KR20160018676A - 항-섬유형성 화합물, 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 섬유증과 관련된 질환 또는 증상의 치료 방법, 및 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도, 또는 섬유증과 관련된 질환 또는 증상의 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 용도 및 방법은 키누레닌(kynurenine), 키누렌산(kynurenic acid) 및 크산투렌산(xanthurenic acid), 및 다양한 유사체, 관련 구조 화합물, 및 약학적 조성물을 사용하며, 여기서 상기 화합물은 하기 화학식 Ⅰ, Ⅱ, 또는 Ⅲ으로 표시되는 하나 이상의 화합물이다:
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2013년 6월 5일 출원된 항-섬유형성 화합 및, 방법"을 명칭으로 미국 가출원 일련 번호 제61/831,404호로부터의 우선권을 주장한다.
본 발명은 섬유증(fibrosis)을 치료하기 위한 신규 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 섬유성 질환(fibrotic disease), 특히 켈로이드(keloids) 및 비대성 흉터(hypertrophic scaring)와 같은 피부의 질환 또는 증상의 치료를 위한 키누레닌, 키누렌산, 크산투렌산, 및/또는 관련 화합물의 용도에 관한 것이다.
섬유증식성 증상의 그룹에 속하는 질병인 섬유증은 피부, 간, 폐, 신장 및 동맥과 같은 다른 장기에서 볼 수 있다. 미국에서는 약 40%의 모든 사망의 부분적 원인은 섬유증식성 질병에 기인한다고 예측되고 있다. 피브로넥틴, 제I형 및 제Ⅲ형 콜라겐과 같은 기질(matrix)의 과형성, 기질금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinases: MMPs)와 같은 기질 분해 효소의 낮은 수준 또는 이들 모두에 기인한 세포외 기질의 과도한 축적이 모든 섬유성 증상(fibrotic condition)의 공통적인 원인이다.
모든 다른 장기에서와 같이, 피부에서의 상처 치료는 다양한 형태의 공격에 대한 조직 반응을 포함하는 동적 과정이다. 이들 과정은 신호의 계속적인 연속적 행위 및 반응을 포함하며, 혈소판, 섬유아세포, 상피세포, 내피세포 및 면역세포가 조직 보수의 매우 복잡한 과정을 조정하기 위해 이들의 통상의 도메인의 밖으로 합쳐진다. 주로 성장인자(GFs) 및 사이토카인과 같은 이들 신호는 상처 치료의 시작, 계속 및 종료를 조정한다(Scott et al. 1994). 상처부위에서의 사이토카인 및 GFs의 합성 및 분비의 불균형은 지연된 상처 치료(예컨대, 당뇨병 및 노인인구에서의 치료) 또는 과-치료(예컨대, 섬유증식성 질환, 절개, 외상성 상처 및 과열 손상에 후발하는 합병증)를 유발한다. 이와 같이, 상처 치료의 중요한 요소는 시기 적절한 중단이고, 이와 같은 시기적절한 중단 없다면, 전세계 수백만명의 환자에서 볼 수 있는 과도한 기질 형성, 유해한 섬유성 증상을 형성할 수 있다.
기질금속단백질 분해효소(MMPs)는 초기의 성장 및 발달, 자궁수복, 골성장, 골흡수 및 상처 치료와 같은 생리적 증상 동안에 ECM 턴오버 및 결합조직 리모델링에 관련된 다양한 단백질 분해효소의 그룹을 말한다. 정상세포에서의 MMP 발현 수준은 낮고, 건강한 결합조직 리모델링을 허여한다. 그러나, MMP의 발현의 불균형은 피부 섬유증, 류머티스성 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 및 종양 침습 및 전이와 같은 다수의 병리학적 증상을 유발한다.
비대성 흉터(hypertrophic scaring) 및 켈로이드와 같은 피부의 섬유증식성 질환을 포함하는 모든 섬유성 증상의 현재의 치료는 만족되지 않고 있다. 따라서, 다양한 섬유성 질환 및 증상에 대한 치료의 치료적 전략이 계속적으로 요구되고 있다.
본 발명은 특정 화합물 - 키누레닌 및 이의 유사체/아형(isoforms), 키누렌산, 및 크산투렌산 - 이 콜라겐 및 피브로넥틴 발현을 억제하는 한편 MMP1 및 MMP3 발현을 자극할 수 있다는 놀라운 발견에 일부 기초한다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 본 발명의 화합물은 생체 내(in vivo) 적용 시에, 켈로이드 흉터(keloid scar)를 저해, 예방 또는 억제할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료 또는 섬유성 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다:
여기서, E1 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; E2 는 H, OH, NH2, R, O, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; E3 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; E4 는 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형(branched linear), 사이클릭, 분지성 사이클릭(branched cyclic), 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹일 수 있고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NR'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OR', R', F, Cl, Br, I, =O, SH, SR', NH2, NHR', N(R')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(R')2 및 CO2R'로 임의로 치환될 수 있으며; R'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택될 수 있고; A는 H, 또는 NH2 일 수 있고; D는 
이거나; A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성할 수 있고:
G는 CH 또는 N 일 수 있고; J는 S 또는 O 일 수 있고; L1 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ 일 수 있고; L2 는 O, SQ', 또는 NQ' 일 수 있고; L3 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ 일 수 있고; Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹 일 수 있고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NQ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OQ', Q', F, Cl, Br, I, =O, SH, SQ', NH2, NHQ', N(Q')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Q')2 및 CO2Q'로 임의로 치환될 수 있으며, Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택될 수 있고, M1 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; M2 는 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; M3 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; M4 는 OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; T는 H, 또는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹 일 수 있고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NT'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OT', T', F, Cl, Br, I, =O, SH, ST', NH2, NHT', N(T')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(T')2 및 CO2T'로 임의로 치환될 수 있으며, T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택될 수 있고, X1 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; X2 는 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; X3 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I 일 수 있고; Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹일 수 있고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NZ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OZ', Z', F, Cl, Br, I, =O, SH, SZ', NH2, NHZ', N(Z')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Z')2 및 CO2Z'로 임의로 치환될 수 있으며, Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택될 수 있다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 섬유성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포유동물의 세포에 투여하는 것을 포함하는 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료 방법을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 섬유성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학식 II의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포유동물의 세포에 투여하는 것을 포함하는 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료 방법을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 섬유성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학식 III의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포유동물의 세포에 투여하는 것을 포함하는 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료 방법을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 섬유성 질환의 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 섬유증의 치료 방법을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 II의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 섬유증의 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 섬유성 질환의 치료 방법을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 III의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 섬유성 질환의 치료가 필요한 개체에서 투여하는 것을 포함하는 섬유성 질환의 치료 방법을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 섬유성 질환(fibrotic disease) 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 II의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 섬유성 질환(fibrotic disease) 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 III의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 섬유성 질환(fibrotic disease) 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 II의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 III의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 약학적 조성물; 및 (b) 섬유성 질환 치료를 위한 사용 지침을 포함하는 상업적 패키지를 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 (a) 화학식 Ⅰ의 화합물; 및 (b) 섬유성 질환 치료를 위한 사용 지침을 포함하는 상업적 패키지를 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 (a) 화학식 Ⅱ의 화합물; 및 (b) 섬유증 치료를 위한 사용 지침을 포함하는 상업적 패키지를 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 (a) 화학식 Ⅲ의 화합물; 및 (b) 섬유성 질환 치료를 위한 사용 지침을 포함하는 상업적 패키지를 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 섬유성 질환의 치료를 위한 화학식 I의 화합물을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 섬유성 질환의 치료를 위한 화학식 II의 화합물을 제공한다.
다른 일 구체예에서, 본 발명은 섬유성 질환의 치료를 위한 화학식 III의 화합물을 제공한다.
섬유성 질환은 켈로이드, 비대성 흉터(hypertrophic scaring), 폐섬유증, 신장섬유증, 간경화증, 백막의 만성 염증(chronic inflammation of tunica albugenia; CITA), 심내막심근섬유증, 종격 섬유증(mediastinal fibrosis), 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 진구성 심근경색(old myocardial infarction), 경피증, 전신성 경화증, 자궁 섬유증(uterine fibroids), 및 재협착증에서 하나 이상이 선택될 수 있다.
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹일 수 있다. R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹일 수 있다. T는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹일 수 있다. Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹일 수 있다.
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹일 수 있다. R'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹일 수 있다. T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹일 수 있다. Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹일 수 있다.
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다. E2 는 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다. E3 은 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다. E4 는 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다. A는 H 또는 NH2일 수 있다. D는 
일 수 있다. 다르게는, A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성할 수 있다: 
G는 CH 또는 N일 수 있다. L1 은 OH, NH2, 또는 SH일 수 있다. M1 은 H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다. M4 는 OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다. X1 은 H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다.
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3일 수 있다. E2 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3일 수 있다. E3 은 H, OH, NH2, OCH3 , 또는 CH3일 수 있다. E4 는 H, OH, NH2, OCH3 , 또는 CH3일 수 있다. A는 H 또는 NH2일 수 있다. D는 
일 수 있다. 다르게는, A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성할 수 있다: 
G는 CH 또는 N일 수 있다. L1은 OH 또는 NH2일 수 있다. M1 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다.
E1 은 H, OH, NH2, OCH3 , 또는 CH3일 수 있다. E2 는 H, OH, NH2, OCH3 , 또는 CH3일 수 있다. E3 은 H, OH, NH2, OCH3 , 또는 CH3일 수 있다. E4 는 H, OH, NH2, OCH3 , 또는 CH3일 수 있다. A는 H, 또는 NH2일 수 있다. D는 
일 수 있다. 다르게는 A 및 D는 하기의 구조를 갖는 6원환을 형성할 수 있다; 
.
E1 은 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E2 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E3 은 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E4 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. A는 H, 또는 NH2일 수 있다. D는 
일 수 있다. 다르게는, A 및 D는 하기의 구조를 갖는 6원환을 형성할 수 있다: 
.
본 발명의 화합물은 화학식 II의 구조를 가질 수 있다:
본 발명의 화합물은 화학식 III의 구조를 가질 수 있다:
L1 은 OH 또는 NH2일 수 있다. E1 은 H 또는 OH일 수 있다. E2 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E3 은 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E4 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다.
E1 은 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E2 는 H 또는 OH일 수 있다. E3 은 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E4 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다.
E1 은 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E2 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E3 은 H 또는 OH일 수 있다. E4 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다.
E1 은 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E2 는 H, OH, 또는 NH2일 수 있다. E3 은 H 또는 OH일 수 있다. E4 는 H 또는 NH2일 수 있다.
E1 은 H 또는 OH일 수 있다. E2 는 H 또는 OH일 수 있다. E3 은 H 또는 OH일 수 있다. E4 는 H 또는 NH2일 수 있다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 하기 화합물에서 선택될 수 있다:
본 발명의 화합물은 하나 이상의 하기 화합물에서 선택될 수 있다:
본 발명의 화합물은 
일 수 있다. 본 발명의 화합물은 
일 수 있다. 본 발명의 화합물은 
일 수 있다. 본 발명의 화합물은 
일 수 있다. 본 발명의 화합물은 
일 수 있다. 본 발명의 화합물은 
일 수 있다. 본 발명의 화합물은 
일 수 있다.
본 발명은 섬유증과 관련된 질환 또는 증상의 치료 방법, 및 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도, 또는 섬유증과 관련된 질환 또는 증상의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
도 1: 인간 진피 섬유아세포에서 MMP -1 발현의 인돌아민 2, 3- 디옥시게나아제 (IDO) 상승-조절. 패널 A는 형질도입되지 않거나(C), 아데노바이러스 벡터(V) 또는 IDO 재조합 유전자를 함유한 벡터(IDO)로 48시간 동안 형질전환시킨 섬유아세포를 보여준다. 여기에서, IDO 및 이의 활성은 웨스턴 블랏팅(왼쪽 패널) 및 키누레닌 수준의 측정(오른쪽 패널)으로 각각 검출되었다(N.D는 키누레닌의 수준이 검출되지 않았음을 나타낸다). 패널 B는 비처리, 아데노바이러스 벡터, 및 IDO-형질도입된 섬유아세포를 나타내며, 이들은 48시간 동안 배양시킨 후 용해시키고 MMP-1의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 검출하였다. 패널 C는 대조군, 빈 벡터(empty vector) 또는 IDO 아데노바이러스 벡터-형질도입된 섬유아세포로부터 수득한 조정배지와 함께 48시간 동안 배양한 섬유아세포를 나타내며, 여기에서 MMP-1의 발현은 웨스턴 블랏팅으로 분석되었다. β-액틴은 패널 A, B 및 C에서 로딩 대조군으로 사용되었다. * 는 p <0.001를 나타낸다.
도 2: 인간 진피 섬유아세포에서 MMP -1 발현에 대한 키누레닌 및 트립토판의 효과. 패널 A 및 B는 다양한 농도의 키누레닌 존재 하에 48시간 동안 배양된 진피 섬유아세포로, 웨스턴 블랏팅이 수행되기 전 세포들이 수확되고 용해되었을 때를 나타내며, 패널 B에서 MMP-1과 β-액틴의 비율이 제시된 것을 보여준다. 패널 C는 트립토판(25 mg/ml)의 부재 또는 존재하에 48시간 동안 배양된 진피 섬유아세포로, 세포들이 수확 및 용해되고, MMP-1 발현이 웨스턴 블랏팅에 의해 평가되었다. β-액틴은 모든 패널에서 로딩 대조군을 위해 사용되었다. 패널 D는 서로 다른 농도의 트립토판의 존재하에 48시간 동안 배양된 섬유아세포를 나타내며, MMP-1의 발현이 웨스턴 블랏팅으로 평가되었다. β-액틴은 모든 패널에서 로딩 대조군을 위해 사용되었다.
도 3: 인간 진피 섬유아세포에서 MMP -2 및 MMP -3 발현에 대한 키누레닌의 효과. 도 3은 수확 및 용해되기 전, 다양한 농도의 키누레닌 존재하에 48시간 동안 배양된 진피 섬유아세포를 나타내며, 웨스턴 블랏팅은 토끼 모노클로날 항-인간 MMP-2 항체 (패널 A) 또는 마우스 모노클로날 항-MMP-3 항체 (패널 B)를 이용하여 수행하였다. 패널 C는 3번의 독립적인 실험에 대한 MMP-3 발현과 β-액틴의 비율을 나타낸다. β-액틴은 모든 실험에서 로딩 대조군을 위해 사용되었다.
도 4: SensoLyte 520 제네릭 MMP 어세이 형광 키트를 이용한 인간 진피 섬유아세포의 조정배지에서의 MMP들의 활성 검출. 50 mg/ml의 키누레닌의 존재(Kyn) 또는 부재(CTL)하에 48시간 동안 배양된 섬유아세포로, 세포 조정배지가 수집되고 10분 동안 1000 × g에서 원심분리한 후, 상청액이 MMP들의 활성을 검출하기 위해 제조업자의 지시에 따라 사용되었다(배지는 37℃에서 3시간 동안 1mM APMA와 함께 배양되었다. 시료를 함유하는 50 ml/웰의 MMP는 50 ml의 MMP 기질 용액과 혼합되었고, 세포 배양 전의 배지는 50 ml의 MMP 기질 용액과 혼합되으며, 배양 1시간 후 기질 대조군으로 사용되었고, EX/EM=490 nm/520 nm에서의 형광강도가 측정되었다). MMP들의 활성은 상대형광단위로 나타낸다(RFU). 데이터는 평균±SD(n=3)로 나타냈다. *는 P< 0.05를 나타낸다.
도 5: 서로 다른 유형의 간엽세포에서 MMP -1 발현에 대한 키누레닌의 효과.도 5는 12.5 내지 150 mg/ml 농도의 키누레닌으로 48시간 동안 배양 및 처리된 세포를 나타내며, MMP-1 발현은 웨스턴 블랏팅으로 분석되었고 β-액틴은 모든 실험에서 로딩 대조군으로 사용되었다. 패널 A는 활막세포에서 MMP-1 발현을 나타낸다. 패널 B는 폐 섬유아세포 세포주 IMR-90에서 MMP-1 발현을 나타낸다.
도 6: 서로 다른 유형의 상피세포에서 MMP -1 발현에 대한 키누레닌의 효과. 도 6은 12.5 내지 150 mg/ml 농도의 키누레닌으로 48시간 동안 배양 및 처리된 세포를 나타내며, MMP-1 발현은 웨스턴 블랏팅으로 분석되었고 β-액틴은 모든 실험에서 로딩 대조군으로 사용되었다. 이때 상부 패널 및 하부 왼쪽 패널은 비처리 또는 키누레닌 처리로부터의 섬유아세포 용해물을 나타내며, 이들은 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다.
도 7: 키누레닌은 인간 진피 섬유아세포에서 ERK1 /2 인산화를 자극한다 - 도 7은 100 mg/ml의 키누레닌의 존재 또는 부재하에 60분 동안 배양된 진피 섬유아세포를 나타내며, 인간 포스포-키나아제 어레이 키트(R & D System™)를 사용하여 항체 어레이를 수행하기 전, 세포를 수확되고 용해 버퍼로 용해시켰다. 스팟 1, 양성 대조군; 스팟 2, 포스포-P38a; 스팟 3, 포스포-ERK1/2; 스팟 4, 포스포-GSK-3a/b; 스팟 5, 포스포-P53; 스팟 6, 양성 대조군.
도 8: 인간 진피 섬유아세포에서 MEK 및 ERK1 /2 인산화의 키누레닌 자극 - 도 8은 표시된 시간 포인트에서 100 mg/ml의 키누레닌 존재하에 배양된 진피 섬유아세포를 나타내며, 인산화-MEK 또는 인산화-ERK1/2 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅이 수행되기 전 세포들은 수확 및 용해되었다(β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다).
도 9 - MEK 또는 ERK1 /2 인산화 저해제의 첨가는 진피 섬유아세포에서 키누레닌 -자극 MMP -1 발현의 효과를 무효화시킨다. 패널 A는 100 mg/ml 키누레닌의 존재 또는 부재하에 다양한 농도의 PD98059와 함께 또는 PD98059 없이 진피 섬유아세포가 배양된 것을 보여준다. 패널 B는 100 mg/ml 키누레닌의 존재 또는 부재하에 30 mM의 PD98059 (ERK1/2 저해제), 30 mM의 U0126 (MEK 저해제) 또는 10 mM의 U0126와 함께 또는 이들 없이 진피 섬유아세포가 배양된 것을 보여준다. MMP-1 발현은 웨스턴 블랏으로 검출되었다(β-액틴은 모든 실험에서 로딩 대조군으로 사용되었다).
도 10 - 진피 섬유아세포에서 프로콜라겐 제1형 발현에 대한 키누레닌 , 키누렌산 , 및 크산투렌산의 효과 - 도 10은 인간 진피 섬유아세포가 표시된 농도의 ㅋ키누레닌으로 48시간 동안 처리된 것을 나타내고(위), 이때 프로-콜라겐에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하기 전 세포들은 수확되고 용해 버퍼로 용해되었으며, 총 50 mg의 단백질이 8% SDS-PAGE에 의해 분류되었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었고, 키누렌산(KA) 및 크산투렌산(XA)에 대해서도 테스트되었다(아래).
도 11 - 섬유아세포 증식에 대한 키누레닌의 효과 - 도 11은 인간 진피 섬유아세포가 표시된 농도의 키누레닌의 존재하에 48시간 동안 배양된 것을 나타낸다. MTT 세포 증식 어세이는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행되었고, 세포 증식은 MTT 어세이에서 세포 인덱스(OD 570nm)로 나타냈다.
도 12a 및 12b - 임상적 외관과 상처 및 흉터의 조직학 - 도 12a 및 12b는 8일째부터 시작하여 총 3주간 아무것도 처리하지 않거나(CTL), CMC 겔 단독(Gel), 또는 0.1 ml의 CMC 겔 내의 50 mg 의 키누레닌(Kyn)으로 매일 처리된 토끼 귀 상처를 나타낸다. 패널 A는 28일째에 ×25 배율에서 아무것도 처리하지 않거나(CTL), CMC 겔(Gel) 또는 CMC 겔 내의 키누레닌(Kyn)으로 처리한 상처의 현미경 조직학을 나타낸다. 패널 B는 측정된 흉터 증가 지수(SEI)를 나타낸다(비처리, CMC 겔, 및 CMC 겔-처리 상처에서 키누레닌에 대한 SEI의 평균±SD). * 은 키누레닌-처리 및 비처리 대조군 사이의 유의적인 차이를 나타낸다(P<0.001); ** 은 키누레닌과 CMC 겔 대조군 사이의 유의적인 차이를 나타낸다(P<0.01). 패널 C는 ×25 및 ×100 배율에서 비처리 피부 상처(왼쪽 패널), 크림으로 처리된 피부 상처(중간 패널), 또는 키누레닌으로 처리된 상처(오른쪽 패널)로부터의 Massons' 트리크롬염색된 전층 피부 섹션을 나타낸다. 패널 D는 비처리 상처(총 4개), 크림으로 처리된 상처(총 4개), 또는 키누레닌으로 처리된 상처(총 8개)로부터의 피부의 총 하이드록시프롤린 함량을 나타낸다 - * 은 p<0.01를 나타낸다.
도 13 - 키누레닌의 국소 적용은 토끼 귀 피부에서 MMP -1 발현을 증가시키고 제1형 α1 콜라겐을 감소시킨다 - 도 13은 전술한 바와 같이 아무것도 처리하지 않거나(CTL) 또는 겔 단독(Gel) 또는 키누레닌에 겔을 더하여(Kyn) 처리한 토끼 귀의 상처를 나타낸다. 여기에서 피부 상처는 Trizol™으로 총 RNA를 추출하기 위해 사용되었고, 1 mg의 RNA는 제1형 α1 콜라겐, MMP-1 및 β-액틴에 대한 정량적 RT-PCR을 위한 cDNA 합성을 위해 사용되었다. 패널 A는 토끼 귀 피부 조직에서 제1형 α1 콜라겐의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 패널 B는 토끼 귀 피부 조직에서 MMP-1의 상대적 발현 수준을 나타낸다 - * 은 p< 0.05를 나타낸다.
도 14 - 인간 진피 섬유아세포에서 MMP -1 발현에 대한 키누레닌 아형의 효과 - 도 14는 50 ㎍/ml의 DL-키누레닌(DL-Kyn) 또는 D-키누레닌(D-Kyn) 또는 L-키누레닌(L-Kyn) 중 하나의 존재 또는 부재하에 48시간 동안 배양한 진피 섬유아세포를 나타내며, 로딩 대조군으로 β-액틴, 항-인간 MMP-1 항체로 웨스턴 블랏팅을 수행하기 전에 세포들이 수확되고 단백질 용해 버퍼(50 mg 총 단백질이 10% SDS 아크릴아미드 겔 상에 로딩되었다)에 용해되었고, 이는 테스트된 모든 키누레닌 아형이 진피 섬유아세포에서 MMP-1 발현을 증가시킨다는 것을 나타내지만, L-키누레닌이 다른 두 아형과 비교하여 더 높은 활성을 갖는 것으로 보인다.
도 15 - 인간 진피 섬유아세포에서 콜라겐 발현에 대한 키누레닌 (FS1) 유사체의 효과 - 도 15는 다양한 농도의 DL-키누레닌(FS1), L-키누레닌, D-키누레닌 또는 키누렌산(FS2) 중 하나로 처리된 진피 섬유아세포, 실시간 PCR에 의해 검출된 mRNA 수준에서의 해당 콜라겐 발현을 나타내며, 로딩 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 16 - 인간 진피 섬유아세포에서 피브로넥틴 발현에 대한 키누레닌 (FS1) 유사체의 효과 - 도 16은 진피 섬유아세포를 다양한 농도의 DL-키누레닌(FS1), L-키누레닌, D-키누레닌 또는 키누렌산(FS2) 중 하나로 처리하고, 실시간 PCR에 의해 검출된 mRNA 수준에서의 해당 피브로넥틴 발현을 나타내며, 로딩 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 17a 및 17b - ConA -자극 지라세포 증식에 대한 50, 100, 150 ㎍ /mL 트립토판 대사체(FS1, LK, FS2, DK)의 억제 효과 비교 - 도 17a 및 17b는 지라세포 증식이 48시간 후에 100 및 150 ㎍/ml에서 D-Kyn, L-Kyn 및 DL-Kyn에 의해 약 2배 정도 현저하게 감소했음에도 불구하고 100 및 150 ㎍/ml의 D-Kyn, L-Kyn, DL-Kyn (FS-1) 및 키누렌산 (FS2)으로 처리한 다음 96시간 후 지라세포 증식이 거의 5배 감소한 것을 나타낸다(P<0.05). 그러나, FS2는 증식 효과가 덜 하다는 것을 보여준다.
도 18 - FS1 (DL- 키누레닌 ) 처리 및 비처리 마우스 지라세포에서 면역 인자 단백질 마이크로어레이 - 도 18은 IL-1, IL-2, CXCL9 및 CXCL10과 같은 일부 전염증성 사이토카인 및 케모카인 생성에 대해 FS1이 면역 억제 효과를 갖는다는 것을 나타내고, FS1은 IL-17 생성에서 현저한 감소를 나타내며, 이는 염증에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 패널 A는 비처리(ConA) 또는 100 ㎍/mL의 Kyn (ConA+Kyn)으로 48시간 동안 처리된 활성화된 지라세포를 나타내며, 조정배지(CM)는 비처리 및 처리된 세포로부터 수집되고 프로테옴 프로파일러 항체 어레이™(Proteome Profiler Antibody Array™) 막에 노출시킨 다음 페인 B(Pane B)에 나타낸 바와 같이 각각의 참조 스팟에 대해 비처리 및 처리 세포에 대하여 밀도 값 백분율로 나타냈다. 패널 B는 프로테옴 프로파일러 항체 어레이 막에 의해 확인된 신호를 나타낸다. 패널 C는 패널 B에 나타난 스팟의 수가 참조 단백질을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 19 - 인간 진피 섬유아세포에서 MMP1 발현에 대한 FS1 및 FS2의 지속 효과. 패널 A는 MMP1 발현에 대한 키누레닌(FS1) 및 키누렌산 (FS2)의 지속 효과를 나타내며, 이때 섬유아세포는 FS1 또는 FS2 (100 ㎍/mL)로 48시간 동안 처리되었으며, 배지를 교체하고 처리 제거 후 12, 24 및 48시간에 세포를 즉시 수확하였고, 웨스턴 블랏팅을 이용하여 진피 섬유아세포에서 MMP1 발현을 평가하였다. 패널 B는 처리된 섬유아세포에서 계산된 MMP1/β 액틴 발현 비율을 나타낸다. 데이터는 4번의 독립된 실험의 평균 ± SEM이다 (*P-value<0.05 및 **P-value<0.01, n=4).
도 2: 인간 진피 섬유아세포에서 MMP -1 발현에 대한 키누레닌 및 트립토판의 효과. 패널 A 및 B는 다양한 농도의 키누레닌 존재 하에 48시간 동안 배양된 진피 섬유아세포로, 웨스턴 블랏팅이 수행되기 전 세포들이 수확되고 용해되었을 때를 나타내며, 패널 B에서 MMP-1과 β-액틴의 비율이 제시된 것을 보여준다. 패널 C는 트립토판(25 mg/ml)의 부재 또는 존재하에 48시간 동안 배양된 진피 섬유아세포로, 세포들이 수확 및 용해되고, MMP-1 발현이 웨스턴 블랏팅에 의해 평가되었다. β-액틴은 모든 패널에서 로딩 대조군을 위해 사용되었다. 패널 D는 서로 다른 농도의 트립토판의 존재하에 48시간 동안 배양된 섬유아세포를 나타내며, MMP-1의 발현이 웨스턴 블랏팅으로 평가되었다. β-액틴은 모든 패널에서 로딩 대조군을 위해 사용되었다.
도 3: 인간 진피 섬유아세포에서 MMP -2 및 MMP -3 발현에 대한 키누레닌의 효과. 도 3은 수확 및 용해되기 전, 다양한 농도의 키누레닌 존재하에 48시간 동안 배양된 진피 섬유아세포를 나타내며, 웨스턴 블랏팅은 토끼 모노클로날 항-인간 MMP-2 항체 (패널 A) 또는 마우스 모노클로날 항-MMP-3 항체 (패널 B)를 이용하여 수행하였다. 패널 C는 3번의 독립적인 실험에 대한 MMP-3 발현과 β-액틴의 비율을 나타낸다. β-액틴은 모든 실험에서 로딩 대조군을 위해 사용되었다.
도 4: SensoLyte 520 제네릭 MMP 어세이 형광 키트를 이용한 인간 진피 섬유아세포의 조정배지에서의 MMP들의 활성 검출. 50 mg/ml의 키누레닌의 존재(Kyn) 또는 부재(CTL)하에 48시간 동안 배양된 섬유아세포로, 세포 조정배지가 수집되고 10분 동안 1000 × g에서 원심분리한 후, 상청액이 MMP들의 활성을 검출하기 위해 제조업자의 지시에 따라 사용되었다(배지는 37℃에서 3시간 동안 1mM APMA와 함께 배양되었다. 시료를 함유하는 50 ml/웰의 MMP는 50 ml의 MMP 기질 용액과 혼합되었고, 세포 배양 전의 배지는 50 ml의 MMP 기질 용액과 혼합되으며, 배양 1시간 후 기질 대조군으로 사용되었고, EX/EM=490 nm/520 nm에서의 형광강도가 측정되었다). MMP들의 활성은 상대형광단위로 나타낸다(RFU). 데이터는 평균±SD(n=3)로 나타냈다. *는 P< 0.05를 나타낸다.
도 5: 서로 다른 유형의 간엽세포에서 MMP -1 발현에 대한 키누레닌의 효과.도 5는 12.5 내지 150 mg/ml 농도의 키누레닌으로 48시간 동안 배양 및 처리된 세포를 나타내며, MMP-1 발현은 웨스턴 블랏팅으로 분석되었고 β-액틴은 모든 실험에서 로딩 대조군으로 사용되었다. 패널 A는 활막세포에서 MMP-1 발현을 나타낸다. 패널 B는 폐 섬유아세포 세포주 IMR-90에서 MMP-1 발현을 나타낸다.
도 6: 서로 다른 유형의 상피세포에서 MMP -1 발현에 대한 키누레닌의 효과. 도 6은 12.5 내지 150 mg/ml 농도의 키누레닌으로 48시간 동안 배양 및 처리된 세포를 나타내며, MMP-1 발현은 웨스턴 블랏팅으로 분석되었고 β-액틴은 모든 실험에서 로딩 대조군으로 사용되었다. 이때 상부 패널 및 하부 왼쪽 패널은 비처리 또는 키누레닌 처리로부터의 섬유아세포 용해물을 나타내며, 이들은 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다.
도 7: 키누레닌은 인간 진피 섬유아세포에서 ERK1 /2 인산화를 자극한다 - 도 7은 100 mg/ml의 키누레닌의 존재 또는 부재하에 60분 동안 배양된 진피 섬유아세포를 나타내며, 인간 포스포-키나아제 어레이 키트(R & D System™)를 사용하여 항체 어레이를 수행하기 전, 세포를 수확되고 용해 버퍼로 용해시켰다. 스팟 1, 양성 대조군; 스팟 2, 포스포-P38a; 스팟 3, 포스포-ERK1/2; 스팟 4, 포스포-GSK-3a/b; 스팟 5, 포스포-P53; 스팟 6, 양성 대조군.
도 8: 인간 진피 섬유아세포에서 MEK 및 ERK1 /2 인산화의 키누레닌 자극 - 도 8은 표시된 시간 포인트에서 100 mg/ml의 키누레닌 존재하에 배양된 진피 섬유아세포를 나타내며, 인산화-MEK 또는 인산화-ERK1/2 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅이 수행되기 전 세포들은 수확 및 용해되었다(β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다).
도 9 - MEK 또는 ERK1 /2 인산화 저해제의 첨가는 진피 섬유아세포에서 키누레닌 -자극 MMP -1 발현의 효과를 무효화시킨다. 패널 A는 100 mg/ml 키누레닌의 존재 또는 부재하에 다양한 농도의 PD98059와 함께 또는 PD98059 없이 진피 섬유아세포가 배양된 것을 보여준다. 패널 B는 100 mg/ml 키누레닌의 존재 또는 부재하에 30 mM의 PD98059 (ERK1/2 저해제), 30 mM의 U0126 (MEK 저해제) 또는 10 mM의 U0126와 함께 또는 이들 없이 진피 섬유아세포가 배양된 것을 보여준다. MMP-1 발현은 웨스턴 블랏으로 검출되었다(β-액틴은 모든 실험에서 로딩 대조군으로 사용되었다).
도 10 - 진피 섬유아세포에서 프로콜라겐 제1형 발현에 대한 키누레닌 , 키누렌산 , 및 크산투렌산의 효과 - 도 10은 인간 진피 섬유아세포가 표시된 농도의 ㅋ키누레닌으로 48시간 동안 처리된 것을 나타내고(위), 이때 프로-콜라겐에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하기 전 세포들은 수확되고 용해 버퍼로 용해되었으며, 총 50 mg의 단백질이 8% SDS-PAGE에 의해 분류되었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었고, 키누렌산(KA) 및 크산투렌산(XA)에 대해서도 테스트되었다(아래).
도 11 - 섬유아세포 증식에 대한 키누레닌의 효과 - 도 11은 인간 진피 섬유아세포가 표시된 농도의 키누레닌의 존재하에 48시간 동안 배양된 것을 나타낸다. MTT 세포 증식 어세이는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행되었고, 세포 증식은 MTT 어세이에서 세포 인덱스(OD 570nm)로 나타냈다.
도 12a 및 12b - 임상적 외관과 상처 및 흉터의 조직학 - 도 12a 및 12b는 8일째부터 시작하여 총 3주간 아무것도 처리하지 않거나(CTL), CMC 겔 단독(Gel), 또는 0.1 ml의 CMC 겔 내의 50 mg 의 키누레닌(Kyn)으로 매일 처리된 토끼 귀 상처를 나타낸다. 패널 A는 28일째에 ×25 배율에서 아무것도 처리하지 않거나(CTL), CMC 겔(Gel) 또는 CMC 겔 내의 키누레닌(Kyn)으로 처리한 상처의 현미경 조직학을 나타낸다. 패널 B는 측정된 흉터 증가 지수(SEI)를 나타낸다(비처리, CMC 겔, 및 CMC 겔-처리 상처에서 키누레닌에 대한 SEI의 평균±SD). * 은 키누레닌-처리 및 비처리 대조군 사이의 유의적인 차이를 나타낸다(P<0.001); ** 은 키누레닌과 CMC 겔 대조군 사이의 유의적인 차이를 나타낸다(P<0.01). 패널 C는 ×25 및 ×100 배율에서 비처리 피부 상처(왼쪽 패널), 크림으로 처리된 피부 상처(중간 패널), 또는 키누레닌으로 처리된 상처(오른쪽 패널)로부터의 Massons' 트리크롬염색된 전층 피부 섹션을 나타낸다. 패널 D는 비처리 상처(총 4개), 크림으로 처리된 상처(총 4개), 또는 키누레닌으로 처리된 상처(총 8개)로부터의 피부의 총 하이드록시프롤린 함량을 나타낸다 - * 은 p<0.01를 나타낸다.
도 13 - 키누레닌의 국소 적용은 토끼 귀 피부에서 MMP -1 발현을 증가시키고 제1형 α1 콜라겐을 감소시킨다 - 도 13은 전술한 바와 같이 아무것도 처리하지 않거나(CTL) 또는 겔 단독(Gel) 또는 키누레닌에 겔을 더하여(Kyn) 처리한 토끼 귀의 상처를 나타낸다. 여기에서 피부 상처는 Trizol™으로 총 RNA를 추출하기 위해 사용되었고, 1 mg의 RNA는 제1형 α1 콜라겐, MMP-1 및 β-액틴에 대한 정량적 RT-PCR을 위한 cDNA 합성을 위해 사용되었다. 패널 A는 토끼 귀 피부 조직에서 제1형 α1 콜라겐의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 패널 B는 토끼 귀 피부 조직에서 MMP-1의 상대적 발현 수준을 나타낸다 - * 은 p< 0.05를 나타낸다.
도 14 - 인간 진피 섬유아세포에서 MMP -1 발현에 대한 키누레닌 아형의 효과 - 도 14는 50 ㎍/ml의 DL-키누레닌(DL-Kyn) 또는 D-키누레닌(D-Kyn) 또는 L-키누레닌(L-Kyn) 중 하나의 존재 또는 부재하에 48시간 동안 배양한 진피 섬유아세포를 나타내며, 로딩 대조군으로 β-액틴, 항-인간 MMP-1 항체로 웨스턴 블랏팅을 수행하기 전에 세포들이 수확되고 단백질 용해 버퍼(50 mg 총 단백질이 10% SDS 아크릴아미드 겔 상에 로딩되었다)에 용해되었고, 이는 테스트된 모든 키누레닌 아형이 진피 섬유아세포에서 MMP-1 발현을 증가시킨다는 것을 나타내지만, L-키누레닌이 다른 두 아형과 비교하여 더 높은 활성을 갖는 것으로 보인다.
도 15 - 인간 진피 섬유아세포에서 콜라겐 발현에 대한 키누레닌 (FS1) 유사체의 효과 - 도 15는 다양한 농도의 DL-키누레닌(FS1), L-키누레닌, D-키누레닌 또는 키누렌산(FS2) 중 하나로 처리된 진피 섬유아세포, 실시간 PCR에 의해 검출된 mRNA 수준에서의 해당 콜라겐 발현을 나타내며, 로딩 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 16 - 인간 진피 섬유아세포에서 피브로넥틴 발현에 대한 키누레닌 (FS1) 유사체의 효과 - 도 16은 진피 섬유아세포를 다양한 농도의 DL-키누레닌(FS1), L-키누레닌, D-키누레닌 또는 키누렌산(FS2) 중 하나로 처리하고, 실시간 PCR에 의해 검출된 mRNA 수준에서의 해당 피브로넥틴 발현을 나타내며, 로딩 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 17a 및 17b - ConA -자극 지라세포 증식에 대한 50, 100, 150 ㎍ /mL 트립토판 대사체(FS1, LK, FS2, DK)의 억제 효과 비교 - 도 17a 및 17b는 지라세포 증식이 48시간 후에 100 및 150 ㎍/ml에서 D-Kyn, L-Kyn 및 DL-Kyn에 의해 약 2배 정도 현저하게 감소했음에도 불구하고 100 및 150 ㎍/ml의 D-Kyn, L-Kyn, DL-Kyn (FS-1) 및 키누렌산 (FS2)으로 처리한 다음 96시간 후 지라세포 증식이 거의 5배 감소한 것을 나타낸다(P<0.05). 그러나, FS2는 증식 효과가 덜 하다는 것을 보여준다.
도 18 - FS1 (DL- 키누레닌 ) 처리 및 비처리 마우스 지라세포에서 면역 인자 단백질 마이크로어레이 - 도 18은 IL-1, IL-2, CXCL9 및 CXCL10과 같은 일부 전염증성 사이토카인 및 케모카인 생성에 대해 FS1이 면역 억제 효과를 갖는다는 것을 나타내고, FS1은 IL-17 생성에서 현저한 감소를 나타내며, 이는 염증에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 패널 A는 비처리(ConA) 또는 100 ㎍/mL의 Kyn (ConA+Kyn)으로 48시간 동안 처리된 활성화된 지라세포를 나타내며, 조정배지(CM)는 비처리 및 처리된 세포로부터 수집되고 프로테옴 프로파일러 항체 어레이™(Proteome Profiler Antibody Array™) 막에 노출시킨 다음 페인 B(Pane B)에 나타낸 바와 같이 각각의 참조 스팟에 대해 비처리 및 처리 세포에 대하여 밀도 값 백분율로 나타냈다. 패널 B는 프로테옴 프로파일러 항체 어레이 막에 의해 확인된 신호를 나타낸다. 패널 C는 패널 B에 나타난 스팟의 수가 참조 단백질을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 19 - 인간 진피 섬유아세포에서 MMP1 발현에 대한 FS1 및 FS2의 지속 효과. 패널 A는 MMP1 발현에 대한 키누레닌(FS1) 및 키누렌산 (FS2)의 지속 효과를 나타내며, 이때 섬유아세포는 FS1 또는 FS2 (100 ㎍/mL)로 48시간 동안 처리되었으며, 배지를 교체하고 처리 제거 후 12, 24 및 48시간에 세포를 즉시 수확하였고, 웨스턴 블랏팅을 이용하여 진피 섬유아세포에서 MMP1 발현을 평가하였다. 패널 B는 처리된 섬유아세포에서 계산된 MMP1/β 액틴 발현 비율을 나타낸다. 데이터는 4번의 독립된 실험의 평균 ± SEM이다 (*P-value<0.05 및 **P-value<0.01, n=4).
본 명세서에서 직접적으로 정의되지 않은 모든 용어는 본 발명의 기술분야에서 이해되는 것과 같이 그 용어와 일반적으로 관련된 의미를 갖는 것으로 이해되야할 것이다. 본 명세서를 통해 적용된 바와 같이, 다음의 용어들은, 다르게 나타내지 않는 한 다음의 의미를 갖는 것으로 이해되야할 것이다.
본 명세서에서 사용된 '개체(subject)'는 새 또는 포유동물과 같은 동물을 말한다. 구체적인 동물로는 래트, 마우스, 개, 고양이, 소, 양, 말, 돼지 또는 영장류를 포함한다. 개체는 추가로 인간일 수 있으며, 대안적으로 환자(patient)로 언급될 수 있다. 개체는 추가로 형질전환동물일 수 있다. 개체는 추가로 비버, 마우스 또는 래트와 같은 설치류일 수 있다.
본 명세서에 사용된 '저해제(inhibitor)'는 생리학적, 화학적 또는 효소 활성 또는 기능을 억제 또는 지연시키는 약물, 화합물 또는 제제를 말한다. 저해제는 효소 활성의 적어도 5% 감소를 야기할 수 있다. 저해제는 또한 유전자 또는 단백질의 발현, 전사 또는 번역을 방해하거나 감소시키는 약물, 화합물 또는 제제를 말한다.
'인돌아민 2, 3-디옥시게나아제', 또는 'IDO'는, 트립토판을 N-포르밀키누레닌으로, 그리고 키누레닌(Kyn)으로 변환시키는 헴-함유 비율 제한 효소리며, 대식세포 및 영양 아층의 비-간세포에서 주로 발견된다. 최근 결과들은 IDO에 의해, 트립토판, 필수 아미노산의 이화작용이 면역 내성과 관련된 것으로 보인다(Kahari 및 Saarialho-Kere 1997). 본 명세서에서 입증된 바와 같이, 키누레닌과 이의 분해 산물인 키누렌산 및 크산투렌산은 MMP-1 및 MMP-3을 유도하며, 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 섬유증의 감소를 나타낸다.
'기질금속단백질 분해효소' 또는 'MMP'는 패밀리는 포유동물 시스템에서 25 징크- 및 칼슘-의존 프로테이나아제로 구성된다. 이들의 기질 특이성, 1차 구조 및 세포 위치에 따라, 콜라게나아제, 겔라티나아제, 스트로멜리신, 마트릴리신, 및 막-유형 MMP로 알려진 밀접하게 연관된 멤버의 5개의 서로 다른 서브패밀리가 확인되었다(Murphy et al. 2002). 이들 모든 MMP에서, MMP1이 제1형, 제2형 및 제3형과 같은 간질성 콜라겐을 분해하는 교원 분해성 과정(collagenolytic process)에 연관된 주요 효소인 반면, MMP-3 (스트로멜리신-1)은 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 및 라미닌과 같은 ECM의 비교원성 부분을 주로 분해하는 것으로 알려진 프로테아제이다(Kahari 및 Saarialho-Kere 1997). 섬유아세포에 의해 방출되는 MMP1과 MMP3 발현 증가는 ECM의 거의 모든 주요 성분의 분해를 개시할 수 있다(Saus et al. 1988). 케라티노사이트에 의해 생성된 MMP들은 상피세포의 이동을 가능하게 하는 것으로 현재 인정되는 반면, 섬유아세포에 의해 나타나는 MMP들은 조직 리모델링을 촉진한다(Salo et al. 1991).
'섬유증(Fibrosis)'은 기관 또는 조직의 정상 구성요소로서 섬유 조직의 형성과 반대로, 회복 또는 반응성 과정과 같이 기관 또는 조직에서 과도한 섬유 결합조직의 형성 또는 발달과 관련된 일반적 용어이다. 흉터(Scarring)는 근본적인 기관 또는 조직의 구조를 제거하는 융합성 섬유증(confluent fibrosis)이다. 섬유증과 연관되거나 섬유증으로 특징지어지는 많은 질환 및/또는 증상이 있으며, 이는 켈로이드, 비대성 흉터, 폐섬유증, 신장섬유증, 간경화증, 백막의 만성 염증(chronic inflammation of tunica albugenia; CITA), 심내막심근섬유증, 종격 섬유증(mediastinal fibrosis), 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 진구성 심근경색(old myocardial infarction), 경피증 및 전신성 경화증을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
섬유증과 관련되거나 섬유증으로 특징지어지는 질환 또는 증상의 치료에 사용하기 위한 많은 화합물이 본 명세서에 제공된다. 현재 발명의 상세한 설명의 문맥상, 용어 '치료'는 기존의 섬유증 또는 섬유성 질환의 치료를 말하며, 또는 대안적으로 섬유증의 발달 또는 진행을 방지하기 위한 섬유성 진행 전 또는 진행 중에 일어나는 치료를 말한다. 본 명세서에 기재된 화합물은 분리될 수 있으며, 또는 추적 화합물, 리포좀, 탄수화물 담체, 고분자성 담체 또는 해당 기술분야의 당업자에게 명백한 다른 제제 또는 부형제와 결합 또는 조합될 수 있다. 다른 일실시예에서, 상기 화합물은 약제를 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 화합물은 약학적 유효량으로 존재할 수 있다. 화합물은 개체가 섬유증 또는 섬유성 질환의 예방 또는 치료에 이익을 얻을 수 있기 때문에 이를 필요로 하는 개체에게 투여하기에 적합한 것일 수 있다. 화합물은 또한 토토머(tautomers) 또는 입체이성질체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "FS"는 FibroStops를 말한다 (예를 들어, FS1은 키누레닌 (또는 DL-키누레닌 또는 DL-Kyn)의 약어로 사용되고, FS2 또는 KA는 키누렌산의 약어로 사용될 수 있다). L-키누레닌은 본 명세서에서 L-Kyn으로 표시될 수 있고, D-키누레닌은 본 명세서에서 D-Kyn으로 표시될 수 있다. 유사하게, 크산투렌산은 본 명세서에서 XA로 표시될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 '약제(medicament)'는 환자 또는 테스트 개체에 투여될 수 있는 조성물을 말하며, 환자 또는 테스트 개체에서 효과를 나타낼 수 있다. 효과는 화학적, 생물학적 또는 물리적일 수 있으며, 환자 또는 테스트 개체는 인간 또는 설치류 또는 형질전환 마우스, 또는 개, 고양이, 소, 양, 말, 햄스터, 기니피그, 토끼 또는 돼지와 같은 비-인간 동물일 수 있다. 약제는 효과적인 화학물질(chemical entity) 단독 또는 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 구성될 수 있다.
용어 '약학적으로 허용되는 부형제'는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제, 항생제 또는 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 생리학적으로 적합한 그 밖의 유사한 것 등을 포함할 수 있다. 부형제는 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 척추 강내, 국소 또는 경구 투여에 적합할 수 있다. 부형제는 멸균 주사 용액 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 수성 용액 또는 분산제를 포함할 수 있다. 약제의 제조를 위한 상기 매질의 사용은 해당 기술분야에 알려져 있다.
일부 실시예에 따른 조성물 또는 화합물은 임의의 다양한 알려진 경로로 투여될 수 있다. 화합물 투여에 적합한 방법의 예는 경구, 정맥 내, 흡입, 근육 내, 피하, 국소, 복강 내, 직장 내 또는 질내 좌약, 설하 및 그 밖의 유사한 경로들을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물은 멸균 수성 용액으로 투여되거나, 지용성 부형제 또는 적합한 또 다른 용액, 현탁액, 패치, 정제 또는 페이스트 형태로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물을 포함하는 조성물은 흡입으로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 에어로졸에 분산되도록 부형제와 결합될 수 있다. 흡입 제형의 예는 해당 기술분야의 당업자에게 공지될 것이다. 다른 제제는 흡수 또는 대사를 돕기 위해, 또는 제어된-방출 제형과 같이 숙주 내로 분산을 지연시키기 위해 본 명세서에 기재된 화합물과 결합되어 포함될 수 있다. 제어된 방출 제형의 예는 해당 기술분야의 당업자에게 공지될 것이며, 마이크로캡슐화 탄수화물 또는 중합체 매트릭스 내 색전증(embolism), 및 그 밖의 것을 포함할 수 있다. 제형을 제조하기 위해 해당 기술분야에 공지된 다른 방법은, 예를 들어, "Remington’s Pharmaceutical Sciences", (19th edition), ed. A. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa 에서 찾아 볼 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시예의 조성물 또는 화합물의 투여량은 투여 경로(경구, 정맥 내, 흡입 또는 그 밖의 경로 등) 및 조성물 또는 화합물이 투여되는 형태(용액, 제어된 방출 또는 그 밖의 형태 등)에 따라 달라질 수 있다. 적합한 투여량의 결정은 해당 기술분야의 당업자의 재량에 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 약제의 '유효량', '치료학적 유효량' 또는 '약학적 유효량'은 약물이 사용된 기간 동안 전달된 약물의 치료학적 수준을 야기하는 농도로 존재하는 약제의 양을 말한다. 이는 전달 방식, 투여 기간, 약제를 수용하는 개체의 나이, 몸무게, 일반적인 건강, 성별 및 식이에 따라 다를 수 있다. 유효량을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일 실시예에서, 섬유성 질환을 가지거나 갖는 것으로 의심되는 개체의 치료를 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 화학식 Ⅰ, Ⅱ, 또는 Ⅲ에 해당하는 구조를 갖는 치료학적 유효량의 화합물 개체에게 투여함을 포함한다. 섬유성 질환은 다음 중 하나일 수 있다: 켈로이드, 비대성 흉터, 폐섬유증, 신장섬유증, 간경화증, 백막의 만성 염증(chronic inflammation of tunica albugenia; CITA), 심내막심근섬유증, 종격 섬유증(mediastinal fibrosis), 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 진구성 심근경색(old myocardial infarction), 경피증, 전신성 경화증, 자궁 섬유증(uterine fibroids), 및 재협착증.
재료 및 방법
세포 배양
섬유아세포, 케라티노사이트 및 활막세포의 공급원(source)으로 신생아 포피와 관절이 사용되었다. 절차(procedure)는 브리티시 컬럼비아 대학의 인간 윤리 위원회의 승인을 바탕으로 수행되었다. 인간의 포피 섬유아세포의 배양은 전술한 바와 같이 이루어졌다(Li et al., 2006). 요약하면, 포피를 모으고, 항생제-항진균제 조제 물질(100 u/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/ml 암포테리신 B)(Invitrogen Life Technologies™, Gaithersburg, MD)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; GIBCO™, Grand Island, NY)로 3회 세척하였다. 시료는 지방이 없는 쪽으로 해부되었고, 직경 2.0 mm 미만의 작은 조각으로 분쇄(mince)하여 DMEM으로 6회 세척한 뒤, 60 × 15-mm 페트리 디쉬에 분배하고 5% CO2 환경의 워터-재킷 가습 배양기(water-jacked humidified incubator)에서 37℃로 배양하였다. 배지는 1주일에 두 번 교체되었다. 세포포화상태(confluence)에 도달하면, 세포는 트립신 처리(0.1% 트립신, Invitrogen Life Technologies™) 및 (0.02% EDTA, Sigma™, St. Louis, MO)에 의해 방출되었고, 1:6의 비율로 계대배양을 위해 분할한 뒤 75-cm2 플라스크에 재파종(reseed) 되었다. 본 연구에서는 3-7 계대(passage)로부터의 섬유아세포를 사용하였다.
인간 포피 케라티노사이트는 전술한 바와 같이 준비되었다(Ghahary et al., 1998). 세포는 소 뇌하수체 추출물(50 ㎍/ml) 및 EGF(0.2 ng/ml)가 보충된 무혈청 케라티노사이트 배지(KSFM; Invitrogen Life Technologies™)에서 배양되었다. 이들 세포는 2-5 계대에서 사용되었다.
활막세포는 37℃에서 4시간 동안 RPMI1640 (Invitrogen Life Technologies™)에서 1 mg/ml 콜라게나아제로(Sigma™) 관절 대체 수술 동안 류머티스 관절염 환자 유래 활막의 효소 소화에 의해 수득되었다. 분리된 세포는 페니실린 G 나트륨(100 U/mL), 스트렙토마이신 설페이트(100 ㎍/mL) 및 암포테리신 B(0.25 ㎍/mL)로 보충된 활막세포 성장 배지(Cell Applications Inc.™, San Diefo, CA)에 평판배양 되었다. 활막세포는 형태학적으로 균질한 섬유아세포-유사 세포인 것으로 나타났고, 2-5 계대에서 사용되었다.
두경부암 환자 유래 편평 세포 암종(UMSCC) 세포주(ATCC™, Manassas, VA)는 10% FBS를 갖는 RPMI-1640 배지에서 유지되었다. 인간 케라티노사이트 세포주 HACAT (ATCC)와 암종 인간 치음경 기저 상피 세포주 A549(carcinomic human alveolar basal epithelial cell line A549, ATCC™)는 10% FBS를 갖는 DMEM에서 배양되었다. 이배체 폐 섬유아세포 IMR-90 (ATCC™)은 10% FBS를 갖는 최소 필수 배지(MEM, Invitrogen™)에서 유지되었다.
아데노바이러스성
벡터에 의한 유전자 형질주입
아데노바이러스성 벡터를 발현하는 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO)의 구성은 전술된 바와 같다(Li et al., 2004). 재조합 아데노바이러스는 100의 감염다중도(MOI)로 인간 피부 섬유아세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 유리된 바이러스 입자들은 감염 30시간 후 배양 배지로부터 제거되었다. 감염의 성공 여부는 리포터 유전자 GFP를 보기 위한 플루오레세인이소티오시안산염(FITC) 필터(Motic Instruments™, Richmond, BC, Canada)가 구비된 Motic™ 도립현미경을 이용하여 형광현미경에 의해 측정되었다. IDO의 발현은 전술한 바와 같이 항-인간 IDO 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 평가되었다(Li et al., 2004). IDO의 생물활성은 조정배지에 존재하는 트립토판 분해 산물, 키누레닌의 수준을 측정함으로써 평가되었다.
조정배지에서의
키누레닌
측정
키누레닌의 수준은 전술한 방법으로 측정되었다(Tokikawa et al., 1988). 요약하면, 약 2 ml의 조정배지가 형질주입 3일 후 동일한 세포 수 개시 배양으로부터 수집되었다. 조정배지로부터의 단백질은 트리클로로초산에 의해 침전되었다. 침전된 단백질을 제거하기 위한 원심분리 후, 약 0.5 ml의 상청액을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮기고 실온에서 10분 동안 동일한 용량의 Ehrich's 시약(Sigma™)으로 배양하였다. 그 결과 생성된 용액의 흡수는 490 nm에서 분광광도계에 의해 2시간 내에 측정되었다. 조정배지의 키누레닌 값은 소정의 키누레닌 농도(0-20 ㎍/ml)로 표준곡선에 의해 계산되었다.
세포 처리
조정배지의 수집을 위해, 섬유아세포는 30시간 동안 대조 모의 벡터터(control mock vector) 또는 IDO 아데노바이러스로 형질도입되거나, 또는 형질도입이 이루어지지 않았다. 바이러스는 PBS로 세척하여 제거하였다. 10% FBS 및 항생제를 함유하는 신선한 DMEM가 추가되었고, 세포는 추가로 48시간 동안 계속해서 배양되었다. 이후 처리되지 않거나, 모의 벡터, 또는 IDO 아데노바이러스 형질도입된 섬유아세포로부터 조정배지가 수집되었다. 80% 세포포화상태(confluence)에서 섬유아세포는 10% FBS 존재하에 10% 신선한 배지를 추가한 90%의 조정배지를 함유하는 배지로 처리되었다. 세포를 48시간 후에 수확하였고, 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
또 다른 세트의 실험에서, 80% 세포포화상태(confluence)의 섬유아세포는 48시간 동안 2% FBS와 항생제를 함유하는 DMEM의 결과 섹션(result section)에 언급된 바와 같은 표시 농도(indicated concentration)로 키누레닌 또는 트립토판으로 처리되었다. 이후 트립신 처리에 의해 세포를 수확하고 웨스턴 블랏을 수행하였다.
유사하게, 활막 세포, IMR-90, 케라티노사이트, UMSCC 및 A549와 같은 다른 세포들은 48시간 동안 전술된 각각의 세포 유형에 대한 적합한 배지에서 12.5 내지 150 ㎍/ml의 농도의 키누레닌으로 처리되었다. 이후 웨스턴 블랏 분석을 위해 세포를 수확하였다.
웨스턴
블랏
분석
세포는 트립신/EDTA에 의해 수확되었고, 50 mM Tris-HCl (pH7.40), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% TritonX-100™, 0.5% Igepal CA-630, 0.025% NaN3 및 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma™)을 함유하는 세포 용해 버퍼로 용해되었다. 세포 파편들은 20,000 × g에서 10분 동안 원심분리하여 제거되었다. 상청액에서의 단백질 농도는 MicroBCA™ 방법(Pierce™, Rockford, IL)을 이용하여 측정되었다. 상청액의 단백질은 단백질 시료 로딩 버퍼(최종 농도: 60 mM Tris-HCl (pH 6.80), 2% SDS, 10% 글리세롤, 1.5% β-머캅토에탄올, 0.002% 브로모페놀 블루)와 혼합되고, 10%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 의해 크기 분획되었다. 단백질이 iBlot™ (Invitrogen Life Technologies™)에 의해 니트로셀룰로오스 막으로 이동한 후, 비-특이적 결합이 5% 스킴 밀크를 함유하는 포스페이트 버퍼 살린 트웬티20(PBS-T)으로 1시간 동안 차단되었다. 이후 막은 1차 항체와 함께 밤새 배양되었다. 1시간 동안 2차 항체와 함께 배양한 후, 단백질 밴드는 증가된 화학발광 (ECL™) 검출 시스템 (Santa Cruz Biotechnology™, Santa Cruz, CA)에 의해 시각화되었다. 본 연구에 사용된 1차 항체들은 마우스 모노클로날 항-인간 MMP-1(R&D Systems™, Minneapolis, MN), 마우스 모노클로날 항-인간 MMP-3 (R&D System™), 토끼 모노클로날 항-인간 MMP-2 (Epitomics™, Burlingame, CA), 토끼 폴리클로날 항-포스포-MEK1/2(Ser217/221™) (Cell Signaling Technology™, Danvers, MA), 토끼 폴리클로날 항-포스포-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology™), 모노클로날 항-β-액틴 (Sigma™), 및 마우스 항-제1형 프로콜라겐 (Developmental Studies Hybridoma Bank™, Iowa City, IA)이다. 2차 항체들은 염소 항-마우스 IgG(H+L) HPR 콘쥬게이트 또는 염소 항-토끼 IgG (H+L) HPR 콘쥬게이트(Bio-rad Laboratory™)(Mississauga, ON, Canada)이다. 2차 항체들은 1:3000의 농도로 사용되었다.
MMP
활성
어세이
(assay)
MMPs의 활성은 제조업자의 프로토콜에 따라 MMP 기질(SensoLyte 520™ 제네릭 MMP 어세이 키트, AnaSpec, Inc.™, Fremont, CA)로 F-FAM/QXLTM 520 형광공명에너지전이 (FRET) 펩타이드를 이용하여 평가되었다. 요약하면, 세포는 48시간 동안 50 ㎍/ml의 키누레닌으로 처리하거나 처리하지 않았다. 조정배지가 수집되고 3시간 동안 37 ℃에서 1mM의 APMA (4-아미노페닐-머큐릭 아세테이트, 구성요소 C에서(in component C), AnaSpect™)와 함께 배양되었다. APMA로 MMP들을 활성화시킨 후, 96-웰 플레이트에서 50 ㎕/웰의 조정배지가 50 ㎕의 MMP 기질 용액과 함께 혼합되었다. 60분 동안 실온에서 배양한 후, 기질 대조군을 포함하는 각 시료에서 EX/EM=490 nm/520 nm에서의 형광강도를 Infinite F500™ 형광 마이크로플레이트 리더(Tecan Group Ltd™, Morrisville, NC)를 이용하여 측정하였다.
인산화 단백질 어레이(array)
90% 세포포화상태(confluence)에서의 인간 섬유아세포를 FBS 없이 DMEM에서 밤새 스타베이션(starved)시키고, 2시간 동안 100 ㎍/ml의 키누레닌으로 처리하거나 처리하지 않았다. 단백질 인산화는 제조업자의 지시에 따라 Human Phospho-Kinase Array™ (R&D System™)을 이용하여 평가되었다. 요약하면, 캡쳐(capture) 및 대조(control) 항체는 니트로셀룰로오스 막(총 46개의 키나아제 인산화 부위)에 중복되어 발견되었다. 세포 용해물(어레이 당 300 ㎍의 총 단백질)이 어레이와 함께 밤새 배양되었다. 어레이는 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위하여 세척되었고, 비오틴 검출 항체의 칵테일과 함께 배양하였다. 스트렙타비딘-HPR과 함께 30분 동안 배양한 후, ECL 검출 시스템(Santa Cruz™)에 의해 신호를 시각화하였다. 블랏들(blots)은 농도계에 의해 분석되었고, 단백질 인산화는 각각의 막에 나타난 양성 대조군으로 정상화되었다.
토끼 귀
비대성
흉터 모델 및
키누레닌의
국소 적용
4.5-5 kg 몸무게의 암컷 토끼(New Zealand white)들이 본 연구를 위해 사용되었다. 브리티시 컬럼비아 대학의 동물 보호 위원회에 의해 프로토콜이 검토되고 승인되었다. 비대성 흉터 토끼 귀 모델은 전술한 바와 같이 마련되었다(Rahmani-Neishaboor, et al., 2010). 요약하면, 2 마리의 토끼가 케타민(22.5 mg/kg) 및 자일라진(2.5 mg/kg)의 근육내 주사에 의해 마취되고 기관내 삽관을 통한 이소플루레인 가스가 이어진다. 4개의 상처들이 피부의 전층 섹션을 제거하기 위해 8-mm 피부 생검 펀치를 이용하여 각 귀의 복부 측면(ventral side)에 노출된 연골까지 형성되었다. 항생제는 키누레닌 처리가 시작될 때까지 매일 상처에 적용하였다.
500 ㎍/ml의 농도로 CMC 겔의 키누레닌(Rahmani-Neishabooret al., 2010)이 상처가 생긴지 1주일 후부터 3주 동안 매일 실험군의 상처에 국소적으로 적용되었다(상처 당 0.1 ml). 대조군의 상처는 매일 동일한 양의 크림으로만 처리되었다.
동물들은 처리 후 3주에 희생되었다. 흉터(10 mm 펀치 생검)들이 채취되었다. 각각의 흉터는 이의 종축을 따라 두 부분으로 나누어 절반은 일상적인 조직학적 분석을 위해 처리되었고, 나머지 절반은 추후 사용을 위해 -80℃에서 보관하였다.
흉터 증가는 H & E 염색 조직 섹션으로부터 흉터 증가 인덱스(Scar Elevation Index; SEI)를 측정함으로써 정량하였다. SEI는 비대성 흉터 아래 정상 조직에 대한 상처 조직의 전체 높이의 비율이다. 1 SEI는 흉터 높이가 주변의 상처를 입지 않은 진피와 동일하다는 것을 나타낸다; SEI > 1 은 증가된 비대성 흉터를 나타낸다.
MTT
어세이
인간 진피 섬유아세포 증식에 대한 키누레닌의 효과는 MTT [3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드] 어세이에 의해 검출되었다. 요약하면, 10,000 개의 세포는 24-웰 플레이트에 접종되고 서로 다른 농도의 키누레닌과 함께 48시간 동안 배양되었다. 배지를 제거하고 0.2 ml의 MTT (2% FBS를 함유하는 DMEM 내 5 mg/ml)를 첨가하였다. 세포는 4시간 동안 MTT와 함께 배양되었다. PBS로 3회 세척한 후, 0.2 ml의 DMSO를 첨가하여 결정을 용해시켰다. 흡광도는 570 nm에서 측정되었다.
피부 시료로부터 히드록시프롤린 함량의 측정: 종래에 보고된 방법에 따라(Gawronskao-Kozak B.et al. 2006), 직경 8 mm 피부 펀치의 절반은 중량을 재고 -80℃에서 냉동되었다. 피부는 2 ml의 PBS에서 균질화되었고 4℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, 1 ml의 6N HCl이 첨가되었고 혼합물은 120℃에서 5시간 동안 가열되었다. 20 ㎕의 냉각된 시료와 50 ㎕의 클로라민 T 용액이 96-웰 플레이트에 첨가되었고 실온에서 20분 동안 배양되었다. 이후 50 ㎕의 엘리치 용액(Erlich solution)이 첨가되고 혼합물은 65℃에서 15분 동안 배양되었다. 흡광도는 570 nm 에서 읽었다. 히드록시프롤린 농도는 표준곡선에 의해 계산되었다.
RNA 추출, cDNA 합성 및 정량적 RT-
PCR
RNA는 Trizol™ (Invitrogen Life Technologies™)에 의해 추출되었다. 요약하면, 1 ml의 Trizol™ 은 균질화된 피부 조직에 첨가되었다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 놓아둔 후 250 ㎕의 클로로포름을 첨가하였다. 20,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 후 맨 위의 수상(aqueous phase)은 새로운 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮겨졌다. 동일한 부피의 이소프로판올을 수상에 첨가하였고 부드럽게 혼합하였다. 20분 동안 원심분리한 후 펠릿을 1 ml의 75% 에탄올로 세척하였다. RNA를 DEPC 처리 H2O에 용해시키고 이의 농도를 Nanodrop2000™로 측정하였다. cDNA는 각 시료에서 1mg의 총 RNA를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 Roche의 cDNA 합성 키트에 의해 합성되었다. 토끼 제1형 α1 콜라겐, MMP-1 및 하우스키퍼 유전자(housekeeper gene) β-액틴에 대한 정량적 실시간 PCR이 ViiA7 (Invitrogen™)에서 수행되었다. cDNA 시료를 STBR Green Master Mix™(Rox) (Roche™, Indianapolis, IN)를 함유하는 PCR 반응 마스터 믹스(PCR reaction master mix)에 첨가하였다. 모든 반응은 다음과 같은 사이클 조건을 이용하여 이중으로 수행하였다: 10분 동안 95℃의 1 사이클, 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40 사이클. 각 시료에서 제1형 α1 콜라겐 및 MMP-1의 발현 수준은 β-액틴으로 정상화되었다. RT-PCR 프라이머: 토끼 제1형 α1 콜라겐: 5'-ACAAGGGTGAGACAGGCGAAC-3' (정방향), 5'-GCCGTTGAGTCCATCTTTCCC-3' (역방향); MMP-1, 5'-TCTGGCCACATCTGCCAATGG-3' (정방향), 5'-AGGGAAGCCAAAGGAGCTGTG-3' (역방향); β-액틴, 5'-AACGAGCGCTTCCGTTGGCCC-3' (정방향), 5'-CTTCTGCATGCGGTCCGCGA-3'(역방향).
실시예
인돌아민
2, 3-
디옥시게나아제
(IDO) 발현은 인간 진피 섬유아세포에서
MMP
-1 발현을 상승-조절한다
MMP-1 발현에 대한 IDO의 효과를 평가하기 위해, 인간 IDO 재조합 아데노바이러스 벡터를 종래에 보고된 방법으로 인간 진피 섬유아세포에 유전자 형질도입시키기 위해 사용하였다(Li et al., 2004). 형질주입 효율은 조정배지에서 웨스턴 블랏 분석 및 키누레닌 측정을 통한 단백질 발현 및 이의 활성을 각각 검출함으로써 평가되었다. 도 1A의 왼쪽 패널에 나타난 바와 같이, IDO 단백질은 IDO 아데노바이러스-형질도입 섬유아세포에서 발현되었으나, 대조군 및 모의 아데노바이러스-형질도입 섬유아세포(mock adenovirus-transduced fibroblasts)에서는 검출되지 않았다. 키누레닌의 수준, IDO 활성에 대한 인덱스는 형질도입되지 않거나 또는 모의-형질도입 대조군(mock transduced control)과 비교하여 IDO 아데노바이러스-형질도입 섬유아세포에서 현저하게 높았다(14.3 ± 0.46 ㎍/ml, n=3)(도 1A의 오른쪽 패널).
대조군, 모의-형질도입 및 IDO-발현 섬유아세포에서의 MMP-1 발현은 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 분석하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, IDO-발현 섬유아세포(12.56 ± 2.37, n=3)에서 MMP-1 발현이 모의-형질도입(1.37 ± 0.59, n=3) 및 비처리된 대조군 섬유아세포(1 ± 0, n=3)와 비교하여 9배 이상 증가하였다. 이러한 결과는 모의-형질도입 섬유아세포가 비처리된 섬유아세포에서 MMP-1 발현과 유의적인 차이를 나타내지 않기 때문에 IDO-발현 섬유아세포에서의 MMP-1 발현의 상승-조절이 아데노바이러스 감염으로 인한 것이 아님을 나타낸다.
IDO는 트립토판을 키누레닌으로 변환시키는 세포내 효소이다. 따라서, IDO-발현 섬유아세포에서 MMP-1 자극의 효과는 IDO 단백질 자체로 인한 것인지 또는 트립토판 대사로 인한 것인지를 명확하게 밝혀야 한다. 이를 위해, 48시간 후에 IDO-발현 섬유아세포 및 대조군으로부터 조정배지를 수집하였다. 이후 90%의 수집된 조정배지 및 10%의 신선한 배지의 조합물이 진피 섬유아세포를 처리하기 위해 사용되었다. 세포들은 처리 48시간 후에 수확되었다. 도 1C에 나타난 바와 같이, MMP-1 발현의 유의적인 증가는 모의-형질도입(1.16 ± 0.31, n=3) 또는 비처리 대조군 섬유아세포(1 ± 0, n=3)와 비교하여 IDO-형질도입 섬유아세포(2.06 ± 0.62, n=3)로부터의 조정배지로 처리한 세포에서 관찰되었다. 이러한 결과는 세포 내의 IDO 단백질보다 IDO 아데노바이러스 감염 섬유아세포의 조정배지 내 인자 또는 인자들이 섬유아세포에서 증가된 MMP-1 발현 수준의 원인으로 작용한다는 것을 나타낸다.
트립토판의 고갈이 아닌,
키누레닌이
인간 진피 섬유아세포에서
MMP
-1 발현을 유도한다
IDO는 트립토판을 키누레닌으로 변환시키는 효소이다. 어떠한 요인(트립토판의 고갈 또는 키누레닌의 증가)이 MMP-1 발현의 IDO 상승-조절의 원인으로 작용하는지 조사. 어떠한 요인이 MMP-1 발현의 IDO 상승-조절의 원인으로 작용하는지 조사하기 위해 섬유아세포를 트립토판 고갈 배양 배지 또는 다양한 농도의 키누레닌을 포함하는 일반 배지에서 성장시켰다. 이후 세포들은 웨스턴 블랏으로 MMP-1 발현에 대해 평가되었다. 도 2C에 나타난 바와 같이, 25 ㎍/ml의 트립토판 존재하에서 성장한 섬유아세포와 트립토판-고갈 배양 배지에서 성장한 섬유아세포 사이에서 MMP-1 발현의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나, MMP-1 발현은 서로 다른 용량(25-150 ㎍/ml)의 키누레닌에 반응하여 현저하게 증가하였다(도 2A 및 도 2B). 이러한 결과들은 트립토판 고갈이 아닌, 키누레닌의 존재가 IDO-발현 세포에서 MMP-1의 상승-조절에 기여한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 우리는 최소 12.5 ㎍/ml의 키누레닌이 진피 섬유아세포에서 MMP-1 발현을 자극시킬수 있다는 것을 발견하였다(데이터는 도시되지 않음). 이 키누레닌 농도는 IDO 발현 섬유아세포로부터의 조정배지에서 검출된 농도와 유사하다(도 1A의 오른쪽 패널). 따라서, 섬유아세포에서 MMP-1의 자극은, 유사 구조를 갖는 다양한 농도의 트립토판의 추가가 진피 섬유아세포에서 MMP-1의 발현을 증가시키는데 실패하였기 때문에, 명확하게 키누레닌에 특이적이다(도 2D).
진피 섬유아세포에서 MMP-2와 MMP-3 발현에 대한 키누레닌의 효과
키누레닌이 다른 MMP들의 발현에도 영향을 미치는지 조사하기 위해, 우리는 진피 섬유아세포를 도 2에 사용한 것과 유사한 농도의 키누레닌으로 처리하였다. 대조군으로 비처리된 세포를 이용하여 MMP-2 및 MMP-3 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블라팅(western blotting)을 사용하였다. 도 3A에 나타난 바와 같이, 키누레닌-처리 및 비처리 섬유아세포 사이에 MMP-2 발현의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나, 유사한 조건에서, 키누레닌 처리는 진피 섬유아세포에서 용량 의존적으로 MMP-3 발현을 현저하게 증가시켰다(도 3B/3C). 더욱이, 키누레닌-처리 섬유아세포에서 MMP들의 증가된 수준에 뒤따라 증가된 MMP 활성이 나타나는지 테스트하기 위해, 50 ㎍/ml 키누레닌의 처리 또는 부재하에 섬유아세포로부터의 조정배지를 처리 48시간 후에 수집하였다. 조정배지에서 MMP 활성은 5-FAM/QXLTM 520 형광공명에너지전이(FRET) 펩타이드를 MMP 기질로 사용하여 SensoLyte 520TM 제네릭 MMP 어세이 키트에 의해 탐지되었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 키누레닌 처리 섬유아세포로부터의 조정배지에서 MMP의 평균 활성은 대조군 배지에서 보다 현저히 높았다. 이는 키누레닌으로 처리된 섬유아세포에서 증가된 MMP들이 효소 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
간엽세포 및 상피세포는 키누레닌 처리에 대해 다르게 반응한다
어떤 유형의 세포가 키누레닌-유도 MMP-1 발현에 민감한지 측정하기 위해, 간엽세포(예를 들어, 고정화 폐 섬유아세포 세포주 IMR-90과 섬유아세포-유사 활막세포)와 상피세포(예를 들어, 폐 상피 암종 세포주 A549, 1차 진피 케라티노사이트, 인간 고정화 케라티노사이트 세포주 HACAT, 및 두경부 편평상피암종 세포주 UMSCC)가 사용되었다. 진피 섬유아세포처럼, 활막세포 및 IMR-90에서 MMP-1 발현은 도 5에 나타난 바와 같이 12.5 ㎍/ml 내지 150 ㎍/ml 농도의 키누레닌 처리에 의해 상승-조절되었다. 그러나, 진피 케라티노사이트, HACAT, A549 및 UMSCC를 포함한 테스트된 모든 상피세포에서 MMP-1의 발현은 키누레닌의 다양한 농도에 대한 반응에서 비처리된 대조군과 크게 다르지 않았다(도 6). 이러한 결과들은 키누레닌-자극 MMP-1 발현에 대한 반응에서 간엽세포와 상피세포 사이에 차이가 있다는 것을 나타낸다.
키누레닌으로
처리된 세포에서
포스포키나아제
어레이에 의한 인산화된 신호 분자의 확인
진피 케라티노사이트에서 키누레닌 상승-조절 MMP-1 발현의 가능한 메커니즘을 결정하기 위해, 우리는 포스포-키나아제 어레이(phosphor-kinase array)를 이용하여, 다중 세린, 트레오닌 또는 티로신 키나아제의 활성을 분석하였다. 상기 어레이는 46개의 서로 다른 단백질 키나아제 및 이들의 다운스트림(downstream) 전사인자들의 활성화 상태를 동시에 탐지하는 것을 가능하게 한다. 도 7에 나타난 바와 같이, 진피 케라티노사이트에 키누레닌으로 처리한 뒤 1시간 후에 세포외 신호-조절 키나아제 1/2(ERK1/2)가 활성화되었다.
포스포-키나아제 어레이로부터 이러한 결과들을 확인하기 위해, 진피 섬유아세포들은 100 ㎍/ml의 키누레닌으로 서로 다른 시간에 처리되었다. 이후 어레이에 배치된 것과 다른 항체를 이용하여, ERK1/2 및 이의 업스트림(upstream) 분자 미토겐-활성 단백질/세포외 신호-조절 키나아제(MEK)를 검출하기 위해 면역검출 분석(immunoblotting analysis)이 사용되었다. 도 8에 나타난 바와 같이, ERK1/2는 키누레닌으로 처리된 세포에서 인산화되었다. 상기 결과는 키누레닌으로 처리된 세포에서 ERK1/2 업스트림 신호 분자 MEK 인산화의 검출에 의해 추가로 확인되었다(도 8). ERK1/2와 MEK는 모두 키누레닌 처리 8시간 후에 하나의 피크를 갖는, 유사한 활성화 패턴을 보여주었다(도 8).
MEK-
ERK1
/2 인산화 저해제의 첨가는 진피 섬유아세포에서
키누레닌
자극 MMP-1 발현의 효과를 무효화시킨다
또 다른 세트의 실험에서, 우리는 키누레닌에 의한 MEK-ERK1/2 MAPK 경로의 활성이 진피 섬유아세포에서 키누레닌-자극 MMP-1 발현과 관련이 있는지 테스트하였다. 이를 위해, 우리는 키누레닌-자극 MMP-1 발현에 대한 MEK 또는 ERK1/2 인산화 저해제의 효과를 조사하였다. 도 9A에 나타난 바와 같이, ERK1/2 활성에 대한 특이적인 저해제인 PD98059의 첨가는 용량 의존적으로 MMP-1 발현에 대한 키누레닌의 자극 효과를 효과적으로 방지하였다. 유사하게, 세포를 MEK 활성에 대한 특이적인 저해제인 U0126로 10 μM 및 30 μM 처리하면 키누레닌에 의한 MMP-1 발현의 상승-조절 또한 현저하게 감소시킨다(도 9B). 이러한 결과들은 MEK-ERK1/2 신호 경로의 활성화가 진피 섬유아세포에서 키누레닌에 의해 유도된 MMP-1 발현의 상승-조절에 기여한다는 것을 입증한다.
진피 섬유아세포에서의 콜라겐 발현 및 섬유아세포 증식에 대한
키누레닌의
효과
생체 내(in vivo)에서 키누레닌의 항-섬유성 역할을 연구하기 전에, 키누레닌은 콜라겐 발현 및 세포 증식에 대한 이의 효과에 대해 테스트되었다. 도 10(위)에 나타난 바와 같이, 키누레닌 25-150 ㎍/ml의 추가는 제1형 프로콜라겐의 발현을 현저하게 감소시킨다. 그러나, 세포가 최대 150 ㎍/ml 농도의 키누레닌에서 배양되었을 때에도, 섬유아세포 증식에 대한 유의적인 효과는 나타나지 않았다(도 11). 또한, 키누레닌 유사체/대사체, 키누렌산 및 크산투렌산의 테스팅은 이러한 화합물이 제1형 프로콜라겐의 발현을 저해하는데에도 효과적이라는 것을 입증한다(도 10(아래)).
토끼 귀 상처에 대힌 키누레닌의 국소 적용은 흉터를 감소시킨다
키누레닌으로 진피 섬유아세포를 처리하면 제1형 프로콜라겐 발현의 감소뿐만 아니라 MMP-1 및 MMP-3 발현 증가를 나타내기 때문에 우리는 키누레닌이 비대성 흉터의 치료 또는 예방을 위한 항-섬유증 제제로서 사용될 수 있는지에 대해 알고 싶었다. 이를 위해, 전술한 바와 같이 (Rahmani-Neishabooret al., 2010; Kloeterset al., 2007; Xie et al., 2008), 토끼 귀 비대성 흉터 모델이 사용되었다. 상처는 상처가 형성된 후 8일째부터 매일 3주 동안 50 ㎍의 키누레닌을 함유하는 0.1 ml의 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC) 겔로 처리되었다. 상처 당 50 mg 용량의 키누레닌은 최적의 결과를 갖는 생체 외(in vitro) 시스템에서 사용된 것과 일치하였다. 이러한 결과는 비처리 또는 CMC 겔 처리 대조군과 비교하여 키누레닌-처리 상처에서 상처 봉합에 대해 유의적인 차이는 없음을 나타낸다(데이터는 도시되지 않음). 그러나, 도 12A에 나타난 바와 같이, 3주 후에 비-처리 상처 또는 비히클(vehicle)만 처리한 대조군 상처보다 키누레닌으로 처리한 상처에서 현저하게 적은 흉터가 관찰되었다. 평균 흉터 증가 인덱스(average scar elevation index; SEI)는 비히클만 처리한 대조군(1.978 ± 0.442, n=4, p<0.01) 및 비처리군(2.098 ± 0.324, n=4, p<0.001)과 비교하여 키누레닌-처리군(1.172 ± 0.156, n=8)에서 현저하게 감소하였다(도 12B). 콜라겐에 대한 Massons' 트리크롬염색은 비처리 또는 겔 단독으로 처리한 상처들과 비교하여 키누레닌으로 처리한 상처에서 콜라겐 함량의 현저한 감소를 나타냈다(도 12C). 이러한 결과와 일치하여, 히드록시프롤린 함량(조직 콜라겐 함량에 대한 인덱스로 사용됨)은 비처리 또는 겔만 단독으로 처리한 상처들과 비교하여 키누레닌으로 처리한 상처에서 현저하게 낮았다(도 12D).
마지막으로, 우리는 토끼 귀 섬유증 모델에서 키누레닌의 국소 적용이 비처리 또는 겔만 단독으로 처리한 상처들과 비교하여 제1형 α1 콜라겐의 발현을 감소시키고 MMP-1의 발현을 증가시킨다는 것을 입증하였다(도 13). 이러한 결과들은 키누레닌이 잠재적으로 비대성 흉터 및 심지어 화상 또는 절개 수술환자에서 자주 볼 수 있는 켈로이드도 치료하기 위한 항-섬유증 인자로 사용될 수 있다는 추정을 추가로 뒷받침해준다.
인간 진피 섬유아세포에서
MMP
-1 발현에 대한
키누레닌
아형(
isoform
)의 효과
키누레닌의 서로 다른 아형이 MMP-1 발현에 영향을 미치는 능력에 대해 테스트 하였다. 테스트된 아형은 DL-키누레닌(DL-Kyn) 또는 D-키누레닌(D-Kyn) 및 L-키누레닌(L-Kyn)이다. 결과는 모든 아형들이 진피 섬유아세포에서 MMP-1 발현을 증가시킨다는 것을 나타내지만, L-키누레닌이 다른 나머지 두 개의 아형과 비교하여 더 높은 활성을 갖는 것으로 보여진다(도 14 참조).
인간 진피 섬유아세포에서 콜라겐 발현에 대한 서로 다른
키누레닌
아형/유사체의 효과
진피 섬유아세포는 도 15에 나타난 바와 같이, FS-1(DL-키누레닌) 또는 D-키누레닌 또는 L-키누레닌 또는 FS-2(키누렌산) 중 하나로 처리되었다. 제1형, α1 콜라겐 발현은 실시간 PCR에 의해 검출되었다. 결과는 이들 아형/유사체들이 콜라겐 발현을 감소시키는데 유사한 효능을 갖는다는 것을 나타낸다.
키누레닌
및 이의
대사체는
배양된 섬유아세포에서
피브로넥틴
발현을
하향조절한다
진피 섬유아세포는 도 16에 나타난 바와 같이, 다양한 농도의 DL-키누레닌(FS1), L-키누레닌, D-키누레닌 또는 키누렌산(FS2) 중 하나로 처리되었다. 피브로넥틴의 발현은 실시간 PCR에 의해 검출되었다. 결과는 키누레닌, DL-키누레닌, 및 L-키누레닌이 모두 피브로넥틴 발현을 하향조절할 수 있다는 것을 입증하며, 이는 키누레닌 대사체도 섬유아세포증식증(fibroproliferative disorder)의 예방 또는 치료에 적합하다는 것을 나타낸다.
키누레닌 및 대사체/유사체는 지라세포에 대해 유의적인 효과를 갖는다
도 17a 및 17b의 결과들은 지라세포 증식이 48시간 후 100 및 150 ㎍/ml의 D-키누레닌, L-키누레닌 및 DL-키누레닌에 의해 약 2배 정도 감소하였음에도 불구하고, 96시간 후 100 및 150 ㎍/ml의 D-키누레닌, L-키누레닌 또는 DL-키누레닌으로 처리한 다음 conA-유도 지라세포 증식이 거의 5배가 감소했다는 것을 보여주었다(P<0.05). FS2는 증식에 대해 다른 대사체 보다 적은 효과를 갖는다. 도 18의 결과들은 FS1이 IL-1, IL-2, CXCL9, 및 CXCL10과 같은 일부 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 케모카인 생성에 대해 면역 억제 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 게다가 이는 염증에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는 IL-17 생성을 현저하게 감소시킬 수 있다.
섬유아세포에서 MMP-1 발현에 대한 키누렌산 및 키누레닌의 지속 효과
섬유아세포에서 MMP-1 발현에 대한 키누렌산(KynA) 및 키누레닌(Kyn)의 지속효과를 측정하기 위해, 세포들은 100 ㎍/ml의 상기 약물로 처리되었다. 처리 48시간 후 배지는 신선한 배지로 교체되었고 이후 세포들은 처리 제거 후 0, 12, 24 또는 48시간에 수확하였다. 처리 후 48시간에 KynA 또는 Kyn에 대한 반응으로 섬유아세포에서 MMP-1 발현의 현저한 증가가 나타났다. Kyn 및 KynA의 제거 후, MMP-1 발현은 또 다른 24시간 동안 비처리된 세포보다 현저하게 높은 상태로 유지되었다(도 19A). 놀랍게도, MMP1 단백질 발현은 Kyn 제거 후 48시간 이내에 정상 수준으로 점차 감소하는 반면, KynA에 대한 반응으로 MMP1 발현은 대조군보다 높게 유지되었다(도 19A). 도 19B는 도 19A 데이터의 정량적 분석을 나타낸다(* P-value<0.05, ** P-value<0.01, n=4). 이러한 결과들로부터 Kyn가 처리된 섬유아세포와 비교하여 KynA가 MMP-1 발현에 대해 더 긴 지속효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
비록 다양한 구체예들이 본 명세서에 기재되어 있기는 하나, 많은 개조(adaptation) 및 변형이 본 기술분야의 당업자의 일반적인 지식에 따라 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 실질적으로 동일한 방식으로 동일한 결과를 달성하기 위해 본 발명의 임의의 양태에 대한 알려진 등가물의 치환을 포함한다. 수치 범위들은 범위를 한정하는 수치들을 포함한다. 용어 "포함하는(comprising)"은 본 명세서에서 확장가능한 용어(open ended term)로 사용되며, 실질적으로 "포함하나, 이에 한정되지 않는"에 상응하고, 용어 "포함하다"는 해당 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "어떤 것(a thing)"에 대한 언급은 하나 이상의 상기 어떤 것을 포함한다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 발명의 일 구체예에 대한 선행 기술임을 인정하는 것이 아니다. 본 발명은 실질적으로 전술한 바와 같은 모든 구체예 및 변형을 상기 실시예 및 도면을 참조하여 포함한다.
Claims (60)
- 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료를 위한 용도:
여기서,
E1 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E2 는 H, OH, NH2, R, O, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이며;
E3 는 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E4 는 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이며;
R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형(branched linear), 사이클릭, 분지성 사이클릭(branched cyclic), 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NR'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OR', R', F, Cl, Br, I, =O, SH, SR', NH2, NHR', N(R')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(R')2 및 CO2R'로 임의로 치환될 수 있으며;
R'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
A는 H, 또는 NH2 이며;
D는이거나;
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
J는 S 또는 O이며;
L1 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
L2 는 O, SQ', 또는 NQ'이며;
L3 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NQ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OQ', Q', F, Cl, Br, I, =O, SH, SQ', NH2, NHQ', N(Q')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Q')2 및 CO2Q'로 임의로 치환될 수 있으며;
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
M1 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이며;
M2 는 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M3 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이며;
M4 는 OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
T는 H, 또는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NT'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OT', T', F, Cl, Br, I, =O, SH, ST', NH2, NHT', N(T')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(T')2 및 CO2T'로 임의로 치환될 수 있으며;
T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
X1 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X2 는 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이며;
X3 는 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NZ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OZ', Z', F, Cl, Br, I, =O, SH, SZ', NH2, NHZ', N(Z')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Z')2 및 CO2Z'로 임의로 치환될 수 있으며;
Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. - 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물의 섬유성 질환(fibrotic disease)을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 용도:
여기서,
E1 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E2 는 H, OH, NH2, R, O, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E3 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E4 는 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NR'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OR', R', F, Cl, Br, I, =O, SH, SR', NH2, NHR', N(R')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(R')2 및 CO2R'로 임의로 치환될 수 있으며;
R'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
A는 H, 또는 NH2 이며;
D는이거나;
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
J는 S 또는 O이며;
L1 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
L2 는 O, SQ', 또는 NQ'이며;
L3 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NQ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OQ', Q', F, Cl, Br, I, =O, SH, SQ', NH2, NHQ', N(Q')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Q')2 및 CO2Q'로 임의로 치환될 수 있으며;
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고,
M1 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M2 는 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M3 는 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M4 는 OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
T는 H, 또는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NT'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OT', T', F, Cl, Br, I, =O, SH, ST', NH2, NHT', N(T')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(T')2 및 CO2T'로 임의로 치환될 수 있으며;
T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
X1 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X2 는 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X3 는 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NZ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OZ', Z', F, Cl, Br, I, =O, SH, SZ', NH2, NHZ', N(Z')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Z')2 및 CO2Z'로 임의로 치환될 수 있으며;
Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 섬유성 질환이 하나 이상의 켈로이드, 비대성 흉터(hypertrophic scaring), 폐섬유증, 신장섬유증, 간경화증, 백막의 만성 염증(chronic inflammation of tunica albugenia; CITA), 심내막심근섬유증, 종격 섬유증(mediastinal fibrosis), 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 진구성 심근경색(old myocardial infarction), 경피증, 전신성 경화증, 자궁 섬유증(uterine fibroids), 및 재협착증인 용도.
- 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서,
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이며,
T는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹인 용도. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
R'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이며,
T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹인 용도. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
A는 H 또는 NH2이며;
D는이거나;
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
L1 은 OH, NH2, 또는 SH이며;
M1 은 H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M4 는 OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X1 은 H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I인 용도. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
A는 H 또는 NH2이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
L1 은 OH 또는 NH2이고;
M1 은 H, OH, 또는 NH2 인 용도. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
A는 H, 또는 NH2이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기의 구조를 갖는 6원환을 형성하는 용도:
.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2이고;
A는 H, 또는 NH2이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기의 구조를 갖는 6원환을 형성하는 용도:
.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 Ⅱ의 구조를 갖는 화합물인 용도:
.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 Ⅲ의 구조를 갖는 화합물인 용도:
.
- 제11항에 있어서, L1 은 OH 또는 NH2인 용도.
- 제11항에 있어서, L1 은 OH인 용도.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H 또는 OH이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 용도. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H 또는 OH이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 용도. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 용도. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H 또는 NH2인 용도. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H 또는 OH이고;
E2 는 H 또는 OH이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H 또는 NH2인 용도. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하나 이상의 하기 화합물인 용도:
.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하나 이상의 하기 화합물인 용도:
- 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포유동물의 세포에 투여하는 것을 포함하는 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료 방법:
여기서,
E1 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E2 는 H, OH, NH2, R, O, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이며;
E3 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E4 는 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이며;
R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NR'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OR', R', F, Cl, Br, I, =O, SH, SR', NH2, NHR', N(R')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(R')2 및 CO2R'로 임의로 치환될 수 있으며;
R'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
A는 H, 또는 NH2 이며;
D는이거나;
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
J는 S 또는 O이며;
L1 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
L2 는 O, SQ', 또는 NQ'이며;
L3 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NQ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OQ', Q', F, Cl, Br, I, =O, SH, SQ', NH2, NHQ', N(Q')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Q')2 및 CO2Q'로 임의로 치환될 수 있으며;
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
M1 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이며;
M2 는 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M3 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이며;
M4 는 OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
T는 H, 또는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NT'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OT', T', F, Cl, Br, I, =O, SH, ST', NH2, NHT', N(T')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(T')2 및 CO2T'로 임의로 치환될 수 있으며;
T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
X1 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X2 는 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이며;
X3 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NZ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OZ', Z', F, Cl, Br, I, =O, SH, SZ', NH2, NHZ', N(Z')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Z')2 및 CO2Z'로 임의로 치환될 수 있으며;
Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. - 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 섬유성 질환의 치료 방법:
여기서,
E1 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E2 는 H, OH, NH2, R, O, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E3 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E4 는 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NR'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OR', R', F, Cl, Br, I, =O, SH, SR', NH2, NHR', N(R')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(R')2 및 CO2R'로 임의로 치환될 수 있으며;
R'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
A는 H, 또는 NH2 이며;
D는이거나;
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
J는 S 또는 O이며;
L1 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
L2 는 O, SQ', 또는 NQ'이며;
L3 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NQ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OQ', Q', F, Cl, Br, I, =O, SH, SQ', NH2, NHQ', N(Q')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Q')2 및 CO2Q'로 임의로 치환될 수 있으며;
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
M1 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M2 는 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M3 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M4 는 OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
T는 H, 또는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NT'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OT', T', F, Cl, Br, I, =O, SH, ST', NH2, NHT', N(T')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(T')2 및 CO2T'로 임의로 치환될 수 있으며;
T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고,
X1 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X2 는 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X3 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NZ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OZ', Z', F, Cl, Br, I, =O, SH, SZ', NH2, NHZ', N(Z')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Z')2 및 CO2Z'로 임의로 치환될 수 있으며;
Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. - 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 섬유성 질환이 하나 이상의 켈로이드, 비대성 흉터(hypertrophic scaring), 폐섬유증, 신장섬유증, 간경화증, 백막의 만성 염증(chronic inflammation of tunica albugenia; CITA), 심내막심근섬유증, 종격 섬유증(mediastinal fibrosis), 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 진구성 심근경색(old myocardial infarction), 경피증, 전신성 경화증, 자궁 섬유증(uterine fibroids), 및 재협착증인 방법.
- 제21항, 제22항 또는 제23항에 있어서,
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이며,
T는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹인 방법. - 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
R'은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이며,
T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹인 방법. - 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
A는 H 또는 NH2이며;
D는이거나;
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
L1 은 OH, NH2, 또는 SH이며;
M1 은 H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M4 는 OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X1 은 H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I인 방법. - 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
A는 H 또는 NH2이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
L1 은 OH 또는 NH2이고;
M1 은 H, OH, 또는 NH2 인 방법. - 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
A는 H, 또는 NH2이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기의 구조를 갖는 6원환을 형성하는 방법:
.
- 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2이고;
A는 H, 또는 NH2이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기의 구조를 갖는 6원환을 형성하는 방법:
.
- 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 Ⅱ의 구조를 갖는 화합물인 방법:
.
- 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 Ⅲ의 구조를 갖는 화합물인 방법:
.
- 제31항에 있어서, L1 은 OH 또는 NH2인 방법.
- 제31항에 있어서, L1 은 OH인 방법.
- 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H 또는 OH이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 방법. - 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H 또는 OH이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 방법. - 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 방법. - 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H 또는 NH2인 방법. - 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H 또는 OH이고;
E2 는 H 또는 OH이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H 또는 NH2인 방법. - 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하나 이상의 하기 화합물인 방법:
.
- 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하나 이상의 하기 화합물인 방법:
.
- 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 섬유성 질환(fibrotic disease) 치료용 약학적 조성물:
여기서,
E1 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E2 는 H, OH, NH2, R, O, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이며;
E3 은 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E4 는 H, OH, NH2, R, OR, NHR, NR2, SH, SR, F, Cl, Br, 또는 I이며;
R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NR'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OR', R', F, Cl, Br, I, =O, SH, SR', NH2, NHR', N(R')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(R')2 및 CO2R'로 임의로 치환될 수 있으며;
R'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
A는 H, 또는 NH2 이며;
D는이거나;
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
J는 S 또는 O이며;
L1 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
L2 는 O, SQ', 또는 NQ'이며;
L3 은 OH, OQ, NH2, NHQ, NQ2, SH, 또는 SQ이고;
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NQ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OQ', Q', F, Cl, Br, I, =O, SH, SQ', NH2, NHQ', N(Q')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Q')2 및 CO2Q'로 임의로 치환될 수 있으며;
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
M1 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이며;
M2 는 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M3 은 H, OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이며;
M4 는 OH, NH2, T, OT, NHT, NT2, SH, ST, F, Cl, Br, 또는 I이고;
T는 H, 또는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NT'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OT', T', F, Cl, Br, I, =O, SH, ST', NH2, NHT', N(T')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(T')2 및 CO2T'로 임의로 치환될 수 있으며;
T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
X1 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X2 는 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이며;
X3 은 H, OH, NH2, Z, OZ, NHZ, NZ2, SH, SZ, F, Cl, Br, 또는 I이고;
Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 20개의 탄소 그룹이고, 여기서, 각각의 탄소는 O, S, SO, SO2, NH, 또는 NZ'에 의해 임의로 치환될 수 있고, 각각의 탄소는 하나 이상의 OH, OZ', Z', F, Cl, Br, I, =O, SH, SZ', NH2, NHZ', N(Z')2, OSO3H, OPO3H3, CO2H, CON(Z')2 및 CO2Z'로 임의로 치환될 수 있으며;
Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 10개의 탄소 그룹으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. - 제41항에 있어서, 상기 섬유성 질환이 하나 이상의 켈로이드, 비대성 흉터(hypertrophic scaring), 폐섬유증, 신장섬유증, 간경화증, 백막의 만성 염증(chronic inflammation of tunica albugenia (CITA), 심내막심근섬유증, 종격 섬유증(mediastinal fibrosis), 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 진구성 심근경색(old myocardial infarction), 경피증, 전신성 경화증, 자궁 섬유증(uterine fibroids), 및 재협착증인 약학적 조성물.
- 제41항 또는 제42항에 있어서,
Q는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
R은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이며,
T는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
Z는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
Q'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
R'은 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이며,
T'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹이고,
Z'는 임의로 포화, 불포화, 선형, 분지성 선형, 사이클릭, 분지성 사이클릭, 방향족, 부분적 방향족 또는 비-방향족인 1 내지 6개의 탄소 그룹인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, CH3, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
A는 H 또는 NH2이며;
D는이거나;
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
L1 은 OH, NH2, 또는 SH이며;
M1 은 H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
M4 는 OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I이고;
X1 은 H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, 또는 I인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기에서 선택된 6원환을 형성하며:
G는 CH 또는 N이고;
L1 은 OH 또는 NH2이고;
M1 은 H, OH, 또는 NH2 인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E2 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E3 은 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
E4 는 H, OH, NH2, OCH3, 또는 CH3이고;
A는 H, 또는 NH2이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기의 구조를 갖는 6원환을 형성하는 약학적 조성물:
.
- 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2이고;
A는 H, 또는 NH2이고;
D는; 또는
A 및 D는 하기의 구조를 갖는 6원환을 형성하는 약학적 조성물:
.
- 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 Ⅱ의 구조를 갖는 화합물인 약학적 조성물:
.
- 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 Ⅲ의 구조를 갖는 화합물인 약학적 조성물:
.
- 제50항에 있어서, L1 은 OH 또는 NH2인 약학적 조성물.
- 제50항에 있어서, L1 은 OH인 약학적 조성물.
- 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H 또는 OH이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H 또는 OH이고;
E3 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H, OH, 또는 NH2인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H, OH, 또는 NH2이고;
E2 는 H, OH, 또는 NH2이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H 또는 NH2인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
E1 은 H 또는 OH이고;
E2 는 H 또는 OH이고;
E3 은 H 또는 OH이고;
E4 는 H 또는 NH2인 약학적 조성물. - 제41항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하나 이상의 하기 화합물인 약학적 조성물:
.
- 제41항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하나 이상의 하기 화합물인 약학적 조성물:
.
- (a) 제41항 내지 제59항 중 어느 한 항의 약학적 조성물; 및 (b) 섬유성 질환 치료를 위한 사용 지침을 포함하는 상업적 패키지.
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