KR20160013761A - 산물 생산능이 향상된 효모 및 그를 이용한 산물을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

증가된 속도로 포도당을 소비할 수 있는 효모 세포 및 상기 효모 세포를 이용하여 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 효율적으로 생산하는 하는 방법을 제공한다.

Description

산물 생산능이 향상된 효모 및 그를 이용한 산물을 생산하는 방법{Yeast having a improved product productivity and method of producint the product}

증가된 속도로 포도당을 소비할 수 있는 효모 세포 및 상기 효모 세포를 이용하여 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 효율적으로 생산하는 하는 방법에 관한 것이다.

유기산 및 알콜과 같은 산물은 식품 및 의약품 및 화학 산업에서 빌딩 블록 물질 (building block material)로서 널리 사용되고 있다. 이들 물질은 석유로부터 생산하는 것이 알려져 있으나, 환경친화적인 미생물을 사용하여 생산하는 방법이 연구되고 있다.

미생물을 사용하여 산물을 생산하는 방법은 발효 기간이 길고 산물을 분리하는데 많은 비용이 소요될 수 있다. 따라서, 상기 미생물은 효모를 포함할 수 있다. 미생물을 사용한 산물을 생산하는 방법에 있어서, 미생물의 산물 생산성을 향상시키는 것이 요구되고 있다.

실제로, 생산성 (productivity)을 증가시키기 위한 많은 접근법은 산 스트레스와 같은 생산 환경이 생산성을 한정한다는 가정에 의존한다. 균주 개발의 다른 중점 사항은, 산물 형성에 관련된 효소 활성이 증진된다는 의미에서, 산물 형성 자체 (product formation itself)에 관한 것이다. 일반적으로 증진된 효소 활성의 예는, 산물의 생산을 위하여 필요한 중간체 (intermediates)를 제공하는 해당과정과 같은 중심 대사경로를 포함할 수 있다.

따라서, 산물 생산능이 증가된 효모 및 그를 이용한 산물 생산 방법이 여전히 요구되고 있다.

일 양상은 증가된 속도로 포도당을 소비할 수 있는 효모 세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 효율적으로 생산하는 하는 방법을 제공한다.

효소 또는 폴리펩티드의 "활성의 감소" 또는 "감소된 활성"은 세포 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포, 모세포(parent cell), 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성을 나타내지 않는 것을 의미한다. 즉 해당 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 폴리펩티드, 본래 조작되지 않은 세포의 폴리펩티드, 또는 모세포의 폴리펩티드 또는 야생형(wild-type) 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 10%이상, 약 20%이상, 약 30%이상, 약 40%이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 감소된 효소 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성의 감소는 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우 또는 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 조작되지 않은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.

용어 “모세포(parent cell)”는 유전적으로 조작된 세포를 수득할 수 있게 하는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 세포를 지칭할 수 있다. 용어 “야생형(wild-type)” 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있게 하는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다.

상기 효소의 활성이 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 유전자의 "제거 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절 인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동 재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자 (paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 "활성 증가" 또는 "증가된 활성"은 효소 또는 폴리펩티드 또는 단백질이 활성을 나타낼 수 있도록 충분한 정도로 증가된 것일 수 있으며, 세포 또는 단리된 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포, 모세포, 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 세포의 폴리펩티드, 모세포의 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 증가된 활성을 갖는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

폴리펩티드의 활성 증가는 폴리펩티드의 발현증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 발현 증가는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 세포 내 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 상기 유전자 발현을 위한 프로모터 서열 또는 전사 종결자 서열일 수 있다. 또한, 상기 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열 (adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.

외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.

용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.

용어 "유전자 (gene)"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding 서열)과 3'-비코딩 서열 (3'-non coding 서열) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다. 상기 조절 영역은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터, 리보좀 결합 부위, polyA 결합 서열, 터미네이터 영역 등을 포함할 수 있다.

"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미한다.

"분비 (secretion)"는 물질이 세포 내부에서 주변세포질공간 (periplasmic space)이나 세포 외 환경으로 이동되는 것을 의미한다.

본 명세서에 언급된 "유기산 (organic acid)"은, 중성 형태의 유기산뿐만 아니라, 음전하 형태의 유기산, 및 그 염을 포함하며 이들 서로 교환가능하게 사용될 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 피루브산, TCA 회로의 중간 산물, 예를 들면, 시트르산, 이탄콘산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 알파-케토글루타르산, 숙신산, 숙신일-CoA, 푸마르산, 말레산, 또는 옥살로아세트산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 아세트산은 아세테이트 또는 그의 염과 교환가능하게 사용된다.

본 명세서에서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.

일 양상은 STD1을 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴 변이(mutation)를 갖는 효모 세포를 제공한다.

상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여 증가된 포도당 소비 속도로 포도당을 소비할 수 있는 능력을 갖는 것일 수 있다. 상기 포도당 소모는 해당과정을 통해 한 분자의 포도당이 두 분자의 피루브산을 형성하는 과정일 수 있다. 상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여 증가된 해당과정(glycolysis) 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 물질의 생산능을 갖는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 생산은 세포 내에서 생산하는 것 또는 세포에서 생산된 후 분비되는 것일 수 있다. 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포는 STD1 또는 STD1 및 MTH1의 활성이 감소되도록 유전적으로 조작되지 않은 것일 수 있다. 또한, 상기 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포는 STD1 유전자 또는 STD1 및 MTH1 유전자가 제거 또는 파괴의 변이를 갖지 않는 세포일 수 있다.

본 명세서에 있어서 "유래 물질"이란 특정 물질로부터 생합성 과정에 의하여 형성되는 물질일 수 있다. "해당과정 중간 산물 유래 물질"이란 해당과정 중간 산물, 예를 들면 피루베이트로부터 생합성 과정에 의하여 형성되는 물질일 수 있다. "생합성 과정"은 세포 내에 자연적으로 존재하는 것뿐만 아니라 외부로부터 유전자의 도입에 의하여 새롭게 형성된 생합성 경로를 포함한다. 구체적으로, 상기 해당과정 중간 산물은 글루코스-6-포스페이트 (G6P), 프럭스토스-6-포스페이트 (F6P), 프럭스토스-1,6-비스포스페이트 (FBP), 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP), 글리세르알데히드-3-포스페이트 (GAP), 1,3-비스포스포글리세레이트, 3-포스포글리세레이트, 2-포스포글리세레이트, 포스포에놀피루베이트 (PEP), 또는 피루베이트일 수 있다. 상기 해당과정 중간 산물 유래 물질은 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP) 유래 물질, 글리세르알데히드-3-포스페이트 (GAP) 유래 물질, 또는 피루베이트 유래 물질인 것일 수 있다. 상기 "DHAP 유래 물질"은 글리세롤-3-포스페이트 (G3P), 글리세롤, 글리세롤 유래 산물 또는 그 조합일 수 있다. 상기 "피루베이트 유래 물질"은 알콜, 유기산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 "피루베이트 유래 물질"은 에탄올, 아세트산, 아세틸-CoA, 락테이트, TCA 회로의 중간 산물, 이들 유래 산물, 또는 그 조합인 것일 수 있다. TCA 회로의 중간 산물은 시트르산, 이타콘산, 이소시트레이트, 옥살로숙신네이트, 알파-케토글루타레이트, 숙신산, 숙신일-CoA, 푸마르산, 말레이트, 옥살로아세테이트, 또는 그 조합인 것일 수 있다. 상기 TCA 회로의 중간 산물 유래 물질은 숙신산 유래 산물일 수 있다. TCA 회로의 중간 산물 유래 물질은 숙신닐-CoA, 숙신산 세미알데히드 (succinic semialdehye: SSA), 4-히드록시부티레이트, 4-히드록시부티릴-CoA, 4-히드록시부티르알데히드, 1,3-부탄디올 (1,3-BDO), 1,4-부탄디올 (1,4-BDO), 부탄올, 또는 이소부탄올일 수 있다. 상기 효모 세포는 숙신산으로부터 1,4-BDO로 전환하는데 작용하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효소는 예를 들면, CoA-의존성 succinate semialdehyde dehydrogenase, 4- hydroxybutyrate (4-HB) dehydrogenase, 4-hydroxybutyryl-CoA (4HB-CoA) transferase, aldehyde/alcohol dehydrogenase, 및 Clostridium acetobutylicum AdhE2일 수 있다.

상기 효모 세포는 STD1, MTH1, 또는 그의 조합을 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴와 같은 변이(mutation)를 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 MTH1, STD1, 또는 그의 조합을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역등의 조절 인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여 STD1, MTH1, 또는 그의 조합의 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 모세포는 STD1, MTH1, 또는 그의 조합을 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴 변이를 갖지 않는 것일 수 있다.

STD1은 글루코스-관련된 유전자 발현을 변화시킬 수 있다. STD1은 hexose transporter (HTX)를 코딩하는 유전자의 전사 억제자 (transcriptional repressor)일 수 있다. Hexose transporter는 글루코스 또는 fructose와 같은 hexose를 plasma membrane을 넘어 translocate할 수 있는 효소와 같은 단백질을 지칭할 수 있다. 상기 hexose transporter는 일례로 HTX1, HTX2, HTX3, HTX4, HTX5, HTX6, HTX7, HTX8, HTX9, HTX10, HTX11, HTX12, HTX13, HTX14, HTX15, HTX16, HTX17, GAL1, SNF3, 또는 RGT2일 수 있다. STD1은 전사 억제자 MTH1과 상호작용하고 기능하는 단백질일 수 있다. STD1은 서열번호 1의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. STD1 유전자는 서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 STD1 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

MTH1은 hexose transporter (HTX)를 코딩하는 유전자의 전사 억제자 (transcriptional repressor)일 수 있다. MTH1은 전사 억제자 STD1과 상호작용하고 기능하는 단백질일 수 있다. MTH1은 서열번호 3의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. MTH1 유전자는 서열번호 3의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 MTH1 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. MTH1 및 STD1 유전자는 효모, 예를 들면, S. cerevisiae 유래의 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Shizosaccharomyces, Issachenkia, 또는 Hansenula에 속하는 균주인 것일 수 있다. Saccharomyces에 속하는 균주는 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.

상기 효모 세포는, 피루베이트로부터 피루베이트 유래 물질을 합성하는 경로의 효소, DHAP로부터 글리세롤을 합성하는 경로, 또는 글리세롤로부터 글리세롤 유래 물질을 합성하는 경로의 효소의 활성이 증가된 것일 수 있다. DHAP로부터 글리세롤을 합성하는 경로는 DHAP와 NADH를 G3P와 NAD+로 전환하는 반응을 촉매하는 G3P 데히드로게나제 (G3P dehydrogenase: GPDH) 및 G3P를 글리세롤과 Pi로 전환시키는 반응을 촉매하는 G3Pase를 포함할 수 있다.

"피루베이트 유래 물질"에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 증가는 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 효모 세포는, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소의 활성, 또는 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 증가는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현, 또는 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소의 발현이 증가된 것에 의한 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 EC 1.1.1.27, 또는 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소는 피루베이트 데카르복실라제 및 알콜 데히드로게나제 중 하나 이상일 수 있다. 피루베이트 데카르복실라제는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 알콜 데히드로게나제 (ADH)는 EC. 1.1.1.2로 분류되는 효소일 수 있다.

상기 효모 세포는, 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 감소된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합을 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴와 같은 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 모세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합을 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 감소된 것일 수 있다. 또한, 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 촉진하거나 도와주는 경로의 활성이 증가된 것일 수 있다.

상기 효모 세포가 락테이트 생산용인 경우, 상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴와 같은 변이를 갖는 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1일 수 있다. 상기 효모 세포는 아세트알데히드를 에탄올로의 전환을 촉매하는 알콜 데히드로게나제 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제는 NADH 의존성일 수 있다. 상기 pdc1 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴와 같은 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 cyb2 유전자는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴와 같은 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GPD)는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 GPD는 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있다. 상기 GPD는 서열번호 7의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다.

상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 상기 효모 세포에 도입 및 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다. 상기 발현의 증가는 유전자의 카피 수가 증가되거나 상기 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 증가는 내인성 유전자의 증폭 또는 외인성 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 조절 영역의 변이는 내인성 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 동종성 (homogenous) 또는 이종성 (heterogenous) 유전자일 수 있다.

피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제 (ldh)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 피루베이트를 락테이트로의 전환을 촉매할 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 또는 D-락테이트에 각각 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 또는 개구리 (Xenopus laevis)로부터 선택되는 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 11, 12, 13, 및 14의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 11, 12, 13, 및 14의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 11, 12, 13, 및 14의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 LDH를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 복제 개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, ADH 프로모터 및 CCW12 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, ADH 프로모터, 및 CCW12 프로모터는 각각 서열번호 16, 17, 18, 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.

LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 게놈에 포함될 수 있다. LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다. LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 L-LDH 또는 D-LDH의 생산에 특이적이어서, 상기 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 효모 세포는 L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체, 또는 그의 염을 생산할 수 있다.

상기 효모 세포는 단일 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 1 내지 10 카피수의 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드의 카피이거나 둘 이상의 상이한 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌(locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다.

또한 상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트(G3P)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 감소되어 있고, 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것인 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다. 상기 효모 세포는 또한, G3P를 글리세롤로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 사카로마이에스 세레비지애는 KCTC 12415BP 균주에 STD1 유전자, 또는 STD1 유전자와 MTH1 유전자가 결실된 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것이고, 락테이트를 다른 산물로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트를 다른 산물로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 더 포함하고, 상기 폴리펩티드는 상기 유전자에 의하여 발현된 것일 수 있다. 락테이트를 다른 산물로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드는 예를 들면, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 효소 및 락틸-CoA를 락틸-CoA 또는 다른 모노머와 축합하여 호모폴리락테이트 (homopolylactate) 또는 락테이트 함유 공중합체를 형성하는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 효소 및 락틸-CoA를 락틸-CoA는 각각 CoA-transferase, 예를 들면, 조작된 Clostridium propionicum propionate CoA transferase (PctCp), 및 Pseudomonas sp. MBEL 6-19 polyhydroxyalkanoate (PHA synthase 1 (PhaC1Ps6-19)일 수 있다 (Teak Ho Yang 등, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 105, No. 1, January 1, 2010).

상기 효모 세포는 Saccharomyces로서, STD1을 코딩하는 유전자, 또는 STD1을 코딩하는 유전자와 MTH1을 코딩하는 유전자가 결실된 것일 수 있다. 상기 Saccharomyces는 Saccharomyces cerevisiae, 예를 들면, Saccharomyces cerevisiae CEN. PK2-1C일 수 있다.

다른 양상은 상기한 바와 같은 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 해당과정 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 산물을 회수하는 단계;를 포함하는, 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 산물을 생산하는 하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 상기 효모 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 "효모 세포"에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 포도당을 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다.

상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물, 예를 들면, 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양할 수 있다. 상기 호기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 20 v/v% 이상, 예를 들면, 20 내지 100v/v%, 20 내지 80v/v%, 20 내지 60v/v%, 20 내지 40v/v%, 또는 20 내지 30v/v%일 수 있다. 그 후 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물, 예를 들면, 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 미세호기 조건, 예를 들면, DO 2v/v% 이하, 예를 들면, 0.001 내지 2v/v%, 0.005 내지 2v/v%, 0.01 내지 2v/v%, 0.05 내지 2v/v%, 0.1 내지 2v/v%, 0.5 내지 2v/v%, 1 내지 2v/v%, 또는 1.5 내지 2v/v%에서 배양할 수 있다.

용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 상기 탄소원은 자화가능한 당 (assimilable sugars)일 수 있다. 상기 자화가능한 당은 6탄당 또는 5 탄당일 수 있다. 상기 탄소원은 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈가 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%, 예를 들면, 0.1% 내지 8%, 0.1% 내지 6%, 0.1% 내지 4%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 1%, 1% 내지 10%, 1% 내지 8%, 1% 내지 6%, 2% 내지 10%, 4% 내지 10%, 6% 내지 10%, 8% 내지 10%, 2% 내지 8%, 또는 2% 내지 6%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

상기 방법은 배양물로부터 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 회수하는 단계를 포함한다. 상기 배양물 (culture)은 세포와 배양매질 (culture medium)을 포함할 수 있다. "피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물"에 대하여는 상기한 바와 같다.

배양물로부터 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물 예를 들면, 락테이트의 회수는 당해 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 회수 또는 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

상기 회수는 세포, 배양 매질 또는 둘 모두로부터 회수하는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 증가된 속도로 포도당을 소비할 수 있다.

다른 양상에 따른 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 생산하는 하는 방법에 의하면, 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 효율적으로 생산할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 효모 세포에서 STD1 , MTH1 , 또는 MTH1 및 STD1 유전자의 활성 감소의 효과

본 실시예에서는 효모 세포의 STD1, MTH1, 또는 STD1 및 MTH1 유전자를 결실시키고, 이러한 유전자 제거에 의한 상기 유전자 활성 감소가 효모 세포의 성장, 포도당 소모 및 에탄올 생산에 미치는 영향을 확인하였다.

(1) STD1 의 활성이 감소된 균주의 제작

STD1 유전자를 결실시키기 위하여 해당 DNA를 필수 아미노산 중 하나를 합성할 수 마커 유전자의 앞 뒤에 loxP site가 있는 채로 제작된 PCR 카세트와 상동재조합(homologous recombination)하여 제거하고, 그러한 마커 유전자를 cre recombinase를 발현하는 벡터를 이용해 loxP site끼리의 상동 재조합을 이용해 제거하는 법을 사용하였다. 먼저 pUG73 벡터(Euroscarf, Acc. no. P30118)을 이용해 PCR 절편을 다음과 같이 제작하였다. pUG73 벡터의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 22 및 23의 프라이머를 사용하여, 앞 뒤가 STD1 유전자의 프로모터의 3' 서열과 터미네이터의 5' 서열과 겹치도록 만든 Leu2 PCR 절편을 제작하여 STD1 유전자 결실카세트를 제작하였다. 이것을 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae CEN.PK2-1D(MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3△ 1; MAL2-8C; SUC2) EUROSCARF accession number: 30000B: 이하 "CEN.PK2-1D 균주"라고도 함) 에 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation) 방법을 이용하여 도입하였다. 형질도입 후 LEUCINE drop out plate 배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. No. Y0626) 6.7 g/L 및 Yeast synthetic drop-out without LEUCINE (Sigma-Aldrich) 1.9 g/L, Agar (USB Products: CAS# 9002-18-0) 15 g/L, 및 포도당 2 (w/v)%, 이하 SC-Leu)에서 세포를 배양하여 세포 내에 STD1 유전자가 LEU2 유전자로 치환된 균주만을 선별하였다. 상기 균주내 치환 여부는, 얻어진 세포의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 24 및 25의 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 확인하였다. 확인 후 선별된 균주에는 pSH62(Euroscarf, Acc. no. P30120) 벡터를 heat shock transformation 으로 도입하였다. 형질도입 후 HISTIDINE drop out 배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. No. Y0626) 6.7 g/L 및 Yeast synthetic drop-out without HISTIDINE (Sigma-Aldrich) 1.9 g/L, Agar (USB Products: CAS# 9002-18-0) 15 g/L, 및 포도당 2 (w/v)% 이하 SC-His)에서 세포를 배양하여 세포 내에 pSH62 벡터가 삽입된 균주만을 선별하였다. 해당 균주는 YP-GAL 배지 (Bacto Peptone(BD & Difco: Cat. No. 211677) 20 g/L 및 Yeast extract(BD & Difco: Cat. No. 212750) 10 g/L, 및 Agar(USB Products: CAS. No. 9002-18-0) 15 g/L, 및 galactose (BD & Difco: Cat. No. 216310) 2 (w/v)%) 에서 24시간 배양하여 GAL promoter에 의한 cre recombinase가 발현되도록 유도하였고, 그 후 YPD plate 배지 (Bacto Peptone(BD & Difco: Cat. No. 211677) 20 g/L 및 Yeast extract(BD & Difco: Cat. No. 212750) 10 g/L, 및 Agar (USB Products: CAS# 9002-18-0) 15 g/L, 및 포도당 2 (w/v)%) 에서 1/1000 희석 후 24h 뒤 colony를 3차 증류수에 풀어준 뒤 YPD, SC-His, SC-Leu plate에 spotting하여, STD1과 치환된 LEU2 유전자와 pSH62 벡터가 모두 빠진 균주만을 선별하였다. 최종적으로 유전자의 결실을 확인하기 위해, 얻어진 세포의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 24 및 26의 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 확인하였다.

(2) MTH1 의 활성이 감소된 균주의 제작

MTH1 유전자를 결실시키기 위하여 DNA를 필수 아미노산 중 하나를 합성할 수 있는 유전자 중 하나로 상동 재조합하고, cre plasmid를 이용해 그것을 제거하는 방법을 사용하였다. 먼저 pUG73 벡터를 이용해 PCR 절편을 다음과 같이 제작하였다. pUG73 벡터의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 27 및 28의 프라이머를 사용하여, 앞 뒤가 MTH1 유전자의 프로모터의 3' 서열과 터미네이터의 5' 서열과 겹치도록 만든 Leu2 PCR 절편을 제작하여 MTH1 유전자 결실카세트를 제작하였다. 이것을 S. cerevisiae CEN.PK2-1D에 heat shock transformation 을 이용하여 도입하였다. 형질도입 후 SC-LEU 배지에서 세포를 배양하여 세포 내에 MTH1 유전자가 LEU2 유전자로 치환된 균주만을 선별하였다. 상기 균주내 치환 여부는, 얻어진 세포의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 29 및 25의 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 확인하였다. 확인 후 선별된 균주에는 pSH62 벡터를 열충격 형질전환 방법으로 도입하였다. 형질도입 후 SC-His 배지에서 세포를 배양하여 세포 내에 pSH62 벡터가 삽입된 균주만을 선별하였다. 해당 균주는 YP-GAL 배지에서 24시간 배양하여 GAL promoter에 의한 cre 효소가 발현되도록 유도하였고, 그 후 YPD plate 배지에서 1/1000 희석 후 24h 뒤 colony를 3차 증류수에 풀어준 뒤 YPD, SC-His, SC-Leu plate에 spotting하여, MTH1과 치환된 LEU2 유전자와 pSH62 벡터가 모두 빠진 균주만을 선별하였다. 최종적으로 유전자의 결실을 확인하기 위해, 얻어진 세포의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 29 및 30의 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 확인하였다.

(3) STD1 및 MTH1 의 활성이 감소된 균주의 제작

STD1, MTH1 유전자를 모두 결실시키기 위하여, STD1이 결실된 균주에 (2)와 같은 방법으로 MTH1이 함께 결실된 균주를 제작하였다.

(4) 형질전환된 효모 세포의 성장, 포도당 소모량 및 에탄올 생산량 확인

상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 4% 포도당을 함유한 YPD 배지에 1차 접종 후 16시간이 지난 뒤 8% 포도당을 함유한 YPD 배지 5ml에 OD₆₀₀ 값이 5가 되도록 접종하고, 30℃에서 170 rpm으로 교반하면서 10 시간 동안 호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD₆₀₀ 값을 측정하였다. 잔류 포도당 및 에탄올 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.

(5) 배양 결과

10 시간 후의 배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 배지 중 잔류 포도당 및 에탄올 농도는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

균주	세포성장(OD600)	포도당 소비(g/L)	에탄올 생산(g/L)
대조군	24.8	74	32.8
MTH1 유전자 제거	17.2	32	12.6
STD1 유전자 제거	25.2	78	35.0
MTH1 및 STD1 유전자 제거	28.3	80	35.5

표 1에서, 대조군은 S. cerevisiae CEN.PK2-1D에 pRS416 vector가 도입된 균주인 것을 제외하고 동일 조건에서 배양한 것이다. MTH1 유전자 제거 균주는 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿmth1)를 나타내고, STD1 유전자 제거 균주는 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿstd1)를 나타내고, STD1 및 MTH1 유전자 제거 균주는 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿstd1, ㅿmth1)를 나타낸다.

표 1에 나타낸 바와 같이, STD1 유전자가 제거된 균주는 대조군에 비하여 세포 성장, 포도당 소비 및 에탄올 생산이 각각, 1.6%, 5.4% 및 6.7% 증가하였다. STD1 유전자가 제거된 균주는 대조군에 비하여 당 소모 속도도 6.5 g/L/h에서 7.1 g/L/h로 증가하여, 약 10% 증가하였다. 상기 당 소모 속도는 6시간 까지의 시간당 포도당 소모량이다.

또한, STD1 및 MTH1 유전자가 제거된 균주는 대조군에 비하여 세포 성장, 포도당 소비 및 에탄올 생산이 각각, 14.1%, 8.1% 및 8.2% 증가하였다. STD1 및 MTH1 유전자가 제거된 균주는 대조군에 비하여 당 소모 속도도 6.5 g/L/h에서 7.8 g/L/h로 증가하여, 약 20% 증가하였다.

실시예 2: 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포에서 STD1 , MTH1 , 또는 MTH1 및 STD1 활성 감소의 효과

본 실시예에서는 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포의 MTH1, STD1, 또는 STD1 및 MTH1 유전자를 결실시키고, 이러한 유전자 제거에 의한 상기 유전자 활성 감소가 효모 세포의 락테이트 생산에 미치는 영향을 확인하였다.

1. 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포의 제조

S. cerevisiae CEN.PK2-1D에서 락테이트 생산능을 향상시키기 위하여, 대사 산물의 흐름을 락테이트 이외의 경로로 흐르게 하는 경로, 즉, 피루베이트로부터 에탄올로의 경로에 관여하는 효소인 피루베이트 데카르복실라제 1(pyruvate decarboxylase 1: PDC1) 유전자를 결실시켰다. PDC1은 피루베이트를 아세트알데히드와 CO₂로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. 이때 pdc1 유전자의 결실과 동시에 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다. LDH는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다.

또한, 락테이트로부터 피루베이트로 전환하는 반응을 촉매하는 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase: cyb2) 유전자를 결실시켰다. 이때 cyb2 유전자의 결실과 동시에 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다.

또한, 해당과정에서 피루베이트로의 대사 흐름을 강화하기 위하여, 디히드록시아세톤 포스페이트 (dihydroxy acetone phosphate: DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (glycerol-3-phosphate: G3P)로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1: gpd1) 유전자를 결실시켰다. GPD1은 상기 반응과 동시에 NADH를 NAD+로 전환시킨다. 이때 gpd1 유전자의 결실과 동시에 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다.

(1) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿ pdc1 :: ldh )의 제작

(1.1) pdc1 를 결실시키며 ldh 를 도입하기 위한 벡터의 제작

사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 피루베이트로부터 아세트알데히드를 거쳐 에탄올로 가는 경로를 차단하기 위하여 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase1: pdc1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다. pdc1 유전자를 제거하는 동시에 일본 자라 유래 Ldh를 발현시키기 위하여 pdc1 유전자를 'ldh 카세트'로 치환하여 pdc1 유전자를 결손시켰다. "카세트"란 달리 언급이 없으면, 프로모터, 코딩 서열, 및 터미네이터가 작동가능하게 연결된 단백질이 발현될 수 있는 단위 서열을 나타낸다.

구체적으로, 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 31 및 32의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 얻어진 CCW12 프로모터 서열 (서열번호 20)과 'ldh 유전자 (서열번호 15)'를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 소화하고, 동일 효소로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하였다. pRS416 vector는 T7 프로모터, 박테리아에서 암피실린 저항성, 효모에서 URA3 카세트 (선택마커), 및 제한효소 클로닝 부위를 갖는 효모 센트로미어 셔틀 플라스미드 (yeast centromere shuttle plasmid)이다. 다음으로, 얻어진 벡터에 pCEP4 plasmid (invitrogen, Cat. no. V044-50)를 주형으로 하고 서열번호 33 및 34의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한PCR하여 얻어진 증폭 산물 즉, 'HPH 카세트' 서열 (서열번호 35)을 SacI로 소화시키고, 동일한 효소로 소화된 상기 얻어진 벡터에 연결하여 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터 p416-ldh-HPH를 제조하였다. pCEP4 plasmid는 다중클로닝 부위 (multiple cloning site)에 삽입된 재조합 유전자의 높은 수준의 전사를 위한 cytomegalovirus (CMV) immediate early enhance/promoter를 사용하는 에피좀성 포유동물 발현 벡터 (episomal mammalian expression vector)이다. pCEP4는 트란스펙션된 세포 (transfected cell)에서 안정된 선택을 위한 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene)을 갖는다. 여기서 'ldh 카세트'는 ldh 유전자 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, ldh 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다. 상기 ldh 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사되도록 하였다. 또한, 'HPH (hygromycin B phosphotransferase) 카세트'는 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene) 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, 히그로마이신 B 저항성 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다.

pdc1의 결실 용 벡터는 p416-ldh-HPH를 주형으로 하고 서열번호 36 및 37의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR에 의하여 ldh 유전자 절편과 pUC57-Ura3HA 벡터 (DNA2.0 Inc.; 서열번호 38)를 각각 SacI로 소화시킨 후 서로 연결하여 pUC-uraHA-ldh를 제조하였다. 이 벡터로부터 pdc1의 결실용 카세트는 pdc1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 39 및 40의 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다. 상기 서열번호 39의 1 내지 41 및 서열번호 40의 1 내지 44는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체의 상동 서열과 상동 재조합되어 pdc1 유전자와 치환될 부분을 의미한다.

(1.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿ pdc1 :: ldh ) 제조

(1.1)에서 제작한 pdc1 deletion용 카세트를 사카로마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, EUROSCARF accession number: 30000B)에 도입하였다. 상기 pdc1 deletion용 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 pdc1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.

그 결과 얻어진 세포에 대하여, pdc1의 결실을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pdc1 유전자 결실 및 ldh 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh)를 제조하였다.

(2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh )의 제작

(2.1) cyb2 를 결실시키기 위한 벡터의 제작

(1)에서 얻어진 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh)에서, 락테이트에서 피루베이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 cyb2 유전자를 제거하였다.

구체적으로, (1.1)에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 43 및 44의 cyb2 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 deletion 용 카세트를 얻었다. 서열번호 43의 프라이머 중 1 내지 45 및 서열번호 44의 프라이머 중 1 내지 45는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 cyb2와 치환될 부분을 의미한다.

(2.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh )의 제조

(2.1)에서 제작한 cyb2 deletion용 카세트를 상기한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 cyb2 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.

그 결과 얻어진 균주에 대하여 cyb2의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 45 및 46의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 유전자 결실된 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh)를 제조하였다.

(3) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조

(3.1) gpd1 를 결실시키기 위한 벡터의 제작

(2)에서 제조된 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2)에서 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세롤-3-포스페이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1, gpd1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다.

구체적으로, (1.1)에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 47 및 48의 gpd1 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 deletion 용 카세트를 얻었다. 서열번호 47의 프라이머 중 1 내지 50 및 서열번호 48의 프라이머 중 1 내지 50는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 gpd1과 치환될 부분을 의미한다.

(3.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조

(3.1)에서 제작한 gpd1 deletion용 카세트를 (2)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 gdp1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.

그 결과 얻어진 균주에 대하여 gpd1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 49 및 50의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)를 제조하였다.

S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)는 2013.5.30일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 수탁번호 KCTC12415BP로 기탁하였다.

3. 형질전환된 효모 세포의 락테이트 생산량 확인

상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 5% 포도당을 함유한 최소 배지 (minimal Ura drop-out media) 50 ml에 OD₆₀₀ 값 1이 되도록 접종하고, 30℃에서 90 rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 잔류 젖산 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.

4. 배양 결과

24시간 동안 배양 결과, 배지 중 젖산 농도는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

균주	젖산 생산 (g/L)	젖산 수율 (%)
대조군	10.8	13.5
MTH1 유전자 제거 균주	10.4	13.1
STD1 유전자 제거 균주	13.4	16.8
STD1 및 MTH1 유전자 제거 균주	12.6	15.8

표 2에서, 대조군은 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh)를 나타내고, MTH1 유전자 제거 균주는 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿmth1)를 나타내고, STD1 유전자 제거 균주는 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿstd1)를 나타내고, STD1 및 MTH1 유전자 제거 균주는 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿstd1,ㅿmth1)를 나타낸다.

표 2에 나타낸 바와 같이, STD1 유전자가 제거된 균주는 대조군에 비하여 젖산 생산성은 10.8 g/L에서 13.4 g/L로 상승하였으며, 수율도 13.5% 에서 16.8%로 상승하였다. 따라서, STD1 유전자가 제거된 균주는 대조군에 비하여 젖산 생산성이 약 24% 향상되었다. 또한, STD1 및 MTH1 유전자가 제거된 균주는 대조군에 비하여 젖산 생산성은 10.8 g/L에서 12.6 g/L로 상승하였으며, 수율도 13.5% 에서 15.8%로 상승하였다. 따라서, STD1 유전자와 MTH1 유전자가 모두 제거된 균주는 대조군에 비하여 젖산 생산성이 약 17% 향상되었다.

한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530

<110> Samsung Electronics. Co., Ltd. <120> Yeast having a improved product productivity and method of producint the product <130> PN105787KR <160> 50 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 444 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Phe Val Ser Pro Pro Pro Ala Thr Ala Arg Asn Gln Val Leu Gly 1 5 10 15 Lys Arg Lys Ser Lys Arg His Asp Glu Asn Pro Lys Asn Val Gln Pro 20 25 30 Asn Ala Asp Thr Glu Met Thr Asn Ser Val Pro Ser Ile Gly Phe Asn 35 40 45 Ser Asn Leu Pro His Asn Asn Gln Glu Ile Asn Thr Pro Asn His Tyr 50 55 60 Asn Leu Ser Ser Asn Ser Gly Asn Val Arg Ser Asn Asn Asn Phe Val 65 70 75 80 Thr Thr Pro Pro Glu Tyr Ala Asp Arg Ala Arg Ile Glu Ile Ile Lys 85 90 95 Arg Leu Leu Pro Thr Ala Gly Thr Lys Pro Met Glu Val Asn Ser Asn 100 105 110 Thr Ala Glu Asn Ala Asn Ile Gln His Ile Asn Thr Pro Asp Ser Gln 115 120 125 Ser Phe Val Ser Asp His Ser Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Ile Phe Ser 130 135 140 Gln Pro Ser Thr Ala Leu Thr Asp Ile Thr Thr Gly Ser Ser Leu Ile 145 150 155 160 Asp Thr Lys Thr Pro Lys Phe Val Thr Glu Val Thr Leu Glu Asp Ala 165 170 175 Leu Pro Lys Thr Phe Tyr Asp Met Tyr Ser Pro Glu Val Leu Met Ser 180 185 190 Asp Pro Ala Asn Ile Leu Tyr Asn Gly Arg Pro Lys Phe Thr Lys Arg 195 200 205 Glu Leu Leu Asp Trp Asp Leu Asn Asp Ile Arg Ser Leu Leu Ile Val 210 215 220 Glu Gln Leu Arg Pro Glu Trp Gly Ser Gln Leu Pro Thr Val Val Thr 225 230 235 240 Ser Gly Ile Asn Leu Pro Gln Phe Arg Leu Gln Leu Leu Pro Leu Ser 245 250 255 Ser Ser Asp Glu Phe Ile Ile Ala Thr Leu Val Asn Ser Asp Leu Tyr 260 265 270 Ile Glu Ala Asn Leu Asp Arg Asn Phe Lys Leu Thr Ser Ala Lys Tyr 275 280 285 Thr Val Ala Ser Ala Arg Lys Arg His Glu Glu Met Thr Gly Ser Lys 290 295 300 Glu Pro Ile Met Arg Leu Ser Lys Pro Glu Trp Arg Asn Ile Ile Glu 305 310 315 320 Asn Tyr Leu Leu Asn Val Ala Val Glu Ala Gln Cys Arg Tyr Asp Phe 325 330 335 Lys Gln Lys Arg Ser Glu Tyr Lys Arg Trp Lys Leu Leu Asn Ser Asn 340 345 350 Leu Lys Arg Pro Asp Met Pro Pro Pro Ser Leu Ile Pro His Gly Phe 355 360 365 Lys Ile His Asp Cys Thr Asn Ser Gly Ser Leu Leu Lys Lys Ala Leu 370 375 380 Met Lys Asn Leu Gln Leu Lys Asn Tyr Lys Asn Asp Ala Lys Thr Leu 385 390 395 400 Gly Ala Gly Thr Gln Lys Asn Val Val Asn Lys Val Ser Leu Thr Ser 405 410 415 Glu Glu Arg Ala Ala Ile Trp Phe Gln Cys Gln Thr Gln Val Tyr Gln 420 425 430 Arg Leu Gly Leu Asp Trp Lys Pro Asp Gly Met Ser 435 440 <210> 2 <211> 1335 <212> DNA <213> S.cerevisiae <400> 2 atgtttgttt caccacctcc agcaacagcg aggaaccaag tattagggaa aagaaaatcg 60 aaaagacatg acgaaaatcc aaagaatgtt caacccaacg ctgacacaga aatgacaaat 120 agcgttcctt ctattggatt caacagcaat cttccacata ataaccaaga aataaacaca 180 ccaaatcact ataatttgag ttccaattca ggaaatgtta ggagcaacaa caattttgtt 240 actacaccac cagaatatgc agacagggca agaatagaaa tcataaaaag gttattgcct 300 actgcaggaa ctaaacctat ggaagtgaac agtaatactg cagaaaatgc aaatatccaa 360 cacataaata ccccggacag tcaaagtttt gtttcagacc attcatcttc atacgaatcg 420 agtatatttt cacagccatc tactgctctt acggacatca ccacaggcag ctcgttaatt 480 gatacaaaaa cacctaagtt cgtcacagaa gtaacacttg aagacgcttt acccaaaaca 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primer <400> 28 tccaaaaaaa ccatcgggaa ggtttctttt tagtatctgc ataggccact agtggatctg 60 60 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ttcctttctt ctcaaacttt 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tctttactgc gataacggt 19 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgagctcttc gcggccacct acgccgctat c 31 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gctctagata ttgatatagt gtttaagcga at 32 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cggccatggc gggagctcgc atgcaag 27 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cgggatatca ctagtgagct cgctccgc 28 <210> 35 <211> 2321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPH cassette <400> 35 gccgggagag ctcgcatgca agtaacctat tcaaagtaat atctcataca tgtttcatga 60 gggtaacaac atgcgactgg gtgagcatat gttccgctga tgtgatgtgc aagataaaca 120 agcaaggcag aaactaactt cttcttcatg taataaacac accccgcgtt tatttaccta 180 tctctaaact tcaacacctt atatcataac taatatttct tgagataagc acactgcacc 240 cataccttcc ttaaaaacgt agcttccagt ttttggtggt tccggcttcc ttcccgattc 300 cgcccgctaa acgcatattt ttgttgcctg gtggcatttg caaaatgcat aacctatgca 360 tttaaaagat tatgtatgct cttctgactt ttcgtgtgat gaggctcgtg gaaaaaatga 420 ataatttatg aatttgagaa caattttgtg ttgttacggt attttactat ggaataatca 480 atcaattgag gattttatgc aaatatcgtt tgaatatttt tccgaccctt tgagtacttt 540 tcttcataat tgcataatat tgtccgctgc ccctttttct gttagacggt gtcttgatct 600 acttgctatc gttcaacacc accttatttt ctaactattt tttttttagc tcatttgaat 660 cagcttatgg tgatggcaca tttttgcata aacctagctg tcctcgttga acataggaaa 720 aaaaaatata taaacaaggc tctttcactc tccttgcaat cagatttggg tttgttccct 780 ttattttcat atttcttgtc atattccttt ctcaattatt attttctact cataacctca 840 cgcaaaataa cacagtcaaa tcctcgagat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt 900 cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg 960 cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa 1020 tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc 1080 gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggaattcagc gagagcctga cctattgcat 1140 ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt 1200 tctgcagccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag 1260 cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat 1320 atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag 1380 tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt 1440 ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat 1500 aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa 1560 catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg 1620 gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct 1680 tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg 1740 tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg 1800 cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg 1860 acgccccagc actcgtccgg atcgggagat gggggaggct aactgaggat ccgtagatac 1920 attgatgcta tcaatcaaga gaactggaaa gattgtgtaa ccttgaaaaa cggtgaaact 1980 tacgggtcca agattgtcta cagattttcc tgatttgcca gcttactatc cttcttgaaa 2040 atatgcactc tatatctttt agttcttaat tgcaacacat agatttgctg tataacgaat 2100 tttatgctat tttttaaatt tggagttcag tgataaaagt gtcacagcga atttcctcac 2160 atgtagggac cgaattgttt acaagttctc tgtaccacca tggagacatc aaaaattgaa 2220 aatctatgga aagatatgga cggtagcaac aagaatatag cacgagccgc ggagcgagct 2280 cggccgcact agtgatatcc cgcggccatg gcggccggga g 2321 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gaaacagcta tgaccatg 18 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gacatgacga gctcgaattg ggtaccggcc gc 32 <210> 38 <211> 4173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC57-Ura3HA vector <400> 38 gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa 60 gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg 120 ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt 180 gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg 240 ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg 300 aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 360 cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag ctcggtacct cgcgaatgca tctagatatc 420 ggatcccgac gagctgcacc gcggtggcgg ccgtatcttt tacccatacg atgttcctga 480 ctatgcgggc tatccctatg acgtcccgga ctatgcagga tcctatccat atgacgttcc 540 agattacgct gctcagtgcg gccgcctgag agtgcaccat accacagctt ttcaattcaa 600 ttcatcattt tttttttatt cttttttttg atttcggttt ctttgaaatt tttttgattc 660 ggtaatctcc gaacagaagg aagaacgaag gaaggagcac agacttagat tggtatatat 720 acgcatatgt agtgttgaag aaacatgaaa ttgcccagta ttcttaaccc aactgcacag 780 aacaaaaacc tgcaggaaac gaagataaat catgtcgaaa gctacatata aggaacgtgc 840 tgctactcat cctagtcctg ttgctgccaa gctatttaat atcatgcacg aaaagcaaac 900 aaacttgtgt gcttcattgg atgttcgtac caccaaggaa ttactggagt tagttgaagc 960 attaggtccc aaaatttgtt tactaaaaac acatgtggat atcttgactg atttttccat 1020 ggagggcaca gttaagccgc taaaggcatt atccgccaag tacaattttt tactcttcga 1080 agacagaaaa tttgctgaca ttggtaatac agtcaaattg cagtactctg cgggtgtata 1140 cagaatagca gaatgggcag acattacgaa tgcacacggt gtggtgggcc caggtattgt 1200 tagcggtttg aagcaggcgg cagaagaagt aacaaaggaa cctagaggcc ttttgatgtt 1260 agcagaattg tcatgcaagg gctccctatc tactggagaa tatactaagg gtactgttga 1320 cattgcgaag agcgacaaag attttgttat cggctttatt gctcaaagag acatgggtgg 1380 aagagatgaa ggttacgatt ggttgattat gacacccggt gtgggtttag atgacaaggg 1440 agacgcattg ggtcaacagt atagaaccgt ggatgatgtg gtctctacag gatctgacat 1500 tattattgtt ggaagaggac tatttgcaaa gggaagggat gctaaggtag agggtgaacg 1560 ttacagaaaa gcaggctggg aagcatattt gagaagatgc ggccagcaaa actaaaaaac 1620 tgtattataa gtaaatgcat gtatactaaa ctcacaaatt agagcttcaa tttaattata 1680 tcagttatta ccctatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 1740 tcaggaaatt gtagcggccg cgaatttgag cttatctttt acccatacga tgttcctgac 1800 tatgcgggct atccctatga cgtcccggac tatgcaggat cctatccata tgacgttcca 1860 gattacgcta ctagcggggg gcccggtgac gggcccgtcg actgcagagg cctgcatgca 1920 agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 1980 ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 2040 taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 2100 cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 2160 tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 2220 gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 2280 atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 2340 ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 2400 cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 2460 tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 2520 gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 2580 aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 2640 tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 2700 aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 2760 aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 2820 ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 2880 ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 2940 atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 3000 atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 3060 tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 3120 gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 3180 tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 3240 gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 3300 cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 3360 gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 3420 atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 3480 aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 3540 atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 3600 aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 3660 aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 3720 gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 3780 gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 3840 gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 3900 ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 3960 ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 4020 atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 4080 gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt 4140 atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggt 4173 <210> 39 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gcttataaaa ctttaactaa taattagaga ttaaatcgct taaggtttcc cgactggaaa 60 gc 62 <210> 40 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ctactcataa cctcacgcaa aataacacag tcaaatcaat caaaccagtc acgacgttgt 60 aaaa 64 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ggacgtaaag ggtagcctcc 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gaagcggacc cagacttaag cc 22 <210> 43 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ccgaaatgat tccctttcct gcacaacacg agatctttca cgcatccagt cacgacgttg 60 taaaa 65 <210> 44 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 aaagtagcct taaagctagg ctataatcat gcatcctcaa attctaggtt tcccgacgga 60 aagc 64 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 cgcaagaacg tagtatccac atgcc 25 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 ggatatttac agaacgatgc g 21 <210> 47 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ccctatgtct ctggccgatc acgcgccatt gtccctcaga aacaaatcaa ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 48 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 tagaagcaac tgtgccgaca gcctctgaat gagtggtgtt gtaaccaccc aggtttcccg 60 actggaaagc 70 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 tcaatgagac tgttgtcctc ctact 25 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 tacatccttg tcgagccttg ggca 24

Claims (20)

1. STD1를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴 변이를 갖는 효모 세포.
2. 청구항 1에 있어서, STD1을 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴 변이를 갖지 않는 모세포(partent cell)에 비하여 STD1의 활성이 감소된 것인 효모 세포.
3. 청구항 1에 있어서, 추가적으로 MTH1를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴 변이를 갖는 것인 효모 세포.
4. 청구항 3에 있어서, MTH1을 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴 변이를 갖지 않는 모세포(partent cell)에 비하여 MTH1의 활성이 감소된 것인 효모 세포.
5. 청구항 1에 있어서, 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여 증가된 포도당 소비 속도로 포도당을 소비할 수 있는 능력을 갖는 것인 효모 세포.
6. 청구항 1에 있어서, 유전적으로 조작되지 않은 세포 또는 모세포에 비하여, 증가된 해당과정(glycolysis) 중간 산물 또는 해당과정 산물 유래 물질의 생산능을 갖는 것인 효모 세포.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 해당과정 중간 산물은 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP), 글리세르알데히드-3-포스페이트(GAP), 또는 피루베이트인 것인 효모 세포.
8. 청구항 6에 있어서, 상기 해당과정 중간 산물 유래 물질은 DHAP로부터 유래된 물질, 또는 피루베이트로부터 유래된 물질이고, 상기 DHAP로부터 유래된 물질은 글리세롤-3-포스페이트 (G3P), 또는 글리세롤이고, 상기 피루베이트 유래 물질은 아세틸-CoA, 에탄올, 아세트산, 락테이트, TCA 회로의 중간 산물, 이들 유래 산물, 또는 그 조합인 것인 효모 세포.
9. 청구항 8에 있어서, TCA 회로의 중간 산물은 시트르산, 이타콘산, 이소시트레이트, 옥살로숙신네이트, 알파-케토글루타레이트, 숙신산, 숙신일-CoA, 푸마르산, 말레이트, 옥살로아세테이트, 또는 그 조합이고, TCA 회로의 중간 산물 유래 물질은 1,3-부탄디올(1,3-BDO), 1,4-부탄디올(1,4-BDO), 부탄올, 또는 이소부탄올인 것인 효모 세포.
10. 청구항 1에 있어서, STD1은 서열번호 1의 아미노산 서열과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
11. 청구항 3에 있어서, MTH1은 서열번호 3의 아미노산 서열과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
12. 청구항 1에 있어서, STD1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
13. 청구항 3에 있어서, MTH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
14. 청구항 1에 있어서, 효모 세포는 Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Shizosaccharomyces, Issachenkia, 또는 Hansenula에 속하는 균주인 것인 효모 세포.
15. 청구항 8에 있어서, 피루베이트로부터 피루베이트 유래 물질을 합성하는 경로, DHAP로부터 글리세롤을 합성하는 경로, 또는 글리세롤로부터 글리세롤 유래 물질을 합성하는 경로의 효소의 활성이 증가된 것인 효모 세포.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
17. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소의 활성, 또는 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소의 활성이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
18. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현, 또는 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소의 발현이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
19. 청구항 18에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 EC 1.1.1.27, 또는 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소를 코딩하는 것이고, 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소는 EC.4.1.1.1로 분류되는 피루베이트 데카르복실라제 및 EC.1.1.1.2로 분류되는 알콜 데히드로게나제 (ADH)를 포함하는 갖는 것인 효모 세포.
20. 청구항 1의 효모 세포를 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 해당과정 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 산물을 회수하는 단계;를 포함하는, 해당과정 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 산물을 생산하는 하는 방법.