KR20160046017A - 신독성을 감소시키는 반코마이신과 실라스타틴의 조성물 - Google Patents

Abstract

본원은 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물, 및 이를 이용한 박테리아 감염의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

신독성을 감소시키는 반코마이신과 실라스타틴의 조성물 {COMPOSITION INCLUDING VANCOMYCIN AND CILASTATIN HAVING REDUCED NEPHROTOXICITY}

본원은 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물, 및 이를 이용한 박테리아 감염의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

반코마이신(Vancomycin)을 포함하는 글리코펩티드계 항생제는 다양한 미생물에 의해 생산되는, 잘 알려져 있는 부류의 항생제이다. 이러한 복합적 다중-고리 펩티드 화합물은 대부분의 그람 양성균에 대한 매우 효과적인 항균성 약제이다. 특히 반코마이신은 1958년부터 임상적으로 사용되어 박테리아의 세포벽에 작용하여 박테리아의 증식을 억제하는 효과가 매우 우수한 항생제이다.

그러나, 이러한 반코마이신의 강력한 항균 특성에도 불구하고, 반합성 페니실린, 세팔로스포린 및 린코마이신 같은 다른 부류의 항생제만큼 박테리아성 질병 치료에 널리 사용되지는 않는데, 이는 반코마이신의 신독성에 관한 염려 때문이다.

최근 중환자에 대한 반코마이신의 치명적인 신독성의 위험이 보고되어 (최저 농도 15~20 ㎍/ml) 다른 대체 신약의 사용이 권장되기도 하였다. 이러한 반코마이신의 신독성이 유발되는 정확한 기전은 아직 알려져 있지 않다.

따라서, 유효한 항균 활성 및 포유동물에 대한 개선된 안전성 프로파일을 가지는 신규한 글리코펩티드계 항생제에 대한 필요성이 존재한다. 특히, 반코마이신은 병원 내 감염의 주요 인자인 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에 대한 1차 치료제인데, MRSA는 현재 가장 대표적인 슈퍼박테리아 중의 하나로 미국에서만 연간 MRSA 균에 감염된 환자가 10 만 명 가량 발생하고 있으며, 이 중 약 1 만 8000 명이 사망할 정도로 치사율이 매우 높은 슈퍼박테리아로 알려져 있다.

이러한 항생제 내성 슈퍼박테리아에 대한 항생제와 관련하여, 대한민국 공개특허 제2003-0032970호에서 글리코펩티드 포스포네이트 유도체 등을 개시하고 있다. 그러나, 다른 항생제에 내성을 가지는 슈퍼박테리아를 포함한 광범위의 병원성 미생물에 대해 유효하고, 동시에 신독성을 감소시킨 신규 항생제 조성물의 개발이 여전히 요구되는 실정이다.

본원은 반코마이신 및 이의 신독성을 감소시키기 위한 실라스타틴을 포함하는, 신규한 복합 조성물을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 약제학적 조성물의 약학적 유효량을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

본원에 의하면, 반코마이신과 실라스타틴을 복합하여 사용함으로써 반코마이신의 신독성을 감소시키는 동시에, 메티실린 내성 황색포도상구균을 포함하는 항생제 내성 슈퍼박테리아에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 나타내는, 신규한 복합 조성물을 제공할 수 있다.

도 1 은 신장세포에 대한 반코마이신의 신독성 유발 메커니즘을 나타내는 개략도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 측정된 HK2 세포주에 대한 반코마이신의 세포독성을 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 측정된 HK2 세포주에 대한 실라스타틴 나트륨의 세포독성을 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 측정된 HK2 세포주에 대한 실라스타틴산의 세포독성을 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 HK2 세포주에 반코마이신과 실라스타틴을 병용 처리한 경우의 세포독성을 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따라 HK2 세포주에 반코마이신과 실라스타틴을 병용 처리한 경우의 세포내 ROS 의 생성을 시간 및 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 본원의 일 실시예에 따라 HK2 세포주에 반코마이신과 실라스타틴을 병용 처리한 경우의 p-gp 및 캐스페이즈 3/7의 발현량을 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따라 HK2 세포주에 반코마이신과 실라스타틴을 병용 처리한 경우의 OCT의 발현량을 측정하기 위하여 사용된 프라이머 서열을 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 본원의 일 실시예에 따른 조성물의 신독성을 실험한 동물실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 조성물의 세포 독성을 LDH 수준 측정을 통해 나타낸 그래프이다.
도 11a 내지 도 11d는 본원의 일 실시예에 따라 세포의 아폽토시스를 분석하여 나타낸 공초점 현미경 이미지이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.

이하, 본원의 약제학적 조성물 및 이를 이용한 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 1 측면은, (a) 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 (b) 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 "반코마이신"이라는 용어는 하기 화학식 1로 표시되는 글리코펩티드 항생제를 의미한다.

본원의 약제학적 조성물은, 신장 내 약물 보호 기능을 가진 실라스타틴 (디하이드로펩티다아제 I 저해제, 항생제 이미페넴의 복합첨가물)과 반코마이신의 복합(병용) 제제에 대한 것이다. 본원의 약제학적 조성물을 개발하기 위하여, 반코마이신(vancomycin, VCM)에 의한 신독성(Nephrotoxicity)을 연구하였다. 구체적으로, 시험관 내 (in vitro) 연구를 통하여 세포 독성의 원인 및 치료 방법을 규명하였으며, HK2 인간 신장 세포주를 이용하였다. 그 결과 반코마이신에 의하여 생성되는 활성산소종(ROS)이 신독성 유발의 원인 중 하나로 밝혀졌으며, 이의 대략적인 메커니즘이 도 1에 나타나 있다.

특히, 고용량 (혈중 20 ㎍/ml 이상, 1일 4 g 이상 투여)에서 신독성이 나타나는 이유는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)와 관련한 세포자살(apoptosis)이 그 원인으로 추정된다.

상기 "약학적으로 허용되는 염" 이라는 용어는, 모계 화합물 (parent compounds)의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 1회 용량 (dosage)이 투여될 때, 생물학적으로 또는 다른 방향으로 해롭지 않은 염들을 의미할 수 있다.

예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 염기 부가 염들은 무기 및 유기 염기들로부터 제조될 수 있다. 무기 염기들로부터 유도된 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 및 마그네슘 염들을 포함할 수 있다. 유기 염기들로부터 유도된 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 일차, 이차 및 삼차 아민; 천연적으로 발생하는 치환된 아민들을 포함하는 치환된 아민들; 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민 (tromethamine), 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인 (procaine), 히드라바민 (hydrabamine), 콜린 (choline), 베타인 (betaine), 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민(theobromine), 퓨린, 피페라진, 피페리딘, 및/또는 N-에틸피페리딘을 포함하는 시클릭 아민들의 염들을 포함할 수 있다. 다른 카르복실산 유도체, 예를 들어 카르복사미드 (carboxamides), 저급 알킬 카르복사미드, 디(저급 알킬) 카르복사미드 등을 포함하는 카르복실산 아미드도 본 발명의 실시에 있어서 유용하다는 것 또한 이해되어야 할 것이다.

예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염들은 무기 및 유기산들로부터 제조될 수 있다. 무기산들로부터 유도된 염들은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 유기산들로부터 유도된 염들은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산 (malic acid), 말론산, 숙신산, 말레산 (maleic acid), 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산 (cinnamic acid), 만델산 (mandelic acid), 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 및/또는 살리실산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 실라스타틴 나트륨을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 "실라스타틴 나트륨"은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 의미한다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 본원의 약제학적 조성물은 통상적인 약제학적 담체들 (carriers) 및 부형제들 (excipients)과 혼합되어 정제 (tablet), 캡슐 (capsule), 엘릭시르 (elixir), 현탁액 (suspensions), 시럽 (syrup), 및/또는 웨이퍼 (wafers) 등의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 그와 같은 약제학적 조성물들은 약 0.1 내지 90 중량%, 더욱 일반적으로는 약 10 내지 30%의 활성 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 약제학적 조성물들은, 옥수수 전분 (corn starch) 또는 젤라틴 (gelatin), 락토오스, 수크로오스, 미세결정형 셀룰로오스 (microcrystalline cellulose), 카올린 (kaolin), 만니톨, 인산 칼슘 (dicalcium phosphate), 염화 나트륨, 및/또는 알긴산 (alginic acid)과 같은 일반적인 담체들 및 부형제들을 함유할 수도 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 제제에 통상적으로 사용되는 붕해제로는 크로스카르멜로스 (croscarmellose), 미세결정형 셀룰로오스, 옥수수 전분, 소듐 전분 글리콜레이트 및/또는 알긴산이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

일반적으로 액체 조성물은, 선택적으로 현탁제, 용해제 (시클로덱스트린과 같은), 방부제, 계면활성제, 습윤제, 향 또는 발색제와 함께, 예를 들어 에탄올, 글리세린, 소르비톨, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-수성 용매, 오일 또는 물과 같은 적당한 액체 담체(들) 내의 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 염의 현탁액 또는 용액으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 다른 한편으로, 액체 제제는 재구성 가능한 분말로부터 제조될 수도 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 활성 화합물, 현탁제, 수크로오스 및 감미료를 함유하는 분말은 물과 함께 현탁액을 형성하도록 재구성될 수 있으며, 활성 성분, 수크로오스 및 감미료를 함유하는 분말로부터 시럽이 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

정제 형태의 조성물은 고체 조성물을 제조하는 데에 통상적으로 사용되는 임의의 적당한 약제학적 담체(들)을 사용하여 제조될 수 있다. 그와 같은 담체들의 예는 마그네슘 스테아레이트 (stearate), 전분, 락토오스, 수크로오스, 미세결정형 셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 결합제들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 정제는 또한 컬러 필름 코팅을 포함할 수도 있으며, 또는 담체(들)의 일부분으로서 컬러가 포함될 수도 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물은 친수성 또는 소수성 매트릭스를 포함하는 정제로서, 방출 조절형 투여 형태 (controlled release dosage form)로 제제화될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

캡슐 형태의 조성물은 통상적인 캡슐화 과정을 이용하여, 예를 들어, 활성 화합물 및 부형제를 경질 젤라틴 캡슐에 도입함으로써 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 다른 방법으로는, 활성 화합물과 고분자량 폴리에틸렌 글리콜의 반-고체 (semi-solid) 매트릭스를 제조하여 경질 젤라틴 캡슐에 충진시킬 수 있으며, 또는 폴리에틸렌 글리콜 중 활성 화합물의 용액 또는 식용 오일, 예를 들어 액체 파라핀 또는 분별된(fractionated) 코코넛 오일 중 현탁액을 제조하여 연질 젤라틴 캡슐 내로 충진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

정제 결합제로는 아카시아, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리-비닐피롤리돈 (Povidone), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 수크로오스, 전분 및/또는 에틸셀룰로오스가 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 사용될 수 있는 윤활제 (lubricant)는 마그네슘 스테아레이트 또는 다른 금속 스테아레이트, 스테아르산, 실리콘 유체, 탈크 (talc), 왁스 (waxes), 오일 및/또는 콜로이드 실리카를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

페퍼민트, 동록유 (oil of wintergreen), 체리 향 등과 같은 향료가 또한 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 부가하여, 투약 형태가 외관상 더 시선을 끌게 하거나 또는 제품을 확인하는 데에 도움이 되도록 하기 위하여 발색제를 첨가하는 것이 바람직할 수도 있다.

비경구로 투여할 때에 활성화되는 본 발명의 약제학적 조성물은 근육내, 수막강내, 또는 정맥내 투여용으로 제제화될 수 있다.

통상적인 근육내 또는 수막강내 투여용 조성물은 아라키스유 (arachis oil) 또는 참기름 같은 오일 중에서, 활성 성분으로 된 현탁액 또는 용액으로 이루어질 수있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 통상적인 근육내 또는 수막강내 투여용 조성물은 예를 들면 활성 성분과 덱스트로스 또는 염화 나트륨, 또는 덱스트로스 및 염화 나트륨을 함유하는 멸균된 등장 수용액으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 다른 예들은 젖산 링거 주사액 (lactated Ringer's injection), 젖산 링거 + 덱스트로스 주사액, 노르모졸(Normosol-M) 및 덱스트로스, 이소라이트 E (Isolyte E), 아실화된 링거 주사액 등이 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 선택적으로, 폴리에틸렌 글리콜 같은 공-용매; 에틸렌디아민 테트라아세트산 같은 킬레이트화제; 소듐 메타비설파이트 (sodium metabisulphite) 같은 항산화제를 본 제제에 포함시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

선택적으로, 용액은 냉동건조될 수 있고, 그 후 투여 직전에 적당한 용매로 재구성 될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 분말 또는 용액 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 약 1 중량부에 대하여, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 약 0.1 중량부 내지 약 10 중량부를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 약 1 중량부에 대하여, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 약 0.1 중량부 내지 약 10 중량부, 약 0.3 중량부 내지 약 10 중량부, 약 0.5 중량부 내지 약 10 중량부, 약 1 중량부 내지 약 10 중량부, 약 1.5 중량부 내지 약 10 중량부, 약 3 중량부 내지 약 10 중량부, 약 5 중량부 내지 약 10 중량부, 약 7 중량부 내지 약 10 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 7 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 5 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 3 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 1.5 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 1 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 0.5 중량부, 또는 약 0.1 중량부 내지 약 0.3 중량부를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 경구 투여, 복강 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 및/또는 피하 주사용인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 메티실린 내성 황색포도상구균(MSRA) 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 메티실린 내성 황색포도상구균 외에도, 항생물질에 저항성을 띠는 모든 종류의 포도상구균의 예방 및/또는 치료를 위한 것일 수 있으며, 그람 양성균, 및 일부 그람 음성균에 대해서도 효과를 보이는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 항생제-내성 슈퍼박테리아의 예방 및/또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 2 측면은, (a) 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 (b) 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약학적 유효량을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본원의 제 1 측면에 대해 설명한 내용은 본원의 제 2 측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 약학적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 세균성 질병을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 "약학적 유효량" 이라는 용어는, 그와 같은 치료를 필요로 하는 포유류에 투여되었을 때에, 치료를 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 치료에 유효한 양은 피험체 및 치료되는 질병의 상태, 통증의 심각도 및 투여 방식에 따라 변화될 수 있으며, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 통상적으로 결정될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 실라스타틴 나트륨을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 대상에 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 박테리아는 메티실린 내성 황색포도상구균(MSRA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 경구 투여, 복강 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 또는 피하 주사에 의하여 대상에 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 약 1 중량부에 대하여, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 약 0.1 중량부 내지 약 10 중량부가 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 약 1 중량부에 대하여, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 약 0.1 중량부 내지 약 10 중량부, 약 0.3 중량부 내지 약 10 중량부, 약 0.5 중량부 내지 약 10 중량부, 약 1 중량부 내지 약 10 중량부, 약 1.5 중량부 내지 약 10 중량부, 약 3 중량부 내지 약 10 중량부, 약 5 중량부 내지 약 10 중량부, 약 7 중량부 내지 약 10 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 7 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 5 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 3 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 1.5 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 1 중량부, 약 0.1 중량부 내지 약 0.5 중량부, 또는 약 0.1 중량부 내지 약 0.3 중량부가 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 1 mM 내지 약 4 mM의 양으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 1 mM 내지 약 4 mM, 약 2 mM 내지 약 4 mM, 약 3 mM 내지 약 4 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1 mM 내지 약 2 mM, 또는 약 2 mM의 양으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 50 ㎍/mL 내지 약 600 ㎍/mL 의 농도로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 50 ㎍/mL 내지 약 600 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL 내지 약 600 ㎍/mL, 약 200 ㎍/mL 내지 약 600 ㎍/mL, 약 300 ㎍/mL 내지 약 600 ㎍/mL, 약 400 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 400 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 300 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 200 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 200 ㎍/mL의 농도로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

(실시예)

반코마이신과 실라스타틴의 세포독성 측정

반코마이신과 실라스타틴의 용량을 설정하기 위하여, 먼저 MTT 분석법(MTT assay)을 이용하여 신장 세뇨관 세포에 대한 세포독성을 확인하였다. 구체적으로는, HK2 세포주에 반코마이신, 실라스타틴 나트륨(cilastatin_Na), 및 실라스타틴산(cilastatin_acid)을 농도별로 처리하여 미토콘드리아 증식(mitochondrial proliferation)을 측정함으로써 세포독성을 측정하였다. 대조군(CTL)의 생존세포를 기준(100%)으로 하여 세포 생존률을 나타내었으며, 도 2는 반코마이신, 도 3은 실라스타틴 나트륨, 도 4는 실라스타틴산의 세포독성을 측정한 결과를 각각 나타낸 그래프이다.

MTT 분석 결과에 따르면, 반코마이신은 2 mM 및 4 mM에서 각각 약 75% 및 50%의 세포 생존률을 나타내었다. 일반적으로 50%의 세포 생존률을 IC50값이라 표시하며, 이를 기준으로 실험을 진행하였다. 또한, 기존의 연구에서 반코마이신이 1 mM 내지 2 mM에서 세포독성이 있다고 보고된 바 있으므로, 이후의 실시예에서는 반코마이신 농도를 2 mM 및 4 mM로 하여 실험을 수행하였다.

실라스타틴은 50 ㎍/mL 내지 800 ㎍/mL의 농도에서 MTT 분석을 실시하였다. 실라스타틴은 600 ㎍/mL 이상의 농도에서 약간의 세포독성을 나타내었으므로, 이후의 실시예에서는 그 이하의 값인 200 ㎍/mL 및 400 ㎍/mL의 실라스타틴 농도에서 실험을 수행하였다.

반코마이신과 실라스타틴 병용 처리시의 세포독성 측정

반코마이신과 실라스타틴을 병용 처리한 경우의 신독성 및 실라스타틴의 신독성 억제 효과를 확인하기 위하여, HK2 세포에 반코마이신과 실라스타틴 나트륨을 농도별로 병용 처리하여 MTT 분석을 통하여 세포독성을 측정하였다. 세포독성의 측정 결과는 도 5에 나타나 있다.

MTT 분석 결과, 반코마이신과 실라스타틴 나트륨을 동시 투여한 실험군에서 세포 보호 효과를 확인하였다.

반코마이신과 실라스타틴 병용 처리시의 신장세포 활성산소종(ROS) 측정

DCF-DA 분석법을 이용하여 반코마이신과 실라스타틴의 농도에 따라 세포 내에서 생산되는 자유 라디칼의 생산량을 DCF-DA 분석을 통하여 시간별로 측정하였다 (도 6). 구체적으로는, 항산화제(antioxidant)를 이용하여 반코마이신에 의해 유도되는 HK2 세포내 ROS의 반응을 측정함으로써 신독성 유발 기전에 ROS의 생성이 관여하는지를 확인하였다. 즉, 본 실험에 의하여 반코마이신에 의해 유발되는 신독성에 ROS가 그 타겟이 되는지를 확인하였으며, 실라스타틴이 반코마이신에 의해 유발되는 ROS를 감소시킨다는 것을 확인하였다.

반코마이신과 실라스타틴 병용 처리시의 캐스페이즈 3/7 및 p-gp 측정

반코마이신에 의한 아폽토시스(apoptosis) 유발 여부를 확인하기 위하여 캐스페이즈(caspase)-3/7 및 p-gp(p-glycoprotein) 의 발현을 확인하고 단백질 발현량 또한 확인하였다. p-gp는 막 수송 단백질의 일종으로서, 신장 내에서 p-gp가 증가하면 약물 배설을 촉진하여 약물에 의한 독성을 감소시키는 효과를 기대할 수 있다. 또한, 캐스페이즈 3/7은 세포의 아폽토시스를 유도하는 단백질로서, 캐스페이즈 3/7의 증가는 아폽토시스의 증가라고 해석될 수 있다.

반코마이신 및/또는 실라스타틴을 처리한 신장세포 실험군에서 p-gp의 발현을 실시간 PCR을 통하여 측정한 결과가 도 7a에 나타나 있다. 실험 결과, 반코마이신을 처리한 실험군에서 대조군과 대비하여 p-gp의 활성이 감소된 것을 확인할 수 있는데, 이로부터 신장세포의 약물 배설이 용이하지 않음이 확인된다. 반면, 반코마이신과 실라스타틴을 병용 처리한 경우에는 p-gp의 활성이 증가한 것으로 보아, 약물 배설이 증가하였거나 또는 약물 배설시 p-gp가 관여하였음을 확인할 수 있었다.

캐스페이즈 3/7의 농도를 측정하기 위하여, 처리되는 반코마이신 및 실라스타틴의 농도별로 실험군을 나누어 신장 세포에 처리하고, 24시간 후 캐스페이즈 3/7 시약을 처리하고 ELISA에서 5 분에 한번씩 luminometry로 측정하였다. 이때 세포가 아폽토시스에 들게 되면, 시간에 따라 캐스페이즈 3/7 활성이 올라가게 되며, 최고점에 도달한 시간 측정 결과는 도 7b에 나타나 있다. 그 결과, 반코마이신만 처리한 실험군은 캐스페이즈 3/7활성이 높게 나타나 아폽토시스가 유발됨을 확인하였으며, 반코마이신과 실라스타틴을 병행 처리한 실험군에서는 캐스페이즈 3/7 활성이 다소 낮게 나타나 세포독성이 감소되었음을 확인할 수 있었다.

OCT (Ornithine Carbamoyl Transferase, 요소생성) gene에 작용하는 정도 측정

신장세포에 독성을 보이는 반코마이신이 OCT(organic cation transport)를 통하여 세포 내로 들어오고, p-gp를 통하여 세포 밖으로 배출된다는 것을 확인하기 위하여, p-gp의 발현에 이어서 OCT의 발현을 실시간 PCR을 통하여 측정하였다. 도 8에 나타난 서열은 실시간 PCR을 수행하기 위하여 사용한 5 쌍의 프라이머의 염기서열이다.

세포 내 LDH(lactate dehydrogenase) 측정

LDH는 세포 내에 존재하는 효소로서, LDH의 수준이 증가하는 경우 세포 독성이 나타남을 알 수 있다. 이에, 반코마이신의 다양한 농도에서 실라스타틴의 존재 또는 부재 하에 세포 내 LDH 수준을 측정하여 반코마이신의 신독성을 확인하였다 (도 10). 이 때, 양성 대조군으로는 트리톤 X-100 1%를, 음성 대조군으로는 일반적인 배지를 사용하였다.

동물에서의 신독성 감소 확인

7 days injection, Pad degree 22-23, BT 조건에서 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 이용하여 동물에서의 신독성 유발 실험을 진행하였다 (도 9a 및 9b). 도 9a는 크레아틴 농도를 측정한 것이며, 도 9b는 BUN 농도를 측정하여 나타낸 것이다. 도 9a 및 9b에 나타난 바에 따르면, 반코마이신 200 mg/kg을 투여했을 경우에는 신독성이 유발되지 않으나 반코마이신 400 mg/kg을 투여했을 경우에는 약하게 신독성이 발생하였다 (BUN이 상승하였으며 크레아틴은 미미하게 상승하였음. BUN과 크레아틴 모두 신장손상의 마커로서 사용이 가능함). 또한, 반코마이신 400 mg/kg을 투여했을 때 실라스타틴 75 mg/kg 농도는 보호 효과가 미약하였으나, 실라스타틴 150 mg/kg 농도 투여시에는 보호 효과가 발생하였다. 추가적으로, 반코마이신600mg/Kg, 반코마이신 600mg/Kg + 실라스타틴 150mg/Kg, 반코마이신 600mg/Kg + 실라스타틴 300mg/Kg및 반코마이신400mg/Kg + 실라스타틴 300mg/Kg 실험군에 대하여 실험을 진행하였다.

TUNEL 분석을 통한 세포의 아폽토시스 확인

TUNEL 염색은 DNA의 끝부분을 염색하는 것으로서, 아폽토시스의 대표적인 현상은 DNA 파쇄(fragmentation)인데, 이 파쇄된 조각이 많이 형성되면 그만큼 DNA의 말단이 많아지게 되고 그 부분을 라벨링하는 방식의 염색법이다.

라벨된 dUTP를 기질로 이용하고 3'-말단에 뉴클레오티드를 붙여주는 말단전달효소(terminal transferase)를 효소로 사용하여 샘플에 처리하면 샘플의 DNA는 라벨된 dUTP가 첨가되어 이를 라벨의 종류에 따라 형광, 효소반응, 방사선등으로 검출할 수 있게 되는 것이 원리이다. 본 실시예에서는 말단을 녹색 형광으로 염색하여 공초점 현미경을 통하여 이미지를 수득하였다 (도 11a 내지 도 11d).

도 11a는 대조군 이미지로서, 형광 발색이 관찰되지 않으므로 아폽토시스가 진행되지 않는 것을 확인하였다. 도 11b는 실라스타틴 나트륨만을 사용한 것으로서 역시 형광발색이 관찰되지 않았다. 도 11c는 2 mM의 반코마이신을 사용한 실험군으로서, 녹색 형광이 관찰되어 아폽토시스가 진행됨을 확인하였다. 도 11d는 반코마이신과 실라스타틴을 병용 처리한 실험군으로서, 녹색 형광의 발광이 현격히 감소하여 아폽토시스가 감소하였음을 확인하였다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

1. (a) 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 (b) 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 약제학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 실라스타틴 나트륨을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   분말 또는 용액 형태인, 약제학적 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염1 중량부에 대하여, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 0.1 중량부 내지 10 중량부를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 약제학적 조성물은 경구 투여, 복강 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 또는 피하 주사용인 것인, 약제학적 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,
   메티실린 내성 황색포도상구균(MSRA) 감염의 예방 또는 치료를 위한, 약제학적 조성물.
8. (a) 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 (b) 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약학적 유효량을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 실라스타틴 나트륨을 포함하는 것인, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법.
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 대상에 투여되는 것인, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법.
11. 제 8 항에 있어서,
    상기 박테리아는 메티실린 내성 황색포도상구균(MSRA)인 것인, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법.
12. 제 8 항에 있어서,
    경구 투여, 복강 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 또는 피하 주사에 의하여 대상에 투여되는 것인, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법.
13. 제 8 항에 있어서,
    상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염1 중량부에 대하여, 상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 0.1 중량부 내지 10 중량부가 투여되는 것인, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법.
14. 제 8 항에 있어서,
    상기 반코마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 1 mM 내지 4 mM의 양으로 투여되는 것인, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법.
15. 제 8 항에 있어서,
    상기 실라스타틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 50 ㎍/mL 내지 600 ㎍/mL 의 농도로 투여되는 것인, 박테리아 감염의 예방 또는 치료 방법.
    
    

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