JP2017535603A - ツツガムシ病に対する免疫組成物およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ツツガムシ病の免疫組成物およびその製造方法に関し、本発明のツツガムシ病の免疫組成物は、細菌由来の構造を有することで効果的に免疫反応を誘発することができ、従来のツツガムシ病リケッチアを使用する免疫組成物よりも免疫原性を効果的に誘発することから、ツツガムシ病を予防することができる免疫組成物を提供する効果がある。
Description
本出願は、２０１４年１０月２９日付で出願された韓国特許出願第１０‐２０１４‐０１４８６２４号および２０１５年１０月２８日付で出願された韓国特許出願第１０‐２０１５‐０１５０４９９号を優先権として主張しており、前記明細書全体は、本出願の参考文献である。
本発明は、ツツガムシ病の免疫組成物およびその製造方法に関し、より詳細には、ツツガムシ病リケッチア由来物質を含み、従来のツツガムシ病リケッチアより安全で効果的に免疫反応を誘発することができ、臨床での使用に適するツツガムシ病の免疫組成物およびその製造方法に関する。
ツツガムシ病は、韓国で毎年６，０００名あまりの患者が発生しており、抗生剤の治療が適切に行われないと死亡に至ることになる。これによる社会経済的な損失が非常に大きく、気候変化による潜在的な拡散に対する対策が求められるにつれて、ツツガムシ病に対するワクチンの開発が切実に必要とされている。
ツツガムシ病は、全世界で発生しており、特に、マレーシア、タイ、フィリピンなどをはじめ、中国、日本およびオーストラリアで頻発しているが、韓国では、農村地方で奇病と呼ばれて来た病気にかかった患者の多数がツツガムシ病患者であることが分かるようになった。ツツガムシ病は、主に秋期に発生するが、これは、主に媒介昆虫であるツツガムシ（ｃｈｉｇｇｅｒ）の密度と関連しており、韓国でもフトゲツツガムシ（Ｌｅｐｔｏｔｒｏｍｂｉｄｉｕｍ ｐａｌｌｉｄｕｍ）の幼虫が多数出現する１０〜１１月に全地域にわたり多く発生している。
また、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ；ツツガムシ病リケッチア）は、グラム陰性菌であり、絶対細胞内（ｏｂｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）寄生生活をすると知られている。また、ツツガムシ病リケッチアは、ツツガムシ病（Ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）の原因菌であり、急性慢性感染でその症状としては、肺炎（ｐｎｅｍｏｎｉｔｉｓ）、脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、発疹、発熱および頭痛などが挙げられる。また、ツツガムシ病の症侯および症状は、他の致命的な熱病（ｆｅｂｒｉｌｅ ｉｌｌｎｅｓｓ）、例えば、レプトスピラ症（ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ）、発疹熱（ｍｕｒｉｎｅ ｔｙｐｈｕｓ）、マラリアなどに類似しているため、これらとツツガムシ病を区別することは非常に難しいことがある。ツツガムシ病による平均死亡率は６％であり、抗菌剤の治療をしなければ死亡率が６０％に至る重い疾病である。効果的な抗菌剤の治療で死亡率は改善したものの、治療の開始が遅れた場合や高齢者の場合は、ショック、呼吸不全、脳炎などの深刻な余病によって死亡に至ることがあり、治療後にも全身倦怠感、筋肉痛が数ヶ月間続くことがある。そのため、ツツガムシ病を効果的に予防するための免疫組成物の開発が至急求められている。
これに関する従来技術のうち、韓国公開特許特２００２‐００２０２８１（公開日：２００２年０３月１５日）には、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）の抗原決定基から由来する２種以上のタンパクの遺伝子を連結したＤＮＡを含むベクターで形質転換した菌株を培養して得られる遺伝子組み換えタンパク質抗原を用いてツツガムシ病を診断する方法を記載している。
本発明は、上述の問題を解決するために導き出されたものであり、本発明の第一の解決しようとする課題は、細菌由来の構造を有し、且つ、効果的に免疫反応を誘発することができるツツガムシ病の免疫組成物およびその製造方法を提供することである。
本発明の第二の解決しようとする課題は、前記ツツガムシ病の予防および治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明の第三の解決しようとする課題は、前記ツツガムシ病の予防および治療用薬学的組成物製造のための用途を提供することである。
本発明の第四の解決しようとする課題は、前記ツツガムシ病の予防および治療用薬学的組成物をこれを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とするツツガムシ病の予防および治療方法を提供することである。
本発明は、ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）免疫組成物を提供する。
本発明の一実施例によれば、前記外膜小胞は、平均直径が２０〜２００ｎｍであってもよい。
本発明の他の一実施例によれば、前記免疫組成物は、ツツガムシ病リケッチアの２０〜１１０ｋＤａタンパク質を含むことができる。
本発明のさらに他の一実施例によれば、前記免疫組成物は、ツツガムシ病リケッチアの５６ｋＤａタンパク質（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）をさらに含むものであってもよい。
本発明のさらに他の一実施例によれば、ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞タンパク質と５６ｋＤａタンパク質を含む免疫組成物は、免疫原性に対する相乗効果を示すものであってもよい。
また、本発明は、細胞にツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）を感染させ、感染した細胞を培養し、培養した感染細胞を取得するステップと、前記培養した感染細胞から感染細胞がない培養上清液を取得するステップと、前記培養上清液を濾過および分離し、精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップと、を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）免疫組成物の製造方法を提供する。
本発明の一実施例によれば、前記精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップは、培養上清液を気孔の平均直径０．１〜０．３μｍの濾過膜で濾過するステップと、アジ化ナトリウムの添加および限外濾過（ｕｌｔｒａ‐ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行って濃縮物を取得するステップと、前記濃縮物を濾過、遠心分離および再懸濁してツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップと、を含むことができる。
本発明の他の一実施例によれば、前記濃縮物を濾過、遠心分離および再懸濁する工程を２〜６回行うことができる。
本発明のさらに他の一実施例によれば、前記精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞は、ツツガムシ病リケッチアの２０〜１１０ｋＤａタンパク質を含むことができる。
また、本発明は、ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）予防用薬学的組成物を提供する。
さらに、本発明は、ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）および５６ｋＤａタンパク質（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）予防用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）の予防および治療剤の製造のための用途を提供する。
本発明は、ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）をこれを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とするツツガムシ病の予防および治療方法を提供する。
本発明のツツガムシ病の免疫組成物は、細菌由来の構造を有することで効果的に免疫反応を誘発し、従来のツツガムシ病リケッチアを使用する免疫組成物よりも免疫原性を効果的に誘発することから、ツツガムシ病を予防することができる免疫組成物を提供する効果がある。
以下、本発明をより詳細に説明する。
上述のように、ツツガムシ病は、これによる社会経済的な損失が非常に大きく、気候変化による潜在的な拡散に対する対策が求められるにつれて、これに対して効果的に免疫力を組成できる免疫組成物の開発が切実に必要とされている。
したがって、本発明は、ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）免疫組成物を提供する。
本発明の前記ツツガムシ病リケッチアは、学名Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉで記載する細菌であってもよく、好ましくは、実施例１に記載のように、ツツガムシ病リケッチアＢｏｒｙｏｎｇ抗原型（ＮＣＣＰ ＮＯ．１４７９４）であってもよい。
前記外膜小胞は、平均直径が２０〜２００ｎｍであってもよく、前記免疫組成物は、ツツガムシ病リケッチアの２０〜１１０ｋＤａタンパク質を含むものであってもよい。
本発明の一実施例では、ツツガムシ病リケッチアの外膜小胞溶解物に対してウェスタンブロットを実施しており、４２ｋＤａ、４７ｋＤａ、５６ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａおよび１１０ｋＤａサイズのタンパク質を見出した。さらに他の本発明の一実施例では、５６ｋＤａタンパク質を外膜小胞タンパク質とともに混合して投与する場合、著しく高い免疫原性効果を示すことを確認した。したがって、本発明は、ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞に５６ｋＤａ外膜タンパク質をさらに含むツツガムシ病の免疫組成物を提供する。
また、本発明は、細胞にツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）を感染させ、感染した細胞を培養し、培養した感染細胞を取得するステップと、前記培養した感染細胞から感染細胞のない培養上清液を取得するステップと、前記培養上清液を濾過および分離して精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップと、を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）免疫組成物の製造方法を提供することで、上述の問題の解決を模索した。これにより、ツツガムシ病リケッチア由来物質を含み、内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）として作用するリポ多糖類（ＬＰＳ；ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）および／またはペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）を含まず、従来のツツガムシ病リケッチアより安全に臨床で使用することができるツツガムシ病の免疫組成物およびその製造方法を提供する効果がある。
先ず、細胞にツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）を感染させ、感染した細胞を培養し、培養した感染細胞を取得するステップについて説明する。
前記細胞は、通常、細菌を培養および精製するために使用されるものであれば特に制限されない。例えば、血管内皮細胞（ＥＣＶ３０４）、線維芽細胞（Ｌ９２９）、ＶＥＲＯ細胞、Ｌ‐９２９細胞、ＨＥＬ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭｃＣｏｙ細胞などの細胞を用いることができる。
前記感染は、通常、病原菌を用いて細胞を感染させる方法であれば特に制限されず、好ましくは、細胞とツツガムシ病リケッチアとを混合し、３５〜４０℃で１００〜２００時間培養して行ってもよく、より好ましくは、ツツガムシ病リケッチアと細菌とを１：３〜１０細胞面積比で混合し、３６〜３８℃で１５０〜１８０時間培養して行ってもよい。
万が一、３５℃未満で培養する場合、ツツガムシ病リケッチアの成長速度が減少して効果的な培養が行われない問題が生じ得、４０℃を超える温度で培養する場合、宿主細胞およびツツガムシ病リケッチアの成長に問題が生じ得る。
また、万が一、１００時間未満で培養する場合、菌増殖の制限による外膜小胞の生産量が減少する問題が生じ得、２００時間を超えて培養する場合、生成された外膜小胞の不安定化が誘発される問題が生じ得る。
次に、前記培養した感染した細胞から感染細胞のない培養上清液を取得する。
前記培養した感染細胞から感染した細胞のない培養上清液を取得する方法は、通常、培養培地で上清液と培養細胞を分離する方法であれば特に制限されないが、好ましくは１０，０００〜２０，０００ｒｐｍで１０〜６０分間遠心分離を行ってもよく、さらに好ましくは１１、０００〜１８、０００ｒｐｍで１５〜４０分間遠心分離してもよい。
万が一、１０，０００ｒｐｍ未満で遠心分離する場合、感染細胞の部分的な破砕物が培養上清液に混合される問題が生じ得、２０，０００ｒｐｍを超える回転数で遠心分離する場合、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞粒子の取得が難しいという問題が生じ得る。
また、万が一、１０分未満で遠心分離する場合、感染細胞または感染細胞由来粒子がツツガムシ病リケッチア外膜小胞と混合されてツツガムシ病リケッチア外膜小胞の精製が容易でないという問題が生じ得、６０分を超える時間の間に遠心分離する場合、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞粒子が遺失される問題が生じ得る。
次に、上述のように取得した感染細胞のない培養上清液を濾過および分離し、精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得する。
前記濾過は、通常、培養液を濾過するために使用できる方法であれば特に制限されないが、好ましくは気孔の平均直径０．１〜０．３μｍの濾過膜で濾過してもよく、さらに好ましくは、気孔の平均直径０．１５〜０．２８μｍの濾過膜で濾過してもよい。
万が一、濾過膜の気孔の平均直径が０．１μｍ未満の場合、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞粒子が遺失される問題が生じ得、濾過膜の気孔の平均直径が０．３μｍを超える場合、感染細胞由来物質が汚染する問題が生じ得る。
前記分離は、通常、混合物から沈殿物を取得するために使用できる方法であれば特に制限されないが、好ましくは、１００，０００〜２５０，０００ｇで遠心分離してもよく、さらに好ましくは、１２０，０００〜２２０，０００ｇで遠心分離してもよい。
本発明の一実現例によれば、前記濾過および分離して精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップは、培養上清液を気孔の平均直径０．１〜０．３μｍの濾過膜で濾過するステップと、アジ化ナトリウムの添加および限外濾過（ｕｌｔｒａ‐ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行って濃縮物を取得するステップと、前記濃縮物を濾過、遠心分離および再懸濁してツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップと、を含むことができる。
前記アジ化ナトリウムの添加は、通常、培養液に添加できる量であれば特に制限されないが、好ましくは、溶液の全体積に対して０．００５〜０．０５体積％で添加してもよく、さらに好ましくは溶液の全体積に対して０．０１〜０．０３体積％で添加してもよい。
万が一、溶液の全体積に対して０．００５体積％未満のアジ化ナトリウムを添加する場合、ツツガムシ病リケッチア以外の微生物によって汚染する問題が生じ得、０．０５体積％を超える量のアジ化ナトリウムを添加する場合、次のステップである精製過程で過量のアジ化ナトリウムによって様々な問題が生じ得る。
前記限外濾過（ｕｌｔｒａ‐ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、通常、細菌または細胞を分離するために使用できるものであれば特に制限されないが、好ましくは、気孔の平均直径が５０〜５００ｋＤａの濾過膜を用いて行ってもよく、さらに好ましくは、気孔の平均直径が７０〜２００ｋＤａの中空糸膜を用いて行ってもよい。
万が一、気孔の平均直径が５０ｋＤａ未満の濾過膜を使用する場合、濃縮時間が長くなることでツツガムシ病リケッチア外膜小胞粒子が変形する問題が生じ得、気孔の平均直径が５００ｋＤａを超える濾過膜を使用する場合、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞粒子が遺失される問題が生じ得る。
前記濃縮物を濾過、遠心分離および再懸濁してツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得する方法は、通常、培養培地および／または培養液から細菌を分離および／または精製するために使用される方法であれば特に制限されない。
本発明の他の一実現例によれば、前記濾過、遠心分離および再懸濁は、濃縮物を平均気孔直径が０．０５〜０．４μｍの濾過膜で濾過し、１００，０００〜２５０，０００ｇで遠心分離した後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁することができる。
本発明のさらに他の一実現例によれば、前記濃縮物を濾過、遠心分離および再懸濁する工程は、１回以上、好ましくは２〜６回行うことができる。
また、本発明のツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップは、さらに純度の高いツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するために、免疫沈降法を用いることができる。
本発明のさらに他の一実現例によれば、ＦＳ１５マウスモノクローナル抗体およびタンパク質Ｇマグネチックビーズを使用して、懸濁物質以外の高純度のツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得した。
上述のような製造方法で取得したツツガムシ病リケッチア外膜小胞は、平均直径が２０〜２００ｎｍであってもよく、ツツガムシ病リケッチアの２０〜１１０ｋＤａタンパク質を含んでもよい。好ましくは５６ｋＤａタンパク質を含むものであってもよい。
また、前記ツツガムシ病リケッチア外膜小胞は、ツツガムシ病リケッチアの主要抗原であり、表面に最も多く存在すると知られた５６ｋＤａタンパク質を含み、リポ多糖類（ＬＰＳ；ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）および／またはペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）を含まず、臨床でより安全な免疫組成物として使用できると予想される。
本発明は、ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）予防用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）および５６ｋＤａタンパク質（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）予防用薬学的組成物を提供する。
本発明の前記ツツガムシ病リケッチアは、学名Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉで記載する細菌であってもよく、好ましくは、実施例１に記載のように、ツツガムシ病リケッチアＢｏｒｙｏｎｇ抗原型（ＮＣＣＰ ＮＯ．１４７９４）であってもよい。
本発明の前記５６ｋＤａタンパク質は、ツツガムシ病リケッチアの外膜に存在する５６ｋＤａタンパク質を示し、好ましくは、配列番号１の塩基配列でコードされるタンパク質であってもよい。
本発明の薬学的組成物はさらに、製薬上許容される担体およびアジュバントから構成されてもよい。「アジュバント」とは、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強する役割をする物質である。免疫アジュバントは、例えば、存在しないかまたは弱い抗体力価または細胞媒介免疫反応を誘導することのように、単独投与の際には弱い免疫原性を帯びる抗原に対する免疫反応を増強させることができ、抗原に対する抗体力価を増加させることができ、個体で免疫反応を達成するために効果的な抗原の容量を減少させることができる。したがって、アジュバントは、大体、免疫反応を増加させる役割を果たし、これは当業者にとって周知の事項である。組成物の有効性を増強させるに適するアジュバントとしては、下記を含むが、これに限定されない。
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油型エマルション製剤（例えば、ムラミルペプチド（下記で定義）またはバクテリア細胞壁成分のような他の特異的な免疫刺激剤を含有するか含有しない）、例えば、（ａ）５％スクアレン、０．５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、および０．５％スパン（Ｓｐａｎ）８５（任意に様々な量のＭＴＰ‐ＰＥ含有）を含有し、マイクロフルイダイザー、例えば、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（マイクロフルイディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ：アメリカマサチューセッツ州ニュートン））を使用してマイクロメータ未満の粒子に製剤化したＭＦ５９（国際特許出願公開公報番号ＷＯ９０／１４８３７参照）、（ｂ）１０％スクアレン、０．４％ツイーン８０、５％プルロニック‐ブロック重合体Ｌ１２１、およびｔｈｒ‐ＭＤＰを含有し、マイクロメータ未満のエマルションに微細流動化するか、または渦動によって粒子のサイズがより大きいエマルションに形成されたＳＡＦ、（ｃ）２％スクアレン、０．２％ツイーン８０、および（アメリカ特許番号４，９１２，０９４に記述された３‐Ｏ‐脱アシル化したモノ‐ホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＴＭ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される一つ以上のバクテリア細胞壁成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（デトックス（Ｄｅｔｏｘ）ＴＭ）を含有するリビ（Ｒｉｂｉ）ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（コリザ社（Ｃｏｒｉｘａ：アメリカモンタナ州ハミルトン））；および（ｄ）モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ；（３）サポニンアジュバント、例えば、クイルＡ（Ｑｕｉｌ Ａ）またはスティミュロン（ＳＴＩＭＵＬＯＮ）ＴＭ ＱＳ‐２１（アンティジェニックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ：アメリカマサチューセッツ州フレーミングハム））（例えば、アメリカ特許番号５，０５７，５４０参照）（前記のものが使用され得る）、またはそれより生成された粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質、および両親媒性タンパク質の組み合わせによって形成された免疫刺激複合体）および（本質的にＩＳＣＯＭと構造は同様であるが、前記タンパク質は含まないものである）イスコマトリックス（Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ）；（４）バクテリアリポポリサッカライド、合成脂質Ａ疑似体（例えば、アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体または疑似体（これは、コリザ社から利用可能であり、アメリカ特許番号６，１１３，９１８に記述されている）（前記のような一つのＡＧＰとしては、２‐［（Ｒ）‐３‐テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２‐デオキシ‐４‐Ｏ‐ホスホノ‐３‐Ｏ‐［（Ｒ）‐３‐テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］‐２‐［（Ｒ）‐３‐‐テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ‐ｂ‐Ｄ‐グルコピラノシドがあり、これはまた５２９として知られており（以前はＲＣ５２９として知られた）、これは、水性型または安定したエマルションとして製剤化する）、（５）合成ポリヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（アメリカ特許番号６，２０７，６４６）；および（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１８など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、大食細胞コロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７‐１およびＢ７‐２など；および（７）補体、例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体。
ワクチン組成物は、薬剤学的に許容される賦形剤と混合してもよい。かかる賦形剤は、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、これらの混合物を含んでもよい。また、ワクチン組成物は、更なる補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを含んでもよい。前記のようなワクチン組成物は、液剤、散剤、エアロゾール、カプセル剤、腸溶皮錠剤またはカプセル剤または坐剤の形態で投与することができる。
投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、局所投与、粘膜内投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これに制限されない。経口投与の際、ペプチドは消化されるため経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか胃での分解から保護するように剤形化しなければならない。また、薬剤組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与され得る。
投与量は、投与形態、投与経路、年齢、健康、体重、重症度、現在治療法の種類、治療回数などに応じて変化されてもよく、免疫組成物が投与されたときに発現される免疫原性に応じて異なり得、当業者によって容易に決定され得る。例えば、筋肉組織に直接投与する場合、免疫学的または予防学的に効果的な量は、約１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜２ｍｇである。
本発明のワクチン組成物は、単独投与するか他の治療剤と併用して投与してもよく、併用投与する場合、従来の治療剤と順次または同時に投与してもよい。
本発明の組成物は、当業者に公知の一つ以上の方法によって、例えば、非経口的に、経粘膜に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、鼻腔内に、皮下に、腹腔内に対象体に投与してもよく、それによって製剤化され得る。
本発明の組成物は、単回容量バイアル、多容量バイアルとして、または予め充填された注射剤として製剤化され得る。
以下、実施例と比較例により本発明の構成およびそれによる効果についてより詳細に説明する。しかし、本実施例は、本発明をより具体的に説明するための例示であって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
細胞培養およびツツガムシ病リケッチアの感染
ツツガムシ病リケッチアＢｏｒｙｏｎｇ抗原型（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ Ｂｏｒｙｏｎｇ ｓｅｒｏｔｙｐｅ）、疾病管理本部資源管理本部ＮＣＣＰ ＮＯ．１４７９４をＥＣＶ‐３０４細胞（血管内皮細胞株、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）に接種した後、３７℃で７日間培養して細菌の増殖を誘導した。ツツガムシ病リケッチアに感染したＥＣＶ‐３０４細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、アメリカｃｏｒｎｉｎｇ ｃｅｌｌｇｒｏ社製）を含むＭ１９９（韓国ｗｅｌｇｅｎｅ社製）培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）を用いて培養した。
細胞培養およびツツガムシ病リケッチアの感染
ツツガムシ病リケッチアＢｏｒｙｏｎｇ抗原型（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ Ｂｏｒｙｏｎｇ ｓｅｒｏｔｙｐｅ）、疾病管理本部資源管理本部ＮＣＣＰ ＮＯ．１４７９４をＥＣＶ‐３０４細胞（血管内皮細胞株、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）に接種した後、３７℃で７日間培養して細菌の増殖を誘導した。ツツガムシ病リケッチアに感染したＥＣＶ‐３０４細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、アメリカｃｏｒｎｉｎｇ ｃｅｌｌｇｒｏ社製）を含むＭ１９９（韓国ｗｅｌｇｅｎｅ社製）培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）を用いて培養した。
前記感染したＥＣＶ‐３０４細胞の培養程度は、間接蛍光抗体法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ；ＩＦＡ）で測定しており、９０％以上の感染率が確認されると、５個の１５０ｍｍ組織培養皿のＥＣＶ ３０４細胞にまた感染させ、前記の方法で感染が確認された細胞は、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞の大量生産のために３０個の１５０ｍｍ組織培養皿（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ、韓国ＳＰＬ社製）にまた感染させた。
次に、培養した感染細胞は培養培地で懸濁させ、４℃で１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、感染細胞のない培養上清液とツツガムシ病リケッチアに感染した細胞ペレットとに分離した。
［実施例２］
ツツガムシ病リケッチアの精製
実施例１のツツガムシ病リケッチアに感染したＥＶＣ‐３０４細胞は３３ｍＭトリ‐ハイドロクロライド（ｔｒｉ‐ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と２５０ｍＭ ＴＳ‐バッファーで表示したスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）を含むｐＨ７．４溶液で再懸濁され、直径１ｍｍのガラス玉を用いて１分間細胞を粉砕し、細胞内にあるツツガムシ病リケッチアが細胞外に排出されるように誘導する。取得したツツガムシ病リケッチアを４℃で１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞残渣を除去し、ツツガムシ病リケッチア懸濁液を取得した。取得したツツガムシ病リケッチア懸濁液は、９０％パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ；アメリカＧＥ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を４０％パーコール密度の濃度になるまで添加し、１４，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離して細胞由来残渣層と細菌だけで構成された層とに分離した。取得したツツガムシ病リケッチア層を集めてリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で２回洗浄し、殺菌リン酸緩衝食塩水で再懸濁させた後、液化窒素を使用して凍結し、精製したツツガムシ病リケッチアを取得した。
ツツガムシ病リケッチアの精製
実施例１のツツガムシ病リケッチアに感染したＥＶＣ‐３０４細胞は３３ｍＭトリ‐ハイドロクロライド（ｔｒｉ‐ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と２５０ｍＭ ＴＳ‐バッファーで表示したスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）を含むｐＨ７．４溶液で再懸濁され、直径１ｍｍのガラス玉を用いて１分間細胞を粉砕し、細胞内にあるツツガムシ病リケッチアが細胞外に排出されるように誘導する。取得したツツガムシ病リケッチアを４℃で１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞残渣を除去し、ツツガムシ病リケッチア懸濁液を取得した。取得したツツガムシ病リケッチア懸濁液は、９０％パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ；アメリカＧＥ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を４０％パーコール密度の濃度になるまで添加し、１４，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離して細胞由来残渣層と細菌だけで構成された層とに分離した。取得したツツガムシ病リケッチア層を集めてリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で２回洗浄し、殺菌リン酸緩衝食塩水で再懸濁させた後、液化窒素を使用して凍結し、精製したツツガムシ病リケッチアを取得した。
［実施例３］
ツツガムシ病リケッチア外膜小胞の精製
実施例１で取得した感染細胞のない培養上清液９００ｍｌは気孔の平均直径が０．２２μｍのフィルターシステム（アメリカｃｏｒｎｉｎｇ社製）を使用して濾過した後、アジ化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）０．０２体積％を添加し、４℃でＱｕｉｘＳｔａｎｄＢｅｎｃｈｔｏｐ ｓｙｓｔｅｍ（アメリカＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と１００ｋＤａ中空糸膜（ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて５０ｍｌまで濃縮した。次に、濃縮物は０．２２μｍシリンジフィルター（アメリカＰａｌｌ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で濾過し、濾過物は４℃で３時間１５０，０００ｇで遠心分離し、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞ペレット（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｅｌｌｅｔ）を取得した。次に、取得したツツガムシ病リケッチア外膜小胞ペレットをさらに精製するために、１ｍｌリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁させ、０．２２μｍシリンジフィルター（アメリカＰａｌｌ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で濾過した。
ツツガムシ病リケッチア外膜小胞の精製
実施例１で取得した感染細胞のない培養上清液９００ｍｌは気孔の平均直径が０．２２μｍのフィルターシステム（アメリカｃｏｒｎｉｎｇ社製）を使用して濾過した後、アジ化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）０．０２体積％を添加し、４℃でＱｕｉｘＳｔａｎｄＢｅｎｃｈｔｏｐ ｓｙｓｔｅｍ（アメリカＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と１００ｋＤａ中空糸膜（ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて５０ｍｌまで濃縮した。次に、濃縮物は０．２２μｍシリンジフィルター（アメリカＰａｌｌ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で濾過し、濾過物は４℃で３時間１５０，０００ｇで遠心分離し、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞ペレット（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｅｌｌｅｔ）を取得した。次に、取得したツツガムシ病リケッチア外膜小胞ペレットをさらに精製するために、１ｍｌリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁させ、０．２２μｍシリンジフィルター（アメリカＰａｌｌ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で濾過した。
全容量１３．２ｍｌの限外濾過チューブに２．５Ｍのスクロース３ｍｌ、１．６Ｍのスクロース３ｍｌ、０．６Ｍのスクロース３ｍｌを含むスクロース溶液を順に積層し（ｓｕｃｒｏｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、次に、リン酸緩衝食塩水で再懸濁された前記濾過物１ｍｌをスクロース勾配（ｓｕｃｒｏｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）に慎重に載せ、以降、チューブは４℃でＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ ４１ Ｔｉ ｒｏｔｏｒを用いて２００，０００ｇで２０時間遠心分離した後、上層から１ｍｌずつ分離した。分離した溶液は１０％ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲルに１２０Ｖの電圧で１時間２０分間電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ‐ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を行った。電気泳動した一枚のゲルはクーマシーブルー染色溶液（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ‐ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に３０分間浸け、以降、蒸留水に３０分間浸けて脱色させた後、タンパク質のバンド様相を確認し、他の一枚は１時間１０分間１１０Ｖの電圧でポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜でタンパク質バンドを移した後、１次抗体であるツツガムシ抗原に対して相補的なＦＳ１５抗体（ａｎｔｉ‐ＴＳＡ５６、ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、仁荷大学校医科大学微生物学教室カン・ゼスン教授研究室）で室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ０．１％ｔｗｅｅｎ２０）バッファーで３回洗浄し、ＦＳ１５に反応する２次抗体（ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，ＪＡＣＫＳＯＮ Ｌａｂ．）で２５℃で１時間反応させた。次に、またＰＢＳＴバッファーで３回洗浄し、膜に２次抗体のＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と反応することができる基質液である化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；ＥＣＬ）溶液（アメリカＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を噴霧した後、Ｘ‐ｒａｙ（ＫＯＤＡＫ）フィルムに１分間感光させてバンドの様相を観察した。
以降、ウェスタンブロット分析結果、類似タンパク質概要を示す分離溶液を混合した後、４℃で１５０，０００ｇで３時間遠心分離し、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞（ＯＭＶ）ペレットを取得した。取得したツツガムシ病リケッチアＯＭＶペレットは、１Ｘプロテアーゼ抑制剤混合剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、アメリカＳＩＧＭＡ‐Ａｌｄｒｉｃｈｉ社製）を含むリン酸緩衝食塩水で再懸濁させた。再懸濁したツツガムシ病リケッチアＯＭＶペレットは、ＤＣタンパク質アッセイ試薬（ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔｓ、アメリカＢｉｏ‐Ｒａｄ社製）を使用して定量した後、−７０℃で保管した。
［実施例４］
ツツガムシ病リケッチア小疱およびツツガムシ病リケッチアＯＭＶの観察
４‐１：ツツガムシ病リケッチアの小疱（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）の観察
ツツガムシ病リケッチアの小疱（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）を観察するために、実施例１のツツガムシ病リケッチアに感染した細胞ペレットを０．１Ｍリン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．４）を含む２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で２時間固定した。ツツガムシ病リケッチアに感染したＥＶＣ‐３０４細胞ペレットは、洗浄した後、１％四酸化オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ）に３０分間静置し、エタノールで脱水し、ビームカプセル（Ｂｅａｍ ｃａｐｓｕｌｅ）にエポキシ樹脂（イギリスＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、製品名：Ｅｐｏｎ ８１２）とともに満たした。超薄（ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）区域はウルトラミクロトーム（ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ、アメリカＲｅｉｃｈｅｒｔ‐Ｊｕｎｇ社製、製品名：ＵｌｔｒａＥ）で切断し、酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）およびクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）に着色した。次に、電子顕微鏡（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＣＭ２００ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＰＨＩＬＬＩＰＳ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））で観察し、ツツガムシ病リケッチア感染を確認した。観察結果は図１に示した。
ツツガムシ病リケッチア小疱およびツツガムシ病リケッチアＯＭＶの観察
４‐１：ツツガムシ病リケッチアの小疱（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）の観察
ツツガムシ病リケッチアの小疱（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）を観察するために、実施例１のツツガムシ病リケッチアに感染した細胞ペレットを０．１Ｍリン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．４）を含む２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で２時間固定した。ツツガムシ病リケッチアに感染したＥＶＣ‐３０４細胞ペレットは、洗浄した後、１％四酸化オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ）に３０分間静置し、エタノールで脱水し、ビームカプセル（Ｂｅａｍ ｃａｐｓｕｌｅ）にエポキシ樹脂（イギリスＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、製品名：Ｅｐｏｎ ８１２）とともに満たした。超薄（ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）区域はウルトラミクロトーム（ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ、アメリカＲｅｉｃｈｅｒｔ‐Ｊｕｎｇ社製、製品名：ＵｌｔｒａＥ）で切断し、酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）およびクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）に着色した。次に、電子顕微鏡（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＣＭ２００ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＰＨＩＬＬＩＰＳ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））で観察し、ツツガムシ病リケッチア感染を確認した。観察結果は図１に示した。
図１から確認することができるように、ツツガムシ病リケッチアに感染した細胞ペレットを電子顕微鏡で観察した結果、ツツガムシ病リケッチアに感染した細胞の表面で外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）が分泌することを確認することができた。また、ツツガムシ病リケッチアに感染した細胞周辺にツツガムシ病リケッチアから由来したものと思われる単一膜小胞体（ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を確認することができた。
さらに、図１から確認される外膜小胞のサイズは約１３０ｎｍであった。
４‐２：ツツガムシ病リケッチアのＯＭＶの観察
実施例３で取得した精製されたツツガムシ病リケッチアのＯＭＶを観察するために、前記実施例３の精製されたツツガムシ病リケッチアの一部をサンプルで２００メッシュ（ｍｅｓｈ）の炭素コーティングされた銅グリッド（ＣＦ２００‐Ｃｕ ｃａｒｂｏｎ ｆｉｌｍ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５分間静置した。前記銅グリッドは、１％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）に着色した。次に、空気中で乾燥し、ＣＭ２００透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＥＭ、オランダＰＨＩＬＬＩＰＳ社製）で観察した。観察結果であるＴＥＭ写真は図２に示した。
実施例３で取得した精製されたツツガムシ病リケッチアのＯＭＶを観察するために、前記実施例３の精製されたツツガムシ病リケッチアの一部をサンプルで２００メッシュ（ｍｅｓｈ）の炭素コーティングされた銅グリッド（ＣＦ２００‐Ｃｕ ｃａｒｂｏｎ ｆｉｌｍ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５分間静置した。前記銅グリッドは、１％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）に着色した。次に、空気中で乾燥し、ＣＭ２００透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＥＭ、オランダＰＨＩＬＬＩＰＳ社製）で観察した。観察結果であるＴＥＭ写真は図２に示した。
図２から確認されるように、精製したツツガムシ病リケッチアＯＭＶは、球形であり、比較的様々なサイズの５０〜１５０ｎｍの小胞体を確認することができ、単一膜で構成されていることを確認することができた。
［実施例５］
ツツガムシ病リケッチア外膜小胞タンパク質の確認
実施例２で取得した精製したツツガムシ病リケッチアは、氷水槽のリン酸緩衝水溶液と超音波機器（アメリカＦｉｓｈｅｒ社製、モデル：Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｒａｔｏｒ ｍｏｄｅｌ ３００）３０ｋＨｚの超音波を１０秒間１０回処理した。次に、５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、ツツガムシ病リケッチア溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）のタンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｂｉｏ‐Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて測定し、−７０℃で保管した。
ツツガムシ病リケッチア外膜小胞タンパク質の確認
実施例２で取得した精製したツツガムシ病リケッチアは、氷水槽のリン酸緩衝水溶液と超音波機器（アメリカＦｉｓｈｅｒ社製、モデル：Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｒａｔｏｒ ｍｏｄｅｌ ３００）３０ｋＨｚの超音波を１０秒間１０回処理した。次に、５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、ツツガムシ病リケッチア溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）のタンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｂｉｏ‐Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて測定し、−７０℃で保管した。
前記ツツガムシ病リケッチア溶解物および実施例３で取得したツツガムシ病リケッチア外膜小胞（ＯＭＶ）のタンパク質のサイズを確認し、実際、外膜小胞タンパク質であるか否かを確認するために、ツツガムシ抗原に相補的なＦＳ１５抗体を用いてウェスタンブロットを行い、その結果を図３に示した。
また、本発明のツツガムシ病リケッチア外膜小胞（ＯＭＶ）を用いたときにツツガムシ病患者の血清に含まれたポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｏｌｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ツツガムシ病リケッチアの抗原に対して相補的な抗体）を用いてウェスタンブロットを行い、その結果を図４に示した。
前記ポリクローナル抗体は、ウェスタンブロット分析法を行うためにツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）患者の血清（ｓｅｒａ）から精製しており、前記患者の遺伝子型は、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ（韓国大田所在企業）がツツガムシＢｏｒｙｏｎｇ遺伝子型（ｂｏｒｙｏｎｇ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）であることを判明した。
図３から確認されるように、前記で分離したツツガムシ病リケッチア溶解物に外膜小胞タンパク質が含まれており、実施例３で精製したタンパク質がツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞（ＯＭＶ）であることを確認した。また、４２ｋＤａ、４７ｋＤａ、５６ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａおよび１１０ｋＤａのタンパク質バンドを確認することができた。
図４から確認されるように、ツツガムシ病患者の血清に含まれたポリクローナル抗体を使用してウェスタンブロットを行った結果、ツツガムシ病リケッチア溶解物の場合、様々なサイズのツツガムシ病リケッチア抗原タンパク質が含まれたことを確認しており、実施例３で分離したツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞は、主に５６ｋＤａを含む他の抗原に該当するタンパク質から構成されていることを確認した。
すなわち、前記結果に示されているように、ツツガムシ病リケッチア外膜小胞は、患者の血清に含まれたツツガムシ病リケッチアに対するポリクローナル抗体と結合することから見て、本発明のツツガムシ病の免疫組成物を利用すれば、ツツガムシ病リケッチアの５６ｋＤａとその他のタンパク質に対する抗体生成を誘導することができ、ツツガムシ病リケッチアに対する免疫力を増加させることができる。
すなわち、５６ｋＤａサイズの外膜タンパク質を含むツツガムシ病リケッチアの外膜小胞は、主に感染した細胞外に分泌され、ツツガムシ病の免疫組成物の製造に適するということを意味する。
［実施例６］
免疫沈降法の分析およびウェスタンブロットの分析
実施例３で分離したツツガムシ病リケッチア外膜小胞（ＯＭＶ）に含まれたタンパク質の免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を行うために、ＦＳ１５マウスモノクローナル抗体（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）はタンパク質Ｇマグネチックビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ、イギリスＢｉｏＬａｂｓ社製）１０μｌと混合し、１時間２５℃で６０ｒｐｍで攪拌しながら培養した。次に、ＩＰバッファー（２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００および０．０１％ＮａＮ３を含む）で３回洗浄した後、ＦＳ１５抗体が結合したマグネチックＧビーズを取得した。
免疫沈降法の分析およびウェスタンブロットの分析
実施例３で分離したツツガムシ病リケッチア外膜小胞（ＯＭＶ）に含まれたタンパク質の免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を行うために、ＦＳ１５マウスモノクローナル抗体（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）はタンパク質Ｇマグネチックビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ、イギリスＢｉｏＬａｂｓ社製）１０μｌと混合し、１時間２５℃で６０ｒｐｍで攪拌しながら培養した。次に、ＩＰバッファー（２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００および０．０１％ＮａＮ３を含む）で３回洗浄した後、ＦＳ１５抗体が結合したマグネチックＧビーズを取得した。
ツツガムシ病リケッチア外膜小胞およびツツガムシ病リケッチア溶解物にそれぞれ前記で取得したＦＳ１５抗体が結合したマグネチックＧビーズを混合した後、４℃で２４時間（または一晩）攪拌しながら混合し、混合液を取得した。取得した混合液は、ＩＰバッファーで４回洗浄し、リン酸緩衝水溶液で洗浄した。
ペレットは、減少サンプルバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ‐Ｃｌ ｐＨ ６．８、１００ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、０．１％ブロモフェノールブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）、１０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を含む）溶液で１００℃で１０分間加熱して可溶化した（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ）後、４℃で１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、可溶性タンパク質を取得した。
取得した可溶性タンパク質の一部は−２０℃で保管し、一部はドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ‐ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、ツツガムシ病患者の血清に含まれたポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行い、前記実施例６の免疫沈降を行っていないサンプルを比較例としてともにロードし、実験を行った。
ウェスタンブロットは、実施例３に提示された方法と同様の方法で行い、２次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）‐コンジュゲート２次抗体（アメリカＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用して１時間２５℃で培養した。次に、培養した膜は、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；ＥＣＬ）溶液（アメリカＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で現像しており、その結果は図５に示した。
図５から確認されるように、ＦＳ１５抗体で免疫沈降を行い、患者の血清由来抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果、ツツガムシ病リケッチア溶解物の場合、４２ｋＤａ、４７ｋＤａ、５６ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａおよび１１０ｋＤａサイズのタンパク質が主に発現されることを確認しており、これは、ツツガムシの主な外膜タンパク質として知られた２２、４７、５６、７０、１１０ｋＤａと非常に類似していることを確認することができた。ツツガムシ由来の外膜小胞の場合、ツツガムシ病リケッチアの主な抗原であり、表面に最も多く存在するものと知られた５６ｋＤａタンパク質バンドが、ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞でも濃厚に発現することを確認することができた。
前記５６ｋＤａタンパク質は、ツツガムシ病リケッチアの感染病因に重要な役割をするものであり、ツツガムシ病リケッチアの細胞膜に主に存在する。すなわち、ツツガムシ病リケッチアの最も重要な抗原の一つであり、細胞に付着し浸透する役割をする。これにより、５６ｋＤａタンパク質に対する抗体は、中和抗体の役割をし、防御免疫に重要な役割を行う。
［実施例７］
５６ｋＤａ組み換えタンパク質の分離および精製
７‐１：５６ｋＤａ（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）遺伝子の増幅
５６ｋＤａタンパク質の８８番から４７９番までのアミノ酸に該当する遺伝子部位（配列番号１）を増幅させるために、ツツガムシ全体遺伝子を鋳型で以下のプライマー対で遺伝子増幅法を（ＰＣＲ）用いて得ようとする遺伝子部位を増幅した。
５６ｋＤａ組み換えタンパク質の分離および精製
７‐１：５６ｋＤａ（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）遺伝子の増幅
５６ｋＤａタンパク質の８８番から４７９番までのアミノ酸に該当する遺伝子部位（配列番号１）を増幅させるために、ツツガムシ全体遺伝子を鋳型で以下のプライマー対で遺伝子増幅法を（ＰＣＲ）用いて得ようとする遺伝子部位を増幅した。
７‐２：５６ｋＤａクローニングと過発現
６個のヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基が結合した５６ｋＤａタンパク質の過発現のためにｐＲＳＥＴ‐Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に増幅された遺伝子を組み込むためにベクターをＥｃｏＲ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素で（ＴＡＫＡＲＡ、Ｊａｐａｎ）処理し、連結酵素を（ＮＥＢ ｂｉｏｌａｂ、ＵＫ）用いて遺伝子とベクターとを連結した。組み換えタンパク質を得るために、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌に形質導入を行ってアンピシリン抗生剤が入っているＬＢ寒天皿に均一に展延して塗布してから３７℃で一晩放置した。いくつかのコロニーの一つを選択してアンピシリンが入っているＬＢ液体培地６ｍｌに入れ、３７℃で２００ｒｐｍで攪拌し、一晩培養した。５００ｍｌのＬＢ液体培地に前記で準備した飽和した大腸菌を５ｍｌ入れ、６００ｎｍでの吸光度が０．５になる時点で過発現のために０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を入れ、３７℃で３時間２００ｒｐｍで攪拌した。
６個のヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基が結合した５６ｋＤａタンパク質の過発現のためにｐＲＳＥＴ‐Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に増幅された遺伝子を組み込むためにベクターをＥｃｏＲ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素で（ＴＡＫＡＲＡ、Ｊａｐａｎ）処理し、連結酵素を（ＮＥＢ ｂｉｏｌａｂ、ＵＫ）用いて遺伝子とベクターとを連結した。組み換えタンパク質を得るために、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌に形質導入を行ってアンピシリン抗生剤が入っているＬＢ寒天皿に均一に展延して塗布してから３７℃で一晩放置した。いくつかのコロニーの一つを選択してアンピシリンが入っているＬＢ液体培地６ｍｌに入れ、３７℃で２００ｒｐｍで攪拌し、一晩培養した。５００ｍｌのＬＢ液体培地に前記で準備した飽和した大腸菌を５ｍｌ入れ、６００ｎｍでの吸光度が０．５になる時点で過発現のために０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を入れ、３７℃で３時間２００ｒｐｍで攪拌した。
７‐３：５６ｋＤａタンパク質の精製
過発現した大腸菌を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して集め、分解バッファー（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３，０．１％ ＴＸ‐１００，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ）３０ｍｌで懸濁した。懸濁液を超音波破砕装置を用いて（７０％）１０秒間３回破砕した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心してペレット部分で組み換えタンパク質が含まれた大腸菌のタンパク質混合液を得る。組み換えタンパク質の精製のために、ペレットを溶解バッファー（ＰＢＳ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ ＴＸ‐１００、８Ｍ ＵＲＥＡ）１０ｍｌで懸濁させた後、懸濁液を超音波破砕装置を用いて（７０％）１０秒間３回破砕した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清液を得た。Ｎｉ‐ＮＴＡが結合したアガロースビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）が満たされたカラム（アガロースビーズの体積は４ｍｌ）に前記の上清液を注ぎ、不要なタンパク質を除去するために洗浄液（分解バッファーと組成が同様、ｐＨ＝６．３）を４０ｍｌずつ３回流した。所望のヒスチジンが結合した５６ｋＤａタンパク質を得るために、溶出バッファー（分解バッファーと組成が同様、ｐＨ＝４．５）を６個のチューブにそれぞれ４ｍｌずつ流して集めた。各分画を１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに電気泳動を実施して量と純度が適切なチューブを選定し、５６ｋＤａタンパク質を精製した。この溶液で８Ｍ ＵＲＥＡを順に除去するために、３ｋＤａサイズの孔を有している浸透圧ビニル（ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）に入れ、精製に使用された溶液と組成を同様にし、ＵＲＥＡの濃度だけ４Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、０．２５Ｍ、０．１Ｍの順に減少させてそれぞれの濃度で２４時間透析をする。透析が終了すると、内毒素の濃度が０．０５ＥＵ／ｍｌの濃度になるように除去した（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）。
過発現した大腸菌を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して集め、分解バッファー（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３，０．１％ ＴＸ‐１００，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ）３０ｍｌで懸濁した。懸濁液を超音波破砕装置を用いて（７０％）１０秒間３回破砕した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心してペレット部分で組み換えタンパク質が含まれた大腸菌のタンパク質混合液を得る。組み換えタンパク質の精製のために、ペレットを溶解バッファー（ＰＢＳ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ ＴＸ‐１００、８Ｍ ＵＲＥＡ）１０ｍｌで懸濁させた後、懸濁液を超音波破砕装置を用いて（７０％）１０秒間３回破砕した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清液を得た。Ｎｉ‐ＮＴＡが結合したアガロースビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）が満たされたカラム（アガロースビーズの体積は４ｍｌ）に前記の上清液を注ぎ、不要なタンパク質を除去するために洗浄液（分解バッファーと組成が同様、ｐＨ＝６．３）を４０ｍｌずつ３回流した。所望のヒスチジンが結合した５６ｋＤａタンパク質を得るために、溶出バッファー（分解バッファーと組成が同様、ｐＨ＝４．５）を６個のチューブにそれぞれ４ｍｌずつ流して集めた。各分画を１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに電気泳動を実施して量と純度が適切なチューブを選定し、５６ｋＤａタンパク質を精製した。この溶液で８Ｍ ＵＲＥＡを順に除去するために、３ｋＤａサイズの孔を有している浸透圧ビニル（ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）に入れ、精製に使用された溶液と組成を同様にし、ＵＲＥＡの濃度だけ４Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、０．２５Ｍ、０．１Ｍの順に減少させてそれぞれの濃度で２４時間透析をする。透析が終了すると、内毒素の濃度が０．０５ＥＵ／ｍｌの濃度になるように除去した（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）。
［実施例８］
５６ｋＤａタンパク質の免疫原性に対する動物実験
８‐１：実験動物の準備
本実施例８では、実施例２で取得・精製したツツガムシ病リケッチアの免疫原性を確認するために、動物実験を行った。本研究と類似の研究を実施した参考文献によると、各群当たり３匹〜５匹のマウスを使用したため、これを根拠として本実験例では各群当たり５匹のマウスを用いた。
５６ｋＤａタンパク質の免疫原性に対する動物実験
８‐１：実験動物の準備
本実施例８では、実施例２で取得・精製したツツガムシ病リケッチアの免疫原性を確認するために、動物実験を行った。本研究と類似の研究を実施した参考文献によると、各群当たり３匹〜５匹のマウスを使用したため、これを根拠として本実験例では各群当たり５匹のマウスを用いた。
マウスは、６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスをオリエントバイオ社から購入した。購入したマウスは、清浄動物施設の環境基準に適するＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）施設で飼育した。実験動物の倫理的な使用のために３Ｒ原則を守り、仁荷大学校の動物実験倫理委員会の規定下で動物実験を実施した。
８‐２：ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞の免疫原性の評価のための動物実験の実施
ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞の免疫原性を評価するために、下記の実験プロトコール通りに動物実験を実施した。
ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞の免疫原性を評価するために、下記の実験プロトコール通りに動物実験を実施した。
前記表２に記載のＯＭＶは、ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞タンパク質（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）であり、ＩＡは免疫アジュバント（Ｉｍｍｕｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）であり、本実験において、免疫アジュバントとしてアルミニウム塩（Ａｌｕｍ）が使用された。また、ＯＭＶは、実施例３で精製した外膜小胞体タンパク質を意味しており、５６ｋＤａは、実施例７で精製したツツガムシ病リケッチア外膜タンパク質である。また、ＰＢＳはオタネニンジン緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）である。
前記使用されたＯＭＶ、５６ｋＤａは、２％アルハイドロゲルアジュバント（インビトロジェン）とＰＢＳをそれぞれ１：１に希釈し、最終体積が１００μｌになるようにした。前記表２に記載のプロトコール通りに２週間隔で３回腹部皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。その後、２週後に血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡとＩＦＡ分析により免疫原性を評価した。免疫原性確認方法としては、免疫蛍光法とＥＬＩＳＡ分析法を用いて免疫原性を確認した。
８‐３：免疫蛍光法を用いた免疫原性の確認
先ず、免疫蛍光法を用いて免疫原性を確認した。タンパク質抗原を有する細菌が塗抹されたガラススライドに１：１２８０まで階段希釈したマウス血清を反応させ、ＦＩＴＣ‐結合抗マウスＩｇＧと反応させた後、蛍光顕微鏡で抗体が生成されたか否かを観察した。
先ず、免疫蛍光法を用いて免疫原性を確認した。タンパク質抗原を有する細菌が塗抹されたガラススライドに１：１２８０まで階段希釈したマウス血清を反応させ、ＦＩＴＣ‐結合抗マウスＩｇＧと反応させた後、蛍光顕微鏡で抗体が生成されたか否かを観察した。
結果、顕微鏡で観察した写真は図６に示しており、下記表３に示されているように、ＯＭＶを注射したマウスでいずれもツツガムシ病リケッチア陽性結果を確認しており、ほとんどが１：６４０以上の高い力価を示した。一方、Ａｌｕｍ、ＰＢＳを投与した対照群ではツツガムシ病リケッチアに対する反応がなかった。すなわち、表３から分かるように、ＯＭＶを用いてツツガムシ病リケッチアに対する免疫原性を誘発することができることを確認した。
８‐４：ＥＬＩＳＡを用いた免疫原性の確認
次に、ＥＬＩＳＡの実験方法で、免疫原性確認のためのタンパク質抗原を９６ウェルプレートにコーティングした後、マウス血清を１：１２８０まで階段希釈しており、これを９６ウェルプレートに分注し、反応させた。その後、ＨＲＰ‐結合抗マウスＩｇＧを反応させ、ＨＲＰに対する基質を添加して反応させた。最後に、波長測定装置（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）で４５０ｎｍで吸光度を測定し観察した。
次に、ＥＬＩＳＡの実験方法で、免疫原性確認のためのタンパク質抗原を９６ウェルプレートにコーティングした後、マウス血清を１：１２８０まで階段希釈しており、これを９６ウェルプレートに分注し、反応させた。その後、ＨＲＰ‐結合抗マウスＩｇＧを反応させ、ＨＲＰに対する基質を添加して反応させた。最後に、波長測定装置（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）で４５０ｎｍで吸光度を測定し観察した。
結果、図７に示されているように、５６ｋＤａタンパク質を用いたＥＬＩＳＡ検査でＯＭＶを注射したマウスグループ１において、平均ＯＤ値は０．２５、５６ｋＤａタンパク質を注射したグループ２において、平均ＯＤ値は０．３９であった。ＯＭＶと５６ｋＤａタンパク質をともに投与したグループ３の平均ＯＤ値は０．９３であり、ＯＭＶと５６ｋＤａタンパク質をそれぞれ投与したグループより著しく上昇していることが認められる。コルビー公式で効果を評価すると、下記式１で示されているように、実測値は０．９３であり、期待値よりも４５．３％の増加した値で相乗作用を確認した。
これにより、マウス実験グループ１の結果としてＯＭＶを使用して５６ｋＤａタンパク質に対する免疫原性を確認しており、且つ、マウス実験グループ３の結果としてＯＭＶが併合投与した５６ｋＤａタンパク質の免疫原性の形成に上昇的に作用するということを確認した。
前記実施例から確認することができるように、ツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞には、ツツガムシ病リケッチアにおいて最も重要な抗原である５６ｋＤａ抗原と他の様々な抗原を含んでいることを確認した。また、グラム陰性菌であるにもかかわらず、外膜にリポ多糖類（ＬＰＳ；ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）および／またはペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）を含んでいないと知られたツツガムシ病リケッチア由来の外膜小胞は、臨床でより安全なワクチンやワクチン補助剤として使用できると判断される。
Claims (15)
- ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）に対する免疫組成物。
- 前記外膜小胞は、平均直径が２０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載のツツガムシ病に対する免疫組成物。
- 前記免疫組成物は、ツツガムシ病リケッチアの２０〜１１０ｋＤａタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１に記載のツツガムシ病に対する免疫組成物。
- 前記免疫組成物は、ツツガムシ病リケッチアの５６ｋＤａタンパク質（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載のツツガムシ病に対する免疫組成物。
- 前記５６ｋＤａタンパク質（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）をさらに含む免疫組成物は免疫原性に対する相乗効果を示すことを特徴とする、請求項４に記載のツツガムシ病に対する免疫組成物。
- 細胞にツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）を感染させ、感染した細胞を培養し、培養した感染細胞を取得するステップと、
前記培養した感染細胞から感染細胞がない培養上清液を取得するステップと、
前記培養上清液を濾過および分離し、精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップと、
を含む、ツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）に対する免疫組成物の製造方法。 - 前記精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップは、
培養上清液を気孔の平均直径０．１〜０．３μｍの濾過膜で濾過するステップと、
アジ化ナトリウムの添加および限外濾過（ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行って濃縮物を取得するステップと、
前記濃縮物を濾過、遠心分離および再懸濁してツツガムシ病リケッチア外膜小胞を取得するステップと、
を含むことを特徴とする請求項６に記載のツツガムシ病に対する免疫組成物の製造方法。 - 前記濃縮物を濾過、遠心分離および再懸濁する工程を２〜６回行うことを特徴とする請求項７に記載のツツガムシ病に対する免疫組成物の製造方法。
- 前記精製されたツツガムシ病リケッチア外膜小胞は、ツツガムシ病リケッチアの２０〜１１０ｋＤａタンパク質を含むことを特徴とする請求項６に記載のツツガムシ病に対する免疫組成物の製造方法。
- ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）に対する予防用薬学的組成物。
- ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）および５６ｋＤａタンパク質（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）に対する予防用薬学的組成物。
- ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）の予防および治療剤の製造のための用途。
- ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）をこれを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とするツツガムシ病の予防および治療方法。
- ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）および５６ｋＤａタンパク質（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）を含むツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）の予防および治療剤の製造のための用途。
- ツツガムシ病リケッチア（Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）由来の外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）および５６ｋＤａタンパク質（Ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ５６）をこれらを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とするツツガムシ病の予防および治療方法。
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