KR20160052174A - 만성 폐쇄성 폐 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 만성 폐쇄성 폐 질환의 진단 방법 - Google Patents

만성 폐쇄성 폐 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 만성 폐쇄성 폐 질환의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

COPD 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 COPD 진단 방법을 제공한다. 이에 의하면, 개체의 COPD를 정확하고 민감하게 진단하는데 사용할 수 있다.

Description

만성 폐쇄성 폐 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 만성 폐쇄성 폐 질환의 진단 방법{Composition, kit, and microarray for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease and method for diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease using the same}
만성 폐쇄성 폐 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 만성 폐쇄성 폐 질환의 진단 방법에 관한 것이다.
만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD)은 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환으로, 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis) 등이 속한다. COPD의 주된 원인은 흡연이지만, 흡연뿐만 아니라 유전적 요인 및 환경적 요인들의 복잡한 상호 작용에 의해 COPD가 유발될 수 있다. 유전적 유인으로는 유전자, 기도 과민 반응 등이 관련되고, 환경적 요인으로는 흡연뿐만 아니라 직업성 분진, 화학물질, 실내외 대기 오염 등이 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.
COPD는 폐 기능 검사를 통해 진단하는데, 폐 기능 검사는 폐활량 측정(spirometric measurments)을 기본으로 하고, 폐용적(volume)과 폐용량(capacity)를 측정한다. 폐활량 측정을 통해 1 초 노력성 호기량(forced expiratory volume in 1 second; FEV1)과 노력성 폐활량(forced vital capacity; FVC)을 측정한다. FEV1은 최대한 들이쉰 다음 내쉬는 1 초간의 부피를 말하고, FVC는 개체가 인위적으로 할 수 있는 최대한의 폐활량을 말한다. FEV1 대 FVC의 비율, 즉 1초율(% forced expiratory volume in one second)이 COPD를 진단하기 위한 지표로서 사용된다.
인간 게놈 기반 연구를 통해 FEV1 또는 FVC와 관련되는 유전적 인자들이 확인되고 있다. 그러나, COPD 또는 COPD의 주된 원인인 흡연과 관련된 유전적 인자가 아직 확인되지 않았다.
따라서, 민감도 및 정확도가 우수하고, 유전적 분석을 통해 간편하게 COPD 를 진단하기 위한 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 COPD 진단 방법을 개발할 필요가 있다.
COPD 진단용 조성물을 제공한다.
COPD 진단용 키트를 제공한다.
COPD 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
COPD 진단 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease; COPD) 진단용 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드는 ACN9 유전자에 포함될 수 있다. 용어 "유전자(gene)"는 각각의 형질을 만드는 단위를 의미하고, 형질의 단위에 상응하는 게놈 서열의 영역일 수 있다. 유전자는 조절 영역, 전사 영역, 또는 기타 기능적 서열 영역을 포함할 수 있다. 기능적 서열 영역은 전사되지 않는 인트론(intron)일 수 있다. ACN9 유전자는 포도당신생합성(gluconeogenesis)에 관련된 Acn9 단백질을 암호화하는 핵산이다. ACN9 유전자는 예를 들어 GenBank Accession No. NC_000007.13의 핵산이거나, 또는 GenBank Accession No. NT_007933.16의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산일 수 있다. 상기 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드는 ACN9 유전자의 인트론에 포함된 것일 수 있다.
상기 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티의 위치는 단일 염기 다형성 위치일 수 있다. 용어 "단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)"은 개인과 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태(약 1개/ 1kb)를 말한다. SNP 위치는 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 뉴클레오티드를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 서열번호 1에서 SNP 위치의 뉴클레오티드의 염기는 대립유전자 아데닌(A) 또는 대립유전자 티민(T)일 수 있다. 상기 서열번호 2에서 SNP 위치의 뉴클레오티드의 염기는 대립유전자 시토신(C) 또는 대립유전자 구아닌(G)일 수 있다. 용어 "대립유전자(allele)"는 쌍이 될 수 있는 대립형질의 유전자를 말한다. 상기 대립유전자는 동일한 위치에 존재하는 단일 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 또는 40개 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일 또는 이에 상보적일 수 있다.
상기 프로브(probe)는 표적 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 예를 들어 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 프로브는 DNA, RNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 검출가능한 표지는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 결합된 형광 색소 화합물일 수 있고, 예를 들어 형광 공여체 및 형광 수용체의 FRET(Forter Resonance Energy Transfer) 쌍 일 수 있다. 상기 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 하나의 대립유전자를 포함한 핵산 단편에는 혼성화하지만, 다른 대립유전자를 포함한 핵산 단편에는 혼성화하지 않을 수 있다.
상기 프라이머(primer)는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합 개시점을 제공하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로, 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에 사용되는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 상기 표적 서열에 상보적인 영역과 혼성화된다. 용어 "증폭 (amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 핵산의 증폭은 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환 방법(cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. 등온 증폭 방법은 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification; SDA), 헬리카제 의존적 증폭(helicase dependant amplification; HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭(exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭(recombinase polymerase amplification; RPA), 루프 매개된 증폭(loop mediated amplification; LAMP), 핵산 기반 증폭(nucleic acid based amplification; NASBA 및 TMA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 1개, 또는 2개 이상의 세트로 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 대립유전자 특이적 프라이머일 수 있다. 증폭에 의하여 산물이 증폭되면, 특정 대립유전자가 존재하는 것일 수 있다.
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)는 폐기종(emphysema), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 양상은 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브 또는 프라이머; 및 중합 반응에 필요한 시약을 포함하는 COPD 진단용 키트를 제공한다.
상기 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 프로브, 프라이머, 및 COPD는 전술한 바와 같다.
상기 키트는 중합 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 dNTP, 중합효소, 완충액, 지시약, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 COPD 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 프로브. 프라이머, 및 COPD는 전술한 바와 같다.
마이크로어레이는 기판에 상기 폴리뉴클레오티드가 고정된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 개체의 COPD 진단 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 COPD는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계를 포함한다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 영장류일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 개체는 COPD에 걸린 것으로 의심되는 개체일 수 있다. 상기 개체는 흡연자일 수 있다. 상기 흡연자는 담배를 피우는 행위를 하거나, 간접적으로 담배 연기에 노출된 개체를 포함한다. 상기 흡연자는 흡연 강도 하위 3분위인 개체일 수 있다. 예를 들어, 흡연 강도 하위 3분위는 35 갑년(pack-year; PY), 35 갑년 미만, 1 갑년 내지 35 갑년, 10 갑년 내지 35 갑년, 20 갑년 내지 35 갑년, 또는 30 갑년 내지 35갑년일 수 있다. 갑년은 1 년 동안 하루 한 갑씩 담배를 피웠을 경우를 기준으로 하는 담배 소비량을 말하고, 1 일 당 흡연량 및 흡연한 연수로 산출할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 개체로부터 유래된 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검(biopsy)와 같은 고체 조직(solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수(amniotic fluid), 복수(peritoneal fluid), 또는 세포간질액(interstitial fluid)와 같은 체액(bodily fluid); 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제(fixatives), 영양성분(nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 예를 들어 폐 조직일 수 있다. 폐 조직은 외과 수술에 의해 얻어지거나, 물질적 또는 레이저 등을 통한 광학적 적출에 의해 얻어질 수 있다. 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ACN9 유전자의 전사체의 양은 대조군에 비하여 감소할 수 있다. 대조군은 음성 대조군으로서 COPD 질병에 걸리지 않은 정상인으로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 핵산 시료는 핵산을 포함한 시료일 수 있다. 핵산은 상기 생물학적 시료로부터 분리 또는 정제된 핵산일 수 있다. 생물학적 시료로부터 핵산을 분리 또는 정제하는 방법은 당업계에 알려진 것일 수 있다.
상기 방법은 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계을 포함한다.
용어 "유전자형(genotype)"은 유전적 조성을 말하고, 대립유전자 또는 대립유전자의 존재 상태일 수 있다.
상기 유전자형의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 유전자형의 결정은 예를 들어, 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립유전자 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis), 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism), 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법은 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 대립유전자가 티민(T)인 경우 COPD로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 대립유전자가 구아닌(G)인 경우 COPD로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 개체의 COPD 진단에 필요한 정보를 얻는 방법을 제공한다. 개체의 COPD 진단에 필요한 정보는 폐 기능에 관한 정보일 수 있다.
일 양상에 따른 COPD 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 COPD 진단 방법에 따르면, 개체의 COPD를 정확하고 민감하게 진단하는데 이용할 수 있다.
도 1은 ACN9의 유전자형에 따른 유전자 발현 수준을 나타내는 그래프이다(y 축: FPKM).
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. COPD 환자의 폐 조직에서 차등 발현된 유전자의 확인
1.1. 대상자의 선별
1,000 명의 COPD 환자 및 1,000 명의 정상인을 대상으로 연구를 수행하였다. COPD 환자는 한국 폐쇄성 폐 질환(Korea obstructive lung disease; KOLD) 연구 그룹 또는 아산 COPD(ASANCOPD) 네트워크에 속하는 24개 병원의 폐 클리닉으로부터 모집하였다. 대조군인 정상인은 아산 의료원(Asan Medical Center, Seoul, Korea)에서 건강 검진을 받은 환자들로부터 모집하였다. 정상인은 모두 현재 흡연을 하고 있거나 흡연 유경험자였다. 대상자들은 미국 흉부학회/유럽 호흡기 학회 기준에 따른 폐기능 검사를 받았다. 정상인들은 정상 폐 기능을 갖는 반면에, 정상 COPD 환자들은 기관지확장제 투여 후 FEV1/FVC가 0.7 미만임을 확인하였다. 흡연의 갑년(pack-year; PY), 즉 1 년 동안 하루 한 갑씩 담배를 피웠을 경우를 기준으로 하는 담배 소비량은 1 일 당 흡연량 및 흡연한 연수로 산출하였다. 모든 대상자는 서면 동의를 하였고, 연구 프로토콜은 각각 임상 시험 심사 위원회의 승인을 받았다.
대상자의 기본적인 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
특징 COPD 환자(n=1,000) 정상인 (n=1,000) p 값
남성(%) 977 명(97.7%) 983 명(98.3%) 0.42
연령(평균±SD) 69.2±7.8 57.2±9.5 <0.0001
흡연, PY(평균±SD) 44.9±23.1 34.7±27.8 <0.0001
FEV1(L) 1.64±0.61 3.41±0.68 <0.0001
FEV1, 예측된 % 55.9±18.6 95.9±32.6 <0.0001
FEV1/FVC 48.9±12.1 78.5±22.8 <0.0001
* SD(standard deviation); 표준 편차
표 1에서, FEV1(L)은 1초 노력성 호기량(forced expiratory volume in 1 second; FEV1)을 말하고, FVC은 노력성 폐활량(forced vital capacity; FVC)을 말한다. FEV1/FVC은 1초율(% forced expiratory volume in one second)을 말한다.
표 1에 나타난 바와 같이, COPD 환자는 대조군인 정상인 보다 더 나이가 많고 담배의 갑년이 더 높았다. 또한, COPD 환자가 정상인 보다 낮은 폐 기능을 가졌다.
1.2. 대상 유전자의 선택 및 유전형 분석
한국 개체군 코호트(cohort)의 유전체 전장 연관 연구(Genome Wide Association Study; GWAS) 결과의 메타 분석(meta-analysis)에 기초하여, 13 종의 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 선택하였다. SNP들은 Applied Biosystems 7900HT 실시간 PCR 시스템 상에서 TaqMan technology(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 유전자형을 분석하였다.
13 종의 SNP 중, COPD와 관련성이 있는 것으로 보이는 ACN9의 대립유전자를 하기 표 2에 나타내었다.
SNP
(참조 SNP 클러스터 번호)		 염색체 번호 위치 유전자 참조
대립유전자		 대안적
대립유전자		 MAF 계수
(beta)
rs10231916 7 96763456 ACN9 A T 0.51 -
rs10229181 7 96795041 ACN9 C G 0.51 -
표 2에서, 참조 대립유전자(Reference allele)는 기준 대립유전자를 말하고, 대안적 대립유전자(Alternative allele)는 다형성으로 변이된 대립유전자를 말한다. MAF(minor-allele frequency)는 대립유전자 빈도를 나타낸다. ACN9의 핵산 서열은 GeneBank Accession No. NC_000007의 핵산 서열이다.
ACN9의 SNP인 rs10231916은 dbSNP138 데이터베이스(https://bioq.saclab.net/query/submit.php?db=bioq_dbsnp_human_138)에 따르면 염색체 7의 5' 말단으로부터 96763456번째 뉴클레오티드의 변이로서 ACN9 유전자의 인트론에 위치하고, 핵산의 염기가 아데닌(A) 또는 티민(T)인 다형성을 갖는다. rs10231916는 하기 서열번호 1의 핵산 서열에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 다형성이고 굵은 글씨 및 괄호로 표시하였다.
rs10231916 : 5'-GCAGCAGATGATACAGCAAACACGT[A/T]ACTGCAAAAACAGCTACAGCAGCTA-3' (서열번호 1)
ACN9의 SNP인 rs10229181은 dbSNP138 데이터베이스에 따르면 염색체 7의 5' 말단으로부터 96795041번 뉴클레오티드의 변이로서 ACN9 유전자의 인트론에 위치하고, 핵산의 염기가 시토신(C) 또는 구아닌(G)인 다형성을 갖는다. rs10229181는 하기 서열번호 2의 핵산 서열에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 다형성이고 굵은 글씨 및 괄호로 표시하였다.
rs10229181 : 5'-GAAACTGAAGAGGTTAATATGCAGA[C/G]TGCAAGGCTAAGTTGGCAGTTTGCC-3' (서열번호 2)
1.3. 유전적 연관 분석
적합도 검정을 이용하여 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 평가하였다. 추가적인 유전적 모델을 추정하고 SAS ver. 9.2 (SAS Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하여 연령, 성별 및 흡연 PY를 조정하면서, 로지스틱 회귀분석을 이용하여 COPD 발병 상태와 유전적 연관을 수행하였다. 전체 모델에 추가하여, SNP와 PY의 상호작용 기간(SNP-by-pack-years interaction term)을 포함한 모델 및 흡연 강도-계층 모델(smoking intensity-stratified model)을 평가하였다. 선형 회귀 분석은 연령, 성별, 및 흡연 갑년을 조정한 후 정량적 표현형으로서 FEV1, 및 FEV1 대 FVC의 비를 이용하여 수행하였다.
COPD 민감성과 유전적 연관 분석, 및 흡연 갑년과의 상호 관련성을 하기 표 3에 타나내었다.
SNP
(참조 SNP 클러스터 번호)		 염색체 번호 유전자 유전형 COPD(명) 대조군(명) OR
95% CI
P SNP 		P i nt
rs10231916 7 ACN9 AA
AT
TT		 271
494
232		 248
549
203		 1.043
(0.893-1.219)
0.60		 1.3x10-8
rs10229181 7 ACN9 CC
CG
GG		 265
479
236		 245
544
204		 1.064
(0.910-1.243)
0.44		 8.1x10-9
표 3에서, OR은 승산비(odd ratio)를 나타내고, CI는 신뢰 구간(Confidence Interval)을 나타내고, P SNP는 COPD 민감성과 SNP의 연관 분석의 p 값을 말하고, P int는 COPD 민감성과 흡연 갑년의 상호 관련성의 p 값을 말한다.
표 3에 나타난 바와 같이, ACN9의 SNP rs10231916와 rs10229181는 전체 집단에서는 아니지만 대조군 개체에서 하디-바인베르크 평형으로부터 보통의 편차를 보였고, COPD 질병 및 흡연과 유의한 상관 관계를 보였다. 표 3에서 P i nt가 0.05 미만이면 SNP와 흡연 간에 유의한 상호작용을 보인다. 따라서, ACN9의 SNP rs10231916와 rs10229181는 P i nt와 연관성이 있고, 상호작용이 유의하였다.
또한, COPD 환자의 흡연 강도에 따라 3 분위로 나누어 흡연 강도에 따른 유전적 연관 분석을 수행하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 3분위의 기준은 35년 미만의 갑년은 하위 3분위, 35년 이상 내지 50년 미만의 갑년은 중위 3 분위, 및 50년 이상의 갑년은 상위 3분위로 나누었다.
SNP
(참조 SNP 클러스터 번호)		 염색체 번호 유전자 하위 3분위 중위 3분위 상위 3분위
rs10231916 7 ACN9 1.25 (1.00-1.56), 0.051 0.97 (0.78-1.20), 0.77 0.82 (0.64-1.06), 0.13
rs10229181 7 ACN9 1.29 (1.03-1.61), 0.028 1.00 (0.81-1.24), 0.98 0.82, (0.64-1.06), 0.13
표 4에서, 수치들은 승산비 (신뢰 구간), 및 p 값을 나타낸다.
승산비가 1 이상이면 COPD 질병의 위험을 높이고, 승산비가 1 이하이면 COPD 질병의 위험을 낮춘다. 다만 신뢰구간이 1을 포함하지 않은 경우에만 유의하게 위험을 낮추거나 높인다. 또한 p<0.05면 SNP와 COPD 질병 간의 유의한 연관성을 보인다. 표 4에 나타난 바와 같이, 흡연량의 하위 3분위의 경우에서만 COPD 질병과 rs10229181는 유의한 상관 관계가 있음을 확인하였다.
한편, 폐 기능과 SNP 간의 관련성을 하기 표 5에 나타내었다.
SNP
(참조 SNP 클러스터 번호)
 모든 대상자(n=2,000) COPD 환자(n=1,000)
FEV1 FEV1/FVC FEV1 FEV1/FVC
rs10231916 -0.028 (0.027)
0.30		 -1.460 (0.712)
0.04		 -0.018 (0.026)
0.49		 -0.496 (0.547)
0.37
rs10229181 -0.028 (0.027)
0.04		 -1.524 (0.716)
0.03		 -0.007 (0.026)
0.78		 -0.427 (0.550)
0.44
표 5에서, 수치들은 β(오류) 값 및 p 값을 나타낸다. β 값은 방향성을 나타내는 것으로 해석되므로, β 값이 음의 값이면 폐기능 저하와 연관성이 있는 것으로 해석된다. 또한 p<0.05면 SNP와 폐기능 간의 유의한 연관성을 보인다.
표 5에 나타난 바와 같이, ACN9에서 rs10231916의 'T' 대립유전자는 낮은 FEV1/FVC 값과 연관되고, 이것은 전체 집단의 결과와 일치하였다. 또한, 폐 기능과 ACN 9의 rs10231916와 rs10229181는 유의한 상관 관계가 있음을 확인하였다.
1.4. 폐 조직에서 유전자 발현
193 명의 COPD 환자 또는 정상인의 폐 조직을 사용하여 RNA 서열 분석을 통해 ACN9의 유전자 발현 프로파일링 데이터를 수득하였다.
구체적으로, RNA 서열 분석을 위해, RNeasy 96 Universal tissue kit(Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 수득된 폐 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 수득한 총 RNA의 정성 및 정량은 NanoDrop 1000 분광 광도계(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 분광학적으로 그리고 Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 전기영동적으로 확인하였다. Illumina에 호환가능한 라이브러리를 구축하기 위해, TruSeq RNA library preparation kit(Illumina, San Diego, CA, USA)을 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 간단히 말해서, polyA 선별을 이용하여 총 RNA로부터 정제된 메신저 RNA를 화학적으로 단편화시키고 랜덤 헥사머 프라이밍(random hexamer priming)을 이용하여 단일 가닥 cDNA로 전환시켰다. 이중 가닥(double-stranded; ds) cDNA를 TruSeq library 구축을 위해 생성하였다. 짧은 ds-cDNA 단편을 시퀀싱 어댑터와 연결시키고 적절한 단편들을 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리시켰다. PCR 증폭에 의해 구축된 TruSeq RNA 라이브러리를 정량적 PCR(quantitative PCR; qPCR) 정량 프로토콜 가이드에 따라 qPCR을 이용하여 정량하였고, 그 양을 Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)를 사용하여 전기영동적으로 정량하였다. HiSeq™2000 플랫폼(Illumina)을 사용하여 핵산 서열 분석을 수행하였다.
후보 유전자의 유전형에 따른 차등 발현을 확인하기 위해, 맵핑된 백만개의 단편 당 엑손의 킬로베이스 당 단편(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped; FPKM)의 수준을 t 검정을 이용하여 분석하였다. FPKM은 발현 수준을 나타낸다.
유전자의 변이체가 유전자 발현에 영향을 미치는지 조사하기 위해, 질병 상태와 관계없이, 혈액 시료를 얻을 수 있는 93 명의 사람에서 ACN9의 유전자형을 분석하였다. 발현 수준 및 유전자형 간의 관련성을 조사하기 위해 선형 회귀 분석을 수행하였다.
ACN9의 발현은 하기 표 6에 나타내고, ACN9의 유전자형에 따른 유전자 발현 수준을 도 1에 나타내었다(fc: fold change).
유전자 COPD/ 정상 fc COPD/정상 표준편차 fc 정상 평균 COPD 평균 정상 표준편차 COPD. 표준편차 COPD/정상 COPD/정상의 p 값
ACN9 -1.24344 1.60x10-1 6.90x10-1 5.95x10-1 8.49x10-2 1.35x10-1 -5.85 2.59x10-8
표 6에 나타난 바와 같이, COPD 환자의 폐 조직에서 유의하게 감소하였다(p=2.59x10-8). 또한, 도 1에 나타난 바와 같이, ACN9에서 rs10231916의 'T' 대립유전자는 93 개의 시료에서 발현이 낮아지는 경향을 보였다(p=0.07).
<110> Kangwon National University Hospital <120> Composition, kit, and microarray for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease and method for diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease using the same <130> PN107129 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs10231916 as a Single Nucleotide Polymorphism of ACN9 <220> <221> mutation <222> (26) <223> Single Nucleotide polymorphism from adenine (A) to thymine (T) <400> 1 gcagcagatg atacagcaaa cacgtaactg caaaaacagc tacagcagct a 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs10229181 <220> <221> mutation <222> (26) <223> Single nucleotide polymorphism from cytosine (C) to guanine (G) <400> 2 gaaactgaag aggttaatat gcagactgca aggctaagtt ggcagtttgc c 51

Claims (14)

  1. 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease; COPD) 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드는 ACN9 유전자에 포함된 것인 COPD 진단용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 위치는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP) 위치인 것인 COPD 진단용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 서열번호 1에서 SNP 위치의 뉴클레오티드의 염기는 대립유전자 아데닌(A) 또는 대립유전자 티민(T)인 것인 COPD 진단용 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 서열번호 2에서 SNP 위치의 뉴클레오티드의 염기는 대립유전자 시토신(C) 또는 대립유전자 구아닌(G)인 것인 COPD 진단용 조성물.
  6. 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브 또는 프라이머; 및
    중합 반응에 필요한 시약을 포함하는 COPD 진단용 키트.
  7. 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 COPD 진단용 마이크로어레이.
  8. 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및
    수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 개체의 COPD 진단 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 대립유전자가 티민(T)인 경우 COPD로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 개체의 COPD 진단 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 대립유전자가 구아닌(G)인 경우 COPD로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 개체의 COPD 진단 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 개체는 흡연자인 것인 개체의 COPD 진단 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 흡연자는 흡연 강도 하위 3분위인 개체인 것인 개체의 COPD 진단 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 흡연 강도 하위 3분위는 35 갑년(pack-year) 또는 35 갑년 미만인 것인 개체의 COPD 진단 방법.
  14. 청구항 8에 있어서, 상기 유전자형을 결정하는 단계는 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립유전자 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis), 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism), 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것인 개체의 COPD 진단 방법.
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