이신코닉 산 단백질 어세이 키트(bicinchoninic acid protein assay kit, DC protein assay reagents, Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하고, -70 ℃에서 보관하였다.

상기 쯔쯔가무시균 용해물 및 실시예 3에서 수득한 쯔쯔가무시균 외막소포(OMV)의 단백질 크기를 확인하고 실제 외막소포 단백질이 맞는지 확인하기 위해 쯔쯔가무시 항원에 상보적인 FS15 항체를 이용하여 웨스턴블롯을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

또한, 본 발명의 쯔쯔가무시균 외막소포(OMV)를 이용하였을 때 쯔쯔가무시 환자 혈청에 포함된 폴리클로날 항체(polycolnal antibody; 쯔쯔가무시균의 항원에 대해 상보적인 항체)를 이용하여 웨스턴블롯을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 폴리클로날 항체는 웨스턴블롯 분석법 수행을 위해 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 환자의 혈청(sera)으로부터 정제하였으며, 상기 환자의 유전자형은 제노텍(Genotech, 한국 대전 소재 기업)에서 쯔쯔가무시 보령 유전자형(boryong genotype)으로 판명되었다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 상기에서 분리한 쯔쯔가무시균 용해물에 외막소포 단백질이 포함되어있으며, 실시예 3에서 정제한 단백질이 쯔쯔가무시균 유래 외막소포(OMV)인 것을 확인하였다. 또한, 42 kDa, 47 kDa, 56 kDa, 70kDa, 80 kDa 및 110 kDa의 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 쯔쯔가무시 환자 혈청에 포함된 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴블롯을 수행한 결과, 쯔쯔가무시균 용해물의 경우 다양한 크기의 쯔쯔가무시균 항원 단백질이 포함된 것을 확인하였고, 실시예 3에서 분리한 쯔쯔가무시균 유래 외막소포는 주로 56kDa을 포함한 다른 항원에 해당하는 단백질로 구성된 것을 확인하였다.

즉, 상기 결과에 나타난 바와 같이, 쯔쯔가무시균 외막소포는 환자의 혈청에 포함된 쯔쯔가무시균에 대한 폴리클로날 항체와 결합하는 것으로 보아, 본 발명의 쯔쯔가무시병 면역조성물을 이용하면, 쯔쯔가무시균의 56kDa과 기타 다른 단백질에 대한 항체 생성을 유도할 수 있어, 쯔쯔가무시균에 대한 면역력을 증가시킬 수 있다.

즉, 56 kDa 크기의 외막 단백질을 포함하는 쯔쯔가무시균의 외막소포는 주로 감염된 세포 밖으로 분비되어, 쯔쯔가무시병 면역조성물을 제조하는데 적합하다는 것을 의미한다.

면역침강법 분석 및 웨스턴 블롯 분석

실시예 3에서 분리한 쯔쯔가무시균 외막소포(OMV)에 포함된 단백질의 면역침강법(immunoprecipitation)을 수행하기 위해, FS15 마우스 단일클론항체(mouse monoclonal antibody)는 단백질 G 마그네틱비드(protein G magnetic Beads, 영국 BioLabs사 제품) 10 ㎕와 혼합하고, 1 시간 동안 25 ℃에서 60rpm으로 교반하면서 배양하였다. 이후 IP 버퍼(25 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris) pH7.5, 150 mMNaCl, 2.5 mM 에틸렌 디아민테트라아세틱 산(ethylene diaminetetraacetic acid; EDTA), 0.05% Triton X-100 및 0.01% NaN₃을 포함)로 3회 세척한 다음, FS15 항체가 결합된 마그네틱 G 비드를 수득하였다.

쯔쯔가무시균 외막소포 및 쯔쯔가무시균 용해물에 각각 상기에서 수득한 FS15 항체가 결합된 마그네틱 G 비드를 혼합한 다음, 4 ℃에서 24 시간 동안(또는 하룻밤 동안) 교반하면서 혼합하여 혼합액을 수득하였다. 수득한 혼합액은 IP 버퍼로 4번 세척하고, 인산완충수용액으로 세척하였다.

펠렛은 감소 샘플 버퍼(50 mMTris-Cl pH 6.8, 100 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT) 2% 도데실 황산 나트륨(SDS; Sodium dodecyl sulfate), 0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 10% 글리세롤(glycerol)을 포함) 용액에서 100 ℃로 10 분 동안 가열하여 가용화시킨(solubilized) 시킨 다음, 4 ℃에서 10 분 동안 14,000 rpm으로 원심분리한 후 가용성 단백질을 수득하였다.

수득한 가용성 단백질 중 일부는 -20 ℃에서 보관하고, 일부는 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(10% Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 수행한 다음, 쯔쯔가무시 환자 혈청에 포함된 폴리클로날 항체를 이용하여 웨스턴블롯을 수행하였으며, 상기 실시예 6의 면역침강을 수행하지 않는 샘플을 비교예로 같이 로딩하여 실험을 수행하였다.

웨스턴블롯은 실시예 3에 제시된 방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 2차 항체는 겨자무화과산효소(horseradish peroxidase; HRP)-컨쥬게이트 2차 항체(미국 Jackson Immunoresearch Laboratories사 제품)를 사용하여 1 시간 동안 25 ℃에서 배양하였다. 이후 배양한 막은 PBST 용액으로 3번 세척하고, 화학발광(enhanced chemiluminescence; ECL) 용액(미국 GE Life Science사 제품)으로 현상했으며, 그 결과는 도 5에 나타냈다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, FS15 항체로 면역침강을 수행하여 환자 혈청유래 항체를 이용하여 웨스턴블롯을 수행한 결과, 쯔쯔가무시균 용해물의 경우 42 kDa, 47 kDa, 56 kDa, 70kDa, 80 kDa 및 110 kDa 크기의 단백질이 주로 발현되는 것을 확인하였으며, 이는 쯔쯔가무시의 주요한 외막단백질로 알려진 22, 47, 56, 70, 110 kDa과 매우 유사한 것을 확인할 수 있었다. 쯔쯔가무시 유래 외막소포의 경우, 쯔쯔가무시균의 주요 항원이며 표면에 가장 많이 존재하는 것으로 알려진 56 kDa 단백질 밴드가 쯔쯔가무시균 유래 외막소포에서도 진하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 56 kDa 단백질은 쯔쯔가무시균의 감염 병인에 중요한 역할을 하는 것으로, 쯔쯔가무시균의 세포막에 주로 존재한다. 즉, 쯔쯔가무시균의 가장 중요한 항원의 하나로써, 세포에 부착하고 침투하는 역할을 하게 된다. 이에, 56 kDa 단백질에 대한 항체는 중화항체의 역할을 하여, 방어 면역에 중요한 역할을 수행하게 된다.

56kDa 재조합 단백질의 분리 및 정제

7-1 : 56kDa(Type specific antigen 56) 유전자의 증폭

56kDa 단백질의 88 번째부터 479 번까지의 아미노산에 해당하는 유전자 부위(서열번호 1)를 증폭시키기 위해 쯔쯔가무시 전체 유전자를 주형으로 아래의 프라이머쌍으로 유전자증폭 기법을 (PCR) 이용하여 얻고자 하는 유전자부위를 증폭하였다.

프라이머	염기서열	서열 번호
TSA56 forward primer	5`-GTGAATTCGTCGACAGAGCAGAGCATAGGT-3`	2
TSA56 reverse primer	5`-GTAAGCTTCTCGAGTCAATACCCTTTAACATCC3`	3

7-2 : 56kDa 클로닝과 과발현

6개의 히스티딘(Histidine) 잔기가 결합된 56kDa 단백질의 과발현을 위하여 pRSET-A 벡터(Invitrogen, USA)에 증폭된 유전자를 넣어 주기 위해 벡터를 EcoR I과 Xho I 제한효소로 (TAKARA, Japan) 처리하고 연결효소를 (NEB biolab, UK) 이용하여 유전자와 벡터를 연결시켰다. 재조합 단백질을 얻기 위해 BL21 (DE3) 대장균에 형질도입을 수행하여 암피실린 항생제가 들어 있는 LB 한천 접시에 고르게 펴서 발라준 후 37℃에서 하룻밤 놓아두었다. 여러 개의 콜로니들 중 하나를 골라서 암피실린이 들어있는 LB 액체 배지 6 ml에 넣고 37℃에서 200 rpm으로 교반하여 하룻밤 동안 배양하였다. 500ml의 LB 액체 배지에 위에서 준비한 포화된 대장균을 5ml 넣어서 600nm 에서의 흡광도가 0.5가 되는 시점에 과발현을 위하여 0.2mM IPTG (SIGMA, USA) 를 넣어 주고 37℃에서 3시간 동안 200 rpm 으로 교반하였다.

7-3 : 56kDa 단백질의 정제

과발현된 대장균을 5000 rpm으로 15분간 원심분리하여 모으고 분해 버퍼 (Lysis buffer : 50mM Tris pH=8.0, 100mM NaCl, 0.1% NaN3, 0.1 % TX-100, 0.1mM PMSF, 1mM DTT) 30 ml 로 현탁시켰다. 부유액을 초음파 파쇄기를 이용하여 (70%) 10초간 3회 동안 파쇄 한 후 12000rpm으로 20분간 원심하여 펠렛 부분에서 재조합 단백질이 포함된 대장균의 단백질 혼합액을 얻는다. 재조합 단백질의 정제를 위하여 펠렛을 용해버퍼 (PBS, 0.5mM DTT, 0.05% TX-100, 8M UREA) 10 ml로 현탁 시킨 후 부유액을 초음파 파쇄기를 이용하여 (70%) 10초간 3회 동안 파쇄한 후 12000rpm으로 20분간 원심하여 상청액을 얻었다. Ni-NTA가 결합된 아가로즈 비즈(Invitrogen, USA)가 채워진 컬럼(아가로즈 비즈의 부피는 4ml)에 위의 상층액을 붓고 불필요한 단백질의 제거를 위해 세척액(분해버퍼와 조성이 같으며, pH= 6.3)을 40 ml 씩 3번 흘려주었다. 원하는 히스티딘이 결합된 56kDa 단백을 얻기 위해 용출 버퍼(분해버퍼와 조성이 같고, pH= 4.5)를 6개의 튜브에 각각 4 ml 씩 흘려주면서 모았다. 각 분획을 10% SDS-PAGE 젤에 전기영동을 실시하여 양과 순도가 적절한 튜브를 선정하여 56kDa 단백질을 정제하였다. 이 용액에서 8M UREA를 순차적으로 제거하기 위해 3kDa 크기의 구멍을 가지고 있는 삼투압비닐 (PIERCE, USA)에 넣어서 정제에 사용된 용액과 조성이 같고 UREA의 농도만 4M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M, 0.1M 순서대로 낮춰가면서 각각의 농도에서 24시간 동안 투석을 한다. 투석이 끝나면 엔도톡신의 농도가 0.05EU/ml의 농도가 되도록 제거하였다(Genescript, USA).

56kDa 단백질의 면역원성에 대한 동물 실험

8-1 : 실험 동물 준비

본 실시예 8에서는 실시예 2에서 수득·정제한 쯔쯔가무시균의 면역원성을 확인하기 위하여, 동물실험을 수행하였다. 본 연구와 유사한 연구를 실시한 참고문헌에 따르면 각 군당 3 마리 내지 5마리의 마우스를 사용하였으므로, 이를 근거로 본 실험예에서는 각 군당 5마리의 마우스를 이용하였다.

마우스는 6 내지 8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 오리엔트바이오에서 구입하였다. 구입한 마우스는 청정동물시설의 환경기준에 적합한 SPF (specific pathogen free)시설에서 사육하였다. 실험동물의 윤리적 사용을 위해 3R 원칙을 준수하였으며, 인하대학교의 동물실험윤리위원회 규정하에서 동물실험을 실시하였다.

8-2 : 쯔쯔가무시 균 유래 외막소포의 면역원성 평가를 위한 동물 실험 실시

쯔쯔가무시 균 유래 외막소포의 면역원성을 평가하기 위하여 하기 실험 프로토콜대로 동물 실험을 실시하였다.

OMV 및 56kDa의 면역원성을 평가 실험 프로토콜

번호	실험군	투약 조성	접종 간격
1	OMV	OMV (80 μg) +2% Alum (50 ul)	2주 간격 3회
2	56kDa	56kDa (20 μg) + 2% Alum (50 ul)	2주 간격 3회
3	OMV + 56kDa	OMV(80μg) + 56kDa(20μg) + 2% Alum (50 ul)	2주 간격 3회
4	Alum +PBS	2% Alum (50ul) + PBS (50 ul)	2주 간격 3회
5	PBS	PBS (100 ul)	2주 간격 3회

상기 표 2에 기재된 OMV는 쯔쯔가무시균 유래 외막소포 단백질(O. tsutsugamushi derived outer membrane vesicles)이고, IA는 면역 증강제(Immune Adjuvant)이며, 본 실험에서 면역증강제로 알루미늄 염(Alum)이 사용되었다. 또한, OMV는 실시예 3에서 정제한 외막소포체 단백질을 의미하며, 56kDa은 실시예 7에서 정제한 쯔쯔가무시균 외막 단백질이다. 또한, PBS는 인삼 완충 식염수(Phosphate buffer saline)이다.

상기 사용된 OMV, 56kDa은 2% 알하이드로겔 어쥬반트(인비트로젠)와 PBS를 각각 1:1로 희석하여 최종 부피가 100 ul가 되도록 하였다. 상기 표 2에 기재된 프로토콜대로 2주 간격으로 3회 복부 피하주사(subcutaneous injection)하였다. 그 후, 2주 후에 혈액 샘플을 채취하여 ELISA와 IFA 분석을 통해 면역원성을 평가하였다. 면역원성 확인 방법으로는 면역형광법과 ELISA 분석법을 이용하여 면역원성을 확인하였다.

8-3 : 면역형광법을 이용한 면역원성 확인

먼저, 면역형광법을 이용하여 면역원성을 확인하였다. 단백질 항원을 가지는 균이 도말된 유리 슬라이드에 1:1280까지 계단 희석한 마우스 혈청을 반응시키고, FITC-결합 항-마우스 IgG와 반응시킨 후 형광현미경으로 항체의 생성 유무를 관찰하였다.

그 결과, 현미경으로 관찰한 사진은 도 6에 나타내었으며, 하기 표 3에 보이는 바와 같이, OMV를 주사한 마우스에서 모두 쯔쯔가무시균 양성결과를 확인하였고, 대부분 1:640이상의 높은 역가를 보였다. 반면 Alum, PBS를 투여한 대조군에서는 쯔쯔가무시균에 대한 반응이 없었다. 즉, 표 3에서 알 수 있듯이 OMV를 이용하여 쯔쯔가무시균에 대한 면역원성을 유발할 수 있음을 확인하였다.

면역형광법을 이용한 OMV 접종 후의 면역원성 결과

실험 군		결과
OMV with IA	1	1:640
	2	1:640
	3	1:1280
	4	1:1280
	5	1:1280
Alum + PBS		non-reactive
PBS		non-reactive

8-4 : ELISA를 이용한 면역원성 확인

다음으로, ELISA의 실험 방법으로, 면역원성 확인을 위한 단백질 항원을 96웰 플레이트에 코팅한 후 마우스 혈청을 1:1280까지 계단 희석하였고, 이를 96웰 플레이트에 분주하여 반응시켰다. 그 후 HRP-결합 항-마우스 IgG를 반응시키고, HRP에 대한 기질을 첨가하여 반응시켰다. 마지막으로 파장측정기(BioTek Instruments, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 56kDa 단백질을 이용한 ELISA검사에서 OMV를 주사한 마우스 그룹1에서 평균 OD값은 0.25, 56kDa 단백질을 주사한 그룹2에서 평균 OD값은 0.39였다. OMV와 56kDa 단백질을 함께 투여한 그룹3의 평균 OD값은 0.93으로 OMV와 56kDa단백질을 각각 투여한 그룹보다 월등히 상승함을 볼 수 있다. 콜비 공식으로 효과를 평가하였을 때, 하기 수학식 1로 나타난 바와 같이, 실측값은 0.93으로 기대치 보다 45.3%의 증가된 값으로 상승작용을 확인하였다.

[수학식 1]

이로써, 마우스 실험 그룹 1의 결과로 OMV를 사용하여 56kDa 단백질에 대한 면역원성을 확인하였고, 이와 함께 마우스 실험 그룹 3의 결과로 OMV가 병합 투여한 56kDa 단백질의 면역원성 형성에 상승적으로 작용한다는 것을 확인하였다.

상기 실시예를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 쯔쯔가무시균 유래 외막소포에는 쯔쯔가무시균에서 가장 중요한 항원인 56 kDa 항원과 다른 여러 항원들을 포함하고 있는 것을 확인하였다. 또한, 그람음성균주임에도 불구하고 외막에 지질다당류(LPS; lipopolysaccharide) 및/또는 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 포함하지 않는 것으로 알려진 쯔쯔가무시균 유래 외막소포는 임상에서 보다 안전한 백신이나 백신 보조제로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> immunogenic compositions against Scrub typhus and method of producing thereof <130> 1040662 <150> KR 10-2014-0148624 <151> 2014-10-29 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated Br56 sequence <400> 1 agagcagagc taggtgttat gtaccttaga aatataagcg ctgaggttga agtaggtaaa 60 ggcgaggtag attctaaagg tgagataaag gcagattctg gaggtgggac agatgctcct 120 atacgtaagc cgtttaaact tacaccacct cagcctacta tgatgcctat aagtatagct 180 gatcgtgact ttgggattga tattcctaac atacctcagg cgcaagcgca agctgcacag 240 cctccgctta atgatcagaa gcgtgctgca gctaggatcg cttggttaaa gaattgtgct 300 ggtattgact atatggtgaa ggatcctaat aatcctgggc atatgatggt aaatccggtg 360 ttgttaaata ttccacaggg caaccctaat cctgttggac agccaccgca gcgagcaaat 420 cagcctgcaa attttgcgat acataaccat gagcaatgga ggagtttggt agttggtctt 480 gctgcattat caaatgctaa taaacctagc gcttctcctg tcaaagtttt gagtgacaaa 540 attattcaga tatatagtga tataaagcca tttgctgata tagctggtat taatgttcct 600 gatactggtt tgcctaatag tgcatctatc gaacagatac agagtaaaat ccaagaatta 660 ggtgatacat tggaagaact cagagattct tttgatgggt atattaataa tgcttttgtt 720 aatcagatac acttgaattt tgtcatgccg ccgcaagcac agcaacagca ggggcaaggg 780 cagcaacagc aagctcaagc tacagcgcaa gaagcagtag cagcagcagc tgttaggctt 840 ttaaatggca gtgatcagat tgcgcagtta tataaagatc ttgttaaatt gcagcgtcat 900 gcaggaatta ggaaagccat ggaaaaatta gctgcccaac aagaagaaga tgcaaagaat 960 caaggtaaag gtgactgcaa gcagcaacaa ggagcatctg aaaaatctaa agaaggaaaa 1020 gtcaaagaaa cagagtttga tctgagtatg gttgttggcc aagttaaact ctatgctgac 1080 ctagttacaa ctgaatcatt ctcaatatac ggtggtgttg gtgcagggtt agcttatact 1140 tatggaaaaa tagataataa ggatgttaaa gggtat 1176 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSA56 forward primer <400> 2 gtgaattcgt cgacagagca gagcataggt 30 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSA56 reverse primer <400> 3 gtaagcttct cgagtcaata ccctttaaca tcc 33

Claims (11)

1. 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi) 유래 외막소포(outer membrane vesicle)를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 면역 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 외막소포는 평균 직경이 20 ~ 200 ㎚인 것을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 면역 조성물은 쯔쯔가무시균의 20 ~ 110 kDa 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 면역 조성물은 쯔쯔가무시균의 56kDa 단백질(Type specific antigen 56)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 56kDa 단백질을 추가로 포함하는 면역 조성물은 면역원성에 대한 상승효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물.
6. 세포에 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi)을 감염시키고 감염된 세포를 배양하여 배양된 감염 세포를 수득하는 단계;
   상기 배양된 감염 세포에서 감염 세포가 없는 배양 상청액을 수득하는 단계; 및
   상기 배양 상청액을 여과 및 분리하여 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계;
   를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 면역 조성물 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포를 수득하는 단계는 배양 상청액을 기공 평균 직경 0.1 ~ 0.3 ㎛인 여과막으로 여과하는 단계;
   아지드화 나트륨 첨가 및 한외 여과(ultra-filtration)를 수행하여 농축물을 수득하는 단계; 및
   상기 농축물을 여과, 원심분리 및 재부유하여 쯔쯔가무시균 외막소포외막소포를 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 농축물을 여과, 원심분리 및 재부유하는 공정을 2 ~ 6회 수행하는 것을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물 제조방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 정제된 쯔쯔가무시균 외막소포는 쯔쯔가무시균의 20 ~ 110kDa 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물 제조방법.
10. 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi) 유래 외막소포(outer membrane vesicle)를 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 예방용 약학적 조성물.
11. 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi) 유래 외막소포(outer membrane vesicle) 및 56kDa 단백질(Type specific antigen 56)을 포함하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus) 예방용 약학적 조성물.

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