KR20160043921A - 스킨-케어 조성물 및 약제학적 배합물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

스킨-케어 조성물 및 약제학적 배합물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부 보호 조성물 및 이의 약제학적 배합물을 개시한다. 상기 피부 보호 조성물의 제조 방법은 시토카인을 수득하기 위해 특정 일수의 날 동안 무혈청 배지에서 세포를 배양하는 것에 기초한다. 수거된 세포는 더 많은 폴리펩티드 혼합물을 얻기 위하여 다수의 동결-융해 주기의 사용으로 손상되며 추가로 농축되고 탈염되어 특정 분자량의 조성물을 수득하며, 여기서 상기 조성물은 피부 콜라겐의 생산을 자극하는 효과가 있다.

Description

스킨-케어 조성물 및 약제학적 배합물 및 이의 제조 방법 {SKIN-CARE COMPOSITION AND THE PHARMACEUTICAL COMBINATION AND PREPARATION METHOD THEREOF}
본 발명은 스킨-케어 조성물의 제조 방법 및 특히 제대의 조직 배양물로부터 특정 성분을 함유하는 조성물을 수득하는 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 피부 콜라겐의 생산을 자극하는 효과를 갖는 스킨-케어 조성물에 관한 것이다.
종래의 기술에 비추어, 성장 인자, 예를 들면, 줄기 세포 인자(SCF), 혈관 내피 성장 인장 인자(VEGF), 상피 성장 인자(EGF) 및 인슐린-양 성장 인자(IGF)는 상피 세포 및 간엽계 줄기 세포를 배양하는 것과 같은 방법을 통해 수득된다. 통상의 방법은 시간-소모적인 일반적 동결을 위해 점차 저하된 온도를 필요로 한다. 또한, 후속 배양 프로세스에서 배지에 함유된 염은 피부 모발의 자극을 유발할 수 있다.
동결-해동 사이클 방법 및 동시에 농축 및 탈염을 사용하는 잇점을 취하지 않으면, 종래의 기술을 사용하는 경우, 생산 수율은 낮고, 프로세스는 지루하고 시간-소모적이다. 본 발명의 한 가지 목적은 스킨-케어 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이며, 여기서 상기 방법은 세포 용해물을 수집하기 위해 액체 질소 동결-해동 사이클을 사용하여 세포를 손상시키고, 이에 의해 폴리펩티드 혼합물(또는 단백질 칵테일)의 수율을 증가시키는 프로세스를 포함한다. 농축 및 탈염 프로세스는 특정한 분자량을 갖는 조성물을 수득하기 위해 사용된다.
상술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 스킨-케어 조성물의 제조 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 돼지 제대 조직(umbilical cord tissue)을 제공하는 단계; 돼지 제대 조직을 세척액으로 세척하여 돼지 제대 조직으로부터 혈액 세포 및 체액을 제거하는 단계; 계대배양을 위해 세포를 돼지 제대 조직으로부터 단리하여 사이토킨을 수득하는 단계; 세포 및 사이토킨을 적어도 2회의 동결-해동 사이클에 제공하여 폴리펩티드 혼합물을 수득하는 단계; 폴리펩티드 혼합물을 농축 및 탈염시켜 조성물을 수득하는 단계를 포함하고, 상기 조성물의 분자량은 3000Da(달톤)을 초과한다.
본 발명에 따라서, "세척액"은 돼지 제대 조직의 등장성 용액을 지칭한다. 바람직하게는, 세척액은 90% 염화나트륨 용액 또는 인산염 완충된 식염수(PBS)이다.
본 발명에 따라서, "세포를 단리하는"은 돼지 제대를 제대 단편으로서 작은 조각으로 절단하고 10ml 성장 배지(α-MEM 및 10% 태소 혈청(FBS)를 포함)를 함유하는 배양 접시에 4 내지 6개 제대 단편을 넣는 것을 지칭한다. 이어서, 배양 접시는 세포를 수득하기 위해 일정한 온도로 용기에 넣어 1주당 2회 3ml 배양 배지의 첨가와 함께 10일 동안 배양하고, 이어서 제대 단편을 제거하며, 여기서 일정한 온도를 갖는 용기는 CO2 인큐베이터(5% CO2 함유)를 지칭한다.
본 발명에 따라, "계대배양"은 세포를 고밀도의 세포 성장으로 수집한 다음 세포를 희석시켜 새로운 배양 접시를 접종함으로써 세포 밀도를 감소시켜 세포 성장을 유지하는 것을 지칭한다. 희석 비율은 세포 유형에 의존한다.
본 발명에 따라서, "동결-해동 사이클"은 세포 손상 효과를 달성하기 위해 반복 사이클로 세포 및 사이토킨을 액체 질소에 넣어 동결시킨 다음 세포를 실온에서 넣어 해동시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 실시형태에서 설명된 바와 같이, 세포를 함유하는 극저온 바이알은 액체 질소에 직접 침지되고, 이어서 세포를 함유하는 극저온 바이알은 액체 질소로부터 제거되고 37℃ 수욕에 넣어 해동시킨다. 상술한 단계는 적어도 2회 반복된다. 파쇄된 세포는 1000G에서 15 내지 20분 동안 원심분리한다.
본 발명에 따라서, "농축 및 탈염"은 폴리펩티드 혼합물을 여과 장치에 넣은 다음 여과 장치를 상청액 제거를 위해 원심분리에 제공하여 폴리펩티드 혼합물의 농축 및 염의 제거 효과를 달성하는 것을 지칭한다. 본 발명의 실시형태에서 설명된 바와 같이, 폴리펩티드 혼합물은 초-여과 장치 또는 원심분리 장치에 넣어 폴리펩티드 혼합물의 용적을 감소시킴으로써 폴리펩티드 혼합물의 농도를 증가시키고 불순물(예: 염 등)을 제거한다. 이어서, 조성물을 수득하고, 여기서 상기 조성물은 3000Da(달톤)을 초과하는 분자량을 갖는다.
바람직하게는, 조성물은 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈소판-유래된 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 형질전환 성장 인자 β-1(transforming growth factor beta-1, TGF-β-1) 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.
계대-배양을 위해 세포를 돼지 제대 조직으로부터 단리하여 사이토킨을 수득하는 단계에서, 사이토킨을 수득하기 위해서는 단리된 세포를 3 내지 18일 동안 혈청-비함유 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
계대배양을 위해 세포를 돼지 제대 조직으로부터 단리하여 사이토킨을 수득하는 단계에서, 사이토킨을 수득하기 위해서는 단리된 세포를 12일 동안 혈청-비함유 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라서, "돼지 제대 조직"은 특정 병원체 비함유(specific pathogen free, SPF) 돼지로부터 수득한 제대 조직을 지칭한다.
본 발명은 추가로 상술된 제조 방법으로부터 수득한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 피부 콜라겐의 생산을 자극하는 효과를 갖는다.
본 발명에 따라서, "피부 콜라겐의 생산을 자극하는"은 본 발명의 실시형태에서 조성물의 효과가 대조군 그룹과 비교하여 콜라겐의 생산을 0.5 내지 3.5배 증가시키는 것을 지칭한다.
본 발명은 추가로 유효량의 상술된 조성물 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 배합물을 제공한다.
바람직하게는, 조성물의 상술된 유효량은 0.05ng/ml 내지 20ng/ml의 범위이다.
본 발명에 따라서, "약제학적으로 허용되는 용매 및/또는 부형제"는 인간 또는 동물에서 경구 투여 또는 외부 용도를 위해 사용될 수 있는 임의의 용매, 예를 들면, 알콜-물 공용매, 물 및 생리학적 식염수를 지칭한다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 용매 및/또는 부형제는 물 또는 생리학적 식염수이다. 첨가된 용매의 양은 조성물의 유효량의 유지에 기반한다.
본 발명의 제조 방법은 사이토킨을 수득하기 위해 특정한 일수 동안 세포를 혈청-비함유 배지에서 배양하는 것에 기반한다. 세포는 보다 많은 폴리펩티드 혼합물을 수득하기 위해 동결-해동 사이클을 사용하여 액체 질소에서 반복적으로 손상시키고, 이를 추가로 농축 및 탈염시켜 특정한 분자량을 갖는 조성물을 수득하며, 여기서 상기 조성물은 피부 콜라겐의 생산을 자극하는 효과를 갖는다.
도 1은 세포 증식 실험에서 본 발명의 조성물을 사용하는 컬럼 그래프의 결과를 나타낸다.
도 2는 MTS 실험에서 본 발명의 조성물을 사용하는 컬럼 그래프의 결과를 나타낸다.
도 3a 내지 3d는 창상-치유 실험에서 본 발명의 조성물을 사용하는 세포 이미지의 결과를 나타낸다. 도 3a에서, D0은 즉 세포를 함유하는 배양 접시에서 라인을 그리는 실험 0일차를 나타낸다. 도 3b에서, D3은 실험 3일차를 나타낸다. SFM은 혈청-비함유-배지를 의미한다. 도 3c 및 3d는 3일 동안 본 발명의 조성물을 각각 0.055ng/ml 및 0.11ng/ml의 농도로 배양 배지에 첨가한 후의 세포 이미지를 나타낸다.
도 4는 피부 콜라겐의 생산을 촉진시키는 실험에서 본 발명의 조성물을 사용하는 컬럼 그래프의 결과를 나타내고, 여기서 X-축은 bFGF의 시험 희석에 기반한다.
하기 특정한 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 사용된다. 당해 기술분야의 숙련가는 본 발명의 잇점 및 효과를 용이하게 인지 수 있다. 본 발명은 응용을 위해 수행되는 상이한 구체적 예에 의해 실시될 수 있다. 또한, 지침의 상세는 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 다양한 변형 및 변화에서 상이한 관점 및 응용에 기초할 수 있다.
실시예
제조 실시예 1: 돼지 제대로부터 세포의 단리
돼지 제대를 수득했다. 돼지 제대를 75% 에탄올로 20 내지 30초 동안 세척하고, 이어서 인산염 완충된 식염수(PBS)로 세척했다. 이어서, 돼지 제대를 3 내지 4개의 동등한 조각으로 절단하고, 멸균된 배양 접시에 넣었다. 제대는 제대 정맥을 따라 메스 또는 겸자를 사용하여 개방했다. 2개의 겸자를 사용하여 제대를 잡아당기고 이를 개방했다. 동맥은 와르톤(Wharton)의 젤리(즉, 제대 내부의 젤라틴성 결합 조직) 상으로 혈액의 비산 없이 제대로부터 주의 깊게 제거했다. 이 사이에, 정맥도 또한 제거했다. 와르톤의 젤리 블록을 코드 양막으로부터 제거하고, 수분을 보유 유지하기 위해 α-MEM을 함유하는 새로운 배양 접시에 넣었다. 이어서, 돼지 제대를 수술용 가위를 사용하여 제대 단편으로 작은 조각으로 절단하고, 및 4 내지 6개의 제대 단편은 10ml 성장 배지(α-MEM 및 10% 태소 혈청(FBS)를 포함)를 함유하는 배양 접시에 넣었다. 이어서, 배양 접시를 1주당 2회 3ml 배양 배지의 첨가와 함께 CO2 인큐베이터(5% CO2 함유)에 넣었다. 이어서, 제대 단편을 10일 후에 제거하고, 접시를 PBS로 세척하고, 신선한 배지를 보충했다. 세포를 80 내지 90% 컨플루언트에 도달하도록 성장시킨 다음, 세포 증식을 위해 계대-배양했다.
제조 실시예 2: 세포의 계대배양
진공을 사용하여 배지를 제거했다. 접시 중의 세포는 5ml PBS로 세척했다. 이어서, PBS를 제거했다. 이어서, 0.25% 트립신-EDTA 3ml를 각각의 배양 접시에 첨가했다. 배양 접시를 37℃에서 5분 동안 배양했다. 단리된 세포를 15ml 원심분리 튜브에 수집하여 5분 동안 400G에서 원심분리하고, 이어서 상청액을 제거했다. 이어서, 2ml 배지를 튜브에 첨가하고, 피펫을 사용하여 세포를 재현탁시켰다. 10㎕ 세포 상청액을 취하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계수하기 위해 10㎕ 트립판 블루와 혼합했다.
제조 실시예 3: 사이토킨의 제조
사이토킨을 수득하기 위해, 제조 실시예 2에서 제조한 세포를 배양 접시에 접종하여, 밀도가 접시당 3×105 내지 7×105 세포에 도달할 때까지 세포를 성장시켰다. 세포는 세포 성장이 90% 컨플루언트에 도달할 때까지 배지의 변화(1주 2회, 즉 대략 3 내지 4일마다)와 함께 CO2 인큐베이터에서 37℃로 배양했다.
세포 성장이 90% 컨플루언트에 도달하는 경우, 세포를 5ml PBS로 2회 세척했다. 이어서, 8ml 혈청-비함유 배지를 각각의 배양 접시에 첨가했다. 접시를 12일 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃로 배양하여 사이토킨을 수득했다.
제조 실시예 4: 폴리펩티드 혼합물의 수집
일부 사이토킨을 배양 배지로 방출되었고, 나머지 사이토킨은 세포 내부에 잔류했다. 배양 배지를 수집했다. 부착된 세포를 37℃에서 5분 동안 0.2% 트립신-EDTA 3ml로 처리한 다음, 수집하여 40G에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 제거했다. 원심분리에 의해 침전된 세포를 10ml PBS로 1회 세척했다. 세포를 다시 원심분리하여 상청액을 제거한 다음, 3ml PBS에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 극저온 바이알에 넣었다. 세포를 함유하는 극저온 바이알을 액체 질소에 직접 침지한 다음, 수욕에서 37℃로 해동시켰다. 상술한 동결-해동 사이클을 2회 반복하여 세포를 파쇄했다. 파쇄된 세포를 1000G에서 15 내지 20분 동안 원심분리했다. 수집된 상청액 및 세포 용해물을 혼합하여, 전체 수율에 대해 계산된 폴리펩티드를 함유하는 혼합물을 수득했다. 상청액, 또는 폴리펩티드를 함유하는 혼합물의 농도는 ELISA(효소-결합된 면역흡착 검정)을 사용하여 측정했다.
제조 실시예 5: 폴리펩티드 혼합물 농도의 측정 및 탈염
특정한 농도를 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해서는 폴리펩티드 혼합물을 농축시키는 것이 요구되었다. 농축된 폴리펩티드 혼합물을 수득하기 위해, 제조 실시예 4로부터 수득된 상청액 및 세포 용해물을 초-여과 장치(모델 번호: Amicon Stir Cell) 또는 원심분리 장비(Amicon Filter Centrifugation Device)에 넣어 폴리펩티드 혼합물의 용적을 감소시키고 이의 농도를 증가시켰다. 농축된 폴리펩티드 혼합물을 수집 튜브에 넣었다. 2ml 농축된 혼합물을 취하여 폴리펩티드 혼합물의 농도를 평가했다.
제조 실시예 6: 폴리펩티드 혼합물의 동결건조
제조 실시예 5로부터 수득한 50ml 농축 폴리펩티드 혼합물을 -80℃에서 밤새(12 내지 16시간) 지퍼 백에 넣어 두었다. 동결건조된 폴리펩티드 혼합물 분말을 수득하기 위해, 농축된 폴리펩티드 혼합물을 함유하는 백을 동결건조기에 넣어 폴리펩티드 혼합물을 4 내지 5일 동안 동결건조시켰다. 동결건조된 폴리펩티드 혼합물 분말을 멸균수로 재현탁시켜 bFGF(염기성 섬유아세포 성장 인자)를 10ng/ml의 최종 농도로 수득했다. bFGF 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고, -80℃에서 저장했다. 농도 조절은 bFGF의 농도에 기반했다. TGF-β1은 168pg/ml의 농도이다. PDGF는 6ng/ml의 농도이다.
제조 실시예 7: MTS 세포 증식의 측정
MTS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움) 시약을 프로메가(Promega)(CellTiter 96R 수성 1용액 세포 증식 검정)으로부터 구입했다. 측정 단계는 4일 동안 배양에 사용된 100㎕ 배지에 상기 시약 20㎕의 첨가를 포함했다. 혼합된 용액을 1.5시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고, 이의 흡광도는 분광광도계를 사용하여 450nm에서 측정하여 살아있는 세포의 증식을 조사했다.
제조 실시예 8: 콜라겐의 생산 자극
사용된 시약은 프로콜라겐(Procollagen) 타입 I C-펩티드(PIP) EIA 키트로부터 수득했다. 100㎕ 항체-POD 접합체 용액을 96-웰 면역검정 접시에 첨가하고, 이어서 각각 96-웰 면역검정 접시의 각 웰에 시험 샘플을 첨가하여 3시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이어서, 96-웰 면역검정 접시를 4회 400㎕ PBS로 세척하고, 100㎕ 기질 용액을 15분 동안 반응을 위해 첨가했다. 이어서, 100㎕ 정지 용액을 첨가하고, 이의 흡광도를 450nm에서 측정했다.
실시형태 1: 세포 증식 실험
5×104 인간 섬유아세포를 4일 동안 6-웰 세포 배양 접시에서 배양했다. 이어서, 배지를 0.055ng/ml 및 0.11ng/ml의 희석 농축물로 제조 실시예 6에서 수득한 bFGF-함유 배지로 대체했다. 세포가 7일차에서 배양된 경우, 세포를 트립신으로 처리하여 배양 접시로부터 박리시켰다. 세포 수를 계수하고, 결과는 도 1에 제시되어 있다. 0.11ng/ml 조성물이 사용되는 경우, 인간 섬유아세포의 증식은 대조군 그룹("0"으로 나타냄)과 비교하여 31.8% 증가했다.
실시형태 2: MTS 실험
2×103 인간 섬유아세포를 4일 동안 96-웰 세포 배양 접시에서 배양했다. 이어서, 배지를 제조 실시예 6으로부터 수득한 bFGF-함유 배지로 대체했다. 세포가 4일차에서 배양되는 경우, 세포는 제조 실시예 7에 기재된 MTS 세포 증식 측정에 기반하여 살아있는 세포의 증식에 대해 조사했다. 결과는 도 2에 제시되어 있다. 0.11ng/ml 조성물이 사용되는 경우, 살아있는 인간 섬유아세포의 증식은 대조군 그룹과 비교하여 35.9% 증가했다.
실시형태 3: 창상-치유 실험
세포 이동은 시험관내 스크래치 시험을 사용하여 조사했다. 5×104 인간 섬유아세포를 7일 동안 6웰 세포 배양 접시에서 배양했다. 이어서, 배지를 제조 실시예 6으로부터 수득한 bFGF-함유 배지로 대체하고, 및 라인을 배양 접시에서 작성했다. 세포의 이미지를 10일차에 취하여 세포 이동을 기록했다. 결과는 도 3a 내지 3d에 제시되어 있다. 0.055ng/ml 및 0.11ng/ml 조성물을 대조군 그룹과 비교하면, 인간 섬유아세포는 스크래치가 작성된 후에 3일차에 작성된 스크래치의 공간을 커버하기 위해 이동했다. 따라서, 0.055ng/ml 내지 0.11ng/ml의 농도에서 bFGF 용액은 섬유아세포의 성장 및 이동을 촉진시키는 효과를 갖는다.
실시형태 4: 콜라겐 생산 실험
제조 실시예 8에 따라, 콜라겐 생산을 촉진시키는 효과는 제조 실시예 6으로부터 수득한 bFGF-함유 배지를 사용하여 시험했다. 보다 높은 농도의 조성물은 보다 우수한 효과를 갖고, 여기서 바람직한 양은 0.0625ng/ml 내지 1ng/ml의 범위이다.

Claims (10)

  1. 돼지 제대 조직(umbilical cord tissue)을 제공하는 단계;
    돼지 제대 조직을 세척액으로 세척하여 돼지 제대 조직으로부터 혈액 세포 및 체액을 제거하는 단계;
    계대배양을 위해 세포를 돼지 제대 조직으로부터 단리하여 사이토킨을 수득하는 단계;
    액체 질소를 사용하여 세포 및 사이토킨을 적어도 2회의 동결-해동 사이클에 제공하여 폴리펩티드 혼합물을 수득하는 단계; 및
    폴리펩티드 혼합물을 농축 및 탈염시켜 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 스킨 케어 조성물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조성물의 분자량이 3000Da(달톤)을 초과하는, 스킨 케어 조성물의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 폴리펩티드 혼합물을 농축 및 탈염시켜 조성물을 수득하는 단계에서, 수득된 조성물이 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈소판-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 형질전환 성장 인자 베타-1(transforming growth factor beta-1, TGF-β1) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는, 스킨 케어 조성물의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 계대배양을 위해 세포를 돼지 제대 조직으로부터 단리하여 사이토킨을 수득하는 단계에서, 단리된 세포가 사이토킨을 수득하기 위해 혈청-비함유 배지에 배치되어 3 내지 18일 동안 배양되는, 스킨 케어 조성물의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 계대배양을 위해 세포를 돼지 제대 조직으로부터 단리하여 사이토킨을 수득하는 단계에서, 단리된 세포가 사이토킨을 수득하기 위해 혈청-비함유 배지에 배치되어 12일 동안 배양되는, 스킨 케어 조성물의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 돼지 제대 조직이 특정의 병원체 비함유(specific pathogen free, SPF) 돼지로부터 수득되는, 스킨 케어 조성물의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 제조 방법으로부터 수득된 조성물로서,
    상기 조성물이 피부 콜라겐의 생산을 자극하는 효과를 갖는, 조성물.
  8. 유효량의 제7항의 조성물 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매 및/또는 부형제를 포함하는, 약제학적 배합물.
  9. 제8항에 있어서, 유효량의 조성물이 0.05ng/ml 내지 20ng/ml의 범위인, 약제학적 배합물.
  10. 제9항에 있어서, 유효량의 조성물이 0.0625ng/ml 내지 1ng/ml의 범위인, 약제학적 배합물.
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