KR20160051559A

KR20160051559A - 신규 하이드로젠퍼옥사이드를 활성화하는 항산화 화합물 및 이를 이용한 약학 조성물

Info

Publication number: KR20160051559A
Application number: KR1020150103551A
Authority: KR
Inventors: 이동원; 박승규; 정다희; 강피터엠
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2015-07-22
Publication date: 2016-05-11
Also published as: US20180105540A1; US10370391B2; WO2016073357A1; KR101765682B1

Abstract

본 발명은 4-하이드록실벤질알콜을 생성 가능한 과산화수소에 특이적 반응성이 높은 페닐보로닉에스터를 가지는 항염 및 항산화화합물을 포함한다. 한 실시 예로, 본 발명의 화합물은 허혈성 질환을 포함하는 산화적 스트레스 및/또는 염증을 예방하고 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

신규 하이드로젠퍼옥사이드를 활성화하는 항산화 화합물 및 이를 이용한 약학 조성물{NOVEL HYDROGEN PEROXIDE-ACTIVABLE, ANTI-OXIDANT COMPOUNDS AND METHODS USING SAME}

본 발명은 항산화 능을 보이는 화합물과 이를 이용한 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생활성(bioactive) 페놀을 생산하는 H₂O₂에 의해 특이적으로 제거를 될 수 있는 페닐 보로닉에스터(phenylboronic ester)에 관한 것이다.

하이드로젠퍼옥사이드(H₂O₂)는 필수적인 산화적 대사산물이며 유기체의 적응, 발달 및 성장을 위해 필수적인 세포신호경로에서의 메신저로서 역할을 한다. H₂O₂은 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)의 한 종류이고, 이는 또한 페록신아질산염(peroxinitrite)과 하이포아염소산염(hypochloride), 하이드록실라디칼과 같은 높은 독성의 ROS의 전구체이다. H₂O₂의 축적이 산화적 스트레스와 염증반응을 유발한다는 많은 증거가 있으며, 이것은 암, 당뇨병, 심혈관계 질환 및 허혈-재관류(ischemia-reperfusion, I/R)손상등과 같은 다양한 병리학적 조건의 발병(onset)과 진행에 높은 관련이 있다. I/R손상은 급성관상동맥증후군(Acute Coronary Syndrome), 간과 신장의 허혈성 손상, 심폐우회로술, 혈관의 혈전색전증 질환과 같은 다양한 임상조건에서 보여진다.

허혈성 조직에서 혈액의 재관류는 I/R손상에서 가장 풍부한 형태의 ROS(Reactive oxygen species)인 많은 양의 H₂O₂를 유도하고, 산화적 스트레스 및 세포손상을 일으키고, 또한 조직 손상을 더 악화시킨다. 따라서 H₂O₂는 산화적스트레스와 연관된 질병에 대한 효율적인 타겟이고, 높은 농도의 H₂O₂생산으로 특정 지어지는 I/R 손상 부위에 직접적인 타겟화된 치료법은 일반적인 항산화치료법 이상의 대해 커다란 이점을 제공할 것이다.

4-하이드록실벤질 알콜(HBA)은 천마(Gastrodia elata)의 주요한 활성성분중의 하나이며, 천마는 아시아에서 염증성 질병 및 경련성 장애의 치료를 위한 허브 물질로 널리 쓰여진다. HBA는 항산화 활성을 보이고 관상동맥성심장질환 및 허혈성 뇌손상과 같은 산화성 스트레스와 관련된 질환에 대해 보호적 역할을 한다. HBA는 또한 페놀 하이드록실 그룹으로 인하여 슈퍼옥사이드(superoxide) 및 하이드로실 라디칼에 대한 강력한 소거제(scavenger)이다. 항산화 및 치료적 물질로서 HBA의 이용에 대하여 관심이 있어왔지만, HBA는 H₂O₂를 소거할 수 없으며, 짧은 혈액순환시간을 갖고 있어 이의 임상적 적용은 한계가 있다.

산화적 스트레스 손상을 예방하거나 치료하는데 유용한 새로운 화합물을 개발할 필요가 있다. 이러한 화합물은 ROS 유발성 산화적 스트레스 및 염증반응을 예방하거나 치료하는데 유용할 수 있다.

하기에 서술한 바와 같이, 본 발명은 하이드로젠퍼옥사이드에 의해 활성화 될 수 있는 항산화 보로닉에스터(esters)(boronic esters)를 특징으로 하고, 이들의 화합물들을 포함하는 조성물 및, 예를 들어 허혈성/재관류 손상의 치료를 위한, 항산화 물질로서, 상기 조성물을 포함하는 항산화 물질의 용도를 특징으로 한다.

본 발명은 4-(하이드록시메틸)페닐보로닉 에스터(4-(hydroxymethyl)phenylboronic ester)를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 보로닉에스터(esters)(boronic esters)를 포함하는 마이크로입자를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 보로닉에스터(esters)(boronic esters) 및/또는또는 마이크로 입자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 에스터(esters), 마이크로입자 또는 조성물을 포함하는 약물전달시스템을 제공한다.

본 발명은 또한 치료대상의 산화적 스트레스로 인한 손상을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 효과적인 양의 본 발명에 따른 에스터(esters), 본 발명에 따른 마이크로입자, 또는 본 발명에 따른 조성물을 치료대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 보로닉에스터(boronic esters)는 치료대상의 신체내에서 4-hydroxybenzyl alcohol(HBA)가 방출되기 위해 적어도 부분적으로 분해되어, 산화적 스트레스로 인한 손상을 치료하거나 예방할 수 있다.

본 발명은 또한 치료대상의 신체부위의 적어도 한 부분에서 ROS(Reactive oxygen species)의 형성을 억제하거나 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 효과적인 양의 본 발명에 따른 에스터(esters), 본 발명에 따른 마이크로입자, 및/또는 본 발명에 따른 조성물을 치료대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 보로닉에스터(boronic esters)는 치료대상의 신체 내에서 HBA가 방출되기 위해 적어도 부분적으로 분해되며, 따라서 치료대상의 신체의 적어도 한 부분에서 ROS의 형성이 억제되거나 예방된다.

본 발명은 또한 이식을 위한 조직 또는 장기에서의 허혈성 손상 또는 재관류 손상을 감소시키기 위한 방법과, 이식하기 전, 또는 이식하는 동안 또는 이식 후에 본 발명에 따른 에스터(esters), 본 발명에 따른 마이크로입자, 및/또는 본 발명에 따른 조성물이 조직 또는 기관과 접촉하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 이로 인해 대조군에 비하여 기관에서 허혈성 손상 및 재관류 손상이 감소되기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 치료대상의 허혈성 재관류 손상과 관련된 세포사멸을 감소시키는 방법을 제공하며, 또는 본 발명에 따른 에스터(esters), 본 발명에 따른 마이크로입자, 또는 본 발명에 따른 조성물의 효과적인 양을 치료대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 따라서 대조군에 비하여 허혈성 재관류 손상에 관련된 세포사멸이 감소되는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 치료대상의 허혈성 재관류와 관련된 염증을 감소시키는 방법을 제공하며, 또는 본 발명에 따른 에스터(esters), 본 발명에 따른 마이크로입자, 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 효과적인 양을 치료대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 따라서 대조군에 비하여 허혈성 재관류 손상에 관련된 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

일 실시예에 따르면, 상기 에스터(esters)는 또한 디올(diol), 트리올(triol), 테트라올(tetraol), 펜타올(pentaol), 헥사놀(hexaol) 및 수산기가 더 많은 폴리올(polyol)로 이루어진 그룹에서 선택 되어진 알코올을 포함하며, 상기 알코올 및 4-하이드록시메틸페닐보로닉 엑시드(4-(hydroxymethyl)phenylboronic acid)는 보로닉에스터(boronic esters)를 형성하기 위해 공유결합으로 결합되어 있다. 다른 실시예에 따르면, 상기 알코올은 디올 또는 트리올을 포함한다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 알코올은 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 또는 2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로판-1,3-디올(2-(hydroxymethyl)-2-methylpropane-1,3-diol)을 포함한다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 보로닉에스터(boronic esters)는 4-(5-하이드록시메틸)-5-메틸-1,3,2-디옥사보리난-2-일)페닐 메탄올)(4-(5-(hydroxymethyl)-5-methyl-1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl methanol) 또는또는 4-(1,3,2-디옥사보리난-2-일)페닐 메탄올)(4-(1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl methanol)을 포함한다.

또 다른 실시예에 따르면, 상기 마이크로입자는 생체적합하며 생분해성이다. 또 다른 실시예에 따르면 마이크로입자는 폴리머 또는 리포좀을 포함한다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 폴리머는 PLA(poly(lactic acid), PGA(poly(glycolic acid)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), 및 PCL(poly(ε-caprolactone) 로 이루어진 그룹에서 적어도 하나를 선택하여 포함한다.

또 다른 실시예에 따르면, 상기 산화적 스트레스 손상은, 급성관상동맥증후군(Acute Coronary Syndrome), 간의 허혈, 신장의 허혈, 뇌의 허혈, 관상동맥질환, 심폐우회로술, 전신 허헐성/재관류 및/또는 혈관의 색전증 등과 관련된 허혈성/재관류 손상이다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 방법은 허혈성/재관류 손상과 연관된 세포사멸 또는 염증을 감소시킨다. 또 다른 실시에에 따르면, 상기 ROS는 슈퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드 종류를 포함한다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 조직 또는 장기는 심장조직, 심장, 신장조직, 신장, 간조직, 간, 폐조직, 폐, 췌장, 췌장조직, 장조직, 장, 흉선, 뼈, 연골, 근육조직, 힘줄, 각막, 상피 조직, 피부, 심장 판막, 뉴런(신경세포), 신경, 내피조직, 동맥 또는 정맥 등이다.

또 다른 실시예에 따르면, 상기 치료대상은 포유류이다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 조직과 장기는 포유류에서 유래된다. 또 다른 실시예에 따르면 상기 포유류는 인간이다.

또 다른 실시예에 따르면, 상기 방법 심장, 간 또는 신경세포의 자멸을 감소시킨다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 방법은 PV loop 분석법 및/또는 심장초음파에 의해 평가되는 심장의 기능장애를 감소시킨다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 방법은 치료대상에서 TNF-α 및/또는 유도성 NOS(nitric oxide synthase) 수준을 감소시킨다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 대조군은 치료하지 않은 치료대상에 존재하는 염증수준이다. 또 다른 실시예에 따르면, 상기 세포의 자멸 또는 염증은 급성관상동맥증후군(Acute Coronary Syndrome), 간의 허혈, 신장의 허혈, 뇌의 허혈, 관상동맥질환, 심폐우회로술 및/또는 혈관의 색전증과 연관되어 있다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 4-(하이드록시메틸)페닐보로닉 에스터(4-(hydroxymethyl)phenylboronic ester)와 항산화제로써 이러한 조성물의 사용에 대한 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 정의되는 조성물들과 물질들은 하기의 제공되는 실시예들과 관련되어 분리되거나 제조된다. 본 발명의 다른 형태들과 장점들은 발명의 상세한 설명과 청구항에서 명백해질 것이다.

본 발명은 또한 치료대상의 산화적 스트레스로 인한 손상을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 효과적인 양의 본 발명에 따른 에스터(esters), 본 발명에 따른 마이크로입자, 및/또는또는 본 발명에 따른 조성물을 치료대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 보로닉에스터(boronic esters)는 치료대상의 신체 내에서 4-hydroxybenzyl alcohol(HBA)가 방출되기 위해 적어도 부분적으로 분해되어, 산화적 스트레스로 인한 손상을 치료하거나 예방할 수 있다.

하기의 본 발명에 대한 바람직한 실시 예에 대한 상세한 설명은 덧붙여진 도면과 함께 읽으면 더욱 잘 이해될 것이다. 본 발명을 도식화하기 위해, 현재 바람직한 실시예 도면을 첨부하였다. 하지만 본 발명은 도면과 함께 개시된 실시예의 정확한 배열 및 수단에 한정되지 않는다는 것은 명확하다.
도 1(도1a~1b)은 H₂O₂ 소거 항산화 BRAP의 생성을 도시한 것이다. (도 1a : H₂O₂ 에 의해 활성화되는 항산화 전구약물로서 BRAP의 분해 및 합성 경로의 예시. 도 1b : H₂O₂ -매개 가수분해 전후의 BRAP ¹H NMR 스펙트럼.)
도 2(도 2a~2c)는 BRAP의 H₂O₂ 소거효과를 도시한 것이다. (도 2a : H₂O₂ 존재 하의 BRAP의 UV흡수량의 변화 예시. 도 2b : 다양한 농도의 BRAP에 의한 H₂O₂ 소거. H₂O₂ 용액(10μΜ)은 1분간 HBA 또는 BRAP와 혼합되고, 화학발광의 강도를 디페닐옥살레이트(diphenyl oxalate)(10 mg)과 루브렌(rubrene) (1 mg)을 첨가함으로써 측정한다. * p<0.01, **p<0.001 H₂O₂ 만 있는 그룹과 비교(n=4/그룹). 도 2C : 산 조건 하에서 72시간 후에 BRAP의¹H NMR 스펙트럼 (pH =3) )
도 3(도 3a~3b)은 마우스의 대식 세포 (RAW264.7) (도 3a)및 ARVC(도 3b)에서 MTT 어세이에 의해 평가될 수 있는 생체적합성 프로필을 막대 그래프의 세트를 도식화한 것이다.
도 4(도 4a-4f)는 in vitro에서 BRAP의 항산화 및 항염증 효과를 도시한 그래프 및 막대 그래프 및 이미지로 도시한 것이다. (도 4a-4b: LPS(1μg/ml)(도 4a) 또는 H₂O₂(250μM)(도 4b)에 의해 활성화되는 마우스의 대식세포에서 ROS생성에 대한 억제효과. ROS생성은 DCF형광의 지표로써 유동세포계수법 (flow cytometry)에 의해 모니터 되어졌다. 형광은 480nm에서의 여기와 530nm에서의 방출로 10000개의 세포에서 분석되었다. 도 4c : H₂O₂ 에 의해 활성화된 성체 랫트(Rats)의 심장근육세포에서의 BRAP의 보호효과. V=vehicle, *<0.05 vs V + H₂O₂ (n=4) 도 4D : LPS-활성화된 세포에서의 NO의 생성에 대한 억제효과 * p<0.01, **p<0.001 LPS처리 그룹과 비교(n=4/그룹). 도 4e-4f : LPS로 활성화되는 마우스의 대식세포 내에서의 TNF-α(도4e) 및 iNOS(도 4f)의 생성에 대한 BRAP의 억제효과. **p<0.001 LPS처리 그룹보다(n=4/그룹)).
도 5(도 5a-5d)는 간의 I/R (1시간 허혈/12시간 재관류)손상에서 BRAP의 유익한 효과를 이미지 및 막대 그래프의 세트로 도시한 것이다. (도 5a : HBA나 BRAP를 주사한 후, 마우스의 간에 대한 헤마톡실린-에오진염색(hematoxylin-eosin(H/E) staining) DHE염색 및 TUNEL염색. 도 5b-5d : 혈청 ALT 레벨의 정량분석 (도5b), 절단된 caspase-3 단백질의 발현 (도 5c), 및 I/R손상 이후의 TNF-α 단백질의 발현(도 5d) * p<0.01 Veh I/R과 비교. † p<0.05 HBA I/R(n=3~4그룹)에 비교. 액틴 단백질의 발현은 단백질 로딩에 대한 인터널 컨트롤(internal control)로써 사용되었다.)
도 6(도 6a-6f)는 I/R 이후, 심장 기능에 대한 BRAP의 효과를 이미지 및 막대 그래프의 세트로 도시한 것이다. (도 6a : I/R손상 이후 2주 동안 BRAP를 투여한 후의 심박출량.(Cardiac output, CO) * p<0.05 각 그룹의 위약에 대한 비교. † p<0.05 Veh I/R에 대한 비교 (n=4~6그룹). 도 6b: 심장근육세포의 DHE염색에 대한 공초점 현미경 이미지. (DAPI : 파랑 / DHE/DAPI: 분홍) 도 6c : 염증 마커의 mRNA 발현에 대한 대표적 이미지 (TNF-α 및 MCP-1). 18S mRNA 발현은 인터널 컨트롤(internal control)로 사용되었다. 도 6d : I/R 손상 후, BRAP투여 이후의 caspase-3 활성 어세이. * p<0.05 각 그룹의 위약에 대한 비교. † p<0.05 Veh I/R에 대한 비교 (n=4~6그룹). 도 6e : 심장근육세포의 TUNEL염색에 대한 대표적 공초점 현미경 결과. 도 6f : TUNEL 양성반응 심장근육세포/총세포의 정량. * p<0.05 각 그룹의 위약에 대하여. † p<0.05 Veh I/R에 대한 비교 (n=3~4그룹). DHE염색, mRNA발현 측정, caspase 활성 어세이, 및 TUNEL분석은 심장의 I/R손상 이후 24시간에 심장조직에서 이뤄졌다.)
도 7(도 7a-7c)은 7일 동안 매일 복강 내의 투여 후, BRAP(1.5mg/kg/day)의 안전성 프로파일을 이미지 및 막대 그래프의 세트로 도시한 것이다. (도 7a-7b : 매일 BRAP를 투여 후, 7일에 Creatinine (도 7a) 및 ALT(도 7b) 레벨. 도 7c : 매일 BRAP 투여 후 7일에 다른 장기의 대표적 H/E염색 조직 박편(section) (n=4/그룹)).
도 8(도 8a-8b)은 인간의 배아 신장(HEK293)세포 (도 8a) 및 마우스의 배아 섬유아세포(NIH 3T3) (도 8b)에서 MTT어세이에 의해 평가된 BRAP의 생체 적합성을 막대 그래프의 세트로 도시한 것이다.
도 9는 LPS(1μg/mL)에 의해 활성화된 마우스의 배아 섬유아세포(NIH 3T3)에서 ROS의 생성에 대한 억제효과를 그래프로 도시한 것이다.
도 10(도 10a-10c)은 I/R손상 후, BRAP 처치하고 뇌줄중 웍(Stroke wok, SW)(도 10a), 박출계수(ejection fraction, EF)(도 10b), 및 구획단축률(fractional shortening, FS)(도 10c)를 막대 그래프로 도시한 것이다.
도 11(도 11a-11b)은 I/R손상 이후, BRAP처치하고 TNF-α(도 11a) 및 MCP-1(도 11b) 의 mRNA발현에 대한 정량분석을 막대 그래프로 도시한 것이다. (* p<0.05 각 그룹의 위약에 대한 비교. † p<0.05 Veh I/R에 대한 비교 (n=4-6/그룹)).
도 12는 4-(1,3,2-디옥사보리난-2-일)페닐 메탄올(4-(1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl methanol)의 H’NMR 스펙트럼 및 그 합성을 도시한 것이다.
도 13은 4-(1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl methanol에 의한 H₂O₂ 소거를 막대 그래프로 도시한 것이다. 실험 예로, 상기 화학적 발광의 강도는 루브렌(rubrene)을 포함한 디페닐 옥살레이트 액(diphenyl oxalate solution)과 반응 후에 측정되어 졌다. 상기 보로네이트(1μM 또는 10μM)는 H₂O₂솔루션(10μM)에 첨가되어 졌다. H₂O₂와 1분 반응시킨 후, 디페닐옥살레이트 액이 H₂O₂ 액에 첨가되어 졌고, 화학적 발광강도는 광도계(luminometer, (Femtomaster FB12, Zylux Corporation, TN, US))를 사용하여 측정되어 졌다.
도 14는 신장(위) 및, BRAP의 다양한 경구 복용량에 대한 재관류 이후 24시간에 크레아티닌(creatinine) 레벨을 도시한 막대 그래프(아래)를 포함한다.
도 15는 재관류 이후, 24시간에 염증마커인 TNF-α 및 MCP-1를 도시한 이미지들이다.
도 16은 I/R이후, DHE염색을 도시한 이미지들이다. DHE 염색은 빨간색으로 보이며 DAPI는 파랑색으로 보여진다.
도 17은 I/R 이후에 TUNEL염색을 도시한 이미지들이다. TUNEL은 녹색으로 보이며, DAPI는 파랑색으로 보여진다.

본 발명은 4-(하이드록시메틸)페닐보로닉 에스터(4-(hydroxymethyl)phenylboronic ester)와 같은 새로운 보로닉에스터(boronic esters)의 예견하지 못한 발견과 관계된 것이다. 한 실시예에 따르면, 상기 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)는 4-(5-(하이드록시메틸(-5-메틸-1,3,2-디옥사보리난-2-일)페닐 메탄올(4-(5-(hydroxymethyl)-5-methyl-1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl methanol, BRAP)를 포함한다. 또다른 실시예에 따르면, 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)는 H₂O₂ 와 반응하여 4-하이드록시벤질 알코올(4-hydroxybenxzyl alcohol, HBA)를 형성한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시예에 따르면, 본 발명의 화합물 및/또는 조성물은 급성관상동맥증후군(Acute Coronary Syndrome), 간의 허혈, 신장의 허혈, 뇌의 허혈, 관상동맥질환, 심폐우회로술 및/또는 혈관의 색전증과 관련된 허혈/재관류 손상을 포함하는 산화관련 질병을 치료 및/또는 예방하는데 유용하다.

H₂O₂의 과 생산은 산화적 스트레스를 유발하고 허혈/재관류(I/R) 손상의 발병에 대한 주요 원인이 된다. 그러므로 H₂O₂ 유도성 산화적 스트레스의 억제는 I/R손상의 치료에 매우 중요하다. 본 발명의 화합물들은 H₂O₂ 로 활성화되는 항산화 전구약물이며, 산화적 스트레스 부위를 특이적으로 표적화할 수 있으며, 항염증 및 항-세포사멸활성을 발휘할 수 있다.

본 발명에 서술된 바와 같이, 본 발명은 생활성(bioactive) 페놀을 생산하는 H₂O₂ 에 의해 특이적으로 제거될 수 있는 페닐 보로닉에스터(phenylboronic ester)를 제공한다.

본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)는 H₂O₂에 탁월한 특이적인 반응성을 갖고 있으며 무독성이다. 도 1a에 도식화되어 있는 것과 같이, HBA를 이용하여 H2O2에 의해 활성화되는 항산화 붕소화된 전구약물(H2O2-activable, anti-oxidant boronated prodrug)인 BRAP이 합성되었다. 어떠한 이론으로 한정되지 않고, BRAP와 같은 보로닉에스터(boronic esters) 화합물은 최소 두 가지의 유익한 치료적인 활성을 제공한다. 하나의 관점에서, BRAP는 급속하고 특이적으로 높은 레벨의 H₂O₂ 에 의해 산화되고, 그 뒤에 H₂O₂ 매개 산화적 스트레스와 손상을 제한한다. 또다른 관점에서, H₂O₂ 매개 보로나이트 산화가 유리 HBA를 생성하고, 산화적 스트레스 하에 조직에서 이것의 내인성 항산화 및 항염증 활성을 가하게 된다. 다시 말하면, 본 발명의 상기 화합물은 H₂O₂ 를 제거하고 항산화 및 항 염증 치료 물질을 방출한다.

H₂O₂에 의해 활성화되는 BRAP를 제공하는 본 발명은 H₂O₂가 과 생산되는 때에만 H₂O₂ 의 레벨을 효과적으로 낮추도록 하고, 정상적인 생리적 상태에서는 일반적인 H₂O₂ 억제를 피하게 한다. 이와 같이, 본 발명의 상기 표적화 된 전략은 해롭게 높은 H₂O₂ 의 농도를 감소시키는데 효과적이고 바람직하지 않은 잠재적 부작용 또한 제한한다.

정의( Definitions )

별도로 정의된 것이 없으면, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 과학적인 용어는 일반적으로 동종업계에 의해 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 하기의 참조문헌들은 본 발명에서 쓰여진 많은 용어들의 일반적인 정의를 제공한다 : Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2^nd ed.1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed., 1988); The Glossary of Genetic, 5^th Ed., R. Rieger et al. (eds), Spriner Verlag(1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991). 일반적으로, 여기서 사용된 상기 명명법과 약학, 유기화학 및 고분자화학에서 실험적 과정은 동종 업계에서 통상적으로 사용되고 잘 알려진 것이다.

본 발명에 설명된 바와 같이, “약 (about)”이라는 용어는 동종업계에서 숙련된 사람에 의해서 이해될 수 있을 것이며 사용된 본문 안에서 어떤 정도로 다양화될 수 있을 것이다. 양, 지속시간 및 이와 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 발명에서 사용된 용어 약(about)은 상기 기재된 방법을 수행하기 적당하도록 특정 값에서부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게 ±5%, 더욱 바람직하게 ±1%, 더더욱 바람직하게는 ±0.1% 정도의 범위를 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “투여(administration)”은 어떠한 적합한 방법에 의해 본 발명의 상기 조성물을 치료대상에게 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “BRAP”는 4-(5-하이드록시메틸)-5-메틸-1,3,2-디옥사보리난-2-일)페닐메탄올)(4-(5-(hydroxymethyl)-5-methyl-1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl methanol)을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “CPB”수술은 심폐우회로술을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “CABG”수술은 관상동맥우회로 이식술을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “조성물 (composition)” 또는 약학 조성물 (pharmaceutical composition”은 약학적으로 수용 가능한 운반체를 가지는 본 발명 내에서 유용한 최소 하나의 조성물의 혼합물을 나타낸다. 상기 약학조성물은, 치료대상에게 상기 조성물의 투여를 용이하게 한다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “DCF”는 디클로로디하이드로플루오레세인 (dichlorodihydrofluorescein]을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “DCFH-DA”는 디클로플루오레세인-디아세테이트(dichlorofluorescein-diacetate )를 나타낸다.

“병(disease)”에 의하여 라는 것은 세포, 조직 또는 장기의 정상적인 기능을 손상 또는 간섭하는 상태 또는 장애를 의미한다. 병의 예들은 뇌의 허혈, 심장의 허혈, 망막의 허혈, 허혈성대장염, 중증하지허혈, 허혈성급성신부전, 뇌졸증, 뇌외상, 태아저산소혈, 허혈성/재관류 손상 또는 허혈성/재관류 손상 합병증과 같은 허혈성 질환을 포함한다. 허혈성/재관류 손상은 심폐우회로술(CPB)과도 연관될 수 있으며, 상기 CPB는 관상동맥 우회로 이식술(CABG); 판막, 결함 또는 동맥류 복구; 심장 및/또는 폐의 이식; 폐 혈전절제술; 또는 폐의 혈전동맥내막절제술, 이에 더하여, 심방세동, 경색신전(infarct extension)과 같은 CPB(또는 CABG)수술과 관련되고, 경색관련동맥의 재폐색(reocclusion of an infarct-related artery, IRA), 순환경색(recurrent infarction), 부정맥, 뇌졸증, 중증도로 증가된 심근경색증(small-to-moderate myocardial infarction), 심실성빈맥/세동(ventricular tachycardia/fibrillation) 및 울혈성심부전과 관련된 허혈성/재관류 손상 합병증을 포함한다. 본 발명의 조성물들은 또한 고형 장기 이식(간, 신장, 폐 또는 심장과 같은)을 포함하는 이식된 조직의 허혈성 손상을 감소시키기 위해, 또는 고형 장기의 보호(간, 신장, 폐 또는 심장과 같은)를 위해 유용하다. 본 발명의 실시 예에 따르면, 본 발명의 방법들은 급성관상동맥증후군(Acute Coronary Syndrome), 간의 허혈, 신장의 허혈, 뇌의 허혈, 관상동맥질환, 심폐우회로술 및/또는 혈관의 색전증과 연관있는 허혈성/재관류 손상에 대해 유용하다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “DMSO”는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “DOX”는 독소루비신(doxorubicin) 또는 이것들의 염을 나타낸다.

“효과적인 양에 의해서”란, 치료되지 않은 환자와 비교하여 병의 증상을 개선하기 위해 요구되는 양을 의미한다. 질병의 치료적 처치를 위해 본 발명을 실행하는데 사용되는 활성 조성물들의 효과적인 양은 투여 방식, 나이, 몸무게 및 일반적인 대상의 건강에 따라서 다양하다. 궁극적으로, 참여한 의사 및 수의사가 적절한 양과 약물투여용법(Dosage regimen)을 결정할 것이다. 상기 양은 “효과적인”양으로서 나타내어 진다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어“HBA”는 4-하이드록시벤질알코올 (4-hydroxybenzyl alcohol) 또는 이의 염 또는 용매화합물을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 iNOS는 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase)을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, “교육용 자료(Instructional material)”는 본 발명의 조성물의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 출판물, 녹음, 도면 또는 어떠한 다른 표현 매체를 포함한다. 일 예에서, 상기 교육용 자료(Instructional material)는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 투여하기에 유용한 키트의 부분일 수 있다. 상기 키트의 교육용 자료(Instructional material)는 예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하고 있는 용기에 부착될 수 있거나 조성물을 포함하고 있는 용기와 함께 이동될 수 있다. 상대적으로, 상기 교육용 자료(Instructional material)는 수령인이 교육용 자료와 조성물을 협동적으로 사용할 목적으로 용기로부터 떨어뜨려서 이동될 수 있다. 예를 들어, 상기 교육용 자료(Instructional material)는 키트의 사용을 위한 것이고, 상기 조성물의 이용을 위한 지침 또는 상기 조성물의 제형의 사용을 위한 지침이다.

본 발명에서 사용된, “I/R”는 허혈성/재관류(ischemic/reperfusion)를 나타낸다.

본 발명에서 사용된, “LPS”는 지질다당류 (lipopolysaccharide)을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, “MCP-1”을 단핵세포 화학주성 단백질-1(Monocyte chemotactic protein-1)을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, “마이크로입자(Microparticle)은 약 10nm에서 1,000μm까지 범위의 평균직경을 가진 입자를 나타낸다. 한 실시예에 따르면, 상기 입자의 평균직경은 약 100nm에서 100μm의 범위이다. 또다른 실시예에 따르면, 상기 입자의 평균직경은 약 100nm에서 10μm의 범위이다. 또다른 실시예에 따르면, 상기 입자의 평균직경은 약 200nm에서 1μm의 범위이다. 또다른 실시예에 따르면, 상기 입자의 평균직경은 약 200nm에서 800nm의 범위이다. 또다른 실시예에 따르면, 상기 입자의 평균직경은 약 500nm이다. 또다른 실시예에 따르면, 상기 입자는 거의 구에 가깝다.

본 발명에서 사용된, “MTT” 는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide를 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “OVA” 는 오브알부민 (ovalbumin)을 나타낸다.

산화적 스트레스 손상에 의한 것은, 활성화된 산소종과 관련된 세포손상을 의미한다.

본 발명에서 사용된, “PCL”은 poly(ε-caprolactone) 또는 그의 염을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, “PGA”은 poly(glycolic acid) 또는 그의 염을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, “약학적으로 수용 가능한”은 본 발명에서 유용한 화합물의 특성 또는 생물학적 활성을 제거하지 않는 운반체 또는 희석액과 같은 물질을 나타내며, 상대적으로 무독성, 즉 상기 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않거나 포함된 화합물의 어떤 요소도 유해적으로 상호작용하지 않는 것이다.

본 발명에서 사용된, “PLA”는 poly(lactic acid) 또는 그의 염을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “PLGA”는 poly(lactic-co-glycolic acid) 또는 그의 염을 나타낸다.

“예방하다(prevent)”,“예방하는(preventing)”또는“예방(prevention)”은 사용된 것과 같이 작용물질 또는 화합물의 투여를 시작할 때 질병 또는 건강상태와 관련된 증상이 생기지 않은 치료대상에서 상기 질병 또는 건강상태와 관련된 증상의 시작을 피하거나 지연시키는 것을 말한다. 질병, 건강상태 및 장애들은 여기서 교환적으로 사용된다.

“대조군(reference)”이란 표준 또는 통제조건이다.

본 발명에서 사용된, “ROS”는 활성산소종(reactive oxygen species)을 나타낸다. ROS는 산소를 포함하는 화학적으로 활성화된 분자이고 산소이온, 슈퍼옥사이드(superoxide) 및 퍼옥사이드(peroxide)를 포함한다.

본 발명에서 사용된, “반응조건”은 물리적 처리, 화학적 시약 또는 그들의 결합을 나타내며, 이는 반응을 촉진시키기 위해 요구되거나 선택적으로 요구된다. 반응조건에 대한 한정이 없는 예시들은 전자석 방사선, 열, 촉매제, 화학적 시약(예를 들어, 하지만 한정이 없는 산(acid), 염기(base), 친전자체 (electrophile), 친핵전자(nucleophile)) 및 완충액(buffer)이다.

본 발명에서 사용된,“염”은 무기산, 유기산, 무기염기, 유기염기, 용매화합물, 수화물, 또는 그들의 포접화합물(clathrates)을 포함하는, 본 발명에서 고려되는 화합물의 염을 나타낸다. 본 발명에서 사용된, 상기 용어 “염”은 본 발명에서 사용되는 화합물인 유리산 또는 유리염기의 부가염을 포괄한다. 적합한 산 부가염은 무기산 또는 유기산에서부터 제조될 수 있다. 무기산의 예로는 염화수소산, 브롬화수소산, 요오드화 수소산, 질산, 탄산, 황산, 인산, 과염소산, 및 테트라플루오보로닉 산(tetrafluoroboronic acid)를 포함한다. 적합한 유기산은 aliphatic, cycloaliphatic, aromatic, araliphatic, heterocyclic, carboxylic 및 sulfonic 등급의 유기산으로부터 선택될 수 있는데, 예를 들면 formic, acetic, propionic, succinic, glycolic, gluconic, lactic, malic, tartaric, citric, ascorbic, glucuronic, maleic, fumaric, pyruvic, aspartic, glutamic, benzoic, anthranilic, 4-hydroxybenzoic, phenylacetic, mandelic, embonic(pamoic), methanesulfonic, ethanesulfonic, bezenesulfonic, patothenic, trifluoromethanesulfonic, 2-hydroxyethanesulfonic, p-toluenesulfonic, sulfanilic, cyclohexylaminosulfonic, stearic, alginic, β-hydroxybutyric, salicylic, galactaric 및 galacturonic acid를 포함한다. 본 발명에서 유용한 화합물의 적합한 염기 부가염은 예를 들어, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 포타슘, 암모늄, 나트륨, 아연염과 같은 alkali metal, alkaline earth metal 및 transition metal salt 등을 포함하는 금속염(metallic salt)을 포함한다. 허용할 수 있는 염기 부가염은 또한 예를 들면, N,N'-dibezenylethylenediamine, chloroprocaine, choline, diethanolamine, ethylenediamine, meglumine(N-methyl-glucamine) 및 procaine과 같은 염기성 아민(basic amine)으로 만들어진 유기염을 포함한다. 이 모든 염들은 예를 들면 적합한 산 또는 염기를 해당되는 유리 염기와 반응시킴으로써 상기 해당하는 유리염기 화합물로부터 종래적인 방법으로 만들어진다.

본 발명에서 사용된, “치료대상(subject)”, “환자(patient)” 또는 “개인(individual)”은 인간 또는 인간이 아닌 포유류 또는 새일 수 있다. 인간이 아닌 포유류는 예를 들어 양, 소, 말, 돼지, 개, 고양이 및 쥐(murine mammals)과의 포유류와 같은 가축 및 애완동물을 포함한다. 바람직하게 상기 대상은 인간이다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “THF”는 tetrahydrofuran을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, 상기 용어 “TNF-α”는 종양괴사인자알파(Tumor necrosis factor-alpha)를 나타낸다.

“치료하다(treat)” 및 “treating(치료하는)” 및 “treatment(치료)”는 본 발명에서 치료대상에게 활성물질 또는 화합물을 투여하는 것에 의해서 치료대상에 의해 경험되는 질병 또는 건강상태의 증상의 빈번도 및 심각성이 감소하는 것을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, “TUNEL”은 terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling을 나타낸다.

본 발명에서 사용된, “약학적으로 수용 가능한 염”은 무기산, 무기염기, 유기산, 유기염기, 용매화합물, 수화물, 및 이들의 포접 화합물을 포함하는 약학적으로 수용가능한 무독성 산 및 염기로부터 제조되는 투여된 화합물의 염을 나타낸다.

본 명세서를 통하여, 본 발명에 대한 다양한 측면이 형식적 범위 내에서 제시되었다. 본 발명의 설명은 형식적 범위 내에서 간결하고 편리를 위해 설명되었으며, 본 발명의 범위에서 한정적으로 해석되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 범위의 설명은, 범위 내 수치의 적절한 부분적 정수일 때 그 범위 내에서 개개의 숫자와 가능한 하부 범위 모두를 특정적으로 개시했다고 고려되어야 한다. 예를 들어, 1에서 6까지의 범위의 설명은 1에서 3까지, 1에서 4까지, 1에서 5까지, 2에서 4까지, 2에서 6까지, 3에서 6까지 등과 같은 하부 범위와 예를 들어, 1,2,2.7,3,4,5,5.3 및 6 등의 그 범위 내의 개개의 숫자를 특정적으로 개시했다고 고려되어야 한다. 이것은 범위의 너비에 상관없이 적용된다.

산화적 스트레스

산화적 스트레스로 인한 손상은, 항산화 방어물에서의 감소와 동시에 산소화 종의 생성이 증가할 때 일어나며, 결국 활성산소종(ROS)의 징후가 유발된다. 이것은 세포 방어 시스템을 제압하고 나중에 결국 정상적인 세포기능에 손상을 입혀 사멸로 유도될 수 있다. (즉, 자발적 세포사멸(apoptotic cell death))

특히, 허혈/재관류(I/R)중에 생성되는 가장 풍부한 형태의 ROS인 H₂O₂ 는, 염증 사이토카인 전구체의 방출 및 세포자멸사을 유도함으로써 중요한 역할을 하고 더 나아가 조직손상을 증대시킨다. H₂O₂ 는 또한 하이드록실 라디칼, 페록신아질산염 및 차아염소산염와 같은 다른 높은 독성 ROS의 전구물질이다. H₂O₂ 의 축적과 연관된 산화적 스트레스 및 염증반응은 허혈-재관류(I/R) 손상과 같은 다양한 병리적 상태의 발병 및 질병의 진행(development)과 매우 관련되어 있다.

I/R손상은 급성관상동맥증후군(Acute Coronary Syndrome), 간 및 신장의 허혈 발작, 심폐우회로술 및 혈관의 색전증 등과 같은 다양한 임상적인 상태에서 보여진다.

허혈 조직에서 혈류의 재관류는 H₂O₂ 의 많은 생성을 유도하고, 산화적 스트레스와 세포의 손상을 일으키며, 더 나아가 조직손상을 악화시킨다.

조직손상의 정도는 허혈성 질병과 연관된 병적상태 및 사망에 대한 가장 중요한 결정요인이므로, 이러한 조건에서 세포의 사멸을 억제하는 것이 긍정적인 결과를 내가 위한 더 중요한 접근법이다. 부분적 항산화 수용력을 초과하는 과도한 양의 H₂O₂는 산화적 손상에 대한 민감성을 결정한다. 그러므로 H₂O₂ 의 생성에 대해 부분적으로 집중하는 것은 다양한 질환의 병리에서 산화적 스트레스 손상을 멈출 수 있는 치료적으로 적절한 방법이다. 그러나 인간의 임상적 연구에서의 일반적인 항산화 치료에 대한 유익한 효과는 실망을 주어 왔다. 임상적 세팅에서 이러한 유익성의 부족에 대한 주요이유 중의 하나는 비특이적인 ROS의 억제가 바람직하지 않는다는 사실 때문이다. 비록 I/R손상 동안, H₂O₂ 의 과생산(마이크로몰 범위내에서)이 해롭다고 해도, 매우 낮은 수준의 H₂O₂ (나노몰 내에서)은 정상적인 생리적 세포기능을 위한 세포적 신호를 위해 필수적이다.

2011년, 거의 11%의 미국 성인은 심혈관계 질환을 진단받았고, 이의 50%이상이 또한 고혈압 및 뇌졸증과 같은 합병증을 경험할 것이다. 비록 심혈관계 질환이 다양한 병인을 갖고 있지만 병의 발병 초기 유도는 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis)과, 심장까지 및 심장으로부터 혈액공급을 운반하는 초기 혈관의 폐색(occlusion of primary vessels)이다. 병이 진행됨에 따라, 심폐우회로술(CPB) 또는 관상동맥우회로이식술(CABG)과 같은 필수적인 절차로 이어지도록 동맥의 막힘이 계속될 것이며, 그로 인해 새로운 혈관들이 향상된 순환이 가능하도록 플라그로 이미 막힌 곳을 우회하기 위해 우회하거나 생성된다. 거의 2%의 미국 성인 또는 395,000 개개인은, 심장마비와 같은 생명을 위협하는 질병을 겪지 않기 위해 CABG 과정이 매년 요구된다.

CABG은 긴 병원체류를 요구하고 수술후 허혈 또는 재관류와 연관된 합병증이 거의 결과적으로 발생하는 주요한 외과수술적 절차이다. CABG 동안(개개의 % 발생정도) 산화적 손상과 연관된 합병증은, 한정되지는 않지만, 심방세동(40%까지), 경색신전 : 경색-관련성 동맥의 재봉쇄 (IRA)(5-30%), 순환경색(17-25%), 부정맥(13.6%), 신장기능감소(5-10%), 뇌졸증(6.1%), 중증으로 발전한 MI(small-to-moderate MI)(2-4%), 심실의 심계항진/세동(2-3%), 울혈성심부전(2.4%), GI 기능장애(2.3%) 및 급성신장부전증(0.7%)를 포함한다.

특히 허혈 및 재관류 손상에서, 거의 15%의 이러한 환자들은 수술 전후 합병증이 발전하며, 환자당 최소 1,0000달러의 추가비용이 추가된다. 손상에 악화요소를 더하여, CABG수술에 따른 주요한 병리적 메커니즘 중 하나는 그 이후의 I/R손상이며, IRA의 재봉쇄와 같은 현상이 나타날 수 있다. 대략 5-30%의 환자들은 경색신전을 경험하며 17-25%의 환자들은 초기 IRA를 거의 경험한다. I/R을 경험한 환자들은, 또한 심근 및 미세혈관 스터닝(stunning)과 결합된 부정맥(13.6%), 및 초기 손상과 자주 구분이 어려운 출혈(5.6%)을 포함하는 증상이 임상적으로 존재할 수 있다. 게다가, I/R의 명백한 결과인 심근괴사는 치명적인 결과와 함께 다수의 CPB 환자들에게 존재해 왔다.

본 발명의 상기 항산화 화합물 (예를 들어, 4-(hydroxymethyl)phenylboronic ester)은 일반적으로 활성산소종 및 허혈-재관류(I/R)손상과 연관된 질병과 장애의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

어떠한 실시 예에서, 본 발명의 상기 화합물은 치료적인 활성의 시간적 및 공간적 조건으로 바람직한 약학적인 효과를 제공한다. 또다른 실시예에서, 본 발명의 상기 화합물은 타겟영역 특정과 자극 민감성이 있는데, 이것은 상기 화합물의 효과를 향상시키고 동시에 바람직하지 않은 부작용을 감소시킨다. 비록 대부분의 ROS가 극단적으로 짧게 생존하긴 하지만, H₂O₂ 는 생산된 가장 안정한 ROS 이다. 결론적으로, H₂O₂ 의 농도는 산화적 스트레스 동안 높은 수준으로 축적되는 경향이 있어 세포손상을 유발한다. 오직 H₂O₂ 와 반응하는 BRAP의 능력이, I/R손상 중에 보여지는 것처럼, 병리적으로 과 생산된 H₂O₂ 에 의해 특이적으로 활성화되고 건강한 부위는 겪지 않도록 한다.

천마(gastrodia elata)의 주요 활성성분 중의 하나인 HBA는, 뇌 허혈 손상 및 관상동맥 질환에 대한 보호적인 역할을 한다. 어떤 실시예에서, BRAP는 H₂O₂ -에 의해 활성화되는 HBA의 전구약물로, 여기서 H₂O₂ -매개 보로네이트 산화는 복합 생물학적 시스템 내에서 H₂O₂ 와 반응하고 H₂O₂ 를 제거하기 위해 화학선택적 접근으로써 작용한다. 분신자살하는(Self-immolative) 보로닉에스터(boronic esters) 보호기(protecting group)를 가진 BRAP는 급속하게 H₂O₂ 를 제거하고, 치료적인 HBA를 방출한다. 어떠한 이론에 의해 한정되어지지 않고, 이러한 특성은 BRAP가 표적화된 방법으로 산화적 스트레스를 겪고 있는 조직에서 상승적으로 강력한 항산화 및 항염증 효과를 발휘하도록 한다. 게다가, 보로닉에스터(boronic esters) 결합에 의한 HBA의 마스킹(Masking)은 또한 이것을 생체에 적합하게 만들어주고 물에 대한 용해도를 높여주어, 더 넓은 약학적인 응용성을 가능하게 한다. 본 발명에서 서술된 바와 같이, BRAP는 산의 조건에서 안정하며, 이것은 경구적으로 생체이용 가능한 약으로써 개발하게 해준다.

본 발명에서 서술된 바와 같이, 마우스의 간 및 심장의 I/R 손상 모델의 이용을 통해, BRAP는 효과적으로 감소된 산화적 스트레스, 염증반응, 그리고 세포자멸사의 개시를 보여준다. 게다가 7일간 매일 높은 농도의 BRAP의 투여는 신장 또는 간의 기능 이상을 보이지 않았으며, 조직분석 또한 탁월한 안전성 프로파일을 입증했다. 이러한 BRAP의 유용한 효과는 이후에 감소된 장기 손상과 기능 향상의 결과를 일으킨다. 이와 같이, H₂O₂ -에 의해 활성화되는 BRAP는, I/R손상에 대한 매우 강력한 타겟화된 치료적 물질이다.

어떠한 실시예에서, 본 발명의 상기 화합물은 수용액에 용해 가능하다. 또다른 실시예에서, 본 발명의 상기 혼합물은 수성 매체에 용해가 불가능하거나 난용성이다.

어떠한 실시예에서, 본 발명의 상기 화합물은 마이크로 입자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 마이크로입자는 무독성이며 생체적합하고, 생리적인 조건 하에서 분해가 가능하다. 또다른 실시예에서, 본 발명의 상기 마이크로입자는 poly lactic(PLA), poly(glycolic acid)(PGA, poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA), 및 poly(ε-caprolactone)(PCL) 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 상기 마이크로입자는 본 발명의 항산화 및/또는 항염증 화합물 및/또는 조성물을 포함하거나 방출하는데 유용하다.

발명의 설명

본 발명은 항염증 및/또는 항산화 화합물을 형성하기 위해 하이드로퍼옥사이드와 적어도 부분적으로 반응이 가능한 상기 보로닉에스터(boronic esters)를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 보로닉에스터(boronic esters)는 4-(하이드록시메틸)페닐보로닉 에스테르(4-(hydroxymethyl)phenylboronic ester)를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 항염증 및/또는 항산화 화합물은 페놀계의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 페놀계 화합물은 4-하이드록시벤질 알코올(4-hydroxybenxzyl alcohol, HBA)를 포함한다.

상기 보로닉에스터(boronic esters)는 알코올과 보로닉산(boronic acid)을 포함하고, 상기 보로닉산(boronic acid) 과 알코올은 보로닉에스터(boronic esters)를 형성하기 위해 공유결합으로 결합되어 있다. 일 실시예에서는, 상기 브로닉산(boronic acid)는 방향족이다. 다른 실시예에서는 상기 브로닉산(boronic acid)는 4-(하이드록시메틸)페닐보로닉산(4-(hydroxymethyl)phenylboronic acid)를 포함한다. 다른 실시예에서는, 상기 알코올은 디올(diol), 트리올(triol), 테트라올(tetraol), 펜타올(pentaol), 헥사올(hexaol) 또는 더 상위의 폴리올(polyol)이다. 다른 실시예에서, 상기 알코올은 디올 또는 트리올이다. 다른 어떤 실시예에서는, 상기 디올(diol)은 1,3-프로판디올(1,3-propanediol)을 포함한다. 또다른 실시예에서는, 상기 보로닉에스터(boronic esters)는 BRAP를 포함한다. 또다른 실시예에서는, 상기 트리올(triol)은 2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로판-1,3-디올(2-(hydroxymethyl)-2-methylpropane-1,3-diol)을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 보로닉에스터는 (4-(1,3,2-디옥사보리난-2일)페닐)메탄올((4-(1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl)methanol)을 포함한다. 또다른 실시예에서는, 상기 알코올은 치료대상에 무독성이며 생체적합성을 갖고 있다. 또다른 실시예에서는, 상기 치료대상은 포유류이다.

어떤 실시예에서는, 상기 보로닉에스터(boronic esters)는 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran), 디클로로메탄(dichloromethane) 또는 디메틸포름아마이드(dimethylformamide)과 같은 비수용매(nonaqueous solvent)에서 상기 알코올과 브로닉산(boronic acid)이 접촉저촉함으로써 제조될 수 있다. 제조된 보로닉에스터(boronic esters)는 추출, 결정화, 침전, 크로마토그래피 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않고, 당 업계에서 잘 알려진 방법을 이용하여 정제될 수 있다.

일 실시예에서는, 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)는 약학조성물의 일부이다.

일 실시예에서는, 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)는 마이크로입자에 포함된다. 또다른 실시예에서는, 상기 마이크로입자는 적어도 하나의 고분자(polymer)를 포함한다. 또다른 실시예에서는, 상기 고분자(polymer)는 poly lactic(PLA), poly(glycolic acid)(PGA), poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA), 및 poly(ε-caprolactone)(PCL), 및 이들의 결합으로 이루어진 그룹에서 선택되어진다. 또다른 실시예에서 상기 마이크로입자는 리포솜을 포함한다. 또다른 실시예에서, 상기 마이크로입자는 무독성이고 생체에 적합하며, 물리적 조건 하에서 분해되면서 항산화 및 항염증의 효과를 가진 HBA와 같은 항염증 및/또는 항산화 화합물을 방출한다. 본 발명의 마이크로입자는 항산화 또는 항염증 조성물의 구성요소 및 약물 전달 시스템으로서 유용하다.

일 실시예에서는, 상기 마이크로입자의 직경은 약 200 nm에서 약 20 μm까지의 범위이다. 또다른 실시예에서는, 마이크로입자의 직경은 약 200 nm에서 약 800 nm까지의 범위이다. 또다른 실시예에서는, 마이크로입자의 직경은 약 400 nm에서 약 600 nm까지의 범위이다.

본 발명은 또한 항산화 및/또는 항염증 약학조성물을 더욱 포함하며, 상기 조성물은 활성 요소로서 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)를 포함한다.

본 발명은 또한 허혈성 질병을 예방하거나 치료하는 약학적 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 활성 요소로서 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)를 포함한다.

본 발명에서 고려되는 허혈성 질환에 대한 한정되지 않는 예는 뇌의 허혈, 심장의 허혈, 당뇨성 심혈관계질환, 심부전, 심근비대, 망막 허혈, 허혈성 대장염, 중증하지허혈, 허혈성 급성신부전, 뇌졸중, 뇌외상, 태아저산소혈, 녹내장, 당뇨성 신경병증, 허혈성/재관류 손상 또는 허혈성/재관류 손상 합병증, 및 급성심정지소생(cardiac arrest resuscitation)과 같은 전신 허혈성/재관류을 포함한다.

하나의 실시예에서는, 상기 허혈성/재관류 손상이 심폐우회로술(CPB)과 연관이 있다. 또다른 실시예에서는, 허혈성손상은 관상동맥우회이식술(CABG)과 연관이 있다; 판막, 손상 또는 동맥류 회복; 심장, 폐, 신장, 간 및/또는 췌장 이식; 폐색전증; 또는 폐의 혈전내막제거.

하나의 실시예에서는, 본 발명의 화합물들이 CPB(및/또는 CABG)수술(즉, 심방세동, 경색신전, 경색관련동맥의 재폐색(IRA), 재발경색, 부정맥, 신장기능감소, 뇌졸중, 중증으로 발전되는 MI, 심실빈맥/세동, 충혈성 심부전, GI기능장애 및 급성신부전)과 연관있는 합병증의 치료에 유용하다.

본 발명은 또한 고형 장기 이식(간, 신장, 폐 또는 심장과 같은) 또는 고형 장기 보존(간, 신장, 폐 또는 심장과 같은)과 연관있는 허혈성 손상의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 활성요소로서 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 항산화효능, 항염증효능, 또는 허혈성 손상을 예방하거나 치료하는 효과를 가진 알려진 활성요소를 적어도 한가지 포함할 수 있다.

장기 또는 조직 이식

본 발명은 장기 또는 조직이식에 대한 향상된 방법을 특징으로 한다. 허혈성 손상 및 재관류 손상은 이식이 가능한 세포, 조직, 또는 장기의 생존률을 감소시킨다. 본 발명은 이러한 손상을 감소시킬 수 있는 조성물을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 한정되지 않고, 이식 전후 및 이식 동안 심장조직, 심장, 신장조직 신장, 간조직, 간, 폐조직, 폐, 췌장조직, 췌장, 소장조직, 소장, 흉선, 뼈, 연골, 근육 조직, 힘줄, 각막, 상피조직, 피부, 심장판막, 뉴런, 신경, 내피조직, 동맥, 또는 정맥을 포함하는 조직 또는 장기(기증(donor) 장기 또는 조직)에 투여된다. 장기 이식을 위한 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.

방 법

하나의 관점에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 치료대상에서 염증 또는 활성산소종과 관련한 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다. 하나의 실시 예에서는, 상기 방법은 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)의 치료적으로 효과적인 양을 치료 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 에스터(esters)는 치료대상의 신체 내에서 항염증 및/또는 항산화 화합물을 방출하기 위해 적어도 부분적인 분해를 겪는다.

다른 관점에서, 본 발명은 치료대상의 적어도 한 신체 부위에서 활성산소종(ROS)의 형성을 예방하거나 억제하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)의 치료적으로 효과적인 양을 치료대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 에스터(esters)는 치료대상의 신체 내에서 항염증 및/또는 항산화 화합물을 방출하는 적어도 부분적인 분해를 겪게 되며, 따라서 치료대상의 적어도 한 신체 부위에서 ROS의 형성이 예방되거나 억제된다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 이식을 위한 조직 또는 장기에서 허혈성 손상 또는 재관류 손상을 감소시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 이식 동안 또는 이식 후에 본 발명의 보로닉에스터(boronic esters)와 조직 또는 장기의 접촉을 포함하며, 상기 에스터(esters)는 항염증 및/또는 항산화 화합물을 방출시키기 위해 적어도 부분적인 분해를 겪게 되며, 따라서 조직 또는 장기에서 허혈성 손상 또는 재관류 손상이 감소 된다.

제형/투여

본 발명의 조성물은 약학적으로 수용가능한 운반체(carrier), 부형제 및/또는 희석액을 포함할 수 있고, 치료대상에게 적합한 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 당 업계에서 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 경구투여 형태 또는 살균된 주사가능한 용액을 포함하는 다양한 형태로 제조될 수 있다. 이에 더하여, 상기 조성물은 흡입제 형태의 약물전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 고형 나노파우더로 제조될 수 있다.

상기 조성물은 파우더, 과립, 정제(tablets), 캡슐, 서스펜션(suspension), 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용을 위한 제제, 좌약, 살균된 주사가능한 용액으로 제조될 수 있다. 당 업계에 잘 알려진 적합한 제형은 예를 들어, Remington’s pharmaceutical science(Mack publishing Company, Easton PA)에 알려져 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 운반체, 부형제 및 희석액은 lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidione, water, methylhydroxybenzoate, talc, propyl hydroxylbenzoate, magnesium stearate 또는 mineral oil을 포함한다.

본 발명의 조성물은 충진제(filler), 증량제(extender), 바인더, 습윤제, 붕해제(disintegrants) 또는 계면활성제와 같은 일반적으로 사용되는 희석액 또는 부형제로 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제형들은 정제, 환제(pills), 가루, 과립 또는 캡슐을 포함하고, 이와 같은 고형 제형들은, 또한 조성물에 더하여, 적어도 하나의 부형제, 예를 들어, 전분, 탄산칼슘, 수크로오즈(sucrose), 젖당(lactose) 또는 젤라틴(gelatin)을 포함한다. 단일 부형제에 더하여, 마그네슘 스테아르산염 또는 탈크와 같은 윤활제 또한 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액체 제형은 서스펜션(suspension), 용액, 에멀젼(emulsion) 및 시럽을 포함하고, 다양한 부형제, 예를 들어, 습윤제, 방향제(flavoring agents), 향료(aromatics) 및 보존제를 포함할 수 있고, 덧붙여 단일 희석액으로 자주 사용되는 물과 액체 파라핀을 포함할 수 있다.

비경구투여를 위한 제형은 살균된 수용액(sterilized aqueous solutions), 비수용액(non-aqueous solutions), 서스펜션(suspension), 에멀젼(emulsion), 동결건조 제제 및 좌약을 포함한다. 비수용매(non-aqueous solvents) 또는 서스펜션화제(suspending agents), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 올리브오일과 같은 식물오일 또는 에틸 올레산(ethyl oleate)과 같은 주사가능한 에스터(esters)가 사용될 수 있다. 좌약의 기제로서, witepsol, Macrogol, Tween61, cacao butter, laurin fat, 또는 glycerogelatin이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물의 바람직한 복용량은 환자의 상태 및 체중, 병의 종류, 약의 형태, 투여경로, 투여기간에 따라 달라지고, 당업자에 의해 적합하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위하여, 본 발명의 상기 약학조성물은 0.01-100mg/kg/day에서 복용될 수 있다. 상기 조성물은 하루에 한번 또는 여러 번에 걸쳐 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 경로에 의해 치료대상에게 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들어, 경구적, 직장으로, 또는 정맥, 근육 내, 피하, 진피, 자궁 내, 경막 또는 뇌실 내 주사 등이 고려되어진다.

다른 지시가 있다면, 상세한 설명 및 청구항에 사용되어진 원료들의 양, 분자량, 반응조건 등 과 같은 특성을 표현한 모든 숫자들은 용어 ‘약(about)’에 의해 모든 사례에서 수정되어 이해될 수 있다. 따라서, 반대로 지시되어 있지 않다면, 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구항에서 제시된 상기 숫자적 변수는, 본 발명에서 얻어지고자 하는 바람직한 특성에 따라 다양화될 수 있는 근사치이다. 적어도, 또한 청구의 범위에 동등한 원칙의 적용을 한정하는 시도로서가 아니라, 각각의 숫자적 변수는 일반적인 라운딩(rounding) 기법을 적용함으로써 보고된 중요한 숫자들의 개수를 고려하여 해석되어야 한다.

본 발명의 넒은 범위를 설명하는 숫자적 범위들 및 변수들은 근사값임에도 불구하고, 상세한 실시 예에서 설명된 상기 수치는 가능한 한 정확히 보고된다. 어떠한 수치는, 그러나, 그것들의 각각의 시험측정에서 발견된 표준편차로부터 필수적으로 결과로 되는, 일종의 오차(Errors)를 본질적으로 포함한다.

본 발명에서 값과 범위가 제공되는 곳이든 아니든, 값과 범위들을 포함하는 모든 값과 범위들은 본 발명의 범위 내에서 포함된다는 것을 의미한다고 이해되어야 한다. 게다가, 이 범위 내에 포함되는 모든 값들과 값들의 범위의 더 높거나 더 낮은 한계치도 또한 본 응용 예에 의해 또한 고려되어 진다.

상기 당업자는 본 발명에 설명된 상세한 실시과정, 실시예들, 청구항들 및 예시들과 숫자적으로 동등한 일반적인 실험을 더 이상 사용하지 않고 인식하거나 알아낼 것이다.

이러한 동등물들은 본 발명의 범위 내에 있다고 고려되어지며, 본 발명에 첨부된 청구항들에 의해 포함된다. 예를 들어, 더 이상의 일반적인 실험을 사용하지 않고, 반응시간, 반응크기/양, 및 용매와 같은 실험적 시약들에 한정되지 않고, 촉매, 압력, 대기조건(예를 들어 질소대기), 및 산화/환원제들, 및 기술적으로 알려진 대체물을 포함하는 반응 조건에서변경은 본 발명의 범위 내에 있다는 것이 이해되어야 할 것이다.

하기의 실시예들은 또한 본 발명의 측면을 설명한다. 그러나, 이것들은 본 발명에서 설명되어진 본 발명의 개시(disclosure) 또는 교시(teaching)를 한정하지 않는다.

실시 예

본 발명은 하기 실시 예들은 참조하여 여기 설명되어진다. 이 실시 예들은 설명만을 목적으로 제공되며, 본 발명은 이 실시 예들에 한정되지 않고, 오히려 본 발명에서 제공되는 교시(teaching)들의 결과로서 증명되는 모든 변수들을 포함한다.

BRAP 의 합성

H₂O₂-에 의해 활성화되는 항산화 전구체 BRAP는 4-(hydroxymethyl)phenylboronic ester와 2-(hydroxymethyl)-2-methylpropane-1,3-diol을 실온에서 반응시킴으로서 합성되었다(도 1a). BRAP는 하얀 수용성가루로 얻어지며, 이의 화학적 구조는 ¹H NMR에 의해 확인되었다 (도 1b).

과산화수소와 BRAP 의 반응

BRAP는 H₂O₂ 에 의하여 급격하게 산화되어 HBA, bornic acid 및 2-(hydroxymethyl)-2-methylpropane-1,3-diol을 생성하도록 디자인되었기 때문에, H₂O₂ 에 대한 BRAP의 민감도는 ¹H NMR을 사용하여 조사되었다. BRAP는 H₂O₂ 를 포함하는 D₂O에 첨가되며, 신호에 대한 변화는 시간에 따라 모니터 되어졌다. H₂O₂ 의 존재 하에서, BRAP는 H₂O₂ 농도 의존적으로 빠르게 산화되어 HBA를 생성하였고,새로운 방향족 양성자 피크가 6.8 및 7.2ppm에서 생성된 것으로 확인되었다. H₂O₂ 의 등가몰(equimolar) 농도(1mM)의 존재 하에서, 대부분의 보로닉에스터(boronic ester)는 ~5분의 가수분해 반감기를 가지고 30분 내로 제거되었다. 거의 모든 보로닉에스터(boronic ester)그룹은 5분 내에 5배 과량(5-fold excess)의 H₂O₂ (5mM)에 의하여 제거되었다. 그러나, H₂O₂의 부 존재 시에는, 상기 브로닉 에스터(boronic ester)는 3일 후에도 온전히 남아있었다.

H₂O₂에 의한 BRAP의 활성은 또한 UV분광기(spectroscopy)를 사용하여 연구되었다. BRAP는 H₂O₂ 와 혼합되었고, UV흡수량의 변화가 시간에 따라 모니터되었다. 273nm에서의 흡수량은, HBA의 페놀 하이드록시 그룹의 출현으로 인하여, 시간에 따라 증가하였고, 예측된 브로닉 에스터(boronic ester)의 절단과 HBA의 생성이 입증되었다 (도 2a). 90분의 처리 후, BRAP는 UV흡수량에서 더 이상의 증가가 보여지지 않았고, 이의 UV흡수량 강도는 같은 농도의 HBA와 거의 같았다.

어떠한 이론에 의한 한정 없이, BRAP는 이것의 H₂O₂ 매개 보로네이트 산화(boronate oxidation) 동안에 H₂O₂ 를 제거할 수 있었다. 이 가능성은 퍼옥살레이트 화학발광(peroxalate chemiluminescence)을 사용하여 조사되었다. 퍼옥살레이트 화학발광(peroxalate chemiluminescence)은 이것의 우수한 정확정과 간편함 때문에 형광분자와 H₂O₂ 를 포함하는 다양한 화학종의 검출을 위한 다양한 목적의 도구(tool)로 사용되어 왔다 (Hadd, et al., 1999, J. Chem. Educ. 76:1237; Lee, et al., 2011, Bull. Korean Chem. Soc. 32:2187). 상기 순수한 H₂O₂ 용액은 매우 높은 방출강도(~1.3x105 RLU)를 보였다. BRAP의 추가는, 농도 의존적으로, 화학발광강도에서 상당한 감소가 발생되었다 (도 2b). 대부분의 H₂O₂ 은 1분 내에 같은 농도의 BRAP에 의해 소거되었다. 대조적으로, HBA 단일 군(10μM)은 화학발광강도를 감소시키지 않았다. 이러한 관찰들은 BRAP가 H₂O₂ 와 빠르게 반응하여 H₂O₂ 가 효과적으로 제거되는 것을 입증하였다. 게다가, BRAP의 안정성은 72시간 동안의 인큐베이션 동안에, 산성환경(pH 3.0)에 의해 영향을 받지 않았다 (도 2c).

BRAP 의 세포독성

BRAP의 초기 세포독성실험은 생체 외(in vitro)에서, 다양한 세포계들(cell lines)과 성인 랫트의 심실근육세포(ventricular cardiomyocyte(ARVC))의 초대배양(primary culture)에서 24시간의 인큐베이션 후, 5mM와 같은 높은 농도에서 유의성 있는 세포독성이 없음을 증명하였다.(도 3a-3b 및 도8a-8b)

실시예 4. BRAP 의 항산화특성

상기 BRAP의 항산화 활성은, LPS(lipopolysaccharide) 에 의해 자극된 마우스의 대식세포(RAW 264.7) 및 섬유아세포(NIH/3T3)를 이용하여 시험되었다(도4a-4b). 자극된 세포에서 세포 내의 ROS 생성은, H₂O₂ 및 하이드록시 라디칼과 같이 다양한 세포 내 산화제의 작용에 의하여 산화될 수 있고 형광 디하이드로디클로로플루오레세인(dihydrodichlorofluorescein, DCF)이 되는 DCFH-DA(dihydrodichlorofluorescein-diacetate)를 이용한 형광유세포분석기(flow cytometry)에 의해 분석되었다 (Kim, et al., 2011, biomat. 32:3021; Cho, et al., 2012, Adv. Funct. Mat 22:4038). 처리되지 않은 세포는 유의한 DCF형광을 갖지 않는다. 반대로, LPS가 DCFH-DA를 형광 DCF로 산화시키는 ROS의 생성을 유도하기 때문에, 강한 DCF형광은 외인성(exogenous) LPS로 처리된 세포에서 관찰되었다.

0.5mM의 HBA는 농도의존적으로 , ROS생성에 중간 정도의 억제효과를 보였다. 그러나 0.25mM의 BRAP는, 0.5mM의 HBA보다, LPS유도성 ROS의 생성에 유의성있게 더 강한 억제효과를 나타냈다. LPS유도성 ROS생성의 유사한 억제가 마우스의 섬유아세포에서도 관찰되었다 (도 9).

심혈관계 질환이 산화적 스트레스 손상과 관련된 가장 일반적이고 임상적으로 관련된 문제들 중 하나이기 때문에, H₂O₂ 유도성 세포사멸로부터 세포적 보호에 대한 BRAP의 효과는, 또한 in vitro 에서 ARVC를 이용하여 조사되었다. H₂O₂ (25mM)는 대략 30%의 세포사멸을 유발하였다. 상기 대조군(vehicle control)과 비교하여, BRAP는 농도의존성으로, H₂O₂ 유도성 세포사멸로부터 유의성있는 보호를 보였다 (도 4c).

일산화질소생성에 대한 BRAP 의 효과

일산화질소는 산화적 스트레스의 주요 원인 중 하나이자 염증 발병에서 잘 알려진 전염증(pro-inflammatory) 매개체(mediator)이다 (Lundberg, et al., 1997, Nature Medicine 3:30). LPS로 처리된 세포에서 일산화질소 생성에 대한 BRAP의 효과는 그리스반응 (Griess reaction)에 기초한 색상 어세이(colormetric assay)를 사용하여 연구 되었다. LPS는 많은 양의 일산화질소생산을 유도하였고, BRAP는 시간과 용량 의존적으로 일산화질소 생성에 억제효과를 나타냈다 (도 4d). HBA 단일 군은 또한 0.5Mm보다 높은 농도에서만 일산화질소생성을 억제하였고, 이것은 BRAP의 더 우수한 항산화 특성을 암시한다.

BRAP 의 항염증 효과

LPS로 자극된 세포에서의 BRAP의 항염증 효과는, TNF-α(tumor necrosis factor alpha) 및 iNOS (inducible nitric oxide synthases) 와 같은 염증성 사이토카인의 레벨을 측정함으로써 조사되었다(도 4e-4f). 상기 TNF-α의 수준은 LPS처리에 의해 유의성있게 증가하였다. BRAP는 TNF-α 및 iNOS의 수준 모두를 유의성있게 억제함으로써 강한 항염증 효과를 나타냈다. HBA 단일군은 또한 BRAP보다 높은 용량에서만 TNF-α의 발현을 감소시켰고, iNOS의 수준을 더 높은 용량에서도 감소시키는데 실패했다. 이러한 관찰은 BRAP가 과생산된 H₂O₂ 를 제거하면서 동시에 활성화된 항산화제로서 작용할 수 있음을 가리킨다. 또한, 상기 BRAP의 향상된 항산화 활성은, H₂O₂ 로 매개된 보로네이트(boronate)의 산화 후, H₂O₂ -를 소거하는 보로닉에스터(boronic ester)와 동시에 생성된 HBA의 시너지효과로부터 유래 된다.

BRAP 의 세포사멸제 및 항염증효과

BRAP가 ROS 생성을 감소시키며 세포사멸을 억제하는지를 평가하는 실험들은, 하지(hind-limb) I/R 손상의 마우스 모델에서 수행되었다. I/R은 1시간 동안 간동맥 및 간문맥의 결찰(ligation)에 의해 처음 유발되었고 뒤이어 간동맥의 재관류를 유발했다. BRAP 또는 HBA는, 재관류 시점에서 복강 내(i.p)에 투여되었다. I/R의 손상 후, 조직학적 분석(histological analysis)은 염증성 세포의 증가된 침투에 의해 증명되었듯이 간의 손상을 입증했다 (도 5a).

I/R 동안, HBA는 간 손상에 대한 최소한의 치료적 효능을 보여주었지만, 같은 복용량의 BRAP은 이러한 조직들의 손상이 유의적으로 약화된 결과를 보였다. I/R손상 동안, ROS생성에 대한 BRAP의 효과를 조사하기 위하여, 조직들은, 세포에 침투가능하고 초과산화물(superoxide), H₂O₂ 및 다른 활성산소를 포함하는 산화제의 존재하에 형광으로 변하는 dihydroethidium(DHE)로 염색되었다.

I/R손상은 강한 보랏빛 형광검출로 증명되었듯이 ROS의 과량생산을 유발하였다. ROS생성은 HBA 및 BRAP 모두에 의해 억제되었으나, BRAP는 HBA보다 ROS 생성에 대해 더 높은 억제효과를 보였다. I/R손상은 또한 강한 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transterase dUTP nick end labeling)양성 세포의 수로 인해 확인되었듯이 심각한 간의 세포자멸사를 유발하였다. HBA는 간의 세포자멸사에 대한 보통의(modest) 억제효과를 보인데 반하여, 같은 복용량의 BRAP는 HBA보다 유의성있게 더 큰 항세포자멸사(anti-apoptotic) 효과를 보였다.

조직학적 발견에 따르면, I/R은 혈청에서의 ALT(alanine transaminase)의 증가에 의해 측정되었듯이 간의 손상을 유발하였다 (도 5b). BRAP는 I/R로 유발된 간의 손상으로부터 농도의존적인 보호능(protection)을 보였다. HBA 는 BRAP에 비하여 훨씬 적은 강한 보호적 효과(potent protective effect)를 가졌다.

게다가, BRAP의 항세포자멸사 및 항염증 특성은 또한 절단된 caspase-3 및 TNF-α 단백질 발현의 레벨을 각각 측정함으로써 평가되었다. HBA은 절단된 caspase-3 및 TNF-α에 대한 최소한의 억제효과를 가졌다. 반면에, 같은 복용량의 BRAP는 caspase-3 및 TNF-α 활성에 대한 유의적인 억제를 보였다 (도 5c-5d). 상기 결과들은 in vitro 에서, 간의 I/R손상 마우스 모델에서 BRAP의 항염증 및 항 세포자멸사 특성을 보여준다.

심장의 I/R손상 모델에서 BRAP 의 효과

BRAP의 상기 유익한 효과는 또한 심장의 I/R손상의 in vivo 마우스 모델을 사용하여 조사되었다. 허혈 45분 후, BRAP(1.5mg/kg) 또는 vehicle은 재관류 시점에 i.p로 투여되었으며, 그리고 나서 매일(1.5mg/kg) 2주간 투여되었다. 심장의 기능적 분석을 위하여, PV(pressure-volume) 루프(loop) 측정 및 심장초음파가 I/R수술 후 2주에 실시되었다. PV(pressure-volume) 루프(loop) 분석은, I/R손상 이후 2주 동안, 심박출량(cardiac output(CO)), SW(stroke work) 및 박출계수(ejection fraction(EF))의 유의적 감소를 보였다 (도 6a 및 도10a-10b).

심장초음파를 이용한 추가적인 심장의 기능적 분석은 또한, I/R 수술 이후 2주에 구획단축률(fractional shortening(FS))의 유의적 감소를 보였다 (도 10c). BRAP의 투여는, PV(pressure-volume) 루프(loop)분석 및 심장초음파 모두에서, I/R 유발성 심장 기능장애를 유의성있게 감소시켰다.

본 연구는 I/R 이후 BRAP의 유익성이 산화적 스트레스, 염증, 및 세포자멸사의 감소와 관련이 있는지를 밝히기 위해 수행되었다. 이러한 기계적인 분석은 심장의 I/R손상 이후 24시간에 심장조직에서 수행되었다. ROS를 제거함으로써 BRAP의 항산화 효과를 탐색하기 위해, DHE(dihydroethidium) 염색이 I/R이후에 ROS생성의 지표로서 사용되었다. ROS의 생성은 vehicle 처리된 마우스 군에서의 I/R 이후 유의성있게 증가되었다 (도 6b). BRAP 투여는 DHE염색을 유의성 있게 감소시켰고, I/R이후에 ROS생성에 대한 BRAP의 제거효과를 보여 주었다. 게다가, 염증반응에 대한 평가는, TNF-α 및 단핵세포 화학주성 단백질-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)의 mRNA레벨이 유의성 있게 증가하는 것으로 보여졌다 (도 6c, 11a 및 11b). BRAP의 투여는 vehicle-처리된 마우스 군에 비하여, TNF-α 및 MCP-1의 발현을 감소시켰다.

I/R이후, BRAP의 항세포자멸사 효과를 평가하기 위하여, caspase-3 활성 어세이 및 TUNEL 염색이 수행 되었다. 세포자멸사의 지표인 caspase-3활성은 I/R이후 유의성 있게 상승했다 (도 6d). BRAP는 capse-3의 활성을 효율적으로 감소시켰다. 게다가, I/R의 24시간 이후 TUNEL-양성 심근세포의 유의성 있는 증가에 의해 증명된 것처럼, I/R은 심근세포 세포자멸사(cardiomyocyte apoptosis)를 증가시켰으며, 이는 BRAP에 의하여 효과적으로 억제되었다 (도 6e-6f). 상기 결과들은, BRAP처리가 산화적 스트레스와 염증을 방지함으로써 I/R유발 심장 손상을 효과적으로 예방하고 세포자멸사를 억제했다는 것을 증명했다.

BRAP 의 독성효과

BRAP의 잠정적인 누적 독성효과를 알아내기 위하여, BRAP(1.5mg/kg/day)은 마우스에게 7일동안 매일 투여되었다. 신장 및 간의 기능에 대한 혈청테스트는 7일 후에도 유의성 있는 비정상을 보이지 않았다 (도 7a-7b). 게다가, 7일 동안 BRAP를 투여한 이후, 다른 장기에서도 축적된 독성에 대한 유의성 있는 조직학적 증거가 없었다. (도 7c). 상기 관찰들은 BRAP가 in vivo 에서 치료적인 복용량에서도 우수한 안전성을 가졌음을 증명하였다.

4-(1,3,2- 디옥사보리난 -2-일) 페닐 메탄올 (4-(1,3,2- Dioxaborinan -2-yl)phenyl)methanol)의 합성

4-(하이드록시메틸)페닐 보로닉 산((4-(hydroxymethyl)phenyl) boronic acid)은 THF에 첨가되어 현탁액(suspension)을 형성했다. 1,2-propanediol이 첨가되었고 상기 현탁액을 24시간 동안 저었다. 24시간 이후, 상기 혼합물은 맑아졌다. 그런다음, 황산 나트륨(Sodium sulfate)이 첨가되었고, 상기 혼합물을 또한 24시간 동안 저었다. 필터 후, 상기 생산물(product)은 회전증발기(rotary evaporator)를 사용하여 용매로부터 분리되었다. 상기 정제되지 않은 생성물(crude product)는 컬럼크로마토그래피에 의해 정제되었다(ethylate : hexane = 2:3) (도 12 참고).

4-(1,3,2- 디옥사보리난 -2일) 페닐 메탄올(4-(1,3,2- Dioxaborinan -2-yl)phenyl)methanol)에 의한 H ₂ O ₂ 제거

보로네이트(Boronate)화합물의 H₂O₂ 를 제거 능력은, 루브렌(rubrene)을 포함하는 디페닐 옥살레이트(diphenyl oxalate) 용액과의 반응 후의 화학발광 강도를 측정함으로서 평가되었다. 상기 보로네이트(boronate)(1μM, 또는 10μM)는 H₂O₂ 용액(10 μM)에 첨가되었다. H₂O₂ 과 1분의 반응 후, diphenyl oxalate 용액은 H₂O₂ 용액에 첨가되었고, 상기 화학발광의 강도는 루미노미터(luminometer)를 사용하므로써 측정되었다 (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation, TN, US; 도 13).

상기 여기서 서술된 상기 결과들은 하기의 재료들과 방법을 사용하여 수행되었다.

BRAP 의 합성

4-(하이드록시메틸)페닐 보로닉 산((4-(hydroxymethyl)pheny)lboronic acid) 및 2-(하이드록시메틸-2-메틸프로판-1,3-디올(2-(hydroxymethyl)-2-methylpropane-1,3-diol)을 건조된 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)에 용해시키고 상기 혼합물은 실온에서 기계적으로 저어지도록(stirring)했다. 상기 반응 혼합물은 24시간의 반응 후 맑아졌으며, Na₂SO₄을 첨가하였다. 상기 반응은 실온에서 하룻밤(overnight)동안 두었고, 용매는 증발시켰다. BRAP는 실리카 겔 크로마토그래피를 이용하여 얻어졌다 (hexane/ethyl acetate = 70/30).

BRAP 의 가수분해 운동( Kinetic )

BRAP는 1mM의 농도에서 PBS(pH 7.4)에 용해되었고, 100μM의 H₂O₂ 의 존재 하에, 37 ℃에서 인큐베이션 되었다. BRAP에서부터 생성된 HBA의 농도는, 적절한 시점에 UV분광기(spectrometer)를 사용하여 측정되었다.

BRAP 의 H ₂ O ₂ 제거와 세포독성

3-(4,5-dimethylthiazil-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 어세이는 BRAP의 세포독성을 평가하기 위해 수행되었다. NIH3T3세포들은 24웰 플레이트에서 1X10⁵ 세포/웰의 밀도로 배양되었으며, RAW 254.7 세포들 및 HEK 세포들 또한 24웰 플레이트에 2X10⁵ 세포/웰의 밀도로 배양되었다. 세포들은 ~80%의 confluency에 이르기 위해 24시간 동안 배양되었다. 세포들은 다양한 양의 BRAP로 처리되었고, 24시간 동안 배양되었다. 각각의 웰에 100μL의 MTT용액이 분주되었고, 4시간 동안 배양되었다. 200μL의 DMSO가 결과적으로 발생된 포르마잔 결정(formazan crystals)들을 용해하기 위하여 각각의 웰에 첨가되었다. 10분의 배양 후, 570nm에서의 흡광도가 마이크로플레이트 리더(Biotek Instrumnets, Winooski, VT)로 측정되었다. 상기 세포의 활성도는 대조군의 세포의 흡광도와 BRAP처리 세포의 흡광도를 비교함으로써 측정되었다.

H₂O₂ 를 제거하는 BRAP의 능력은, 루브렌(rubrene)을 포함하는 디페닐 옥살레이트(diphenyl oxalate) 용액와 반응한 후, 화학발광 강도를 측정함으로서 평가되었다. BRAP(1μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM)을 H₂O₂ 용액(10 μM)에 첨가한다. H₂O₂ 와 1,5 또는 10분의 반응 후, diphenyl oxalate 용액은 H₂O₂ 용액에 첨가되었고, 화학적 발광은 광도계(luminometer, Femtomaster FB 12, Zylux Corporation, TN, US)를 이용하여 측정되었다.

공초점 레이저 스캐닝 현미경

세포들은 24시간 동안 250 μM 의 H₂O₂ 로 전처리 되었고, 그리고 나서 HBA와 BRAP로 15분 동안 처리되었다. 세포 내의 ROS 레벨을 측정하기 위하여, 세포들은 DCFH-DA로 15분간 처리되었다. 세포들은 신선한 배지로 두 번 세척되었고, 공초점 스캐닝 현미경으로 분석되었다.

동물 수술( Animal surgeries )

간의 I/R 수술은 12주 된 수컷 마우스에서 수행되었다. 간단하게, 마우스는 마취되었고, 개복술을 위하여 정중선절개가 수행되었다. portal triad, biliary tree를 확인한 후, 간문맥과 간동맥의 주요한 몸통은, 간의 대략 70%가 허혈성 손상에 이르게 하기 위하여 맥관구조의 오른쪽 아래의 엽(lobe)을 제외하고 혈관 클립으로 고정되었다. 1시간의 허혈 이후, 재관류가 혈관클립을 풀면서 이루어졌다. 마우스의 sham group은 혈관 결찰(clamp)을 하지 않았다.

심장 I/R/수술은 Choudhury, et al., 2011, Basic Res Cardiol 106:397에 서술된 것과 같이 12주된 수컷 마우스에서 수행되었다. 간단히 말하면, 마우스는 마취되었고, 설치류 벤틸레이터(ventilator)에 놓았다 (model 687, Havard Respirator). 개흉술 후, 왼쪽 앞쪽의 하향 동맥(LAD, left anterior descending artery)이 확인되고, 특수화된 30G-카테테르(catheter)를 둘러싸게 매어서 7-0 실크 봉합선으로 묶었다. 상기 동물들을 마취와 벤틸레이션(ventilation) 조건하에 허혈상태에서 45분간 두었고, 이후 상기 봉합선을 자르고 동맥의 관류가 다시 재건됨으로써 상기 재관류가 이루어졌다. Sham 수술된 마우스는 LAD의 폐쇄 없이 같은 과정을 겪게 했다.

심장의 기능적 분석

심장의 기능은 압력-부피 루프 분석(pressure volume loop measurement) 와 심장초음파를 사용하여 Lee, et al., 2013,Sci,Rep 3:2233에 서술된 것과 같이 I/R이후 2주에 측정되었다. 압력-부피 변수(pressure volume parameters)들은 오른쪽 일반 경동맥 안에 삽입한 1,4 Fr. 마이크로-팁 압력-볼륨 카테테르(1,4 Fr. micro-tip pressure-volume catheter) (Scisense Incm Ontario, Canada)를 사용하여 isoflurane(2%) 흡입제 마취 후 측정되었다. 상기 카테테르(catheter)는, LV 혈류역학적 변수들을 획득하기 위해 왼쪽 뇌술 안쪽으로 살살 다가가야 했다. 데이터는 Powerlab system (ADInstruments, Colorado Springs, CO)를 이용하여 기록되었다. 심박동수(HR), 박출량(SV), 박출작용(SW) 및 심박출량(CO)를 포함하는 맥박 압력-부피 변수에 의한 맥박은 Cardiosoft pro software (Cardiosoft, Houston, TX)를 이용하여 측정되고 분석되었다. 흉강을 통한 심장초음파는 MS400변환기(18-38MHz)(Visualsonics, Toronto, Canada)와 함께 Vevo2100 극초단파 소형동물 이미징 시스템(Ultra-high frequency small animal imaging system)을 이용하여 수행되었다.

세포사멸어세이 ( apoptosis assay )

간의 세포사멸 어세이를 위하여, TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 염색이 DeadEndTM fluorometric Tunel kit(promega, Madison, WI)를 이용하여 수행되었다. 조직 구획(section)은 핵 (4’-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)염색) 및 세포사멸핵(TUNEL 염색)을 염색하였고, 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 분석 되었다. 심장조직을 위하여, TUNEL염색은 in situ 세포 사멸 검출 키트, 플루오레세인(fluorescein) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 사용하여 수행되어졌다. 비 심장근육세포 핵으로부터의 심장근육세포를 감별하기 위하여, 핵의 삼중염색(DAPI염색), 사멸세포핵(TUNEL염색) 및 심장근육세포(α-Actinin 염색)이 사용되었고, 염색된 구획은 공초점 현미경을 사용하여 분석되었다. ~2000-핵/필드와 최소한의 ~10 고출력 필드는 각각의 샘플에 대해 산출되었다.

caspase -3 및 PARP 활성 어세이

caspase-3의 활성은, Choudhury, et al., 2011, Basic Res Cardiol 106:397; Bae, et al.,2010, Am J Physiol Heart Circ Physiol 299:H1374에 설명된 것과 같이, 비색분석법 키트(colorimetric assay kit) (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 측정되었다. 간단히 말하면, 단백질 샘플은 Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide 의 기질들에 첨가되었다. p-nitroanilide의 효소-촉매적인 방출은 405nm 에서 측정되었다. PRAP 활성어세이를 위하여, 활성은 비색분석법 키트(colorimetric assay kit) (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여, 플레이트에서 히스톤(histone)코팅된 단백질들 위에 biotinylated poly(ADP-ribose)를 결합함으로써 450nm에서 측정되었다.

역전사 중합효소 연쇄반응( Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction)(RT-PCR) 및 웨스턴블롯어세이 ( Western blot assay )

분자분석을 위해 모아진 심장조직들은, Bae, et al.,2010, Am J physiol Heart Circ Physiol 299:H1374에 따라 분석이 수행되었다. RT-PCR을 위해 리보솜의 18S 프라이머들은 내부적 대조군으로 작용했고 모든 RT-PCR 신호들이, 관련된 RT 생성물들의 18S 신호에 대해 표준화 되었다. 웨스턴 블랏 분석을 위해, 단백질 함유물은 BCA 어세이를 사용하여 측정되었다.

활성산소종 ( ROS ) 염색

OCT(The optimal cutting temperature)-내장된 조직들은 4% paraformaldehyde에 고정되었다. 조직구획은 37℃에서 30분 동안 빛이 차단된 수분이 있는 챔버에서 5μM dihydroethidium(DHE,Sigma-Aldrich)와 배양시켰다. 그리고 나서, 4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)이 적용되었다. 이미지들은 공초점 형광 현미경으로 얻어졌다.

통계적 분석( Statistical Analyses )

데이터들은 평균들 ±SEM으로써 표현되었다. 그룹들 간 및 그룹들 내의 비교는 Graphpad prism 5.0(San Diego, CA)를 사용하여 unpaired Student t-tests와 반복된 ANOVA측정으로 수행되었다. <0.05의 p-values는 유의성 있다고 고려되었다.

신장의 허혈/ 재관류(IR)손상에 대한 BRAP 의 경구투여의 효과

경구적으로 투여된 BRAP는 마우스에서 신장 I/R 손상 모델에서 실험되었다. 상기 모델에서, 마우스의 신장 중의 하나는 단독적인 클램핑(unilateral clamping) 및 대측성 신장절제술(contralateral nephrectomy)의 혼합을 사용하여 대략 30분 동안 허혈상태로 하였다. BRAP는 마우스에게 두 번의 시점에 경구적으로 투여되었다: 수술 전의 밤, I/R수술 바로 직전. I/R 후의 판독 마커들은 다음을 포함했다: 재관류 이후, 24시간의 크레아티닌(Creatinine) 레벨; TNF-α 및 단핵구 화학주성인자 단백질-1(monocyte chemo-attractant protein-1)(MCP-1)(모두 염증 마커들); DHE염색(ROS생성을 위한 모니터링); 및 TUNEL염색(세포사멸을 위한 모니터링).

상기 결과들은, 경구적으로 매일 투여한 BRAP(8mg/kg)이 4일후 신장의 I/R손상의 모델에서 신장 기능의 유의한 향상 결과를 보였음을 나타냈다 (도 14). 또한, 본 발명에서 서술된 바와 같이, 항염증 마커인, TNF-α 및 MCP-1 의 활성은 BRAP의 경구적 투여로 유의하게 경감되었다 (도 15). ROS생성의 마커인, DHE 염색(도 16) 및 세포사멸의 마커인, TUNEL염색(도 17)들 또한 BRAP의 경구투여에 따라 유의하게 감소되었다.

여기서 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허출원 및 공개된 개시들은, 이로써 그들의 전부에서 참조함으로써 여기서 포함된다.

본 발명이 특정 실시 예들에 참조와 함께 개시되나, 다른 실시 예들과 본 발명의 변형들이 본 발명의 순수한 원리와 범위에서 분리되지 않고 당 업계에서 잘 알려진 다른 것들에 의해 창안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구항들은 모든 이러한 실시 예들과 동등한 변형물들을 포함하여 이해되기 위한 것이다.

Claims

4-(하이드록실메틸)페닐보로닉에스터 (4-(hydroxymethyl)phenylboronic ester)
제 1항에 있어서, 상기 보로닉에스터(boronic ester)는 diol, triol, tetraol, pentaol, hexaol 및 더 높은 polyol로 이루어진 그룹에서 선택된 알코올을 더욱 포함하고, 여기서 상기 알코올 및 4-(하이드록실메틸)페닐보로닉 산(4-(hydroxymethyl)phenylboronic acid)은 공유결합으로 결합되어 형성된 것을 특징으로 하는 보로닉에스터(boronic ester).
제 2항에 있어서, 상기 알코올은 diol 또는 triol을 포함하는 것을 특징으로 하는 보로닉에스터(boronic ester).
제 3항에 있어서, 상기 알코올은 1,3-propanediol 또는 2-(hydroxymethyl)-2-methylpropane-1,3-diol을 포함하는 것을 특징으로 하는 보로닉에스터(boronic ester).
제 1항에 있어서, 상기 보로닉에스터(boronic esters)는 4-(5-(hydroxymethyl)-5-methyl-1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl methanol 또는 4-(1,3,2-dioxaborinan-2-yl)phenyl methanol을 포함하는 것을 특징으로 하는 보로닉에스터(boronic ester).
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 보로닉에스터(boronic esters)를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
제 6항에 있어서, 상기 마이크로입자는 폴리머(polymer) 또는 리포좀(liposome)을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
제 7항에 있어서, 상기 폴리머(polymer)는 poly (lactic acid)(PLA), poly(glycolic acid)(PGA), poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA), 및 poly(ε-caprolactone)(PCL)로 이루어진 그룹에서 적어도 하나를 선택하여 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 보로닉에스터(boronic esters)를 포함하는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 보로닉에스터는 체내에서 4-hydroxybenxzyl alcohol(HBA)를 방출하기 위해 적어도 부분적으로 분해되는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 산화적스트레스 손상은 급성관상동맥증후군(Acute Coronary Syndrome), 간의 허혈, 신장의 허혈, 뇌의 허혈, 관상동맥질환, 심폐우회로술, 전신 허헐성/재관류 및/또는 혈관의 색전증 등과 연관된 허혈/재관류 손상인 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 11항에 있어서, 상기 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료는 허혈성/재관류 손상과 연관이 있는 세포사멸(apoptosis) 또는 염증반응을 감소시키는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 11항에 있어서, 상기 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료는 ROS의 형성을 억제하거나 예방하는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제13항에 있어서, 상기 ROS는 Superoxide 또는 peroxide species를 포함하는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 9항에 있어서, 상기 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료는, 조직 또는 장기의 이식하는 동안 또는 이식 전후에, 조직 또는 기관에서의 허혈성 손상 또는 재관류 손상을 감소시키는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 15항에 있어서, 상기 조직 또는 장기는 심장조직, 심장, 신장조직, 신장, 간 조직, 간, 폐 조직, 폐, 췌장, 췌장조직, 장 조직, 장, 흉선, 뼈, 연골, 근육조직, 힘줄, 각막, 상피, 조직, 피부, 심장 판막, 뉴런, 신경, 내피조직, 동맥 또는 정맥인 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 15항에 있어서, 상기 허혈성 손상 또는 재관류 손상이 감소되는 것은 상기 허혈성 손상 또는 재관류 손상과 관련된 세포사멸 또는 염증을 감소시키는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 17항에 있어서, 상기 세포사멸을 감소시키는 것은 심장, 간 또는 신경세포의 사멸을 감소시키는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 18항에 있어서, 상기 심장의 세포사멸을 감소시키는 것은 PV loop 분석법 및/또는 심장초음파에 의해 평가되는 심장의 기능장애를 감소시키는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 17항에 있어서, 상기 염증을 감소시키는 것은 TNF-α 및/또는 유도되는 일산화질소 합성수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 17항에 있어서, 상기 세포사멸 또는 염증은, 급성관상동맥증후군(Acute Coronary Syndrome), 간의 허혈, 신장의 허혈, 뇌의 허혈, 관상동맥질환, 심폐우회로술, 전신의 허헐성/재관류 및/또는 혈관의 색전증과 관련된 세포사멸 또는 염증인 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 6항의 마이크로 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 손상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 보로닉에스터(boronic esters)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 시스템.
제 6항의 마이크로 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 시스템.
제 9항의 약학조성물을 포함하는 약물전달 시스템.